CN111926032B - 植物花斑蛋白hb1及其编码基因在调控植物花斑表型中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了植物花斑蛋白HB1及其编码基因在调控植物花斑表型中的应用。本发明提供了一种培育具有花斑表型的植株的方法，包括如下步骤：对植物基因组中的HB1基因进行基因编辑，得到基因编辑植株，从基因编辑植株的自交后代中获得纯合型基因编辑植株；纯合型基因编辑植株即为具有花斑表型的植株。本发明还保护一种植物育种方法，包括如下步骤：抑制植物中HB1基因的表达，从而得到具有花斑表型的植物。本发明对于花卉植物多彩观赏性状的定向选育、提高育种效率等方面有重要意义，具有极高商业价值及科研价值。

Description

植物花斑蛋白HB1及其编码基因在调控植物花斑表型中的 应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及植物花斑蛋白HB1及其编码基因在调控植物花斑表型中的应用。

背景技术

叶片花斑突变体因其在同一叶片上具有绿色和非绿色(黄色或者白色)部分，在纯绿色植物的基础上带来不同的观赏性状，是未来增彩植物培育的一个重要研究方向。花斑的形成是因为绿色组织中含有正常的叶绿体，而处于黄色或者白色区域的组织则含有发育不正常的质体。

自然界中存在着花斑突变体，目前仅有少量用于多彩花卉植物的栽培与种植，且这种花斑产生的机制还尚不明确。目前，对于花斑植物的选育主要由自然突变、物理或化学方法诱变得来，一般存在耗费时间长、分子机理不明确、在植物中应用有限等一系列缺陷。

发明内容

本发明提供了植物花斑蛋白HB1及其编码基因在调控植物花斑表型中的应用。

本发明提供了一种培育具有花斑表型的植株的方法，包括如下步骤：对植物基因组中的HB1基因进行基因编辑，得到基因编辑植株，从基因编辑植株的自交后代中获得纯合型基因编辑植株；纯合型基因编辑植株即为具有花斑表型的植株。所述自交后代可为自交1代的后代、自交2代的后代、自交3代的后代等，直至得到纯合型基因编辑植株。纯合型基因编辑植株的自交后代即为具有花斑表型的株系。

本发明提供了一种培育具有花斑表型的植株的方法，包括如下步骤：对植物基因组中的HB1基因进行基因编辑，得到纯合型基因编辑植株，即为具有花斑表型的植株。纯合型基因编辑植株的自交后代即为具有花斑表型的株系。

以上任一所述方法中，对植物基因组中的HB1基因进行基因编辑具体通过Cas9系统实现。Cas9系统采用的sgRNA如序列表的序列5所示。

以上任一所述方法中，对植物基因组中的HB1基因进行基因编辑具体通过导入重组质粒实现。重组质粒具体可为：利用Golden Gate法(采用限制性内切酶Bsa I)，将线性化的sgRNA表达盒和pYLCRISPR/Cas9Pubi-H质粒连接，得到的重组质粒。线性化的sgRNA表达盒如序列表的序列4所示。

本发明还保护用于对植物基因组中的HB1基因进行基因编辑的物质在培育具有花斑表型的植物中的应用。

用于对植物基因组中的HB1基因进行基因编辑的物质具体可为产品甲、产品乙、产品丙或产品丁。

产品甲包括特异sgRNA和CAS9蛋白。

产品乙包括表达特异sgRNA的DNA分子和表达CAS9蛋白的DNA分子。

产品丙包括表达特异sgRNA的重组质粒和表达CAS9蛋白的质粒。

产品丁包括表达特异sgRNA和CAS9蛋白的重组质粒。

所述特异sgRNA的靶序列为：HB1基因中的“TTACTCGTGGCGTGGTGTTG”。

所述特异sgRNA如序列表的序列5所示。

表达特异sgRNA的DNA分子具体可为序列表的序列4所示的DNA分子。

CAS9蛋白为CAS9基因编码的蛋白质。

CAS9基因具体如序列表的序列7中第724-4926位核苷酸所示。

表达特异sgRNA和CAS9蛋白的重组质粒具体可为：利用Golden Gate法(采用限制性内切酶Bsa I)，将线性化的sgRNA表达盒和pYLCRISPR/Cas9Pubi-H质粒连接，得到的重组质粒。线性化的sgRNA表达盒如序列表的序列4所示。

本发明还保护一种植物育种方法，包括如下步骤：对植物基因组DNA中的HB1基因进行基因编辑，从而得到具有花斑表型的植物。

对植物基因组中的HB1基因进行基因编辑具体通过Cas9系统实现。

Cas9系统采用的sgRNA如序列表的序列5所示。

对植物基因组中的HB1基因进行基因编辑具体通过导入重组质粒实现。重组质粒具体可为：利用Golden Gate法(采用限制性内切酶Bsa I)，将线性化的sgRNA表达盒和pYLCRISPR/Cas9Pubi-H质粒连接，得到的重组质粒。线性化的sgRNA表达盒如序列表的序列4所示。

本发明还保护一种植物育种方法，包括如下步骤：抑制植物中HB1基因的表达，从而得到具有花斑表型的植物。

本发明还保护一种植物育种方法，包括如下步骤：降低植物中HB1蛋白的含量和/或活性，从而得到具有花斑表型的植物。

本发明还保护HB1蛋白在调控植物花斑表型中的应用。

本发明还保护HB1蛋白在调控植物叶绿体发育中的应用。

以上任一所述HB1基因为编码HB1蛋白的基因。

以上任一所述HB1蛋白为如下(a1)或(a2)或(a3)：

(a1)序列表中序列1所示的蛋白质；

(a2)将序列表中序列1所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物花斑表型相关的由其衍生的蛋白质；

(a3)来源于拟南芥且与(a1)所限定的氨基酸序列至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％以上同一性且与植物花斑表型相关的蛋白质。

以上任一所述HB1基因为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)：

(b1)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；

(b2)序列表中序列3所示的DNA分子；

(b3)来源于拟南芥且与(b1)或(b2)至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％以上同一性且编码所述蛋白质的DNA分子；

(b4)在严格条件下与(b1)或(b2)限定的核苷酸序列杂交且编码所述蛋白质的DNA分子。

以上任一所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物可为十字花科植物。所述十字花科植物可为拟南芥属植物。所述拟南芥属植物可为拟南芥，例如哥伦比亚生态型拟南芥。

以上任一所述具有花斑表型的植株可为叶片具有花斑表型的植株。

以上任一所述具有花斑表型的植物可为叶片具有花斑表型的植物。

以上任一所述基因编辑植株具体可为将HB1基因中的“TTACTCGTGGCGTGGTGTTG”替换为“TTACTCGTGGCGTGGTGATTG”的植株。

本发明中通过CRISPR/CAS9基因编辑技术对HB1基因进行基因编辑，hb1纯合突变体表现为明显的黄绿色花斑表型，其黄化组织处叶绿体发育受到影响，但不影响植株整体的正常生长和生活史。HB1蛋白定位于叶绿体内，在质体基因转录、质体核糖体RNA(rRNA)剪切过程中起着重要作用，最终致使叶绿体发育受到影响，进而产生叶绿素缺失的黄化斑点。

在实际生产中本发明可获得花斑表型植物，为园林绿化及多彩花卉培养提供支持。本发明对定向、快速、高效培育多彩及观赏植物的具有十分重要的理论和实际意义。本发明对于花卉植物多彩观赏性状的定向选育、提高育种效率等方面有重要意义，具有极高商业价值及科研价值。

附图说明

图1为靶点区域的测序峰图。

图2为野生型植株和hb1株系植株的示例性照片。

图3为示例性的两个细胞在激光扫描共聚焦显微镜下的照片。

图4为透射电子显微镜电镜观察叶绿体超微结构的照片。

图5为Western blotting的结果照片。

图6为Northern blotting的结果照片。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

AtU3d-sgRNA质粒：武汉淼灵生物科技有限公司；AtU3d-sgRNA质粒如序列表的序列6所示。pYLCRISPR/Cas9Pubi-H质粒：武汉淼灵生物科技有限公司；pYLCRISPR/Cas9Pubi-H质粒如序列表的序列7所示。

本发明的发明人在研究过程中从哥伦比亚生态型拟南芥中发现了一个新的调控花斑表型的蛋白，命名为Hua Ban1蛋白(HB1蛋白)。哥伦比亚生态型拟南芥中的HB1蛋白如序列表的序列1所示。将编码HB1蛋白的基因命名为HB1基因。哥伦比亚生态型拟南芥的cDNA中的HB1基因的开放阅读框如序列表的序列2所示。哥伦比亚生态型拟南芥的基因组DNA中的HB1基因如序列表的序列3所示。

实施例1、获得基因编辑株系

一、构建CRISPR/CAS9基因编辑载体

1、分别合成单链DNA分子guide-F和单链DNA分子guide-R，然后混合并退火，得到两端具有粘末端的双链DNA分子。

guide-F：5’-gtcaTTACTCGTGGCGTGGTGTTG-3’；

guide-R：5’-aaacCAACACCACGCCACGAGTAA-3’。

2、取AtU3d-sgRNA质粒，采用限制性内切酶Bsa I进行单酶切，回收酶切产物。

3、将步骤1得到的具有粘末端的双链DNA分子和步骤2得到的酶切产物连接，得到连接产物。

4、取步骤3得到的连接产物，采用UF和guide-R组成的引物对进行PCR扩增，回收扩增产物。

5、取步骤3得到的连接产物，采用gR-R和guide-F组成的引物对进行PCR扩增，回收扩增产物。

6、取步骤4的扩增产物和步骤5的扩增产物，等摩尔混合后作为模板，采用Pps-R和Pgs-L组成的引物对进行PCR扩增，得到扩增产物(线性化的sgRNA表达盒)。

经测序，线性化的sgRNA表达盒如序列表的序列4所示，表达序列表的序列5所示的sgRNA。

实际应用中，也可直接人工合成线性化的sgRNA表达盒。

7、利用Golden Gate法(采用限制性内切酶Bsa I)，将线性化的sgRNA表达盒和pYLCRISPR/Cas9Pubi-H质粒连接，得到CRISPR/CAS9基因编辑载体。

UF：5’-CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG-3’。

gR-R：5’-CGGAGGAAAATTCCATCCAC-3’。

Pps-R：5’-TTCAGAggtctcTACCGACTAGTATGGAATCGGCAGCAAAGG-3’。

Pgs-L：5’-AGCGTGggtctcGCTCGACGCGTATCCATCCACTCCAAGCTC-3’。

二、获得基因编辑植株

1、取步骤一构建的CRISPR/CAS9基因编辑载体，导入农杆菌GV3101，得到重组农杆菌。

2、取步骤1得到的重组农杆菌，采用浸花法侵染哥伦比亚生态型拟南芥植株的花序，待果荚成熟后收获种子。

3、将步骤2收获的种子播种于含有50mg/L潮霉素的固体1/2MS培养基，培养10天后将正常生长的植株移植至营养土中培养，即为T₁代植株。

4、从T₁代植株中筛选基因编辑植株。

具体步骤：取植株叶片，提取基因组DNA，采用引物F和引物R组成的引物对进行PCR扩增，然后回收PCR扩增产物并测序，根据测序结果筛选基因编辑植株(基因编辑植株的形式可为杂合型基因编辑植株、嵌合型基因编辑植株或纯合型基因编辑植株)。

引物F：5’-AAAGACCGAGACTTGTTCCCTAATC-3’；

引物R：5’-GAGATTCGGATATGAGGAAGCAGGT-3’。

5、步骤4获得的基因编辑植株自交并收获种子。

6、将步骤5收获的种子播种于含有50mg/L潮霉素的固体1/2MS培养基，培养10天后将正常生长的植株移植至营养土中培养，即为T₂代植株。

7、从T₂代植株中筛选基因编辑植株(具体步骤同步骤4)。

8、步骤7获得的基因编辑植株自交并收获种子。

9、将步骤8收获的种子播种于营养土中并培养为植株，即为T₃代植株。

10、T₃代植株进行鉴定(具体步骤同步骤4)，发现某一T₂代植株自交得到的T₃代植株均为相同的纯合型基因编辑植株，该T₂代植株命名为hb1植株，hb1植株的自交后代命名为hb1株系。

11、hb1株系的T₃代植株自交并收获种子，将收获的种子播种于营养土中并培养为植株，即为T₄代植株。

12、hb1株系的T₄代植株自交并收获种子，将收获的种子播种于营养土中并培养为植株，即为T₅代植株。

hb1植株、T₁代植株中的一株杂合型基因编辑植株以及野生型植株(哥伦比亚生态型拟南芥植株)的靶点区域的测序峰图见图1。图1中：A：野生型植株；B：T₁代杂合型基因编辑植株(箭头指示A插入，表现为套峰)；C：hb1植株(箭头指示A插入，产生移码突变)。

经测序验证，与哥伦比亚生态型拟南芥的基因组DNA相比，hb1植株的基因组DNA中的HB1基因的差异仅在于用“TTACTCGTGGCGTGGTGATTG”替换了“TTACTCGTGGCGTGGTGTTG”。

hb1植株、hb1株系的T₃代植株、hb1株系的T₄代植株、hb1株系的T₅代植株均具有如下表型：每个叶片均具有明显的花斑表型(即叶片上具有相对均匀分布的绿色区域以及黄化区域)。

在平行条件下培养的萌发30天的野生型植株(哥伦比亚生态型拟南芥植株)和hb1株系的T₄代植株的示例性照片见图2。野生型植株的叶片为全绿色，无黄化区域。hb1株系的T₄代植株的叶片的黄化区域占叶片面积的百分比为63.5％(10株植株叶片的平均值，通过Image J软件进行的测量结果)。

实施例2、HB1蛋白的细胞亚定位

1、以序列表的序列2所示的双链DNA分子为模板，采用HB1-GFPS和HB1-GFPA组成的引物对进行PCR扩增，回收PCR扩增产物。

HB1-GFPS：5’-CCGGAATTCATGCTGAGTCAAGATTTATC-3’；

HB1-GFPFPA：5’-CGGGATCCCTCCTTCTGACCAATCTCG-3’。

2、取步骤1得到的扩增产物，采用限制性内切酶EcoRI和KpnI进行双酶切，回收酶切产物。

3、取PBSK载体(信诚兴创科技发展有限公司，产品目录号为Biovector105802)，采用限制性内切酶EcoRI和KpnI进行双酶切，回收载体骨架。

4、将步骤2得到的酶切产物和步骤3得到的载体骨架连接，得到重组质粒PBSK-HB1。

5、取萌发3周的哥伦比亚生态型拟南芥植株的第5、6和7片真叶，将叶片的中间部分切成0.5-1mm的细条，放入酶解液黑暗消化3-4h，离心，收集原生质体。

6、采用PEG法将重组质粒PBSK-HB1转化原生质体，光照培养过夜。

7、用激光扫描共聚焦显微镜(LSM510META，Zeiss)观察叶肉细胞中GFP的表达。观察时物镜放大倍数为40倍，激发光波长488nm，带通BP505-530 nm，长通LP560 nm。

示例性的两个细胞(Cell 1和Cell 2)的结果见图3。HB-GFP信号与叶绿素自发荧光信号完全重叠，表明HB1蛋白定位于叶绿体内。

实施例3、叶绿体发育检测及关键蛋白的累积

一、叶绿体发育情况检测

供试植株：野生型植株(哥伦比亚生态型拟南芥植株)、hb1株系的T₄代植株。

对叶绿体超微结构进行透射电子显微镜电镜观察，具体步骤如下：取大约生长3周的供试植株的第六片真叶，用3％戊二醛溶液固定约2h，然后用0.1M PBS缓冲液冲洗，然后用1％锇酸溶液4℃固定过夜，然后用0.1M PBS缓冲液冲洗，然后进行酒精脱水(用30％→95％每次2～30min→100％三次每次20min)，然后进行渗透(1/3还氧树脂+2/3环氧丙烷2h→1/2还氧树脂+1/2环氧丙烷2h→2/3还氧树脂+1/3环氧丙烷2h→纯还氧树脂)，然后放于干燥器中1～2天)，然后进行包埋(聚合37℃，24h→45℃，24h→55℃，24h→60℃，2h)。修块标记，超薄切片进行定位，电子透射电镜进行观察。

野生型植株的叶片，叶绿体均发育正常，均能看到类囊体膜结构。

hb1株系植株的叶片：绿色区域中叶绿体发育正常，能看到类囊体膜结构(下框)；黄化区域中叶绿体表现为未发育或发育不完整(上框)。示例性照片见图4。

二、影响叶绿体发育关键蛋白累积的检测

供试植株：野生型植株(哥伦比亚生态型拟南芥植株，用WT表示)、hb1株系的T₄代植株。供试样本：大约生长3周的供试植株的全植株。

1、总蛋白的提取

取50mg鲜重的供试样本，加入200μL的buffer E(0.1514g/mL的Tris，0.01g/mL的SDS，10％甘油，0.095g/mL的Na²S²O⁵，pH 8.8)研磨成匀浆，13000g室温离心10分钟，收集上清液。

2、总蛋白的定量

取15μL上清液，采用BioRad DcProtein Assay试剂盒(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)进行全蛋白定量(单位为mg/mL)。

3、根据总蛋白定量的结果，调平两种供试样本得到的上清液的总蛋白浓度，得到蛋白溶液。将野生型植株得到的蛋白溶液分别稀释至2倍体积、4倍体积或8倍体积。

4、取hb1株系植株得到的蛋白溶液、野生型植株得到的蛋白溶液、野生型植株得到的蛋白溶液的2倍稀释液、野生型植株得到的蛋白溶液的4倍稀释液、野生型植株得到的蛋白溶液的8倍稀释液，分别进行蛋白电泳以及Western blotting(Actin蛋白作为内参，用于检测各个光系统蛋白的抗体均为市售抗体)。

结果见图5。hb1株系植株中的影响叶绿体发育及光合作用的各组分蛋白含量(如D1、PsaC、RbcL、Cytf、ATPase和PetD)均显著降低。光合作用复合物相关亚基的含量降低，会致使叶绿体类囊体膜及叶绿体发育不良，同时会导致与光系统结合的叶绿素含量降低，最后导致黄化表型。

实施例4、HB1蛋白在调控质体基因表达中的功能分析

供试植株：野生型植株(哥伦比亚生态型拟南芥植株，用WT表示)、hb1株系的T₄代植株。供试样本：大约生长3周的供试植株的全植株。

一、总RNA的提取

0.3g鲜重的供试样本在液氮中迅速研磨成粉末，加入装有1mL Trizol试剂的Eppendorf管中，振荡混匀后，冰浴15min。加入200μL预冷的氯仿，振荡混匀，冰浴5min。4℃、12000rpm离心15min后吸取上清，加入0.7倍体积的异丙醇，轻摇混匀。-20℃沉淀15min后，4℃、12000rpm离心15min。用75％的乙醇洗涤沉淀，干燥5min，之后加入40μL DEPC水溶解沉淀。测定波长260nm和280nm的OD值，确定RNA的浓度。RNA的浓度(单位为μg/mL)＝OD260×40×稀释倍数。

二、Northern印迹分析

每个电泳泳道按10μg总RNA上样，甲醛变性的1.5％琼脂糖凝胶电泳(55V电压电泳时间在4小时左右)。电泳缓冲液pH7.0的MOPS缓冲液。然后用20×SSC转移液将变性的RNA转移到尼龙膜上，转膜过夜后80度烘箱烘烤两个小时，转好的膜预杂交后与α-³²P-dCTP标记的基因克隆探针进行杂交。杂交好的膜利用X-ray光片在-80℃放射显影。其所用探针名称及序列见表1。

结果见图6(18S rRNA作为内参)。多个质体基因如PetB、PetD、NdhA、4.5S rRNA和16S rRNA等转录本水平下调，而5S rRNA、rps14、ycf3、23S rRNA的转录本前体明显累积增加。以上结果说明，HB1基因的缺失会导致质体基因转录调控发生异常，最终导致黄化部位叶绿体发育异常，导致花斑表型的出现。

表1 Nothern印迹分析中探针引物序列

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京林业大学

<120> 植物花斑蛋白HB1及其编码基因在调控植物花斑表型中的应用

<130> GNCYX201425

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 611

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 1

Met Leu Ser Gln Asp Leu Ser Phe Ser Lys Thr Leu Asn Pro Ser Phe

1 5 10 15

Ser Phe Arg Lys Ser Pro Leu Asn Ser Gly Val Arg Arg Ile Val Ser

20 25 30

Val Leu Pro Ala Ile Thr Glu Arg Asn Tyr Ala Phe Ser Val Lys Arg

35 40 45

Ser Glu Leu Leu Leu Arg Glu Asp Gly Gly Phe Arg Arg Asp Val Arg

50 55 60

Ala Leu Ala Gly Arg Ser Lys Lys Lys Leu Gly Gly Gly Ser Ser Gly

65 70 75 80

Gly Arg Ile Glu Gly Asp Ser Asp Met Arg Lys Gln Val Lys Arg Asn

85 90 95

Ala Arg Glu Lys Ser Lys Lys Leu Ala Glu Ser Leu Phe Tyr Arg Leu

100 105 110

Tyr Asn Asn Pro Asp Lys Ser Arg Ser Gln Ile Leu Ser Ser His Pro

115 120 125

Asp Lys Phe Thr Glu Glu Glu Leu Glu Met Ile Gly Leu Gly Tyr Asp

130 135 140

Arg Met Val Arg Phe Met Asp Lys Asp Asp Pro Arg Leu Arg His Pro

145 150 155 160

Tyr Asp Trp Phe Lys Tyr Gly Glu Phe Gly Pro Tyr Ser Trp Arg Gly

165 170 175

Val Val Val Gly Asp Pro Val Arg Gly Thr Ile Ser Asp Glu Cys Val

180 185 190

Thr Met Ile Gly Glu Val Glu Asn His Glu Glu Phe Glu Lys Ile Glu

195 200 205

Gln His Glu Met Asn Ile Ala Phe Gln Lys Arg Val Lys Glu Leu Asp

210 215 220

Ser Asn Val Gly Leu Arg Tyr Phe Trp Val Phe Val Arg His Pro Lys

225 230 235 240

Trp Arg Leu Ser Glu Leu Pro Trp Glu Gln Trp Thr Leu Val Ser Glu

245 250 255

Val Val Val Glu Ala Asp Lys Lys Gln Arg Leu Asp Lys Trp Asn Leu

260 265 270

Met Gly Arg Leu Gly Asn Lys Ser Arg Ser Leu Ile Cys Gln Cys Ala

275 280 285

Ala Trp Phe Arg Pro Asp Ile Val Tyr Val Lys Lys Pro Val Phe Gln

290 295 300

Cys Arg Phe Glu Pro Gln Glu Asp Phe Phe Asn Ser Leu Ile Pro Tyr

305 310 315 320

Leu Asn Pro Val Thr Glu Ser Gly Phe Val Cys Glu Val Glu Asp Asp

325 330 335

Glu Gly Arg Val Glu Leu Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Leu Cys Lys Met

340 345 350

Leu Lys Val Arg Gln Thr Ala Phe Val Asp Asp Val Val Asn Ala Tyr

355 360 365

Glu Lys Leu Ser Asp Glu Lys Lys Ser Arg Val Leu Lys Phe Leu Leu

370 375 380

Gly Asn His Pro Asn Glu Leu Leu His Pro Tyr Thr Lys Glu Trp Lys

385 390 395 400

Ala Lys Leu Glu Glu Met Glu Leu Gly Cys Asp Ala Pro Asp Glu Asp

405 410 415

Glu Asp Glu Ile Ser Ile Ser Gly Ser Ser Glu Lys Ala Glu Phe Ser

420 425 430

Glu Trp Ile Glu Asp Glu Ala Asp Asn Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp

435 440 445

Asp Asp Asp Asp Gly Glu Val Glu Glu Val Asp Asp Asp Asp Asn Met

450 455 460

Val Val Asp Val Glu Gly Asn Val Glu Glu Asp Ser Leu Glu Asp Glu

465 470 475 480

Ile Glu Glu Ser Asp Pro Glu Glu Asp Glu Arg Tyr Trp Glu Glu Gln

485 490 495

Phe Asn Lys Ala Thr Asn Asn Ala Glu Arg Met Glu Lys Leu Ala Glu

500 505 510

Met Ser Met Val Val Ser Asp Lys Phe Tyr Glu Lys Gln Leu Lys Ala

515 520 525

Leu Glu Glu Arg Glu Lys Gly Glu Ile Glu Gly Asp Glu Leu Glu Met

530 535 540

Arg Gly Lys Lys Ala Lys Val Lys Pro Glu Glu Trp Lys Thr Val Gly

545 550 555 560

Tyr Gly Arg Trp Met Lys Lys Ile Lys Lys Ser Arg Ile Pro Pro Glu

565 570 575

Leu Phe Leu Arg Ala Ala Val Arg Pro Phe Val Tyr Arg Asn Leu Val

580 585 590

Lys Glu Ile Val Leu Thr Arg His Ala Ile Leu Glu Gly Glu Ile Gly

595 600 605

Gln Lys Glu

610

<210> 2

<211> 1836

<212> DNA

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 2

atgctgagtc aagatttatc cttttctaaa accctgaacc ctagcttttc cttccgtaaa 60

tctccactca attccggggt acgaaggatc gtttcggttt taccggcaat taccgagagg 120

aattatgcgt ttagtgtcaa aaggtcggag cttttgctca gagaagatgg tggattccgg 180

cgagacgtgc gggcattggc cgggaggagc aagaaaaagc ttggaggagg ttcatctggt 240

ggaaggatag aaggagattc ggatatgagg aagcaggtga agaggaatgc tcgtgaaaag 300

tcgaagaagc tagcggaatc tttgttttat agattgtata ataaccctga caagagtcgg 360

agtcagattc tcagtagtca tccggataag tttactgagg aggagcttga gatgattggg 420

cttggttacg ataggatggt tcggtttatg gataaggatg acccgagatt gcgtcatcct 480

tatgattggt tcaagtatgg agagtttgga ccttactcgt ggcgtggtgt tgtggttggt 540

gatccggttc gtggtactat ctctgatgag tgtgttacta tgattggtga agtggagaat 600

catgaagagt ttgagaagat tgagcagcat gagatgaata tagcttttca gaagagggtt 660

aaggagttgg attcgaatgt tggtttgagg tatttttggg tgtttgtcag gcatccgaaa 720

tggagactca gtgagttacc gtgggagcaa tggacgttgg ttagtgaagt ggttgtggaa 780

gcggataaga agcagaggtt ggataagtgg aatttgatgg ggagattagg gaacaagtct 840

cggtctttga tatgtcaatg tgcggcttgg tttagacctg atattgtgta tgtgaagaag 900

cctgtgtttc agtgtaggtt tgagcctcaa gaagatttct ttaactcgct tatcccttat 960

ttaaacccgg tgacggaatc tggatttgtg tgtgaagtgg aggatgatga aggtagagtg 1020

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<210> 3

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<212> DNA

<213> Arabidopsis thaliana

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<212> DNA

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<213> Arabidopsis thaliana

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<212> DNA

<213> Arabidopsis thaliana

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<213> Arabidopsis thaliana

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<222> (17361)..(17361)

<223> n is a, c, g, or t

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ccctggcggc cgccgagaat gaacgccaag aggaacaagc atgaaaccgc accaggacgg 7380

ccaggacgaa ccgtttttca ttaccgaaga gatcgaggcg gagatgatcg cggccgggta 7440

cgtgttcgag ccgcccgcgc acgtctcaac cgtgcggctg catgaaatcc tggccggttt 7500

gtctgatgcc aagctggcgg cctggccggc cagcttggcc gctgaagaaa ccgagcgccg 7560

ccgtctaaaa aggtgatgtg tatttgagta aaacagcttg cgtcatgcgg tcgctgcgta 7620

tatgatgcga tgagtaaata aacaaatacg caaggggaac gcatgaaggt tatcgctgta 7680

cttaaccaga aaggcgggtc aggcaagacg accatcgcaa cccatctagc ccgcgccctg 7740

caactcgccg gggccgatgt tctgttagtc gattccgatc cccagggcag tgcccgcgat 7800

tgggcggccg tgcgggaaga tcaaccgcta accgttgtcg gcatcgaccg cccgacgatt 7860

gaccgcgacg tgaaggccat cggccggcgc gacttcgtag tgatcgacgg agcgccccag 7920

gcggcggact tggctgtgtc cgcgatcaag gcagccgact tcgtgctgat tccggtgcag 7980

ccaagccctt acgacatatg ggccaccgcc gacctggtgg agctggttaa gcagcgcatt 8040

gaggtcacgg atggaaggct acaagcggcc tttgtcgtgt cgcgggcgat caaaggcacg 8100

cgcatcggcg gtgaggttgc cgaggcgctg gccgggtacg agctgcccat tcttgagtcc 8160

cgtatcacgc agcgcgtgag ctacccaggc actgccgccg ccggcacaac cgttcttgaa 8220

tcagaacccg agggcgacgc tgcccgcgag gtccaggcgc tggccgctga aattaaatca 8280

aaactcattt gagttaatga ggtaaagaga aaatgagcaa aagcacaaac acgctaagtg 8340

ccggccgtcc gagcgcacgc agcagcaagg ctgcaacgtt ggccagcctg gcagacacgc 8400

cagccatgaa gcgggtcaac tttcagttgc cggcggagga tcacaccaag ctgaagatgt 8460

acgcggtacg ccaaggcaag accattaccg agctgctatc tgaatacatc gcgcagctac 8520

cagagtaaat gagcaaatga ataaatgagt agatgaattt tagcggctaa aggaggcggc 8580

atggaaaatc aagaacaacc aggcaccgac gccgtggaat gccccatgtg tggaggaacg 8640

ggcggttggc caggcgtaag cggctgggtt gcctgccggc cctgcaatgg cactggaacc 8700

cccaagcccg aggaatcggc gtgagcggtc gcaaaccatc cggcccggta caaatcggcg 8760

cggcgctggg tgatgacctg gtggagaagt tgaaggccgc gcaggccgcc cagcggcaac 8820

gcatcgaggc agaagcacgc cccggtgaat cgtggcaagc ggccgctgat cgaatccgca 8880

aagaatcccg gcaaccgccg gcagccggtg cgccgtcgat taggaagccg cccaagggcg 8940

acgagcaacc agattttttc gttccgatgc tctatgacgt gggcacccgc gatagtcgca 9000

gcatcatgga cgtggccgtt ttccgtctgt cgaagcgtga ccgacgagct ggcgaggtga 9060

tccgctacga gcttccagac gggcacgtag aggtttccgc agggccggcc ggcatggcca 9120

gtgtgtggga ttacgacctg gtactgatgg cggtttccca tctaaccgaa tccatgaacc 9180

gataccggga agggaaggga gacaagcccg gccgcgtgtt ccgtccacac gttgcggacg 9240

tactcaagtt ctgccggcga gccgatggcg gaaagcagaa agacgacctg gtagaaacct 9300

gcattcggtt aaacaccacg cacgttgcca tgcagcgtac gaagaaggcc aagaacggcc 9360

gcctggtgac ggtatccgag ggtgaagcct tgattagccg ctacaagatc gtaaagagcg 9420

aaaccgggcg gccggagtac atcgagatcg agctagctga ttggatgtac cgcgagatca 9480

cagaaggcaa gaacccggac gtgctgacgg ttcaccccga ttactttttg atcgatcccg 9540

gcatcggccg ttttctctac cgcctggcac gccgcgccgc aggcaaggca gaagccagat 9600

ggttgttcaa gacgatctac gaacgcagtg gcagcgccgg agagttcaag aagttctgtt 9660

tcaccgtgcg caagctgatc gggtcaaatg acctgccgga gtacgatttg aaggaggagg 9720

cggggcaggc tggcccgatc ctagtcatgc gctaccgcaa cctgatcgag ggcgaagcat 9780

ccgccggttc ctaatgtacg gagcagatgc tagggcaaat tgccctagca ggggaaaaag 9840

gtcgaaaagt tctctttcct gtggatagca cgtacattgg gaacccaaag ccgtacattg 9900

ggaaccggaa cccgtacatt gggaacccaa agccgtacat tgggaaccgg tcacacatgt 9960

aagtgactga tataaaagag aaaaaaggcg atttttccgc ctaaaactct ttaaaactta 10020

ttaaaactct taaaacccgc ctggcctgtg cataactgtc tggccagcgc acagccgaag 10080

agctgcaaaa agcgcctacc cttcggtcgc tgcgctccct acgccccgcc gcttcgcgtc 10140

ggcctatcgc ggccgctggc cgctcaaaaa tggctggcct acggccaggc aatctaccag 10200

ggcgcggaca agccgcgccg tcgccactcg accgccggcg cccacatcaa ggcaccctgc 10260

ctcgcgcgtt tcggtgatga cggtgaaaac ctctgacaca tgcagctccc ggagacggtc 10320

acagcttgtc tgtaagcgga tgccgggagc agacaagccc gtcagggcgc gtcagcgggt 10380

gttggcgggt gtcggggcgc agccatgacc cagtcacgta gcgatagcgg agtgtatact 10440

ggcttaacta tgcggcatca gagcagattg tactgagagt gcaccatatg cggtgtgaaa 10500

taccgcacag atgcgtaagg agaaaatacc gcatcaggcg ctcttccgct tcctcgctca 10560

ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg 10620

taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc 10680

agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc 10740

cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac 10800

tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc 10860

tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata 10920

gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc 10980

acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca 11040

acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag 11100

cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta 11160

gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg 11220

gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc 11280

agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt 11340

ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgcat tctaggtact 11400

aaaacaattc atccagtaaa atataatatt ttattttctc ccaatcaggc ttgatcccca 11460

gtaagtcaaa aaatagctcg acatactgtt cttccccgat atcctccctg atcgaccgga 11520

cgcagaaggc aatgtcatac cacttgtccg ccctgccgct tctcccaaga tcaataaagc 11580

cacttacttt gccatctttc acaaagatgt tgctgtctcc caggtcgccg tgggaaaaga 11640

caagttcctc ttcgggcttt tccgtcttta aaaaatcata cagctcgcgc ggatctttaa 11700

atggagtgtc ttcttcccag ttttcgcaat ccacatcggc cagatcgtta ttcagtaagt 11760

aatccaattc ggctaagcgg ctgtctaagc tattcgtata gggacaatcc gatatgtcga 11820

tggagtgaaa gagcctgatg cactccgcat acagctcgat aatcttttca gggctttgtt 11880

catcttcata ctcttccgag caaaggacgc catcggcctc actcatgagc agattgctcc 11940

agccatcatg ccgttcaaag tgcaggacct ttggaacagg cagctttcct tccagccata 12000

gcatcatgtc cttttcccgt tccacatcat aggtggtccc tttataccgg ctgtccgtca 12060

tttttaaata taggttttca ttttctccca ccagcttata taccttagca ggagacattc 12120

cttccgtatc ttttacgcag cggtattttt cgatcagttt tttcaattcc ggtgatattc 12180

tcattttagc catttattat ttccttcctc ttttctacag tatttaaaga taccccaaga 12240

agctaaggaa ggtgcgaaca agtccctgat atgagatcat gtttgtcatc tggagccata 12300

gaacagggtt catcatgagt catcaactta ccttcgccga cagtgaattc agcagtaagc 12360

gccgtcagac cagaaaagag attttcttgt cccgcatgga gcagattctg ccatggcaaa 12420

acatggtgga agtcatcgag ccgttttacc ccaaggctgg taatggccgg cgaccttatc 12480

cgctggaaac catgctacgc attcactgca tgcagcattg gtacaacctg agcgatggcg 12540

cgatggaaga tgctctgtac gaaatcgcct ccatgcgtct gtttgcccgg ttatccctgg 12600

atagcgcctt gccggaccgc accaccatca tgaatttccg ccacctgctg gagcagcatc 12660

aactggcccg ccaattgttc aagaccatca atcgctggct ggccgaagca ggcgtcatga 12720

tgactcaagg caccttggtc gatgccacca tcattgaggc acccagctcg accaagaaca 12780

aagagcagca acgcgatccg gagatgcatc agaccaagaa aggcaatcag tggcactttg 12840

gcatgaaggc ccacattggt gtcgatgcca agagtggcct gacccacagc ctggtcacca 12900

ccgcggccaa cgagcatgac ctcaatcagc tgggtaatct gctgcatgga gaggagcaat 12960

ttgtctcagc cgatgccggc taccaagggg cgccacagcg cgaggagctg gccgaggtgg 13020

atgtggactg gctgatcgcc gagcgccccg gcaaggtaag aaccttgaaa cagcatccac 13080

gcaagaacaa aacggccatc aacatcgaat acatgaaagc cagcatccgg gccagggtgg 13140

agcacccatt tcgcatcatc aagcgacagt tcggcttcgt gaaagccaga tacaaggggt 13200

tgctgaaaaa cgataaccaa ctggcgatgt tattcacgct ggccaacctg tttcgggcgg 13260

accaaatgat acgtcagtgg gagagatctc actaaaaact ggggataacg ccttaaatgg 13320

cgaagaaacg gtctaaatag gctgattcaa ggcatttacg ggagaaaaaa tcggctcaaa 13380

catgaagaaa tgaaatgact gagtcagccg agaagaattt ccccgcttat tcgcaccttc 13440

cctaattata acaagacgaa ctccaattca ctgttccttg cattctaaaa ccttaaatac 13500

cagaaaacag ctttttcaaa gttgttttca aagttggcgt ataacatagt atcgacggag 13560

ccgattttga aaccgcggtg atcacaggca gcaacgctct gtcatcgtta caatcaacat 13620

gctaccctcc gcgagatcat ccgtgtttca aacccggcag cttagttgcc gttcttccga 13680

atagcatcgg taacatgagc aaagtctgcc gccttacaac ggctctcccg ctgacgccgt 13740

cccggactga tgggctgcct gtatcgagtg gtgattttgt gccgagctgc cggtcgggga 13800

gctgttggct ggctggtggc aggatatatt gtggtgtaaa caaattgacg cttagacaac 13860

ttaataacac attgcggacg tttttaatgt actgaattaa cgccgaatta attcggggga 13920

tctggatttt agtactggat tttggtttta ggaattagaa attttattga tagaagtatt 13980

ttacaaatac aaatacatac taagggtttc ttatatgctc aacacatgag cgaaacccta 14040

taggaaccct aattccctta tctgggaact actcacacat tattatggag aaactcgagc 14100

ttgtcgatcg acagatcccg gtcggcatct actctatttc tttgccctcg gacgagtgct 14160

ggggcgtcgg tttccactat cggcgagtac ttctacacag ccatcggtcc agacggccgc 14220

gcttctgcgg gcgatttgtg tacgcccgac agtcccggct ccggatcgga cgattgcgtc 14280

gcatcgaccc tgcgcccaag ctgcatcatc gaaattgccg tcaaccaagc tctgatagag 14340

ttggtcaaga ccaatgcgga gcatatacgc ccggagtcgt ggcgatcctg caagctccgg 14400

atgcctccgc tcgaagtagc gcgtctgctg ctccatacaa gccaaccacg gcctccagaa 14460

gaagatgttg gcgacctcgt attgggaatc cccgaacatc gcctcgctcc agtcaatgac 14520

cgctgttatg cggccattgt ccgtcaggac attgttggag ccgaaatccg cgtgcacgag 14580

gtgccggact tcggggcagt cctcggccca aagcatcagc tcatcgagag cctgcgcgac 14640

ggacgcactg acggtgtcgt ccatcacagt ttgccagtga tacacatggg gatcagcaat 14700

cgcgcatatg aaatcacgcc atgtagtgta ttgaccgatt ccttgcggtc cgaatgggcc 14760

gaacccgctc gtctggctaa gatcggccgc agcgatcgca tccatagcct ccgcgaccgg 14820

ttgtagaaca gcgggcagtt cggtttcagg caggtcttgc aacgtgacac cctgtgaacg 14880

gcgggagatg caataggtca ggctctcgct aaactcccca atgtcaagca cttccggaat 14940

cgggagcgcg gccgatgcaa agtgccgata aacataacga tctttgtaga aaccatcggc 15000

gcagctattt acccgcagga catatccacg ccctcctaca tcgaagctga aagcacgaga 15060

ttcttcgccc tccgagagct gcatcaggtc ggagacgctg tcgaactttt cgatcagaaa 15120

cttctcgaca gacgtcgcgg tgagttcagg ctttttcata tctcattgcc ccccggatct 15180

gcgaaagctc gagagagata gatttgtaga gagagactgg tgatttcagc gtgtcctctc 15240

caaatgaaat gaacttcctt atatagagga agggtcttgc gaaggatagt gggattgtgc 15300

gtcatccctt acgtcagtgg agatatcaca tcaatccact tgctttgaag acgtggttgg 15360

aacgtcttct ttttccacga tgctcttcgt gggtgggggt ccatctttgg gaccactgtc 15420

ggcagaggca tcttgaacga tagcctttcc tttatcgcaa tgatggcatt tgtaggtgcc 15480

accttccttt tctactgtcc ttttgatgaa gtgacagata gctgggcaat ggaatccgag 15540

gaggtttccc gatattaccc tttgttgaaa agtctcaata gccctttggt cttctgagac 15600

tgtatctttg atattcttgg agtagacgag agtgtcgtgc tccaccatgt tcacatcaat 15660

ccacttgctt tgaagacgtg gttggaacgt cttctttttc cacgatgctc ctcgtgggtg 15720

ggggtccatc tttgggacca ctgtcggcag aggcatcttg aacgatagcc tttcctttat 15780

cgcaatgatg gcatttgtag gtgccacctt ccttttctac tgtccttttg atgaagtgac 15840

agatagctgg gcaatggaat ccgaggaggt ttcccgatat taccctttgt tgaaaagtct 15900

caatagccct ttggtcttct gagactgtat ctttgatatt cttggagtag acgagagtgt 15960

cgtgctccac catgttggca agctgctcta gccaatacgc aaaccgcctc tccccgcgcg 16020

ttggccgatt cattaatgca gctggcacga caggtttccc gactggaaag cgggcagtga 16080

gcgcaacgca attaatgtga gttagctcac tcattaggca ccccaggctt tacactttat 16140

gcttccggct cgtatgttgt gtggaattgt gagcggataa caatttcaca caggaaacag 16200

ctatgacatg attacgaatt cgagctcggt accgtaacta taacggtcct aaggtagcga 16260

aggatccgct cgctacctta agagaggata tccctccatc ctataatgta ggctatagga 16320

actagggcaa ggccggccat gcggccgcaa gctgggtgca gcgtgacccg gtcgtgcccc 16380

tctctagaga taatgagcat tgcatgtcta agttataaaa aattaccaca tatttttttt 16440

gtcacacttg tttgaagtgc agtttatcta tctttataca tatatttaaa ctttactcta 16500

cgaataatat aatctatagt actacaataa tatcagtgtt ttagagaatc atataaatga 16560

acagttagac atggtctaaa ggacaattga gtattttgac aacaggactc tacagtttta 16620

tctttttagt gtgcatgtgt tctccttttt ttttgcaaat agcttcacct atataatact 16680

tcatccattt tattagtaca tccatttagg gtttagggtt aatggttttt atagactaat 16740

ttttttagta catctatttt attctatttt agcctctaaa ttaagaaaac taaaactcta 16800

ttttagtttt tttatttaat aatttagata taaaatagaa taaaataaag tgactaaaaa 16860

ttaaacaaat accctttaag aaattaaaaa aactaaggaa acatttttct tgtttcgagt 16920

agataatgcc agcctgttaa acgccgtcga cgagtctaac ggacaccaac cagcgaacca 16980

gcagcgtcgc gtcgggccaa gcgaagcaga cggcacggca tctctgtcgc tgcctctgga 17040

cccctctcga gagttccgct ccaccgttgg acttgctccg ctgtcggcat ccagaaattg 17100

cgtggcggag cggcagacgt gagccggcac ggcaggcggc ctcctcctcc tctcacggca 17160

ccggcagcta cgggggattc ctttcccacc gctccttcgc tttcccttcc tcgcccgccg 17220

taataaatag acaccccctc cacaccctct ttccccaacc tcgtgttgtt cggagcgcac 17280

acacacacaa ccagatctcc cccaaatcca cccgtcggca cctccgcttc aaggtacgcc 17340

gctcgtcctc cccccccccc ntctctacct tctctagatc ggcgttccgg tccatggtta 17400

gggcccggta gttctacttc tgttcatgtt tgtgttagat ccgtgtttgt gttagatccg 17460

tgctgctagc gttcgtacac ggatgcgacc tgtacgtcag acacgttctg attgctaact 17520

tgccagtgtt tctctttggg gaatcctggg atggctctag ccgttccgca gacgggatcg 17580

atttcatgat tttttttgtt tcgttgcata gggtttggt 17619

Claims (4)

1.一种培育具有花斑表型的植株的方法，包括如下步骤：对拟南芥属植物基因组中的HB1基因进行基因编辑，得到基因编辑植株，从基因编辑植株的自交后代中获得纯合型基因编辑植株；纯合型基因编辑植株即为具有花斑表型的植株；

所述HB1基因为如下(b1)或(b2)：

(b1)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；

(b2)序列表中序列3所示的DNA分子；

所述基因编辑植株为将所述HB1基因中的“TTACTCGTGGCGTGGTGTTG”替换为“TTACTCGTGGCGTGGTGATTG”的植株。

2.一种培育具有花斑表型的植株的方法，包括如下步骤：对拟南芥属植物基因组中的HB1基因进行基因编辑，得到纯合型基因编辑植株，即为具有花斑表型的植株；

所述HB1基因为如下(b1)或(b2)：

(b1)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；

(b2)序列表中序列3所示的DNA分子；

所述基因编辑植株为将所述HB1基因中的“TTACTCGTGGCGTGGTGTTG”替换为“TTACTCGTGGCGTGGTGATTG”的植株。

3.HB1蛋白在调控拟南芥属植物花斑表型中的应用；所述HB1蛋白为序列表中序列1所示的蛋白质。

4.HB1蛋白在调控拟南芥属植物叶绿体发育中的应用；所述HB1蛋白为序列表中序列1所示的蛋白质。

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