CN108220176B - 一种提高酿酒酵母工程菌株发酵生产葡萄糖二酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高酿酒酵母工程菌株发酵生产葡萄糖二酸的方法，属于生物工程技术领域。本发明通过以在酿酒酵母基因组中多拷贝存在的Delta位点作为外源基因模块整合位点，实现外源基因模块一次整合达到多拷贝表达的目的。本发明通过整合表达的方式使经过整合基因组Delta位点后的基因工程菌，传代20次，在相同的发酵条件下葡萄糖二酸的产量仍为3.8g/L，对于葡萄糖二酸的工业化生产具有重要的应用意义。

Description

一种提高酿酒酵母工程菌株发酵生产葡萄糖二酸的方法
技术领域
本发明涉及一种提高酿酒酵母工程菌株发酵生产葡萄糖二酸的方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
D-葡糖二酸(D-glucaric acid)作为非常重要的有机酸已被广泛研究，其在医疗和工业中有着广泛的应用，比如降胆固醇、治疗糖尿病、肿瘤治疗等等[1,2]，或可能用作聚合物前体，包括新型尼龙和高度分支聚酯[2]。目前已经有利用产自葡萄糖的葡糖二酸制备羟基化尼龙的报道，羟基化尼龙是可生物降解的纤维[2]。在美国太平洋西北国家实验室、国家再生能源实验室和美国能源部写的一份报告中，葡糖二酸被认为是”top value-addedchemical from biomass”[3]。由于该有机酸的重要性，正越来越得到学术界和工业界的重视。
目前生产葡糖二酸的方法主要以化学法为主，即葡萄糖的化学氧化，采用硝酸作为溶剂和氧化剂，这是一个非选择性、高成本的过程。化学法的主要问题是低得率，只有不到40％；需要高温；会产生大量氧化反应副产物，不利于后续葡糖二酸的分离。虽然有研究发现催化剂五氧化二钒、4-乙酰氨基-2,2,6,6-四甲基-1-二苯哌酯等可以提高葡糖二酸的得率，但是这些催化剂太昂贵。生物法合成葡糖二酸相较于传统的化学法，有着很多的优势，比如更加环境友好，更大的实现低成本生产的可能性[1]。生物法产葡糖二酸有很多种途径[4]。在合适的菌种中构建高效稳定的葡糖二酸合成途径，应用于工业生产，取代传统的化学途径，将是非常有前景的研究领域。
麻省理工学院Prather课题组研究了大肠杆菌代谢工程产有机酸，其在大肠杆菌中构建了合成葡糖二酸的代谢途径，同时表达了三个酶，包括来自酿酒酵母的肌醇-1-磷酸合成酶Ino1(myo-inositol-1-phosphate)、单磷酸肌醇磷酸酶INM1(inositolmonophosphate 1-phosphatase)来自老鼠的肌醇磷酸氧化酶MIOX(myo-inositoloxygenase)和来自丁香假单胞菌的糖醛酸脱氢酶Udh，利用大肠杆菌现有的PTS途径(phosphoenolpyruvate-dependent phosphotransferase system)，合成葡糖二酸，从葡萄糖到葡糖二酸的代谢途径如图2所示[2]。最后经优化，最终葡糖二酸的产量为1g/L，MIOX是影响最终产量的最重要因素，是整合代谢流的限速步骤。主要原因是MIOX的不稳定性，在稳定期时，即使在没有葡糖二酸的情况下，MIOX的活力也会迅速下降。
该课题组利用蛋白融合技术提高了MIOX的稳定性，同时利用定向进化提高了MIOX的活力。将SUMO融合到MIOX的N-末端，使得葡糖二酸的产量提高了74％；虽然定向进化没有改进MIOX，但是他们筛选到了一个长941bp的DNA片段，它的表达可以提高肌醇的运输量，并且使得葡糖二酸的产量提高65％。最后，他们改造的重组大肠杆菌可以把10.8g/L的肌醇转化成4.85g/L的葡糖二酸[1]。该课题组还利用脚手架蛋白提高MIOX的比活力，从而提高了葡糖二酸的产量，相较于没有脚手架蛋白的对照，葡糖二酸产量提高了5倍。与之前报道的最高产量相比，提高了50％[5]。该课题组在大肠杆菌代谢工程制备葡糖二酸的研究中取得了突破。但由于在酿酒酵母中质粒表达的不稳定和易丢失，该类基因工程菌不适用于实际的工业化生产。
参考文献：
1.Shiue,E.and K.L.Prather,Improving D-glucaric acid production frommyo-inositol in E.coli by increasing MIOX stability and myo-inositoltransport.Metab Eng,2014.22:p.22-31.
2.Moon,T.S.,et al.,Production of glucaric acid from a syntheticpathway in recombinant Escherichia coli.Appl Environ Microbiol,2009.75(3):p.589-95.
3.Werpy,T.and G.Petersen,Top value added chemicals from biomass,volume 1:results of screening for potential candidates from sugars andsynthesis gas.US Department of Energy,Washington,DC.,2004.
4.Moon,T.S.,Retrobiosynthesis of D-glucaric acid in a metabolicallyengineered strain of Escherichia coli.MIT Doctoral Thesis,2010.
5.Moon,T.S.,et al.,Use of modular,synthetic scaffolds for improvedproduction of glucaric acid in engineered E.coli.Metab Eng,2010.12(3):p.298-305.
6.Jin H,Mc Caffery M,Grote E,Ergosterol promotes pheromone signalingand plasma membrane fusion in mating yeast.The Journal of cell Biology,2008,180(4):813-826
7.SakaiA,ShimizuY,HishinumaF,Integration of heterologous genes intothe chromosome of
Saccharomyces cerevisiae using a delta sequence of yeastretrotansposon Ty,Applied Microbiology and Biotechnology,1990,33(3):302～306
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供一种高产葡糖二酸的酿酒酵母工程菌株及构建方法。本发明通过以下方案来实现：
本发明的第一个目的是提供一种产D-葡萄糖二酸的酿酒酵母基因工程菌，是以酿酒酵母BY4741为出发菌株，敲除OPI基因，将拟南芥(Arabidopsis thaliana)来源的肌醇加氧酶(MIOX)和丁香假单胞菌来源的糖醛酸脱氢酶(UDH)整合至酿酒酵母BY4741基因组的Delta位点。
在本发明的一种实施方式中，以组成型质粒PY26-TEF-GPD将拟南芥来源的肌醇加氧酶(MIOX4)和丁香假单胞菌来源的糖醛酸脱氢酶(UDH)整合至酿酒酵母基因组的Delta位点。
本发明的第二个目的是提供在酿酒酵母中构建高产D-葡萄糖二酸途径的方法，按照以下步骤顺序进行：
在本发明的一种实施方式中，所述片段MIOX4来自拟南芥，经过密码子优化，由金唯志科技公司全基因合成至PUC57-MIOX4-UDH质粒，由pY26-MIOX4F和pY26-MOX4R扩增。
在本发明的一种实施方式中，所述基因UDH片段来自丁香假单胞菌(Pseudomonasputida)，经过密码子优化后，由金唯志科技公司全基因合成至PUC57-MIOX4-UDH质粒，由引物pY26-UDHF和pY26-UDHR扩增。
在本发明的一种实施方式中，所述片段Delta1来自酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，由引物Delta1F和Delta1R扩增。
在本发明的一种实施方式中，所述片段Delta2来自酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，由引物Delta2F和Delta2R扩增。
在本发明的一种实施方式中，所述片段U-GPD由GPD启动子，UDH基因，CYC1终止子组成，如SEQ ID NO.7所示；来自质粒pY26-TEF-GPD-MIOX4-UDH，由U-GPDF和U-GPDR扩增。
在本发明的一种实施方式中，所述片段M-TEF由TEF启动子，MIOX4基因，ADH终止子组成，如SEQ ID NO.4所示；来自质粒pY26-TEF-GPD-MIOX4-UDH，由引物M-TEFF和M-TEFF扩增。
在本发明的一种实施方式中，所述片段His1为组氨酸缺陷型的筛选标记，如SEQID NO.5所示；来自质粒pRS313，由引物His1F和His1R扩增
在本发明的一种实施方式中，所述片段His2为组氨酸缺陷型筛选标记，如SEQ IDNO,8所示；来自质粒pRS313，由引物His2F和His2R扩增
在本发明的一种实施方式中，所述方法将片段Delta1、M-TEF、His1进行降落PCR，以PCR产物为模板，由引物Delta1F和His1R扩增得到DMH-001片段。
在本发明的一种实施方式中，所述方法将片段Delta2、U-GPD、His2进行降落PCR，以PCR产物为模板，由引物His2F和Delta2R扩增得到DUH-001片段。
在本发明的一种实施方式中，所述方法将所述DMH-001和DMH-002转化至酿酒酵母整合基因组，以SD-His缺陷型培养基培养，筛选获得高产D-葡萄糖二酸的酿酒酵母基因工程菌Bga-001。
本发明的第三个目的是提供一种利用该菌株高产葡糖二酸的方法，利用葡萄糖为底物高产高附加值葡糖二酸。
在本发明的一种实施方式中，将单菌落接种于10mlYPD中，30℃，250rpm，摇床培养24h即为种子液。
所述方法将重组菌种子液以1％-2％接种量接种到发酵培养基中，使转接后初始浓度达到OD600为0.1，30℃、250rpm，培养144小时。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的碳源为葡萄糖。
在本发明的一种实施方式中，将种子液按照2％的接种量接种到含有50ml液体培养基的250ml的锥形瓶中，30℃、摇床转速250rpm，培养144小时。
在本发明的一种实施方式中，将所述酿酒酵母基因工程菌接种至40mlYPD培养基中，250rpm 30℃过夜培养至OD600为4.8～5.2，按2％的接种量转接使初始OD600值为0.1，初始培养基体积YPD为2L，肌醇浓度60mM，温度为30℃，pH控制在4以上，转速700rpm-800rpm，通气量3L/min。
本发明的有益效果：针对单位点基因组整合效率不高，但多拷贝质粒表达传代又不稳定的问题。本方法选择以在酿酒酵母基因组中多拷贝存在的Delta位点作为外源基因模块整合位点，实现外源基因模块一次整合达到多拷贝表达的目的。本实验室构建游离性质粒pY26-TEF-GPD-MIOX4-UDH转化酿酒酵母成功生产葡萄二酸，但由于质粒表达的不稳定，产量由10g/L下降到传代20次后的2/L，而经过整合基因组Delta位点后，经传代20次，在相同的发酵条件下产量仍为3.8g/L。
附图说明
图1为葡糖二酸代谢途径和Delta位点整合方法；
图2为pY26-TEF-GPD-MIOX4-UDH质粒图谱。
具体实施方式
表1为实施例1、2用到的引物
Figure BDA0001563760540000041
Figure BDA0001563760540000051
实施例1质粒pY26-TEF-GPD-MIOX4-UDH构建
以PUC57-MIOX4-UDH为模板,分别以pY26-MIOX4F/pY26-MIOX4R和pY26-UDHF/pY26-UDHR为引物扩增得到MIOX4和UDH基因。分别用BglII/NotI双酶切MIOX4回收产物和质粒pY26-TEF-GPD，得到pY26-MIOX4质粒，纯化回收由T4连接酶过夜连接构建质粒pY26-TEF-GPD-MIOX4。将利用Gibson Assembly组装构建pY26-MIOX4-UDH，然后再用EcoRI单酶切质粒pY26-TEF-GPD-UDH质粒，利用Gibson Assembly组装构建pY26-TEF-GPD–MIOX4-UDH质粒，验证引物为veri-pYF和veri-pYR。经过菌落PCR验证，质粒构建成功。
实施例2整合片段DMH-001和DUH-001片段的获得。
以酿酒酵母BY4741基因组为模板，分别以Delta1F/Delta1R和Delta2F/Delta2R为引物扩增Delta1和Delta2片段；以质粒pY26-TEF-GPD-MIOX4-UDH(本实验室构建，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)为模板，U-GPDF/U-GPDR和M-TEFF/M-TEFR为引物分别扩增片段U-TEF(包括启动子GPD、基因UDH、终止子CYC1)和M-TEF(包括启动子TEF、基因MIOX4、终止子ADH1)；以质粒pRS313(本实验保藏，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)为模板，引物His1F/His1F和His2F/His2R分别扩增片段His1和His2。将Delta1、M-TEF、His1三个片段进行降落PCR，以PCR产物为模板，Delta1F/His1R为引物，扩增得到DMH-001。将His2、U-GPD、Delta2进行降落PCR，以PCR产物为模板，His2F/Delta2R为引物扩增得到DUH-001，如图1。
实施例3高产葡萄二酸整合菌株Bga-001获得
将上述两个整合片段DMH-001和DUH-001通过醋酸锂转化法分别转化酿酒酵母BY4741ΔOPI(本实验室保藏)，涂布SD-His缺陷型培养基，待2-3天挑取转化子即为整合成功的重组菌，把阳性转化子接入10ml YPD液体培养基作为种子，过夜培养，以2％接种量转接50mlYPD(培养基中加入60mM肌醇)液体培养基，30℃，250rpm摇床培养7d。每12h取样，13000rpm离心5min取上清，0.22μm滤膜过滤。葡糖二酸产量由日立高效液相色谱仪检测，示差检测器，柱温30℃，进样量30ul。由此筛选出一株高产葡糖二酸的菌株，培养7d的产量为3.8g/L，命名为Bga-001。
实施例4扩大培养提高葡糖二酸产量
将筛选得到的阳性转化子接种至40ml YPD培养基中，250rpm 30℃过夜培养至OD600约为5.0左右，按2％转接后使初始OD600值为0.1，初始培养基体积YPD为2L，肌醇浓度为60mM，温度为30℃，PH控制在4以上，转速700rpm-800rpm，通气量3L/min。发酵144h，最终产量5.8g。
实施例5菌株稳定性的验证
分别将实施例2构建的基因工程菌与公开号为107164255A的专利中构建的基因工程菌接种至相同的的发酵培养基中，按实施例3的方式培养，测定产量，分别为10g/L和3.8g/L。
将两株基因工程菌分别以相同的方式传代20次，按实施例3的方式培养，测定产量，分别为2g/L和3.8g/L，可见，实施例2的基因工程菌传代稳定性好，更适用于工业化生产。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种提高酿酒酵母工程菌株发酵生产葡萄糖二酸的方法
<160> 26
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 9184
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
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aataatattt atagaattgt gtagaattgc agattccctt tt 222
<210> 7
<211> 1848
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gagctccagc tgtttatcat tatcaatact cgccatttca aagaatacgt aaataattaa 60
tagtagtgat tttcctaact ttatttagtc aaaaaattag ccttttaatt ctgctgtaac 120
ccgtacatgc ccaaaatagg gggcgggtta cacagaatat ataacatcgt aggtgtctgg 180
gtgaacagtt tattcctggc atccactaaa tataatggag cccgcttttt aagctggcat 240
ccagaaaaaa aaagaatccc agcaccaaaa tattgttttc ttcaccaacc atcagttcat 300
aggtccattc tcttagcgca actacagaga acaggggcac aaacaggcaa aaaacgggca 360
caacctcaat ggagtgatgc aacctgcctg gagtaaatga tgacacaagg caattgaccc 420
acgcatgtat ctatctcatt ttcttacacc ttctattacc ttctgctctc tctgatttgg 480
aaaaagctga aaaaaaaggt tgaaaccagt tccctgaaat tattccccta cttgactaat 540
aagtatataa agacggtagg tattgattgt aattctgtaa atctatttct taaacttctt 600
aaattctact tttatagtta gtcttttttt tagttttaaa acaccagaac ttagtttcga 660
cggattctag aactagtgga tcccccgggc tgcaggatgg cctccgctca tactacgcaa 720
actccattta atagattatt gcttacaggc gcagcaggtg ggttaggtaa ggttttaaga 780
gaaactttgc gtccatattc ccacattctt cgtttgtctg atatagctga gatggcacct 840
gccgtgggtg atcatgaaga agttcaagtt tgtgaccttg cagacaagga cgcagtgcac 900
aggttagtag agggcgtcga tgctatctta cactttggtg gagtttcagt cgaaagacca 960
tttgaagaaa ttttgggtgc taatatatgt ggtgtctttc acatatacga agctgctaga 1020
agacatggcg ttaaaagagt catttttgcc agcagtaacc atgtaatagg cttttataag 1080
caaaacgaaa ctatcgatgc gcattctcca cgtagaccag attcatatta cggtctatca 1140
aaatcctatg gagaggatat ggcgtccttt tactttgaca ggtatggtat tgaaactgtt 1200
agtataagga tagggtcatc atttcctgaa cctcaaaata ggagaatgat gtcaacatgg 1260
ttatcatttg atgatcttac ccgtttgctt gagagagcat tgtatacgcc ggacgtgggt 1320
cataccgtcg tttacggtgt ctccgataat aaaactgttt ggtgggacaa tagattcgca 1380
tctaagttgg attatgctcc taaggatagt tccgaggtat ttagggcgaa agttgatgca 1440
caacctatgc ctgctgatga cgaccctgcc atggtctacc aagggggtgc cttcgtggcg 1500
agtggtccgt ttggtgataa atagaattcg atatcaagct tatcgatacc gtcgacctcg 1560
agtcatgtaa ttagttatgt cacgcttaca ttcacgccct ccccccacat ccgctctaac 1620
cgaaaaggaa ggagttagac aacctgaagt ctaggtccct atttattttt ttatagttat 1680
gttagtatta agaacgttat ttatatttca aatttttctt ttttttctgt acagacgcgt 1740
gtacgcatgt aacattatac tgaaaacctt gcttgagaag gttttgggac gctcgaaggc 1800
tttaatttgc ggccggtacc caattcgccc tatagtgagt cgtattac 1848
<210> 8
<211> 527
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tgaggcactt tccagagcgg tggtagatct ttcgaacagg ccgtacgcag ttgtcgaact 60
tggtttgcaa agggagaaag taggagatct ctcttgcgag atgatcccgc attttcttga 120
aagctttgca gaggctagca gaattaccct ccacgttgat tgtctgcgag gcaagaatga 180
tcatcaccgt agtgagagtg cgttcaaggc tcttgcggtt gccataagag aagccacctc 240
gcccaatggt accaacgatg ttccctccac caaaggtgtt cttatgtagt gacaccgatt 300
atttaaagct gcagcatacg atatatatac atgtgtatat atgtatacct atgaatgtca 360
gtaagtatgt atacgaacag tatgatactg aagatgacaa ggtaatgcat cattctatac 420
gtgtcattct gaacgaggcg cgctttcctt ttttcttttt gctttttctt tttttttctc 480
ttgaactcga cggatcatat gcggtgtgaa ataccgcaca gatgcgt 527
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
agatcttcac caacgcagat tttcag 26
<210> 10
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gcggccgcat gactatcagt gtagaaaa 28
<210> 11
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gacggattct agaactagtg gatcccccgg gctgcaggat ggcctccgct catactacgc 60
aaact 65
<210> 12
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
aggtcgacgg tatcgataag cttgatatcg aattttattt atcaccaaac ggaccactcg 60
ccacgaa 67
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
ctggcaaggt agacaagccg acaa 24
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
ggagggcgtg aatgtaagcg tga 23
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
ggctggcaac taatagggac act 23
<210> 16
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
tccaattcag ctggcgtaat agcggctata atatcaggta tacagaatat 50
<210> 17
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
ctgtatacct gatattatag cctgctatta cgccagctga at 42
<210> 18
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
gtgtactaga ggaggccaag agtagctgga gctcatagct tca 43
<210> 19
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
ttttgaagct atgagctcca gctactcttg gcctctctag t 41
<210> 20
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
ctgcgtacgg cctgttcgaa agatctacca ccgctctgga aagtgcctca tccaaaggcg 60
caaatcctg 69
<210> 21
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
cgccctatag tgagtcgtat tactgttgga ataaaaatca act 43
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
aaaagggaat ctgcaattct 20
<210> 23
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
tgtgaaatac cgcacagatg cgtgagctcc agctgtttat ca 42
<210> 24
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
gatagttgat ttttattcca acagtaatac gactcactat ag 42
<210> 25
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
ctactggcgc gtggagtaaa aaggtttgga tcaggatttg cgcctttgga tgaggcactt 60
tccagagcg 69
<210> 26
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
ataatgataa acagctggag ctcacgcatc tgtgcggtat t 41

Claims (7)

1.一种产D-葡萄糖二酸的酿酒酵母基因工程菌，其特征在于，以酿酒酵母BY4741为出发菌株，敲除OPI基因，以组成型质粒PY26-TEF-GPD分别将拟南芥(Arabidopsis thaliana)来源的肌醇加氧酶和丁香假单胞菌来源的糖醛酸脱氢酶整合至酿酒酵母BY4741基因组的Delta1和Delta2位点，所述Delta1和Delta2片段分别含有SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。
2.一种构建权利要求1所述基因工程菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)分别扩增酿酒酵母的Delta1和Delta2片段；
(2)扩增由GPD启动子、UDH基因、CYC1终止子组成的U-GPD片段；扩增由TEF启动子、MIOX4基因、ADH终止子组成的M-TEF片段；
(3)将Delta1与M-TEF扩增连接，将Delta2和U-GPD扩增连接，并将扩增连接后的DNA片段转化至酿酒酵母中，所述Delta1和Delta2片段分别含有SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述M-TEF片段含有如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；所述U-GPD片段含有SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列。
4.一种葡萄糖二酸的生产方法，其特征在于，以权利要求1的基因工程菌为发酵微生物，以葡萄糖为碳源进行发酵。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，发酵培养基中还含有肌醇。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，将基因工程菌的种子液以1％-2％的接种量接种到发酵培养基中，于28～30℃培养72～144小时。
7.权利要求1所述的基因工程菌在制备含有D-葡萄糖二酸的产品中的应用。
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