CN116949085A - 草菇Vvpks基因在调控开伞性状中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种草菇Vvpks基因在调控开伞性状中的应用。本发明通过构建草菇CRISPR/Cas9 pks基因编辑载体，并转化进野生型草菇，删除了pks基因的283bp的片段，删除片段后的草菇表现出菌褶不发育，不开伞的表型。敲除pks基因后，草菇表现出子实体成熟后不开伞的性状，显著延长了草菇的采摘周期和保存时间，有利于在产业上的应用和推广。

Description

草菇Vvpks基因在调控开伞性状中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及草菇Vvpks基因在调控开伞性状中的应用。
背景技术
草菇，又名兰花菇、麻菇、秆菇、广东菇和中国菇等，是一种生长在热带，亚热带地区，喜温喜湿的草腐真菌。在分类学上属于真菌界担子菌纲、伞菌目、光柄菇科、小包脚菇属。草菇栽培具有生长周期短、经济效益高等特点。卵型期草菇具有较高营养价值和经济价值，生产上主要采收卵型期草菇，相比其他食用菌，草菇生长快，新陈代谢活动旺盛，呼吸作用强烈，采摘后的草菇仍具有较高的新陈代谢活动，容易破膜开伞，从卵型变成伞状进入伸长期和成熟期。草菇一旦开伞后，营养价值和商品价值都大大下降。因此育成能保持在卵型期不开伞的草菇具有较高的经济价值。
草菇主要育种方法，包括人工选择育种、杂交育种、诱变育种、原生质体融合育种、基因工程育种等。由于草菇其菌丝细胞多核且无锁状联合，使得从生理形态上区分同核与异核菌丝或亲本与杂交种难以实现，导致草菇遗传育种研究进展十分缓慢，较长一段时间只能借助传统的驯化、组织分离、孢子分离等人工选择方法育种。随着分子生物学的发展，基因编辑技术已经成功应用于多种动、植物及微生物基因组的编辑。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种草菇pks基因在调控草菇开伞性状中的应用。
草菇pks基因在调控草菇开伞性状中的应用，其中，所述的草菇pks基因的核苷酸序列的NCBI数据库序列登记号为HM237364.1。
所述的草菇pks基因被敲除后，草菇表现出菌褶不发育，不开伞的表型。
所述的草菇pks基因是通过CRISPR技术敲除的。
所述的草菇（Volvariella volvacea(Bull.) Singer）为光柄菇科小包脚菇属真菌。
所述的草菇为Volvariella volvacea V23，其基因组的NCBI数据库登记号为GCA_000349905.1。
一种CRISPR基因编辑载体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
一种草菇菌株，是野生型草菇菌株敲除pks基因后得到的。
所述的草菇pks基因的核苷酸序列的NCBI数据库序列登记号为HM237364.1。
所述的野生型草菇菌株为Volvariella volvacea V23。
所述的草菇菌株，是野生型草菇菌株使用SEQ ID NO.1所示的载体敲除pks基因后得到的。
一种草菇孢子，为上述草菇菌株培养后得到。
一种草菇菌丝体，为上述草菇菌株培养后得到。
一种草菇子实体，为上述草菇菌株培养后得到。
所述的草菇子实体在食品加工中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
草菇其菌丝营养生长所需的温度为 32～34℃，最适宜的出菇温度为28～30℃，在适宜的条件下播种后 8～10 天即可收获达到商品要求的子实体，是所有人工栽培大型可食用真菌中所需栽培时间最短的种类。草菇子实体采收后，自身的新陈代谢活动较为旺盛，子实体很快破膜开伞，从卵形子实体变成伞状体，开伞后，草菇的蛋白质、核酸、碳水化合物等营养物质含量均低于纽扣期和蛋形期。而本发明通过基因编辑的手段，删除了pks基因的283bp的片段，删除片段后的草菇表现出菌褶不发育，不开伞的表型，防止草菇子实体开伞后消耗营养成分，能够提高草菇子实体的营养价值和经济价值，在草菇养殖产业中具有广泛的应用前景。
附图说明
图1是实施例2中草菇转化子与野生型扩增得到的pks基因片段的凝胶电泳结果。
图2是实施例2中草菇转化子与野生型扩增得到的pks基因片段序列对比结果。
图3是实施例2中草菇转化子与野生型培养后不同天数的培养基形态图。
图4是实施例2中草菇转化子与野生型培养得到的子实体切开后的形态对比图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下面实施方案中若未注明具体试验条件，则通常按照常规试验条件或按照试剂公司所建议的试验条件。所使用的材料、试剂等，若无特殊说明，均为从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1
1、编辑载体构建
通过CodonUsage数据库分析得到Cas9蛋白在草菇中表达的合适编码序列VvCas9，并加入核定位信号，提交生物公司合成。根据NCBI公布的草菇gpd基因（编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶，glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）启动子序列设计相应的引物并扩增得到VvPgpd。
构建gRNA表达盒，根据侧耳、裂褶菌的U6序列在草菇基因组中搜寻草菇U6启动子序列，通过生物信息学网站预测草菇PPO基因的靶位点，在靶位点后接上gRNA scaffold和草菇U6的3’-UTR，得到gRNA表达盒。
选择突变的sdhB（succinatedehy drogenase）基因，点突变后可编码萎锈灵（carboxin）抗性基因，该基因可通过点突变或基因合成的方法得到。
采用Infusion的方法依次将VvPgpd、VvCas9、gRNA表达盒、VvsdhB基因连接，将连接后得到的片段连入表达载体得到草菇CRISPR/Cas9 pks基因编辑载体，载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2、载体转化
（1）以草菇子实体为材料制作原生质体
制2%酶液：称取0.2g裂解酶（L1412 sigma aldrich）于15ml离心管，加入250μL0.2M pH值5.7的MES缓冲液、7.5ml 0.8M的甘露醇溶液、1.7ml ddH2O。将切成小块的草菇子实体，放入酶液30℃酶解1.5h，收集原生质体。
（2）原生质体转化与筛选
调节原生质体浓度为 1×108/mL，用手轻弹重悬，分装至2ml 离心管中；取160μL原生质体，每管加入160μL STC溶液和5μg 步骤1中得到的草菇CRISPR/Cas9 pks基因编辑载体，用手轻弹混匀原生质体；加入50μL PTC缓冲液，轻轻混匀。室温放置5min，2000rpm离心去除上清；加入1ml 4℃预冷的CYM液体培养基，轻轻混匀；加入到100ml冷却的CYM固体培养基中，倒平板，30℃培养22h；原生质体萌发后再铺一层含4μg/ml萎锈灵的PDA固体培养基，能够萌发的原生质体即成功表达了载体的转化子，编号后用于后续实验。
实施例2
1、转化子验证
经过实施例1中萎锈灵培养基筛选得到草菇转化子pks9-1、pks9-2和pks9-3，设计pks基因编辑位点附近的引物序列，对筛选到的转化子及野生型菌株提取DNA，用设计的引物扩增，得到的片段进行凝胶电泳及测序。其中未突变野生型菌株扩增片段大小约为800bp，pks基因片段删除后约为500bp，杂合菌株为包含800bp和500bp两条带，凝胶电泳结果如图1所示，pks9-2与野生型的片段序列对比结果如图2所示，实验结果显示，草菇CRISPR/Cas9 pks基因编辑载体成功敲除了草菇pks基因。
鉴定引物pks-F：CGTGTCTGTTCTCGGATCAAAG；
鉴定引物pks-R：ACCATGGAGCCTCGTCTTCTTCGG；
扩增的目标序列如下，小写部分为转化子psk-2中被敲除的部分：
cgtgtctgttctcggatcaaaggctccctGTCCAGAGTTGAGGCACTCCTGTATTCTAGGGTTGTGGAAAGCTAGTAGGAATCTTGCTGAGAATTCTTCCAAGGTAGACCGCCGTGGAAGCAGCCAGCCTAAGAAATTCTATATAAGCTGCAACCTACATCTCACCGCTGAAGCACACTTGTACTGCAATGGCCCCCACTAATGCCTCCCTCGACGTACCCATCTTctctggacatggtactgcagctgctcgatctgtacaagtgatccaacaggccgttcgtgatgcgtcaataccggcaggctctgtgcttctttccgcttgccatgaagcgttccaccaagaactatcgtcgctttcgatcgaagaactcgggcacctgaacgtgaatctggcagacttttacgacaaagccgctttgctttcgttgtccacagaccgttaccggcacaaccccttaatttctgggtgctctcttttcttgatccaatctttacggtaccttgcgTATGTGGAAGATGTTCGTATATCCACGAGGCCCTTGCAGTCATCTTGTGATGCACCCGATCGCCATTTCCAGCAAGGCCTCGAGGTATTAGGGTTCTCCTCAGGGATATTGCCAGCATGCATCGTAGCGACTTCAACTTCGACGATTTCCTATATCTCACGAGCGGTGGAGGTGTTTCGGTTAGCCATTTGGATCGGCGTTCGTTGTCACCAATTTCGTATACGTGAATTAGAAGCAGCGCGCCTACCCAAGGATTGTTCTTTACCATGGAGCCTCGTCTTCTTCGG。
2、pks基因缺失后表型观察
将转化子pks9-1、pks9-2和pks9-3突变菌株与野生型草菇接种到出菇培养基（含棉籽壳50%、稻草50%，含水量60%，121℃灭菌1.5 h）上30℃培养，每种接种三份培养基，观察并记录表型。
原基出现7d后，野生型菌株在原基形成后全部开伞，转化子pks9-1、pks9-2和pks9-3突变菌株长出子实体但是不开伞；9d后野生型菌株全部萎蔫，突变菌株的子实体仍保持不开伞且没有出现萎蔫，如图3所示。切开转化子pks9-1、pks9-2和pks9-3突变菌株与野生型草菇的子实体后，突变菌株的子实体表现出菌褶不发育（图4）。实验结果证明，敲除pks基因后，草菇表现出子实体成熟后不开伞的性状，显著延长了草菇的采摘周期和保存时间，有利于在产业上的应用和推广。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.草菇pks基因在调控草菇开伞性状中的应用，其特征在于：
所述的草菇pks基因的核苷酸序列的NCBI数据库序列登记号为HM237364.1。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：
所述的草菇pks基因被敲除后，草菇表现出菌褶不发育，不开伞的表型。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：
所述的草菇pks基因是通过CRISPR技术敲除的。
4.一种草菇菌株，其特征在于：
是野生型草菇敲除权利要求1所述的草菇pks基因后得到的。
5.根据权利要求4所述的草菇菌株，其特征在于：
所述的草菇菌株，是野生型草菇使用SEQ ID NO.1所示的载体敲除pks基因后得到的。
6.一种草菇孢子，为权利要求4或5所述的草菇菌株培养后得到。
7.一种草菇菌丝体，为权利要求4或5所述的草菇菌株培养后得到。
8.一种草菇子实体，为权利要求4或5所述的草菇菌株培养后得到。
9.权利要求8所述的草菇子实体在食品加工中的应用。
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