BR112013032683B1 - métodos de aumentar a resistência a pestes e/ou doenças em uma planta e de produção de um composto orgânico que possui atividade inseticida, atividade repelente a insetos e atividade antifúngica - Google Patents

Abstract

NOVOS ENDÓFITOS DE BRACHIARIA-UROCHLOA A presente invenção está relacionada a fungos Acremonium spp, onde os citados fungos são purificados ou isolados de plantas do complexo Brachiaria-Urochloa, e, onde, quando os citados fungos são inoculados em uma planta, a citada planta apresenta resistência melhorada a doenças e/ou pestes em relação a uma planta controle não inoculada. A presente invenção também está relacionada às plantas inoculadas com os citados fungos, aos produtos produzidos pelos fungos e genes, proteínas e métodos relacionados.

Description

Campo da invenção

[001]A presente invenção está relacionada a fungos, plantas infectadas por fungos, produtos produzidos por fungos e métodos relacionados.

Antecedentes da invenção

[002]Microrganismos representam uma fonte valiosa de novos genes e compostos que apresentam potencial para serem utilizados em uma faixa de setores industriais. A literatura científica oferece numerosos relatos de microrganismos como a fonte principal de antibióticos, imunosupressores, agentes anticancerígenos e drogas para reduzir o colesterol, além de seu uso na descontaminação ambiental, e na produção de alimentos e cosméticos. Um grupo relativamente não explorado de microrganismos conhecidos como endófitos, que vivem nos tecidos de plantas vivas, fornece uma variedade de novos compostos e genes que podem proporcionar importantes benefícios para a sociedade, em particular, na agricultura.

[003]Endófitos geralmente formam relações mutualísticas com seus hospedeiros, com o endófito oferecendo adaptação aumentada para o hospedeiro, geralmente através da produção de compostos de defesa. Ao mesmo tempo, a planta hospedeira oferece os benefícios de um meio protegido e nutrição para o endófito.

[004]Membros do complexo de espécies Brachiaria-Urochloa pertencem à família Poaceae de gramíneas. Algumas espécies de Brachiaria-Urochloa são plantas forrageiras gramíneas tropicais economicamente significativas que têm sido disponibilizadas como cultivos comerciais e incluem B. brizantha, B. decumbens, B. dictyoneura, B. humidicola e B. ruziziensis, assim como seus híbridos interespecífi- cos e intraespecíficos correspondentes.

[005]Uma análise da diversidade genética baseada em dados dos espaçado- res transcritos internos (ITS) da sequência de DNA ribossômica nuclear indica uma intensa afinidade entre Urochloa e Brachiaria, suportando estudos morfológicos e anatômicos que demonstram uma evolução contínua entre estes gêneros de gramí- neas.

[006]Fungos endofíticos disseminados em sementes foram observados em B. brizantha. Estes endófitos podem exercer um papel na proteção de Brachiaria- Urocloa de fungos patógenos, tais como Drechslera spp., que causam manchas nas folhas.

[007]Existe uma falta de informação e conhecimento sobre os fungos endófi- tos do complexo das espécies de Brachiaria-Urochloa, assim como dos métodos para a identificação e caracterização de novos endófitos e seu desenvolvimento em programas de aperfeiçoamento de plantas Brachiaria-Urochloa.

[008]É objeto da presente invenção superar, ou no mínimo melhorar uma ou mais dificuldades ou deficiências associadas com técnicas anteriores.

Resumo da invenção

[009]Essa invenção descreve métodos para a identificação, isolamento, caracterização e inoculação de novos endófitos de Brachiaria-Urochloa, respectivamente, que podem ser utilizados para estabelecer novas associações de endófitos- Brachiaria Urochloa para melhorar a produção de pastos na indústria pecuária.

[0010]A descoberta, caracterização e inoculação de novos fungos endófitos associados a gramíneas do complexo Brachiaria-Urochloa podem ajudar no processo de desenvolvimento de uma variedade de pasto na criação de gado em climas quentes ao redor do mundo.

[0011]Muitos destes pastos de Brachiaria-Urochloa comercialmente desenvolvidos são plantas apomíticas apospóricas. Estas gramíneas se reproduzem asse- xualmente através de semente sem a necessidade de união de gametas; dessa for-ma disseminando o genótipo materno.

[0012]A reprodução apomítica apresenta várias vantagens para pesquisa, e para o uso de associações de hospedeiros de gramíneas - fungos endófitos. A implicação prática da transmissão de semente de endófitos em Brachiaria-Urochloa é significativa; uma vez associados com a planta, os fungos podem se perpetuar através da semente, estabelecido que as condições de armazenamento da semente não podem reduzir a sobrevivência dos fungos.

[0013]Em um primeiro aspecto, a presente invenção oferece um fungo subs-tancialmente isolado ou purificado de Acremonium spp, onde o citado fungo é purificado ou isolado de uma planta do complexo Brachiaria-Urochloa, e onde, quando o citado fungo é inoculado na planta, a citada planta tem a sua resistência aumentadapara doenças e/ou pestes em relação a uma planta controle que não foi inoculada.

[0014]De preferência, o fungo é selecionado do grupo que consiste deAcremonium 9.2.C, Acremonium 10.1.A, Acremonium 11.1.A, Acremonium 12.1.A,Acremonium 12.1.B, Acremonium 12.1.C, Acremonium 12.1.D Acremonium 12.1.E,Acremonium 14.1.B, Acremonium 14.1.C, Acremonium 15.2.C, Acremonium 15.2.D,Acremonium 15.2.E, conforme descrito na presente invenção.

[0015]Amostras representativas, denominadas Acremonium 1.1.A (1.1A), 3.3.A (3.3A), 5.1.B (5.1B), 9.2.A (9.2A) e 12.1.A (12.1A) foram depositadas no The National Measurement Institute em 15 de junho de 2011, com os números de acesso V11/011370, V11/011371, V11/011372, V11/011373, e V11/011374, respectivamente.

[0016]O termo “substancialmente purificado” significa que o fungo é isento de outros organismos. Portanto, o termo inclui, por exemplo, um fungo em cultura axênica. De preferência, o fungo é no mínimo aproximadamente 90% puro, com maior preferência no mínimo aproximadamente 95% puro, ainda com maior preferência, no mínimo aproximadamente 98% puro, e ainda com maior preferência, no mínimo aproximadamente 99% puro.

[0017]O termo “isolado” significa que o fungo é removido de seu meio original (por exemplo, o meio natural se ocorre normalmente na natureza). Por exemplo, um fungo que ocorre normalmente na natureza em uma planta viva não é isolado, mas o mesmo fungo separado de alguns ou de todo os materiais coexistentes no sistema natural é considerado isolado.

[0018]Em seu meio natural, o fungo pode ser endófito, isto é, vive em mutualismo com uma planta. De forma alternada, o fungo pode ser epífita, isto é cresce ligado ou sobre uma planta. De preferência, o fungo é um endófito.

[0019]O fungo da presente invenção pode, em seu meio natural, estar associado a uma planta do complexo Brachiaria-Urochloa. Mais particularmente, a planta do complexo Brachiaria-Urochloa é selecionada do grupo que consiste de Brachiaria brizantha, Brachiaria decumbens, Brachiaria humidicola, Brachiaria stolonifera, Bra- chiaria ruziziensis, Urochloa brizantha, Urochloa decumbens, Urochloa humidicola, Urochloa mosambicensis, Brachiaria marlothii, Brachiaria nigropedata, Urochloa dic- tyoneura, Urochloa oligotricha, Urochloa panicoides, Brachiaria obtusiflora, Brachia- ria serrifolia, Urochloa advena, Urochloa arrecta, Urochloa brachyura, Urochloa emi- nii, Urochloa mollis, Urochloa xantholeuca, Urochloa oligotricha, Urochloa panicoi- des, Urochloa plantaginea, Urochloa platynota e Urochloa xantholeuca, assim como híbridos interespecíficos e intraespecíficos do complexo Brachiaria-Urochloa.

[0020]Em uma modalidade de preferência, a planta do complexo Brachiaria- Urochloa é selecionada do grupo que consiste de Brachiaria brizantha, Brachiaria decumbens, Brachiaria humidicola e Urochloa mosambicensis.

[0021]O termo “associado com” no contexto significa que o fungo vive dentro ou próximo da planta. Por exemplo, pode ser endofítico, ou seja, vivendo dentro dos tecidos internos da planta, ou epifítico, ou seja, crescendo sobre a planta.

[0022]O fungo pode ser um heterótrofo que utiliza carbono orgânico para se desenvolver, mais particularmente, é um saprófita que se alimenta de detritos.

[0023]Em outro aspecto, a presente invenção oferece uma planta inoculada com um fungo conforme descrito anteriormente, com a citada planta sendo uma planta hospedeira sem fungo, infectada com o citado fungo. De preferência, a planta na qual o fungo é associado melhora a resistência a pestes e/ou doenças em relação a uma planta controle sem inoculação. Em uma modalidade de preferência, esta resistência melhorada inclui atividade inseticida e repelente a insetos. Em outra modalidade de preferência, a resistência melhorada a pestes e/ou doenças inclui atividade antifúngica.

[0024]Em uma modalidade de preferência, a planta hospedeira pode ser inoculada com mais de uma cepa de fungos, de acordo com a presente invenção.

[0025]De preferência, a planta é um produto agrícola, tal como uma espécie de gramínea, de preferência uma planta forrageira, pastagem ou grama para produção de bioenergia, tais como as que pertencem ao complexo Brachiaria-Urochloa (grama de pânico, do gênero Panicum) incluindo Brachiaria brizantha, Brachiaria decumbens, Brachiaria humidicola, Brachiaria stolonifera, Brachiaria ruziziensis, B. dictyoneura, Urochloa brizantha, Urochloa decumbens, Urochloa humidicola, Uro- chloa mosambicensis, assim como híbridos interespecíficos e intraespecíficos do complexo Brachiaria-Urochloa, e os que pertencem ao Lolium e Festuca, incluindo L. perenne (azevém pereno) e L. arundinaceum (festuca alta) e L. multiflorum (azevém italiano).

[0026]De preferência, a planta é infectada com o fungo por um método selecionado do grupo que consiste de inoculação, reprodução, cruzamento, hibridização e suas combinações.

[0027]As plantas infectadas por fungos podem ser cultivadas por técnicas conhecidas. Os versados na técnica podem determinar prontamente as condições da cultura dependendo da planta a ser cultivada.

[0028]Em outro aspecto, a presente invenção oferece uma planta, semente ou outra parte derivada da planta da presente invenção, e infectada com um fungo da presente invenção. De preferência, a planta, semente ou outra parte na qual o fungo está associado apresenta resistência melhorada a pestes e/ou doenças em relação a uma planta não inoculada, semente ou outra parte da planta. Em uma modalidade de preferência, a resistência melhorada a pestes e/ou doenças inclui atividade repelente e inseticida. Em outra modalidade de preferência, a resistência melhorada a pestes e/ou doenças inclui atividade antifúngica.

[0029]De preferência, a célula vegetal, a planta, semente ou outra parte é proveniente de uma gramínea, com maior preferência de uma planta forrageira, de pastagem ou de bioenergia, tais como as que pertencem ao complexo Brachiaria- Urochloa (gramas de pânico), incluindo Brachiaria brizantha, Brachiaria decumbens, Brachiaria humidicola, Brachiaria stolonifera, Brachiaria ruziziensis, B. dictyoneura, Urochloa brizantha, Urochloa decumbens, Urochloa humidicola, Urochloa mosambi- censis, assim como híbridos interespecíficos e intraespecíficos do complexo das espécies de Brachiaria-Urochloa, tais como híbridos interespecíficos entre Brachiaria ruziziensis x Brachiaria brizantha, Brachiaria ruziziensis x Brachiaria decumbens, [Brachiaria ruziziensis x Brachiaria decumbens] x Brachiaria brizantha, [Brachiaria ruziziensis x Brachiaria brizantha] x Brachiaria decumbens e os que pertencem aos gêneros Lolium e Festuca, incluindo L. perenne (azevém pereno) e L. arundinaceum (festuca alta) e L. multiflorum (azevém italiano).

[0030]O termo “célula vegetal” significa qualquer célula que se autopropaga, ligada por uma membrana semipermeável e contendo plastídeo. Tal célula também exige uma parede celular se outra propagação for desejada. A célula vegetal, conforme utilizada na presente invenção, inclui, sem limitação, culturas de suspensão de sementes, embriões, regiões meristemáticas, calo vegetal, folhas, raízes, rebentos, gametófitos, esporófitos, pólen e micrósporos.

[0031]Em outro aspecto, a presente invenção oferece o uso de um fungo conforme descrito anteriormente, para produzir uma planta infectada com o citado fungo. De preferência, a planta na qual o fungo é associado apresentou resistência melhorada a pestes e/ou a doenças relacionadas a uma planta controle não inoculada. Em uma modalidade de preferência, a resistência melhorada a pestes e/ou doenças inclui atividade repelente e inseticida. Em outra modalidade de preferência, a resistência melhorada a pestes e/ou doenças inclui atividade antifúngica.

[0032]Em outro aspecto da presente invenção, existe um método para aumentar a resistência a pestes e/ou doenças em uma planta, com o citado método incluindo inocular a citada planta com um fungo, conforme descrito anteriormente. De preferência, a planta na qual o fungo está associado apresenta resistência melhorada a pestes e/ou doenças em relação a uma planta não inoculada. Em uma modalidade de preferência, a resistência melhorada a pestes e/ou doenças inclui atividade repelente e inseticida. Em outra modalidade de preferência, a resistência melhorada a pestes e/ou doenças inclui atividade antifúngica.

[0033]Em outro aspecto da presente invenção, o fungo pode ser selecionado e/ou caracterizado por um método incluindo: fornecimento de uma pluralidade de amostras de fungos; sujeição dos citados fungos à análise genética; seleção dos fungos que apresentam um perfil genético e metabólico desejado.

[0034]Em uma modalidade de preferência, esse aspecto da invenção pode incluir a etapa adicional de avaliação da origem geográfica e seleção do fungo que apresenta o perfil genético e metabólico desejado e uma origem geográfica desejada.

[0035]Em uma modalidade de preferência, a pluralidade de amostras de fungos pode ser fornecida por um método incluindo: fornecimento de uma pluralidade de amostras de plantas que podem conter fungos; e isolamento de fungos das citadas amostras de plantas.

[0036]Em uma modalidade de preferência, a análise genética inclui a detecção da presença ou ausência de marcadores polimórficos, tais como repetições de sequências simples.

[0037]O inventor descobriu que a detecção específica de fungos em plantas com marcadores, tais como marcadores SSR, ofereceu as ferramentas para a avaliação eficiente da diversidade genética dos fungos nas populações de gramíneas e para a descoberta potencial de novas cepas fúngicas.

[0038]O termo “pluralidade” de amostras de endófitos ou amostras de plantas significa um número suficiente que permita uma comparação dos perfis genéticos e metabólicos de endófitos fúngicos individuais. De preferência, entre aproximadamente 10 e 1.000.000 amostras de endófitos ou amostras de plantas são fornecidas, e com maior preferência entre aproximadamente 100 e 1.000 amostras de en- dófitos ou amostras de plantas.

[0039]O termo “análise genética” significa a análise do DNA nuclear e/ou mi- tocondrial do endófito.

[0040]Essa análise pode envolver a detecção da presença ou ausência de marcadores polimórficos, tais como repetições de sequências simples (SSRs) ou marcadores do tipo pareados. SSRs, também denominadas microssatélites, são baseadas em um elemento essencial com 1-7 nucleotídeos, mais comumente com 1-4 nucleotídeos, sendo sequencialmente repetido. O conjunto de SSR é inserido em sequências de DNA com acompanhamento do complexo. Microssatélites surgem devido a propriedade de deslizamento durante a replicação, onde a enzima DNA polimerase para e desliza ao longo de seu molde, de forma que as sequências curtas sejam repetidas. Algumas partes da sequência tendem a deslizar mais que outras, fornecendo variações nos números relativos de lócus da SSR, baseado em motivos diferentes. Uma vez duplicado o conjunto SSR pode também se expandir (ou contrair) devido a novo deslizamento e/ou troca de cromátide desigual. O número total de locais de SSR é alto, de forma que em princípio estes locais são capazes de fornecer marcações para qualquer gene ligado.

[0041]SSRs são altamente polimórficas devido a variação e números de repetições, e são co-dominantemente herdadas. Sua detecção é baseada na reação de cadeia de polimerase (PCR), exigindo somente pequenas quantidades de DNA e sendo adequada para automação. Estão presentes em todos os genomas eucarióti- cos e ocorrem em genomas fúngicos e de plantas. Consequentemente, as SSRs são marcadores ideais para uma ampla faixa de aplicações, tais como análise da diversidade genética, mapeamento genético, mapeamento de caracteres ou seleção as-sistida com marcador.

[0042]De forma alternada ou em adição, a análise genética pode compreender o sequenciamento genômico e/ou do DNA mitocondrial e realização de comparações sequenciais para avaliar a variação genética entre os fungos. Em uma modalidade de preferência, a sequência do espaçador transcrito interno (ITS) pode ser utilizada para análise genética.

[0043]O termo “análise metabólica” significa a análise de metabólitos, particularmente toxinas, produzidas pelos fungos. De preferência, é realizada pela preparação de plantas inoculadas para cada fungo e medição dos níveis de toxina na planta. Com maior preferência, isto é realizado pela preparação de plantas isogeni- camente inoculadas para cada fungo e medição dos níveis da toxina na planta.

[0044]O termo “perfil genético e metabólico desejado” significa que o fungo inclui características genéticas e metabólicas que resultam em um fenótipo benéfico para a estrutura da planta ou, de outra forma, estão associadas com os fungos.

[0045]Tais propriedades benéficas incluem tolerância aumentada a falta de água e/ou nutrientes e resistência melhorada a pestes e/ou doenças na planta nas quais o fungo é associado. Em uma modalidade de preferência, as propriedades benéficas incluem atividade repelente e inseticida. Em outra modalidade de preferência, a resistência melhorada a pestes e/ou doenças inclui atividade antifúngica.

[0046]Por exemplo, a resistência a pestes e/ou doenças na planta pode ser aumentada em no mínimo aproximadamente 5%, com maior preferência no mínimo aproximadamente 10%, com maior preferência no mínimo aproximadamente 25%, com maior preferência no mínimo aproximadamente 50%, com maior preferência no mínimo aproximadamente 100%, em relação a uma planta não inoculada que não contém o fungo endófito. De preferência, a resistência a pestes e/ou doenças na planta pode ser aumentada entre aproximadamente 5% e aproximadamente 50%, com maior preferência entre aproximadamente 10% e aproximadamente 25%, em relação a uma planta não inoculada que não contém o fungo endófito.

[0047]Em outro aspecto, a presente invenção oferece um método de cultivo de um fungo, conforme descrito anteriormente, com o citado método incluindo o crescimento do citado fungo em um meio incluindo uma fonte de carboidratos, por exemplo, um ágar ou caldo com base de açúcar/amido, tal como ágar ou caldo batata dextrose, ou um ágar ou caldo a base de cereal, tal como ágar ou caldo de aveia.

[0048]O fungo pode ser cultivado sob condições aeróbicas ou anaeróbicas.

[0049]Em uma modalidade particularmente de preferência, o fungo pode ser cultivado em um meio de cultura incluindo batata dextrose ou aveia, por exemplo, ágar de batata dextrose, ágar de aveia, caldo de batata dextrose ou de aveia.

[0050]O fungo pode ser cultivado por um período de aproximadamente 1 a 100 dias, com maior preferência de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 dias, e com maior preferência de aproximadamente 10 a aproximadamente 30 dias.

[0051]Em uma modalidade de preferência, o fungo pode ser cultivado em um biorreator. O termo “biorreator” significa um dispositivo ou sistema que suporta um meio biologicamente ativo, tal como um frasco onde é realizado um processo químico envolvendo os fungos da presente invenção e/ou seus produtos. O processo químico pode ser aeróbico ou anaeróbico. O biorreator pode apresentar um volume variando de militros a metros cúbicos, por exemplo, de aproximadamente 50 mL a aproximadamente 50.000 litros. O biorreator pode ser operado via cultura em lote, cultura de alimentação em lote, cultura de perfusão ou cultura contínua, por exem-plo, cultura contínua em um biorreator de tanque com agitação. Os fungos cultivados no biorreator podem ser suspensos ou imobilizados.

[0052]Em uma modalidade de preferência, o método pode incluir outra etapa de recuperação de um composto orgânico produzido pelo fungo dentro de células fúngicas, incluindo tecido intracelular do meio de cultura (por exemplo, líquidos se- cretados) ou do espaço com ar (por exemplo, vapores secretados), associado com o meio de cultura ou fungos.

[0053]Os vapores podem surgir diretamente do fungo ou dos líquidos secre- tados na fase líquida e de vapor.

[0054]A etapa de recuperação do composto orgânico é realizada de preferência por células de separação do meio de cultura ou capturando vapores associados com o meio de cultura ou fungos.

[0055]De preferência, o composto orgânico é então isolado ou purificado por um método selecionado do grupo que consiste de cromatografia gasosa, cromato- grafia líquida, destilação fracionada e cromatografia de absorção, tal como adsorção por troca de pressão.

[0056]O termo “composto orgânico” significa um composto químico cujas moléculas contêm carbono.

[0057]Em uma modalidade de preferência, o composto orgânico pode apresentar atividade inseticida ou repelente de insetos. Em uma modalidade particularmente de preferência, o composto orgânico pode ser peramina ou um análogo, derivado ou sal deste.

[0058]O termo “derivado” significa um composto orgânico obtido, ou considerado como derivado de um composto da presente invenção. Exemplos de derivados incluem compostos onde o nível de saturação de uma ou mais ligações foi alterado (por exemplo, uma simples ligação foi alterada para uma ligação dupla ou tripla) ou onde um ou mais átomos são substituídos com um átomo diferente ou grupo funcional. Exemplos de átomos diferentes e grupos funcionais podem incluir, mas não estão limitados a hidrogênio, halogênio, oxigênio, nitrogênio, enxofre, hidróxi, alcóxi, alquila, alquenila, alquinila, amina, amida, cetona e aldeído.

[0059]De preferência, o citado composto orgânico é produzido por um método conforme descrito anteriormente.

[0060]Em uma modalidade de preferência, o composto orgânico pode ser obtido de um fungo da presente invenção.

[0061]Ainda em outro aspecto da presente invenção, é fornecido o uso de um composto orgânico, de acordo com a presente invenção como um inseticida ou repelente.

[0062]Ainda em outro aspecto da presente invenção, é fornecido o uso de um composto orgânico, de acordo com a presente invenção como um composto an- tifúngico.

[0063]Em outro aspecto da presente invenção, é fornecido um método de produção de um composto orgânico, com o citado método incluindo o cultivo de um fungo, conforme descrito acima, sob condições adequadas para produzir o citado composto orgânico. De preferência, as condições são as descritas anteriormente.

[0064]De preferência, o composto orgânico é uma peramina ou análogo, derivado ou sal deste.

[0065]Em uma modalidade de preferência, o método pode incluir uma etapa adicional de recuperação de um composto orgânico produzido pelos fungos, conforme descrito acima.

[0066]Baseado nos depósitos descritos acima, o genoma total de um fungo de Acremonium spp., selecionado do grupo que consiste de Acremonium 1,1,A (1,1A), 3,3,A (3,3A), 5,1.B (5,1B), 9,2A (9,2A) e 12,1A) é incorporado na presente invenção como referência.

[0067]Logo, em outro aspecto, a presente invenção inclui a identificação e/ou ácidos nucléicos de clonagem incluindo genes que codificam polipeptídeos que são envolvidos na produção de compostos orgânicos da presente invenção, por exemplo, genes que codificam enzimas de uma ou mais vias bioquímicas que resultam na síntese dos citados compostos orgânicos.

[0068]O termo “via bioquímica” significa uma pluralidade de reações químicas que ocorrem dentro de uma célula, que são catalisadas por mais de uma enzima ou subunidade da enzima, e resultam na conversão de um substrato em um produto. Isso inclui, por exemplo, uma situação onde duas ou mais subunidades de enzimas (cada uma sendo uma proteína codificada por um gene separado) são combinadas para formar uma unidade de processamento que converte um substrato em um produto. Uma via bioquímica não é limitada por sequenciamento espacial ou temporal.

[0069]Métodos para identificação e/ou clonagem de ácidos nucléicos que codificam tais genes são conhecidos pelos versados na técnica e incluem a criação de bancos de dados de ácidos nucléicos, tais como de cDNA ou genômicos, e pesquisando tais bancos de dados, por exemplo, utilizando sondas, para genes que codificam enzimas de vias sintéticas, para os citados compostos orgânicos; ou mutação do genoma do fungo da presente invenção, por exemplo, utilizando mutagênese de transposons ou química, identificando alterações na produção de um composto orgânico da presente invenção, e logo, identificando genes que codificam enzimas de vias sintéticas para o citado composto orgânico.

[0070]Logo, em outro aspecto da presente invenção, é fornecido um ácido nucléico isolado ou substancialmente purificado codificando um polipeptídeo envolvido na produção de um composto orgânico da presente invenção.

[0071]Em uma modalidade de preferência, o ácido nucléico codifica um poli- peptídeo envolvido na produção de peramina ou um análogo, derivado ou sal deste.

[0072]Em uma modalidade de preferência, o ácido nucléico pode incluir um gene que codifica a gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH), ou um fragmento funcionalmente ativo ou variante deste. Em uma modalidade particularmente de preferência, o ácido nucléico pode incluir uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo de sequências demonstradas em ID Nos. 2,3,4,5 e 6 e fragmentos funcionalmente ativos e variantes destes.

[0073]Em uma modalidade de preferência, o ácido nucléico pode incluir um gene perA, ou um fragmento funcionalmente ativo ou variante deste. Em uma modalidade particularmente de preferência, o ácido nucléico pode incluir uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo de sequências demonstradas em ID Nos. 8,9 e 10, e fragmentos funcionalmente ativos e variantes destes.

[0074]O termo “ácido nucléico” significa uma cadeia de nucleotídeos capaz de transportar a informação genética. O termo geralmente se refere a genes ou fragmentos funcionalmente ativos ou variantes destes, e/ou outras sequências no ge- noma do organismo que influenciam o seu fenótipo. O termo “ácido nucléico” inclui DNA (tal como cDNA ou DNA genômico) e RNA (tal como mRNA ou microRNA) que apresenta fita simples ou dupla, contendo opcionalmente bases de nucleotídeos sintéticos, não naturais ou alterados, ácidos nucléicos sintéticos e suas combinações.

[0075]O termo “ácido nucléico” codificando um polipeptídeo envolvido na produção de um composto orgânico da presente invenção significa um ácido nucléi- co que codifica uma enzima normalmente presente em um fungo da presente invenção, que catalisa uma etapa na via resultando na síntese do composto orgânico da invenção.

[0076]A presente invenção abrange fragmentos funcionalmente ativos e variantes de ácidos nucléicos da presente invenção. O termo “funcionalmente ativo” em relação ao ácido nucléico significa que o fragmento ou variante (tal como análogo, derivado ou mutante) é capaz de manipular a síntese de um composto orgânico da presente invenção, por exemplo, através da tradução em uma enzima que é capaz de participar na via que resulta na síntese do composto orgânico. Tais variantes incluem as alélicas que ocorrem ou não naturalmente. Adições, deleções, substituições e derivações de um ou mais nucleotídeos são contempladas a medida que as modificações não resultam em perda da atividade funcional do fragmento ou variante. De preferência, o fragmento ou variante funcionalmente ativo apresenta no mínimo 80% de semelhança com a parte relevante da sequência mencionada acima, a qual o fragmento ou variante corresponde, com maior preferência no mínimo aproximadamente 90% de semelhança, e com maior preferência no mínimo aproximadamente 95% de semelhança, e ainda com maior preferência no mínimo aproximadamente 98% de semelhança. Tais variantes e fragmentos funcionalmente ativos incluem, por exemplo, os que apresentam alterações conservativas do ácido nucléi- co.

[0077]De preferência, o fragmento apresenta um tamanho de no mínimo 20 nucleotídeos, de preferência no mínimo 50 nucleotídeos, com maior preferência no mínimo 100 nucleotídeos, com maior preferência no mínimo 200 nucleotídeos, e ainda com maior preferência no mínimo 500 nucleotídeos.

[0078]O termo “alterações conservativas do ácido nucléico” significa substituições do ácido nucléico que resultam na conservação do aminoácido na proteína codificada, em virtude da degeneração do código genético. Tais variantes e fragmentos funcionalmente ativos também incluem, por exemplo, as alterações no ácido nucléico que resultam nas substituições conservativas dos aminoácidos de um ou mais resíduos na sequência de aminoácidos correspondente.

[0079]O termo “substituições conservativas dos aminoácidos” significa a substituição de um aminoácido por outro da mesma classe, sendo as classes conforme abaixo: Apolar: Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met Fe, Trp Polar neutra: Gli, Ser, Thr, Cis, Tir, Asn, Gln Ácida: Asp, Glu Básica: Lis, Arg, His Outras substituições conservativas de aminoácidos podem também ser produzidas conforme abaixo: Aromática: Fe, Tir, His Doador de prótons: Asn, Gln, Lis, Arg, His, Trp Aceptor de prótons: Glu, Asp, Thr, Ser, Tir, Asn, Gln

[0080]Em outro aspecto da presente invenção, existe uma construção genética incluindo um ácido nucléico, de acordo com a presente invenção.

[0081]O termo “construção genética” significa uma molécula de ácido nucléi- co recombinante.

[0082]Em uma modalidade de preferência, a construção genética de acordo com a presente invenção pode ser um vetor.

[0083]O termo “vetor” significa uma construção genética utilizada para transferir material genético para uma célula alvo.

[0084]O vetor pode ser de qualquer tipo adequado, podendo ser viral ou não viral. O vetor pode ser de expressão. Tais vetores incluem sequências de ácido nu- cléico cromossômicas, não cromossômicas e sintéticas, por exemplo, derivadas de vírus vegetais; plasmídeos bacterianos; derivadas de plasmídeos Ti de Agrobacterium tumefaciens; derivadas dos plasmídeos Ri do Agrobacterium rhizogenes; de fago de DNA; de cromossomas artificiais de levedura; de cromossomas artificiais bacterianos; de cromossomas artificiais bacterianos binários; de vetores derivados de combinações de plasmídeos e de fago de DNA. Entretanto, qualquer outro vetor pode ser utilizado contanto que seja replicável ou integrativo ou viável na célula alvo.

[0085]Em uma modalidade de preferência deste aspecto da invenção, a construção genética pode incluir também um promotor e um terminador; com o citado promotor, gene e terminador sendo operativamente ligados.

[0086]O termo “promotor” significa uma sequência de ácidos nucléicos suficiente para uma transcrição direta de uma sequência de ácidos nucléicos operativamente ligados.

[0087]O termo “operativamente ligado” significa que o(s) ácido(s) nucléico(s) e uma sequência reguladora, tal como um promotor, são ligados de forma a permitir a expressão do citado ácido nucléico sob condições apropriadas, por exemplo, quando moléculas adequadas, tais como proteínas ativadoras transcricionais são ligadas às sequências reguladoras. De preferência, um promotor operativamente ligado está a montante do ácido nucléico associado.

[0088]O termo “a montante” significa na direção 3’->5’ ao longo do ácido nu- cléico.

[0089]O promotor e o terminador podem ser de qualquer tipo adequado e podem ser endógenos em uma célula alvo, ou podem ser exógenos, estabelecido que sejam funcionais..

[0090]Uma variedade de terminadores, que podem ser empregados nas construções genéticas da presente invenção, são também bem conhecidos pelos versados na técnica. O terminador pode ser proveniente do mesmo gene com a sequência do promotor ou um gene diferente. Os terminadores particularmente ade- quados são sinais de poliadenilação.

[0091]A construção genética, além do promotor, do gene e do terminador, pode incluir elementos necessários para expressão do ácido nucléico, em combinações diferentes, por exemplo, estrutura do vetor, origem de replicação (ori), locais de clonagem múltipla, sequências espaçadoras, intensificadores, introns, genes de resistência a antibióticos e outros genes marcadores selecionáveis [tais como gene da neomicina fosfotransferase (nptll), gene da higromicina fosfotransferase (hph)], e genes repórteres (tais como beta-glicuronidase (GUS) (gusA)]. A construção genética pode conter também um local de ligação do ribossoma para início da tradução. A construção genética pode também incluir sequências apropriadas para expressão da amplificação.

[0092]Os versados na técnica irão considerar que vários componentes da construção genética estão operacionalmente ligados para produzir a expressão do citado ácido nucléico. Técnicas para ligação dos componentes da construção genética da presente invenção são bem conhecidas pelos versados na técnica. Tais técnicas incluem o uso de ligantes, tais como ligantes sintéticos, por exemplo, incluindo um ou mais locais de enzimas de restrição.

[0093]De preferência, a construção genética é substancialmente purificada ou isolada. O termo “substancialmente purificada” significa que a construção genética está livre de genes, que no genoma natural do organismo de onde o ácido nucléi- co ou promotor da invenção é derivado, circunda o ácido nucléico ou promotor. Portanto, o termo abrange, por exemplo, uma construção genética que é incorporada em um vetor; em um plasmídeo ou vírus de replicação autônoma; ou em DNA ge- nômico de um procarionte ou eucarionte; ou que existe como uma molécula separada (por exemplo, um cDNA ou um fragmento de cDNA ou um fragmento genômico produzido por PCR ou digestão de endonuclease de restrição) independente de outras sequências. Isto também inclui uma construção genética que é parte de um ge ne híbrido que codifica uma sequência adicional de polipeptídeos. De preferência, a construção genética substancialmente purificada é no mínimo aproximadamente 90% pura, de preferência no mínimo aproximadamente 95% pura, com maior preferência no mínimo aproximadamente 98% pura, e ainda com maior preferência no mínimo aproximadamente 99% pura.

[0094]O termo “isolado” significa que o material é removido de seu meio original (por exemplo, o meio natural se ocorre naturalmente). Por exemplo, um ácido nucléico que ocorre naturalmente em uma planta viva não é isolado, mas o mesmo ácido nucléico separado de algum ou de todos os materiais coexistentes no sistema natural, é isolado. Tais ácidos nucléicos podem ser parte de um vetor e/ou podem ser parte de uma composição, e ainda podem ser isolados de forma que tal vetor ou composição não faça parte deste meio natural.

[0095]Uma alternativa para uso de um gene marcador selecionável para oferecer uma característica fenotípica para seleção de células hospedeiras transformadas, a presença da construção genética em células transformadas pode ser determinada por outras técnicas conhecidas na área, tal como PCR (reação de cadeia de polimerase), análise de hibridização em Southern blot, ensaios histoquímicos (por exemplo, ensaios GUS), análise de hibridização em western blot.

[0096]As construções genéticas da presente invenção podem ser introduzidas em plantas ou fungos através de qualquer técnica adequada. As técnicas para incorporação de construções genéticas da presente invenção em células vegetais ou fúngicas (por exemplo, por transdução, transfecção, transformação ou alvo genético) são bem conhecidas pelos versados na técnica. Tais técnicas incluem a introdução mediada por Agrobacterium, introdução mediada por Rhizobium, eletroporação para tecidos, células e protoplastos, fusão de protoplasto, injeção em órgãos reprodutivos, injeção em embriões imaturos e introdução de projéteis de alta velocidade em células, tecidos, embriões maduros e imaturos, transformação por biolística, trans- formação de Whiskers, e suas combinações. A escolha da técnica irá depender do tipo de planta ou fungo a ser transformado, e pode ser prontamente determinada por um versado na técnica. Para transformação de protoplastos, a PEG mediada é particularmente de preferência. Para transformação de protoplastos fúngicos, a eletropo- ração e transformação PEG mediada são particularmente de preferência. Para transformação de hifas fúngicas, a transformação Agrobacterium mediada é a de preferência. Para transformação de protoplastos fúngicos, a eletroporação e transformação PEG mediada são particularmente de preferência. Para transformação de hifas fúngicas, a transformação Agrobacterium mediada é a de preferência.

[0097]As células que incorporam as construções genéticas da presente invenção podem ser selecionadas, conforme descrito abaixo, e então cultivadas em um meio apropriado para regenerar plantas ou fungos transformados, utilizando técnicas bem conhecidas na área. As condições da cultura, tais como temperatura, pH e semelhantes, ficarão claras para os versados na técnica. As plantas resultantes podem se reproduzir, tanto sexualmente como assexualmente, utilizando métodos bem conhecidos na área, para produzir gerações sucessivas de plantas ou fungos transformados.

[0098]A presente invenção também oferece um polipeptídeo substancialmente purificado ou isolado na produção de um composto orgânico da presente invenção.

[0099]Em uma modalidade de preferência, o polipeptídeo pode ser envolvido na produção de peramina ou um análogo, derivado ou sal deste.

[00100]Em uma modalidade de preferência, o polipeptídeo pode ser codificado por um ácido nucléico de acordo com a presente invenção.

[00101]A presente invenção abrange fragmentos funcionalmente ativos e variantes dos polipeptídeos da presente invenção. O termo “funcionalmente ativo” neste contexto significa que o fragmento ou variante apresenta uma ou mais das propri- edades biológicas da proteína da qual o fragmento ou variante é derivado. Adições, deleções, substituições e derivações de um ou mais aminoácidos são contempladas a medida que as modificações não resultam em perda da atividade funcional do fragmento ou variante. De preferência, o fragmento ou variante apresenta no mínimo aproximadamente 80% de semelhança com a parte relevante da sequência acima mencionada, da qual o fragmento ou variante é derivado, com maior preferência no mínimo aproximadamente 90% de semelhança, com maior preferência no mínimo 95% de semelhança, e ainda com maior preferência no mínimo aproximadamente 98% de semelhança. Tais variantes e fragmentos funcionalmente ativos incluem, por exemplo, os que apresentam substituições de aminoácidos conservativos de um ou mais resíduos na sequência de aminoácidos correspondente.

[00102]De preferência, o fragmento apresenta um tamanho de no mínimo 10 aminoácidos, com maior preferência no mínimo 20 aminoácidos, com maior preferência no mínimo 50 aminoácidos, com maior preferência no mínimo 100 aminoáci- dos, e ainda com maior preferência no mínimo 200 aminoácidos. Conforme utilizado na presente invenção, o termo “compreende” e as variações do termo, tais como “compreendendo”, “compreende” e “compreendido” não excluem outros aditivos, componentes, valores inteiros ou etapas.

[00103]Uma referência a qualquer técnica anterior na especificação não deve ser considerada como um conhecimento ou qualquer forma de sugestão de que esta técnica faça parte do conhecimento geral na Austrália ou qualquer outra jurisdição, ou que esta técnica pode ser verificada, compreendida e considerada como relevante por um versado na área.

Descrição detalhada das modalidades

[00104]A presente invenção será detalhada com relação aos exemplos e às figuras. Deve ser compreendido, entretanto, que a seguinte descrição é somente ilustrativa, e não deve ser considerada como uma restrição da parte geral da inven-ção descrita anteriormente.

Descrição das figuras

[00105]Figura 1. Análise principal dos componentes (PCA) da diversidade genética entre espécies de gramíneas do complexo Brachiaria-Urochloa utilizando marcadores SSR dominantemente marcados.

[00106]Figura 2. Isolamento de fungos endófitos de espécies de gramíneas do complexo Brachiaria-Urochloa . A. Explantes de cultivo interno com superfície esterilizada de espécies de gramíneas do complexo Brachiaria-Urochloa são colocados em meio de ágar de batata dextrose (PDA) e cultivados à temperatura de 25°C, no escuro para crescimento de endófitos; B. Após 4 semanas, os fungos endófitos cresceram em torno dos explantes e foram subcultivados em meio de PDA fresco.

[00107]Figura 3. Árvore do método de agrupamento de vizinhos obtida da análise da sequência da região ITS (espaço interno transcrito) do rDNA para 20 fungos endófitos isolados de espécies de gramíneas do complexo Brachiaria-Urochloa. Após o alinhamento de todas as sequências ITS, o comprimento total dos contigs foi de 619 bp e continham 120 locais informativos de parcimônia. A robustez dos nódulos nas árvores foi testada por análise bootstrap de 1000 reamostragens. Os números nas ramificações são as porcentagens da análise bootstrap.

[00108]Figura 4. Morfologia de fungos endófitos representativos de espécies de gramíneas do complexo Brachiaria-Urochloa. Os isolados dos endófitos são agrupados baseados na análise das sequências ITS.

[00109]Figura 5. Inoculação de mudas jovens derivadas de sementes de gramíneas do complexo Brachiaria-Urochloa com micélio de fungo endófito. A. Sementes são escarificadas (inserção) e esterilizadas; B. Germinação da semente após 9 dias, à temperatura de 26°C no escuro; C. Mudas jovens são inoculadas com micélio de endófitos; D. Após 4 semanas em meio MS, as plântulas são transferidas para o solo; E. Crescimento das plântulas após 7 dias no solo; F. Plantas esta- belecidas no solo em estufa são testadas para a presença e identidade dos endófi- tos, utilizando um ensaio com marcador de DNA.

[00110]Figura 6. Inoculação in vitro de calos de regeneração de gramíneas do complexo Brachiaria-Urochloa com fungos endófitos isolados subcultivados. A. Geração de calos embriogênicos de proliferação derivados de meristema de gramí- neas do complexo Brachiaria-Urochloa; B. Explantes de calos embriogênicos cultivados in vitro de gramíneas do complexo Brachiaria-Urochloa ; C. Regeneração de rebentos (e raízes) seguido por inoculação de endófitos; D. Regeneração de plânu- las; E. Após 4 semanas em meio MS, as plânulas são transferidas para o solo; F. Plantas maduras são testadas com relação à presença e à identidade utilizando um ensaio com marcador de DNA.

[00111]Figura 7. Marcação da análise dos componentes principais (PCA) de todos os compostos metabólicos após análise de LC-MS (ITMS + p ESI Full ms [80,00-2000,00]) de amostras de tecidos pseudoembrionários de B. brizantha, B. decumbens, B. humidicola e U. mosambicensis associadas com os fungos endófitos correspondentes. Cópias técnicas são agrupadas. Os componentes 1, 2 e 3 apresentam até 19,2%, 11,3% e 5,6% da variabilidade, respectivamente.

[00112]Figura 8. Análise LC-MS de associações de fungo endófitos- gramíneas Urocholoa mosambicensis fornecendo cromatograma de íons extraídos. A. Extração íon positiva; B. Cromatograma de íon extraído da peramina m/z 248; C. Espectrometria de massa com tempo de retenção de 3,00 minutos.

[00113]Figura 9. Um exemplo de reações de inibição no ensaio antifúngico. Isolado de endófito de Acremonium 9.2.A foi testado para atividade antifúngica contra 8 espécies de fungos patogênicos.

[00114]Figura 10. Alinhamento da sequência de DNA do gene GAPDH de Neurospora crassa com homólogos de 5 isolados de endófitos fúngicos Acremonium conforme abaixo: 2a linha - grupo 2; 3a linha - grupo 3; linhas 4, 5 e 6 - grupo 1.

[00115]Figura 11. Seção relevante da árvore do método de agrupamento de vizinhos derivada do alinhamento da proteína GAPDH apresentando a nova identidade de 3 isolados de Acremonium. Os endófitos de Acremonium são marcados em rosa, azul e amarelo, correspondendo a seus grupos ITS 1,2 e 3, respectivamente. Nota: somente 1 isolado de Acremonium (12.1.E) do seu grupo ITS 1 é fornecido na árvore devido a semelhança de aminoácidos da proteína GAPDH entre os membros do grupo ITS.

[00116]Figura 12. Alinhamento do Epichloe festucae por gene perA (1_0) com genes homólogos de isolados de Acremonium do grupo ITS (3.3A, 5.1B e 12.1.E).

[00117]Exemplo 1. Caracterização molecular de gramíneas do complexo Brachiaria-Urochloa

[00118]Lotes de sementes de espécies de gramíneas do complexo Brachia- ria-Urochloa provenientes da Austrália (tabela 1). Essa pesquisa oferece a base para descoberta de endófitos e caracterização do complexo de espécies de gramíneas do complexo Brachiaria-Urochloa .Tabela 1. Espécies do complexo Brachiaria-Urochloa utilizadas para descoberta de endófitos

[00119]Para caracterizar a diversidade das espécies de gramíneas e confirmar sua cessão para o complexo Brachiaria-Urochloa, uma análise da diversidade genética foi realizada utilizando marcadores de repetições de sequências simples (SSR), derivados de Brachiaria-Urochloa. Os pares de primer BbUNICAMP001, BbUNICAMP002, BbUNICAMP003, BbUNICAMP004, BbUNICAMP005, BbUNI- CAMP006 e BbUNICAMP007 foram selecionados (Jungmann et al. 1999), e utilizados para amplificar entre as espécies do complexo Brachiaria-Urochloa. Como os níveis de ploidia entre as espécies de Brachiaria-Urochloa variam, os alelos para cada local de SSR foram avaliados dominantemente (presença/ausência) e a análise dos componentes principais (PCA) foi realizada (figura 1).

[00120]Cada uma das espécies de Brachiaria-Urochloa foi discriminada utilizando estes marcadores. Nenhuma variação dentro das populações foi observada, conforme esperado para espécies apomíticas. B. brizantha e B. decumbens são espécies mais semelhantes entre si do que as espécies B. humidicola e U. mosambi- censis. Existem duas populações de B. humidicola, com Humidicola 1 sendo diferente de Humidicola2 e de U. mosambicensis. A natureza geneticamente distinta das plantas Humidicola 1 e Humidicola 2 sugere que existem duas diferentes subespécies presentes nos lotes de sementes de B. humidicola analisadas.

Exemplo 2. Isolamento de endófitos fúngicos de gramíneas do complexo Brachiaria-Urochloa

[00121]Fungos endófitos de gramíneas do complexo foram isolados de explantes jovens de cultivo com superfície esterilizada (figura 2). Um total de 31 fungos endófitos foi isolado e subcultivado. Vinte e nove isolados de fungos endófitos foram identificados como espécies de Acremonium por exame morfológico em cultura in vitro. Dois isolados de fungos endófitos (14.1.A e 14.1.D) não eram do tipo morfológico do Acremonium e foram excluídos de nova análise. A tabela 2 apresenta um resumo dos fungos endófitos isolados das gramíneas do complexo Brachiaria- Urochloa.

[00122]Tabela 2. Resumo de fungos endófitos purificados e subcultivados de gramíneas do complexo Brachiaria-Urochloa. Os nomes isolados são codificados de forma que o primeiro número represente o lote da semente e o segundo o número da planta de 20 sementes germinadas de cada lote de sementes.

Exemplo 3 - Caracterização genética de endófitos fúngicos de gramíneas do complexo Brachiaria-Urochloa

[00123]Como Acremonium é um gene anamórfico, a sequência ITS espaça- dora transcrita interna foi utilizada para nova caracterização. A região total do DNA ribossomal nuclear, que compreende tanta as sequências espeçadoras internas ITS1 e ITS2 como as subunidades 5,8S, foi PCR ampliada utilizando os primersITS5 e ITS4 (White et al. 1990). Os produtos de amplificação por PCR purificados foram sequenciados utilizando tecnologia de Sanger. Endófitos isolados subcultiva- dos foram então agrupados com base na semelhança da sequência ITS. Os dados da sequência foram utilizados na análise BLASTn para identificar pareamentos na base de dados NCBI (tabela 3).

[00124]A análise filogenética de 20 fungos endófitos isolados de gramíneas do complexo Brachiaria-Urochloa identificou 4 grupos distintos na sequência de ITS rDNA nuclear (figura 3). Diferenças morfológicas nos endófitos existem tanto entre como dentro destes grupos ITS (figura 4). Isolados de endófitos dentro de cada grupo são pareados (< 99% de semelhança) em uma ampla faixa de diferentes Ascomi- cetos (tabela 3). Nenhum dos isolados de endófitos provenientes de gramíneas do complexo Brachiaria-Urochloa forneceram 100% de semelhança com a sequência ITS rDNA nuclear de outros fungos do banco de dados público, indicando que endó- fitos fúngicos únicos foram isolados.

[00125]A análise molecular de 29 endófitos isolados com dados de ITS rDNA nuclear identificou a presença de cepas de endófitos múltiplos dentro da mesma planta nas plantas 9.2 e 12.1 (tabela 4). A presença de múltiplas cepas de endófitos dentro de uma planta hospedeira não é geralmente observada em outras espécies de gramíneas, tais como azevém perena e festuca alta, sugerindo uma nova descoberta em Brachiaria.

[00126]Tabela 3. Resumo dos fungos endófitos isolados de gramíneas do complexo Brachiaria-Urochloa utilizando análise da sequência ITS. Os fungos endó- fitos são agrupados de acordo com a semelhança da sequência ITS, e o pareamento BLAST mais próximo para cada grupo ITS é demonstrado.

Tabela 4. Resumo do número de endófitos isolados de cada planta Brachia-ria ou Urochloa e o número correspondente de grupos ITS rDNA nucleares identificados.

Exemplo 4 - Inoculação de fungos endófitos em plantas de hospedeiros docomplexo Brachiaria-Urochloa

[00127]Metodologias para inoculação de fungos endófitos isolados e subcul- tivados em mudas (figura 5) e calos de regeneração (figura 6) de espécies de gra- míneas do complexo Brachiaria-Urochloa foram desenvolvidas para permitir a geração de novas associações de fungos endófitos-hospedeiro entre as espécies de gramíneas do complexo Brachiaria-Urochloa e os endófitos isolados de uma faixa de espécies de gramíneas de pastagens (incluindo espécies do complexo Brachiaria- Urochloa ).

Exemplo 5 - Perfil metabólico das associações endófitos-gramíneas do complexo Brachiaria-Urochloa

[00128]Plantas maduras das associações de endófitos-gramíneas do complexo Brachiaria-Urochloa que foram mantidas em um meio controlado foram submetidas à análise do perfil metabólico. Três plantas individuais (cópias biológicas) de cada lote de semente foram analisadas utilizando espectrometria de massa - croma- tografia líquida (LC-MS), com duas cópias técnicas por planta. Plantas adicionais, representando os subgrupos Humidicola1 e Humidicola2 identificados na análise da diversidade genética com base de SSR, foram selecionadas dos lotes de sementes 2, 4 e 8. Amostras pseudoembrionárias liofilizadas foram preparadas para análise LC-MS utilizando um procedimento de extração de metanol 80%.

[00129]A análise dos componentes principais (PCA) baseada em um banco de dados LC-MS total revela diferenças nos perfis metabólicos de cada associação endófito-gramínea do complexo Brachiaria-Urochloa analisada (figura 7). Cada associação forma um grupo distinto, indicando que existe uma variação limitada dentro de uma espécie/população. Para a análise genética com base SSR, existem duas populações distintas de B. humidicola, com amostras de Humidicola 1 formando um grupo separado para o restante das populações. A marcação PCA 3D indica que as associações de B. decumbens e B. brizantha compartilham perfis metabólicos semelhantes aos das associações de Humidicola2 e U. mosambicensis.

[00130]A peramina do composto derivado de fungo endófito, conhecida por apresentar atividade inseticida, foi produzida in planta, e foi identificada nos perfis metabólicos das associações fungos endófitos-gramíneas Urocholoa mosambicensis (figura 3). A presença da peramina foi confirmada através de MS (íons extraídos da razão massa-carga [m/z] de 248). Todas as amostras de associações de fungos en- dófitos-gramíneas Urocholoa mosambicensis testadas produziram o composto inseticida peramina (tabela 5 e figura 8).

[00131]Tabela 5. Determinação da presença de composto inseticida peramina derivado de fungos endófitos em associações de fungos endófitos-gramíneas Brachiaria-Urochloa. Amostras de associações de fungos endófitos-gramíneas Bra- chiaria-Urochloa foram selecionadas para análise do perfil metabólico. Três plantas (cópias biológicas) de cada grupo foram analisadas. Amostras de associações de fungos endófitos-gramíneas Urocholoa mosambicensis testadas, produziram o composto inseticida peramina derivado de endófitos.

Exemplo 6. Atividade antifúngica de endófitos de Acremonium isolados do complexo de espécies Brachiaria-Urochloa

[00132]Uma publicação anterior relatou a atividade antifúngica nos fungos endofíticos Acremonium implicatum isolados de Brachiaria brizantha (Kelemu et al. 2001). Para pesquisar a atividade antifúngica nos endófitos isolados na presente invenção, todos os 29 fungos endofíticos Acremonium foram testados em relação a oito modelos de teste: Alternaria alternata, Colletotrichum graminicola, Rhizoctonia cerealis, Trichoderma harzianum, Phoma sorghina, Botrytis cinerea, Bipolaris portu- laceae e Drechslera brizae. Placas de petri contendo ágar de batata dextrose foram inoculadas com uma colônia central de cada isolado endófito, e incubadas por 10 dias, à temperatura de 24°C. Dois inóculos de um modelo de teste fúngico foram então colocados nos lados opostos de cada placa. As culturas foram incubadas à temperatura ambiente no escuro durante 5 dias, e o tamanho da zona de inibição foi visualmente avaliado em uma escala de 0-5 (0 - sem inibição; 1 - inibição muito fraca; 2- inibição fraca; 3 - inibição moderada; 4 - inibição forte; 5 - inibição muito forte. Para cada combinação de patógeno-fungo endófito, cinco cópias foram avaliadas, e realizada uma média dos resultados. O isolado endófito 9.2.A apresentou uma ampla e forte atividade antifúngica, inibindo o crescimento de todos, menos Bo- trytis cinerea e Trichoderma harzianum (tabela 6, figura 9). Existiram diferenças no nível da atividade antifúngica através dos grupos ITS - o grupo 3 (isolado 9.2.A) apresentou o maior resultado, seguido pelo grupo 2 (isolados 12.1.A e 12.1.D) e grupo 2 (5 isolados). Os isolados endófitos dentro do grupo ITS 1 apresentaram inibição mínima do crescimento dos fungos patógenos (tabela 6).

[00133]Tabela 6. Atividade antifúngica exibida por endófitos de Brachiaria em relação aos fungos patógenos da planta. O tamanho da zona de inibição foi visualmente avaliado em uma escala de 0-5 (0 - sem inibição; 1 - inibição muito fraca; 2- inibição fraca; 3 - inibição moderada; 4 - inibição forte; 5 - inibição muito forte).

Exemplo 7. Sequenciamento do genoma total de fungos endófitos isolados de gramíneas do complexo Brachiaria-Urochloa

[00134]Metodologias para sequenciamento de genoma total de fungos endó- fitos baseadas na paralelização massiva de reações de sequenciamento foram estabelecidas utilizando plataformas de sequenciamento, tais como Ilumina HiSeq2000. DNA de alta qualidade genômica é preparado de amostras de micélios de fungos endófitos, isolados de gramíneas do complexo Brachiaria-Urochloa, subcultivados em meio líquido. O DNA de cada cepa de fungo endófito é preparado para sequen- ciamento utilizando metodologias conhecidas. Amostras podem ser sequenciadas em multiplexador utilizando uma tentativa de indexação. A plataforma Illumina HiS- eq2000 é baseada no sequenciamento por tentativa de síntese, onde milhões de fragmentos de DNA são ligados na superfície de uma unidade de célula de fluxo de vidro, e então ampliadas in situ para produzir um grupo simples de fitas de DNA. O sequenciamento é obtido pela adição de polimerase e 4 nucleotídeos diferencialmente marcados com fluorescência com um grupo 3’-OH inativo, que garante que somente um único nucleotídeo seja incorporado em cada ciclo. Cada incorporação base é seguida por captura de imagem e então clivagem química para remover o corante fluorescente permitindo a extensão da base. A sequência é compilada por sobreposição de imagem após o término do sequenciamento. As sequências compiladas são verificadas com relação à qualidade antes da montagem do genoma e análise.

[00135]Cinco isolados de endófitos (1.1.A, 3.3.A, 5.1.B, 9.2.A e 12.1.E) foram sequenciados utilizando a plataforma Illumina HiSeq2000. Leituras finais parea- das para cada isolado foram utilizadas como entrada para o novo conjunto de se- quenciamento genômico. A análise das sequências montadas revelou que isolados dentro do mesmo grupo ITS apresentavam características similares de montagem de sequência (tabela 7).Tabela 7

[00136]Para pesquisar o nível de diversidade entre as 5 cepas de endófitos(1.1.A, 3.3.A, 5.1.B, 9.2.A e 12.1.E), o gene GAPDH foi identificado utilizando a sequência GAPDH cDNA de Neurospora crassa como uma consulta em uma pesquisa BLASTn de uma base de dados da sequência, compreendendo contigs de 5 isolados de endófitos. As sequências do gene GAPDH foram polimórficas entre os grupos ITS, mas altamente similares dentro dos grupos (figura 10), sugerindo que os isolados 3.3.A, 5.1.B e 12.1. possam ser da mesma cepa. A análise filogenética da proteína GAPDH confirmou que os 3 grupos ITS aos quais os isolados 1.1A, 9.2.A e 12.1E pertencem, são divergentes entre si, e entre todos os outros fungos dentro de uma base de dados fúngica in-house (figura 11).

[00137]Para pesquisar o nível da diversidade entre os 3 isolados que pertencem ao grupo 1 ITS, o gene A peramina (perA) do Epichloe festucae (Acesso GenBank # BAE06845) e genes homólogos dentro do grupo 1 ITS (endófitos 3.3.A, 5.1.B e 12.1.E) foram alinhados. O polimorfismo da sequência foi observado dentro do grupo 1 ITS sugerindo possivelmente cepas diferentes (figura 12).

[00138]Deve ser compreendido que a invenção descrita e definida nesta especificação abrange todas as combinações alternativas de dois ou mais aspectos individuais mencionados ou evidentes a partir do texto ou figuras. Todas estas diferentes combinações constituem vários aspectos alternativos da invenção. Referências Jungmann, L., A. C. B. Sousa, et al. (2009). Isolation and characterization of microsatellite markers for Brachiaria brizantha (Hochst. ex A. Rich.) Stap. Conservation Genetics 10(6): 1873-1876. Kelemu, S., White J.F, Jr., et al. (2001). "An endophyte of the tropical forage grass Brachiaria brizantha: Isolating, identifying, and characterizing the fungus, and determining its antimycotic properties." Canadian Journal of Microbiology 47(1): 5562. White, T.J., Bruns, T., Lee, S., and Taylor, J. (1990) Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications pp. 315-322. Academic Press.

Claims (7)

1. Método de aumentar a resistência a pestes e/ou doenças em uma planta, o dito método CARACTERIZADO pelo fato de que inclui inocular a dita planta com um ou mais fungos de Acremonium spp, em que o dito fungo é purificado ou isolado de uma planta do complexo de espécies Brachiaria-Urochloa, e em que, quando o dito fungo é inoculado na dita planta, a dita planta apresenta resistência melhorada a doenças e/ou pestes em relação a uma planta controle não inoculada e em que o dito fungo é selecionado a partir do grupo que consiste em Acremonium 1.1.A, Acremonium 3.3.A, Acremonium 5.1.B, Acremonium 9.2.A, Acremonium 12.1.A, depositados no National Measurement Institute em 15 de junho de 2011 com número de Acesso V11/011370, V11/011371, V11/011372, V11/011373, V11/011374, respectivamente.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita planta do complexo Brachiaria-Urochloa é selecionada a partir do grupo que consiste em Brachiaria brizantha, Brachiaria decumbens, Brachiaria humidicola, Brachiaria stolonifera, Brachiaria ruziziensis, Urochloa brizantha, Urochloa decum- bens, Urochloa humidicola, Urochloa mosambicensis, Brachiaria marlothii, Brachiaria nigropedata, Urochloa dictyoneura, Urochloa oligotricha, Urochloa panicoides, Bra- chiaria obtusiflora, Brachiaria serrifolia, Urochloa advena, Urochloa arrecta, Urochloa brachyura, Urochloa eminii, Urochloa mollis, Urochloa xantholeuca, Urochloa oligotricha, Urochloa panicoides, Urochloa plantaginea, Urochloa platynota e Urochloa xan- tholeuca, e híbridos interespecíficos e intraespecíficos dos mesmos.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita planta do complexo Brachiaria-Urochloa é selecionada a partir do grupo que consiste em Brachiaria brizantha, Brachiaria decumbens, Brachiaria humidicola e Urochloa mosambicensis.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito fungo é isolado por um método que inclui as etapas de: fornecer uma pluralidade de amostras de fungos; submeter os ditos fungos à análise genética; submeter os ditos fungos à análise metabólica; e selecionar os fungos que apresentam um perfil genético e metabólico desejado.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito método inclui ainda as etapas de: avaliar a origem geográfica dos fungos; e selecionar os fungos que apresentam um perfil genético e metabólico desejado e uma origem geográfica desejada.

6. Método, de acordo com a reivindicação 4 ou 5, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita análise genética inclui detectar a presença ou ausência de marcadores polimórficos, tais como repetições de sequências simples.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito aumento de resistência a pestes e/ou doenças é selecionado a partir do grupo que consiste em atividade inseticida, atividade repelente a insetos e atividade antifúngica.

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