CN103044533B - 与己糖转运相关的蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与己糖转运相关的蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的蛋白为下述1)或2)：1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加，且与己糖转运相关的由1)衍生的蛋白质。实验证明本发明所提供的CsHT1蛋白能够使己糖运输缺陷的酵母突变体恢复葡萄糖的吸收功能，这证实了黄瓜己糖载体蛋白CsHT1具有葡萄糖转运的功能。这些结果说明与己糖转运相关蛋白CsHT1及其编码基因可用于调控黄瓜体内的糖代谢、提高黄瓜品质，可广泛用于植物体内糖代谢的研究。

Description

与己糖转运相关的蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种与己糖转运相关的蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

近几年来，我国蔬菜产业飞速发展，据农业部统计，2005年全国蔬菜播种面积1772.07万公顷，总产量达56451.49万吨，人均占有量432kg。另据联合国粮农组织(FAO)统计，2005年我国蔬菜播种面积及产量均居世界第一位，其中蔬菜播种面积占世界的43％，总产量占世界的49％。目前，我国蔬菜播种面积占世界蔬菜播种总面积的三分之一以上，产量占世界总产量的50％左右，是当今世界上蔬菜播种面积最大、产出量最多的国家。蔬菜产业的发展，不仅改善了人们的生活水平，而且促进了加工工业的发展，大力提高了出口创汇，在农业结构战略性调整中，已成为农业和农村经济新的增长点和支柱产业。

黄瓜是世界各国普遍栽培的重要蔬菜之一，也是我国五大蔬菜作物之一，我国的黄瓜栽培面积约为110万公顷。与大多数高等植物相同，黄瓜的光合作用主要发生在成熟的叶片、果实和茎等绿色组织中，我们称之为“源”。而对于根和花等不具有光合能力的非绿色组织，我们称之为“库”。植株生长发育所需的碳水化合物从源器官合成后以一定的形式通过韧皮部运输到各个库器官中贮存或吸收利用。由于单糖在运输过程中常会引起细胞渗透压发生变化且还易被调节细胞代谢活性的酶所水解，故长距离运输途径中的碳水化合物都是以多糖的形式存在。到达库器官后，少部分的二糖或多糖可以被库器官直接吸收利用，但是大多数多糖还是被水解为单糖后才被植物所吸收。在库器官中，部分单糖直接通过共质体被吸收，还有一部分单糖则是在单糖转运蛋白的协助下通过质外体被吸收。尽管目前对黄瓜的生理生化特性以及各种逆境条件下的相关指标的变化均作了广泛的研究，但还没有发现对于黄瓜的单糖转运蛋白相关基因的克隆及功能的研究，研究黄瓜中单糖转运蛋白基因的功能和定位有助于弄清黄瓜糖代谢的机理。

发明内容

本发明的目的是提供一种与己糖转运相关的蛋白及其编码基因。

本发明所提供的与己糖转运相关的蛋白，名称为CsHT1(Hexose Transporter)，来源于葫芦科、甜瓜属、黄瓜(Cucumis sativus L.)品种国农25号，是如下1)或2)的蛋白质：

1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加，且与己糖转运相关的由1)衍生的蛋白质。

序列表中的序列2由518个氨基酸残基组成，为了使上述1)中的CsHT1便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述2)中的CsHT1可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述2)中的CsHT1的编码基因可通过将序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

上述与己糖转运相关蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。

与己糖转运相关蛋白的编码基因具体可为如下1)-3)中任一所述的基因：

1)核苷酸序列是序列表中的序列1；

2)在严格条件下可与序列表中序列1限定的DNA序列杂交，且编码上述与己糖转运相关蛋白的DNA分子；

3)与1)限定的基因具有90％以上的同源性，且编码上述与己糖转运相关蛋白的DNA分子。

所述3)中的基因，与1)或2)限定的基因最好有95％以上的同源性。

序列表中的序列1由1557个核苷酸组成，为CsHT1基因的开放阅读框架(ORF)，序列1所示核苷酸序列经转录、翻译得到序列表中序列2所示的CsHT1蛋白。

含有上述与己糖转运相关蛋白编码基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

在本发明的实施例中，所述重组载体具体为在pDR196的多克隆位点间插入所述基因得到的重组表达载体，得到重组表达载体pDR196-CsHT1，所述多克隆位点具体为EcoR I和Sal I。

携带有本发明与己糖转运相关蛋白编码基因CsHT1表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或组织中。

使用CsHT1基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛生素基因Ubiquitin启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源广泛，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达并能产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

所述表达盒由能够启动所述CsHT1基因表达的启动子，CsHT1基因，以及转录终止序列组成。

所述重组菌为携带所述基因的酵母。

上述与己糖转运相关蛋白，或其编码基因，或所述重组表达载体及表达盒在提高微生物对己糖吸收中的应用也属于本发明的保护范围。在本发明的实施例中，所述己糖具体为葡萄糖；所述微生物具体为酵母。

本发明还保护培育具有高己糖吸收性能的微生物的方法。该方法包括如下步骤：将携带有CsHT1基因的所述重组表达载体转化目的微生物，得到对己糖吸收性能高于目的微生物的重组微生物。

在本发明的实施例中，所述微生物具体为酵母；所述己糖具体为葡萄糖；所述重组表达载体具体为在pDR196的多克隆位点EcoR I和Sal I之间插入CsHT1基因得到的重组表达载体。

另外，扩增所述CsHT1基因的全长或任一片段的引物也属于本发明的保护范围，如核苷酸序列如下的引物对：5’-ATGGCGGGAGGTGGATTTGTTTCT-3’和5’-TCAGACACCTTTGCCATACGGCTCCATACT-3’。

本发明构建了与己糖转运相关基因CsHT1的异源表达载体，并将其转入具有己糖运输缺陷的酵母突变体EBY.VW4000中，实验证明，转入pDR196-CsHT1载体的酵母突变体可以恢复酵母的葡萄糖吸收功能，而只转入pDR196空载体的酵母突变体则不能恢复酵母对葡萄糖的吸收功能。实验结果说明CsHT1编码的蛋白质具有转运葡萄糖的功能。对CsHT1基因的表达和功能进行深入研究有助于弄清黄瓜体内单糖的分配以及吸收规律，为黄瓜糖代谢机理提供理论依据，并最终为提高黄瓜的产量和品质提供理论基础。

附图说明

图1为与己糖转运相关基因CsHT1在黄瓜不同组织中的半定量RT-PCR检测结果。其中，(A)为黄瓜不同组织中CsHT1基因的RT-PCR电泳图，(B)为18s rRNA作为内参的电泳图；R代表根，St代表茎，L代表叶片，P代表叶柄，Fl代表花，Fr代表幼果。

图2酵母重组质粒pDR196-CsHT1 PCR及酶切鉴定结果。其中，A为重组质粒pDR196-CsHT1 PCR鉴定结果。泳道1：DL2000 DNA Marker；泳道2，3，4，：pDR196-CsHT1 PCR扩增片断。B为重组质粒pDR196-CsHT1酶切鉴定结果结果。泳道1：DL2000 DNA Marker；泳道2，3：pDR196-CsHT1酶切(EcoR I和Sal I)鉴定结果。

图3为酵母转化体EBY.VW4000/pDR196-CsHT1在麦芽糖和葡萄糖培养基上的生长情况。其中，A为不同酵母转化体在麦芽糖为唯一碳源的YNB培养基上的生长情况。B为不同酵母转化体在葡萄糖为唯一碳源的YNB培养基上的生长情况。A和B的第一排(pDR196)均为酵母转化体EBY.VW4000/pDR196；第二排(CsHT1)均为酵母转化体EBY.VW4000/pDR196-CsHT1。

图4为不同温育时间对酵母葡萄糖吸收的影响。黑心圆代表的是酵母转化体EBY.VW4000/pDR196-CsHT1对葡萄糖吸收的时间曲线，空心圆代表的是只转入酵母转化体EBY.VW4000/pDR196对葡萄糖吸收的时间曲线。

具体实施例

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下是实力中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、黄瓜己糖转运相关蛋白及其编码基因的获得

将黄瓜品种国农25号的种子(中国农业大学蔬菜系)播种于装有草炭、蛭石和田间土(体积比为1∶1∶1)的混合基质中，待植株长至3-5片叶片时定值于日光温室内，常规管理，待植株开花结果后取根、茎、叶、叶柄、花、果6个样，用TRIzol法分别提取总RNA，并用promega公司的反转录酶(M-MLV)反转录得到cDNA第一链。以这些cDNA为模板，根据中国农业科学院黄瓜基因组数据库(http://cucumber.genomics.org.cn/page/cucumber/index.jsp)比对出的一个可能的单糖转运蛋白cDNA序列来设计PCR引物5’-ATGGCGGGAGGTGGATTTGTTTCT-3’和5’-TCAGACACCTTTGCCATACGGCTCCATACT-3’。通过PCR的方法克隆己糖转运蛋白基因的编码区全长。PCR反应体系如下：10×PCR缓冲液5μl；dNTP Mixture(25mM)4μl；Taq酶(5U/μl)1μl；上下游引物(浓度均为10μM)各2μl；模板(反转录的cDNA)2μl；ddH₂O补充至50μl。PCR反应条件如下：95℃预变性5min，94℃变性30S，62℃退火30s，72℃延伸2min，共30个循环，最后72℃延伸7min。

取50μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1A所示，只有花中扩出了1557bp左右的目的条带。切下目的片段，纯化回收后连接到pGEM-T easy载体(promega，货号：A1360)上，，命名为pGEM-T：CsHT1，进而对该PCR产物进行测序。结果表明该PCR产物的核苷酸序列是序列表中的序列1(1557bp)。经同源性比较分析后初步确定获得的1557bp片段即是己糖转运蛋白的全长编码区，将其命名为CsHT1基因。CsHT1基因的核苷酸序列如序列表中的序列1所示，其编码的己糖转运蛋白的氨基酸序列如序列表中的序列2所示。

实施例2、黄瓜己糖转运蛋白CsHT1在酵母中的转运功能验证及分析

1、重组表达载体pDR196-CsHT1的构建

以实施例1所得的pGEM-T：CsHT1重组质粒为模板，设计引物，其中上游引物为5’-CCGGAATTCATGGCGGGAGGTGGATTTGTTTCT(划横线部分为EcoR I酶切位点)，下游引物为5’-ACGCGTCGACTCAGACACCTTTGCCATACGGCTCCATACT(划横线部分为Sal I酶切位点)，PCR扩增得到上下游分别带有酶切位点EcoR I和Sal I的CsHT1基因。再将上述扩增所得的CsHT1基因片段，连同pDR196(Ren-Chun Fan，Chang-Cao Peng et al(2009)Apple SucroseTransporter SUT 1and S orbitol TransporterSOT6 Interact with Cytochrome b5 to Regulate Their Affinity for Substrate Sugars.PlantPhysiol.Vol.150)载体用相同的限制性内切EcoR I和Sal I酶切，将酶切后的CsHT1基因片段和pDR196载体的大片段同时回收，用T₄连接酶连接后，转化大肠杆菌。得到的阳性克隆通过PCR和测序鉴定，获得构建成功的重组表达载体，命名为pDR196-CsHT1。

2、重组表达载体pDR196-CsHT1转化酵母突变株EBY.VW4000及鉴定

酵母突变株EBY.VW4000(Ce′line Vignault，Magali Vachaud，BirsenCakir et al(2005).VvHT1 encodes a monosaccharide transporter expressed in the conducting complexof the grape berry phloem Journal of Experimental Botany，1409-1418)

2.1酵母突变菌株EBY.VW4000感受态的制备步骤

(1)挑取生长良好的EBY.VW4000单克隆酵母菌斑于1ml YPD液体培养基中，剧烈漩涡振荡数分钟，使酵母团状物分散开。

(2)将上述(1)液体转入5-10ml YPD液体培养基，30℃，230rmp，摇菌12-15h，使OD₆₀₀＞1.5。

(3)取(2)中溶液2ml转入30-40ml YPD液体培养基中，使OD₆₂₃在0.2-0.3之间，30℃，250rmp摇菌3-4h，检测OD₆₂₃(OD₆₂₃应为0.6-0.8)。注意密度过高或过低都会降低转化效率。

(4)用50ml灭菌离心管收集OD₆₂₃应为0.6-0.8的菌液20-30毫升，室温1500g离心10min，收集细胞弃上清。

(5)用5ml灭菌的1×TE Buffer(pH7.4)重悬细胞，室温1500g离心5min，收集细胞弃上清。

(6)重复步骤(5)

(7)用1ml灭菌的含0.1M LiCl/TE Buffer重悬细胞并转入2ml离心管中，30℃孵育细胞1h，室温1500g离心5min，收集细胞弃上清。

(8)用1ml灭菌的含0.1M LiCl/TE Buffer重悬细胞，室温13000rmp离心15s，收集细胞弃上清。

(9)用300μl灭菌的含0.1M LiCl/TE Buffer重悬细胞，以100μl每管分装酵母细胞，立即进行转化。

2.2重组表达载体pDR196-CsHT 1转化酵母感受态的步骤

(1)100℃煮沸1ml鲑鱼精DNA(SS-DNA)5min，迅速冰浴以制备单链DNA。

(2)1.5ml离心管中加入100μl酵母感受态细胞，5-10μg待转化重组质粒DNA(重组表达载体pDR196-CsHT1或pDR196空载体)，50μg变性的SS-DNA，轻轻涡旋混匀使菌体完全分布均匀。

(3)加入600μl灭菌的含0.1M LiCl/PEG4000溶液，涡旋混合10s。

(4)30℃，230rmp水浴孵育30min。

(5)加入70μl二甲基亚砜(DMSO)，轻轻颠倒混匀。

(6)42℃温浴15min，冰上冷却1-2min。

(7)室温14000rmp离心5min，弃上清。

(8)用500μl灭菌的1×TE Buffer(pH7.4)重悬细胞，室温14000rpm离心3-5s，弃上清。

(9)加入300-500μl YPD液体培养基，30℃水浴摇床孵育1-4h，分别取100μl涂于含2％麦芽糖的SD-ura(pH5.8)培养基和2％葡萄糖的SD-ura(pH5.8)培养基上，30℃培养生长3-5天，得到转入pDR196-CsHT1的酵母转化体EBY.VW4000/pDR196-CsHT1和转入pDR196空载体的酵母转化体EBY.VW4000/pDR196。

2.3酵母转化体EBY.VW4000/pDR196-CsHT1的鉴定

挑取在含2％葡萄糖的SD-ura(pH5.8)培养基上生长旺盛的酵母单菌落，接种于YPD液体培养基中，于30℃，230rmp振荡过夜。然后用天根生化科技有限公司的酵母质粒小提试剂盒进行质粒提取，并以此提取的重组质粒为模板进行PCR和双酶切鉴定。结果如图2所示。

3、酵母转化体EBY.VW4000/pDR196-CsHT1生长实验

挑取生长旺盛的酵母(实验组：酵母转化体EBY.VW4000/pDR196-CsHT1；阴性对照组：酵母转化体EBY.VW4000/pDR196)单克隆于含有2％麦芽糖的液体尿嘧啶合成缺陷型培养基(Synthetic Dropout Medium-Uraci，SD-ura，pH6.0)(0.67％YNB，2％麦芽糖，0.077％SD-ura)中，过夜振荡培养至OD₆₂₃＞1.5，吸取少量菌液在新鲜含2％麦芽糖的SD-ura(pH6.0)培养基中振荡培养至OD₆₂₃＝0.6，用灭菌的含2％麦芽糖SD-ura(pH6.0)培养液分别稀释1倍、10倍、100倍、1000倍，充分混匀，吸取5μl分别点在2％麦芽糖或2％葡萄糖为唯一碳源的SD-ura(pH6.0)固体培养基(以2％麦芽糖为唯一碳源的SD-ura(pH6.0)固体培养基的组成为0.67％YNB(含(NH₄)₂SO₄)、2％麦芽糖、0.077％SD-ura，1.5％琼脂，pH6.0；以2％葡萄糖为唯一碳源的SD-ura(pH6.0)固体培养基的组成为0.67％YNB(含(NH₄)₂SO₄)、2％葡萄糖、0.077％SD-ura，1.5％琼脂，pH6.0)上，30℃培养2-4天观察实验结果(图3)。结果表明在以麦芽糖为唯一碳源的情况下，酵母转化体EBY.VW4000/pDR196-CsHT1和pDR196空载体重组酵母EBY.VW4000/pDR196都能够正常生长，但是在以葡萄糖为唯一碳源的情况下，只有酵母转化体EBY.VW4000/pDR196-CsHT1可以正常生长，而pDR196空载体重组酵母EBY.VW4000/pDR196却不能正常生长，说明CsHT1基因的转入恢复了酵母突变体EBY.VW4000的葡萄糖吸收功能。

4、黄瓜己糖转运蛋白CsHT1葡萄糖转运动力学特征

将转己糖转运蛋白基因的酵母转化体进行[¹⁴C]-葡萄糖吸收实验，进一步验证黄瓜己糖载体蛋白CsHT1的葡萄糖转运功能。

黄瓜己糖转运蛋白基因重组酵母(酵母转化体EBY.VW4000/pDR196-CsHT1)或pDR196空载体重组酵母(酵母转化体EBY.VW4000/pDR196)在液体SD-麦芽糖培养基(0.67％YNB，2％麦芽糖，0.077％SD-ura)中生长至OD₆₂₃＝0.8，离心收集细胞并用25mmol/L PBS洗涤两次，然后用pH值为6.0的PBS重悬细胞沉淀，调整到OD₆₂₃＝20。然后在30℃，230rpm的水浴摇床中进行孵育培养，培养时间分别为0min、1min、2min、3min、4min、5min。以加入浓度为100μmol/L的[¹⁴C]-Glucose为吸收反应的开始。反应结束后将细胞转移至装有玻璃纤维滤膜(GF/C，Whatman)的抽滤装置中并迅速用4ml冰冷的灭菌水连续漂洗三次。最后滤膜用液闪仪计数[¹⁴C]衰变，根据公式C＝(A×M)/(m×D)(C为葡萄糖吸收量，单位为pmol/mg；A为液闪仪测得的衰变值，单位DPM；M为每个反应体系中加入的葡萄糖总量，单位pmol；D为每个反应体系中加入的[¹⁴C]-Glucose总衰变数，单位DPM；m为每个反应体系中加入的酵母鲜重，单位为mg；)算出葡萄糖的吸收量。葡萄糖吸收量具体数值如下：酵母转化体EBY.VW4000/pDR196-CsHT1在0min，1min，2min，3min，4min，5min的葡萄糖吸收量分别为：0.3，7.9，9.4，13.7，18.4，24.6，单位pmol/mg；酵母转化体EBY.VW4000/pDR196在0min，1min，2min，3min，4min，5min的葡萄糖吸收量分别为0.028，0.046，0.044，0.026，0.076，0.052，单位pmol/mg。图4为实验结果图。实验结果表明，转入pDR196-CsHT1载体的酵母转化体EBY.VW4000/pDR196-CsHT可以恢复酵母的葡萄糖吸收功能，而只转入PDR196空载体的酵母转化体EBY.VW4000/pDR196则不能恢复酵母的葡萄糖吸收功能，从而验证了CsHT1基因的己糖转运功能。

实施例3、黄瓜不同组织中CsHT1基因的表达分析

于晴天中午时，选取长至初瓜期的黄瓜国农25号的根、茎、叶、叶柄、花、果，采用TRIzol法分别提取其总RNA，经1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。分别以上述根、茎、叶、叶柄、花、果的总RNA为模板，反转录得到第一条cDNA链，以此cDNA链为模板，用下述两条引物进行PCR扩增：

5’-ATGGCGGGAGGTGGATTTGTTTC和

5’-TCAGACACCTTTGCCATACGGCTCCATACT-3’，同时以18s rRNA作为内参对照，进行表达分析。

结果如图1所示，这一结果表明，CsHT1基因只能在黄瓜的花中检测到。

Claims (14)

1.蛋白质，为由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因的序列为序列表中的序列1。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体。

5.含有权利要求2或3所述基因的表达盒。

6.含有权利要求2或3所述基因的转基因细胞系。

7.含有权利要求2或3所述基因的重组菌。

8.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体为在pDR196的多克隆位点间插入权利要求2或3所述基因得到的重组表达载体。

9.根据权利要求7所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌为携带有权利要求2或3所述基因的酵母。

10.权利要求1所述的蛋白，或权利要求2或3所述的基因，或权利要求4所述的重组表达载体，或权利要求5所述的表达盒在提高微生物对葡萄糖吸收中的应用。

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于：所述微生物为酵母。

12.培育具有高葡萄糖吸收性能的微生物的方法，所述方法包括如下步骤：将权利要求4或8所述的重组表达载体转化目的微生物，得到葡萄糖吸收性能高于所述目的微生物的重组微生物。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于：所述微生物为酵母。

14.扩增权利要求2或3所述基因全长的引物。