RU2783430C1

RU2783430C1 - Минигеномная система вируса Пуумала для оценки противовирусной активности ингибиторов РНК-зависимой РНК-полимеразы

Info

Publication number: RU2783430C1
Application number: RU2022106953A
Authority: RU
Inventors: Антон Евгеньевич Тишин; Ильназ Рамисович Иматдинов; Алмаз Рамисович Иматдинов; Елена Юрьевна Прудникова; Олег Викторович Пьянков; Елена Васильевна Гаврилова; Ринат Амирович Максютов
Filing date: 2022-03-16
Publication date: 2022-11-14

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии. Описана минигеномная система вируса Пуумала для оценки противовирусной активности ингибиторов РНК-зависимой РНК-полимеразы, включающая рекомбинантные плазмиды nStem-IRES-PUUV_L, nStem-IRES-PUUV_N, nStem-PUUV_S_DsRed, обеспечивающие экспрессию искусственных генов за счет промотора бактериофага Т7, а также за счет внутреннего сайта посадки рибосом вируса энцефаломиелита (IRES). Изобретение позволяет воссоздать репликативную машинерию вируса Пуумала in vitro. Рекомбинантные плазмиды nStem-IRES-PUUV_L, nStem-IRES-PUUV_N предназначены для внутриклеточного синтеза вирусных белков, составляющих репликативную машинерию вируса Пуумала. Рекомбинантная плазмида nStem-PUUV_S_DsRed предназначена для оценки функциональной активности минигеномной системы. Изобретение расширяет арсенал инструментов для исследования вируса Пуумала, позволяя проводить скрининг ингибиторов РНК-зависимой РНК-полимеразы, направлено модифицировать сегменты вирусного генома для функционального изучения доменов вирусных белков, а также для прототипирования рекомбинантных вакцин с контролируемым циклом репликации. 7 ил., 3 пр.

Description

Изобретение относится к минигеномной системе вируса Пуумала для оценки противовирусной активности ингибиторов РНК-зависимой РНК-полимеразы, включающей рекомбинантные плазмиды nStem-IRES-PUUV_L, nStem-IRES-PUUV_N, nStem-PUUV_S_DsRed, обеспечивающим экспрессию искусственных генов за счет промотора бактериофага Т7, а также за счет внутреннего сайта посадки рибосом вируса энцефаломиелита (IRES), что позволяет воссоздать репликативную машинерию вируса Пуумала in vitro. Данное изобретение может быть использовано в биотехнологии, молекулярной биологии, генетической инженерии и медицине.

Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС) - острая вирусная зооантропонозная инфекция, вызываемая представителями рода хантавирусов (Orthohantavirus), широко представленными по всему миру. Заболевание характеризуется лихорадкой и грипп-подобными симптомами, острой почечной недостаточностью и геморрагической гемостазиопатией в тяжелых случаях. На территории России встречаются пять вирусов, приводящих к ГЛПС: Пуумала, Хантаан, Амур, Добрава/Белград и Сеул. На территории РФ ежегодно регистрируется 7-9 тысяч случаев ГЛПС возбудителем более 90% из них является вирус Пуумала (PUUV). PUUV представляет собой оболочечный вирус с сегментированным одноцепочечным РНК-геномом с отрицательным смыслом. Геном вируса имеет три сегмента. Большой L-сегмент кодирует вирусную РНК-зависимою РНК-полимеразу (RdRp), средний М-сегмент кодирует два поверхностных гликопротеина (Gn) и (Gc), и малый S-сегмент кодирует белок нуклеокапсида (N) [1].

Естественным резервуаром PUUV является рыжая полевка Myodes glareolus, семейства Cricetidae, которая широко распространена на территории Российской Федерации (РФ) [2]. С периодичностью в 4-5 лет происходит рост числа зараженных связанный с естественными изменениями численности популяции грызуна-переносчика [3]. Люди инфицируются в большинстве случаев после прямого контакта с инфицированными грызунами или их экскрементами, зачастую при вдыхании аэрозоля, зараженного вирусом. Передача PUUV от человека к человеку не наблюдалась. PUUV является труднокультивируемым, поэтому существует сложность в выращивании этого патогена в клеточной культуре до высоких титров.

На сегодняшний день в мире существует ряд вакцинных препаратов, направленных на специфическую профилактику ГЛПС. Все эти препараты относятся к классу инактивированных вакцин, их использование одобрено в Китае, Южной и Северной Корее [4]. Препараты, производимые в этих странах разработаны на основе вирусов Хантаан и Сеул, и не способствуют формированию протективного иммунного ответа против PUUV [5]. Работа с представителями рода Orthohantavirus и производство хантавирусных инактивированных вакцин сопряжено с созданием лабораторий и производств высокого уровня биобезопасности BSL-3, что значительно снижает, исследовательские возможности и возможности технологического масштабирования производства вакцинных препаратов.

Заявляемая минигеномная система позволяет проводить работы в лабораториях с уровнем биобезопасности BSL-2 и BSL-1. Изобретение расширяет арсенал инструментов для исследования вируса Пуумала, позволяя проводить скрининг ингибиторов РНК-зависимой РНК-полимеразы, направлено модифицировать сегменты вирусного генома для функционального изучения доменов вирусных белков, а также для прототипирования рекомбинантных вакцин с контролируемым циклом репликации.

Известно решение по патенту (RU2221869C2, МПК C12N 15/63, опубл. 20.10.2004) [6], где был предложен вариант рекомбинантной плазмиды с промотором SP-6, обеспечивающий синтез РНК-копии S-сегмента вируса Хантаан для положительного контроля для диагностики возбудителя геморрагической лихорадки с почечным синдромом. Получение вирусной РНК достигалось трансформацией E. Coli штамма XL-2Blue плазмидой pSP64-S, содержащей кДНК-копию S-сегмента вируса Хантаан.

Известно решение по патенту (WO2014158123A1, МПК A61K39/12, опубл. 02.10.2014) [7], где был предложен вариант бивалентной ДНК-вакцины на основе M-сегмента вируса Хантаан и M-сегмента вируса Пуумала. Полученный результат достигался созданием рекомбинантных плазмид несущих кДНК копии вирусных сегментов в плазмидном векторе pWRG.

Наиболее близким аналогом (прототипом) является решение по международной заявке РСТ (WO2020123989, МПК А61К 39/12, опубл. 18.06.2020 г.) [8], где был предложен вариант репликонных вирусных частиц вируса ККГЛ, содержащих все вирусные белки, S- и L-сегменты генома, но не содержащих полноразмерного М-сегмента. Получение вирусных частиц на культуре клеток достигалось путем трансфекции плазмидами pCAGGS, содержащие все три рамки считывания, и минигеномными плазмидами рТ7, содержащие полноразмерные S- и L-сегменты.

Системы получения вирусоподобных частиц не описаны для вируса Пуумала ввиду сложностей его культивирования. Также не описаны минигеномные системы вируса Пуумала.

Недостатками аналогов по патенту RU2221869C2 и межд. заявке WO2014158123A1 является невозможность проведения исследований внутриклеточного взаимодействия вирусных белков in vitro. Недостатком наиболее близкого аналога (прототипа) по межд. заявке WO2020123989 является использование дополнительных плазмид или вирусного вектора, которые бы обеспечивали продукцию вирусных гликопротеинов, что может повлечь снижение эффективности трансфекции. Кроме того, это решение не может эффективно использовано для вируса Пуумала, т.к. не позволит проводить наработки вирусных частиц.

Таким образом, из анализа уровня техники видно, что существует потребность в разработке новых подходов и систем для фундаментальных исследований вируса Пуумала, для разработки кандидатных вакцинных препаратов и поиска эффективных терапевтических препаратов.

Раскрытие изобретения

Техническим результатом заявленного изобретения является создание функциональной минигеномной системы, воссоздающей работу репликативной машинерии вируса Пуумала и используемой для оценки противовирусной активности ингибиторов РНК-зависимой РНК-полимеразы.

Указанный технический результат достигается тем, что минигеномная система вируса Пуумала для оценки противовирусной активности ингибиторов РНК-зависимой РНК-полимеразы включает рекомбинантные плазмиды nStem-IRES-PUUV_L, nStem-IRES-PUUV_N, nStem-PUUV_S_DsRed и характеризуется тем, что:

- рекомбинантная плазмида nStem-IRES-PUUV_L, предназначенная для внутриклеточного синтеза вирусного белка РНК-зависимой РНК-полимеразы, имеющая нуклеотидную последовательность SEQ NO:1 размером 9996 п.н., содержащая в соответствии с физической и генетической картой, представленной на фиг 1., ген, кодирующий РНК-зависимую РНК-полимеразу вируса Пуумала и состоящая из следующих элементов:

• ген β-лактамазы (координаты с 7983 по 8843 п.н.) под контролем промотора (координаты с 7878 по 7982 п.н.), в качестве генетического маркера, определяющего устойчивость к ампициллину клеток бактерии E.coli;

• ORI (origin of replication) - точка начала репликации плазмидного вектора nStem (координаты с 9014 по 9602 п.н.);

• Т7 promoter - нуклеотидная последовательность промотора бактериофага Т7, необходимая для in vitro транскрипции (координаты с 9 по 32 п.н.);

• Т7 terminator - нуклеотидная последовательность терминатора бактериофага Т7 необходим для in vitro транскрипции (координаты с 7769 по 7816 п.н.);

• L protein (RdRp) - открытая рамка считывания гена РНК-зависимой РНК-полимеразы вируса Пуумала (координаты с 623 по 7093 п.н.);

• IRES - внутренний сайт посадки рибосом вируса энцефаломиелита, обеспечивающий экспрессию гена (координаты с 45 по 619 п.н.);

• SV40 poly(A) signal - сигнал полиаденелирования (координаты с 9841 по 9975 п.н.);

• WPRE - посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурка, необходимый для увеличения уровня экспрессии белка (координаты с 7135 по 7723 п.н.).

• RdRp - открытая рамка считывания гена RdRp (РНК-зависимая РНК-полимераза) вируса Пуумала (координаты с 623 по 7093 п.н.);

- рекомбинантная плазмида nStem-IRES-PUUV_N, предназначенная для внутриклеточного синтеза вирусного белка нуклеопротеина, имеющая последовательность SEQ NO:2 размером 4860 п.н., содержащая в соответствии с физической и генетической картой, представленной на фиг 2., целевой ген, кодирующий нуклеопротеин вируса Пуумала и состоящая из следующих элементов:

• ген β-лактамазы (координаты с 2847 по 3707 п.н.) под контролем промотора (координаты с 2742 по 2846 п.н.), в качестве генетического маркера, определяющего устойчивость к ампициллину клеток бактерии E.coli;

• ORI (origin of replication) - точка начала репликации плазмидного вектора nStem (координаты с 3878 по 4466 п.н.);

• Т7 terminator - нуклеотидная последовательность терминатора бактериофага Т7 необходим для in vitro транскрипции (координаты с 2633 по 2680 п.н.);

• нуклеопротеин (N) - открытая рамка считывания гена нуклеопротеина вируса Пуумала (координаты с 623 по 1924 п.н.);

• SV40 poly(A) signal - сигнал полиаденелирования (координаты с 4705 по 4839 п.н.);

• WPRE - посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурка, необходимый для увеличивает экспрессию белка (координаты с 1999 по 2587 п.н.).

• N - открытая рамка считывания гена N (нуклеопротеин) (координаты с 623 по 1924 п.н.);

- рекомбинантная плазмида nStem-PUUV_S_DsRed, предназначенная для оценки функциональной активности минигеномной системы, имеющая последовательность SEQ ID NO:3 размером 4947 п.н., содержащая в соответствии с физической и генетической картой, представленной на фиг 3., полноразмерную кДНК копию S-сегмента вируса Пуумала в открытую рамку считывания которого через P2A белок вcтроен ген репортерного флуоресцентного красного белка DsRed_Express, и состоит из следующих элементов:

• S_DsRed - полноразмерная кДНК копия S-сегмента вируса Пуумала (координаты с 210 по 2782 п.н.), включающая открытую рамку считывания гена нуклеопротеина (N) со вставленным в нее через P2A (координаты с 950 по 1006 п.н.) геном красного флуоресцентного белка DsRed_Express (координаты с 266 по 940 п.н.);

• HDV-dRbz - рибозим вируса гепатита дельта, необходимый для синтеза РНК с аутентичными 5’ концами (координаты с 2783 по 2872 п.н.)

• Т7 terminator - нуклеотидная последовательность терминатора бактериофага Т7 необходим для in vitro транскрипции (координаты с 2633 по 2680 п.н.).

Трансфицированные плазмиды транскрибируются РНК-полимеразой T7, что приводит к образованию мРНК вирусных белков с рекомбинантных плазмид nStem-IRES-PUUV_L, nStem-IRES-PUUV_N и образованию вРНК-подобных молекул с плазмиды nStem-PUUV_S_DsRed. мРНК продукты с рекомбинантных плазмид nStem-IRES-PUUV_L, nStem-IRES-PUUV_N благодаря наличию IRES вируса энцефаломиокардита транслируются с образованием вирусных белков нуклеопротеина (N) и РНК-зависимой РНК-полимеразы (RdRp), необходимых для транскрипции и репликации искусственного вирусного сегмента S_DsRed. Белок нуклеопротеин (N) распознает и инкапсидирует вРНК с образованием RNP-комплекса. РНК-зависимая РНК-полимераза (RdRp) распознает RNP-комплекс и синтезирует белок N_DsRed, на этапе трансляции благодаря наличию P2A-пептида происходит отщепление белка DsRed от белка N, что приводит к накоплению красного флуоресцентного белка DsRed-Express и аутентичного вирусного белка N.

Существенными отличиями заявляемого изобретения от прототипа, обеспечивающими достижение технического результата, являются:

1. Использование вируса Пуумала вместо вируса ККГЛ;

2. Отсутствие плазмиды или вирусного вектора, кодирующего гликопротеины Gn и Gc, что предотвращает образование вирусных частиц и повышает эффективность трансфекции;

3. Использование IRES для синтеза вирусных белков кэп-независимым путем;

4. Использование T7 промотора для всех плазмид.

Сущность заявленного изобретения поясняется чертежами. На фиг.1 изображена физическая и генетическая карта рекомбинантной плазмиды nStem-IRES-PUUV_L. На фиг.2 изображена физическая и генетическая карта рекомбинантной плазмиды nStem-IRES-PUUV_N. На фиг.3 изображена физическая и генетическая карта рекомбинантной плазмиды nStem-PUUV_S_DsRed. На фиг.4 представлена электрофореграмма в 1.5% агарозном геле полноразмерных кДНК копий S- (А), L- (Б), S_DsRed-сегментов (В) вируса Пуумала, где М - ДНК-маркер 1 Kb М12 (СибЭнзим, Россия). На фиг.5 приведена схема трансфекции. На фиг.6 показаны монослой клеточной линии ВНК-21/13, без рекомбинантной плазмиды nStem-IRES-PUUV_L (А) и полным комплексом компонентов минигеномной системы (Б). На фиг.7 представлены результаты оценки количество клеток стабильно экспрессирующих ген красного флуоресцентного белка DsRed-Express с помощью проточного цитометра NovoCyte Penteon Flow Cytometer System.

Осуществление изобретения

Первым этапом создания целевых плазмид стал выбор способа экспрессии целевых генов в клеточных культурах. Для этого была выбрана система под контролем полимеразы фага T7 и IRES. Данная система позволяет высокоэффективно осуществлять синтез вирусных белков на стабильном уровне по кэп-независимому пути.

В качестве целевого гена были выбраны участки, кодирующие РНК-зависимую РНК-полимеразу и нуклеопротеин вируса Пуумала (открытая рамка считывания L-сегмента и S-сегмента соответственно). Такой выбор обусловлен тем, что гены, кодирующие вирусную РНК-зависимую РНК-полимеразу и нуклеопротеин, необходимы и достаточны для транскрипции и репликации вирусной РНК.

Таком образом, изобретение может быть использовано для функционального изучения доменов вирусных белков, а также для прототипирования рекомбинантных вакцин с контролируемым циклом репликации.

Пример 1. Получение полноразмерных ДНК копий S- и L-сегментов вируса Пуумала

Вирусные сегменты были разбиты (разделены) на фрагменты длиной 800-1000 п.н. Фрагменты в свою очередь были пересчитаны в олигонулкеотиды. Подбор олигонуклеотидов для синтеза осуществляли с помощью ПО SnapGene v.3.2.1 и Oligo7, используя в качестве референса последовательности S- и L-сегмента вируса Пуумала геном вируса Пуумала обнаруженный при крупной вспышке ГЛПС в г.Саратов в 2019 году (отсутствует в GenBank). Синтез олигонуклеотидных праймеров был проведен биотехнологической компанией «Евроген» (г.Москва).

1.1. Постановка сборочной ПЦР

Для проведения реакции в пробирке в эквимолярном соотношении смешивали олигонуклеотиды составляющие 1 фрагмент вирусного сегмента. Затем проводили постановку реакции сборочной ПЦР, пробирку со смесью необходимых компонентов помещали в амплификатор Thermal Cycler С1000 (BioRad, США). Условия для ПЦР-сборки: 98°C в течение 5 секунд, температура отжига с 65°C в течение 30 секунд и 72°C в течение 60 секунд 10 циклов. После реакции сборочную ПЦР проводили реамплификацию целевых фрагментов крайними (фланкирующими) праймерами.

1.2. Выделение ДНК из агарозного геля

После проведения ПЦР, очистку продуктов амплификации ДНК проводили методом электрофореза в 1.5% агарозном геле в трис-ацетатном буфере (ТАЕ×1), окрашивали раствором бромистого этидия в течение 10 мин и проявляли с использованием УФ-трансиллюминатора «UV Transilluminator 2000» (Bio-Rad, США). После визуализации под УФ-излучением фрагменты ДНК необходимой длины, разделенные в агарозном геле, вырезали и выделяли из геля при помощи набора QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Германия) в соответствии с рекомендациями производителя.

1.3. Объединение фрагментов при помощи overlap-extension ПЦР

Концентрацию выделенных ДНК фрагментов измеряли при помощи NanoDrop One (Thermo Scientific, США). После чего фрагменты смешивали в эквимолярных количествах и осуществляли первый этап (overlap) синтеза с помощью полимеразы Phusion High-Fidelity (NEB, США). Условия первой реакции: 30 циклов при 98°C в течение 30 секунд, 70°C в течение 30 секунд и 72 °C в течение 60 секунд. Второй этап (extension) осуществляли при помощи концевых праймеров. Условия второй реакции: 10 циклов при 98 °C в течение 20 секунд, 60 °C в течение 40 секунд и 72 °C в течение 60 секунд

Очистку продуктов амплификации ДНК при помощи электрофореза в агарозном геле осуществляли способом, описанным ранее. После визуализации под УФ-излучением фрагменты ДНК необходимой длины, разделенные в агарозном геле (фиг.4), вырезали и выделяли из геля аналогичным образом.

Пример 2. Получение конструкций nStem, несущих открытую рамку считывания S- L-сегмента вируса Пуумала

2.1. Клонирование ПЦР продуктов, несущих открытую рамку считывания S- L-сегмента вируса в плазмиду

Клонирование гена РНК-зависимой РНК-полимеразы и нуклеопротеина в векторе nStem осуществляли с использованием метода Гибсона. Реакционную смесь готовили в соответствии с активностью фермента и концентрацией ДНК.

Трансформанты были отобраны с помощью стандартной процедуры ПЦР-скрининга на внутренний участок каждой из вставок.

2.2. Получение плазмидных конструкций nStem-IRES-PUUV_L, nStem-IRES-PUUV_N и nStem-PUUV_S_DsRed и подтверждение их структуры при помощи рестрикционного анализа. С помощью бактериологической петли колонию с чашки Петри переносили в пробирку, содержащую 3,5 мл жидкой питательной среды SOB с селективным антибиотиком ампициллином (100 мкг/мл). Далее пробирки помещали в шейкер-инкубатор на 16-18 часов при 170 об/мин, 30°С. Полученную бактериальную суспензию использовали для выделения плазмидной ДНК при помощи набора QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Германия) в соответствии с рекомендациями производителя.

2.3. Подтверждение структуры плазмид секвенированием по Сэнгеру

Для подтверждения корректной нуклеотидной последовательности полученных образцов использовали метод секвенирования по Сэнгеру. Для постановки реакции использовали набор BrilliantDye Terminator (v3.1) Cycle Sequencing kit (Nimagen, Нидерланды), очищали образцы через Sephadex G-50 Superfine (Cytiva, Швеция) колоночным методом согласно рекомендациям производителя, после чего передавали для проведения капиллярного гель-электрофореза на автоматическом секвенаторе 3500XL Applied Biosystems (США). Полученные хроматограммы анализировали с использованием программного обеспечения SnapGene 3.2.1.

Пример 3. Липофекция клеточной линии ВНК-21/13 плазмидами nStem-IRES-PUUV_L, nStem-IRES-PUUV_N, nStem-PUUV_S_DsRed, pCAG-T7 (необходимой для внутриклеточного синтеза ДНК-зависимой РНК-полимеразы фага Т7), и подтверждение функциональный активности минигеномной системы вируса Пуумала. Для подтверждения функциональный активности минигеномной системы вируса Пуумала, была выбрана перевиваемая клеточная линия ВНК-21/13. Для липофекции использовали набор Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific, США). Количество взятой для трансфекции плазмидной ДНК в сумме составляло 3 мкг для одной лунки, с соотношением 1:1:1:1 плазмидами nStem-PUUV_RdRp (фиг.1), nStem-IRES-PUUV_N (фиг.2), nStem-PUUV_S_DsRed (фиг.3), pCAG-T7 соответственно. Смесь для липофекции готовили согласно рекомендациям производителя. Перед проведением трансфекции делали рассев клеток на культуральном 6-луночном планшете по 2 мл клеточной суспензии с концентрацией 100 тыс.клеток/мл на лунку в питательной ростовой среде DMEM/F-12 с 7%-содержанием фетальной бычьей сыворотки. Планшет инкубировали до получения монослоя клеток с конфлюентностью в 70-90%. Перед трансфекцией производили замену питательной среды DMEM/F-12 на среду с пониженным содержанием сыворотки OptiMEM (2 мл на лунку), после чего проводили трансфекцию (фиг.5) и вносили по 250 мкл полученной смеси ДНК-липидного комплекса в 5 лунок, распределяя смесь по всей поверхности. В качестве контроля оставляли 1 лунку с монослоем клеток трансфицированным плазмидами nStem-IRES-PUUV_N, nStem-PUUV_S_DsRed, pCAG-T7. Через 12 часов после трансфекции производили смену питательной среды на OptiMEM не содержащую ДНК-липидного комплекса. После инкубации в течение 48 часов при 37°С в СО2-инкубаторе исследовали монослой линии клеток ВНК-21/13 на наличие клеток стабильно экспрессирующих ген красного флуоресцентного белка DsRed-Express с использованием системы визуализации Evos M5000 (Фиг.6) и оценивали количество клеток стабильно экспрессирующих ген красного флуоресцентного белка DsRed-Express с помощью проточного цитометра NovoCyte Penteon Flow Cytometer System (Agilent Technologies, США), обработку данных проводили с использованием программного обеспечению NovoExpress (1.5.0) (Фиг.7). Наличие клеток, флуоресцирующих в красном диапазоне, подтверждает экспрессию гена DsRed, что подтверждает заявляемый технический результат. При попадании всех компонентов минигеномной системы в эукариотическую клетку происходит синтез вирусных белков нуклеопротеина (N) и РНК-зависимой РНК-полимеразы (RdRp), закодированных в плазмидах nStem-IRES-PUUV_N, nStem-PUUV_L соответственно. Параллельно происходит синтез вРНК с плазмиды nStem-PUUV_S_DsRed, вРНК не может быть транслирована в эукариотической клетке в нормальных условиях и подлежит расщеплению, но в силу физико-химических особенностей белок нуклеопротеин (N) распознает и инкапсидирует вРНК с образованием RNP-комплекса. РНК-зависимая РНК-полимераза (RdRp) распознает RNP-комплекс и синтезирует белок N_DsRed, на этапе трансляции благодаря наличию P2A-пептида происходит отщепление белка DsRed от белка N, что приводит к накоплению красного флуоресцентного белка DsRed-Express в клетке и его флуоресценции, а также происходит синтез и накопление аутентичного вирусного белка N. Нарушение работы из компонентов минигеномной системы приведет к отсутствию красного флуоресцентного сигнала. На фиг.7 представлены результаты проточной цитометрии. Клетки трансфицированные не полным комплексом компонентов минигеномной системы, без рекомбинантной плазмиды nStem-IRES-PUUV_L (А), клетки трансфицированные полным комплексом компонентов минигеномной системы (Б).

Таким образом, данная минигеномная система является одним из инструментов для оценки эффективности действия ингибиторов РНК-зависимой РНК-полимеразы. При внесении ингибиторов РНК-зависимой РНК-полимеразы (глицирризин, Ремдисивир, рибавирин и др.) в клеточную культуру с функциональной минигеномной системой ожидается снижение уровня красного флуоресцентного сигнала при эффективном ингибировании РНК-зависимой РНК-полимеразы, если снижения уровня красного флуоресцентного сигнала не наблюдается, то можно судить о слабой эффективности того или иного препарата против вируса Пуумала (9, 10).

Источники патентной и научно-технической информации:

1. H. Jiang, H. Du, L. M. Wang, P. Z. Wang, и X. F. Bai, «Hemorrhagic Fever with Renal Syndrome: Pathogenesis and Clinical Picture», Front. Cell. Infect. Microbiol., т.6, с.1, фев. 2016, doi: 10.3389/fcimb.2016.00001.

2. P. Heyman, A. Vaheri, и E. Members, «Situation of hantavirus infections and haemorrhagic fever with renal syndrome in European countries as of December 2006», Eurosurveillance, т.13, вып.28, с.18925, июл. 2008, doi: 10.2807/ese.13.28.18925-en.

3. Evgeniy A. Tkachenko, Aydar A. Ishmukhametov, Tamara K. Dzagurova, Alla D. Bernshtein, Viacheslav G. Morozov, Alexandra A. Siniugina, Svetlana S. Kurashova, Alexandra S. Balkina, Petr E. Tkachenko, Detlev H. Kruger, Boris Klempa. Hemorrhagic Fever with Renal Syndrome, Russia. 2019

4. А. А. Синюгина, А. А. Ишмухаметов. Т. К. Дзагурова, М. В. Баловнева, М. и др. Вакцины для профилактики хантавирусных лихорадок. 2019

5. Chu YK, Jennings GB, Schmaljohn CS. A vaccinia virus vectored Hantaan virus vaccine protects hamsters from challenge with Hantaan and Seoul viruses but not Puumala virus. J. Virol. 69(10), 6417-6423 (1995).

6. RU2221869C2, МПК C12N 15/63, опубл. 20.10.2004 (аналог)

7. WO2014158123A1, МПК A61K39/12, опубл. 02.10.2014 (аналог)

8. WO2020123989, МПК А61К 39/12, опубл. 18.06.2020 г.(прототип)

9. J. Y. Rathbun, M. E. Droniou, R. Damoiseaux, K. G. Haworth, J. E. Henley, C. M. Exline, H. Choe, и P. M. Cannon. «Novel Arenavirus Entry Inhibitors Discovered by Using a Minigenome Rescue System for High-Throughput Drug Screening» Journal of virology, 2015, 89(16), 8428-8443. https://doi.org/10.1128/JVI.00997-15

10. E. V. Nelson, J. R. Pacheco, A. J. Hume, T. N. Cressey, L. R. Deflubé, J. B. Ruedas, J. H. Connor, H. Ebihara, и E. Mühlberger. «An RNA polymerase II-driven Ebola virus minigenome system as an advanced tool for antiviral drug screening» Antiviral research, 2016, 146, 21-27. https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2017.08.005.

--->

ПРИЛОЖЕНИЕ

Перечень последовательностей

<110> Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный научный центр

вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере

защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»

Роспотребнадзора) <120>Минигеномная система вируса Пуумала для оценки

противовирусной активности ингибиторов РНК-зависимой РНК-полимеразы.

<160> SEQ ID NO:3

<210> SEQ ID NO:1

<211>9996 п.н.

<212>DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность рекомбинантной конструкции,

обеспечивающей экспрессию РНК-зависимой РНК-полимеразы (L) вируса Пуумала.

<400> 1

CCTCTCGAGA AATTAATACG ACTCACTATA GGGAGACGCG TTAGCCCCTC TCCCTCCCCC 60

CCCCCTAACG TTACTGGCCG AAGCCGCTTG GAATAAGGCC GGTGTGCGTT TGTCTATATG 120

TTATTTTCCA CCATATTGCC GTCTTTTGGC AATGTGAGGG CCCGGAAACC TGGCCCTGTC 180

TTCTTGACGA GCATTCCTAG GGGTCTTTCC CCTCTCGCCA AAGGAATGCA AGGTCTGTTG 240

AATGTCGTGA AGGAAGCAGT TCCTCTGGAA GCTTCTTGAA GACAAACAAC GTCTGTAGCG 300

ACCCTTTGCA GGCAGCGGAA CCCCCCACCT GGCGACAGGT GCCTCTGCGG CCAAAAGCCA 360

CGTGTATAAG ATACACCTGC AAAGGCGGCA CAACCCCAGT GCCACGTTGT GAGTTGGATA 420

GTTGTGGAAA GAGTCAAATG GCTCTCCTCA AGCGTATTCA ACAAGGGGCT GAAGGATGCC 480

CAGAAGGTAC CCCATTGTAT GGGATCTGAT CTGGGGCCTC GGTACACATG CTTTACATGT 540

GTTTAGTCGA GGTTAAAAAA ACGTCTAGGC CCCCCGAACC ACGGGGACGT GGTTTTCCTT 600

TGAAAAACAC GATGATAATA CCATGGAGAA ATACAGAGAG ATCCACGAGA GAGTGAAGGA 660

GGCAGTCCCA GGGGAAACGT CCGCAGTAGA GTGTTTAGAC TTATTAGATC GGCTGTATGC 720

AGTTAGGCAT GATGTTGTAG ATCAGATGAT AAAGCATGAT TGGTCTGACA ATAAAGATAA 780

AGAACAACCA ATTGGTCTGG TCTTATTAAT GGCTGGTGTC CCAAATGATG TGATACAAAG 840

CATGGAGAAA AGAATTATCC CAGGGAGTCC AAGTGGCCAA ATTCTTAGAT CATTTTTTAA 900

GATGACACCT GATAATTATA AAATAACAGG AAATCTAATA GAGTTTATTG AGGTAACAGT 960

GACTGCTGAT GTGGCAAGAG GTGTTAGAGA AAAAATATTA AAATACCAAG GAGGTTTAGA 1020

GTTTATTGAG CAACAACTAC AGGTAGAAGC ACAAAAAGGT AATTGTCAAT CTGGCTTTAG 1080

GATAAAGTTT GATGTGGTGG CTATAAGAAC AGATGGATCA AATATTTCAA CACAATGGCC 1140

CAGCAGGAGG AATGAAGGTG TTGTACAGGC AATGAGGTTA ATACAGGCAG ACATTAATTT 1200

CGTTAGAGAA CATTTGATAA AAAATGACGA GAGAGGTGCA CTTGAAGCAA TGTTTAATTT 1260

AAAATTTCAT GTCACTGGCC CTAAAGTGCG AACATTTGAT ATTCCGAATT ACAGGCCTCA 1320

GCAATTATGT CAACCTGTAT TAGAAAATCT GGTAGATTAT TGTAAGAATT GGCTCGGAAC 1380

TGATCATGCT TTTGCATTTA AAGAAGTAAC TGGGCAACGT GTCTTTAATG TGTTTAGAGA 1440

TGAAGAAGAA CTACATGCAT CTAAGTATGG ACACTCAAGA AAGCCTAGAA ATTTTCTTTT 1500

ATGTCAAATA AGCCTTCAAG CACCATATCT ACCATCAACC ATAGCCTCTG ATCAATATGA 1560

TACAAGGTTA GCTTGCAGTG AAATTCTGAA AAATTATCCT GAGACACCTT TACAACTTTT 1620

AGCCAGGGAT ATGGCTTACA AATACATTAC ACTAGATAAT GAGGATATTA TCAATTATTA 1680

TAATCCGAGA GTTTACTTTA AACCCACACA AAATATCAAA GAACCAGGGA CTTTTAAGTT 1740

AAATTTGTCT AGTATGGATC CTAAGTCGAA GGCATTGATT GATATAATCT CAAAGGATTC 1800

AAAGAAAGGG GTTTTTGGTG AATTAATAGA TAGTATTGAT GTAGCAAGTC AGGTTCAGCA 1860

GAATGAATGT GCAAAAACTA TTGAAAAAAT CCTTTCTGAT CTTGAAGTTA ATATAGGTGA 1920

TTCTACTGCT GGATTAGAAC AACCAAAAAG AACTACCGGA GTGGATGATA TCTTAAGGAA 1980

GTTTTATGAC AATGAACTTG TTAAGTACTT AATCTCAGTT ATACGGAAAA CAACTGCCTG 2040

GCATTTAGGA CATCTATTAC GTGATATTAC TGAATCTCTT ATTGCACATG CAGGGCTTAA 2100

AAGATCTAAA TATTGGTCTA CTCATGGCTA TGCCTATGGT AGTGTCCTGT TGTGTATCCT 2160

GCCATCTAAA TCACTTGAAG TTGCAGGCTC ATTCATTAGA TTTTTTACTA TATTCAAGGA 2220

GGGACTAGGC CTTATTGATG TAGATAATCT TGATTCTAAA GTAGAGATTG ATGGTGTTTC 2280

ATGGTGTTTC AGCAAAATTA TTAGCCTGGA TTTAAATCGA TTATTAGCAT TGAATATTGC 2340

ATTTGAAAAG TCCCTTCTTG CTACAGCTAC ATGGTTTCAA TATTATACAG AGGATCAAGG 2400

GCATTTCCCT CTCCAACATG CATTACGATC TGTCTTTGCA TTCCATTTCC TTCTTTCCAC 2460

ATCTCAAAAG ATGAAACTAT GTGCCATATT TGATAATCTA CGGTACCTTA TTCCAGCAGT 2520

TACATCAACA TATTCTGGCT TTGAGCCATT AATTAGGAAG TTCTTTGAAC GACCCTTCAA 2580

AAGTGCATTG GAGGTATACT TGTATAATAT TATAAAGACA CTATTAGTTA GCTTAGCTCA 2640

AAATAATAAA ATAAGATTTT ATTCAAGAGT TAGACTTTTG GGGCTAACTG TTGATCAATC 2700

AACAATTGGG GCAAGTGGAG TTTATCCATC ATTAATGTCA CGGGTCGTGT ATAAGCATTA 2760

TCGTAGTTTA ATTTCAGAAG CAACAACTTG TTTCTTTTTA TTTGAGAAAG GACTACATGG 2820

TAATCTCACA GAAGAAGCTA AAATTCACCT TGAGACAGTT GAATGGGCCA GAAAATTTAG 2880

AGAAAAAGAA AGAGAGTTAG GTAGTTATAT AATGGAAGAA GGTTATCATA TACAAGATGT 2940

CTTAAACAAT CAGGTAGTTG TTGAACAGCA ACTCTTTTGC CAAGAAGTTG TCGAATTAGC 3000

TGCCCAAGAA TTAAATACTT ACTTGCATGC AAAGTCTCAA GTAATGGCAA GTAATATAAT 3060

GAATAAACAT TGGGATAAAC CATACTTTAG TCAAACCAGG AATATCAGTC TTAAGGGGAT 3120

GTCAGGAGCA TTACAAGAAG ATGGTCATCT GGCTGCAAGT GTTACTCTCA TTGAGGCAAT 3180

TCGGTTTTTA AATCATTCAC AAAATAACCC TACAGTATTA GAACTTTATG AACAGACAAA 3240

AAAACAAAGG GCACAAGCAA GAATTGTTAG GAAATACCAA AGGACTGAAG CTGATAGAGG 3300

TTTCTTCATA ACCACATTAT CAACTAGAGT AAGGTTAGAA ATTATTGAAG ATTATTATGA 3360

TGCTATAGCT AGGGTTGTTC CAGAAGAATA TATATCCTAT GGAGGTGAAA GAAAGATACT 3420

GAACATTCAA CAGGCTTTAG AGAAGGCATT GAGGTGGGCT TCTGGAGAAA GTGAAATCCA 3480

GTCCTCGTTG GGTCACTCCA TAAAATTGAA AAGAAAGCTG ATGTATGTAA GTGCGGATGC 3540

AACTAAATGG TCACCAGGTG ATAATTCAGC AAAGTTTAGA AGATTTACTC AATCCTTATA 3600

TGATGGTTTA CGTGATGACA AGCTAAAAAA TTGTGTAGTT GATGCTCTAA GAAATATTTA 3660

TGAAACTGAC TTTTTTATAT CCAGAAAACT GCATAGGTAT ATTGATAATA TGGGTGAATT 3720

GTCTGATGAA GTACTAGATT TCTTATCTTT TTTTCCTAAT AAAGTGTCTG CTTCAATAAA 3780

AGGCAACTGG CTGCAAGGTA ATTTAAACAA ATGTTCTTCA TTATTTGGGG CGGCGGTATC 3840

ATTATTGTTT AAACGTGTGT GGGCCAAATT ATATCCAGAG TTAGAGTGTT TTTTTGAGTT 3900

TGCTCATCAC TCTGATGATG CTTTATTCAT TTATGGTTAT TTAGAACCAG TAGATGATGG 3960

AACAGAATGG TTTCAGTACG TGACTCAACA AATACAGGCA GGAAACTTTC ATTGGCATGC 4020

TGTGAATCAA GAAATGTGGA AAAGCATGTT TAATCTCCAT GAGCATATTT TATTAATGGG 4080

TTCTATAAAA ATATCACCTA AAAAGACAAC AGTATCTCCT ACAAATGCGG AGTTTTTATC 4140

TACATTCTTT GAGGGTTGTG CAGTCTCTAT CCCCTTTATA AAGATTTTAT TAGGTTCACT 4200

CTCTGATCTG CCTGGCTTGG GTTATTTCGA TGATCTTGCT GCAGCTCAAA GTAGGTGTGT 4260

TAAGGCATTA GATATGGGTG CATGCCCTCA GCTTGCACAA CTAGGAATAG TATTATGTAC 4320

GAGTAAGGTT GAAAGATTAT ATGGTACTGC TCCTGGTATG GTCAATAATC CTACTGCATA 4380

CTTAAAGGTG GACAGAAGTC TGATTCCTAT ACCGTTAGGT GGTGATGGTT CTATGTCAAT 4440

CATGGAACTA GCCACAGCAG GTATAGGGAT GGCAGACAAA AATATATTAA AAAATGCATT 4500

CATAACTTAC AAACATGCAA AAAAAGATAA TGATAGATAT GTGTTAGGAT TGTTTAAATT 4560

CTTAATGTCA TTGTCAGATG ATATATTCCA GCATGATCGC TTGGGGGAAT TTAGTTTTGT 4620

AGGTAAAGTT CAGTGGAAAG TTTTCACCCC TAAAAGTGAG TTTGAATTTT ATGACCAATA 4680

TTCAAGAAAA TATCTTGAGC TGTGGAGTGA ACAACATCCT GTCTATGATT ATATTATACC 4740

AAGAGGTAGG GATAACCTAT TAGTATACTT GGTAAGGAAG TTAAATGACC CTAGTATAGT 4800

TACTGCAATG ACAATGCAAT CACCACTTCA ATTGAGGTTT CGGATGCAGG CAAAGCAACA 4860

TATGAAAGTA TGTAAGTTAG GTGGTGAATG GGTGACATTT AGGGAAGTTC TTGCCGCTGC 4920

AGATGCATTT GCATCAGAGT ACCGACCAAC ATCACAGGAT ATGGAGCTCT TTCAAACACT 4980

TGTTAATTGT ACATTTTCTA AAGAATATGC CTGGAGGGAC TTCTTAAATG AAGTACAATG 5040

TGATGTTTTA ACAACAAGAC AAATTCATAG ACCAAAAGTT GCCCGTACTT TTACAGTTAA 5100

AGAAAGAGAT CAAACAATAC AAAATCCTAT TACGGCTGTG ATTGGCTACA AGTATGCTAG 5160

TAAAGTAGAT GAAATAAGTG ATGTATTAGA TAGTGCTATT CATCCAGACT CATTGTCTAC 5220

CGACTTGCAG CTTATGAGGG AAGGTGTCTA CAGAGAATTA GGTCTTGATA TCAGCCAACC 5280

GAATGTATTG AAGAAAGTTG CACCATTGTT GTATAAGTCT GGAAAGTCGA GGATTGTAAT 5340

TGTGCAAGGA AATGTAGAGG GTACAGCTGA ATCAATTTGT AGTTATTGGT TGAAGACTAT 5400

GTCTCTTGTT AAGACTATTA AAGTAAAACC AAAAAAGGAG GTCCTAAAAG CTGTATCTCT 5460

TTATGGAAAA AAAGAAAAAG CTGGTGATTT AACACATTTA GCTGCAATGA GATTATGCAT 5520

TGAAGTTTGG AGATGGTGCA AAGCTAATGA GCAAGATTCT GTATCTTGGT TAAAGTATCT 5580

AATGTTTGAA AACAAAACAT TGGAACAATG GATAGATTCA TTTTGTTCCA GAGGAGTTTT 5640

ACCTGTGGAT CCTGAGATCC AATGTTTAGG CCTTCTTGTA TATGATCTTA AGGGACAAAA 5700

GGGTTTATTG CAAGTACAAG CTAACAGGAG AGCATATTCA GGGAAGCAGT ATGATGCCTA 5760

TTGTGTGCAA ACTTATAATG AAGAGACAAA ACTTTATGAA GGAGATTTGA GGGTAACATT 5820

TAATTTTGGT ATAGACTGTG CAAGACTAGA AATCTTTTGG GACAAAAAAG AGTATATTTT 5880

GGAAACATCC ATAACCCAAC GAAATGTATT AAAGATTCTC ATGGAAGAAG TAACTAAAGA 5940

ATTACTACGT TGTGGTATGA GATTTAAGAC AGAGCAAGTC AACTCCTCAC GTAGTGTAGT 6000

ATTGTTTAAA ACAGAAAGTG GTTTTGAATG GGGTAAACCC AATGTACCAT GTATTGTTTA 6060

TAGAAATTGC ACCCTTAGGA CAGGATTGAG AGTACGACAG CCTACAAACA AAGCATTTTC 6120

AATTACTATT CAGGCTAATG GATTTAGGGC TATGGCCCAG CTTGATGAAG AAAATCCTAG 6180

ATTCTTACTC GCCCATGCAT ATCATAATTT AAAAGATGTT AGGTATCAGG CACTACAAGC 6240

AGTCGGAAAT GTGTGGTTTA AGATGACTCA ACATAAACTG TTTATAAATC CGATAATATC 6300

TGCTGGGCTG CTTGAGAATT TTATGAAAGG TTTGCCTGCA GCAATTCCTC CAGCAGCTTA 6360

CTCTCTAATT ATGAACAAGG CAAAAATATC TGTTGATTTA TTCATGTTTA ATGAACTGTT 6420

AGCTTTAATT AACCCACAGA ATGTTTTAAA CTTAGATGGA ATAGAAGAAA CATCAGAAGG 6480

TTTTACAACA GTTAGCACAA TTTCTAGTAC ACAATGGTCA GAAGAGGTAA GTTTAACAAT 6540

GGATGATAGT GATGATGATG AGAATGCTTC ACAGCTTGAT TACACTATTG ACCTTGATGA 6600

TATAGATTTT GAAACAATTG ATCTAAAAGA GGATATCGAG CATTTTTTAC AGGATGAATC 6660

AGCATATACT GGAGATCTCT TAATTCAAAC TGAGGAAACT GAAATAAGAA AGCTGAGAGG 6720

TATGATCAAA ATTCTTGAGC CTGTAAAGCT TATTAAAAGT TGGGTTTCCA AAGGTTTATC 6780

CATAGACAAG ATATATAACC CTGTTAATAT TGTTCTCATG ACTCGATACA TGTCCAAGCA 6840

TTACAATTTC CATACAAAGC AGTTATCTCT TATGGATCCG TATGATTTAA CAGAGTTCGA 6900

AAGTATTGTT AAAGGTTGGG GAGAGTGTGT TAAAGATAGG TTTATTGAAC TTGACCAGGA 6960

AGCCCAGCGG AAGGTCACTG AAGAGAGAGT GCTACCAGAA GATGTACTTC CAGACTCCCT 7020

CTTTTCATTT AGACATGCTG ATATCTTATT AAAGAGATTA TTTCCCAGGG ACTCAGCCTC 7080

TTCTTTTTAT TAACAGATTA TACTTCTTAT TGCTCTTTAT CGCGGCCGCT CGACAATCAA 7140

CCTCTGGATT ACAAAATTTG TGAAAGATTG ACTGGTATTC TTAACTATGT TGCTCCTTTT 7200

ACGCTATGTG GATACGCTGC TTTAATGCCT TTGTATCATG CTATTGCTTC CCGTATGGCT 7260

TTCATTTTCT CCTCCTTGTA TAAATCCTGG TTGCTGTCTC TTTATGAGGA GTTGTGGCCC 7320

GTTGTCAGGC AACGTGGCGT GGTGTGCACT GTGTTTGCTG ACGCAACCCC CACTGGTTGG 7380

GGCATTGCCA CCACCTGTCA GCTCCTTTCC GGGACTTTCG CTTTCCCCCT CCCTATTGCC 7440

ACGGCGGAAC TCATCGCCGC CTGCCTTGCC CGCTGCTGGA CAGGGGCTCG GCTGTTGGGC 7500

ACTGACAATT CCGTGGTGTT GTCGGGGAAA TCATCGTCCT TTCCTTGGCT GCTCGCCTGT 7560

GTTGCCACCT GGATTCTGCG CGGGACGTCC TTCTGCTACG TCCCTTCGGC CCTCAATCCA 7620

GCGGACCTTC CTTCCCGCGG CCTGCTGCCG GCTCTGCGGC CTCTTCCGCG TCTTCGCCTT 7680

CGCCCTCAGA CGAGTCGGAT CTCCCTTTGG GCCGCCTCCC CGCCTGGTAC CTTTAAGACC 7740

AATGACTTAC AAGGCAGCTG AGCAATAACT AGCATAACCC CTTGGGGCCT CTAAACGGGT 7800

CTTGAGGGGT TTTTTGCTGA AAGGAGGAAC TAGTCAATAA TCAATCTCGA CCAGGTGGCA 7860

CTTTTCGGGG AAATGTGCGC GGAACCCCTA TTTGTTTATT TTTCTAAATA CATTCAAATA 7920

TGTATCCGCT CATGAGACAA TAACCCTGAT AAATGCTTCA ATAATATTGA AAAAGGAAGA 7980

GTATGAGTAT TCAACATTTC CGTGTCGCCC TTATTCCCTT TTTTGCGGCA TTTTGCCTTC 8040

CTGTTTTTGC TCACCCAGAA ACGCTGGTGA AAGTAAAAGA TGCTGAAGAT CAGTTGGGTG 8100

CACGAGTGGG TTACATCGAA CTGGATCTCA ACAGCGGTAA GATCCTTGAG AGTTTTCGCC 8160

CCGAAGAACG TTTTCCAATG ATGAGCACTT TTAAAGTTCT GCTATGTGGC GCGGTATTAT 8220

CCCGTATTGA CGCCGGGCAA GAGCAACTCG GTCGCCGCAT ACACTATTCT CAGAATGACT 8280

TGGTTGAGTA CTCACCAGTC ACAGAAAAGC ATCTTACGGA TGGCATGACA GTAAGAGAAT 8340

TATGCAGTGC TGCCATAACC ATGAGTGATA ACACTGCGGC CAACTTACTT CTGACAACGA 8400

TCGGAGGACC GAAGGAGCTA ACCGCTTTTT TGCACAACAT GGGGGATCAT GTAACTCGCC 8460

TTGATCGTTG GGAACCGGAG CTGAATGAAG CCATACCAAA CGACGAGCGT GACACCACGA 8520

TGCCTGTAGC AATGGCAACA ACGTTGCGCA AACTATTAAC TGGCGAACTA CTTACTCTAG 8580

CTTCCCGGCA ACAATTAATA GACTGGATGG AGGCGGATAA AGTTGCAGGA CCACTTCTGC 8640

GCTCGGCCCT TCCGGCTGGC TGGTTTATTG CTGATAAATC TGGAGCCGGT GAGCGTGGCT 8700

CTCGCGGTAT CATTGCAGCA CTGGGGCCAG ATGGTAAGCC CTCCCGTATC GTAGTTATCT 8760

ACACGACGGG GAGTCAGGCA ACTATGGATG AACGAAATAG ACAGATCGCT GAGATAGGTG 8820

CCTCACTGAT TAAGCATTGG TAACTGTCAG ACCAAGTTTA CTCATATATA CTTTAGATTG 8880

ATTTAAAACT TCATTTTTAA TTTAAAAGGA TCTAGGTGAA GATCCTTTTT GATAATCTCA 8940

TGACCAAAAT CCCTTAACGT GAGTTTTCGT TCCACTGAGC GTCAGACCCC GTAGAAAAGA 9000

TCAAAGGATC TTCTTGAGAT CCTTTTTTTC TGCGCGTAAT CTGCTGCTTG CAAACAAAAA 9060

AACCACCGCT ACCAGCGGTG GTTTGTTTGC CGGATCAAGA GCTACCAACT CTTTTTCCGA 9120

AGGTAACTGG CTTCAGCAGA GCGCAGATAC CAAATACTGT CCTTCTAGTG TAGCCGTAGT 9180

TAGGCCACCA CTTCAAGAAC TCTGTAGCAC CGCCTACATA CCTCGCTCTG CTAATCCTGT 9240

TACCAGTGGC TGCTGCCAGT GGCGATAAGT CGTGTCTTAC CGGGTTGGAC TCAAGACGAT 9300

AGTTACCGGA TAAGGCGCAG CGGTCGGGCT GAACGGGGGG TTCGTGCACA CAGCCCAGCT 9360

TGGAGCGAAC GACCTACACC GAACTGAGAT ACCTACAGCG TGAGCATTGA GAAAGCGCCA 9420

CGCTTCCCGA AGGGAGAAAG GCGGACAGGT ATCCGGTAAG CGGCAGGGTC GGAACAGGAG 9480

AGCGCACGAG GGAGCTTCCA GGGGGAAACG CCTGGTATCT TTATAGTCCT GTCGGGTTTC 9540

GCCACCTCTG ACTTGAGCGT CGATTTTTGT GATGCTCGTC AGGGGGGCGG AGCCTATGGA 9600

AAAACGCCAG CAACGCGGCC TTTTTACGGT TCCTGGCCTT TTGCTGGCCT TTTGCTCACA 9660

TGTTCTTTCC TGCGTTATCC CCTGATTCTG TGGATAACCG TATTACCGCC TTTGAGTGAG 9720

CTGATACCGC TCGCCGCAGC CGAACGACCG AGCGCAGCGA GTCAGTGAGC GAGGAAGCGG 9780

AAGAGCGCCC AATACGCAAA CCGCCTCTCC CCGCGCGTTG GCCGATTCAT TAATGCAGCG 9840

GATCCAGACA TGATAAGATA CATTGATGAG TTTGGACAAA CCACAACTAG AATGCAGTGA 9900

AAAAAATGCT TTATTTGTGA AATTTGTGAT GCTATTGCTT TATTTGTAAC CATTATAAGC 9960

TGCAATAAAC AAGTTAGCTT TTTGCAAAAG CCTAGG 9996

<210> SEQ ID NO:2

<211>4860 п.н.

<212>DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

обеспечивающей экспрессию нуклеопротеина (N) вируса Пуумала.

<400> 2

CCTCTCGAGA AATTAATACG ACTCACTATA GGGAGACGCG TTAGCCCCTC TCCCTCCCCC 60

CCCCCTAACG TTACTGGCCG AAGCCGCTTG GAATAAGGCC GGTGTGCGTT TGTCTATATG 120

TTATTTTCCA CCATATTGCC GTCTTTTGGC AATGTGAGGG CCCGGAAACC TGGCCCTGTC 180

TTCTTGACGA GCATTCCTAG GGGTCTTTCC CCTCTCGCCA AAGGAATGCA AGGTCTGTTG 240

AATGTCGTGA AGGAAGCAGT TCCTCTGGAA GCTTCTTGAA GACAAACAAC GTCTGTAGCG 300

ACCCTTTGCA GGCAGCGGAA CCCCCCACCT GGCGACAGGT GCCTCTGCGG CCAAAAGCCA 360

CGTGTATAAG ATACACCTGC AAAGGCGGCA CAACCCCAGT GCCACGTTGT GAGTTGGATA 420

GTTGTGGAAA GAGTCAAATG GCTCTCCTCA AGCGTATTCA ACAAGGGGCT GAAGGATGCC 480

CAGAAGGTAC CCCATTGTAT GGGATCTGAT CTGGGGCCTC GGTACACATG CTTTACATGT 540

GTTTAGTCGA GGTTAAAAAA ACGTCTAGGC CCCCCGAACC ACGGGGACGT GGTTTTCCTT 600

TGAAAAACAC GATGATAATA CCATGAGTGA CTTGACAGAC ATCCAAGAGG AGATAACCCG 660

CCATGAGCAA CAACTTGTTG TTGCCAGACA AAAACTCAAG GATGCAGAGA GAGCAGTGGA 720

AGTGGACCCG GATGACGTTA ACAAAAACAC ACTACAAGCG AGGCAACAAA CAGTGTCAGC 780

ATTGGAGGAT AAACTCGCAG ACTACAAGAG AAGAATGGCA GATGCTGTGT CCCGGAAGAA 840

AATGGATACT AAACCTACTG ACCCGACTGG GATTGAACCT GATGATCATC TCAAGGAGAG 900

ATCAAGCCTT AGATATGGAA ATGTCCTTGA TGTAAATGCC ATTGACATTG AAGAACCAAG 960

TGGTCAGACA GCAGATTGGT ATACTATTGG AGTCTATGTA ATAGGTTTTA CAATTCCCAT 1020

CATTTTAAAG GCTCTATACA TGTTGTCAAC ACGTGGAAGA CAGACCGTGA AAGAGAACAA 1080

GGGAACACGG ATCAGGTTCA AGGATGACAC ATCATTTGAG GATATTAATG GCATTAGGAG 1140

ACCAAAACAT CTATATGTGT CCATGCCTAC TGCCCAGTCC ACCATGAAAG CTGAAGAACT 1200

TACACCCGGA CGGTTTCGTA CAATTGTATG TGGCTTATTC CCTACACAGA TACAAGTGCG 1260

TAATATCATG AGTCCAGTGA TGGGAGTGAT TGGTTTTTCT TTTTTTGTCA AAGACTGGCC 1320

AGAGAGGATT AGGGAATTTA TGGAAAAAGA ATGCCCTTTC ATAAAACCAG AAGTTAAGCC 1380

CGGGACACCA GCACAGGAGA TAGAATTTTT GAAAAGGAAT AGGGTTTATT TCATGACCCG 1440

CCAAGATGTT CTTGACAAAA ATCATGTGGC TGACATTGAT AAGTTAATTG ACTATGCTGC 1500

CTCTGGTGAC CCTACATCAC CTGATGACAT CGAATCGCCT AATGCACCAT GGGTATTTGC 1560

TTGTGCACCA GACCGGTGTC CCCCTACATG CATTTATGTT GCTGGGATGG CTGAATTAGG 1620

CGCATTCTTT TCAATCCTAC AGGATATGAG GAACACTATT ATGGCATCTA AAACTGTAGG 1680

TACAGCAGAA GAGAAATTAA AAAAGAAGTC CTCCTTCTAT CAATCATATT TACGCCGGAC 1740

ACAATCAATG GGGATTCAAC TTGATCAGAG GATAATCCTA CTGTACATGT TGGAGTGGGG 1800

AAAAGAAATG GTGGATCATT TCCATCTTGG TGATGATATG GATCCTGAGC TCAGGGGCCT 1860

TGCTCAGTCA CTCATAGATC AGAAAGTAAA AGAAATATCA AATCAGGAGC CCTTAAAGAT 1920

ATGATTAAAT CAAGTTTATT ACTAATTATA GATATAGTAT ATTGCTAATC TTAGATTATC 1980

CCATCGCGGC CGCTCGACAA TCAACCTCTG GATTACAAAA TTTGTGAAAG ATTGACTGGT 2040

ATTCTTAACT ATGTTGCTCC TTTTACGCTA TGTGGATACG CTGCTTTAAT GCCTTTGTAT 2100

CATGCTATTG CTTCCCGTAT GGCTTTCATT TTCTCCTCCT TGTATAAATC CTGGTTGCTG 2160

TCTCTTTATG AGGAGTTGTG GCCCGTTGTC AGGCAACGTG GCGTGGTGTG CACTGTGTTT 2220

GCTGACGCAA CCCCCACTGG TTGGGGCATT GCCACCACCT GTCAGCTCCT TTCCGGGACT 2280

TTCGCTTTCC CCCTCCCTAT TGCCACGGCG GAACTCATCG CCGCCTGCCT TGCCCGCTGC 2340

TGGACAGGGG CTCGGCTGTT GGGCACTGAC AATTCCGTGG TGTTGTCGGG GAAATCATCG 2400

TCCTTTCCTT GGCTGCTCGC CTGTGTTGCC ACCTGGATTC TGCGCGGGAC GTCCTTCTGC 2460

TACGTCCCTT CGGCCCTCAA TCCAGCGGAC CTTCCTTCCC GCGGCCTGCT GCCGGCTCTG 2520

CGGCCTCTTC CGCGTCTTCG CCTTCGCCCT CAGACGAGTC GGATCTCCCT TTGGGCCGCC 2580

TCCCCGCCTG GTACCTTTAA GACCAATGAC TTACAAGGCA GCTGAGCAAT AACTAGCATA 2640

ACCCCTTGGG GCCTCTAAAC GGGTCTTGAG GGGTTTTTTG CTGAAAGGAG GAACTAGTCA 2700

ATAATCAATC TCGACCAGGT GGCACTTTTC GGGGAAATGT GCGCGGAACC CCTATTTGTT 2760

TATTTTTCTA AATACATTCA AATATGTATC CGCTCATGAG ACAATAACCC TGATAAATGC 2820

TTCAATAATA TTGAAAAAGG AAGAGTATGA GTATTCAACA TTTCCGTGTC GCCCTTATTC 2880

CCTTTTTTGC GGCATTTTGC CTTCCTGTTT TTGCTCACCC AGAAACGCTG GTGAAAGTAA 2940

AAGATGCTGA AGATCAGTTG GGTGCACGAG TGGGTTACAT CGAACTGGAT CTCAACAGCG 3000

GTAAGATCCT TGAGAGTTTT CGCCCCGAAG AACGTTTTCC AATGATGAGC ACTTTTAAAG 3060

TTCTGCTATG TGGCGCGGTA TTATCCCGTA TTGACGCCGG GCAAGAGCAA CTCGGTCGCC 3120

GCATACACTA TTCTCAGAAT GACTTGGTTG AGTACTCACC AGTCACAGAA AAGCATCTTA 3180

CGGATGGCAT GACAGTAAGA GAATTATGCA GTGCTGCCAT AACCATGAGT GATAACACTG 3240

CGGCCAACTT ACTTCTGACA ACGATCGGAG GACCGAAGGA GCTAACCGCT TTTTTGCACA 3300

ACATGGGGGA TCATGTAACT CGCCTTGATC GTTGGGAACC GGAGCTGAAT GAAGCCATAC 3360

CAAACGACGA GCGTGACACC ACGATGCCTG TAGCAATGGC AACAACGTTG CGCAAACTAT 3420

TAACTGGCGA ACTACTTACT CTAGCTTCCC GGCAACAATT AATAGACTGG ATGGAGGCGG 3480

ATAAAGTTGC AGGACCACTT CTGCGCTCGG CCCTTCCGGC TGGCTGGTTT ATTGCTGATA 3540

AATCTGGAGC CGGTGAGCGT GGCTCTCGCG GTATCATTGC AGCACTGGGG CCAGATGGTA 3600

AGCCCTCCCG TATCGTAGTT ATCTACACGA CGGGGAGTCA GGCAACTATG GATGAACGAA 3660

ATAGACAGAT CGCTGAGATA GGTGCCTCAC TGATTAAGCA TTGGTAACTG TCAGACCAAG 3720

TTTACTCATA TATACTTTAG ATTGATTTAA AACTTCATTT TTAATTTAAA AGGATCTAGG 3780

TGAAGATCCT TTTTGATAAT CTCATGACCA AAATCCCTTA ACGTGAGTTT TCGTTCCACT 3840

GAGCGTCAGA CCCCGTAGAA AAGATCAAAG GATCTTCTTG AGATCCTTTT TTTCTGCGCG 3900

TAATCTGCTG CTTGCAAACA AAAAAACCAC CGCTACCAGC GGTGGTTTGT TTGCCGGATC 3960

AAGAGCTACC AACTCTTTTT CCGAAGGTAA CTGGCTTCAG CAGAGCGCAG ATACCAAATA 4020

CTGTCCTTCT AGTGTAGCCG TAGTTAGGCC ACCACTTCAA GAACTCTGTA GCACCGCCTA 4080

CATACCTCGC TCTGCTAATC CTGTTACCAG TGGCTGCTGC CAGTGGCGAT AAGTCGTGTC 4140

TTACCGGGTT GGACTCAAGA CGATAGTTAC CGGATAAGGC GCAGCGGTCG GGCTGAACGG 4200

GGGGTTCGTG CACACAGCCC AGCTTGGAGC GAACGACCTA CACCGAACTG AGATACCTAC 4260

AGCGTGAGCA TTGAGAAAGC GCCACGCTTC CCGAAGGGAG AAAGGCGGAC AGGTATCCGG 4320

TAAGCGGCAG GGTCGGAACA GGAGAGCGCA CGAGGGAGCT TCCAGGGGGA AACGCCTGGT 4380

ATCTTTATAG TCCTGTCGGG TTTCGCCACC TCTGACTTGA GCGTCGATTT TTGTGATGCT 4440

CGTCAGGGGG GCGGAGCCTA TGGAAAAACG CCAGCAACGC GGCCTTTTTA CGGTTCCTGG 4500

CCTTTTGCTG GCCTTTTGCT CACATGTTCT TTCCTGCGTT ATCCCCTGAT TCTGTGGATA 4560

ACCGTATTAC CGCCTTTGAG TGAGCTGATA CCGCTCGCCG CAGCCGAACG ACCGAGCGCA 4620

GCGAGTCAGT GAGCGAGGAA GCGGAAGAGC GCCCAATACG CAAACCGCCT CTCCCCGCGC 4680

GTTGGCCGAT TCATTAATGC AGCGGATCCA GACATGATAA GATACATTGA TGAGTTTGGA 4740

CAAACCACAA CTAGAATGCA GTGAAAAAAA TGCTTTATTT GTGAAATTTG TGATGCTATT 4800

GCTTTATTTG TAACCATTAT AAGCTGCAAT AAACAAGTTA GCTTTTTGCA AAAGCCTAGG 4860

<210> SEQ ID NO:3

<211>4947 п.н.

<212>DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

предназначенной для оценки функциональной активности минигеномной системы.

<400> 3

TGGCCGATTC ATTAATGCAG CGGATCCAGA CATGATAAGA TACATTGATG AGTTTGGACA 60

AACCACAACT AGAATGCAGT GAAAAAAATG CTTTATTTGT GAAATTTGTG ATGCTATTGC 120

TTTATTTGTA ACCATTATAA GCTGCAATAA ACAAGTTAGC TTTTTGCAAA AGCCTAGGCC 180

TCTCGAGAAA TTAATACGAC TCACTATAGT AGTAGTAGAC TCCTTGAAAA GCTACTACGA 240

GAACAAAACT GGAATGAGTG ACACCATGGC CTCCTCCGAG GACGTCATCA AGGAGTTCAT 300

GCGCTTCAAG GTGCGCATGG AGGGCTCCGT GAACGGCCAC GAGTTCGAGA TCGAGGGCGA 360

GGGCGAGGGC CGCCCCTACG AGGGCACCCA GACCGCCAAG CTGAAGGTGA CCAAGGGCGG 420

CCCCCTGCCC TTCGCCTGGG ACATCCTGTC CCCCCAGTTC CAGTACGGCT CCAAGGTGTA 480

CGTGAAGCAC CCCGCCGACA TCCCCGACTA CAAGAAGCTG TCCTTCCCCG AGGGCTTCAA 540

GTGGGAGCGC GTGATGAACT TCGAGGACGG CGGCGTGGTG ACCGTGACCC AGGACTCCTC 600

CCTGCAGGAC GGCTCCTTCA TCTACAAGGT GAAGTTCATC GGCGTGAACT TCCCCTCCGA 660

CGGCCCCGTA ATGCAGAAGA AGACTATGGG CTGGGAGGCC TCCACCGAGC GCCTGTACCC 720

CCGCGACGGC GTGCTGAAGG GCGAGATCCA CAAGGCCCTG AAGCTGAAGG ACGGCGGCCA 780

CTACCTGGTG GAGTTCAAGT CCATCTACAT GGCCAAGAAG CCCGTGCAGC TGCCCGGCTA 840

CTACTACGTG GACTCCAAGC TGGACATCAC CTCCCACAAC GAGGACTACA CCATCGTGGA 900

GCAGTACGAG CGCGCCGAGG GCCGCCACCA CCTGTTCCTG GGCTCCGGAG CTACTAACTT 960

CAGCCTGCTG AAGCAGGCTG GAGACGTGGA GGAGAACCCC GGGCCCAGTG ACTTGACAGA 1020

CATCCAAGAG GAGATAACCC GCCATGAGCA ACAACTTGTT GTTGCCAGAC AAAAACTCAA 1080

GGATGCAGAG AGAGCAGTGG AAGTGGACCC GGATGACGTT AACAAAAACA CACTACAAGC 1140

GAGGCAACAA ACAGTGTCAG CATTGGAGGA TAAACTCGCA GACTACAAGA GAAGAATGGC 1200

AGATGCTGTG TCCCGGAAGA AAATGGATAC TAAACCTACT GACCCGACTG GGATTGAACC 1260

TGATGATCAT CTCAAGGAGA GATCAAGCCT TAGATATGGA AATGTCCTTG ATGTAAATGC 1320

CATTGACATT GAAGAACCAA GTGGTCAGAC AGCAGATTGG TATACTATTG GAGTCTATGT 1380

AATAGGTTTT ACAATTCCCA TCATTTTAAA GGCTCTATAC ATGTTGTCAA CACGTGGAAG 1440

ACAGACCGTG AAAGAGAACA AGGGAACACG GATCAGGTTC AAGGATGACA CATCATTTGA 1500

GGATATTAAT GGCATTAGGA GACCAAAACA TCTATATGTG TCCATGCCTA CTGCCCAGTC 1560

CACCATGAAA GCTGAAGAAC TTACACCCGG ACGGTTTCGT ACAATTGTAT GTGGCTTATT 1620

CCCTACACAG ATACAAGTGC GTAATATCAT GAGTCCAGTG ATGGGAGTGA TTGGTTTTTC 1680

TTTTTTTGTC AAAGACTGGC CAGAGAGGAT TAGGGAATTT ATGGAAAAAG AATGCCCTTT 1740

CATAAAACCA GAAGTTAAGC CCGGGACACC AGCACAGGAG ATAGAATTTT TGAAAAGGAA 1800

TAGGGTTTAT TTCATGACCC GCCAAGATGT TCTTGACAAA AATCATGTGG CTGACATTGA 1860

TAAGTTAATT GACTATGCTG CCTCTGGTGA CCCTACATCA CCTGATGACA TCGAATCGCC 1920

TAATGCACCA TGGGTATTTG CTTGTGCACC AGACCGGTGT CCCCCTACAT GCATTTATGT 1980

TGCTGGGATG GCTGAATTAG GCGCATTCTT TTCAATCCTA CAGGATATGA GGAACACTAT 2040

TATGGCATCT AAAACTGTAG GTACAGCAGA AGAGAAATTA AAAAAGAAGT CCTCCTTCTA 2100

TCAATCATAT TTACGCCGGA CACAATCAAT GGGGATTCAA CTTGATCAGA GGATAATCCT 2160

ACTGTACATG TTGGAGTGGG GAAAAGAAAT GGTGGATCAT TTCCATCTTG GTGATGATAT 2220

GGATCCTGAG CTCAGGGGCC TTGCTCAGTC ACTCATAGAT CAGAAAGTAA AAGAAATATC 2280

AAATCAGGAG CCCTTAAAGA TATGATTAAA TCAAGTTTAT TACTAATTAT AGATATAGTA 2340

TATTGCTAAT CTTAGATTAT CCCATATATT CAGGGATTTA TTAATTGTTT ACTAATTCAA 2400

ATATACGGGT TTGACAATTA TTAGTATCAG GGTTTTGAAT TAATGCACTA ATCAGGGTTT 2460

AACTGGAATT ACACAATAAC AATTACATAT CAAATTATAG ATTTACTACA GGAATTACTA 2520

ATGACAGTTA TGAATGTAAT ATCATAGTAT ATTTTTGTAA TCAATATCCA ATTAGCATTA 2580

TATATGTATA GATTTATAGT TTACTATTCC ATTTAAGGGG CCCAAGAATG TGAAACTGAG 2640

CTATCCCTTT CTTTTTCACC ACTATCTCTC TTACTTCCTA CCTCAGTGTA CTTATATATA 2700

TGCAAGTAGC ATATATATAA GTACACAACA TACTACCTCA ACATGCTGAT TTCTTGATTG 2760

CTTTTCAAGG AGTCTACTAC TAGGGTCGGC ATGGCATCTC CACCTCCTCG CGGTCCGACC 2820

TGGGCATCCG AAGGAGGACG CACGTCCACT CGGATGGCTA AGGGAGAGCC ACTTTTTTTT 2880

CCACCGCTGA GCAATAACTA GCATAACCCC TTGGGGCCTC TAAACGGGTC TTGAGGGGTT 2940

TTTTGCTGAA AGGAGGAACT AGTCAATAAT CAATGTCGAC CAGGTGGCAC TTTTCGGGGA 3000

AATGTGCGCG GAACCCCTAT TTGTTTATTT TTCTAAATAC ATTCAAATAT GTATCCGCTC 3060

ATGAGACAAT AACCCTGATA AATGCTTCAA TAATATTGAA AAAGGAAGAG TATGAGTATT 3120

CAACATTTCC GTGTCGCCCT TATTCCCTTT TTTGCGGCAT TTTGCCTTCC TGTTTTTGCT 3180

CACCCAGAAA CGCTGGTGAA AGTAAAAGAT GCTGAAGATC AGTTGGGTGC ACGAGTGGGT 3240

TACATCGAAC TGGATCTCAA CAGCGGTAAG ATCCTTGAGA GTTTTCGCCC CGAAGAACGT 3300

TTTCCAATGA TGAGCACTTT TAAAGTTCTG CTATGTGGCG CGGTATTATC CCGTATTGAC 3360

GCCGGGCAAG AGCAACTCGG TCGCCGCATA CACTATTCTC AGAATGACTT GGTTGAGTAC 3420

TCACCAGTCA CAGAAAAGCA TCTTACGGAT GGCATGACAG TAAGAGAATT ATGCAGTGCT 3480

GCCATAACCA TGAGTGATAA CACTGCGGCC AACTTACTTC TGACAACGAT CGGAGGACCG 3540

AAGGAGCTAA CCGCTTTTTT GCACAACATG GGGGATCATG TAACTCGCCT TGATCGTTGG 3600

GAACCGGAGC TGAATGAAGC CATACCAAAC GACGAGCGTG ACACCACGAT GCCTGTAGCA 3660

ATGGCAACAA CGTTGCGCAA ACTATTAACT GGCGAACTAC TTACTCTAGC TTCCCGGCAA 3720

CAATTAATAG ACTGGATGGA GGCGGATAAA GTTGCAGGAC CACTTCTGCG CTCGGCCCTT 3780

CCGGCTGGCT GGTTTATTGC TGATAAATCT GGAGCCGGTG AGCGTGGCTC TCGCGGTATC 3840

ATTGCAGCAC TGGGGCCAGA TGGTAAGCCC TCCCGTATCG TAGTTATCTA CACGACGGGG 3900

AGTCAGGCAA CTATGGATGA ACGAAATAGA CAGATCGCTG AGATAGGTGC CTCACTGATT 3960

AAGCATTGGT AACTGTCAGA CCAAGTTTAC TCATATATAC TTTAGATTGA TTTAAAACTT 4020

CATTTTTAAT TTAAAAGGAT CTAGGTGAAG ATCCTTTTTG ATAATCTCAT GACCAAAATC 4080

CCTTAACGTG AGTTTTCGTT CCACTGAGCG TCAGACCCCG TAGAAAAGAT CAAAGGATCT 4140

TCTTGAGATC CTTTTTTTCT GCGCGTAATC TGCTGCTTGC AAACAAAAAA ACCACCGCTA 4200

CCAGCGGTGG TTTGTTTGCC GGATCAAGAG CTACCAACTC TTTTTCCGAA GGTAACTGGC 4260

TTCAGCAGAG CGCAGATACC AAATACTGTC CTTCTAGTGT AGCCGTAGTT AGGCCACCAC 4320

TTCAAGAACT CTGTAGCACC GCCTACATAC CTCGCTCTGC TAATCCTGTT ACCAGTGGCT 4380

GCTGCCAGTG GCGATAAGTC GTGTCTTACC GGGTTGGACT CAAGACGATA GTTACCGGAT 4440

AAGGCGCAGC GGTCGGGCTG AACGGGGGGT TCGTGCACAC AGCCCAGCTT GGAGCGAACG 4500

ACCTACACCG AACTGAGATA CCTACAGCGT GAGCATTGAG AAAGCGCCAC GCTTCCCGAA 4560

GGGAGAAAGG CGGACAGGTA TCCGGTAAGC GGCAGGGTCG GAACAGGAGA GCGCACGAGG 4620

GAGCTTCCAG GGGGAAACGC CTGGTATCTT TATAGTCCTG TCGGGTTTCG CCACCTCTGA 4680

CTTGAGCGTC GATTTTTGTG ATGCTCGTCA GGGGGGCGGA GCCTATGGAA AAACGCCAGC 4740

AACGCGGCCT TTTTACGGTT CCTGGCCTTT TGCTGGCCTT TTGCTCACAT GTTCTTTCCT 4800

GCGTTATCCC CTGATTCTGT GGATAACCGT ATTACCGCCT TTGAGTGAGC TGATACCGCT 4860

CGCCGCAGCC GAACGACCGA GCGCAGCGAG TCAGTGAGCG AGGAAGCGGA AGAGCGCCCA 4920

ATACGCAAAC CGCCTCTCCC CGCGCGT 4947

<---

Claims

Минигеномная система вируса Пуумала для оценки противовирусной активности ингибиторов РНК-зависимой РНК-полимеразы, характеризующаяся тем, что содержит:
- рекомбинантную плазмиду nStem-IRES-PUUV_L, предназначенную для внутриклеточного синтеза вирусного белка РНК-зависимой РНК-полимеразы, имеющую нуклеотидную последовательность SEQ NO: 1 размером 9996 п.н., содержащую в соответствии с физической и генетической картой, представленной на фиг. 1, ген, кодирующий РНК-зависимую РНК-полимеразу вируса Пуумала, и состоящую из следующих элементов:
• ген β-лактамазы, имеющий координаты с 7983 по 8843 п.н., под контролем промотора, в качестве генетического маркера, определяющего устойчивость к ампициллину клеток бактерии E. Coli и имеющего координаты с 7878 по 7982 п.н.;
• ORI (origin of replication) - точка начала репликации плазмидного вектора nStem, имеющего координаты с 9014 по 9602 п.н.;
• Т7 promoter - нуклеотидная последовательность промотора бактериофага Т7, необходимая для in vitro транскрипции и имеющая координаты с 9 по 32 п.н.;
• Т7 terminator - нуклеотидная последовательность терминатора бактериофага Т7, необходимая для in vitro транскрипции и имеющая координаты с 7769 по 7816 п.н.;
• L protein - открытая рамка считывания гена RdRp РНК-зависимой РНК-полимеразы вируса Пуумала, имеющая координаты с 623 по 7093 п.н.;
• IRES - внутренний сайт посадки рибосом вируса энцефаломиелита, обеспечивающий экспрессию гена и имеющий координаты с 45 по 619 п.н.;
• SV40 poly(A) signal - сигнал полиаденелирования, имеющий координаты с 9841 по 9975 п.н.;
• WPRE - посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурка, необходимый для увеличения уровня экспрессии белка, имеющий координаты с 7135 по 7723 п.н.;
- рекомбинантную плазмиду nStem-IRES-PUUV_N, предназначенную для внутриклеточного синтеза вирусного белка нуклеопротеина, имеющую последовательность SEQ NO: 2 размером 4860 п.н., содержащую в соответствии с физической и генетической картой, представленной на фиг. 2, целевой ген, кодирующий нуклеопротеин вируса Пуумала, и состоящую из следующих элементов:
• ген β-лактамазы, имеющий координаты с 2847 по 3707 п.н., под контролем промотора в качестве генетического маркера, определяющего устойчивость к ампициллину клеток бактерии E. Coli и имеющего координаты с 2742 по 2846 п.н.;
• ORI (origin of replication) - точка начала репликации плазмидного вектора nStem, имеющего координаты с 3878 по 4466 п.н.;
• Т7 promoter - нуклеотидная последовательность промотора бактериофага Т7, необходимая для in vitro транскрипции и имеющая координаты с 9 по 32 п.н.;
• Т7 terminator - нуклеотидная последовательность терминатора бактериофага Т7, необходимая для in vitro транскрипции и имеющая координаты с 2633 по 2680 п.н.;
• нуклеопротеин (N) - открытая рамка считывания гена нуклеопротеина вируса Пуумала, имеющая координаты с 623 по 1924 п.н.;
• IRES - внутренний сайт посадки рибосом вируса энцефаломиелита, обеспечивающий экспрессию гена и имеющий координаты с 45 по 619 п.н.;
• SV40 poly(A) signal - сигнал полиаденелирования, имеющий координаты с 4705 по 4839 п.н.;
• WPRE - посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурка, необходимый для увеличения экспрессии белка и имеющий координаты с 1999 по 2587 п.н.;
- рекомбинантную плазмиду nStem-PUUV_S_DsRed, предназначенную для оценки функциональной активности минигеномной системы, имеющую последовательность SEQ ID NO: 3 размером 4947 п.н., содержащую в соответствии с физической и генетической картой, представленной на фиг. 3, полноразмерную кДНК копию S-сегмента вируса Пуумала, в открытую рамку считывания которого через P2A белок вcтроен ген репортерного флуоресцентного красного белка DsRed_Express, и состоящую из следующих элементов:
• ген β-лактамазы, имеющий координаты с 2847 по 3707 п.н. под контролем промотора в качестве генетического маркера, определяющего устойчивость к ампициллину клеток бактерии E. Coli и имеющего координаты с 2742 по 2846 п.н.;
• ORI (origin of replication) - точка начала репликации плазмидного вектора nStem, имеющая координаты с 3878 по 4466 п.н.;
• SV40 poly(A) signal - сигнал полиаденелирования, имеющий координаты с 4705 по 4839 п.н.;
• Т7 promoter - нуклеотидная последовательность промотора бактериофага Т7, необходимая для in vitro транскрипции и имеющая координаты с 9 по 32 п.н.;
• S_DsRed - полноразмерная кДНК копия S-сегмента вируса Пуумала, имеющая координаты с 210 по 2782 п.н., включающая открытую рамку считывания гена нуклеопротеина (N), имеющую координаты с 950 по 1006 п.н. со вставленным в нее через P2A геном красного флуоресцентного белка DsRed_Express, имеющим координаты с 266 по 940 п.н.;
• HDV-dRbz - рибозим вируса гепатита дельта, необходимый для синтеза РНК с аутентичными 5’ концами и имеющий координаты с 2783 по 2872 п.н.;
• Т7 terminator - нуклеотидная последовательность терминатора бактериофага Т7, необходимая для in vitro транскрипции и имеющая координаты с 2633 по 2680 п.н.