CN111909851B

CN111909851B - 基于杜氏盐藻代谢途径和雨生红球藻bkt的产虾青素工程菌及其构建方法与应用

Info

Publication number: CN111909851B
Application number: CN202010655671.7A
Authority: CN
Inventors: 姜建国; 陈浩宏; 吴芳纯; 梁明华; 王彦硕
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2020-07-09
Filing date: 2020-07-09
Publication date: 2022-06-14
Anticipated expiration: 2040-07-09
Also published as: CN111909851A

Abstract

本发明公开了一种基于杜氏盐藻代谢途径和雨生红球藻BKT的产虾青素工程菌及其构建方法与应用。该工程菌以杜氏盐藻为材料，通过插入雨生红球藻β‑胡萝卜素酮化酶(BKT)，使BKT在该重组藻细胞内稳定表达，可实现杜氏盐藻由β‑胡萝卜素到虾青素的转化，进一步实现虾青素在杜氏盐藻中的积累，为天然虾青素的生产开辟了一条新的途径。

Description

基于杜氏盐藻代谢途径和雨生红球藻BKT的产虾青素工程菌及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及分子克隆领域，具体涉及基于杜氏盐藻代谢途径和雨生红球藻BKT的产虾青素工程菌及其构建方法与应用。

背景技术

在植物和藻类中，类胡萝卜素在光系统的组装、采光和光保护中发挥着重要作用。类胡萝卜素作为维生素A的前体和保护细胞免受自由基和单线态氧的破坏作用的抗氧化剂，也是人类营养的重要组成部分。例如，据报道类胡萝卜素可以预防早衰、退行性疾病和癌症。类胡萝卜素的工业用途包括化妆品和食品中的补充剂，动物饲料添加剂和着色剂。

在类胡萝卜素中，虾青素是β-胡萝卜素(3,3′-羟基-β，β-胡萝卜素-4,4′-二酮)的3,3′-二羟基化和4,4′-二酮化衍生物，是最有价值的天然产物之一。虾青素是类胡萝卜素中已知的最强的抗氧化剂，因为在3,3′-和4,4′-位置分别有羟基和酮官能团，具有最大的正氧化电位(相对于甘汞电极)。这种色素已作为饲料染料在工业上开发利用，特别是在水产养殖和家禽养殖中作为饲料添加剂。虾青素的多种生物学功能包括参与单线态氧猝灭、降低低密度脂蛋白、抗肿瘤活性和增强免疫反应。在鲑鱼和鳟鱼中，虾青素被证明可以保护鱼卵免受紫外线辐射的损害，并提高幼鱼的存活率和生长速度。据报道，虾青素可增强人体免疫功能，减少大鼠口腔癌变，抑制小鼠乳腺肿瘤的生长。

目前已知的发现能够产生虾青素的真核微藻有雪地衣藻Chlamydomonasnivalis，新绿球藻Neochloris wimmeri，原管藻Protosiphon botryoides，Scotiellopsisoocystiformis，雨生红球藻Haematococcus Pluvialis，佐夫色绿藻Chromochloriszofingiensis，绿球藻Chlorococcum sp.等，它们分别在严寒，高温，强光，氮缺乏等逆境环境中积累大量的虾青素。雨生红球藻中的β-胡萝卜素酮化酶(BKT)是最早发现的合成虾青素的关键酶基因。莱茵衣藻虽然不能生产虾青素，但是在其中也发现了β-胡萝卜素酮化酶，且具有很高的将玉米黄质酮化的能力。C.zofingiensis也发现了两个β-胡萝卜素酮化酶，其中CzBKT1被证明是不可或缺的。

杜氏盐藻Dunaliella salina，是一种耐盐性极强的真核绿藻，可以在0.5-5mol/LNaCl的盐度范围内存活，其在高盐浓度下，能够被刺激产生大量的β-胡萝卜素，目前已经商业化用于生产β-胡萝卜素。杜氏藻虽然能够积累大量的β-胡萝卜素，但是却不能够生产虾青素。而且目前报道的基因工程改造的杜氏藻中虾青素含量都是极低的，并不能够达到商业化生产的目的。因此，构建一种稳定高产的产虾青素的杜氏盐藻是一项具有重大意义的工作。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种基于杜氏盐藻代谢途径和雨生红球藻BKT的产虾青素工程菌。该工程菌以杜氏盐藻为材料，通过插入雨生红球藻β-胡萝卜素酮化酶(BKT)，使BKT在该重组藻细胞内稳定表达，可实现杜氏盐藻由β-胡萝卜素到虾青素的转化，进一步实现虾青素在杜氏盐藻中的积累。

本发明的另一目的在于提供上述基于杜氏盐藻代谢途径和雨生红球藻BKT的产虾青素工程菌的构建方法。

本发明的再一目的在于提供上述基于杜氏盐藻代谢途径和雨生红球藻BKT的产虾青素工程菌的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

基于杜氏盐藻代谢途径和雨生红球藻BKT的产虾青素工程菌，所述的产虾青素工程菌中含有雨生红球藻BKT的编码基因。

所述的雨生红球藻BKT的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述的雨生红球藻BKT的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示序列的自5'末端第2764位至第3750位核苷酸所示。

所述的杜氏盐藻优选为杜氏盐藻CCAP 19/18。

所述的雨生红球藻BKT的编码基因的导入优选通过同源重组技术实现；具体操作为将含有雨生红球藻BKT的编码基因的重组质粒导入杜氏盐藻。

所述的重组质粒为以pCR2.1为骨架载体，将杜氏巴氏藻内源性的启动子基因序列(Dbgpdhpro)、叶绿体定位肽RBS2基因序列、BKT基因序列、2A剪切肽基因序列(2A)、博来霉素和绿色荧光蛋白基因序列(ble-EGFP)，以及杜氏巴氏藻内源性的终止子基因序列(Dbpsyter)按转录方向依次连接在一起得到。

所述的启动子基因序列如SEQ ID NO.1所示序列的自5'末端第294位至第2559位核苷酸所示。

所述的叶绿体定位肽RBS2基因序列如SEQ ID NO.1所示序列的自5'末端第2566位至第2763位核苷酸所示。

所述的2A剪切肽基因序列如SEQ ID NO.1所示序列的自5'末端第3751位至第3725位核苷酸所示。

所述的博来霉素和绿色荧光蛋白基因序列如SEQ ID NO.1所示序列的自5'末端第3826位至第5124位核苷酸所示。

所述的终止子基因序列如SEQ ID NO.1所示序列的自5'末端第5131位至第6232位核苷酸所示。

优选的，所述的重组质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

上述基于杜氏盐藻代谢途径和雨生红球藻BKT的产虾青素工程菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)利用相关基因工程手段从杜氏巴氏盐藻中克隆到启动子基因序列和终止子基因序列，合成BKT基因序列、叶绿体定位肽RBS2基因序列、2A剪切肽基因序列和博来霉素-绿色荧光蛋白基因序列；

(2)将启动子基因序列、叶绿体定位肽基因序列、BKT基因序列、2A剪切肽序列基因序列和博来霉素-绿色荧光蛋白基因序列按转录方向依次连接到pCR2.1载体上，得到重组质粒；

(3)将步骤(2)得到的重组质粒转化到大肠杆菌中扩大培养，提取质粒并转化到杜氏盐藻中，获得基于杜氏盐藻代谢途径和雨生红球藻BKT的产虾青素工程菌。

步骤(2)中所述的连接优选通过In-Fusion克隆技术实现。

步骤(3)中所述的转化的方法优选为电击转化法。

上述基于杜氏盐藻代谢途径和雨生红球藻BKT的产虾青素工程菌在制备虾青素中的应用。

一种制备虾青素的方法，为将所述的基于杜氏盐藻代谢途径和雨生红球藻BKT的产虾青素工程菌置于培养基中培养10～30天，收集培养物，即得到虾青素。

所述的培养基优选为含1～2mol/L氯化钠的杜氏盐藻培养液；更优选为含1.5mol/L氯化钠的杜氏盐藻培养液

所述的杜氏盐藻培养液的配方如下：NaNO₃ 0.420g/L，NaH₂PO₄·2H₂O 0.156g/L，NaHCO₃ 0.840g/L，KCl 0.074g/L，MgSO₄·7H₂O 1.230g/L，CaCl₂·2H₂O 0.044g/L，0.1％Fe-EDTA液0.5mL/L；A5微量元素溶液1mL/L，pH 7.5；其中，Fe-EDTA液成分如下：Na₂EDTA0.189g/L，FeCl₃·6H₂O 0.244g/L；A5微量元素溶液成分如下：H₃BO₃ 2.86g/L，MnCl₂·4H₂O1.81g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.22g/L，CuSO₄·5H₂O 0.08g/L，(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 0.04g/L。

所述的培养的时间优选为20天。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明利用杜氏盐藻的内源性启动子Dbgpdhpro和终止子Dbpsyter，将雨生红球藻BKT基因通过通过酶切连接的方法构建成外源载体pCR2.1-Dbgpdhpro-RBS2-HpBKT-2A-ble-EGFP-Dbpsyter，最后将质粒通过电击法转化至杜氏盐藻中，将含有藻细胞的培养液经离心分离，超声破碎后，再用有机溶剂提取藻细胞中的类胡萝卜素，提取液用高效液相色谱法(HPLC)分离测定，从而测定杜氏盐藻中虾青素和其它色素的含量，实现杜氏盐藻由β-胡萝卜素到虾青素的转化，筛选出了产虾青素的藻株，为天然虾青素的生产开辟了一条新的途径。其中，杜氏盐藻是一种高产β-胡萝卜素的绿藻，其积累的β-胡萝卜素能够为生成虾青素提丰富的供底物。此外，杜氏盐藻能够在高盐浓度下生存，不容易染菌，杜氏盐藻不具有细胞壁，在发酵和提取虾青素的过程中具有简化工序的好处。2A肽段能够减少杜氏藻表达载体的构建难度，能够同时表达两个或者两个以上的融合蛋白。

附图说明

图1是杜氏盐藻虾青素表达载体的质粒图谱。

图2是杜氏盐藻野生型和突变株的培养结果图；其中，(a)为对照组和突变株的细胞图；(b)为对照组和突变株的藻液图。

图3是突变株的液相图谱。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为从商业途径得到的试剂和材料。

实施例中所用的杜氏盐藻(Dunaliella salina)，购自英国CultureCollectionof Algae and Protozoa藻种库，编号CCAP 19/18；

实施例1

1、杜氏盐藻培养液配制

配制不含氯化钠的盐藻培养液，培养液的成分如下：NaNO₃ 0.420g/L，NaH₂PO₄·2H₂O 0.156g/L，NaHCO₃ 0.840g/L，KCl 0.074g/L，MgSO₄·7H₂O 1.230g/L，CaCl₂·2H₂O0.044g/L，0.1％Fe-EDTA液0.5mL/L。向培养液中加入A5微量元素溶液至终浓度为1mL/L，调pH至7.5。其中，Fe-EDTA液成分如下：Na₂EDTA 0.189g/L，FeCl₃·6H₂O 0.244g/L；A5微量元素溶液成分如下：H₃BO₃ 2.86g/L，MnCl₂·4H₂O 1.81g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.22g/L，CuSO₄·5H₂O0.08g/L，(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 0.04g/L。

2、杜氏盐藻虾青素表达载体的构建

将pCR2.1载体序列、Dbgapdhpro启动子序列、RBS2序列(叶绿体定位肽)、雨生红球藻BKT基因序列、2A剪切肽序列、ble-EGFP序列(博来霉素和绿色荧光蛋白基因)以及Dbpsyter终止子(即Dbpsy terminator)序列这些序列按转录方向依次连接在一起，构建方式如图1，构建得到的杜氏盐藻虾青素表达载体的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。其中，2A序列是保证表达框雨生红球藻BKT和ble-EGFP是保证能够顺利分开表达，在细胞体内实现自剪切，行驶独立蛋白功能的作用。ble是保证通过博来霉素抗性筛选后，能够得到单克隆突变株。

ble-EGFP来自质粒pZBET(在文献“doi:10.1104/pp.114.235390”中公开)；Dbgapdhpro启动子(即Dbgapdh promoter)和Dbpsyter终止子(即Dbpsy terminator)来自杜氏巴氏藻(在专利“CN201910773769.X”中公开)；pCR2.1载体骨架购自invitrogen公司；RBS2(NCBI ID：AY530156.1)的片段序列由通用生物公司合成得到；雨生红球藻的HpBKT基因(NCBI ID：AAZ15702.1)来自雨生红球藻。克隆和构建的引物如下表：

表1克隆和构建的引物序列

构建方案为：

①pCR2.1+Dbgapdhpro(Dbgapdhpro通过TA克隆连接到pCR2.1)；

②pCR2.1+Dbgapdhpro+RBS2(Eco RV和Xho I酶切)；

③pCR2.1+Dbgapdhpro+RBS2+HpBKT(Eco RV和Xho I酶切)；

④pCR2.1+Dbgapdhpro+RBS2+HpBKT+2A-ble-EGFP(Eco RV和Xho I酶切)；

⑤pCR2.1+Dbgapdhpro+RBS2+HpBKT+2A-ble-EGFP+Dbpsyter(Eco RV和Xho I酶切)；

(1)制备线性化载体。

用所采用的限制性核酸内切酶(购自Thermo Fisher Scientific)。37℃水浴3h。酶切反应体系如下：

(2)1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物。

(3)酶切之后，采用PCR纯化试剂盒纯化线性化载体。

3、PCR扩增目的片段

(1)使用Takara的Prime STAR HS DNA Polymerase(高保真酶，购自Takara)，进行两轮PCR反应。

(2)1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

(3)用OMEGA公司的胶回收试剂盒E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit回收目的片段，纯化PCR产物。

4、In-Fusion克隆

(1)建立In-Fusion(购自Takara)克隆反应体系：

(2)50℃孵育15min，然后置于冰上。

(3)连接产物转化大肠杆菌DH5α，涂布于含有卡那酶素的平板上。在37℃生化培养箱中倒置培养12～16h。注意培养时间不宜过长，否则抗性失效，生长出卫星菌落，给筛选阳性克隆造成困难

5、质粒的提取

参照OMEGA公司的E.Z.N.A.TM Plasmid Mini Kit试剂盒的说明书，提取质粒pSDS-DbCRTISO。

(1)10000g，1min离心，收集菌体。

(2)加入250μL SolutionⅠ，涡旋十几秒，混匀。

(3)加入250μL SolutionⅡ，上下颠倒4～6次，室温放置2min。

(4)加入350μL SolutionⅢ，轻轻摇匀，10000g，10min离心。

(5)转上清至Hibind柱，10000g，1min离心。

(6)弃掉滤液，加入500μL Buffer HB，10000g，1min离心。

(7)弃掉滤液，加入700μL DNA Wash Buffer，10000g，1min离心。

(8)重复洗一次(步骤7)。

(9)10000g，空管离心2min。

(10)弃掉收集管将HiBind柱套进干净的1.5mL EP管，加入50～100μL灭菌水(60℃预热)洗脱DNA，静置1～2min后，10000g，1min离心。

6、电击转化杜氏盐藻虾青素表达载体

前期准备：

(1)对数期藻细胞：重新接种杜氏盐藻细胞，培养7天左右，杜氏盐藻生长至对数期，此时转化率最高。

(2)重组质粒：提前一天接种含重组质粒(构建方案⑤对应的重组质粒)的大肠杆菌，提取质粒，并测质粒浓度，备用。

(3)干净的电极杯。

电转化：

(1)收集处于对数生长期的杜氏盐藻细胞培养液，室温，离心2000rpm，5min，收集细胞，用新鲜培养基清洗2次。

(2)用2×HEPES缓冲液(NaCl 1mol/L，KCl 0.01mol/L，CaCl₂ 0.01mol/L，HEPES0.04mol/L，甘露醇0.4mol/L，山梨醇0.4mol/L)调整杜氏盐藻细胞浓度达到大约为1.2～2×10⁶个/mL；

(3)取400μL 2×HEPES缓冲液悬浮细胞，加入0.4cm电击杯内；

(4)加入1μg的质粒混匀后冰浴静置10～15min；

(5)采用电容25μF，电阻400Ω，电压0.8KV的电击条件转化杜氏盐藻。

(6)将电击杯置于冰浴中静置5min；

(7)将悬浮液转移至1.5mL离心管中，1000rpm离心10min；

(8)去除电击缓存液(用移液器吸取上清)，加入1mL 1.5mol/L盐度(NaCl)的杜氏盐藻培养液中；

(9)转移至试管内，暗培养12h后，转至光照培养箱中正常培养48h。

(10)博莱霉素(Zeocin)抗性培养基：在100mL含有11.7g(2.0mol/L)NaCl的盐藻培养基中加入0.75g的琼脂粉，在微波炉中4min，待冷却至60℃左右的时候加入10μL 100mg/mL的Zeocin，混匀，倒平板，培养基的Zeocin最终浓度为0.01mg/mL。

(11)在暗处恢复培养24h后的转化藻培养液，分别吸取500μL涂布于杜氏盐藻固体博莱霉素抗性培养基平板中，然后放置光照培养箱，给予14：10(光照：暗夜)的光照周期进行培养，经过约14d的光照培养，将平板上长出的单克隆藻落接种于杜氏盐藻液体博莱霉素抗性培养基中，按照常规培养至对数生长期，用于后续检测、验证。

7、挑选单克隆突变株，将已鉴定的单克隆突变株转移至含1.5mol/L氯化钠的杜氏盐藻培养液的培养基中培养20天，并观察细胞形态和培养形态，如图2所示。

8、HPLC定性分析转化子的类胡萝卜素成分

(1)将流动相用0.22μm孔径滤膜进行抽滤处理，接着超声处理60min去除液体中的气泡。

(2)将类胡萝卜素提取物以及β-胡萝卜素标准品溶液，用0.2μm孔径的聚碳酸酯滤膜进行过滤处理。

(3)调节色谱柱(C30YMC carotenoid column,5μm,250*4.6mm)温度在25℃，以1.0mL/min的流速用甲醇冲洗至平衡(约2h)。

(4)改为用流动相甲基叔丁基醚(A相)/甲醇(B相)(梯度洗脱：0min，90％A相和10％B相；10min，60％A相和40％B相；20min 50％A相和50％B相；25min，10％A相和90％B相；29.5min，90％A相和10％B相)，以1mL/min的流速进行洗柱，直至平衡。

(5)将浓度为100μg/mL的虾青素标准品存储液稀释为0.625μg/mL、1.25μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL和20μg/mL等不同浓度的工作液，用HPLC仪测定473nm波长下工作液的峰面积，根据结果绘制标准曲线。

(6)上样20μL，在波长473nm下检测40min。

细胞形态分析如图2(a)所示，从图2(a)可以看出野生型的藻细胞依然为绿色，而转化了雨生红球藻BKT基因的，其藻细胞的颜色变为金黄色了，而且藻细胞也变大了，培养形态结果如图2(b)所示，从图2(b)可以看出藻液颜色有明显差别，野生型的藻液依旧为绿色，而转化的变为红黄色了。

通过液相色谱检测，我们在9.89min检测到虾青素的液相峰，如图3所示，经过计算分析得到虾青素的产量为142.17μg/g。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南理工大学

<120> 基于杜氏盐藻代谢途径和雨生红球藻BKT的产虾青素工程菌及其构建方法与应用

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 9853

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 杜氏盐藻虾青素表达载体

<400> 1

agcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc 60

acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc 120

tcactcatta ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc ggctcgtatg ttgtgtggaa 180

ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagctatga ccatgattac gccaagcttg 240

gtaccgagct cggatccact agtaacggcc gccagtgtgc tggaattcgg cttccttgcc 300

aatgtttccc ttctgacgaa cacctaaggt aaactgcatc cttggtgtta cacccataca 360

gggctctcga aactacacca tgtgttgcag accacactgt cctcacaagt tgctggttgg 420

catggaacgt aggcatggaa agtaagacat gcccaagagg gagaaaacaa tcaggagctc 480

aagcatgtta gctctgtagg ccatccttgc actaagagtg gagcccctcc ccccaaaagg 540

agcacccctg aagggtactt tttcaccaag cggagaaccc aaagtggagc accagagacg 600

caacaaagca gcagtgacct ttacctggaa catgtttcag ggtacagaag caaaaggcct 660

ttggtcagga acatggccgt gagcctgttc ataaaagaga gggggttttg caacaaagca 720

gcagtggcta cctggaacaa aggctctggc agcagcgccc aggagagtgg gcagcagcac 780

caccttggtg agctgggcga gcagggggcc tggctgcagg ccgctgctgc tgctgccccc 840

tacagcgctg cccagcaaca ctggcagtac caggggcatg gtgaagacgc ctgcaagatg 900

cagagatggc aaataaggag tgcccctcca tgcgagcaac ggacaatttt gactaacttt 960

ttacacacgc atcacctctc acagaagctt gcttgcatgc aagcgcacac aacacacaca 1020

tacatgcacg cacacccaca cacccacaca cccacacgca caaacttgac cgagagaaca 1080

caggagttac tgttggcaca tgcacctggc actcaacaga tgggcaatac ttggactttg 1140

ttactgctgt cgtgcttgag tattcatgaa acacagtagc aagaatgcaa cgggacgggc 1200

actattccgt gtactccagt gcgtagtaga gtcatccacg cagtagggtt tactttgcaa 1260

ttatttctca cagactcttc acaaaggaaa ggcatgccta ttgagacaag atggcgtgcc 1320

cacctaaaat gttggatgcc agggtcaaca aaatggccag cgctgtgctt ccacccacag 1380

ctgcggtcat gcttatacca gaggataggg tggttggcat acagcagaag acagctgcgc 1440

ccagtgcgat ggggagagag tggtccggca gtggcagcct cagcaacaca taagcgagca 1500

ggggcgtgag cagcaaaatg gagaccagcc cgaaggtcac gcagcctgca ggctcaagaa 1560

aaatgagcag tgtcagaacg tgctcctgcc atctgtatgc agatggcacg gaccagctgg 1620

tgtgcattca tatgcactca tgagcacaga tctggggctg ccatcagcaa gaagtgcatg 1680

taagtcctac gttgaagatt ggttagctgc caagagtttg gtttagcccc ccggtttgaa 1740

ttggagcttc acctgttgac tttgccgcag ctagcgcatc gccacgcttc agtggcagcc 1800

cactgatgac gaagatggca attgtgatca agtttgaaag gcccagctca taagctctta 1860

ggccctcttg ggggcggatc acacccagca ggatgaaaga aatcaaagcg aaagggagga 1920

tctgcttgtc aatggctctc agcacagaca gcactgcttt tgctggcgac tgcatgtttg 1980

ttggaccccc agcatggtcg tgatgctgcc cttgtgagag cacgtgggtc cgctgcttgg 2040

tttctttccc tgtgcagttc ctcctggaga gaatgcccca ttgcgcggat aaccggtgtt 2100

ggtggaaact gtgcacagag catgccctgc tcaacggcac agtttgccgt atctgaagca 2160

tcccagtcta tattcccaac tgctccttca attttgcact tattgacctc atgcttgcat 2220

gccgctcaag cttcacagga agcagcagct cggggtagca cagaggattt tccaacaaat 2280

gagaaatgca aacagtgaag cgctgtagca cttgcttgca ggggcttgct tctctcatga 2340

aagttcatga caagagcgaa gtgactccca ttgagcacaa tacgatggaa aatggatcat 2400

aagaagaaat cctctttgag taagtttgag tgcagacact tcggagcggt tggaacggac 2460

aaactcaagg agttttgatc ctactcacgc cgctcataaa tttttacgtt gtttcaattg 2520

tgaggtgtat ttgaacagtc ttggcagcag aacagtgagc ccgggatggc ctctctcatt 2580

gcaaagtccg cctccgtggc ccctgttgcc agccgcacct ccaccaaggt gcaggcctct 2640

ttgaagcctg ccgtgcgcgc cgtgcccaag gcccaggctc ccgctgtgcg cgccaaccag 2700

atgatggtgt ggcagcccat caacaacaag cagttcgaga ccttctccta cctgcccccc 2760

ctgatgcagc tagcagcgac agtaatgttg gagcagctta ccggaagcgc tgaggcactc 2820

aaggagaagg agaaggaggt tgcaggcagc tctgacgtgt tgcgtacatg ggcgacccag 2880

tactcgcttc cgtcagaaga gtcagacgcg gcccgcccgg gactgaagaa tgcctacaag 2940

ccaccacctt ccgacacaaa gggcatcacg atggcgctag ctgtcatcgg ctcctgggcc 3000

gcagtgttcc tccacgccat ttttcaaatc aagcttccga cctccttgga ccagctgcac 3060

tggctgcccg tgtcagatgc cacagctcag ttggttggcg gcagcagcag tctgatgcac 3120

atcgtcgtag tattctttgt cctggagttc ctgtacacag gcctttttat caccacgcat 3180

gatgctatgc atggcaccat cgccatgaga aacaggcagc ttaatgactt cttgggcaga 3240

gtatgcatct ccttgtacgc ctggtttgat tacaacatgc tgcaccgcaa gcattgggag 3300

caccacaatc acactggtga ggtgggcaag gaccctgact tccacagggg aaaccccggc 3360

attgtgccct ggtttgccag cttcatgtcc agctacatgt cgatgtggca gtttgcgcgc 3420

ctcgcatggt ggacggtggt catgcagctg ctgggtgcgc cgatggcgaa cctgctggtg 3480

ttcatggcgg ctgcgcccat cctgtctgcc ttccgcttgt tctactttgg cacgtacatg 3540

ccccacaagc ctgagcctag cgctgcgtca ggctccccac cagtcgtcat gaactggtgg 3600

aagtcgcgca ctagccaggc gtccgacctg gtcagctttc tgacctgcta ccacttcgat 3660

ctgcactggg agcaccaccg ctggcccttc gccccctggt gggagctgcc caactgccgc 3720

cgtctgtctg gccgaggtct ggttcctgcc tctagaggag cttgtcaatt gttgaatttt 3780

gatttgttga agttggctgg agatgttgaa tctaatcctg gacctatgag cccagaacga 3840

cgcccggccg acatccgccg tgccaccgag gcggacatgc cggcggtctg caccatcgtc 3900

aaccactaca tcgagacaag cacggtcaac ttccgtaccg agccgcagga accgcaggag 3960

tggacggacg acctcgtccg tctgcgggag cgctatccct ggctcgtcgc cgaggtggac 4020

ggcgaggtcg ccggcatcgc ctacgcgggc ccctggaagg cacgcaacgc ctacgactgg 4080

acggccgagt cgaccgtgta cgtctccccc cgccaccagc ggacgggact gggctccacg 4140

ctctacaccc acctgctgaa gtccctggag gcacagggct tcaagagcgt ggtcgctgtc 4200

atcgggctgc ccaacgaccc gagcgtgcgc atgcacgagg cgctcggata tgccccccgc 4260

ggcatgctgc gggcggccgg cttcaagcac gggaactggc atgacgtggg tttctggcag 4320

ctggacttca gcctgccggt accgccccgt ccggtcctgc ccgtcaccga gattggaggt 4380

ggaggttcgg gaggtggagg ttcgatggtg agcaagggcg aggagctgtt caccggggtg 4440

gtgcccatcc tggtcgagct ggacggcgac gtaaacggcc acaagttcag cgtgtccggc 4500

gagggcgagg gcgatgccac ctacggcaag ctgaccctga agttcatctg caccaccggc 4560

aagctgcccg tgccctggcc caccctcgtg accaccctga cctacggcgt gcagtgcttc 4620

agccgctacc ccgaccacat gaagcagcac gacttcttca agtccgccat gcccgaaggc 4680

tacgtccagg agcgcaccat cttcttcaag gacgacggca actacaagac ccgcgccgag 4740

gtgaagttcg agggcgacac cctggtgaac cgcatcgagc tgaagggcat cgacttcaag 4800

gaggacggca acatcctggg gcacaagctg gagtacaact acaacagcca caacgtctat 4860

atcatggccg acaagcagaa gaacggcatc aaggtgaact tcaagatccg ccacaacatc 4920

gaggacggca gcgtgcagct cgccgaccac taccagcaga acacccccat cggcgacggc 4980

cccgtgctgc tgcccgacaa ccactacctg agcacccagt ccgccctgag caaagacccc 5040

aacgagaagc gcgatcacat ggtcctgctg gagttcgtga ccgccgccgg gatcactctc 5100

ggcatggacg agctgtacaa gtaatacgta gcacagcctc tgtatggttg cagccgctgg 5160

ttgtgctgta gcccgtgcgc ccacatgggt gctgggcgag cagggtttca gtgttgctgg 5220

ctgactgaca tgcaagtgct caggaactga gtgcaggctg tgggcgcccg cgaccaagct 5280

atgtaacact agattactgg tttgcaagac tgccaagtag aactgcatgc tcagaaatat 5340

gtcgcaaggg gtggtgtgtg tgctggacac gccacgcgca cctccagtgc agctctctgc 5400

cctgatgttt tttggtaagt ggtatatctt gaccttttgg ctccttgccg cttgcattgc 5460

ccatcccaca tgcattctgc atacagtcca gcagacatgc atggcgggct cctgttgggg 5520

tgccaagcac accatgtgat ttgtgagtga gagagctttc aaatccggca ctcatgggaa 5580

tgttgagtgt gtgaatgcga tgcccctgct tgaggtgtcc ttgcttaccg tacttctccc 5640

ttctttctcg gactcccgag gagtgcttag cccaacgttg gcagcgtatt ccttgtcgca 5700

tcttcttcac gcctgaatgt atttgcgctg tggtttgtat gcatatatag gacagggtca 5760

tctgatatga tctgctcttt gagcggcttc tgtgcggggg catgaaggac aagagtgctg 5820

agggactctg gctggtgctc tgtttgcgtc ccccttagag tcgctcacct cctcaatacc 5880

ttattttgct gtcttcaagc cacttcgact tgaaacccca ctatgacgag caatcccttg 5940

tatagtgcct tgcaaggctt caactcatag ctttttgttt attcatttaa gcaggcttga 6000

atttttttgt cataattgtt ttgcatgccc gatttctttc cgtggcatgc ttgttttttc 6060

ctctcaaggc tttgcgctta gcttgcactt gatgtaagac ttgctttcgt gcatctgtca 6120

tgggatggca cttccccgca ttgtacggca cataaaatgc tcaggaaagg ttacaggtta 6180

catgtgttgt gtttggatat acagtgtgta gtgatacaag aagaaaggca gggatatcca 6240

tcacactggc ggccgctcga gcatgcatct agagggccca attcgcccta tagtgagtcg 6300

tattacaatt cactggccgt cgttttacaa cgtcgtgact gggaaaaccc tggcgttacc 6360

caacttaatc gccttgcagc acatccccct ttcgccagct ggcgtaatag cgaagaggcc 6420

cgcaccgatc gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg gcgaatggac gcgccctgta 6480

gcggcgcatt aagcgcggcg ggtgtggtgg ttacgcgcag cgtgaccgct acacttgcca 6540

gcgccctagc gcccgctcct ttcgctttct tcccttcctt tctcgccacg ttcgccggct 6600

ttccccgtca agctctaaat cgggggctcc ctttagggtt ccgatttagt gctttacggc 6660

acctcgaccc caaaaaactt gattagggtg atggttcacg tagtgggcca tcgccctgat 6720

agacggtttt tcgccctttg acgttggagt ccacgttctt taatagtgga ctcttgttcc 6780

aaactggaac aacactcaac cctatctcgg tctattcttt tgatttataa gggattttgc 6840

cgatttcggc ctattggtta aaaaatgagc tgatttaaca aaaatttaac gcgaatttta 6900

acaaaattca gggcgcaagg gctgctaaag gaagcggaac acgtagaaag ccagtccgca 6960

gaaacggtgc tgaccccgga tgaatgtcag ctactgggct atctggacaa gggaaaacgc 7020

aagcgcaaag agaaagcagg tagcttgcag tgggcttaca tggcgatagc tagactgggc 7080

ggttttatgg acagcaagcg aaccggaatt gccagctggg gcgccctctg gtaaggttgg 7140

gaagccctgc aaagtaaact ggatggcttt cttgccgcca aggatctgat ggcgcagggg 7200

atcaagatct gatcaagaga caggatgagg atcgtttcgc atgattgaac aagatggatt 7260

gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc ggctatgact gggcacaaca 7320

gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca gcgcaggggc gcccggttct 7380

ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg caggacgagg cagcgcggct 7440

atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg ctcgacgttg tcactgaagc 7500

gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag gatctcctgt catcccacct 7560

tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg cggcggctgc atacgcttga 7620

tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc atcgagcgag cacgtactcg 7680

gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa gagcatcagg ggctcgcgcc 7740

agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgcg catgcccgac ggcgaggatc tcgtcgtgac 7800

ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat ggccgctttt ctggattcat 7860

cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac atagcgttgg ctacccgtga 7920

tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc ctcgtgcttt acggtatcgc 7980

cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt gacgagttct tctgaattga 8040

aaaaggaaga gtatgagtat tcaacatttc cgtgtcgccc ttattccctt ttttgcggca 8100

ttttgccttc ctgtttttgc tcacccagaa acgctggtga aagtaaaaga tgctgaagat 8160

cagttgggtg cacgagtggg ttacatcgaa ctggatctca acagcggtaa gatccttgag 8220

agttttcgcc ccgaagaacg ttttccaatg atgagcactt ttaaagttct gctatgtggc 8280

gcggtattat cccgtattga cgccgggcaa gagcaactcg gtcgccgcat acactattct 8340

cagaatgact tggttgagta ctcaccagtc acagaaaagc atcttacgga tggcatgaca 8400

gtaagagaat tatgcagtgc tgccataacc atgagtgata acactgcggc caacttactt 8460

ctgacaacga tcggaggacc gaaggagcta accgcttttt tgcacaacat gggggatcat 8520

gtaactcgcc ttgatcgttg ggaaccggag ctgaatgaag ccataccaaa cgacgagcgt 8580

gacaccacga tgcctgtagc aatggcaaca acgttgcgca aactattaac tggcgaacta 8640

cttactctag cttcccggca acaattaata gactggatgg aggcggataa agttgcagga 8700

ccacttctgc gctcggccct tccggctggc tggtttattg ctgataaatc tggagccggt 8760

gagcgtgggt ctcgcggtat cattgcagca ctggggccag atggtaagcc ctcccgtatc 8820

gtagttatct acacgacggg gagtcaggca actatggatg aacgaaatag acagatcgct 8880

gagataggtg cctcactgat taagcattgg taactgtcag accaagttta ctcatatata 8940

ctttagattg atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa gatccttttt 9000

gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc 9060

gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg 9120

caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact 9180

ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt tcttctagtg 9240

tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg 9300

ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac 9360

tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca 9420

cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga 9480

gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc 9540

ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct 9600

gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg 9660

agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct 9720

tttgctcaca tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc 9780

tttgagtgag ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc 9840

gaggaagcgg aag 9853

<210> 2

<211> 329

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> BKT氨基酸序列

<400> 2

Met Gln Leu Ala Ala Thr Val Met Leu Glu Gln Leu Thr Gly Ser Ala

1 5 10 15

Glu Ala Leu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Val Ala Gly Ser Ser Asp Val

20 25 30

Leu Arg Thr Trp Ala Thr Gln Tyr Ser Leu Pro Ser Glu Glu Ser Asp

35 40 45

Ala Ala Arg Pro Gly Leu Lys Asn Ala Tyr Lys Pro Pro Pro Ser Asp

50 55 60

Thr Lys Gly Ile Thr Met Ala Leu Ala Val Ile Gly Ser Trp Ala Ala

65 70 75 80

Val Phe Leu His Ala Ile Phe Gln Ile Lys Leu Pro Thr Ser Leu Asp

85 90 95

Gln Leu His Trp Leu Pro Val Ser Asp Ala Thr Ala Gln Leu Val Gly

100 105 110

Gly Ser Ser Ser Leu Met His Ile Val Val Val Phe Phe Val Leu Glu

115 120 125

Phe Leu Tyr Thr Gly Leu Phe Ile Thr Thr His Asp Ala Met His Gly

130 135 140

Thr Ile Ala Met Arg Asn Arg Gln Leu Asn Asp Phe Leu Gly Arg Val

145 150 155 160

Cys Ile Ser Leu Tyr Ala Trp Phe Asp Tyr Asn Met Leu His Arg Lys

165 170 175

His Trp Glu His His Asn His Thr Gly Glu Val Gly Lys Asp Pro Asp

180 185 190

Phe His Arg Gly Asn Pro Gly Ile Val Pro Trp Phe Ala Ser Phe Met

195 200 205

Ser Ser Tyr Met Ser Met Trp Gln Phe Ala Arg Leu Ala Trp Trp Thr

210 215 220

Val Val Met Gln Leu Leu Gly Ala Pro Met Ala Asn Leu Leu Val Phe

225 230 235 240

Met Ala Ala Ala Pro Ile Leu Ser Ala Phe Arg Leu Phe Tyr Phe Gly

245 250 255

Thr Tyr Met Pro His Lys Pro Glu Pro Ser Ala Ala Ser Gly Ser Pro

260 265 270

Pro Val Val Met Asn Trp Trp Lys Ser Arg Thr Ser Gln Ala Ser Asp

275 280 285

Leu Val Ser Phe Leu Thr Cys Tyr His Phe Asp Leu His Trp Glu His

290 295 300

His Arg Trp Pro Phe Ala Pro Trp Trp Glu Leu Pro Asn Cys Arg Arg

305 310 315 320

Leu Ser Gly Arg Gly Leu Val Pro Ala

325

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Dbgapdhpro-F

<400> 3

ccttgccaat gtttcccttc 20

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Dbgapdhpro-R

<400> 4

ctcactgttc tgctgccaag ac 22

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Dbpsyter-F

<400> 5

gcacagcctc tgtatggttg 20

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Dbpsyter-R

<400> 6

cctgcctttc ttcttgtatc act 23

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> HpBKT-F

<400> 7

atgcagctag cagcgacag 19

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> HpBKT-R

<400> 8

ctaggcagga accagacct 19

<210> 9

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> RBS2-F

<400> 9

gtcttggcag cagaacagtg agcccgggat ggcctctctc at 42

<210> 10

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> RBS2-R

<400> 10

tctagatgca tgctcgagcg gccgccagtg tgatggatat ccaggggggg caggtag 57

<210> 11

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Hp-F

<400> 11

ctcctacctg ccccccctga tgcagctagc agcgacagta 40

<210> 12

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Hp-R

<400> 12

tctagatgca tgctcgagcg gccgccagtg tgatggatat cggcaggaac cagacctcgg 60

<210> 13

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 2be-F

<400> 13

ccgaggtctg gttcctgcct ctagaggagc ttgtcaattg 40

<210> 14

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 2be-R

<400> 14

ctctagatgc atgctcgagc ggccgccagt gtgatggata tcttacttgt acagctcgtc 60

catgc 65

<210> 15

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Db-F

<400> 15

tcggcatgga cgagctgtac aagtaatacg tagcacagcc tctgtatggt tgcag 55

<210> 16

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Db-R

<400> 16

tgcatgctcg agcggccgcc agtgtgatgg atatccctgc ctttcttctt gtatcact 58

Claims

1.一种基于杜氏盐藻代谢途径和雨生红球藻BKT的产虾青素工程菌的构建方法，其特征在于：将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的重组质粒转化到大肠杆菌中扩大培养，提取质粒并转化到杜氏盐藻中，获得基于杜氏盐藻代谢途径和雨生红球藻BKT的产虾青素工程菌；其中：

所述的重组质粒是以pCR2.1为骨架载体，将杜氏巴氏藻内源性的启动子基因序列、叶绿体定位肽RBS2基因序列、BKT基因序列、2A剪切肽基因序列、博来霉素和绿色荧光蛋白基因序列，以及杜氏巴氏藻内源性的终止子基因序列按转录方向依次连接在一起得到。

2.一种基于杜氏盐藻代谢途径和雨生红球藻BKT的产虾青素工程菌，其特征在于：通过权利要求1中所述的制备方法制备得到。

3.权利要求2中所述的基于杜氏盐藻代谢途径和雨生红球藻BKT的产虾青素工程菌在制备虾青素中的应用。

4.一种制备虾青素的方法，其特征在于：将权利要求2中所述的基于杜氏盐藻代谢途径和雨生红球藻BKT的产虾青素工程菌置于培养基中培养10～30天，收集培养物，即得到虾青素。