CN113502235B - 一种强化表达内质网大小调节因子的酿酒酵母菌株的构建和应用 - Google Patents

一种强化表达内质网大小调节因子的酿酒酵母菌株的构建和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种强化表达内质网大小调节因子的酿酒酵母菌株的构建和应用，属于代谢工程技术领域。本发明以酿酒酵母BY4741为出发菌株，强化MVA代谢途径中的关键基因tHMG1(3‑羟基‑3‑甲基戊二酰辅酶A还原酶)、IDI(异戊烯基焦磷酸异构酶)以及ERG20(法尼基焦磷酸合酶)以提高角鲨烯前体代谢物产量，敲除ROX1基因以促进菌体生长，发酵生产角鲨烯产量为1.44g/L。进一步强化内质网大小调节因子相关基因INO2、SCS22、TCB2和IST2以扩大内质网表面积增强细胞蛋白质合成能力，发酵产量达到2.06g/L，提高了43.1％。

Description

一种强化表达内质网大小调节因子的酿酒酵母菌株的构建和应用
技术领域
本发明涉及一种强化表达内质网大小调节因子的酿酒酵母菌株的构建和应用，属于代谢工程技术领域。
背景技术
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作为模式工业微生物，是一种GRAS(Generally regarded as safe)菌株。不同于原核微生物，真核微生物酿酒酵母多种不同的亚细胞器为不同酶行使正确功能提供了特定的生理化学环境。其中，内质网(Endoplasmic reticulum,ER)是真核细胞中最为重要的细胞器之一，是蛋白质、脂质和糖类的合成场所，并且内质网的体积是蛋白质折叠能力的关键决定因素之一。并且，酿酒酵母可以通过甲羟戊酸途径(Mevalonate pathway,MVA)途径为类异戊二烯生物合成提供重组的前体物质，因此是通过微生物发酵法生产萜类物质的常用宿主之一。通过对酿酒酵母的内质网进行改造，强化内质网相关基因以扩大内质网表面积，可以使得酿酒酵母的内质网保证蛋白质的正确折叠且有更多空间容纳更多蛋白质。
发明内容
本发明提供了一种强化内质网的酿酒酵母菌株的构建方法，并且以发酵法生产角鲨烯为例，验证强化内质网后的应用效果。
本发明提供了一种重组酿酒酵母菌株，所述重组酿酒酵母强化表达了3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶tHMG1、异戊烯基焦磷酸异构酶IDI和法尼基焦磷酸合酶ERG20，敲除了ROX1基因，并且强化表达了内质网大小调节因子的相关基因INO2、SCS22、TCB2和IST2。
在本发明的一种实施方式中，所述重组酿酒酵母通过PGPD启动子强化表达tHMG1，通过PPGK1启动子强化表达INO2和IST2，通过PTEF1启动子强化表达ERG20，IDI，TCB2，通过PGAP启动子强化SCS22。
在本发明的一种实施方式中，以酿酒酵母BY4741为出发菌株。
在本发明的一种实施方式中，所述tHMG1的Gene ID为42650、所述IDI的Gene ID为855986、所述ERG20的Gene ID为853272、所述INO2的Gene ID为851701、所述ROX1的Gene ID为856178、所述SCS22的Gene ID为852186、所述TCB2的Gene ID为855637、所述IST2的GeneID为852382。
在本发明的一种实施方式中，所述强化表达，是指在酿酒酵母BY4741基因组上强化表达了2个拷贝数的tHMG1、1个拷贝数的IDI、1个拷贝数的ERG20，并且强化表达了1个拷贝数的INO2、1个拷贝数的SCS22、1个拷贝数的TCB2和1个拷贝数的IST2。
本发明还提供了一种制备角鲨烯的方法，所述方法为，采用上述强化内质网的酿酒酵母发酵制备得到。
在本发明的一种实施方式中，所述方法为，将重组酿酒酵母接种至种子培养基活化后，制备得到种子液，将种子液接种至发酵培养基中，发酵培养，制备得到角鲨烯。
在本发明的一种实施方式中，将重组酿酒酵母在28～32℃下在种子培养基中活化，得到种子液，将种子液以1-5％的接种量接入发酵培养基中，在28～32℃下发酵培养。
在本发明的一种实施方式中，所述种子培养基为YPD培养基。
在本发明的一种实施方式中，将所述的酵母菌种子液在YPD培养基中，于28～32℃，220～280rpm条件下培养15～24h，得到种子液。
在本发明的一种实施方式中，将制备得到的种子液以1-5％(v/v)的接种量接入发酵培养基中，在28～32℃下发酵培养72-96h。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基为大豆蛋白胨培养基，所述大豆蛋白胨培养基包括以下组分：30～60g/L大豆蛋白胨、10～30g/L蔗糖、10～30g/L葡萄糖、10-30g/L甘油。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基为大豆蛋白胨培养基，所述大豆蛋白胨培养基包括以下组分：45～55g/L大豆蛋白胨、15～25g/L蔗糖、15～25g/L葡萄糖、15-25g/L甘油
本发明还提供了上述重组酿酒酵母，或上述方法在制备含有角鲨烯产品中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述产品为食品或化学品。
有益效果
本发明以酿酒酵母BY4741为出发菌株，强化MVA代谢途径中的关键基因tHMG1(3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶)、IDI(异戊烯基焦磷酸异构酶)以及ERG20(法尼基焦磷酸合酶)以提高角鲨烯前体代谢物产量，敲除ROX1基因以促进菌体生长，发酵生产角鲨烯产量为1.44g/L。进一步强化内质网大小调节因子相关基因INO2、SCS22、TCB2和IST2以扩大内质网表面积增强细胞蛋白质合成能力，发酵产量达到2.06g/L，提高了43.1％。
具体实施方式
下述实施例中所涉及的BY4741菌株购自北京华越洋生物。
下述实施例中所涉及的培养基如下：
SD HIS平板：YNB培养基1.7g/L，葡萄糖20g/L，L-亮氨酸0.1g/L，L-色氨酸0.1g/L，尿嘧啶0.1g/L，琼脂粉20g/L。
SD Ura平板：YNB培养基1.7g/L，葡萄糖20g/L，L-亮氨酸0.1g/L，L-色氨酸0.1g/L，L-组氨酸0.1g/L，琼脂粉20g/L。
YPD固体平板：1％酵母粉，2％蛋白胨，2％葡萄糖，1.5％琼脂粉。
下述实施例中所涉及的检测方法如下：
角鲨烯产量的测定：
使用Agilent 1260进行高效液相色谱检测，色谱柱为C18 ODS(5μm,250×4.6mm,Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)。流动相：纯乙腈，流速0.6mL/min，柱温40℃，波长为195nm，进样体积为10μL。
实施例1：构建酿酒酵母菌株Y1
具体步骤如下：
(1)人工合成基因片段PGPD-tHMG1-TADH1(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)；
以酿酒酵母BY4741基因组为模板，采用表1所述的引物序列，用引物ROX1-UP-F、ROX1-UP-R扩增得到基因片段ROX1-UP；
用引物ROX1-DOWN-F、ROX1-DOWN-R扩增得到基因片段ROX1-DOWN；
以质粒pMHyLp-HIS(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)为模板，采用引物ROX1-loxH-F、ROX1-loxH-R扩增得到ROX1-His片段。
(2)将步骤(1)中的四个片段PGPD-tHMG1-TADH1、ROX1-UP、ROX1-DOWN、ROX1-His采用PCR进行融合PCR，跑胶得到的正确条带进行切胶回收后得到融合基因片段ΔROX1-PGPD-tHMG1-TADH1。
(3)将步骤(2)中的融合基因片段转化入酿酒酵母BY4741菌株感受态中，在SD HIS平板上于30℃培养2-3天，使用表1所述的引物YZ-tHMG1-F、YZ-tHMG1-R进行单菌落PCR验证。挑选条带正确的单菌落，得到菌株BY4741ΔROX1-PGPD-tHMG1-TADH1-HIS。
(4)将步骤(3)得到的菌株制备成感受态，转化入PY26-Cre(核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示)质粒，在SD Ura平板上于30℃培养2-3天，取单菌落接入YPD培养基内培养15-24h，划线于含有5-FOA的YPD平板上，于30℃培养2-3天。将长出的单菌落分别在SD Ura、SDHis、YPD固体平板上进行点板验证，仅在YPD培养基上生长的单菌落为正确的酿酒酵母菌株BY4741ΔROX1-PGPD-tHMG1-TADH1，命名为酿酒酵母Y1。
表1：引物序列：
Figure BDA0003148362050000031
Figure BDA0003148362050000041
实施例2：构建酿酒酵母菌株Y2
(1)人工合成基因片段PTEF1-IDI-TCYC1(核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)；
以酿酒酵母BY4741基因组为模板，采用如表2所示的引物序列，用引物911b-UP-F、911b-UP-R扩增得到基因片段911b-UP；
用引物911b-DOWN-F、911b-DOWN-R扩增得到基因片段911b-DOWN；
以质粒pMHyLp-HIS为模板，采用引物IDI-loxH-F、IDI-loxH-R扩增得到INO2-His片段。
(2)将步骤(1)中的四个片段PTEF1-IDI-TCYC1、911b-UP、911b-DOWN、IDI-His采用PCR进行融合PCR，跑胶得到的正确条带进行切胶回收后得到融合基因片段911b-PTEF1-IDI-TCYC1。
(3)将步骤(2)中的基因片段转化入实施例1制备得到的Y1菌株感受态中，在SDHIS平板上于30℃培养2-3天，使用引物YZ-IDI-F、YZ-IDI-R进行单菌落PCR验证。挑选条带正确的单菌落，得到菌株Y1-911b-PTEF1-IDI-TCYC1-HIS。
(4)将步骤(3)得到的菌株制备成感受态，转化入PY26-Cre质粒，在SD Ura平板上于30℃培养2-3天，取单菌落接入YPD培养基内培养15-24h，划线于含有5-FOA的YPD平板上，于30℃培养2-3天。将长出的单菌落分别在SD Ura、SD His、YPD固体平板上进行点板验证，仅在YPD培养基上生长的单菌落为正确的酿酒酵母菌株BY4741ΔROX1-PGPD-tHMG1-TADH1-911b-PTEF1-IDI-TCYC1，命名为酿酒酵母Y2。
表2：引物序列
911b-DOWN-F cgtaatcatggtcatagctgtttcctggatgagggtgaagggaaacag
911b-DOWN-R ccaacaatatgggtacgagaga
911b-UP-F tctctgctggtcggtacttaa
911b-UP-R gctcgaaggctttaatttgcggcctctgtcaccaagaaatgtcctt
IDI-loxH-F agtaaaaaaggagtagaaacattttgaagctattaaaacgacggccagtgcca
IDI-loxH-R ctgtttcccttcaccctcatccaggaaacagctatgaccatgattacg
YZ-IDI-F caattttcattgcagcactgaccaag
YZ-IDI-R aacaaatttccccagttttctctacagatgt
实施例3：构建酿酒酵母菌株Y3
具体步骤如下：
(1)人工合成基因片段PGPD-tHMG1-TADH1-PTEF1-ERG20-TCYC1(核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示)；
以酿酒酵母BY4741基因组为模板，采用表3所述的引物序列，用引物ERG20-UP-F、ERG20-UP-R扩增得到基因片段ERG20-UP；
用引物ERG20-DOWN-F、ERG20-DOWN-R扩增得到基因片段ERG20-DOWN；
以质粒pMHyLp-HIS为模板，采用引物ERG20-loxH-F、ERG20-loxH-R扩增得到ERG20-His片段。
(2)将步骤(1)中的四个片段PGPD-tHMG1-TADH1-PTEF1-ERG20-TCYC1-PPGK、ERG20-UP、ERG20-DOWN、ERG20-His采用PCR进行融合PCR，跑胶得到的正确条带进行切胶回收后得到融合基因片段PGPD-tHMG1-TADH1-PTEF1-ERG20-TCYC1；
(3)将步骤(2)中得到的融合基因片段转化入实施例2制备得到的Y2菌株的感受态中，在SD HIS平板上于30℃培养2-3天，使用引物YZ-ERG20-F、YZ-ERG20-R进行单菌落PCR验证；挑选条带正确的单菌落，得到菌株Y2-PGPD-tHMG1-TADH1-PTEF1-ERG20-TCYC1-HIS。
(4)将步骤(3)得到的菌株制备成感受态，转化入PY26-Cre质粒，在SD Ura平板上于30℃培养2-3天，取单菌落接入YPD培养基内培养15-24h，划线于含有5-氟乳清酸的YPD平板上，于30℃培养2-3天。将长出的单菌落分别在SD Ura、SD His、YPD固体平板上进行点板验证，仅在YPD培养基上生长的单菌落为正确的酿酒酵母菌株BY4741ΔROX1-PGPD-tHMG1-TADH1-911b-PTEF1-IDI-TCYC1-PGPD-tHMG1-TADH1-PTEF1-ERG20-TCYC1，命名为酿酒酵母Y3。
表3：引物序列
ERG20-DOWN-F cgtaatcatggtcatagctgtttcctgccactcacgttcgatccatt
ERG20-DOWN-R accaaatcaagtagcaaagagc
ERG20-loxH-F ttctttgaaatggcgagtattgataatgataaaacgacggccagtgcca
ERG20-loxH-R aatggatcgaacgtgagtggcaggaaacagctatgaccatgattacg
ERG20-UP-F tctacgctacactctggaaaga
ERG20-UP-R ggaagtaattatctactttttacaacaaatataaaacaatgcaacaagcaactgggaacg
YZ-ERG20-F ggaattatgccgagctcgtgt
YZ-ERG20-R tttatgttctacatcttttggccaccattcc
实施例4：构建酿酒酵母菌株Y4
具体步骤如下：
(1)人工合成基因片段PPGK1-INO2-TINO2(核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)；
以酿酒酵母BY4741基因组为模板，采用表4所述的引物序列，用引物INO2-UP-F、INO2-UP-R扩增得到基因片段INO2-UP；
用引物INO2-DOWN-F、INO2-DOWN-R扩增得到基因片段INO2-DOWN；
以质粒pMHyLp-HIS为模板，采用引物INO2-loxH-F、INO2-loxH-R扩增得到INO2-His片段。
(2)将步骤(1)中的四个片段PPGK1-INO2-TINO2、INO2-UP、INO2-DOWN、INO2-His采用PCR进行融合PCR，跑胶得到的正确条带进行切胶回收后得到融合基因片段UP-PPGK1-INO2-TINO2-Down；
(3)将步骤(2)中得到的融合基因片段转化入实施例3制备得到的Y3菌株的感受态中，在SD HIS平板上于30℃培养2-3天，使用引物YZ-INO2-F、YZ-INO2-R进行单菌落PCR验证；挑选条带正确的单菌落，得到菌株Y3-PPGK1-INO2-TINO2-HIS。
(4)将步骤(3)得到的菌株制备成感受态，转化入PY26-Cre质粒，在SD Ura平板上于30℃培养2-3天，取单菌落接入YPD培养基内培养15-24h，划线于含有5-氟乳清酸的YPD平板上，于30℃培养2-3天。将长出的单菌落分别在SD Ura、SD His、YPD固体平板上进行点板验证，仅在YPD培养基上生长的单菌落为正确的酿酒酵母菌株BY4741ΔROX1-PGPD-tHMG1-TADH1-911b-PTEF1-IDI-TCYC1-PGPD-tHMG1-TADH1-PTEF1-ERG20-TCYC1-PPGK1-INO2-TINO2，命名为酿酒酵母Y4。
表4：引物序列
INO2-DOWN-F aattatctactttttacaacaaatataaaacaatgcaacaagcaactgggaacgaatta
INO2-DOWN-R tcaggaatcatccagtatgtgctgtagtg
INO2-loxH-F ataaaggattcgcgcccaaatcgtaaaacgacggccagtgcca
INO2-loxH-R tcgaaggctttaatttgcggcccaggaaacagctatgaccatgattacg
INO2-UP-F atggcttcagaaaaagaaattaggagagag
INO2-UP-R cgtaatcatggtcatagctgtttcctgggccgcaaattaaagccttcga
YZ-INO2-F aaatttctcaggtcgatgagtctcgtg
YZ-INO2-R ggagcatgatgagtttggttatcgg
实施例5：构建酿酒酵母菌株Y5～Y6
在实施例4的基础上，将SCS22、TCB2、IST2进行过表达，得到酿酒酵母菌株Y5；
具体步骤如下：
(1)具体实施例方式同实施例4，区别在于，人工合成基因片段PGAP-SCS22-TADH1-PTEF1-TCB2-TCYC1(核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示)；以酿酒酵母BY4741基因组为模板，采用表5的引物，分别扩增得到基因片段208a-UP，208a-DOWN；以质粒pMHyLp-HIS为模板，采用表5的引物扩增得到208a-His片段；将上述片段融合后得到208a-SCS22-TCB2片段，并转化如Y4感受态中，得到菌株Y4-208a-PGAP-SCS22-TADH1-PTEF1-TCB2-TCYC1-His，并将上述菌株去除His片段，将得到的菌株命名为酿酒酵母Y5；
(2)具体实施例方式同实施例4，区别在于，人工合成基因片段PPGK1-IST2-TTDH3(核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示)；以酿酒酵母BY4741基因组为模板，采用表6的引物分别扩增得到基因片段YPR-UP，YPR-DOWN；以质粒pMHyLp-HIS为模板，采用表6的引物扩增得到YPR-His片段；将上述片段融合后得到YPR-PPGK1-IST2-TTDH3片段，并转化入Y5感受态中，得到菌株Y5-YPR-PPGK1-IST2-TTDH3-His(BY4741ΔROX1-PGPD-tHMG1-TADH1-911b-PTEF1-IDI-TCYC1-PGPD-tHMG1-TADH1-PTEF1-ERG20-TCYC1-PPGK1-INO2-TINO2-208a-PGAP-SCS22-TADH1-PTEF1-TCB2-TCYC1-YPR-PPGK1-IST2-TTDH3-His)，并将上述菌株去除His片段，将得到的菌株命名为酿酒酵母Y6。
表5：引物序列
208a-DOWN-F gaaggctttaatttgcggccacggcaatgacaaaaactgaatatcttgat
208a-DOWN-R ttactttacatgttatcggaggcctg
208a-loxH-F tttctctgatttttttttcaatgagtgcacaggaaacagctatgaccatgatta
208a-loxH-R cgtattctttgaaatggcagtattgataatgataaaacgacggccagtgccaa
208a-UP-F ctgttaccaaatactcctcctctactc
208a-UP-R aatcatggtcatagctgtttcctgtgcactcattgaaaaaaaaatcagagaaag
YZ-208a-F gcagcttaccaaaacgtggagga
YZ-208a-R tgtggttagcatcacgataaggacgg
表6：引物序列
YPR-DOWN-F ccgctgtatagctcatatctttcccttgcgtccattcatctgacccaata
YPR-DOWN-R gcatactcactatcgtaaactgtcct
YPR-loxH-F tatgagttgttagagctgttacaagtgtggaattgtgagcggataacaatttcaca
YPR-loxH-R ttatgcagatgttataatatctgtgcgtatgcgtaaggagaaaataccgcatc
YPR-UP-F aatgtcatctattcggtagcactca
YPR-UP-R attgttatccgctcacaattccacacttgtaacagctctaacaactcatacc
YZ-YPR-F actgacggttggtctatggaactc
YZ-YPR-R actattaatcccaccatagaaatttgtataggaaagtagt
实施例6：Y1～Y6酿酒酵母菌株发酵制备角鲨烯
具体步骤如下：
(1)制备种子液
在5mL YPD培养基中挑取酿酒酵母菌株Y1～Y6，于28～32℃，220～280rpm条件下培养15～24h。按1％～5％(v/v)的接种量转接至含有20～40mL大豆蛋白胨培养基的250mL圆底烧瓶中，于28～32℃，220～280rpm条件下培养72～96h，制备得到种子液。
大豆蛋白胨培养基：45～55g/L大豆蛋白胨、15～25g/L蔗糖、15～25g/L葡萄糖、15-25g/L甘油。
(2)发酵培养
将步骤(1)制备得到的种子液按4％(v/v)的接种量转接至含有20～40mL大豆蛋白胨培养基的250mL圆底烧瓶中，于28～32℃，220～280rpm条件下培养96h。
大豆蛋白胨培养基：45～55g/L大豆蛋白胨、15～25g/L蔗糖、15～25g/L葡萄糖、15-25g/L甘油。
取发酵液1mL，加入1mL乙酸乙酯和0.5g玻璃珠进行研磨破碎，于12000rpm离心10min后，取上层乙酸乙酯进行角鲨烯产量的测定。结果如表7所示。
表7：Y1～Y6菌株产量
菌株 产量(g/L)
Y1 0.81±0.02
Y2 0.89±0.07
Y3 1.44±0.10
Y4 1.74±0.02
Y5 1.98±0.01
Y6 2.06±0.04
结果显示，强化内质网大小调节因子相关基因INO2、SCS22、TCB2和IST2以扩大内质网表面积增强细胞蛋白质合成能力后，Y6菌株角鲨烯发酵产量达到2.06g/L，相比较于未强化内质网的菌株Y3的1.44g/L，提高了43.1％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种强化表达内质网大小调节因子的酿酒酵母菌株的构建和应用
<130> BAA210889A
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 2388
<212> DNA
<213> 人工序列
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<211> 4446
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Claims (7)

1.一种重组酿酒酵母菌株，其特征在于，以酿酒酵母BY4741为出发菌株，强化表达了3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶tHMG1、异戊烯基焦磷酸异构酶IDI和法尼基焦磷酸合酶ERG20，敲除了ROX1基因，并且强化表达了内质网大小调节因子的相关基因INO2、SCS22、TCB2和IST2；所述重组酿酒酵母通过PGPD启动子强化表达tHMG1，通过PPGK1启动子强化表达INO2和IST2，通过PTEF1启动子强化表达ERG20，IDI，TCB2，通过PGAP启动子强化SCS22；所述tHMG1的GeneID为42650、所述IDI的GeneID为855986、所述ERG20的GeneID为853272、所述INO2的GeneID为851701、所述ROX1的Gene ID为856178、所述SCS22的GeneID为852186、所述TCB2的GeneID为855637、所述IST2的GeneID为852382。
2.一种制备角鲨烯的方法，其特征在于，采用权利要求1所述的重组酿酒酵母发酵制备得到。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法为，将重组酿酒酵母接种至种子培养基，制备得到种子液，将制备得到的种子液以1-5％(v/v)的接种量接入发酵培养基中，发酵培养，制备得到角鲨烯。
4.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于，将所述的重组酿酒酵母接种至YPD培养基中，于28~32℃，220~280rpm条件下培养15~24h，得到种子液。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述发酵培养条件为：在28~32℃下发酵培养72-96h。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基包括：30~60g/L大豆蛋白胨、10~30g/L蔗糖、10~30g/L葡萄糖、10-30g/L甘油。
7.权利要求1所述的重组酿酒酵母，或权利要求2~6任一所述的方法在制备含有角鲨烯产品中的应用。
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