CN113699177A - OsABF1基因在水稻育种调控和/或水稻种子活力机制研究中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了OsABF1基因在水稻育种调控和/或水稻种子活力机制研究中的应用，属于植物学和生物技术领域。所述的OsABF1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。所述的OsABF1基因的编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。与野生型(WT)比，OsABF1基因过表达植株(OsABF1‑OE)的种子萌发率显著的低于野生型植株(WT)，而突变体osabf1水稻种子的萌发率略高于野生型植株(WT)，但显著高于OsABF1基因过表达植株(OsABF1‑OE)种子萌发率。OsABF1基因是一个潜在的协同水稻抗逆和水稻种子育种调控和/或水稻种子活力机制研究的候选新靶点。

Description

OsABF1基因在水稻育种调控和/或水稻种子活力机制研究中 的应用

技术领域

本发明属于植物学和生物技术领域，具体涉及OsABF1基因在水稻育种调控和/或水稻种子活力机制研究中的应用。

背景技术

水稻是世界上最重要的粮食作物之一。近年来，随着经济的快速发展和城镇化脚步的日益加快，降低成本、操作简便的水稻直播技术正逐渐取代传统的水稻育秧栽培模式。值得一提的是，种子活力已成为影响直播技术推广的关键因素之一。因此，发掘调控水稻种子活力的相关基因，并阐明其调控机制，对于培育适用于水稻直播的优质高产、高活力的新品种具有重要意义。

种子休眠和萌发是影响其活力的主要遗传因素。众所周知，植物激素脱落酸(Abscisic acid，ABA)是调控种子休眠和萌发的最重要内源因素，ABA浓度降低或相关蛋白的降解均可打破休眠促进萌发。已有研究表明，OsbZIP12是水稻ABA信号途径和耐旱胁迫中的一个正效调节因子，同时OsABF1是开花转变的负向调控因子，干旱会增加OsABF1表达，从而间接抑制Ehd1基因的表达，延迟抽穗。值得一提的是，目前尚未发现OsABF1参与种子活力的调控，如种子休眠。现在有关OsABF1基因的研究进展基本上是关于抗逆性的功能。但有关OsABF1基因对于水稻种子活力的调控并未见报道。

发明内容

本发明目的在于提供OsABF1基因的应用，特别是OsABF1基因在水稻育种调控和/或水稻种子活力机制研究中的应用。

本发明的上述目的通过以下技术方案实现：

OsABF1基因在水稻育种调控和/或水稻种子活力机制研究中的应用。

所述的OsABF1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

所述的OsABF1基因的编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

所述的水稻育种调控优选包括对水稻种子活力改良的调控。

所述的对水稻种子活力改良的调控优选为对水稻种子萌发率的调控。

所述的调控为负调控。

所述的负调控是指在水稻中过表达OsABF1基因，促进水稻OsABF1过表达水稻种子休眠，导致OsABF1基因过表达植株(OsABF1-OE)种子萌发率降低，而突变体osabf1的水稻种子萌发率略高于野生株WT，但显著高于OsABF1基因过表达植株(OsABF1-OE)种子萌发率。因此，敲除OsABF1基因对提高种子活力具有重要意义，为水稻直播技术的发展提供理论基础。

所述的水稻优选为粳稻。

所述的粳稻优选为中花11。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

(1)本发明利用PCR的方法从水稻中克隆出OsABF1基因(所对应基因座位号与RiceGenome Annotation Project中公布的LOC_Os01g64730相对应)。OsABF1基因对提高水稻种子活力具有重要意义，可以作为水稻种子活力改良的新靶点。

(2)本发明通过CRISPR/Cas9敲除OsABF1，获得osabf1突变体植株。对osabf1突变体萌发的表型进行详细分析。结果表明，与野生型(WT)比，OsABF1基因过表达植株(OsABF1-OE)的种子萌发率显著的低于野生型植株(WT)，而突变体osabf1水稻种子的萌发率略高于野生型植株(WT)，但显著高于OsABF1基因过表达植株(OsABF1-OE)种子萌发率。由此推断，OsABF1正调控水稻种子的休眠。

(3)本发明通过深入的研究探索OsABF1基因的表达调控，结合基因编辑技术，有望创制优异的OsABF1等位基因，如敲除该基因可以促进水稻种子萌发，提高种子活力。

(4)基于以往的研究，OsABF1基因能够有效提高植株的抗逆性，提高水稻对环境的适应性，尤其是对不良环境的适应性。可见，OsABF1基因是一个潜在的协同水稻抗逆和水稻种子育种调控和/或水稻种子活力机制研究的候选新靶点。

附图说明

图1为OsABF1的基因编辑：野生型(WT)和突变体(osabf1)的序列分析图；其中，该序列分析图通过chromas软件查看比对，AGATCCGATGCCGTGTGCGA代表靶位点，PAM代表crRNA互补序列邻近基序，箭头所指代表突变位点，箭头所指字体A代表插入碱基A。

图2为OsABF1的表型分析结果图；其中，图a为野生型植株(WT)、突变体osabf1 植株和OsABF1基因过表达植株(OsABF1-OE)的种子萌发率实物图；图b为野生型植株(WT)、突变体osabf1植株和OsABF1基因过表达植株(OsABF1-OE)的种子萌发率统计结果图；每个水稻品种重复三次；·表示显著，··表示极显著，n＝3。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例中所使用的实验方法如无说明，均为常规方法。

植物材料：本研究供试材料为粳稻背景(Oryza sativa L.)。野生型(WT)为中花11(ZH11) (公开使用的水稻品种，市售)。植物过表达载体pRHV由中国农业科学院王国梁课题组提供 (植物过表达载体pRHVcGFP在He F,Zhang F,Sun W,et al.A Versatile VectorToolkit for Functional Analysis of Rice Genes[J].Rice,2018,11(1):27.的补充数据中已公开)；以上遗传材料的遗传转化由百格基因科技(江苏)有限公司构建。菌株和质粒：实验所用的菌株大肠杆菌 DH5α购自广州春泥有限公司；pYLCRISPR/Cas9Pubi-H和pYLsgRNA-OsU3载体由华南农业大学刘耀光院士课题组提供(pYLCRISPR/Cas9Pubi-H和pYLsgRNA-OsU3载体已在曾栋昌,马兴亮,谢先荣,等.植物CRISPR/Cas9多基因编辑载体构建和突变分析的操作方法[J].中国科学: 生命科学,2018,048(007):783-794.中公开)；

化学试剂：限制性核酸内切酶KpnI、SpeI、BsaI-HF和T4 DNA连接酶购自NewEngland Biolabs公司；高保真酶KOD FX购自TOYOBO公司；abm反转录试剂盒购自abm生物科技有限公司；胶回收试剂盒和质粒抽提试剂盒购自济凡生物科技(北京)有限公司；2×TaqPCR StarMix购自北京康润诚业生物科技有限公司。PCR产物纯化试剂盒购于生工生物工程(上海) 股份有限公司。

实施例1：水稻osabf1突变体的获得

osabf1突变体是根据曾栋昌,马兴亮,谢先荣,等.植物CRISPR/Cas9多基因编辑载体构建和突变分析的操作方法[J].中国科学:生命科学,2018,048(007):783-794.中记载的 CRISPR/Cas9技术构建的，具体步骤如下：

1、靶序列选择及引物设计

以野生型植株OsABF1基因取23bp大小AGATCCGATGCCGTGTGCGACGG为靶点序列，根据靶位点设计引物，如表1。

表1：靶位点引物

表2：构建sgRNA表达盒的通用引物

2、sgRNA表达盒的构建

OsABF1-gRT与OsABF1-OsU3T1引物用水稀释至浓度100μM，前引物和后引物各20μL，混合在一起，引物混合后变性退火，100℃变性5分钟，室温冷却，形成带有粘性末端的片段。中间载体SK-gRNA进行AarI酶切，37℃酶切3-6h，试剂盒纯化酶切产物，形成带有粘性末端的载体，酶切体系如表3所示。

表3：第一轮PCR反应体系

注：反应1为U-F和OsABF1-OsU3T1的PCR扩增产物；反应2为OsABF1-gRT和gR-R 的PCR扩增产物。

98℃变性10s、58℃退火15s、68℃延伸15s，25-26个PCR循环。

分别取3-5μL反应1和反应2的PCR扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检查(反应1产物长度约750bp，反应2产物长度约140bp)。如果扩增产物较弱，也可以继续第二轮PCR。

表4：第二轮PCR反应体系

注：若琼脂糖凝胶电泳检测反应1和反应2条带较亮，则稀释10倍作为第二轮PCR模板；若条带较弱则直接用于第二轮扩增模板。

98℃变性10s、58℃退火15s、68℃延伸30s，25-28个PCR循环。

取3μL PCR产物电泳检查，并估计样品的大致浓度，用PCR产物纯化试剂盒纯化，即得sgRNA表达盒。

3、将sgRNA表达盒克隆到pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体

此步骤使用基于Bsa I-HF酶切和连接的“金门”克隆方法，以“边切边连”法组装sgRNA 表达盒到pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体。也可以采用Gibson Assembly方法组装sgRNA表达盒到pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体。

表5：pYLCRISPR/Cas9 Pubi-H载体“边切边连”反应体系

用变温循环(可使用PCR仪)进行边切边连反应：37℃变性5min、10℃退火5min、20℃延伸5min，10-15个PCR循环；37℃总延伸5min。

取上一步的连接产物3-5μL转化至感受态细胞DH5α，无抗LB液体培养基37℃培养30 min，将转化细胞涂在含卡那霉素(25g/mL)的LB平板37℃过夜培养。利用测序引物SP-R进行测序检测，验证重组载体是否正确。

4、转化植株靶点突变类型的检测

利用农杆菌等方法介导的遗传转化，获得转化植株后，可用Cas9检测引物Cas9-F/Cas-R (表2)进一步确认。获得转基因植株T₀代，再将T₀代自交繁种，直至获得纯合位点的单突变体(该过程由百格基因科技(江苏)有限公司完成)。通过测序(测序由广州睿博生物技术有限公司完成)比对该基因靶位点，确定该基因在第39位插入了一个A碱基，最终导致其发生移码而提前终止。

5、水稻基因组总DNA的提取

提取待测水稻植株叶片基因组DNA，在敲除靶位点序列附近设计引物，经PCR扩增后，产物进行测序分析，鉴定其基因靶序列是否发生了改变。

(1)取少量叶片置2mL管子中，加入钢珠，加入400-500μL TPS溶液。

(2)粉碎机粉碎，75℃水浴30min；

(3)12000rpm离心10min；

(4)取上清(500μL)至1.5mL管子中，加冰冻的等体积无水乙醇，上下混匀；

(5)放置-20℃0.5h以上；

(6)12000rpm离心5min，去上清；

(7)静置0.5h以上，去酒精，干燥；

(8)加100μL ddH₂O，混合均匀，溶解备用。

6、PCR扩增鉴定

以提取的DNA为模板，引物为表6的OsABF1-F/R，进行PCR扩增，PCR扩增反应体系如表7所示。

表6：PCR扩增的目的片段引物

表7：PCR反应体系

扩增程序为：94℃预变性5min；98℃变性10s、55℃退火30s、68℃延伸60s/1kb，25个循环；72℃总延伸5min，16℃保持1min。反应结束后，取5μL扩增产物加到含核酸染料的1％琼脂糖凝胶中电泳；电泳结束后在紫外成像仪上照胶，检测条带是否扩增出来，如果条带扩增出来，说明该片段是可能包含突变点的目的基因片段。其余PCR产物则送去测序公司进行测序(测序由广州睿博生物技术有限公司完成)。

7、测序比对

将测序结果放入刘耀光院士DSDecodeM(http://skl.scau.edu.cn/dsdecode/)网站进行比对，根据峰图判断纯杂合位点，单峰则代表纯合位点，双峰则代表杂合位点。结果如图1所示，突变位点插入A的并为单峰则表示该植株即纯合的osabf1突变体植株。

实施例2：OsABF1过表达植株的构建

植物过表达载体pRHVcGFP由中国农业科学院王国梁课题组提供(植物过表达载体pRHVcGFP已在He F,Zhang F,Sun W,et al.A Versatile Vector Toolkit forFunctional Analysis of Rice Genes[J].Rice,2018,11(1):27.的补充数据中公开)。

1、pRHVcGFP-OsABF1过表达载体的构建

(1)目的基因扩增

取WT叶片的cDNA为模板(根据abm反转录试剂盒说明书操作)，根据目的基因设计引物(表8)，经过PCR扩增得到目的基因，扩增PCR体系如表9所示：

表8：PCR扩增的目的片段引物

表9：目的基因PCR反应体系

扩增程序为：94℃预变性5min；98℃变性10s、55℃退火30s、68℃延伸60s，32个循环； 68℃总延伸5min，16℃保持1min。反应结束后，取50μL扩增产物加到含核酸染料的1％琼脂糖凝胶中电泳，电泳结束后在紫外成像仪上照胶，检测条带是否扩增出来。如果目的条带扩增出来，说明扩增片段中可能含有目的基因。将目的条带切割起来，继续胶回收纯化产物(根据胶回收试剂盒说明书操作)以及浓度测定。

(2)制备线性化载体

分别取过表达载体pRHVcGFP和目的基因各3μg(根据质粒抽提试剂盒说明书操作)，两个反应体系都加入相应限制性核酸内切酶37℃双酶切20min。过表达载体pRHVcGFP和目的基因各反应体系如表10所示：

表10：酶切反应体系

取50μL反应产物加到含核酸染料的1％琼脂糖凝胶中电泳，电泳结束后在紫外成像仪上照胶，目的条带分离出来后，将目的条带切割起来，继续胶回收纯化产物以及浓度测定。

(3)重组反应

用2×Hieff

MultiS Enzyme Premix(来源于多片段一步法快速克隆试剂盒，购于上海翊圣生物科技有限公司)同源重组酶将插入片段和载体按比例重组起来，得到pRHVcGFP-OsABF1过表达载体。最适载体与插入片段摩尔比为1:(2-3)。这些摩尔数对应的DNA质量可由以下公式粗略计算获得：最适载体使用量X＝[0.02×载体碱基对数]ng(0.03pmol)。最适插入片段使用量Y＝[0.04×插入片段碱基对数]ng(0.06pmol)或＝[0.06×插入片段碱基对数]ng(0.09pmol)。重组反应体系如表11：

表11：重组反应体系

体系配制完成后，用移液器轻轻吸打混匀各组分，短暂离心将反应液收集至管底。置于50℃反应20min。反应产物可直接进行转化，也可储存于-20℃，待需要时解冻转化。

(4)重组产物转化、涂板

在冰上解冻克隆感受态细胞DH5α。取10μL冷却重组产物(pRHVcGFP-OsABF1过表达载体)，加入到100μL感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30min；42℃热激 60秒，冰浴孵育2min，加入900μL LB培养基，37℃，200rpm，摇菌30min，5000rpm离心3min，弃掉上清。用剩余培养基将菌体重悬，用无菌涂布棒在含有kan抗性的平板上轻轻涂匀。待菌液被吸收，将平板倒置，于37℃过夜培养。

(5)克隆鉴定

最方便快捷的方法是菌落PCR。用无菌的枪头或牙签将单个菌落挑至500μL LB培养基中混匀，直接取1μL作为PCR模板，剩余菌液后续做测序鉴定。PCR反应体系如表12：

表12：菌落PCR反应体系

扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸30s，25个循环；72℃总延伸5min，16℃保持1min。反应结束后，取20μL扩增产物加到含核酸染料的 1％琼脂糖凝胶中电泳；电泳结束后在紫外成像仪上照胶，检测条带是否扩增出来。如果条带扩增出来，则将克隆送去测序公司进行测序(测序由广州睿博生物技术有限公司完成)，测序引物为：

UbiP-seq：TTTTAGCCCTGCCTTCATACGC；

CFP-seqR：AACTTGTGGCCGTTTACGTCG。

2、转基因植物遗传转化与鉴定

将构建好的pRHVcGFP-OsABF1过表达载体送去百格基因科技(江苏)有限公司做遗传转化，至得到T₀代植株。对得到的转基因植株进行鉴定，由于pRHVcGFP-OsABF1过表达载体带HYG潮霉素标签，所以只需要通过鉴定有无潮霉素标记判断是否是转基因植株。提取待测植株叶片的总基因组DNA，采用引物HYG(表13)进行PCR扩增，通过跑琼脂糖凝胶电泳判断PCR产物的条带大小是否符合，符合即为含有目的基因的转基因植株(即OsABF1 基因过表达植株)。PCR扩增方法参考植物pRHVcGFP-OsABF1过表达载体构建方法中的步骤(5)克隆鉴定的PCR反应体系和PCR扩增程序，反应结束后，取5μL扩增产物加到含有核酸染料的1％琼脂糖凝胶中电泳，电泳结束后在紫外成像仪上照胶，观察是否有目的条带。 T₀代植株自交，得到T₁代植株，T₁代植株自交，再得到T₂代纯合的OsABF1基因过表达植株(OsABF1-OE)。

表13：HYG鉴定引物

实施例3：OsABF1表型分析

本发明人在广东省广州市华南农业大学农场播种粳稻品种野生型(WT)、突变体(osabf1) 和OsABF1过表达植株(OsABF1-OE)，在水稻种子萌发过程中的测定水稻萌发率及对植物激素脱落酸(ABA)的响应。

待测水稻：野生型(WT)、突变体(osabf1)和OsABF1基因过表达植株(OsABF1-OE)。

分别取待测水稻种子，详细分析水稻种子萌发率，并对其进一步的测量统计。

具体步骤如下：取成熟度一致的20粒水稻种子摆放在含有滤纸的培养皿中并加入无菌水 5mL，置于黑暗条件28℃恒温培养箱培养3天后统计种子的萌发率；每个水稻品种重复三次。

结果如图2所示。表型分析发现，野生型(WT)、突变体(osabf1)和OsABF1基因过表达植株(OsABF1-OE)均对ABA敏感，且相较于WT和突变体osabf1，OsABF1基因过表达植株(OsABF1-OE)对ABA更敏感。与野生型(WT)相比，OsABF1基因过表达植株 (OsABF1-OE)表现出萌发缓慢且对ABA敏感的表型，与WT相比，突变体osabf1的萌发率略高于野生型植株(WT)，但显著高于OsABF1基因过表达植株(OsABF1-OE)种子萌发率。以上结果表明，OsABF1基因过表达负调控水稻种子活力，正调控水稻种子的休眠，是潜在的改良水稻种子活力的新靶点。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> OsABF1基因在水稻育种调控和/或水稻种子活力机制研究中的应用

<160> 26

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 801

<223> OsABF1基因的核苷酸序列

atgatggcgt cgagggtgat ggcgtcgtcg tcgccgtcgc acacggcatc ggatctcgcg 60

cggttcgcgg cggggagggg tgggggcggg agcgcggggc tggggtcgat gaacgtggag 120

gagatcctcc gcggcatcta cgccgacatg ccgacgccgg cgctgcccct cgtcggcggt 180

gacaggccga tgtcgccgct cccggcgccg gatgtcgccg ccgcgccgcg gacggcggag 240

gaggtctgga aggagataac tggtgcgggc gtcgccgccg ccgccggcgg cgtggtgccc 300

cctgctgctg ctgctgctgc tgccccggcc gtcgtcgctg gcgctggcgc tggcaccggc 360

gcggagatga cgctggagga ctttctggcg agggagggcg cggtgaagga agacgaggct 420

gtggtcaccg atccctcggc ggccaagggg caggtggtga tggggttcct gaacggggca 480

gaggtcaccg gaggcgtcac cggcggcagg agcaggaaga ggcacctgat ggatccgatg 540

gaccgcgccg cgatgcagcg gcagaagcga atgatcaaaa atcgcgagtc ggcggcgagg 600

tcacgggaga ggaagcaggc ctatattgct gagctcgagt cgctggtcac gcaactcgag 660

gaggagaacg ccaagatgtt caaagaacag gaggagcaac atcagaaacg acttaaagag 720

ctcaaggaaa tggttgttcc agtcatcatt aggaaaacgt cagcacgaga tcttagaaga 780

acaaactcga tggagtggta g 801

<210> 2

<211> 266

<223> OsABF1基因的氨基酸序列

Met Met Ala Ser Arg Val Met Ala Ser Ser Ser Pro Ser His Thr Ala

1 5 10 15

Ser Asp Leu Ala Arg Phe Ala Ala Gly Arg Gly Gly Gly Gly Ser Ala

20 25 30

Gly Leu Gly Ser Met Asn Val Glu Glu Ile Leu Arg Gly Ile Tyr Ala

35 40 45

Asp Met Pro Thr Pro Ala Leu Pro Leu Val Gly Gly Asp Arg Pro Met

50 55 60

Ser Pro Leu Pro Ala Pro Asp Val Ala Ala Ala Pro Arg Thr Ala Glu

65 70 75 80

Glu Val Trp Lys Glu Ile Thr Gly Ala Gly Val Ala Ala Ala Ala Gly

85 90 95

Gly Val Val Pro Pro Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Pro Ala Val Val

100 105 110

Ala Gly Ala Gly Ala Gly Thr Gly Ala Glu Met Thr Leu Glu Asp Phe

115 120 125

Leu Ala Arg Glu Gly Ala Val Lys Glu Asp Glu Ala Val Val Thr Asp

130 135 140

Pro Ser Ala Ala Lys Gly Gln Val Val Met Gly Phe Leu Asn Gly Ala

145 150 155 160

Glu Val Thr Gly Gly Val Thr Gly Gly Arg Ser Arg Lys Arg His Leu

165 170 175

Met Asp Pro Met Asp Arg Ala Ala Met Gln Arg Gln Lys Arg Met Ile

180 185 190

Lys Asn Arg Glu Ser Ala Ala Arg Ser Arg Glu Arg Lys Gln Ala Tyr

195 200 205

Ile Ala Glu Leu Glu Ser Leu Val Thr Gln Leu Glu Glu Glu Asn Ala

210 215 220

Lys Met Phe Lys Glu Gln Glu Glu Gln His Gln Lys Arg Leu Lys Glu

225 230 235 240

Leu Lys Glu Met Val Val Pro Val Ile Ile Arg Lys Thr Ser Ala Arg

245 250 255

Asp Leu Arg Arg Thr Asn Ser Met Glu Trp

260 265

<210> 3

<211> 23

<223> OsABF1基因的靶点序列

agatccgatg ccgtgtgcga cgg 23

<210> 4

<211> 39

<223> OsABF1-gRT

gatccgatgc cgtgtgcgac gggttttaga gctagaaat 39

<210> 5

<211> 36

<223> OsABF1-OsU3T1

ccgtcgcaca cggcatcggt gccacggatc atctgc 36

<210> 6

<211> 22

<223> 引物U-F

ctccgtttta cctgtggaat cg 22

<210> 7

<211> 20

<223> 引物gR-R

cggaggaaaa ttccatccac 20

<210> 8

<211> 47

<223> 引物Pps-R

ttcagaggtc tctaccgact agtcacgcgt atggaatcgg cagcaaa 47

<210> 9

<211> 40

<223> 引物Pgs-L

agcgtgggtc tcgctcgacg cgtatccatc cactccaagc 40

<210> 10

<211> 28

<223> 引物PB-R

gcgcgcggtc tctaccgact agtcacgc 28

<210> 11

<211> 30

<223> 引物PB-L

gcgcgcggtc tcgctcgacg cgtatccatc 30

<210> 12

<211> 22

<223> 引物SP-L

gcggtgtcat ctatgttact ag 22

<210> 13

<211> 21

<223> 引物SP-R

tgcaataact tcgtataggc t 21

<210> 14

<211> 20

<223> 引物Cas9-F

ctgacgctaa cctcgacaag 20

<210> 15

<211> 25

<223> 引物Cas9-R

ccgatctagt aacatagatg acacc 25

<210> 16

<211> 21

<223> 引物OsABF1-F

gtggaaactg gaaggtttgc g 21

<210> 17

<211> 18

<223> 引物OsABF1-R

gccctccctc gccagaaa 18

<210> 18

<211> 39

<223> 引物OsABF1-OE-F

ccgggtgagc tcggtaccat gatggcgtcg agggtgatg 39

<210> 19

<211> 36

<223> 引物OsABF1-OE-R

agcggccgca ctagtccact ccatcgagtt tgttct 36

<210> 20

<211> 22

<223> 引物UbiP-seq

ttttagccct gccttcatac gc 22

<210> 21

<211> 21

<223> 引物CFP-seqR

aacttgtggc cgtttacgtc g 21

<210> 22

<211> 24

<223> 引物HYG-F

aagatgttgg cgacctcgta ttgg 24

<210> 23

<211> 26

<223> 引物HYG-R

gatcgttatg tttatcggca ctttgc 26

<210> 24

<211> 9381

<223> 植物过表达载体pRHVcGFP序列

atgcaggtgt ctcaaaatct ctgatgttac attgcacaag ataaaaatat atcatcatga 60

acaataaaac tgtctgctta cataaacagt aatacaaggg gtgttatgag ccatattcaa 120

cgggaaacgt cgaggccgcg attaaattcc aacatggatg ctgatttata tgggtataaa 180

tgggctcgcg ataatgtcgg gcaatcaggt gcgacaatct atcgcttgta tgggaagccc 240

gatgcgccag agttgtttct gaaacatggc aaaggtagcg ttgccaatga tgttacagat 300

gagatggtca gactaaactg gctgacggaa tttatgcctc ttccgaccat caagcatttt 360

atccgtactc ctgatgatgc atggttactc accactgcga tccccggaaa aacagcattc 420

caggtattag aagaatatcc tgattcaggt gaaaatattg ttgatgcgct ggcagtgttc 480

ctgcgccggt tgcattcgat tcctgtttgt aattgtcctt ttaacagcga tcgcgtattt 540

cgtctcgctc aggcgcaatc acgaatgaat aacggtttgg ttgatgcgag tgattttgat 600

gacgagcgta atggctggcc tgttgaacaa gtctggaaag aaatgcataa acttttgcca 660

ttctcaccgg attcagtcgt cactcatggt gatttctcac ttgataacct tatttttgac 720

gaggggaaat taataggttg tattgatgtt ggacgagtcg gaatcgcaga ccgataccag 780

gatcttgcca tcctatggaa ctgcctcggt gagttttctc cttcattaca gaaacggctt 840

tttcaaaaat atggtattga taatcctgat atgaataaat tgcagtttca tttgatgctc 900

gatgagtttt tctaatcaga attggttaat tggttgtaac actggcagag cattacgctg 960

acttgacggg acggcgcaag ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt tcgttccact 1020

gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg 1080

taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc 1140

aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata 1200

ctgttcttct agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa gaactctgta gcaccgccta 1260

catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc 1320

ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg 1380

ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc gaacgaccta caccgaactg agatacctac 1440

agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg 1500

taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct tccaggggga aacgcctggt 1560

atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct 1620

cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg 1680

ccttttgctg gccttttgct cacatgttct ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata 1740

accgtattac cgcctttgag tgagctgata ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca 1800

gcgagtcagt gagcgaggaa gcggaagagc gcccggcgcg ccgaatgaac gccaagagga 1860

acaagcatga aaccgcacca ggacggccag gacgaaccgt ttttcattac cgaagagatc 1920

gaggcggaga tgatcgcggc cgggtacgtg ttcgagccgc ccgcgcacgt ctcaaccgtg 1980

cggctgcatg aaatcctggc cggtttgtct gatgccaagc tggcggcctg gccggccagc 2040

ttggccgctg aagaaaccga gcgccgccgt ctaaaaaggt gatgtgtatt tgagtaaaac 2100

agcttgcgtc atgcggtcgc tgcgtatatg atgcgatgag taaataaaca aatacgcaag 2160

gggaacgcat gaaggttatc gctgtactta accagaaagg cgggtcaggc aagacgacca 2220

tcgcaaccca tctagcccgc gccctgcaac tcgccggggc cgatgttctg ttagtcgatt 2280

ccgatcccca gggcagtgcc cgcgattggg cggccgtgcg ggaagatcaa ccgctaaccg 2340

ttgtcggcat cgaccgcccg acgattgacc gcgacgtgaa ggccatcggc cggcgcgact 2400

tcgtagtgat cgacggagcg ccccaggcgg cggacttggc tgtgtccgcg atcaaggcag 2460

ccgacttcgt gctgattccg gtgcagccaa gcccttacga catatgggcc accgccgacc 2520

tggtggagct ggttaagcag cgcattgagg tcacggatgg aaggctacaa gcggcctttg 2580

tcgtgtcgcg ggcgatcaaa ggcacgcgca tcggcggtga ggttgccgag gcgctggccg 2640

ggtacgagct gcccattctt gagtcccgta tcacgcagcg cgtgagctac ccaggcactg 2700

ccgccgccgg cacaaccgtt cttgaatcag aacccgaggg cgacgctgcc cgcgaggtcc 2760

aggcgctggc cgctgaaatt aaatcaaaac tcatttgagt taatgaggta aagagaaaat 2820

gagcaaaagc acaaacacgc taagtgccgg ccgtccgagc gcacgcagca gcaaggctgc 2880

aacgttggcc agcctggcag acacgccagc catgaagcgg gtcaactttc agttgccggc 2940

ggaggatcac accaagctga agatgtacgc ggtacgccaa ggcaagacca ttaccgagct 3000

gctatctgaa tacatcgcgc agctaccaga gtaaatgagc aaatgaataa atgagtagat 3060

gaattttagc ggctaaagga ggcggcatgg aaaatcaaga acaaccaggc accgacgccg 3120

tggaatgccc catgtgtgga ggaacgggcg gttggccagg cgtaagcggc tgggttgcct 3180

gccggccctg caatggcact ggaaccccca agcccgagga atcggcgtga gcggtcgcaa 3240

accatccggc ccggtacaaa tcggcgcggc gctgggtgat gacctggtgg agaagttgaa 3300

ggccgcgcag gccgcccagc ggcaacgcat cgaggcagaa gcacgccccg gtgaatcgtg 3360

gcaagcgtcc gctgatcgaa tccgcaaaga atcccggcaa ccgccggcag ccggtgcgcc 3420

gtcgattagg aagccgccca agggcgacga gcaaccagat tttttcgttc cgatgctcta 3480

tgacgtgggc acccgcgata gtcgcagcat catggacgtg gccgttttcc gtctgtcgaa 3540

gcgtgaccga cgagctggcg aggtgatccg ctacgagctt ccagacgggc acgtagaggt 3600

ttccgcaggg ccggccggca tggccagtgt gtgggattac gacctggtac tgatggcggt 3660

ttcccatcta accgaatcca tgaaccgata ccgggaaggg aagggagaca agcccggccg 3720

cgtgttccgt ccacacgttg cggacgtact caagttctgc cggcgagccg atggcggaaa 3780

gcagaaagac gacctggtag aaacctgcat tcggttaaac accacgcacg ttgccatgca 3840

gcgtacgaag aaggccaaga acggccgcct ggtgacggta tccgagggtg aagccttgat 3900

tagccgctac aagatcgtaa agagcgaaac cgggcggccg gagtacatcg agatcgagct 3960

agctgattgg atgtaccgcg agatcacaga aggcaagaac ccggacgtgc tgacggttca 4020

ccccgattac tttttgatcg atcccggcat cggccgtttt ctctaccgcc tggcacgccg 4080

cgccgcaggc aaggcagaag ccagatggtt gttcaagacg atctacgaac gcagtggcag 4140

cgccggagag ttcaagaagt tctgtttcac cgtgcgcaag ctgatcgggt caaatgacct 4200

gccggagtac gatttgaagg aggaggcggg gcaggctggc ccgatcctag tcatgcgcta 4260

ccgcaacctg atcgagggcg aagcatccgc cggttcctaa tgtacggagc agatgctagg 4320

gcaaattgcc ctagcagggg aaaaaggtcg aaaaggtctc tttcctgtgg atagcacgta 4380

cattgggaac ccaaagccgt acattgggaa ccggaacccg tacattggga acccaaagcc 4440

gtacattggg aaccggtcac acatgtaagt gactgatata aaagagaaaa aaggcgattt 4500

ttccgcctaa aactctttaa aacttattaa aactcttaaa acccgcctgg cctgtgcata 4560

actgtctggc cagcgcacag ccgaagagct gcaaaaagcg cctagtttac ccgccaatat 4620

atcctgtcag gcgcgccccg atctagtaac atagatgaca ccgcgcgcga taatttatcc 4680

tagtttgcgc gctatatttt gttttctatc gcgtattaaa tgtataattg cgggactcta 4740

atcataaaaa cccatctcat aaataacgtc atgcattaca tgttaattat tacatgctta 4800

acgtaattca acagaaatta tatgataatc atcgcaagac cggcaacagg attcaatctt 4860

aagaaacttt attgccaaat gtttgaacga tctactcact tagcggccgt tacttgtaca 4920

gctcgtccat gccgagagtg atcccggcgg cggtcacgaa ctccagcagg accatgtgat 4980

cgcgcttctc gttggggtct ttgctcaggg cggactgggt gctcaggtag tggttgtcgg 5040

gcagcagcac ggggccgtcg ccgatggggg tgttctgctg gtagtggtcg gcgagctgca 5100

cgctgccgtc ctcgatgttg tggcggatct tgaagttcac cttgatgccg ttcttctgct 5160

tgtcggccat gatatagacg ttgtggctgt tgtagttgta ctccagcttg tgccccagga 5220

tgttgccgtc ctccttgaag tcgatgccct tcagctcgat gcggttcacc agggtgtcgc 5280

cctcgaactt cacctcggcg cgggtcttgt agttgccgtc gtccttgaag aagatggtgc 5340

gctcctggac gtagccttcg ggcatggcgg acttgaagaa gtcgtgctgc ttcatgtggt 5400

cggggtagcg gctgaagcac tgcacgccgt aggtcagggt ggtcacgagg gtgggccagg 5460

gcacgggcag cttgccggtg gtgcagatga acttcagggt cagcttgccg taggtggcat 5520

cgccctcgcc ctcgccggac acgctgaact tgtggccgtt tacgtcgccg tccagctcga 5580

ccaggatggg caccaccccg gtgaacagct cctcgccctt gctcaccata gcggccgcac 5640

tagtaagctt ggtaccgagc tcacccgggg atcccactgg atctggatat cctgcataag 5700

taacaccaaa caacagggtg agcatcgaca aaagaaacag taccaagcaa ataaatagcg 5760

tatgaaggca gggctaaaaa aatccacata tagctgctgc atatgccatc atccaagtat 5820

atcaagatca aaataattat aaaacatact tgtttattat aatagatagg tactcaaggt 5880

tagagcatat gaatagatgc tgcatatgcc atcatgtata tgcatcagta aaacccacat 5940

caacatgtat acctatccta gatcgatatt tccatccatc ttaaactcgt aactatgaag 6000

atgtatgaca cacacataca gttccaaaat taataaatac accaggtagt ttgaaacagt 6060

attctactcc gatctagaac gaatgaacga ccgcccaacc acaccacatc atcacaacca 6120

agcgaacaaa aagcatctct gtatatgcat cagtaaaacc cgcatcaaca tgtataccta 6180

tcctagatcg atatttccat ccatcatctt caattcgtaa ctatgaatat gtatggcaca 6240

cacatacaga tccaaaatta ataaatccac caggtagttt gaaacagaat tctactccga 6300

tctagaacga ccgcccaacc agaccacatc atcacaacca agacaaaaaa aagcatgaaa 6360

agatgacccg acaaacaagt gcacggcata tattgaaata aaggaaaagg gcaaaccaaa 6420

ccctatgcaa cgaaacaaaa aaaatcatga aatcgatccc gtctgcggaa cggctagagc 6480

catcccagga ttccccaaag agaaacactg gcaagttagc aatcagaacg tgtctgacgt 6540

acaggtcgca tccgtgtacg aacgctagca gcacggatct aacacaaaca cggatctaac 6600

acaaacatga acagaagtag aactaccggg ccctaaccat ggaccggaac gccgatctag 6660

agaaggtaga gagggggggg gggggaggac gagcggcgta ccttgaagcg gaggtgccga 6720

cgggtggatt tgggggagat ctggttgtgt gtgtgtgcgc tccgaacaac acgaggttgg 6780

ggaaagaggg tgtggagggg gtgtctattt attacggcgg gcgaggaagg gaaagcgaag 6840

gagcggtggg aaaggaatcc cccgtagctg ccggtgccgt gagaggagga ggaggccgcc 6900

tgccgtgccg gctcacgtct gccgctccgc cacgcaattt ctggatgccg acagcggagc 6960

aagtccaacg gtggagcgga actctcgaga ggggtccaga ggcagcgaca gagatgccgt 7020

gccgtctgct tcgcttggcc cgacgcgacg ctgctggttc gctggttggt gtccgttaga 7080

ctcgtcgacg gcgtttaaca ggctggcatt atctactcga aacaagaaaa atgtttcctt 7140

agttttttta atttcttaaa gggtatttgt ttaattttta gtcactttat tttattctat 7200

tttatatcta aattattaaa taaaaaaact aaaatagagt tttagttttc ttaatttaga 7260

ggctaaaata gaataaaata gatgtactaa aaaaattagt ctataaaaac cattaaccct 7320

aaaccctaaa tggatgtact aataaaatgg atgaagtatt atataggtga agctatttgc 7380

aaaaaaaaag gagaacacat gcacactaaa aagataaaac tgtagagtcc tgttgtcaaa 7440

atactcaatt gtcctttaga ccatgtctaa ctgttcattt atatgattct ctaaaacact 7500

gatattattg tagtactata gattatatta ttcgtagagt aaagtttaaa tatatgtata 7560

aagatagata aactgcactt caaacaagtg tgacaaaaaa aatatgtggt aattttttat 7620

aacttagaca tgcaatgctc attatctcta gagaggggca cgaccgggtc acgctgcact 7680

gcagtaattc gggggatctg gattttagta ctggattttg gttttaggaa ttagaaattt 7740

tattgataga agtattttac aaatacaaat acatactaag ggtttcttat atgctcaaca 7800

catgagcgaa accctatagg aaccctaatt cccttatctg ggaactactc acacattatt 7860

atggagaaac tcgagcttgt cgatcgacag atcccggtcg gcatctactc tatttctttg 7920

ccctcggacg agtgctgggg cgtcggtttc cactatcggc gagtacttct acacagccat 7980

cggtccagac ggccgcgctt ctgcgggcga tttgtgtacg cccgacagtc ccggctccgg 8040

atcggacgat tgcgtcgcat cgaccctgcg cccaagctgc atcatcgaaa ttgccgtcaa 8100

ccaagctctg atagagttgg tcaagaccaa tgcggagcat atacgcccgg agtcgtggcg 8160

atcctgcaag ctccggatgc ctccgctcga agtagcgcgt ctgctgctcc atacaagcca 8220

accacggcct ccagaagaag atgttggcga cctcgtattg ggaatccccg aacatcgcct 8280

cgctccagtc aatgaccgct gttatgcggc cattgtccgt caggacattg ttggagccga 8340

aatccgcgtg cacgaggtgc cggacttcgg ggcagtcctc ggcccaaagc atcagctcat 8400

cgagagcctg cgcgacggac gcactgacgg tgtcgtccat cacagtttgc cagtgataca 8460

catggggatc agcaatcgcg catatgaaat cacgccatgt agtgtattga ccgattcctt 8520

gcggtccgaa tgggccgaac ccgctcgtct ggctaagatc ggccgcagcg atcgcatcca 8580

tagcctccgc gaccggttgt agaacagcgg gcagttcggt ttcaggcagg tcttgcaacg 8640

tgacaccctg tgtacggcgg gagatgcaat aggtcaggct ctcgctaaac tccccaatgt 8700

caagcacttc cggaatcggg agcgcggccg atgcaaagtg ccgataaaca taacgatctt 8760

tgtagaaacc atcggcgcag ctatttaccc gcaggacata tccacgccct cctacatcga 8820

agctgaaagc acgagattct tcgccctccg agagctgcat caggtcggag acgctgtcga 8880

acttttcgat cagaaacttc tcgacagacg tcgcggtgag ttcaggcttt ttcattgtcc 8940

tctccaaatg aaatgaactt ccttatatag aggaagggtc ttgcgaagga tagtgggatt 9000

gtgcgtcatc ccttacgtca gtggagatgt cacatcaatc cacttgcttt gaagacgtgg 9060

ttggaacgtc ttctttttcc acgatgctcc tcgtgggtgg gggtccatct ttgggaccac 9120

tgtcggcaga gagatcttga atgatagcct ttcctttatc gcaatgatgg catttgtagg 9180

agccaccttc cttttctact gtcctttcga tgaagtgaca gatagctggg caatggaatc 9240

cgaggaggtt tcccgaaatt atcctttgtt gaaaagtctc aatagccctt tggtcttctg 9300

agactgtatc tttgacattt ttggagtaga ccagagtgtc gtgctccacc atgtttgttt 9360

acaccacaat atatcctgcc a 9381

<210> 25

<211> 3224

<223> pYLsgRNA-OsU3载体

ggatccagcg tgggtctcgg ttttagagct agaaatagca agttaaaata aggctagtcc 60

gttatcaact tgaaaaagtg gcaccgagtc ggtgcttttt ttcaagagct tggagtggat 120

ggaattttcc tccgttttac ctgtggaatc ggcagcaaag gaaggaatct ttaaacatac 180

gaacagatca cttaaagttc ttctgaagca acttaaagtt atcaggcatg catggatctt 240

ggaggaatca gatgtgcagt cagggaccat agcacaagac aggcgtcttc tactggtgct 300

accagcaaat gctggaagcc gggaacactg ggtacgttgg aaaccacgtg tgatgtgaag 360

gagtaagata aactgtagga gaaaagcatt tcgtagtggg ccatgaagcc tttcaggaca 420

tgtattgcag tatgggccgg cccattacgc aattggacga caacaaagac tagtattagt 480

accacctcgg ctatccacat agatcaaagc tggtttaaaa gagttgtgca gatgatccgt 540

ggcaagagac ctctgaagat aacatactaa gcttggcact ggccgtcgtt ttacaacgtc 600

gtgactggga aaaccctggc gttacccaac ttaatcgcct tgcagcacat ccccctttcg 660

ccagctggcg taatagcgaa gaggcccgca ccgatcgccc ttcccaacag ttgcgcagcc 720

tgaatggcga atggcgcctg atgcggtatt ttctccttac gcatctgtgc ggtatttcac 780

accgcatatg gtgcactctc agtacaatct gctctgatgc cgcatagtta agccagcccc 840

gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct gacgggcttg tctgctcccg gcatccgctt 900

acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct gcatgtgtca gaggttttca ccgtcatcac 960

cgaaacgcgc gagacgaaag ggcctcgtga tacgcctatt tttataggtt aatgtcatga 1020

taataatggt ttcttagacg tcaggtggca cttttcgggg aaatgtgcgc ggaaccccta 1080

tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct catgagacaa taaccctgat 1140

aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat tcaacatttc cgtgtcgccc 1200

ttattccctt ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc tcacccagaa acgctggtga 1260

aagtaaaaga tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg ttacatcgaa ctggatctca 1320

acagcggtaa gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg ttttccaatg atgagcactt 1380

ttaaagttct gctatgtggc gcggtattat cccgtattga cgccgggcaa gagcaactcg 1440

gtcgccgcat acactattct cagaatgact tggttgagta ctcaccagtc acagaaaagc 1500

atcttacgga tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc tgccataacc atgagtgata 1560

acactgcggc caacttactt ctgacaacga tcggaggacc gaaggagcta accgcttttt 1620

tgcacaacat gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg ggaaccggag ctgaatgaag 1680

ccataccaaa cgacgagcgt gacaccacga tgcctgtagc aatggcaaca acgttgcgca 1740

aactattaac tggcgaacta cttactctag cttcccggca acaattaata gactggatgg 1800

aggcggataa agttgcagga ccacttctgc gctcggccct tccggctggc tggtttattg 1860

ctgataaatc tggagccggt gagcgtgggt ctcgcggtat cattgcagca ctggggccag 1920

atggtaagcc ctcccgtatc gtagttatct acacgacggg gagtcaggca actatggatg 1980

aacgaaatag acagatcgct gagataggtg cctcactgat taagcattgg taactgtcag 2040

accaagttta ctcatatata ctttagattg atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga 2100

tctaggtgaa gatccttttt gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt 2160

tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc 2220

tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc 2280

cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac 2340

caaatactgt tcttctagtg tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac 2400

cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt 2460

cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct 2520

gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat 2580

acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt 2640

atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg 2700

cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt 2760

gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt 2820

tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg 2880

tggataaccg tattaccgcc tttgagtgag ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg 2940

agcgcagcga gtcagtgagc gaggaagcgg aagagcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc 3000

ccgcgcgttg gccgattcat taatgcagct ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg 3060

gcagtgagcg caacgcaatt aatgtgagtt agctcactca ttaggcaccc caggctttac 3120

actttatgct tccggctcgt atgttgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag 3180

gaaacagcta tgaccatgat tacgaattcg agctcggtac ccgg 3224

<210> 26

<211> 16419

<223> pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体

tggcaggata tattgtggtg taaacaaatt gacgcttaga caacttaata acacattgcg 60

gacgttttta atgtactgaa ttaacgccga attaattcgg gggatctgga ttttagtact 120

ggattttggt tttaggaatt agaaatttta ttgatagaag tattttacaa atacaaatac 180

atactaaggg tttcttatat gctcaacaca tgagcgaaac cctataggaa ccctaattcc 240

cttatctggg aactactcac acattattat ggagaaactc gagcttgtcg atcgacagat 300

ccggtcggca tctactctat ttctttgccc tcggacgagt gctggggcgt cggtttccac 360

tatcggcgag tacttctaca cagccatcgg tccagacggc cgcgcttctg cgggcgattt 420

gtgtacgccc gacagtcccg gctccggatc ggacgattgc gtcgcatcga ccctgcgccc 480

aagctgcatc atcgaaattg ccgtcaacca agctctgata gagttggtca agaccaatgc 540

ggagcatata cgcccggagt cgtggcgatc ctgcaagctc cggatgcctc cgctcgaagt 600

agcgcgtctg ctgctccata caagccaacc acggcctcca gaagaagatg ttggcgacct 660

cgtattggga atccccgaac atcgcctcgc tccagtcaat gaccgctgtt atgcggccat 720

tgtccgtcag gacattgttg gagccgaaat ccgcgtgcac gaggtgccgg acttcggggc 780

agtcctcggc ccaaagcatc agctcatcga gagcctgcgc gacggacgca ctgacggtgt 840

cgtccatcac agtttgccag tgatacacat ggggatcagc aatcgcgcat atgaaatcac 900

gccatgtagt gtattgaccg attccttgcg gtccgaatgg gccgaacccg ctcgtctggc 960

taagatcggc cgcagcgatc gcatccatag cctccgcgac cggttgtaga acagcgggca 1020

gttcggtttc aggcaggtct tgcaacgtga caccctgtgc acggcgggag atgcaatagg 1080

tcaggctctc gctaaactcc ccaatgtcaa gcacttccgg aatcgggagc gcggccgatg 1140

caaagtgccg ataaacataa cgatctttgt agaaaccatc ggcgcagcta tttacccgca 1200

ggacatatcc acgccctcct acatcgaagc tgaaagcacg agattcttcg ccctccgaga 1260

gctgcatcag gtcggagacg ctgtcgaact tttcgatcag aaacttctcg acagacgtcg 1320

cggtgagttc aggctttttc atatctcatt gccccccggg atctgcgaaa gctcgagaga 1380

gatagatttg tagagagaga ctggtgattt cagcgtgtcc tctccaaatg aaatgaactt 1440

ccttatatag aggaaggtct tgcgaaggat agtgggattg tgcgtcatcc cttacgtcag 1500

tggagatatc acatcaatcc acttgctttg aagacgtggt tggaacgtct tctttttcca 1560

cgatgctcct cgtgggtggg ggtccatctt tgggaccact gtcggcagag gcatcttgaa 1620

cgatagcctt tcctttatcg caatgatggc atttgtaggt gccaccttcc ttttctactg 1680

tccttttgat gaagtgacag atagctgggc aatggaatcc gaggaggttt cccgatatta 1740

ccctttgttg aaaagtctca atagcccttt ggtcttctga gactgtatct ttgatattct 1800

tggagtagac gagagtgtcg tgctccacca tgttatcaca tcaatccact tgctttgaag 1860

acgtggttgg aacgtcttct ttttccacga tgctcctcgt gggtgggggt ccatctttgg 1920

gaccactgtc ggcagaggca tcttgaacga tagcctttcc tttatcgcaa tgatggcatt 1980

tgtaggtgcc accttccttt tctactgtcc ttttgatgaa gtgacagata gctgggcaat 2040

ggaatccgag gaggtttccc gatattaccc tttgttgaaa agtctcaata gccctttggt 2100

cttctgagac tgtatctttg atattcttgg agtagacgag agtgtcgtgc tccaccatgt 2160

tggcaagctg ctctagccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc cgattcatta 2220

atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca acgcaattaa 2280

tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc cggctcgtat 2340

gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg accatgatta 2400

cgaattcgag ctcggtacca actataacgg tcctaaggta gcgaaggatc cgctcgctac 2460

cttaagagag gatatccctc catcctataa tgtaggctat aggaactagg gcaaggccgg 2520

ccatgcggcc gcaagctggg tgcagcgtga cccggtcgtg cccctctcta gagataatga 2580

gcattgcatg tctaagttat aaaaaattac cacatatttt ttttgtcaca cttgtttgaa 2640

gtgcagttta tctatcttta tacatatatt taaactttac tctacgaata atataatcta 2700

tagtactaca ataatatcag tgttttagag aatcatataa atgaacagtt agacatggtc 2760

taaaggacaa ttgagtattt tgacaacagg actctacagt tttatctttt tagtgtgcat 2820

gtgttctcct ttttttttgc aaatagcttc acctatataa tacttcatcc attttattag 2880

tacatccatt tagggtttag ggttaatggt ttttatagac taattttttt agtacatcta 2940

ttttattcta ttttagcctc taaattaaga aaactaaaac tctattttag tttttttatt 3000

taataattta gatataaaat agaataaaat aaagtgacta aaaattaaac aaataccctt 3060

taagaaatta aaaaaactaa ggaaacattt ttcttgtttc gagtagataa tgccagcctg 3120

ttaaacgccg tcgacgagtc taacggacac caaccagcga accagcagcg tcgcgtcggg 3180

ccaagcgaag cagacggcac ggcatctctg tcgctgcctc tggacccctc tcgagagttc 3240

cgctccaccg ttggacttgc tccgctgtcg gcatccagaa attgcgtggc ggagcggcag 3300

acgtgagccg gcacggcagg cggcctcctc ctcctctcac ggcacggcag ctacggggga 3360

ttcctttccc accgctcctt cgctttccct tcctcgcccg ccgtaataaa tagacacccc 3420

ctccacaccc tctttcccca acctcgtgtt gttcggagcg cacacacaca caaccagatc 3480

tcccccaaat ccacccgtcg gcacctccgc ttcaaggtac gccgctcgtc ctcccccccc 3540

ccccctctct accttctcta gatcggcgtt ccggtccatg gttagggccc ggtagttcta 3600

cttctgttca tgtttgtgtt agatccgtgt ttgtgttaga tccgtgctgc tagcgttcgt 3660

acacggatgc gacctgtacg tcagacacgt tctgattgct aacttgccag tgtttctctt 3720

tggggaatcc tgggatggct ctagccgttc cgcagacggg atcgatttca tgattttttt 3780

tgtttcgttg catagggttt ggtttgccct tttcctttat ttcaatatat gccgtgcact 3840

tgtttgtcgg gtcatctttt catgcttttt tttgtcttgg ttgtgatgat gtggtctggt 3900

tgggcggtcg ttctagatcg gagtagaatt ctgtttcaaa ctacctggtg gatttattaa 3960

ttttggatct gtatgtgtgt gccatacata ttcatagtta cgaattgaag atgatggatg 4020

gaaatatcga tctaggatag gtatacatgt tgatgcgggt tttactgatg catatacaga 4080

gatgcttttt gttcgcttgg ttgtgatgat gtggtgtggt tgggcggtcg ttcattcgtt 4140

ctagatcgga gtagaatact gtttcaaact acctggtgta tttattaatt ttggaactgt 4200

atgtgtgtgt catacatctt catagttacg agtttaagat ggatggaaat atcgatctag 4260

gataggtata catgttgatg tgggttttac tgatgcatat acatgatggc atatgcagca 4320

tctattcata tgctctaacc ttgagtacct atctattata ataaacaagt atgttttata 4380

attattttga tcttgatata cttggatgat ggcatatgca gcagctatat gtggattttt 4440

ttagccctgc cttcatacgc tatttatttg cttggtactg tttcttttgt cgatgctcac 4500

cctgttgttt ggtgttactt ctgcagatgg ctcctaagaa gaagcggaag gttggtattc 4560

acggggtgcc tgcggctgac aagaagtact ccatcggcct cgacatcggc accaacagcg 4620

tcggctgggc ggtgatcacc gacgagtaca aggtcccgtc caagaagttc aaggtcctgg 4680

gcaacaccga ccgccactcc atcaagaaga acctcatcgg cgccctcctc ttcgactccg 4740

gcgagacggc ggaggcgacc cgcctcaagc gcaccgcccg ccgccgctac acccgccgca 4800

agaaccgcat ctgctacctc caggagatct tctccaacga gatggcgaag gtcgacgact 4860

ccttcttcca ccgcctcgag gagtccttcc tcgtggagga ggacaagaag cacgagcgcc 4920

accccatctt cggcaacatc gtcgacgagg tcgcctacca cgagaagtac cccactatct 4980

accaccttcg taagaagctt gttgactcta ctgataaggc tgatcttcgt ctcatctacc 5040

ttgctctcgc tcacatgatc aagttccgtg gtcacttcct tatcgagggt gaccttaacc 5100

ctgataactc cgacgtggac aagctcttca tccagctcgt ccagacctac aaccagctct 5160

tcgaggagaa ccctatcaac gcttccggtg tcgacgctaa ggcgatcctt tccgctaggc 5220

tctccaagtc caggcgtctc gagaacctca tcgcccagct ccctggtgag aagaagaacg 5280

gtcttttcgg taacctcatc gctctctccc tcggtctgac ccctaacttc aagtccaact 5340

tcgacctcgc tgaggacgct aagcttcagc tctccaagga tacctacgac gatgatctcg 5400

acaacctcct cgctcagatt ggagatcagt acgctgatct cttccttgct gctaagaacc 5460

tctccgatgc tatcctcctt tcggatatcc ttagggttaa cactgagatc actaaggctc 5520

ctctttctgc ttccatgatc aagcgctacg acgagcacca ccaggacctc accctcctca 5580

aggctcttgt tcgtcagcag ctccccgaga agtacaagga gatcttcttc gaccagtcca 5640

agaacggcta cgccggttac attgacggtg gagctagcca ggaggagttc tacaagttca 5700

tcaagccaat ccttgagaag atggatggta ctgaggagct tctcgttaag cttaaccgtg 5760

aggacctcct taggaagcag aggactttcg ataacggctc tatccctcac cagatccacc 5820

ttggtgagct tcacgccatc cttcgtaggc aggaggactt ctaccctttc ctcaaggaca 5880

accgtgagaa gatcgagaag atccttactt tccgtattcc ttactacgtt ggtcctcttg 5940

ctcgtggtaa ctcccgtttc gcttggatga ctaggaagtc cgaggagact atcacccctt 6000

ggaacttcga ggaggttgtt gacaagggtg cttccgccca gtccttcatc gagcgcatga 6060

ccaacttcga caagaacctc cccaacgaga aggtcctccc caagcactcc ctcctctacg 6120

agtacttcac ggtctacaac gagctcacca aggtcaagta cgtcaccgag ggtatgcgca 6180

agcctgcctt cctctccggc gagcagaaga aggctatcgt tgacctcctc ttcaagacca 6240

accgcaaggt caccgtcaag cagctcaagg aggactactt caagaagatc gagtgcttcg 6300

actccgtcga gatcagcggc gttgaggacc gtttcaacgc ttctctcggt acctaccacg 6360

atctcctcaa gatcatcaag gacaaggact tcctcgacaa cgaggagaac gaggacatcc 6420

tcgaggacat cgtcctcact cttactctct tcgaggatag ggagatgatc gaggagaggc 6480

tcaagactta cgctcatctc ttcgatgaca aggttatgaa gcagctcaag cgtcgccgtt 6540

acaccggttg gggtaggctc tcccgcaagc tcatcaacgg tatcagggat aagcagagcg 6600

gcaagactat cctcgacttc ctcaagtctg atggtttcgc taacaggaac ttcatgcagc 6660

tcatccacga tgactctctt accttcaagg aggatattca gaaggctcag gtgtccggtc 6720

agggcgactc tctccacgag cacattgcta accttgctgg ttcccctgct atcaagaagg 6780

gcatccttca gactgttaag gttgtcgatg agcttgtcaa ggttatgggt cgtcacaagc 6840

ctgagaacat cgtcatcgag atggctcgtg agaaccagac tacccagaag ggtcagaaga 6900

actcgaggga gcgcatgaag aggattgagg agggtatcaa ggagcttggt tctcagatcc 6960

ttaaggagca ccctgtcgag aacacccagc tccagaacga gaagctctac ctctactacc 7020

tccagaacgg tagggatatg tacgttgacc aggagctcga catcaacagg ctttctgact 7080

acgacgtcga ccacattgtt cctcagtctt tccttaagga tgactccatc gacaacaagg 7140

tcctcacgag gtccgacaag aacaggggta agtcggacaa cgtcccttcc gaggaggttg 7200

tcaagaagat gaagaactac tggaggcagc ttctcaacgc taagctcatt acccagagga 7260

agttcgacaa cctcacgaag gctgagaggg gtggcctttc cgagcttgac aaggctggtt 7320

tcatcaagag gcagcttgtt gagacgaggc agattaccaa gcacgttgct cagatcctcg 7380

attctaggat gaacaccaag tacgacgaga acgacaagct catccgcgag gtcaaggtga 7440

tcaccctcaa gtccaagctc gtctccgact tccgcaagga cttccagttc tacaaggtcc 7500

gcgagatcaa caactaccac cacgctcacg atgcttacct taacgctgtc gttggtaccg 7560

ctcttatcaa gaagtaccct aagcttgagt ccgagttcgt ctacggtgac tacaaggtct 7620

acgacgttcg taagatgatc gccaagtccg agcaggagat cggcaaggcc accgccaagt 7680

acttcttcta ctccaacatc atgaacttct tcaagaccga gatcaccctc gccaacggcg 7740

agatccgcaa gcgccctctt atcgagacga acggtgagac tggtgagatc gtttgggaca 7800

agggtcgcga cttcgctact gttcgcaagg tcctttctat gcctcaggtt aacatcgtca 7860

agaagaccga ggtccagacc ggtggcttct ccaaggagtc tatccttcca aagagaaact 7920

cggacaagct catcgctagg aagaaggatt gggaccctaa gaagtacggt ggtttcgact 7980

cccctactgt cgcctactcc gtcctcgtgg tcgccaaggt ggagaagggt aagtcgaaga 8040

agctcaagtc cgtcaaggag ctcctcggca tcaccatcat ggagcgctcc tccttcgaga 8100

agaacccgat cgacttcctc gaggccaagg gctacaagga ggtcaagaag gacctcatca 8160

tcaagctccc caagtactct cttttcgagc tcgagaacgg tcgtaagagg atgctggctt 8220

ccgctggtga gctccagaag ggtaacgagc ttgctcttcc ttccaagtac gtgaacttcc 8280

tctacctcgc ctcccactac gagaagctca agggttcccc tgaggataac gagcagaagc 8340

agctcttcgt ggagcagcac aagcactacc tcgacgagat catcgagcag atctccgagt 8400

tctccaagcg cgtcatcctc gctgacgcta acctcgacaa ggtcctctcc gcctacaaca 8460

agcaccgcga caagcccatc cgcgagcagg ccgagaacat catccacctc ttcacgctca 8520

cgaacctcgg cgcccctgct gctttcaagt acttcgacac caccatcgac aggaagcgtt 8580

acacgtccac caaggaggtt ctcgacgcta ctctcatcca ccagtccatc accggtcttt 8640

acgagactcg tatcgacctt tcccagcttg gtggtgataa gcgtcctgct gccaccaaaa 8700

aggccggaca ggctaagaaa aagaagtagg atcctcccga tcgttcaaac atttggcaat 8760

aaagtttctt aagattgaat cctgttgccg gtcttgcgat gattatcata taatttctgt 8820

tgaattacgt taagcatgta ataattaaca tgtaatgcat gacgttattt atgaggtggg 8880

tttttatgat tagagtcccg caattataca tttaatacgc gatagaaaac aaaatatagc 8940

gcgcaaacta ggataaatta tcgcgcgcgg tgtcatctat gttactagat cgggagcacc 9000

ggtaaggcgc gccgtagtgc tcgagagacc tctgaagtgg ccgattcatt aatgcagctg 9060

gcacgacagg tttcccgact ggaaagcggg cagtgagcgc aacgcaatta atgtgagtta 9120

gctcactcat taggcacccc aggctttaca ctttatgctt ccggctcgta tgttgtgtgg 9180

aattgtgagc ggataacaat ttcacacaag aaacagctat gaccatgatt acgccaagct 9240

atttaggtga cactatagaa tactcaagct atgcatcaag ctcaatgggt ctagtctgta 9300

gatacccatc acactggcga ccgctcgaac atcagtttaa ggtttacacc tataaaagag 9360

agagccgtta tcgtctgttt gtggatgtac agagtgatat tattgacacg ccggggcgac 9420

ggatggtgat ccccctggcc agtgcacgtc tgctgtcaga taaagtctcc cgtgaacttt 9480

acccggtggt gcatatcggg gatgaaagct ggcgcatgat gaccaccgat atggccagtg 9540

tgcctgtctc cgttatcggg gaagaagtgg ctgatctcag ccaccgcgaa aatgacatca 9600

aaaacgccat taacctgatg ttctggggaa tataaatgtc aggcctgaat ggcgaatgga 9660

cgcgccctgt agcggcgcat taagcgcggc gggtgagcgt gggtctcgcg gtatcattgg 9720

cgcgcctctc gagctagcgg ccgcatgcat cgatctccta catcgtataa attagcctat 9780

acgaagttat tgcatctatg tcgggtgcgg agaaagaggt aatgaaatgg cagtattaga 9840

tctgataact tcgtataatg tatgctatac gaagttatga ctgcaggtcg acacccataa 9900

tagctgtttg ccaagcttgg cactggccgt cgtttttaca acgtcgtgac tgggaaaacc 9960

ctggcgttac ccaacttaat cgccttgcag cacatccccc tttcgccagc tggcgtaata 10020

gcgaagaggc ccgcaccgat cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaat ggcgaatgct 10080

agagcagctt gagcttggat cagattgtcg tttcccgcct tcagtttaaa ctatcagtgt 10140

ttgacaggat atattggcgg gtaaacctaa gagaaaagag cgtttattag aataacggat 10200

atttaaaagg gcgtgaaaag gtttatccgt tcgtccattt gtatgtgcat gccaaccaca 10260

gggttcccct cgggatcaaa gtactttgat ccaacccctc cgctgctata gtgcagtcgg 10320

cttctgacgt tcagtgcagc cgtcttctga aaacgacatg tcgcacaagt cctaagttac 10380

gcgacaggct gccgccctgc ccttttcctg gcgttttctt gtcgcgtgtt ttagtcgcat 10440

aaagtagaat acttgcgact agaaccggag acattacgcc atgaacaaga gcgccgccgc 10500

tggcctgctg ggctatgccc gcgtcagcac cgacgaccag gacttgacca accaacgggc 10560

cgaactgcac gcggccggct gcaccaagct gttttccgag aagatcaccg gcaccaggcg 10620

cgaccgcccg gagctggcca ggatgcttga ccacctacgc cctggcgacg ttgtgacagt 10680

gaccaggcta gaccgcctgg cccgcagcac ccgcgaccta ctggacattg ccgagcgcat 10740

ccaggaggcc ggcgcgggcc tgcgtagcct ggcagagccg tgggccgaca ccaccacgcc 10800

ggccggccgc atggtgttga ccgtgttcgc cggcattgcc gagttcgagc gttccctaat 10860

catcgaccgc acccggagcg ggcgcgaggc cgccaaggcc cgaggcgtga agtttggccc 10920

ccgccctacc ctcaccccgg cacagatcgc gcacgcccgc gagctgatcg accaggaagg 10980

ccgcaccgtg aaagaggcgg ctgcactgct tggcgtgcat cgctcgaccc tgtaccgcgc 11040

acttgagcgc agcgaggaag tgacgcccac cgaggccagg cggcgcggtg ccttccgtga 11100

ggacgcattg accgaggccg acgccctggc ggccgccgag aatgaacgcc aagaggaaca 11160

agcatgaaac cgcaccagga cggccaggac gaaccgtttt tcattaccga agagatcgag 11220

gcggagatga tcgcggccgg gtacgtgttc gagccgcccg cgcacgtctc aaccgtgcgg 11280

ctgcatgaaa tcctggccgg tttgtctgat gccaagctgg cggcctggcc ggccagcttg 11340

gccgctgaag aaaccgagcg ccgccgtcta aaaaggtgat gtgtatttga gtaaaacagc 11400

ttgcgtcatg cggtcgctgc gtatatgatg cgatgagtaa ataaacaaat acgcaagggg 11460

aacgcatgaa ggttatcgct gtacttaacc agaaaggcgg gtcaggcaag acgaccatcg 11520

caacccatct agcccgcgcc ctgcaactcg ccggggccga tgttctgtta gtcgattccg 11580

atccccaggg cagtgcccgc gattgggcgg ccgtgcggga agatcaaccg ctaaccgttg 11640

tcggcatcga ccgcccgacg attgaccgcg acgtgaaggc catcggccgg cgcgacttcg 11700

tagtgatcga cggagcgccc caggcggcgg acttggctgt gtccgcgatc aaggcagccg 11760

acttcgtgct gattccggtg cagccaagcc cttacgacat atgggccacc gccgacctgg 11820

tggagctggt taagcagcgc attgaggtca cggatggaag gctacaagcg gcctttgtcg 11880

tgtcgcgggc gatcaaaggc acgcgcatcg gcggtgaggt tgccgaggcg ctggccgggt 11940

acgagctgcc cattcttgag tcccgtatca cgcagcgcgt gagctaccca ggcactgccg 12000

ccgccggcac aaccgttctt gaatcagaac ccgagggcga cgctgcccgc gaggtccagg 12060

cgctggccgc tgaaattaaa tcaaaactca tttgagttaa tgaggtaaag agaaaatgag 12120

caaaagcaca aacacgctaa gtgccggccg tccgagcgca cgcagcagca aggctgcaac 12180

gttggccagc ctggcagaca cgccagccat gaagcgggtc aactttcagt tgccggcgga 12240

ggatcacacc aagctgaaga tgtacgcggt acgccaaggc aagaccatta ccgagctgct 12300

atctgaatac atcgcgcagc taccagagta aatgagcaaa tgaataaatg agtagatgaa 12360

ttttagcggc taaaggaggc ggcatggaaa atcaagaaca accaggcacc gacgccgtgg 12420

aatgccccat gtgtggagga acgggcggtt ggccaggcgt aagcggctgg gttgtctgcc 12480

ggccctgcaa tggcactgga acccccaagc ccgaggaatc ggcgtgacgg tcgcaaacca 12540

tccggcccgg tacaaatcgg cgcggcgctg ggtgatgacc tggtggagaa gttgaaggcc 12600

gcgcaggccg cccagcggca acgcatcgag gcagaagcac gccccggtga atcgtggcaa 12660

gcggccgctg atcgaatccg caaagaatcc cggcaaccgc cggcagccgg tgcgccgtcg 12720

attaggaagc cgcccaaggg cgacgagcaa ccagattttt tcgttccgat gctctatgac 12780

gtgggcaccc gcgatagtcg cagcatcatg gacgtggccg ttttccgtct gtcgaagcgt 12840

gaccgacgag ctggcgaggt gatccgctac gagcttccag acgggcacgt agaggtttcc 12900

gcagggccgg ccggcatggc cagtgtgtgg gattacgacc tggtactgat ggcggtttcc 12960

catctaaccg aatccatgaa ccgataccgg gaagggaagg gagacaagcc cggccgcgtg 13020

ttccgtccac acgttgcgga cgtactcaag ttctgccggc gagccgatgg cggaaagcag 13080

aaagacgacc tggtagaaac ctgcattcgg ttaaacacca cgcacgttgc catgcagcgt 13140

acgaagaagg ccaagaacgg ccgcctggtg acggtatccg agggtgaagc cttgattagc 13200

cgctacaaga tcgtaaagag cgaaaccggg cggccggagt acatcgagat cgagctagct 13260

gattggatgt accgcgagat cacagaaggc aagaacccgg acgtgctgac ggttcacccc 13320

gattactttt tgatcgatcc cggcatcggc cgttttctct accgcctggc acgccgcgcc 13380

gcaggcaagg cagaagccag atggttgttc aagacgatct acgaacgcag tggcagcgcc 13440

ggagagttca agaagttctg tttcaccgtg cgcaagctga tcgggtcaaa tgacctgccg 13500

gagtacgatt tgaaggagga ggcggggcag gctggcccga tcctagtcat gcgctaccgc 13560

aacctgatcg agggcgaagc atccgccggt tcctaatgta cggagcagat gctagggcaa 13620

attgccctag caggggaaaa aggtcgaaaa ggtctgtttc ctgtggatag cacgtacatt 13680

gggaacccaa agccgtacat tgggaaccgg aacccgtaca ttgggaaccc aaagccgtac 13740

attgggaacc ggtcacacat gtaagtgact gatataaaag agaaaaaagg cgatttttcc 13800

gcctaaaact ctttaaaact tattaaaact cttaaaaccc gcctggcctg tgcataactg 13860

tctggccagc gcacagccga agagctgcaa aaagcgccta cccttcggtc gctgcgctcc 13920

ctacgccccg ccgcttcgcg tcggcctatc gcggccgctg gccgctcaaa aatggctggc 13980

ctacggccag gcaatctacc agggcgcgga caagccgcgc cgtcgccact cgaccgccgg 14040

cgcccacatc aaggcaccct gcctcgcgcg tttcggtgat gacggtgaaa acctctgaca 14100

catgcagctc ccggagacgg tcacagcttg tctgtaagcg gatgccggga gcagacaagc 14160

ccgtcagggc gcgtcagcgg gtgttggcgg gtgtcggggc gcagccatga cccagtcacg 14220

tagcgatagc ggagtgtata ctggcttaac tatgcggcat cagagcagat tgtactgaga 14280

gtgcaccata tgcggtgtga aataccgcac agatgcgtaa ggagaaaata ccgcatcagg 14340

cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg 14400

gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga 14460

aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg 14520

gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag 14580

aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc 14640

gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg 14700

ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt 14760

cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc 14820

ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc 14880

actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg 14940

tggcctaact acggctacac tagaaggaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca 15000

gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc 15060

ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat 15120

cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt 15180

ttggtcatgc attctaggta ctaaaacaat tcatccagta aaatataata ttttattttc 15240

tcccaatcag gcttgatccc cagtaagtca aaaaatagct cgacatactg ttcttccccg 15300

atatcctccc tgatcgaccg gacgcagaag gcaatgtcat accacttgtc cgccctgccg 15360

cttctcccaa gatcaataaa gccacttact ttgccatctt tcacaaagat gttgctgtct 15420

cccaggtcgc cgtgggaaaa gacaagttcc tcttcgggct tttccgtctt taaaaaatca 15480

tacagctcgc gcggatcttt aaatggagtg tcttcttccc agttttcgca atccacatcg 15540

gccagatcgt tattcagtaa gtaatccaat tcggctaagc ggctgtctaa gctattcgta 15600

tagggacaat ccgatatgtc gatggagtga aagagcctga tgcactccgc atacagctcg 15660

ataatctttt cagggctttg ttcatcttca tactcttccg agcaaaggac gccatcggcc 15720

tcactcatga gcagattgct ccagccatca tgccgttcaa agtgcaggac ctttggaaca 15780

ggcagctttc cttccagcca tagcatcatg tccttttccc gttccacatc ataggtggtc 15840

cctttatacc ggctgtccgt catttttaaa tataggtttt cattttctcc caccagctta 15900

tataccttag caggagacat tccttccgta tcttttacgc agcggtattt ttcgatcagt 15960

tttttcaatt ccggtgatat tctcatttta gccatttatt atttccttcc tcttttctac 16020

agtatttaaa gataccccaa gaagctaatt ataacaagac gaactccaat tcactgttcc 16080

ttgcattcta aaaccttaaa taccagaaaa cagctttttc aaagttgttt tcaaagttgg 16140

cgtataacat agtatcgacg gagccgattt tgaaaccgcg gtgatcacag gcagcaacgc 16200

tctgtcatcg ttacaatcaa catgctaccc tccgcgagat catccgtgtt tcaaacccgg 16260

cagcttagtt gccgttcttc cgaatagcat cggtaacatg agcaaagtct gccgccttac 16320

aacggctctc ccgctgacgc cgtcccggac tgatgggctg cctgtatcga gtggtgattt 16380

tgtgccgagc tgccggtcgg ggagctgttg gctggctgg 16419

Claims (9)

1.OsABF1基因在水稻育种调控和/或水稻种子活力机制研究中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的OsABF1基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的OsABF1基因的编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的水稻育种调控包括对水稻种子活力改良的调控。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的对水稻种子活力改良的调控为对水稻种子萌发率的调控。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的调控为负调控。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的负调控是指在水稻中过表达OsABF1基因，促进水稻OsABF1过表达水稻种子休眠，导致OsABF1基因过表达植株种子萌发率降低，而突变体osabf1的水稻种子萌发率略高于野生株WT，但显著高于OsABF1基因过表达植株(OsABF1-OE)种子萌发率。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的水稻为粳稻。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的粳稻为中花11。

Images