CN110055281B - 一种用于制备car-t的慢病毒载体及其构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于制备CAR‑T的慢病毒载体质粒及其制备方法和用途，含有双启动子；酶切位点充足，易于插入基因；含有T2A序列，T2A序列能使连接的两个基因同时表达；本发明的用于制备CAR‑T的慢病毒载体，酶切位点充足，组件丰富，易于改造，方便载体的构建；本发明的用于制备CAR‑T的慢病毒载体应用广泛，可用于构建单CAR及多CAR、表达自杀基因或筛选基因等，也可用于构建表达细胞因子的第四代CAR，能满足CAR‑T中慢病毒载体质粒同时表达多个基因的要求；利用该慢病毒载体包装的慢病毒滴度高，利用该慢病毒载体质粒制备的慢病毒感染T细胞的效率高，并且制备的CAR‑T细胞具有较大的杀伤力。

Description

一种用于制备CAR-T的慢病毒载体及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及慢病毒载体技术领域，具体说是一种用于制备CAR-T的慢病毒载体及其构建方法和应用。
背景技术
随着免疫学、分子生物学和基因工程技术的发展，人们对恶性肿瘤细胞治疗模式的认识日新月异，尤其是嵌合抗原受体T细胞疗法(Chimeric Antigen Receptor T-CellImmunotherapy；CAR-T)在白血病和实体肿瘤领域的探索和应用，使人们看到了治愈恶性肿瘤的希望，其原理是，从癌症病人身上分离免疫T细胞，利用基因工程技术在T细胞表面表达由肿瘤抗原特异性单链抗体(scFv)和T细胞受体胞内成分组成的嵌合抗原受体(CAR-T细胞)，通过体外培养大量扩增CAR-T细胞并输回病人体内，CAR-T细胞特异性识别并杀伤带有特定抗原的肿瘤细胞并引发免疫反应从而达到治疗肿瘤的效果。
在CAR-T细胞治疗中，基因载体系统的构建具有举足轻重的作用，它关系到CAR在T细胞表面的表达效率，进而关系到CAR-T细胞治疗恶性肿瘤的效果。对于CAR-T构建来说，慢病毒是目前最常用的导入CAR基因的工具。优秀的慢病毒载体质粒是CAR-T细胞制备的关键环节之一，由于慢病毒载体质粒启动子的不同导致启动CAR基因表达的效率不同，甚至影响病毒转染T细胞的效率。CAR-T对慢病毒载体质粒同时表达多个基因提出了较高的要求，如除导入CAR基因外，CAR-T细胞内有时还需要导入自杀基因以建立风险控制机制，或者导入多个CAR针对多个肿瘤靶点防止肿瘤细胞逃逸，或者表达细胞因子以构建增强CAR-T等，因此含有多个启动子和酶切位点，组件丰富，易于改造，方便治疗载体构建的慢病毒载体亟待开发。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的是提供一种用于制备CAR-T的慢病毒载体及其构建方法和应用。
本发明为实现上述目的，通过以下技术方案实现：
一种用于制备CAR-T的慢病毒载体质粒，含有hPGK和hUbC双启动子；酶切位点充足，易于插入基因；含有T2A序列，T2A序列能使连接的两个基因同时表达；
所述酶切位点为XbaI、NdeI、SalI、BamHI、NsiI、PstI和KpnI；
其基因序列为SEQ ID NO：3。
优选的一种用于制备CAR-T的慢病毒载体质粒，慢病毒载体质粒携带并表达单个CAR基因、或多个CAR基因、或含有CAR基因与其他基因，所述的其他基因为细胞因子、趋化因子、自杀基因或筛选基因。
本发明还包括一种用于制备CAR-T的慢病毒载体质粒的构建方法，包括以下步骤：
①以Plenti PGK GFP Puro为起始载体，通过BamHI和KpnI酶切，切下含有hPGKpromoter、cPPT/CTS、RRE、5’-LTR、ori、Amp、3’-LTR组件的长片段Fragment 1，切胶回收，备用；
其中Fragment 1的基因序列为SEQ ID NO：1；
②合成基因片段Fragment 2，基因片段Fragment 2中含有以下酶切位点或组件：BamHI、SalI、2A、NdeI、XbaI、WPRE、hUbC、NsiI、PstI、NsiI和KpnI；
Fragment 2的基因序列为SEQ ID NO：2；
③BamHI和KpnI酶切Fragment 2，切胶回收，与步骤①的切胶回收产物连接，连接产物转化Stbl3感受态，涂布平板，挑取单菌落至LB培养基中，培养10～15小时；
④质粒小提，BamHI和KpnI酶切验证目的条带，目标条带的大小为1.947kb，质粒测序验证，得到慢病毒载体pLC，大小为7.967kb，pLC的基因序列为SEQ ID NO：3。
本发明还包括一种用于制备CAR-T的慢病毒载体质粒，在构建携带单个CAR基因的质粒中的应用。
本发明还包括一种用于制备CAR-T的慢病毒载体质粒，在构建携带多个CAR基因的质粒中的应用。
本发明还包括一种用于制备CAR-T的慢病毒载体质粒，在构建携带CAR基因和其它基因的质粒中的应用，其中其它基因为细胞因子、趋化因子、自杀基因或筛选基因。所述细胞因子如IL-2、IL-12、IL-7或IL-15等；所述趋化因子如CCL19等；所述自杀基因为iCasp9等；所述筛选基因为嘌呤霉素抗性基因、EGFP基因等。
本发明还包括一种用于制备CAR-T的慢病毒载体质粒，在制备用于CAR-T的慢病毒中的应用。
本发明还包括一种用于制备CAR-T的慢病毒载体质粒，在制备CAR-T细胞中的应用。
本发明相比现有技术具有以下优点：
本发明的用于制备CAR-T的慢病毒载体，含有hPGK或hUbC双启动子，T2A序列等，酶切位点充足，组件丰富，易于改造，方便载体的构建；本发明的用于制备CAR-T的慢病毒载体应用广泛，可用于构建单CAR及多CAR、表达自杀基因或筛选基因等，也可用于构建表达细胞因子的第四代CAR，能满足CAR-T中慢病毒载体质粒同时表达多个基因的要求；利用该慢病毒载体包装的慢病毒滴度高，利用该慢病毒载体质粒制备的慢病毒感染T细胞的效率高，并且制备的CAR-T细胞具有较大的杀伤力。
本发明的用于制备CAR-T的慢病毒载体的构建方法，流程少，步骤易实施。
附图说明
图1为Fragment 1的组成示意图；
图2为基因片段Fragment 2的组成示意图；
图3为慢病毒载体pLC的图谱示意图；
图4为慢病毒载体质粒pLC的构建过程示意图。
具体实施方式
本发明的目的是提供一种用于制备CAR-T的慢病毒载体及其构建方法和应用，通过以下技术方案实现：
一种用于制备CAR-T的慢病毒载体质粒的构建方法，如图4所示，包括以下步骤：①以Plenti PGK GFP Puro(W509-5)为起始载体，通过BamHI和KpnI酶切，切下含有hPGKpromoter、cPPT/CTS、RRE、5’-LTR、ori、Amp、3’-LTR组件的长片段Fragment 1，切胶回收，备用；Fragment 1的基因序列为SEQ ID NO：1；
如图1所示的Fragment 1，其中LTR、HIV-1ψ、RRE、cPPT/CTS为慢病毒载体质粒中的常见序列。AmpR为氨苄抗性基因，AmpRpromoter为氨苄抗性基因启动子，连同ori(复制起点)及lac promoter等为质粒常规组件；hPGK promoter指磷酸甘油酸激酶-1基因的启动子；
②合成基因片段Fragment 2，如图2所示，基因片段Fragment 2中含有以下酶切位点或组件：BamHI、SalI、T2A、NdeI、XbaI、WPRE、Promoter 2、NsiI、PstI、NsiI、KpnI；T2A序列编码2A肽，T2A序列连接2个基因，利用T2A序列的自剪切作用，可以实现两个基因的同时表达，Factor Xa site为常规组件，非必需，hUbC promoter为人聚泛素启动子-C；其中Fragment 2的基因序列为SEQ ID NO：2；
③BamHI和KpnI酶切Fragment 2，切胶回收，与步骤①的切胶回收产物连接，(连接方法参照T4DNAligase说明书所附方法)，连接产物转化Stbl3感受态，涂布平板，挑取单菌落至LB培养基中，培养10～15小时；
④质粒小提，BamHI和KpnI酶切验证目的条带，大小约为2kb，质粒测序验证，得到慢病毒载体pLC，大小约为8kb，pLC的基因序列为SEQ ID NO：3；
如图3所示的慢病毒载体pLC的图谱，该慢病毒载体pLC具有以下特征：
①双启动子结构，含hPGK及hUbC启动子；
②hPGK及hUbC两个启动子均适合启动CAR基因或者其他基因在T细胞中的表达；
③酶切位点充足(XbaI、NdeI、SalI、BamHI、NsiI、KpnI、PstI等)，易于插入基因；
④含T2A序列；该序列能够使其连接的两个基因同时表达。
一种用于制备CAR-T的慢病毒载体质粒，在构建携带单个CAR基因的质粒中的应用。
携带单个CAR基因的质粒的构建，步骤如下：
1、常规方法克隆或合成相应的CAR基因片段，该基因片段上游含有BamHI酶切位点，下游含有SalI酶切位点；
2、BamHI和SalI双酶切CAR基因片段；切胶回收；
3、BamHI和SalI双酶切质粒pLC；切胶回收；
4、常规方法连接上述切胶回收产物；
5、常规方法将连接产物转化stbl3感受态细胞；涂布LB培养基平板(氨苄青霉素抗性)；
6、挑取单克隆至LB培养基培养过夜；
7、小提质粒，BamHI和SalI双酶切结合凝胶电泳验证之；进一步质粒测序验证正确性；
8、质粒保存于-20℃，命名为pLC-CAR；该质粒中不含有其他基因(EGFP等)，以其为基础制备的慢病毒适用于临床试验。
一种用于制备CAR-T的慢病毒载体质粒，在构建携带两个或三个CAR基因的质粒中的应用。
携带两个CAR基因的质粒的构建，步骤如下：
1、常规方法克隆或合成CAR基因CAR-1；该基因片段上游含有BamHI酶切位点，下游含有SalI酶切位点；
2、BamHI和SalI双酶切CAR-1基因片段；切胶回收；
3、BamHI和SalI双酶切质粒pLC；切胶回收；
4、常规方法连接上述切胶回收产物；
5、常规方法将连接产物转化stbl3感受态细胞；涂布LB培养基平板(氨苄青霉素抗性)；
6、挑取单克隆至LB培养基培养过夜；
7、小提质粒，BamHI和SalI双酶切结合凝胶电泳验证之；进一步质粒测序验证正确性；正确质粒命名为pLC-CAR-1；
8、常规方法克隆或合成另外的CAR基因CAR-2；该基因片段上游含有NdeI酶切位点，下游含有XbaI酶切位点；
9、NdeI和XbaI双酶切CAR-2基因片段；切胶回收；
10、NdeI和XbaI双酶切pLC-CAR-1；切胶回收；
11、常规方法连接上述切胶回收产物；
12、常规方法将连接产物转化stbl3感受态细胞；涂布LB培养基平板(氨苄青霉素抗性)；
13、挑取单克隆至LB培养基培养过夜；
14、小提质粒，NdeI和XbaI双酶切结合凝胶电泳验证之；进一步质粒测序验证正确性；正确质粒命名为pLC-CAR-1-CAR-2；该质粒即携带CAR-1和CAR-2两个基因。
携带三个CAR基因的质粒的构建，步骤如下：
1、常规方法克隆或合成三个CAR基因CAR-1、CAR-2、CAR-3；其中CAR-1基因片段上游含有BamHI酶切位点，下游含有SalI酶切位点；CAR-2基因片段上游含有NdeI酶切位点，下游含有XbaI酶切位点；CAR-3基因片段上游含有PstI酶切位点，下游含有KpnI酶切位点；
2、携带CAR-1和CAR-2两个基因的质粒构建方法如上所示，得到质粒pLC-CAR-1-CAR-2。
3、PstI和KpnI双酶切CAR-3基因片段；切胶回收；
4、PstI和KpnI双酶切pLC-CAR-1-CAR-2质粒；切胶回收；
5、常规方法连接上述切胶回收产物；
6、常规方法将连接产物转化stbl3感受态细胞；涂布LB培养基平板(氨苄青霉素抗性)；
7、挑取单克隆至LB培养基培养过夜；
8、小提质粒，PstI和KpnI双酶切结合凝胶电泳验证之；进一步质粒测序验证正确性；得到携带三个CAR基因的质粒pLC-CAR-1-CAR-2-CAR-3。
一种用于制备CAR-T的慢病毒载体质粒，在构建携带CAR基因和其它基因的质粒中的应用，其中其它基因为细胞因子、趋化因子、自杀基因或筛选基因。所述细胞因子如IL-2、IL-12、IL-7或IL-15等；所述趋化因子如CCL19等；所述自杀基因为iCasp9等；所述筛选基因为嘌呤霉素抗性基因、EGFP基因等。
携带CAR及其他基因X的质粒的构建，步骤如下：
1、其他基因X在这里指细胞因子、趋化因子、自杀基因、筛选基因等；所述细胞因子如IL-2、IL-12、IL-7或IL-15等；所述趋化因子如CCL19等；所述自杀基因为iCasp9等；所述筛选基因为嘌呤霉素抗性基因、EGFP基因等。将这两个基因命名为X1、X2；
2、将X1基因克隆或全基因合成，上下游分别含有酶切位点NdeI和XbaI；
3、NdeI和XbaI双酶切X1基因片段；切胶回收；
4、NdeI和XbaI双酶切质粒pLC-CAR；切胶回收；
5、常规方法连接上述切胶回收产物；
6、常规方法将连接产物转化stbl3感受态细胞；涂布LB培养基平板(氨苄青霉素抗性)；
7、挑取单克隆至LB培养基培养过夜；
8、小提质粒，NdeI和XbaI双酶切结合凝胶电泳验证之；进一步质粒测序验证正确性；
9、质粒保存于-20℃或者-80℃，命名为pLC-CAR-X1；
10、将X2基因克隆或全基因合成，上下游分别含有酶切位点PstI和KpnI；
11、PstI和KpnI双酶切X2及pLC-CAR-X1；切胶回收；
12、常规方法连接切胶回收产物；
13、常规方法将连接产物转化stbl3感受态细胞；涂布LB培养基平板(氨苄青霉素抗性)；
14、挑取单克隆至LB培养基培养过夜；
15、小提质粒，PstI和KpnI双酶切结合凝胶电泳验证之；进一步质粒测序验证正确性；
16、质粒保存于-20℃或者-80℃，命名为pLC-CAR-X1-X2。
一种用于制备CAR-T的慢病毒载体质粒，在制备用于CAR-T的慢病毒中的应用
用于CAR-T的慢病毒的制备，包括以下步骤：
1、质粒大提
将上述构建的慢病毒质粒(以上制备的慢病毒质粒均可以)常规转化stbl3感受态，挑取单克隆至500ml锥形瓶(内含100mlLB培养基)，过夜培养，利用天根质粒大提试剂盒提取质粒，ddH2O洗脱质粒，Nanadrop测得质粒浓度大于1μg/μl；
2、病毒包装
(1)制备A液：取1.5ml EP管，加入opti-MEM 1.2ml，加入各质粒如下，votex 5-10s以彻底混匀。
质粒质量比：
psPAX2 7.5μg
pMD2.G 2.5μg
基于pLC构建的上述慢病毒质粒10μg；
(2)制备B液：取15ml离心管，加入opti-MEM 1.5ml，lipo200060μl加入opti-MEM中，涡旋振荡5-10s；
(3)将A液加入B液中，涡旋振荡5-10s，常温放置20min；
(4)293T准备：293T cells铺10cm plate，至293T cells融合度达到80％；
(5)将A、B混合液均匀滴在上述10cm plate中，静置3-5min，轻轻摇匀；37℃培养箱培养约60h；
(6)收集上清液，1000rpm离心10min，去除细胞碎片，0.45μm滤膜过滤；
(7)分装置于-80℃保存。
3、滴度测定
(1)病毒包装第二天(24小时)，准备24孔板，293T细胞5E+5/孔铺6个孔，待细胞覆盖50％左右时，分别加入5ul、10ul、20ul、50ul、100ul和200ul病毒悬液，37℃过夜培养，24小时观察荧光显色情况；
(2)测定前一天，使用293T贴壁细胞铺板，96孔板，每孔4×104个细胞，体积100μl；根据病毒的预期滴度，准备7-10个无菌的EP管,每管中加入90μl无血清培养基；取待测定的病毒原液10μl加入到第一个管中，混匀后，取10μl加入到第二个管中,继续相同的操作直到最后一管；
(3)滴度计算方法：第一个EP管中加入10μl病毒原液，记为1E+1μl；第二个EP管中进行了第一次十倍稀释，所得病毒原液为第一个EP中的1/10，记为1E+0μl；依次类推…第八个EP管中进行了第七次十倍稀释，记为1E-6μl；选取所需的细胞孔，弃去90μl培养基，加入90μl稀释好的病毒溶液，培养箱培养；24h后，加入完全培养基100μl，小心操作，不要吹起细胞；4天后，观察荧光表达情况，荧光细胞数随稀释倍数的增加而减少。病毒滴度＝荧光细胞数/病毒原液量。
(4)通常，病毒滴度可以达到1E+8(TU/ml)以上。
一种用于制备CAR-T的慢病毒载体质粒，在制备CAR-T细胞中的应用。
利用构建的慢病毒感染T细胞制备CAR-T细胞，包括以下步骤：
1、CD3阳性T细胞筛选
(1)收集PBMC细胞，计数板计数。
(2)将一定剂量(细胞数量决定)的分选磁珠加入细胞悬液中，等待片刻。
(3)将分选柱放于分选架上，用0.5ml缓冲液(PBS+0.5％BSA+0.5mM EDTA)冲洗分选柱。
(4)细胞悬液过柱，弃过柱液。
(5)将分选柱取下，用缓冲液将筛选的T细胞冲入培养瓶/皿中，加入完全培养基和IL-2培养。
2、T细胞活化
(1)T细胞计数，将5E+5/w T细胞加入24孔板。
(2)每孔加入anti-CD3300ng/ml，IL-2 100IU/ml。
(3)37℃培养6h或过夜培养。
3、RetroNectin包被培养板
(1)PBS稀释RetroNectin 4ug/ml，包被培养板2ug/cm2。
(2)将适量体积的RetroNectin加入培养板，室温2小时或4℃过夜。
24孔细胞培养板：0.5ml/孔；
6孔细胞培养板：2ml/孔；
(3)弃去RetroNectin，加适量体积的2％BSA的PBS终止，室温30min。
24孔细胞培养板：0.5ml/孔；
6孔细胞培养板：2ml/孔；
(4)弃去BSA溶液，用PBS洗板一次，弃去。
注：RetroNectin可以用封口膜封闭后，4℃保存一周。
4、慢病毒感染T细胞
Lenti转染T细胞
(1)将病毒按照一定的MOI值(10-100)加入RetroNectin包被的24孔板中，3000rpm32℃离心2h；
(2)将T细胞加入24孔板，细胞数不超过5E+5/孔，3000rpm 32℃离心2h；
(3)补充适量培养基(或不补充，最多不超过1ml)，加入IL-2 100IU/ml，polybrene(聚凝胺)8ug/ml；
(4)37℃培养，5％CO2培养。
5、CAR-T细胞扩增
加入适量X-vivo 15无血清培养基，IL-2 100IU/ml，隔天换液。
6、感染率测定
取1*105细胞，流式测定EGFP发光细胞数目的比率，以此来衡量CAR-T细胞的感染率。感染率通常在50％以上，可达到80％。
本发明中采用的切胶回收步骤均为分子生物学中常规的方法步骤。
合成基因片段Fragment 2为公司合成(生工生物工程(上海)股份有限公司)。
以下结合具体实施例来对本发明作进一步的描述。
实施例1
携带CD19-CAR基因的质粒的构建
构建步骤如下：
全基因合成CD19-CAR基因，上下游分别含有酶切位点BamHI和SalI；
基因序列为SED ID NO：4；
BamHI和SalI双酶切CD19-CAR基因片段，切胶回收；
BamHI和SalI双酶切质粒pLC，切胶回收；
使用常规方法连接上述切胶回收产物，将连接产物转化stbl3感受态细胞，涂布LB培养基平板(氨苄青霉素抗性)；挑取单克隆至LB培养基培养过夜；小提质粒，BamHI和SalI双酶切结合凝胶电泳验证，进一步质粒测序验证正确性；
将所得质粒保存于-20℃，命名为pLC-CD19CAR，该质粒中不含有其它基因(如EGFP等)，以其为基础的慢病毒可用于临床试验。
实施例2
构建携带CD19-CAR和EGFP的质粒
以Plenti PGK GFP Puro(W509-5)为模板，常规方法设计引物(引物上游含有NdeI酶切位点，下游具有XbaI酶切位点)，克隆EGFP基因；
上游引物：GATTATCATATGGAAGGTAGAGGTAGTCTCCTCACATGTGGCG；
下游引物：GATTATTCTAGATTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCG；
NdeI和XbaI双酶切EGFP基因片段和pLC-CD19CAR质粒；
切胶回收；
常规分子生物学方法连接切胶回收产物；
连接产物转化stbl13感受态细胞；
挑取单克隆至LB培养基培养过夜；
小提质粒，NdeI和XbaI酶切验证结合凝胶电泳验证：EGFP插入pLC-CD19CAR质粒中，所得质粒命名为pLC-CD19CAR-EGFP。该质粒中CAR基因和EGFP基因通过2A连接，通过EGFP可以监测CAR基因的表达情况，为常规实验研究提供方便。
实施例3
构建携带CD19-CAR、CD20-CAR、EGFP三个基因的质粒
全基因合成CD20-CAR基因，上游酶切位点PstI，下游酶切位点KpnI，基因序列为SEQ ID NO：5；
PstI和KpnI双酶切CD20-CAR基因片段和pLC-CD19CAR-EGFP质粒；
切胶回收；常规方法连接切胶回收产物；连接产物转化stbl3感受态细胞；挑取单克隆至LB培养基培养过夜；小提质粒，PstI和KpnI酶切验证结合凝胶电泳，测序验证，所得质粒命名为pLC-CD19CAR-EGFP-CD20CAR。
实施例4
构建携带CD19-CAR、IL-7、CCL19基因的质粒
全基因合成IL-7基因(Gene ID:3574)，上游酶切位点NdeI，下游酶切位点XbaI；
NdeI和XbaI双酶切IL-7基因片段和pLC-CD19CAR质粒；
切胶回收；
常规分子生物学方法连接切胶回收产物；
连接产物转化stbl3感受态细胞；
挑取单克隆至LB培养基培养过夜；
小提质粒，NdeI和XbaI酶切验证结合凝胶电泳验证：IL-7插入pLC-CD19CAR质粒中，所得质粒命名为pLC-CD19CAR-IL-7；
全基因合成CCR19基因(Gene ID:6363)，上游酶切位点PstI，下游酶切位点KpnI；
PstI和KpnI双酶切CCR19基因片段和pLC-CD19CAR-IL-7质粒；
切胶回收；
常规分子生物学方法连接切胶回收产物；
连接产物转化stbl3感受态细胞；
挑取单克隆至LB培养基培养过夜；
小提质粒，PstI和KpnI酶切验证结合凝胶电泳验证：CCR19插入pLC-CD19CAR-IL-7质粒中，所得质粒命名为pLC-CD19CAR-IL-7-CCR19。该质粒携带CD19-CAR、IL-7和CCL19等三个基因。
实施例5
构建携带CD19-CAR、EGFP及嘌呤霉素抗性基因的质粒
以Plenti PGK GFP Puro(W509-5)为模板，常规方法设计引物(引物上游具有PstI酶切位点，下游具有KpnI酶切位点)(请问引物是什么)，克隆嘌呤霉素N-乙酰转移酶编码基因Puro；
上游引物：GATTATCTGCAGATGACCGAGTACAAGCCCACGGTG；
下游引物：GATTATGGTACCTCAGGCACCGGGCTTGCGGGTC；
PstI和KpnI酶切Puro基因及pLC-CD19CAR-EGFP；切胶回收；常规方法连接切胶回收产物；连接产物转化stbl3感受态细胞；挑取单克隆至LB培养基培养过夜；小提质粒，PstI和KpnI酶切验证结合凝胶电泳，测序验证，所得质粒命名为pLC-CD19CAR-EGFP-Puro。
实施例6
制备携带CD19-CAR和EGFP基因的慢病毒
制备A液：取1.5mlEP管，加入opti-MEM 1.2ml，加入各质粒如下，涡旋振荡5～10s以彻底混匀，加入的质粒质量为：
psPAX2 7.5μg
pMD2.G 2.5μg
pLC-CD19CAR-EGFP 10μg
制备B液：取15ml离心管，加入opti-MEM 1.5ml，lipo200060μl加入opti-MEM中，涡旋振荡5-10s；
将A液加入B液中，涡旋振荡5-10s，常温放置20min；
293T准备：293T细胞铺10cm板子，至293T细胞融合度达到80％；
将A、B混合液均匀滴在上述10cm板中，静置3～5min，轻轻摇匀，37℃培养箱培养60小时左右；收集上清液，1000rpm离心10分钟，去除细胞碎片，0.45μm滤膜过滤，分装置于-80℃保存。
滴度测定
①病毒包装24小时后，准备24孔板，293T细胞5E+5/孔铺6个孔，待细胞覆盖50％左右时，分别加入5ul、10ul、20ul、50ul、100ul和200ul病毒悬液，37℃过夜培养，24小时观察荧光显色情况；
②测定前一天，使用293T贴壁细胞铺板，96孔板，每孔4×104个细胞，体积100μl，根据病毒的预期滴度，准备7～10个无菌EP管，每管中加入90μl无血清培养基，取待测定的病毒原液10μl加入到第一个管中，混匀后，取10μl加入到第二个管中，继续相同的操作直到最后一管；
③滴度计算方法：第一个EP管中加入10μl病毒原液，记为1E+1μl；第二个EP管中进行了第一次十倍稀释，所得病毒原液为第一个EP中的1/10，记为1E+0μl；以此类推……第八个EP管中进行了第七次十倍稀释，记为1E-6μl；选取所需的细胞孔，弃去90μl培养基，加入90μl稀释好的病毒溶液，培养箱培养24小时后，加入完全培养基100μl，小心操作，不要吹起细胞，4天后观察荧光表达情况，荧光细胞数随稀释倍数的增加而减少。
病毒滴度＝荧光细胞数/病毒原液量。
通常，病毒滴度可以达到1E+8(TU/ml)以上。
实施例7
CD19-CART细胞的制备
①CD3阳性T细胞筛选
收集PBMC细胞，计数板计数；将一定剂量的分选磁珠(美天旎公司，人CD3microbeads，orderNO.130-050-101)(每107细胞加入20ul microbeads)加入细胞悬液中，等待10～30秒；将分选柱放于分选架上，用0.5ml缓冲液(PBS+0.5％BSA+0.5mM EDTA)冲洗分选柱；细胞悬液过柱，弃过柱液；将分选柱取下，用缓冲液将筛选的T细胞冲入培养瓶/皿中，加入完全培养基和IL-2培养；
②T细胞活化
T细胞计数，将5E+5/wT细胞加入24孔板；每孔加入anti-CD3300ng/ml，IL-2100IU/ml；37℃培养6～12小时；
③RetroNectin包被培养板
PBS稀释RetroNectin 4ug/ml，包被培养板2μg/cm2；
将适量体积的RetroNectin加入培养板，室温2小时或4℃8～12小时；
24孔细胞培养板：0.5ml/孔；
6孔细胞培养板：2ml/孔；
弃去RetroNectin，加入适量体积的2％BSA的PBS终止，室温30分钟；
24孔细胞培养板：0.5ml/孔；
6孔细胞培养板：2ml/孔；
弃去BSA溶液，用PBS洗板一次，弃去上清；
(RetroNectin可以用封口膜封闭后，4℃保存一周)。
④慢病毒感染T细胞
Lenti转染T细胞
将病毒按照一定的MOI值(10～100)加入RetroNectin包被的24孔板中，3000rpm32℃离心2小时；将T细胞加入24孔板，细胞数不超过5E+5/孔，3000rpm 32℃离心2小时；补充适量培养基(或不补充，最多不超过1ml)，加入IL-2 100IU/ml，聚凝胺8μg/ml；37℃，5％CO2培养；
⑤CAR-T细胞扩增
加入适量X-vivo 15无血清培养基，IL-2 100IU/ml，隔天换液；
⑥感染率测定
取1*105个细胞，流式测定EGFP发光细胞数目的比率，以此来衡量CAR-T细胞的感染率，感染率一般在50％以上，最高达80％；
⑦细胞毒性试验
取Raji细胞和CD19-CART细胞，用培养基(1640+10％FBS)重悬，96孔板中加入Raji细胞4*104/孔，按照效靶比10:1加入CD19-CART细胞，CO2培养箱中培养24小时，利用7AAD和CD3流式抗体检测Raji细胞凋亡比率，经计算，在效靶比10:1的情况下，CD19-CART细胞对Raji细胞的杀伤率为76.4％。
序列表
<110> 山东大学第二医院
<120> 一种用于制备CAR-T 的慢病毒载体及其构建方法和应用
<141> 2019-04-25
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 6032
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggtaccttta agaccaatga cttacaaggc agctgtagat cttagccact ttttaaaaga 60
aaagggggga ctggaagggc tagctcactc ccaacgaaga caagatctgc tttttgcttg 120
tactgggtct ctctggttag accagatctg agcctgggag ctctctggct gcctagggaa 180
cccactgctt aagcctcaat aaagcttgcc ttgagtgctt caagtagtgt gtgcccgtct 240
gttgtgtgac tctggtaact agagatccct cagacccttt tagtcagtgt ggaaaatctc 300
tagcagtagt agttcatgtc atcttattat tcagtattta taacttgcaa agaaatgaat 360
atcagagagt gagaggaact tgtttattgc agcttataat ggttacaaat aaagcaatag 420
catcacaaat ttcacaaata aagcattttt ttcactgcat tctagttgtg gtttgtccaa 480
actcatcaat gtatcttatc atgtctggct ctagctatcc cgcccctaac tccgcccagt 540
tccgcccatt ctccgcccca tggctgacta atttttttta tttatgcaga ggccgaggcc 600
gcctcggcct ctgagctatt ccagaagtag tgaggaggct tttttggagg cctaggcttt 660
tgcgtcgaga cgtacccaat tcgccctata gtgagtcgta ttacgcgcgc tcactggccg 720
tcgttttaca acgtcgtgac tgggaaaacc ctggcgttac ccaacttaat cgccttgcag 780
cacatccccc tttcgccagc tggcgtaata gcgaagaggc ccgcaccgat cgcccttccc 840
aacagttgcg cagcctgaat ggcgaatggc gcgacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg 900
cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga ccgctacact tgccagcgcc ctagcgcccg 960
ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc 1020
taaatcgggg gctcccttta gggttccgat ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa 1080
aacttgatta gggtgatggt tcacgtagtg ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc 1140
ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata gtggactctt gttccaaact ggaacaacac 1200
tcaaccctat ctcggtctat tcttttgatt tataagggat tttgccgatt tcggcctatt 1260
ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgt 1320
ttacaatttc ccaggtggca cttttcgggg aaatgtgcgc ggaaccccta tttgtttatt 1380
tttctaaata cattcaaata tgtatccgct catgagacaa taaccctgat aaatgcttca 1440
ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat tcaacatttc cgtgtcgccc ttattccctt 1500
ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc tcacccagaa acgctggtga aagtaaaaga 1560
tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg ttacatcgaa ctggatctca acagcggtaa 1620
gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg ttttccaatg atgagcactt ttaaagttct 1680
gctatgtggc gcggtattat cccgtattga cgccgggcaa gagcaactcg gtcgccgcat 1740
acactattct cagaatgact tggttgagta ctcaccagtc acagaaaagc atcttacgga 1800
tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc tgccataacc atgagtgata acactgcggc 1860
caacttactt ctgacaacga tcggaggacc gaaggagcta accgcttttt tgcacaacat 1920
gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg ggaaccggag ctgaatgaag ccataccaaa 1980
cgacgagcgt gacaccacga tgcctgtagc aatggcaaca acgttgcgca aactattaac 2040
tggcgaacta cttactctag cttcccggca acaattaata gactggatgg aggcggataa 2100
agttgcagga ccacttctgc gctcggccct tccggctggc tggtttattg ctgataaatc 2160
tggagccggt gagcgtgggt ctcgcggtat cattgcagca ctggggccag atggtaagcc 2220
ctcccgtatc gtagttatct acacgacggg gagtcaggca actatggatg aacgaaatag 2280
acagatcgct gagataggtg cctcactgat taagcattgg taactgtcag accaagttta 2340
ctcatatata ctttagattg atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa 2400
gatccttttt gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc 2460
gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat 2520
ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga 2580
gctaccaact ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt 2640
ccttctagtg tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata 2700
cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac 2760
cgggttggac tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg 2820
ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg 2880
tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag 2940
cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct 3000
ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc 3060
aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt 3120
ttgctggcct tttgctcaca tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg 3180
tattaccgcc tttgagtgag ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga 3240
gtcagtgagc gaggaagcgg aagagcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg 3300
gccgattcat taatgcagct ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg 3360
caacgcaatt aatgtgagtt agctcactca ttaggcaccc caggctttac actttatgct 3420
tccggctcgt atgttgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagcta 3480
tgaccatgat tacgccaagc gcgcaattaa ccctcactaa agggaacaaa agctggagct 3540
gcaagcttaa tgtagtctta tgcaatactc ttgtagtctt gcaacatggt aacgatgagt 3600
tagcaacatg ccttacaagg agagaaaaag caccgtgcat gccgattggt ggaagtaagg 3660
tggtacgatc gtgccttatt aggaaggcaa cagacgggtc tgacatggat tggacgaacc 3720
actgaattgc cgcattgcag agatattgta tttaagtgcc tagctcgata caataaacgg 3780
gtctctctgg ttagaccaga tctgagcctg ggagctctct ggctaactag ggaacccact 3840
gcttaagcct caataaagct tgccttgagt gcttcaagta gtgtgtgccc gtctgttgtg 3900
tgactctggt aactagagat ccctcagacc cttttagtca gtgtggaaaa tctctagcag 3960
tggcgcccga acagggacct gaaagcgaaa gggaaaccag agctctctcg acgcaggact 4020
cggcttgctg aagcgcgcac ggcaagaggc gaggggcggc gactggtgag tacgccaaaa 4080
attttgacta gcggaggcta gaaggagaga gatgggtgcg agagcgtcag tattaagcgg 4140
gggagaatta gatcgcgatg ggaaaaaatt cggttaaggc cagggggaaa gaaaaaatat 4200
aaattaaaac atatagtatg ggcaagcagg gagctagaac gattcgcagt taatcctggc 4260
ctgttagaaa catcagaagg ctgtagacaa atactgggac agctacaacc atcccttcag 4320
acaggatcag aagaacttag atcattatat aatacagtag caaccctcta ttgtgtgcat 4380
caaaggatag agataaaaga caccaaggaa gctttagaca agatagagga agagcaaaac 4440
aaaagtaaga ccaccgcaca gcaagcggcc gctgatcttc agacctggag gaggagatat 4500
gagggacaat tggagaagtg aattatataa atataaagta gtaaaaattg aaccattagg 4560
agtagcaccc accaaggcaa agagaagagt ggtgcagaga gaaaaaagag cagtgggaat 4620
aggagctttg ttccttgggt tcttgggagc agcaggaagc actatgggcg cagcctcaat 4680
gacgctgacg gtacaggcca gacaattatt gtctggtata gtgcagcagc agaacaattt 4740
gctgagggct attgaggcgc aacagcatct gttgcaactc acagtctggg gcatcaagca 4800
gctccaggca agaatcctgg ctgtggaaag atacctaaag gatcaacagc tcctggggat 4860
ttggggttgc tctggaaaac tcatttgcac cactgctgtg ccttggaatg ctagttggag 4920
taataaatct ctggaacaga tttggaatca cacgacctgg atggagtggg acagagaaat 4980
taacaattac acaagcttaa tacactcctt aattgaagaa tcgcaaaacc agcaagaaaa 5040
gaatgaacaa gaattattgg aattagataa atgggcaagt ttgtggaatt ggtttaacat 5100
aacaaattgg ctgtggtata taaaattatt cataatgata gtaggaggct tggtaggttt 5160
aagaatagtt tttgctgtac tttctatagt gaatagagtt aggcagggat attcaccatt 5220
atcgtttcag acccacctcc caaccccgag gggacccgac aggcccgaag gaatagaaga 5280
agaaggtgga gagagagaca gagacagatc cattcgatta gtgaacggat ctcgacggta 5340
tcggttaact tttaaaagaa aaggggggat tggggggtac agtgcagggg aaagaatagt 5400
agacataata gcaacagaca tacaaactaa agaattacaa aaacaaatta caaaaattca 5460
aaattttatc gatcacgaga ctagcctcga gaagcttgat atcgaattcc cacggggttg 5520
gggttgcgcc ttttccaagg cagccctggg tttgcgcagg gacgcggctg ctctgggcgt 5580
ggttccggga aacgcagcgg cgccgaccct gggtctcgca cattcttcac gtccgttcgc 5640
agcgtcaccc ggatcttcgc cgctaccctt gtgggccccc cggcgacgct tcctgctccg 5700
cccctaagtc gggaaggttc cttgcggttc gcggcgtgcc ggacgtgaca aacggaagcc 5760
gcacgtctca ctagtaccct cgcagacgga cagcgccagg gagcaatggc agcgcgccga 5820
ccgcgatggg ctgtggccaa tagcggctgc tcagcggggc gcgccgagag cagcggccgg 5880
gaaggggcgg tgcgggaggc ggggtgtggg gcggtagtgt gggccctgtt cctgcccgcg 5940
cggtgttccg cattctgcaa gcctccggag cgcacgtcgg cagtcggctc cctcgttgac 6000
cgaatcaccg acctctctcc ccagggggat cc 6032
<210> 2
<211> 1947
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggatccgatt atgtcgacga aggtagaggt agtctcctca catgtggcga tgtagaagag 60
aaccctggtc cgcatatgtc tagaagcggc cgcaatcaac ctctggatta caaaatttgt 120
gaaagattga ctggtattct taactatgtt gctcctttta cgctatgtgg atacgctgct 180
ttaatgcctt tgtatcatgc tattgcttcc cgtatggctt tcattttctc ctccttgtat 240
aaatcctggt tgctgtctct ttatgaggag ttgtggcccg ttgtcaggca acgtggcgtg 300
gtgtgcactg tgtttgctga cgcaaccccc actggttggg gcattgccac cacctgtcag 360
ctcctttccg ggactttcgc tttccccctc cctattgcca cggcggaact catcgccgcc 420
tgccttgccc gctgctggac aggggctcgg ctgttgggca ctgacaattc cgtggtgttg 480
tcggggaagc tgacgtcctt tccatggctg ctcgcctgtg ttgccacctg gattctgcgc 540
gggacgtcct tctgctacgt cccttcggcc ctcaatccag cggaccttcc ttcccgcggc 600
ctgctgccgg ctctgcggcc tcttccgcgt cttcgccttc gccctcagac gagtcggatc 660
tccctttggg ccgcctcccc gcctggaatt ctaccgggtg cagcggcctc cgcgccgggt 720
tttggcgcct cccgcgggcg cccccctcct cacggcgagc gctgccacgt cagacgaagg 780
gcgcaggagc gttcctgatc cttccgcccg gacgctcagg acagcggccc gctgctcata 840
agactcggcc ttagaacccc agtatcagca gaaggacatt ttaggacggg acttgggtga 900
ctctagggca ctggttttct ttccagagag cggaacaggc gaggaaaagt agtcccttct 960
cggcgattct gcggagggat ctccgtgggg cggtgaacgc cgatgattat ataaggacgc 1020
gccgggtgtg gcacagctag ttccgtcgca gccgggattt gggtcgcggt tcttgtttgt 1080
ggatcgctgt gatcgtcact tggtgagttg cgggctgctg ggctggccgg ggctttcgtg 1140
gccgccgggc cgctcggtgg gacggaagcg tgtggagaga ccgccaaggg ctgtagtctg 1200
ggtccgcgag caaggttgcc ctgaactggg ggttgggggg agcgcacaaa atggcggctg 1260
ttcccgagtc ttgaatggaa gacgcttgta aggcgggctg tgaggtcgtt gaaacaaggt 1320
ggggggcatg gtgggcggca agaacccaag gtcttgaggc cttcgctaat gcgggaaagc 1380
tcttattcgg gtgagatggg ctggggcacc atctggggac cctgacgtga agtttgtcac 1440
tgactggaga actcgggttt gtcgtctggt tgcgggggcg gcagttatgc ggtgccgttg 1500
ggcagtgcac ccgtaccttt gggagcgcgc gcctcgtcgt gtcgtgacgt cacccgttct 1560
gttggcttat aatgcagggt ggggccacct gccggtaggt gtgcggtagg cttttctccg 1620
tcgcaggacg cagggttcgg gcctagggta ggctctcctg aatcgacagg cgccggacct 1680
ctggtgaggg gagggataag tgaggcgtca gtttctttgg tcggttttat gtacctatct 1740
tcttaagtag ctgaagctcc ggttttgaac tatgcgctcg gggttggcga gtgtgttttg 1800
tgaagttttt taggcacctt ttgaaatgta atcatttggg tcaatatgta attttcagtg 1860
ttagactagt aaagcttaaa ttgtccgcta aattctggcc gtttttggct tttttgttag 1920
acaatgcatc tgcagatgca tggtacc 1947
<210> 3
<211> 7967
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caggtggcac ttttcgggga aatgtgcgcg gaacccctat ttgtttattt ttctaaatac 60
attcaaatat gtatccgctc atgagacaat aaccctgata aatgcttcaa taatattgaa 120
aaaggaagag tatgagtatt caacatttcc gtgtcgccct tattcccttt tttgcggcat 180
tttgccttcc tgtttttgct cacccagaaa cgctggtgaa agtaaaagat gctgaagatc 240
agttgggtgc acgagtgggt tacatcgaac tggatctcaa cagcggtaag atccttgaga 300
gttttcgccc cgaagaacgt tttccaatga tgagcacttt taaagttctg ctatgtggcg 360
cggtattatc ccgtattgac gccgggcaag agcaactcgg tcgccgcata cactattctc 420
agaatgactt ggttgagtac tcaccagtca cagaaaagca tcttacggat ggcatgacag 480
taagagaatt atgcagtgct gccataacca tgagtgataa cactgcggcc aacttacttc 540
tgacaacgat cggaggaccg aaggagctaa ccgctttttt gcacaacatg ggggatcatg 600
taactcgcct tgatcgttgg gaaccggagc tgaatgaagc cataccaaac gacgagcgtg 660
acaccacgat gcctgtagca atggcaacaa cgttgcgcaa actattaact ggcgaactac 720
ttactctagc ttcccggcaa caattaatag actggatgga ggcggataaa gttgcaggac 780
cacttctgcg ctcggccctt ccggctggct ggtttattgc tgataaatct ggagccggtg 840
agcgtgggtc tcgcggtatc attgcagcac tggggccaga tggtaagccc tcccgtatcg 900
tagttatcta cacgacgggg agtcaggcaa ctatggatga acgaaataga cagatcgctg 960
agataggtgc ctcactgatt aagcattggt aactgtcaga ccaagtttac tcatatatac 1020
tttagattga tttaaaactt catttttaat ttaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg 1080
ataatctcat gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg 1140
tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc 1200
aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc 1260
tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtc cttctagtgt 1320
agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc 1380
taatcctgtt accagtggct gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact 1440
caagacgata gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac 1500
agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg aactgagata cctacagcgt gagctatgag 1560
aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg 1620
gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg 1680
tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga 1740
gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt 1800
ttgctcacat gttctttcct gcgttatccc ctgattctgt ggataaccgt attaccgcct 1860
ttgagtgagc tgataccgct cgccgcagcc gaacgaccga gcgcagcgag tcagtgagcg 1920
aggaagcgga agagcgccca atacgcaaac cgcctctccc cgcgcgttgg ccgattcatt 1980
aatgcagctg gcacgacagg tttcccgact ggaaagcggg cagtgagcgc aacgcaatta 2040
atgtgagtta gctcactcat taggcacccc aggctttaca ctttatgctt ccggctcgta 2100
tgttgtgtgg aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg aaacagctat gaccatgatt 2160
acgccaagcg cgcaattaac cctcactaaa gggaacaaaa gctggagctg caagcttaat 2220
gtagtcttat gcaatactct tgtagtcttg caacatggta acgatgagtt agcaacatgc 2280
cttacaagga gagaaaaagc accgtgcatg ccgattggtg gaagtaaggt ggtacgatcg 2340
tgccttatta ggaaggcaac agacgggtct gacatggatt ggacgaacca ctgaattgcc 2400
gcattgcaga gatattgtat ttaagtgcct agctcgatac aataaacggg tctctctggt 2460
tagaccagat ctgagcctgg gagctctctg gctaactagg gaacccactg cttaagcctc 2520
aataaagctt gccttgagtg cttcaagtag tgtgtgcccg tctgttgtgt gactctggta 2580
actagagatc cctcagaccc ttttagtcag tgtggaaaat ctctagcagt ggcgcccgaa 2640
cagggacctg aaagcgaaag ggaaaccaga gctctctcga cgcaggactc ggcttgctga 2700
agcgcgcacg gcaagaggcg aggggcggcg actggtgagt acgccaaaaa ttttgactag 2760
cggaggctag aaggagagag atgggtgcga gagcgtcagt attaagcggg ggagaattag 2820
atcgcgatgg gaaaaaattc ggttaaggcc agggggaaag aaaaaatata aattaaaaca 2880
tatagtatgg gcaagcaggg agctagaacg attcgcagtt aatcctggcc tgttagaaac 2940
atcagaaggc tgtagacaaa tactgggaca gctacaacca tcccttcaga caggatcaga 3000
agaacttaga tcattatata atacagtagc aaccctctat tgtgtgcatc aaaggataga 3060
gataaaagac accaaggaag ctttagacaa gatagaggaa gagcaaaaca aaagtaagac 3120
caccgcacag caagcggccg ctgatcttca gacctggagg aggagatatg agggacaatt 3180
ggagaagtga attatataaa tataaagtag taaaaattga accattagga gtagcaccca 3240
ccaaggcaaa gagaagagtg gtgcagagag aaaaaagagc agtgggaata ggagctttgt 3300
tccttgggtt cttgggagca gcaggaagca ctatgggcgc agcctcaatg acgctgacgg 3360
tacaggccag acaattattg tctggtatag tgcagcagca gaacaatttg ctgagggcta 3420
ttgaggcgca acagcatctg ttgcaactca cagtctgggg catcaagcag ctccaggcaa 3480
gaatcctggc tgtggaaaga tacctaaagg atcaacagct cctggggatt tggggttgct 3540
ctggaaaact catttgcacc actgctgtgc cttggaatgc tagttggagt aataaatctc 3600
tggaacagat ttggaatcac acgacctgga tggagtggga cagagaaatt aacaattaca 3660
caagcttaat acactcctta attgaagaat cgcaaaacca gcaagaaaag aatgaacaag 3720
aattattgga attagataaa tgggcaagtt tgtggaattg gtttaacata acaaattggc 3780
tgtggtatat aaaattattc ataatgatag taggaggctt ggtaggttta agaatagttt 3840
ttgctgtact ttctatagtg aatagagtta ggcagggata ttcaccatta tcgtttcaga 3900
cccacctccc aaccccgagg ggacccgaca ggcccgaagg aatagaagaa gaaggtggag 3960
agagagacag agacagatcc attcgattag tgaacggatc tcgacggtat cggttaactt 4020
ttaaaagaaa aggggggatt ggggggtaca gtgcagggga aagaatagta gacataatag 4080
caacagacat acaaactaaa gaattacaaa aacaaattac aaaaattcaa aattttatcg 4140
atcacgagac tagcctcgag aagcttgata tcgaattccc acggggttgg ggttgcgcct 4200
tttccaaggc agccctgggt ttgcgcaggg acgcggctgc tctgggcgtg gttccgggaa 4260
acgcagcggc gccgaccctg ggtctcgcac attcttcacg tccgttcgca gcgtcacccg 4320
gatcttcgcc gctacccttg tgggcccccc ggcgacgctt cctgctccgc ccctaagtcg 4380
ggaaggttcc ttgcggttcg cggcgtgccg gacgtgacaa acggaagccg cacgtctcac 4440
tagtaccctc gcagacggac agcgccaggg agcaatggca gcgcgccgac cgcgatgggc 4500
tgtggccaat agcggctgct cagcggggcg cgccgagagc agcggccggg aaggggcggt 4560
gcgggaggcg gggtgtgggg cggtagtgtg ggccctgttc ctgcccgcgc ggtgttccgc 4620
attctgcaag cctccggagc gcacgtcggc agtcggctcc ctcgttgacc gaatcaccga 4680
cctctctccc cagggggatc cgattatgtc gacgaaggta gaggtagtct cctcacatgt 4740
ggcgatgtag aagagaaccc tggtccgcat atgtctagaa gcggccgcaa tcaacctctg 4800
gattacaaaa tttgtgaaag attgactggt attcttaact atgttgctcc ttttacgcta 4860
tgtggatacg ctgctttaat gcctttgtat catgctattg cttcccgtat ggctttcatt 4920
ttctcctcct tgtataaatc ctggttgctg tctctttatg aggagttgtg gcccgttgtc 4980
aggcaacgtg gcgtggtgtg cactgtgttt gctgacgcaa cccccactgg ttggggcatt 5040
gccaccacct gtcagctcct ttccgggact ttcgctttcc ccctccctat tgccacggcg 5100
gaactcatcg ccgcctgcct tgcccgctgc tggacagggg ctcggctgtt gggcactgac 5160
aattccgtgg tgttgtcggg gaagctgacg tcctttccat ggctgctcgc ctgtgttgcc 5220
acctggattc tgcgcgggac gtccttctgc tacgtccctt cggccctcaa tccagcggac 5280
cttccttccc gcggcctgct gccggctctg cggcctcttc cgcgtcttcg ccttcgccct 5340
cagacgagtc ggatctccct ttgggccgcc tccccgcctg gaattctacc gggtgcagcg 5400
gcctccgcgc cgggttttgg cgcctcccgc gggcgccccc ctcctcacgg cgagcgctgc 5460
cacgtcagac gaagggcgca ggagcgttcc tgatccttcc gcccggacgc tcaggacagc 5520
ggcccgctgc tcataagact cggccttaga accccagtat cagcagaagg acattttagg 5580
acgggacttg ggtgactcta gggcactggt tttctttcca gagagcggaa caggcgagga 5640
aaagtagtcc cttctcggcg attctgcgga gggatctccg tggggcggtg aacgccgatg 5700
attatataag gacgcgccgg gtgtggcaca gctagttccg tcgcagccgg gatttgggtc 5760
gcggttcttg tttgtggatc gctgtgatcg tcacttggtg agttgcgggc tgctgggctg 5820
gccggggctt tcgtggccgc cgggccgctc ggtgggacgg aagcgtgtgg agagaccgcc 5880
aagggctgta gtctgggtcc gcgagcaagg ttgccctgaa ctgggggttg gggggagcgc 5940
acaaaatggc ggctgttccc gagtcttgaa tggaagacgc ttgtaaggcg ggctgtgagg 6000
tcgttgaaac aaggtggggg gcatggtggg cggcaagaac ccaaggtctt gaggccttcg 6060
ctaatgcggg aaagctctta ttcgggtgag atgggctggg gcaccatctg gggaccctga 6120
cgtgaagttt gtcactgact ggagaactcg ggtttgtcgt ctggttgcgg gggcggcagt 6180
tatgcggtgc cgttgggcag tgcacccgta cctttgggag cgcgcgcctc gtcgtgtcgt 6240
gacgtcaccc gttctgttgg cttataatgc agggtggggc cacctgccgg taggtgtgcg 6300
gtaggctttt ctccgtcgca ggacgcaggg ttcgggccta gggtaggctc tcctgaatcg 6360
acaggcgccg gacctctggt gaggggaggg ataagtgagg cgtcagtttc tttggtcggt 6420
tttatgtacc tatcttctta agtagctgaa gctccggttt tgaactatgc gctcggggtt 6480
ggcgagtgtg ttttgtgaag ttttttaggc accttttgaa atgtaatcat ttgggtcaat 6540
atgtaatttt cagtgttaga ctagtaaagc ttaaattgtc cgctaaattc tggccgtttt 6600
tggctttttt gttagacaat gcatctgcag atgcatggta cctttaagac caatgactta 6660
caaggcagct gtagatctta gccacttttt aaaagaaaag gggggactgg aagggctagc 6720
tcactcccaa cgaagacaag atctgctttt tgcttgtact gggtctctct ggttagacca 6780
gatctgagcc tgggagctct ctggctgcct agggaaccca ctgcttaagc ctcaataaag 6840
cttgccttga gtgcttcaag tagtgtgtgc ccgtctgttg tgtgactctg gtaactagag 6900
atccctcaga cccttttagt cagtgtggaa aatctctagc agtagtagtt catgtcatct 6960
tattattcag tatttataac ttgcaaagaa atgaatatca gagagtgaga ggaacttgtt 7020
tattgcagct tataatggtt acaaataaag caatagcatc acaaatttca caaataaagc 7080
atttttttca ctgcattcta gttgtggttt gtccaaactc atcaatgtat cttatcatgt 7140
ctggctctag ctatcccgcc cctaactccg cccagttccg cccattctcc gccccatggc 7200
tgactaattt tttttattta tgcagaggcc gaggccgcct cggcctctga gctattccag 7260
aagtagtgag gaggcttttt tggaggccta ggcttttgcg tcgagacgta cccaattcgc 7320
cctatagtga gtcgtattac gcgcgctcac tggccgtcgt tttacaacgt cgtgactggg 7380
aaaaccctgg cgttacccaa cttaatcgcc ttgcagcaca tccccctttc gccagctggc 7440
gtaatagcga agaggcccgc accgatcgcc cttcccaaca gttgcgcagc ctgaatggcg 7500
aatggcgcga cgcgccctgt agcggcgcat taagcgcggc gggtgtggtg gttacgcgca 7560
gcgtgaccgc tacacttgcc agcgccctag cgcccgctcc tttcgctttc ttcccttcct 7620
ttctcgccac gttcgccggc tttccccgtc aagctctaaa tcgggggctc cctttagggt 7680
tccgatttag tgctttacgg cacctcgacc ccaaaaaact tgattagggt gatggttcac 7740
gtagtgggcc atcgccctga tagacggttt ttcgcccttt gacgttggag tccacgttct 7800
ttaatagtgg actcttgttc caaactggaa caacactcaa ccctatctcg gtctattctt 7860
ttgatttata agggattttg ccgatttcgg cctattggtt aaaaaatgag ctgatttaac 7920
aaaaatttaa cgcgaatttt aacaaaatat taacgtttac aatttcc 7967
<210> 4
<211> 1758
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggatccatgc ttctcctggt gacaagcctt ctgctctgtg agttaccaca cccagcattc 60
ctcgacatcc agatgacaca gactacatcc tccctgtctg cctctctggg agacagagtc 120
accaagagtt gcagggcaag tcaggacatt agtaaatatt taaattggta tcagcagaaa 180
ccagatggaa ctgttaaact cctgatctac catacatcaa gattacactc aggagtccca 240
tcaaggttca gtggcagtgg gtctggaaca gattattctc tcaccattag caacctggag 300
caagaagata ttgccactta cttttgccaa cagggtaata cgcttccgta cacgttcgga 360
ggggggacta agttggaaat aacacgggct gatgctgcac caactgtatc catcttccca 420
ccatccagta atggctctac ctccggctcc ggcaagcccg gctccggcga gggctccacc 480
aagggcaggg tgaaactgca ggagtcagga cctggcctgg tggcgccctc acagagcctg 540
tccgtcacat gcactgtctc aggggtctca ttacccgact atggtgtaag ctggattcgc 600
cagcctccac gaaagggtct ggagtggctg ggagtaatat ggggtagtga aaccacatac 660
tataattcag ctctcaaatc cagactgacc atcatcaagg acaactccaa gagccaagtt 720
ttcttaaaaa tgaacaggct gcaaactggt gacacagcca tttactactg tgccaaacat 780
tattactacg gtggtagcta tgctatggac tactggggtc aaggaacctc agtcaccgtc 840
tcctcaattg aagttatgta tcctcctcct tacctagaca atgagaagag caatggaacc 900
attatccatg tgaaagggaa acacctttgt ccaagtcccc tatttcccgg accttctaag 960
cccttttggg tgctggtggt ggttggtgga gtcctggctt gctatagctt gctagtaaca 1020
gtggccttta ttattttctg ggtgaggacg aagaggagca ggctcctgca cagtgactac 1080
atgaacatga ctccccgccg ccccgggccc acccgcaagc attaccagcc cgccccacca 1140
cgcttcgcag cctatcgatc cttctctgtt gttaaacggg gcagaaagaa actcctgtat 1200
atattcaaac aaccatttat gagaccagta caaactactc aagaggaaga tggctgtagc 1260
tgccgatttc cagaagaaga agaaggaggc cgtgaactgc ggagggacca gaggctgccc 1320
cccgatgccc acaagccccc tgggggaggc agtttccgga cccccatcca agaggagcag 1380
gccgacgccc actccaccct ggccaagatc agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc 1440
cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc tataacgagc tcaatctagg acgaagagag 1500
gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc cgggaccctg agatgggggg aaagccgcag 1560
agaaggaaga accctcagga aggcctgtac aatgaactgc agaaagataa gatggcggag 1620
gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt 1680
taccagggtc tcagtacagc caccaaggac acctacgacg cccttcacat gcaggccctg 1740
ccccctcgct aagtcgac 1758
<210> 5
<211> 1460
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctgcagatgc ttctcctggt gacaagcctt ctgctctgtg agttaccaca cccagcattc 60
ctcgaccaga ttgtgctgag ccagagcccg gcgattctga gcgcgagccc gggcgaaaaa 120
gtgaccatga cctgccgcgc gagcagcagc ctgagcttta tgcattggta tcagggcgtg 180
ccggcgcgct ttagcggcag cggcagcggc accagctata gcctgaccat tagccgcgtg 240
gaagcggaag atgcggcgac ctatttttgc catcagtgga gcagcaaccc gctgaccttt 300
ggcgcgggca ccaaactgga actgaaacgc ggcggcggcg gcagccaggt gcagctgcgc 360
cagccgggcg cggaactggt gaaaccgggc gcgagcgtga aaatgagctg caaagcgagc 420
ggctatacct ttaccagcta taacatgcat tgggtgaaac agaccccggg ccagggcctg 480
gaatggattg gcgcgattta tccgggcaac ggcgatacca gctataacca gaaatttaaa 540
ggcaaagcga ccctgaccgc ggataaaagc agcagcaccg cgtatatgca gctgagcagc 600
ctgaccagcg aagatagcgc ggtgtattat tgcgcgcgca gccattatgg cagcaactat 660
gtggattatt ttgattattg gggccagggc accaccctga ccgtgagcag cgaattcatt 720
gaagttatgt atcctcctta cctagacaat gagaagagca atggaaccat tatccatgtg 780
aaagggaaac acctttgtcc aagtccccta tttcccggac cttctaagcc cttttgggtg 840
ctggtggtgg ttggtggagt cctggcttgc tatagcttgc tagtaacagt ggcctttatt 900
attttctggg tgaggagtaa gaggagcagg ctcctgcaca gtgactacat gaacatgact 960
ccccgccgcc cgggcccacc cgcaagcatt accagcccta tgccccacca cgcgacttcg 1020
cagcctatcg ctccttctct gttgttaaac ggggcagaaa gaaactcctg tatatattca 1080
aacaaccatt tatgagacca gtacaaacta ctcaagagga agatggctgt agctgccgat 1140
ttccagaaga agaagaagga ggatgtgaac tgagagtgaa gttcagcagg agcgcagacg 1200
cccccgcgta ccagcagggc cagaaccagc tctataacga gctcaatcta ggacgaagag 1260
aggagtacga tgtttagaac cctcaggaag gcctgtacaa tgaaaaagat aagatggcgg 1320
aggcctacag tgagattggg atgaaaggcg agcgccggag gggcaagggg cacgatggcc 1380
tttaccaggg tctcagtaca gccaccaagg acacctacga cgcccttcac atgcaggccc 1440
tgccccctcg ctaaggtacc 1460

Claims (8)

1.一种用于制备CAR-T的慢病毒载体质粒，其特征在于：含有hPGK和hUbC双启动子；含有T2A序列，T2A序列能使连接的两个基因同时表达；
酶切位点为XbaI、NdeI、SalI、BamHI、NsiI、PstI和KpnI；
所述用于制备 CAR-T 的慢病毒载体质粒的基因序列为 SEQ ID NO：3。
2.权利要求1的一种用于制备CAR-T的慢病毒载体质粒，其特征在于：在双启动子及T2A序列的作用下，慢病毒载体质粒能够最多同时表达3个基因；该慢病毒载体质粒中携带并表达单个CAR基因、或多个CAR基因或含有CAR基因与其他基因，所述的其他基因为细胞因子、趋化因子、自杀基因或筛选基因。
3.权利要求1的一种用于制备CAR-T的慢病毒载体质粒的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
以Plenti PGK GFP Puro为起始载体，通过BamHI和KpnI酶切，切下含有hPGKpromoter、cPPT/CTS、RRE、5’-LTR、ori、Amp、3’-LTR组件的长片段Fragment 1，切胶回收，备用；
其中Fragment 1的基因序列为SEQ ID NO：1；
Figure DEST_PATH_IMAGE004
合成基因片段Fragment 2，基因片段Fragment 2中含有以下酶切位点或组件：BamHI、SalI、2A、NdeI、XbaI、WPRE、hUbC、NsiI、PstI、NsiI和KpnI；
Fragment 2的基因序列为SEQ ID NO：2；
Figure DEST_PATH_IMAGE006
BamHI和KpnI酶切Fragment 2，切胶回收，与步骤
Figure 177807DEST_PATH_IMAGE002
的切胶回收产物连接，连接产物转化Stbl3感受态，涂布平板，挑取单菌落至LB培养基中，培养10~15小时；
Figure DEST_PATH_IMAGE008
质粒小提，BamHI和KpnI酶切验证目的条带，大小为1.947kb，质粒测序验证，得到慢病毒载体pLC，大小为7.967 kb，pLC的基因序列为SEQ ID NO：3。
4.权利要求1的一种用于制备CAR-T的慢病毒载体质粒的应用，其特征在于：在构建携带单个CAR基因的质粒中的应用。
5.权利要求1的一种用于制备CAR-T的慢病毒载体质粒的应用，其特征在于：在构建携带多个CAR基因的质粒中的应用。
6.权利要求1的一种用于制备CAR-T的慢病毒载体质粒的应用，其特征在于：在构建携带CAR基因和其它基因的质粒中的应用，其中其它基因为细胞因子、趋化因子、自杀基因或筛选基因。
7.权利要求1的一种用于制备CAR-T的慢病毒载体质粒的应用，其特征在于：在制备用于CAR-T的慢病毒中的应用。
8.权利要求1的一种用于制备CAR-T的慢病毒载体质粒的应用，其特征在于：在制备CAR-T细胞中的应用。
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