CN108949599A - 一种产β-紫罗兰酮基因工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种产β‑紫罗兰酮基因工程菌及其构建方法与应用。本发明以解脂耶氏酵母为底盘细胞，将β‑紫罗兰酮表达模块(约14.5kb)线性化后转入解脂耶氏酵母体内并利用CRISPR/cas9技术介导整合到设计的染色体位置，具有简单快速高效的优点，2～3周即可获得大片段整合工程菌株，明显缩短工程菌构建周期。按照本发明的方法获得的基因工程菌的β‑紫罗兰酮的摇瓶发酵初产量可达到约6.3mg/L。本发明可利用简单培养基发酵生产香料β‑紫罗兰酮，可实现多基因一次性高效转化与整合，可明显缩短工程菌构建时间，所得工程菌可利用葡萄糖、甘油等简单碳源进行香料β‑紫罗兰酮的发酵生产，具有良好的工业应用前景。

Description

一种产β-紫罗兰酮基因工程菌及其构建方法与应用

技术领域

本发明属于微生物发酵领域，具体地说，是关于一种产β-紫罗兰酮基因工程菌及其构建方法与应用。

背景技术

紫罗兰酮是一种高级香料，是调香中不可或缺的重要的原香料，用途广，需求量大。紫罗兰酮的分子式为C₁₃H₂₀O，根据双键位置的不同，可将紫罗兰酮划分为α体，β体和γ体3种同分异构体，而自然界中多以α体，β体这两种异构的混合形式存在，其中β-紫罗兰酮是用于高档级精细日用化妆品的调香剂和增香剂，也是医药工业上合成维生素A的重要原料。在食品行业中，紫罗兰酮常用作高档食品、饮料的增香剂，是中国GB2760-2011规定允许使用的食用香料，主要用以配制龙眼、树莓、黑莓、樱桃、柑橘等香精，全球年需求量达近万吨。由于国内目前的生产工艺限制，缺口超过1000吨，特别是医药级的，基本全靠进口。产品的市场潜力大，也急需高效的生产方法。

目前生产β-紫罗兰酮的方法主要有化学合成。化学合成法是以柠檬醛和丙酮为原料，经缩合、环化、分离提纯得到的。国外由于原材料的缺乏，主要侧重利用石油化工产品为原料进行合成。而我国的山苍子油年产量已达2000吨，而从山苍子油中可直接提取获得柠檬醛，故我国主要改用该方法进行β-紫罗兰酮的工业合成。但该方法具有总回收率低(仅为40％～45％)、工艺较为复杂、合成周期较长等缺点。相对来讲，生物发酵法生产β-紫罗兰酮在一定程度上克服了化学合成法的缺点，具有生产工艺简单、成本低、产品质量好等优点。

β-紫罗兰酮生物体内合成是以β-类胡萝卜素为前体，在类胡萝卜素裂解双加氧酶的催化下合成的。目前发现许多微生物都具有生产类胡萝卜素的能力，而且由解脂耶氏酵母出发构建的工程菌株已经实现了β-类胡萝卜素的高产[CN201210525553.X，CN201410243227.9]。然而，关于β-紫罗兰酮生物异源合成的报道非常少。Lopez等人通过在酿酒酵母中引入红法夫酵母的β-胡萝卜素合成途径和来源于矮牵牛的类胡萝卜素裂解双加氧酶，最终获得了5mg/L DCW[López J,et al.Production of beta-ionone by combinedexpression of carotenogenic and plant CCD1 genes in Saccharomycescerevisiae.Microbial Cell Factories.2015.14:84]。由于代谢调控机理及宿主本身的限制，β-紫罗兰酮的产量还有望进一步得到提高。

解脂耶氏酵母是一种一般安全(Generally recognized as safe，GRAS)的微生物，主要分布在富含脂肪和蛋白质的环境中，因其在脂类和萜类合成上的优势而引起越来越多的研究兴趣。目前，由解脂耶氏酵母工程菌生产的DHA和EPA两种功能性脂类产品已在杜邦公司实现了商业化生产[WO2012027689]。还有更多的产品正走向工业生产规模的水平，如萜类化合物胡萝卜素的产量已经达4.5g/L的水平[CN201410243227.9]，而且帝斯曼公司也开始利用解脂耶氏酵母进行冷杉醇的合成[WO2016094178]。证明了解脂耶氏酵母在异源表达萜类化合物上有一定的优势，有望开发用于多种萜类香料的合成。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种产β-紫罗兰酮基因工程菌的构建方法。

本发明的另一目的在于提供通过上述构建方法获得的产β-紫罗兰酮基因工程菌。

本发明的再一目的在于提供上述产β-紫罗兰酮基因工程菌的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明提供的一种产β-紫罗兰酮基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：

1)构建基因表达模块，所述基因表达模块包括β-紫罗兰酮生产相关的基因、所述β-紫罗兰酮生产相关的基因上游的启动子和所述β-紫罗兰酮生产相关的基因下游的终止子；

2)构建CRISPR/cas9操作载体，包括导向染色体整合位点的sgRNA转录模块、cas9蛋白表达模块和筛选标记；

3)将步骤1)所述基因表达模块和步骤2)所述CRISPR/cas9操作载体共转化至解脂耶氏酵母中，获得产β-紫罗兰酮基因工程菌。

根据本发明，步骤1)中所述的基因表达模块还包括rDNA基因整合上下游同源臂、可丢失的筛选标记基因表达盒。

根据本发明，步骤1)中所述的构建基因表达模块包括以下步骤：

1.1通过PCR扩增获得所述β-紫罗兰酮生产相关的基因、所述β-紫罗兰酮生产相关的基因上游的启动子片段、所述β-紫罗兰酮生产相关的基因下游的终止子片段，所述rDNA基因整合上下游同源臂、所述可丢失的筛选标记基因表达盒；

1.2将所述β-紫罗兰酮生产相关的基因、所述β-紫罗兰酮生产相关的基因上游的启动子片段、所述β-紫罗兰酮生产相关的基因下游的终止子片段、所述rDNA基因整合上下游同源臂、所述筛选标记基因表达盒和筛选标记丢失模块片段分别通过gibson assembly组装法进行组装获得基因表达模块。

根据本发明的优选实施例，步骤1)中所述β-紫罗兰酮生产相关的基因为CarB，CarRP，CCD1。

根据本发明的优选实施例，所述CarB和CarRP来源于卷枝毛霉菌，CCD1来源于矮牵牛。

根据本发明的优选实施例，步骤1)中所述启动子选自TEF1p，EXP1p，GPD2p。

根据本发明的优选实施例，所述启动子来源于解脂耶氏酵母。

根据本发明的优选实施例，步骤1)所述终止子选自XPR2t，LIP2t，MIG1t。

根据本发明的优选实施例，所述终止子来源于解脂耶氏酵母。

根据本发明的优选实施例，所述筛选标记基因为Ura3。

根据本发明的优选实施例，所述筛选标记基因来源于解脂耶氏酵母。

根据本发明的优选实施例，所述筛选标记丢失模块为hisG-hisG。

根据本发明的优选实施例，所述筛选标记丢失模块来源为pNKY51质粒(ADDGENE编号：14839)。

根据本发明，步骤2)中所述的构建CRISPR/cas9操作载体包括以下步骤：

通过在线设计染色体整合位点的sgRNA靶序列，将sgRNA靶序列引入到引物中，通过PCR的方法，将sgRNA靶序列引入到CRISPR/cas9操作载体上。

根据本发明的优选实施例，步骤2)中所述载体以pCAS1yl为出发载体。

根据本发明的优选实施例，所述sgRNA靶序列设计网站为：http://e-crisp-test.dkfz.de/E-CRISP/designcrispr.html。

根据本发明的优选实施例，所述染色体整合位点可以为染色体上的非必需基因位点，优选rDNA位点。

优选的，所述的sgRNA靶序列为GGAGTAACTATGCTCTCTTAAGG，SEQ ID NO：2。其中，下划线部分为PAM位点。

所述的sgRNA序列如SEQ ID NO：1。

一种产β-紫罗兰酮基因工程菌，通过上述构建方法构建得到。

所述的产β-紫罗兰酮基因工程菌在发酵生产β-紫罗兰酮中的应用，尤其可应用于利用多种碳源为底物发酵生产β-紫罗兰酮。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明以解脂耶氏酵母为底盘细胞，将β-紫罗兰酮表达模块(约14.5kb)线性化后转入解脂耶氏酵母体内并利用CRISPR/cas9技术介导整合到设计的染色体位置，具有简单快速高效的优点，2～3周即可获得大片段整合工程菌株，明显缩短工程菌构建周期。按照本发明的方法获得的基因工程菌的β-紫罗兰酮的摇瓶发酵初产量可达到约6.3mg/L，具有良好的工业应用前景。

(2)本发明可利用简单培养基发酵生产香料β-紫罗兰酮，可实现多基因一次性高效转化与整合，可明显缩短工程菌构建时间，所得工程菌可利用葡萄糖、甘油等简单碳源进行香料β-紫罗兰酮的发酵生产，有较好的应用前景。

附图说明

图1是β-紫罗兰酮在解脂耶氏酵母体内的合成途径示意图。

图2是β-紫罗兰酮基因表达模块的组装顺序示意图，其中，rDNAu表示rDNAup，HUH表示hisG-Ura3-hisG，rDNAd表示rDNAdown。

图3是CRISPR/cas9操作载体的示意图。

图4是β-紫罗兰酮工程菌的PCR鉴定结果图；其中，泳道1-3分别为CarB，CarRP，CCD1基因部分序列。

图5是β-紫罗兰酮工程菌发酵的产量图。其中，A图为以葡萄糖为碳源，不同温度发酵的产量图，B图为发酵温度为20℃，不同碳源发酵的产量图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂商所建议的实验条件。

β-紫罗兰酮在解脂耶氏酵母体内的合成途径示意图，如图1所示。

实施例1实验方案及引物设计

本实施例的实验方案设计如下：

在解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica po1f(购至YEASTERN BIOTECH公司，菌株信息：MatA，leu2-270，ura3-302，xpr2-322，axp1-2，Leu^-，Ura^-ΔAEP，ΔAXP，Suc⁺)中表达来自于卷枝毛霉菌的CarB和CarRP和来自于矮牵牛的CCD1基因，构建β-紫罗兰酮合成途径，并同时以Ura3基因作为筛选标记，选择酵母染色体rDNA位点作为整合位点，各基因模块的组装顺序如图2所示。CRISPR/cas9操作载体，以pCAS1yl(ADDGENE编号73226)为出发载体，构建如图3所示。

利用gibson assembly的方法构建以下基因表达模块和CRISPR/cas9操作载体：

rDNAup-hisG-Ura3-hisG，TEF1p-CarB-XPR2t，EXP1p-CarRP-LIP2t，GPD2p-CCD1-MIG1t-rDNAdown，pCAS1yl-rDNA1和pCAS1yl-rDNA2。各DNA片段信息如表1所示：

表1各DNA片段信息

按照gibson assembly组装的技术要求，使用Oligo6设计PCR引物序列用于扩增以上各DNA片段，引物序列如SEQ ID NO：18～SEQ ID NO：47所示。

实施例2基因工程菌的构建

2.1 β-紫罗兰酮基因的获得：

基因选择来源于卷枝毛霉菌的CarB，CarRP和来源于矮牵牛的CCD1，经密码子优化，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；利用序列表中的引物，分别扩增获得CarB，CarRP，CCD1基因片段。

2.2酵母基因组DNA的提取

解脂耶氏酵母po1f基因组的提取方法如下：从新鲜复苏的平板中挑取单克隆菌落接于5mL YPD液体培养基试管，28℃，250rpm，培养24小时，收集1mL菌液，使用酵母基因组提取试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司)提取基因组。

质粒的提取方法如下：接种含有相应质粒的DH5α菌于5mL LB液体培养基，其中含有氨苄青霉素终浓度为50μg/mL，37℃，220rpm，过夜培养约14小时，使用质粒提取试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司)抽提质粒。

2.3序列表所述DNA片段的PCR扩增

各DNA片段的PCR扩增均使用Q5高保真DNA聚合酶(购自New England Biolabs公司)，按照50μL PCR体系配制PCR扩增反应液(表2)。

表2 PCR扩增反应液配制体系

成分	体积(μL)
		5×Q5 Reaction Buffer	10
dNTPs(10mM)	2
		Q5 High-Fidelity DNA Polymerase	0.5
引物F(20μM)	1.25
		引物R(20μM)	1.25
模板DNA	1ng
		ddH2O	补齐至50

PCR程序设置参照说明书并根据引物Tm值设置退火温度值。

将PCR产物使用超薄DNA产物纯化试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司)纯化回收片段，-20℃保存备用。

2.4基因表达模块的构建

将2.3中获得的DNA片段通过gibson assembly组装方法构建以下各表达模块，rDNAup-hisG-Ura3-hisG，TEF1p-CarB-XPR2t，EXP1p-CarRP-LIP2t，GPD2p-CCD1-MIG1t-rDNAdown。所采用的试剂为Gibson Assembly Master Mix(购自New England Biolabs公司)。在获得各表达模块后，再通过gibson assembly按顺序进行组装，构建β-紫罗兰酮表达模块。构建得到的重组子通过PCR和测序验证正确。其中，以pUC19(ADDGENE编号：50005)为克隆载体。

2.5 CRISPR/cas9操作载体的构建

通过gibson assembly组装方法将2.3中获得的DNA片段pCAS1yl-rDNA1和pCAS1yl-rDNA2组装成CRISPR/cas9操作载体pCAS1yl-rDNA。构建得到的重组子通过PCR和测序验证正确。

2.6基因表达模块和CRISPR/cas9操作载体共转化至解脂耶氏酵母po1f

采用化学转化方法将2.4中获得的β-紫罗兰酮表达模块rDNAup-hisG-Ura3-hisG-TEF1p-CarB-XPR2t-EXP1p-CarRP-LIP2t-GPD2p-CCD1-MIG1t-rDNAdown和2.5中获得的CRISPR/cas9操作载体pCAS1yl-rDNA转化至解脂耶氏酵母po1f。

操作方法如下：挑取单克隆菌落接于10mL YPD液体培养基，28℃，250rpm，培养至OD₆₀₀达到0.8～1.0，500×g，4min离心收集菌体，弃尽上清。按照酵母感受态细胞制备试剂盒(Frozen-EZ Yeast Transformation II，购自ZYMO公司)说明书步骤制得转化感受态细胞。取20μL感受态并加入DNA片段400ng，按说明书步骤进行转化，涂布于缺尿嘧啶和亮氨酸的SD固体培养基，于28℃培养3～4天。

2.7鉴定

β-紫罗兰酮显微黄色，因此产β-紫罗兰酮的菌株会有颜色变化。在转化平板上挑选显微黄色的菌株，按2.2中的基因组提取方法提取基因组，并以此为模板进行PCR扩增CarB，CarRP，CCD1基因片段，经电泳分析，结果如图4所示，成功获得β-紫罗兰酮生产菌株。

实施例3基因工程菌的发酵及β-紫罗兰酮的检测

3.1发酵

种子液培养方法如下：

从培养平板天趣实施例2中筛选获得的阳性克隆的单菌落，接到10mL YPD培养液中(50mL离心管)，28℃，250rpm，培养至OD₆₀₀为2～3。

不同温度的发酵培养方法如下：

将种子液接种到20mL YPD培养基中(50mL摇瓶)，初始OD₆₀₀值为0.1，有机相为正十二烷(10％V/V)，分别放置于不同温度(15～30℃)的摇床中，250rpm，培养12天。

不同碳源的发酵培养方法如下：

将种子液接种到20mL含各种不同碳源(20g/L)的YP培养基中(50mL摇瓶)，初始OD₆₀₀值为0.1，有机相为正十二烷(10％V/V)，20℃，250rpm，培养12天。

3.2 β-紫罗兰酮的检测

发酵结束后，小心吸取发酵液上层有机相，12000rpm离心5min，吸取1mL上清液至一新1.5mL离心管，经0.22μm滤头过滤至气相瓶，-20℃冻存或上气相色谱检测。内参为异长叶烯(终浓度为200μM)。

气相色谱检测方法如下：

仪器型号：安捷伦7890A；

分析柱：DB-FFAP毛细管柱(60m×0.25mm id,0.25μm film thickness或J&WScientific,Agilent Technologies)；

进样量：1μL；

升温程序：80℃保持1min；以10℃/min上升到120℃，保持1min；再以10℃/min上升到240℃，保持18min；程序结束。

3.3 β-紫罗兰酮的产量测定

经过检测，通过以上步骤构建的基因工程菌在以葡萄糖为碳源时，β-紫罗兰酮产量可达4.3mg/L，以甘油为碳源时，产量可达6.3mg/L。

β-紫罗兰酮工程菌发酵的产量图如图5所示，其中，A图为以葡萄糖为碳源，不同温度发酵的产量图；B图为发酵温度为20℃，不同碳源发酵的产量图。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南理工大学

<120> 一种产β-紫罗兰酮基因工程菌及其构建方法与应用

<160> 47

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> sgRNA序列

<400> 1

ggagtaacta tgctctctta gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60

cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt 100

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> sgRNA靶序列

<400> 2

ggagtaacta tgctctctta agg 23

<210> 3

<211> 701

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> rDNAup

<400> 3

catgattacg ccacgcgtgc ggccgcatcg atcctaaggg gtggcataac tgtcgcgtac 60

ggcccgataa gggccttctc caaaagggaa gccggttgaa attccggcac ttggatgtgg 120

attctccacg gcaacgtaac tgaatgtggg gacggtggca caagtcttgg aaggagttat 180

cttttctttt taacggagtc aacaccctgg aattagtttg tctagagata gggtatcgtt 240

ccggaagagg ggggcagctt tgtcccctcc gatgcacttg tgacgcccct tgaaaacccg 300

caggaaggaa tagttttcac gccaagtcgt actgataacc gcagcaggtc tccaaggtga 360

acagcctcta gttgatagaa taatgtagat aagggaagtc ggcaaaatag atccgtaact 420

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ggcggctggg caactggcag ccggacccgc ggcagacact gcgtcgctcc gtccacatca 540

tcaaccgccc cagaactggt acggacaagg ggaatctgac tgtctaatta aaacatagct 600

ttgcgatggt tgtaaaacaa tgttgacgca aagtgatttc tgcccagtgc tctgaatgtc 660

aaagtgaaga aattcaaaaa acgacggcca gtgccaagct t 701

<210> 4

<211> 2117

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> HisG-Ura3

<400> 4

ggggctgttc cagtcaatca gggtattgaa gctcatggtc tttactccat cacagggttc 60

cgccttatcc ggcctacaga acccaaaata tcaacgcatt acgtaggcct gataagcgca 120

gcgccatcag gcgtcagatc actccatcat cttctcgatc ggcagtacca gaatcgagct 180

ggcgccaagc gctttcagtt tctccatggt ttcccagaac aacgtttcgc tgctgaccat 240

gtgcatcgcc acgcgctgtt gctcgcctgc cagcggcaga attgtcggcc tttcggcgcc 300

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cacgccatcc attaccagac ccggaatgtc atcatcacgc acgcgcagga tatcaatcgg 900

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cagtttcctc ggcaccagct cgcaggccag caatgattcc ggttccgggt acaccgtggg 1980

cgttggtgat atcggaccac tcggcgattc ggtagacacc gttcttgtac tggtgcttga 2040

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caagttcctt gaggggg 2117

<210> 5

<211> 2150

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Ura3-hisG

<400> 5

gaagaaaccg tgcttaagag caagttcctt gagggggagc acagtgccgg cgtaggtgaa 60

gtcgtcaatg atgtcgatat gggtcttgat catgcacaca taaggtccga ccttatcggc 120

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ggctgccacg agcttgagca ctcgagcggc aaaggcggac ttgtggacgt tagctcgagc 240

ttcgtaggag ggcattttgg tggtgaagag gagactgaaa taaatttagt ctgcagaact 300

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ttgaacttat agatagactg gactatacgg ctatcggtcc aaattagaaa gaacgtcaat 420

ggctctctgg gcgtcgcctt tgccgacaaa aatgtgatca tgatgaaagc cagcaatgac 480

gttgcagctg atattgttgt cggccaaccg cgccgaaaac gcagctgtca gacccacagc 540

ctccaacgaa gaatgtatcg tcaaagtgat ccaagcacac tcatagttgg agtcgtactc 600

caaaggcggc aatgacgagt cagacagata ctcgtcgacc ttttccttgg gaaccaccac 660

cgtcagccct tctgactcac gtattgtagc caccgacaca ggcaacagtc cgtggatagc 720

agaatatgtc ttgtcggtcc atttctcacc aactttaggc gtcaagtgaa tgttgcagaa 780

gaagtatgtg ccttcattga gaatcggtgt tgctgatttc aataaagtct tgagatcagt 840

ttggccagtc atgttgtggg gggtaattgg attgagttat cgcctacagt ctgtacaggt 900

atactcgctg cccactttat actttttgat tccgctgcac ttgaagcaat gtcgtttacc 960

aaaagtgaga atgctccaca gaacacaccc cggtaccccg ctgttccagt caatcagggt 1020

attgaagctc atggtcttta ctccatcaca gggttccgcc ttatccggcc tacagaaccc 1080

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gcctgccagc ggcagaattg tcggcctttc ggcgcctggc agcagggcga taacctcttc 1320

caggcgttca cttggcgcgt gcatcatgat gtatttcgat tcgcgcgcct gaatcacgcc 1380

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gcgctgaatc agacaggctt tagagcggta gataacttcg acttcacgca ggccgttagc 1500

ttcaagcgtc gcgccggtag agaccaaatc gcagatagcg tcggccagcc ccgcgcgcgg 1560

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gccgtcccag gcttcgtcaa ccggtgttgc cagcgataaa cggcagccgc cgaagtcaag 1740

acggcgcagg gttaaatagc gtggatcttc gccctgtgcg cggcggttga gtagctcttc 1800

ttccagcacg ttttcgccga taataccgag atcgaccacg ccatccatta ccagacccgg 1860

aatgtcatca tcacgcacgc gcaggatatc aatcggcatg ttttccgcca tcgcaatcag 1920

gcgctgagtg tgtaaattaa tttttatgcc gcagcgggcc agcaattctc gtgaatcatc 1980

gcttaaacgg cctgatttct gaatagctat gcgtaagcgg gtgttgtcta acattctgcg 2040

ttcctcttta tcctgtctga accggtctgt atcgcgcgcc aaaaaaaaag cccccggaag 2100

atgatcttcc gggggctttc tcatgcgttc atgcaccact ggaagatccg 2150

<210> 6

<211> 406

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> TEF1p

<400> 6

agagaccggg ttggcggcgt atttgtgtcc caaaaaacag ccccaattgc cccaattgac 60

cccaaattga cccagtagcg ggcccaaccc cggcgagagc ccccttcacc ccacatatca 120

aacctccccc ggttcccaca cttgccgtta agggcgtagg gtactgcagt ctggaatcta 180

cgcttgttca gactttgtac tagtttcttt gtctggccat ccgggtaacc catgccggac 240

gcaaaataga ctactgaaaa tttttttgct ttgtggttgg gactttagcc aagggtataa 300

aagaccaccg tccccgaatt acctttcctc ttcttttctc tctctccttg tcaactcaca 360

cccgaaatcg ttaagcattt ccttctgagt ataagaatca ttcaaa 406

<210> 7

<211> 1740

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CarB

<400> 7

atgtccaaga agcacatcgt gatcataggc gccggagtgg gcggaaccgc caccgccgcc 60

cgactggccc gagagggctt caaggtgacc gtggttgaga agaacgactt cggaggcggc 120

cgatgttctc tgatccacca tcagggccac cgatttgacc agggcccttc tctgtacctg 180

atgcctaagt acttcgagga cgcctttgcc gacctggacg agcgaatcca ggaccacctg 240

gagctgctgc gatgtgacaa caactacaag gtccactttg acgacggcga gtccatccag 300

ctgtcctctg acctgactcg aatgaaggct gagctggacc gagtggaggg ccctctggga 360

ttcggacgat tcctggactt catgaaggag acccacatcc actacgagtc tggcaccctc 420

attgccctga agaagaactt cgagtctatt tgggacctga tccgaattaa gtacgcccct 480

gagattttcc gactccacct gttcggaaag atctacgacc gagcctctaa gtacttcaag 540

accaagaaga tgcgaatggc tttcaccttc cagaccatgt acatgggcat gtcgccctac 600

gatgcccctg ccgtctactc tctgctccag tacaccgagt tcgccgaggg catttggtac 660

ccccgaggag gattcaacat ggtggtccag aagctcgagg ctatcgccaa gcagaagtac 720

gacgccgagt tcatctacaa cgcccctgtc gccaagatca acaccgacga cgccaccaag 780

caggtgactg gagtgaccct ggagaacggc cacatcattg acgccgacgc cgtggtgtgt 840

aacgccgacc tggtgtacgc ttaccacaac ctgctgcccc cctgtcgatg gactcagaac 900

accctggcct ccaagaagct gacctcgtct tctatttcct tctactggtc catgtccacc 960

aaggtgcccc agctggacgt ccacaacatc ttcctcgccg aggcttacca ggagtccttt 1020

gacgagatct tcaaggactt cggactgccc tccgaggcct ccttctacgt gaacgtccct 1080

tcgcgaatcg acccctccgc cgcccccgac ggcaaggact ctgtcattgt gctggtgccc 1140

attggacaca tgaagtctaa gacaggagac gcatctaccg agaactaccc cgccatggtg 1200

gacaaggccc gaaagatggt gctggccgtg attgagcgac gactgggaat gtccaacttc 1260

gccgacctga ttgagcacga acaggtgaac gaccccgccg tctggcagtc taagttcaac 1320

ctctggcgag gctccatcct gggcctgtct cacgatgttc ttcaggtgct ctggtttcga 1380

ccttctacta aagattccac cggtagatac gacaacctgt ttttcgttgg agcttctact 1440

caccctggaa ccggagtccc cattgtcctg gctggatcta agctgacctc tgaccaggtg 1500

gtgaagtctt ttggcaagac ccccaagccc cgaaagatcg agatggagaa cacccaggct 1560

cctctggagg agcccgacgc cgagtctaca tttcccgtgt ggttctggct gcgagctgcc 1620

ttctgggtca tgttcatgtt cttctacttc ttcccccagt ctaacggcca gacccccgcc 1680

tcgtttatta acaacctgct tcctgaggtg tttagagtcc ataactctaa cgtgatttga 1740

<210> 8

<211> 411

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> XPR2t

<400> 8

cctgtcccca cgttgccggt cttgcctcct actacctgtc catcaatgac gaggttctca 60

cccctgccca ggtcgaggct cttattactg agtccaacac cggtgttctt cccaccacca 120

acctcaaggg ctctcccaac gctgttgcct acaacggtgt tggcatttag gcaattaaca 180

gatagtttgc cggtgataat tctcttaacc tcccacactc ctttgacata acgatttatg 240

taacgaaact gaaatttgac cagatattgt tgtaaataga aaatctggct tgtaggtggc 300

aaaatcccgt ctttgttcat caattccctc tgtgactact cgtcatccct ttatgttcga 360

ctgtcgtatt tttattttcc atacatacgc aagtgagatg cccgtgtccg a 411

<210> 9

<211> 998

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> EXP1p

<400> 9

gagtttggcg cccgtttttt cgagccccac acgtttcggt gagtatgagc ggcggcagat 60

tcgagcgttt ccggtttccg cggcgggacg agagcccatg atgggggctc ccaccaccag 120

caatcagggc cctgattaca cacccacctg taatgtcatg ctgttcatcg tggttaatgc 180

tgctgtgtgc tgtgtgtgtg tgttgtttgg cgctcattgt tgcgttatgc agcgtacacc 240

acaatattgg aagcttatta gcctttctat tttttcgttt gcaaggctta acaacattgc 300

tgtggagagg gatggggata tggaggccgc tggagggagt cggagaggcg ttttggagcg 360

gcttggcctg gcgcccactc gcgaaacgca cctaggaccc tttggcacgc cgaaatgtgc 420

cacttttcag tctagtaacg ccttacctac gtcattccat gcatgcatgt ttgcgccttt 480

tttcccttgc ccttgatcgc cacacagtac agtgcactgt acagtggagg ttttgggggg 540

gtcttagatg ggagctaaaa gcggcctagc ggtacactag tgggattgta tggagtggca 600

tggagcctgg gtggagcctg acaggacgca cgaccggcta gcccgtgaca gacgatgggt 660

ggctcctgtt gtccaccgcg tacaaatgtt tgggccaaag tcttgtcagc cttgcttgcg 720

aacctaattc ccaattttgt cacttcgcac ccccattgat cgagccctaa cccctgccca 780

tcaggcaatc caattaagct cgcattgtct gccttgttta gtttggctcc tgcccgtttc 840

ggcgtccact tgcacaaaca caaacaagca ttatatataa ggctcgtctc tccctcccaa 900

ccacactcac ttttttgccc gtcttccctt gctaacacaa aagtcaagaa cacaaacaac 960

caccccaacc cccttacaca caagacatat ctacagca 998

<210> 10

<211> 1845

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CarRP

<400> 10

atgctgctga cctacatgga ggtgcacctg tactacaccc tgcccgtgct gggcgtgctg 60

tcttggctgt ctcgacccta ctacaccgcc accgacgccc tgaagttcaa gttcctgacc 120

ctcgtcgcct tcaccaccgc ctctgcctgg gacaactaca ttgtgtacca caaggcttgg 180

tcctactgtc ccacctgtgt gaccgccgtg atcggatacg ttcccctgga ggagtacatg 240

ttcttcatca tcatgaccct gctgaccgtt gccttcacca acctcgtgat gcgatggcac 300

ctgcactctt tcttcatccg acccgagacc cccgtgatgc agtctgtgtt agtgcgactg 360

gtccccatca ccgctctgct cataaccgcc tacaaggctt ggcacctggc cgtgcccgga 420

aagcccctct tctacggatc ttgtatcctg tggtacgctt gtcctgtgct cgctctgctg 480

tggttcggag ccggagagta catgatgcga cggcccttag ccgtgctcgt gtctatcgct 540

ctgcccaccc tgtttctgtg ttgggttgac gtagtggcta ttggagctgg aacttgggac 600

atttctctgg ctacttcgac cggcaagttc gtggtgcccc acctgcccgt ggaggagttc 660

atgttcttcg ccctgatcaa caccgtgctt gtgttcggca cctgtgctat tgacaggacc 720

atggctattc tgcacctgtt taagaacaag tctccctacc agcgacctta ccagcactct 780

aagtctttcc tgcaccagat tttagagatg acctgggcct tctgtctgcc tgatcaggtg 840

ctgcactctg acaccttcca cgacctgtcc gtgtcttggg acatcctgcg aaaggcctct 900

aagtctttct acaccgcttc cgccgtgttc cccggagacg tgcgacagga gctgggcgtg 960

ctgtacgctt tttgtcgagc caccgacgac ctgtgcgaca acgagcaggt gcccgtgcag 1020

accagaaagg agcagctgat cctgacccac cagttcgtgt ccgacctgtt cggacagaag 1080

acttctgccc ctaccgccat cgactgggac ttctacaacg accagctgcc cgcttcctgt 1140

atttccgcct tcaagtcttt cacccgactg cgacacgtcc tggaggccgg agctatcaag 1200

gagctgctcg acggatacaa gtgggacctg gagcgacgat ctatccgaga tcaggaggac 1260

ctccgatact actccgcttg tgtggcctct tctgtcggag agatgtgtac ccgaatcatc 1320

ctggcccacg ccgataagcc cgcttctcga cagcagactc agtggatcat tcagagagcc 1380

cgagagatgg gactggtgct gcagtacacc aacatcgccc gagacatcgt gaccgactct 1440

gaggagctgg gacgatgtta cctgccccag gactggctga ccgagaagga ggtcgccctg 1500

attcagggcg gcctggcccg agagatcgga gaggagcgac tgctgtccct gtcccaccga 1560

ttgatctacc aggctgacga gctgatggtg gtggctaaca agggaatcga caagctgccc 1620

tcgcactgtc agggcggcgt gcgagccgcc tgtaacgtgt acgcctctat cggaactaag 1680

ctgaagtcct acaagcacca ctacccctct cgagctcacg tgggaaactc taagcgagtc 1740

gagattgccc tgctgtctgt gtacaacctg tacaccgccc ccattgccac ctcttctact 1800

acccactgcc gacagggcaa gatgcgaaac ctgaacacca tctaa 1845

<210> 11

<211> 202

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> lip2t

<400> 11

gctatttatc actctttaca acttctacct caactatcta ctttaataaa tgaatatcgt 60

ttattctcta tgattactgt atatgcgttc ctctaagaca aatcgaaacc agcatgcgat 120

cgaatggcat acaaaagttt cttccgaagt tgatcaatgt cctgatagtc aggcagcttg 180

agaagattga cacaggtgga gg 202

<210> 12

<211> 931

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GPD2p

<400> 12

cgcagtagga tgtcctgcac gggtcttttt gtggggtgtg gagaaagggg tgcttggaga 60

tggaagccgg tagaaccggg ctgcttgggg ggatttgggg ccgctgggct ccaaagaggg 120

gtaggcattt cgttggggtt acgtaattgc ggcatttggg tcctgcgcgc atgtcccatt 180

ggtcagaatt agtccggata ggagacttat cagccaatca cagcgccgga tccacctgta 240

ggttgggttg ggtgggagca cccctccaca gagtagagtc aaacagcagc agcaacatga 300

tagttggggg tgtgcgtgtt aaaggaaaaa aaaagaagct tgggttatat tcccgctcta 360

tttagaggtt gcgggataga cgccgacgga gggcaatggc gccatggaac cttgcggata 420

tcgatacgcc gcggcggact gcgtccgaac cagctccagc agcgtttttt ccgggccatt 480

gagccgactg cgaccccgcc aacgtgtctt ggcccacgca ctcatgtcat gttggtgttg 540

ggaggccact ttttaagtag cacaaggcac ctagctcgca gcaaggtgtc cgaaccaaag 600

aagcggctgc agtggtgcaa acggggcgga aacggcggga aaaagccacg ggggcacgaa 660

ttgaggcacg ccctcgaatt tgagacgagt cacggcccca ttcgcccgcg caatggctcg 720

ccaacgcccg gtcttttgca ccacatcagg ttaccccaag ccaaaccttt gtgttaaaaa 780

gcttaacata ttataccgaa cgtaggtttg ggcgggcttg ctccgtctgt ccaaggcaac 840

atttatataa gggtctgcat cgccggctca attgaatctt ttttcttctt ctcttctcta 900

tattcattct tgaattaaac acacatcaac a 931

<210> 13

<211> 1641

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CCD1

<400> 13

atgggtagaa aggagtctga cgatggagtt gagcgaatag agggcggagt ggtggttgtc 60

aaccctaagc ccaagaaggg aattaccgcc aaggccattg acctgctgga gaaggttatc 120

atcaagctga tgcacgactc ttccaagccc ctgcactacc tgtccggcaa cttcgccccc 180

accgacgaga ccccccccct gaacgacctg cccatcaagg gacacctgcc cgagtgtctg 240

aacggcgagt tcgtccgagt gggacccaac cccaagttcg cccccgtcgc cggctaccac 300

tggttcgacg gcgacggaat gatccacggc ctgaggatta aggacggcaa ggccacctac 360

gtgtcccgat acgtgcgaac gtctcgactg aagcaggaag agttcttcga gggagccaag 420

ttcatgaaga tcggcgacct caagggactg ttcggattgt tcaccgtgta catgcagatg 480

ctgcgagcga agctgaagat tctggacacc tcgtacggaa acggcaccgc caacaccgcc 540

ctggtgtacc accacggcaa gctgctcgcc ctgtctgagg ctgacaagcc ctacgccctg 600

aaggtgctgg aggacggtga cctgcagacc ctgggaatgc tggactacga caagcgactc 660

ctgcactcct tcaccgccca ccctaaggtg gaccccgtga ccggcgagat gttcaccttc 720

ggctacgccc acgagccccc ctacatcacc taccgcgtga tttctaagga cgggatcatg 780

caggaccctg tccccatcac cattcctgag gccatcatga tgcatgactt cgccattacc 840

gagaactacg ccatcatgat ggacctgcct ctgtgtttcc gacccaagga gatggtgaag 900

aacaaccagc tggcgtttac ttttgacacc accaagaagg ctcgattcgg agtgctgccc 960

cgatacgcca agtcggaggc cctgatccgg tggttcgagc tgcccaactg cttcattttc 1020

cataacgcca acgcctggga ggagggcgac gaggtcgtgc tgatcacctg ccggctgccc 1080

caccccgacc tggacatggt gaacggcgag gtcaaggaga acctggagaa cttctctaac 1140

gagctgtacg agatgcgatt caacatgaag tctggcgccg cctcccagaa gaagctgtct 1200

gagtcgtctg tggacttccc ccgaattaac gagaactaca ccggacgaaa gcagcgatac 1260

gtctacggca ccaccctcaa ctccatcgcc aaggtgaccg gcattattaa gttcgacctg 1320

cacgccgagc ccgagaccgg caagaagcag ctggaggtcg gcggaaacgt ccagggaatt 1380

ttcgacctgg gacccggacg attcggctct gaggctgtgt tcgtgccctc ccagcccggc 1440

accgagtgtg aggaggacga cggctacctg attttcttcg tgcacgacga gaacaccggc 1500

aagtcggctg tgaacgtgat cgacgccaag accatgtccg ccgagcccgt tgccgtggtg 1560

gagctgccca agcgagtgcc ctacggcttc cacgccttct tcgtgactga ggagcagatc 1620

caggagcagg ctaagctgta a 1641

<210> 14

<211> 501

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> mig1t

<400> 14

cactggccgg tcgataattt aacgtgctga gctcagcaca cgcattgccc attggctgta 60

tatagatgaa tgtaatgata ccgtaagaga atgagagcac ggtattgtat tacaggggat 120

taagtacaca ttacttggag ttctgtacca gaagacacta ctatacatgg tattacttac 180

attagagtcg gtgaccgtat tcgtctcgta tagacataat attttcctac cccacattgt 240

tcctgggcct tcggagcaca tctacagtga gtgactgttt cagttgagct tgaggggtta 300

agtaagtggg ggaagggttt gcgattctga aaaagagcat gactaatctc tctgtggagg 360

agcaatgaag tcacgtgatg caatcatacc ggtgtatcgg atctgcctgg gtgtctgatt 420

actaatcatt tactcacctg ttttccccag ctatctcatc catctcagag cctcggccca 480

gccttcggcc cttttgggtt t 501

<210> 15

<211> 601

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> rDNAdown

<400> 15

attagtgacg cgcatgaatg gattaacgag attcccactg tccctatcta ctatgtagcg 60

aaaccacagc caagggaacg ggcttggcag aatcagcggg gaaagaagac cctgttgagc 120

ttgactctag tttgacattg tgaagagaca tagggggtgt agaataagtg ggagcttcgg 180

cgccggtgaa ataccactac ccttatcgtt tctttactta tttagtaagt ggaagtggtt 240

taacaaccat tttctagcat tcctttccag gctgaagaca ttgtcaggtg gggagtttgg 300

ctggggcggc acatctgtta aaagataacg cagatgtcct aagggggact caatgagaac 360

agaaatctca tgtagaacaa aagggtaaaa gtccccttga ttttgatttt cagtgtgaat 420

acaaaccatg aaagtgtggc ctatcgatcc tttagttgtt cggagtttga acctagaggt 480

gccagaaaag ttaccacagg gataactggc ttgtggcagt caagcgttca tagcgacatt 540

gctttttgat ccttcgatgt cggctcttcc tatcataccg aaggcggccg cacgcgtgaa 600

t 601

<210> 16

<211> 6611

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> pCAS1yl-rDNA1

<400> 16

ggagtaacta tgctctctta gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60

cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt ggccggcatg gtcccagcct 120

cctcgctggc gccggctggg caacatgctt cggcatggcg aatgggacca ctggccggtc 180

gataatttaa cgtgctgagc tcagcacacg cattgcccat tggctgtata tagatgaatg 240

taatgatacc gtaagagaat gagagcacgg tattgtatta caggggatta agtacacatt 300

acttggagtt ctgtaccaga agacactact atacatggta tcacttacat tagagtcggt 360

gaccgtattc gtctcgtata gacataatat tttcctaccc cacattgttc ctgggccttc 420

ggagcacatc tacagtgagt gactgtttca gttgagcttg aggggttaag taagtggggg 480

aagggtttgc gattctgaaa aagagcatga ctaatctctc tgtggaggag caatgaagtc 540

acgtgatgca atcataccgg tgtatcggat ctgcctgggt gtctgattac taatcattta 600

ctcacctgtt ttccccagct atctcatcca tctcagagcc tcggcccagc cttcggccct 660

tttgggtttg tcgacagaga ccgggttggc ggcgtatttg tgtcccaaaa aacagcccca 720

attgccccaa ttgaccccaa attgacccag tagcgggccc aaccccggcg agagccccct 780

tcaccccaca tatcaaacct cccccggttc ccacacttgc cgttaagggc gtagggtact 840

gcagtctgga atctacgctt gttcagactt tgtactagtt tctttgtctg gccatccggg 900

taacccatgc cggacgcaaa atagactact gaaaattttt ttgctttgtg gttgggactt 960

tagccaaggg tataaaagac caccgtcccc gaattacctt tcctcttctt ttctctctct 1020

ccttgtcaac tcacacccga aatcgttaag catttccttc tgagtataag aatcattcaa 1080

aatggtgagt ttcagaggca gcagcaattg ccacgggctt tgagcacacg gccgggtgtg 1140

gtcccattcc catcgacaca agacgccacg tcatccgacc agcacttttt gcagtactaa 1200

ccgcaggaca agaagtactc cattgggctc gatatcggca caaacagcgt cggctgggcc 1260

gtcattacgg acgagtacaa ggtgccgagc aaaaaattca aagttctggg caataccgat 1320

cgccacagca taaagaagaa cctcattggc gccctcctgt tcgactccgg ggagacggcc 1380

gaagccacgc ggctcaaaag aacagcacgg cgcagatata cccgcagaaa gaatcggatc 1440

tgctacctgc aggagatctt tagtaatgag atggctaagg tggatgactc tttcttccat 1500

aggctggagg agtccttttt ggtggaggag gataaaaagc acgagcgcca cccaatcttt 1560

ggcaatatcg tggacgaggt ggcgtaccat gaaaagtacc caaccatata tcatctgagg 1620

aagaagcttg tagacagtac tgataaggct gacttgcggt tgatctatct cgcgctggcg 1680

catatgatca aatttcgggg acacttcctc atcgaggggg acctgaaccc agacaacagc 1740

gatgttgaca aactctttat ccaactggtt cagacttaca atcagctttt cgaagagaac 1800

ccgatcaacg catccggagt tgacgccaaa gcaatcctga gcgctaggct gtccaaatcc 1860

cggcggctcg aaaacctcat cgcacagctc cctggggaga agaagaacgg cctgtttggt 1920

aatcttatcg ccctgtcact cgggctgacc cccaacttta aatctaactt cgacctggcc 1980

gaagatgcca agcttcaact gagcaaagac acctacgatg atgatctcga caatctgctg 2040

gcccagatcg gcgaccagta cgcagacctt tttttggcgg caaagaacct gtcagacgcc 2100

attctgctga gtgatattct gcgagtgaac acggagatca ccaaagctcc gctgagcgct 2160

agtatgatca agcgctatga tgagcaccac caagacttga ctttgctgaa ggcccttgtc 2220

agacagcaac tgcctgagaa gtacaaggaa attttcttcg atcagtctaa aaatggctac 2280

gccggataca ttgacggcgg agcaagccag gaggaatttt acaaatttat taagcccatc 2340

ttggaaaaaa tggacggcac cgaggagctg ctggtaaagc ttaacagaga agatctgttg 2400

cgcaaacagc gcactttcga caatggaagc atcccccacc agattcacct gggcgaactg 2460

cacgctatcc tcaggcggca agaggatttc tacccctttt tgaaagataa cagggaaaag 2520

attgagaaaa tcctcacatt tcggataccc tactatgtag gccccctcgc ccggggaaat 2580

tccagattcg cgtggatgac tcgcaaatca gaagagacca tcactccctg gaacttcgag 2640

gaagtcgtgg ataagggggc ctctgcccag tccttcatcg aaaggatgac taactttgat 2700

aaaaatctgc ctaacgaaaa ggtgcttcct aaacactctc tgctgtacga gtacttcaca 2760

gtttataacg agctcaccaa ggtcaaatac gtcacagaag ggatgagaaa gccagcattc 2820

ctgtctggag agcagaagaa agctatcgtg gacctcctct tcaagacgaa ccggaaagtt 2880

accgtgaaac agctcaaaga agactatttc aaaaagattg aatgtttcga ctctgttgaa 2940

atcagcggag tggaggatcg cttcaacgca tccctgggaa cgtatcacga tctcctgaaa 3000

atcattaaag acaaggactt cctggacaat gaggagaacg aggacattct tgaggacatt 3060

gtcctcaccc ttacgttgtt tgaagatagg gagatgattg aagaacgctt gaaaacttac 3120

gctcatctct tcgacgacaa agtcatgaaa cagctcaaga ggcgccgata tacaggatgg 3180

gggcggctgt caagaaaact gatcaatggg atccgagaca agcagagtgg aaagacaatc 3240

ctggattttc ttaagtccga tggatttgcc aaccggaact tcatgcagtt gatccatgat 3300

gactctctca cctttaagga ggacatccag aaagcacaag tttctggcca gggggacagt 3360

cttcacgagc acatcgctaa tcttgcaggt agcccagcta tcaaaaaggg aatactgcag 3420

accgttaagg tcgtggatga actcgtcaaa gtaatgggaa ggcataagcc cgagaatatc 3480

gttatcgaga tggcccgaga gaaccaaact acccagaagg gacagaagaa cagtagggaa 3540

aggatgaaga ggattgaaga gggtataaaa gaactggggt cccaaatcct taaggaacac 3600

ccagttgaaa acacccagct tcagaatgag aagctctacc tgtactacct gcagaacggc 3660

agggacatgt acgtggatca ggaactggac atcaatcggc tctccgacta cgacgtggat 3720

catatcgtgc cccagtcttt tctcaaagat gattctattg ataataaagt gttgacaaga 3780

tccgataaaa atagagggaa gagtgataac gtcccctcag aagaagttgt caagaaaatg 3840

aaaaattatt ggcggcagct gctgaacgcc aaactgatca cacaacggaa gttcgataat 3900

ctgactaagg ctgaacgagg tggcctgtct gagttggata aagccggctt catcaaaagg 3960

cagcttgttg agacacgcca gatcaccaag cacgtggccc aaattctcga ttcacgcatg 4020

aacaccaagt acgatgaaaa tgacaaactg attcgagagg tgaaagttat tactctgaag 4080

tctaagctgg tctcagattt cagaaaggac tttcagtttt ataaggtgag agagatcaac 4140

aattaccacc atgcgcatga tgcctacctg aatgcagtgg taggcactgc acttatcaaa 4200

aaatatccca agcttgaatc tgaatttgtt tacggagact ataaagtgta cgatgttagg 4260

aaaatgatcg caaagtctga gcaggaaata ggcaaggcca ccgctaagta cttcttttac 4320

agcaatatta tgaatttttt caagaccgag attacactgg ccaatggaga gattcggaag 4380

cgaccactta tcgaaacaaa cggagaaaca ggagaaatcg tgtgggacaa gggtagggat 4440

ttcgcgacag tccggaaggt cctgtccatg ccgcaggtga acatcgttaa aaagaccgaa 4500

gtacagaccg gaggcttctc caaggaaagt atcctcccga aaaggaacag cgacaagctg 4560

atcgcacgca aaaaagattg ggaccccaag aaatacggcg gattcgattc tcctacagtc 4620

gcttacagtg tactggttgt ggccaaagtg gagaaaggga agtctaaaaa actcaaaagc 4680

gtcaaggaac tgctgggcat cacaatcatg gagcgatcaa gcttcgaaaa aaaccccatc 4740

gactttctcg aggcgaaagg atataaagag gtcaaaaaag acctcatcat taagcttccc 4800

aagtactctc tctttgagct tgaaaacggc cggaaacgaa tgctcgctag tgcgggcgag 4860

ctgcagaaag gtaacgagct ggcactgccc tctaaatacg ttaatttctt gtatctggcc 4920

agccactatg aaaagctcaa agggtctccc gaagataatg agcagaagca gctgttcgtg 4980

gaacaacaca aacactacct tgatgagatc atcgagcaaa taagcgaatt ctccaaaaga 5040

gtgatcctcg ccgacgctaa cctcgataag gtgctttctg cttacaataa gcacagggat 5100

aagcccatca gggagcaggc agaaaacatt atccacttgt ttactctgac caacttgggc 5160

gcgcctgcag ccttcaagta cttcgacacc accatagaca gaaagcggta cacctctaca 5220

aaggaggtcc tggacgccac actgattcat cagtcaatta cggggctcta tgaaacaaga 5280

atcgacctct ctcagctcgg tggagacagc agggctgacc ccaagaagaa gaggaaggtg 5340

tgattttgga cctcgagtca ttggacctcg agtcatgtaa ttagttatgt cacgcttaca 5400

ttcacgccct ccccccacat ccgctctaac cgaaaaggaa ggagttagac aacctgaagt 5460

ctaggtccct atttattttt ttatagttat gttagtatta agaacgttat ttatatttca 5520

aatttttctt ttttttctgt acagacgcgt cgggggggcc gatccccctt tcatcaaatt 5580

tagggatgcc atcaactttc agttcataat taatatctta ccaaattagg taatctgcaa 5640

aagttcagac tgtgaaatgt aacattttat atatcaagct ctatttaacg cctcacagta 5700

gttaacataa agagatacag aattgtcgtg tcagtgtata ctatccatgt gtatactctg 5760

gatatccatt tgtattccat tatctacgaa aagcgggtac cgagctcgaa ttcactggcc 5820

gtcgttttac aacgtcgtga ctgggaaaac cctggcgtta cccaacttaa tcgccttgca 5880

gcacatcccc ctttcgccag ctggcgtaat agcgaagagg cccgcaccga tcgcccttcc 5940

caacagttgc gcagcctgaa tggcgaatgg cgcctgatgc ggtattttct ccttacgcat 6000

ctgtgcggta tttcacaccg catatggtgc actctcagta caatctgctc tgatgccgca 6060

tagttaagcc agccccgaca cccgccaaca cccgctgacg cgccctgacg ggcttgtctg 6120

ctcccggcat ccgcttacag acaagctgtg accgtctccg ggagctgcat gtgtcagagg 6180

ttttcaccgt catcaccgaa acgcgcgaga cgaaagggcc agatctgttc ggaaatcaac 6240

ggatgctcaa ccgatttcga cagtaataat ttgaatcgaa tcggagccta aaatgaaccc 6300

gagtatatct cataaaattc tcggtgagag gtctgtgact gtcagtacaa ggtgccttca 6360

ttatgccctc aaccttacca tacctcactg aatgtagtgt acctctaaaa atgaaataca 6420

gtgccaaaag ccatggcact gagctcgtct aacggacttg atatacaacc aattaaaaca 6480

aatgaaaaga aatacagttc tttgtatcat ttgtaacaat taccctgtac aaactaaggt 6540

attgaaatcc cacaatattc ccaaagtcca cccctttcca aattgtcatg cctacaactc 6600

atataccaag c 6611

<210> 17

<211> 5354

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> pCAS1yl-rDNA2

<400> 17

acaactcata taccaagcac taacctacca aacaccacta aaaccccaca aaatatatct 60

taccgaatat acagtaacaa gctaccacca cactcgttgg gtgcagtcgc cagcttaaag 120

atatctatcc acatcagcca caactccctt cctttaataa accgactaca cccttggcta 180

ttgaggttat gagtgaatat actgtagaca agacactttc aagaagactg tttccaaaac 240

gtaccactgt cctccactac aaacacaccc aatctgcttc ttctagtcaa ggttgctaca 300

ccggtaaatt ataaatcatc atttcattag cagggcaggg ccctttttat agagtcttat 360

acactagcgg accctgccgg tagaccaacc cgcaggcgcg tcagtttgct ccttccatca 420

atgcgtcgta gaaacgactt actccttctt gagcagctcc ttgaccttgt tggcaacaag 480

tctccgacct cggaggtgga ggaagagcct ccgatatcgg cggtagtgat accagcctcg 540

acggactcct tgacggcagc ctcaacagcg tcaccggcgg gcttcatgtt aagagagaac 600

ttgagcatca tggcggcaga cagaatggtg gcaatggggt tgaccttctg cttgccgaga 660

tcgggggcag atccgtgaca gggctcgtac agaccgaacg cctcgttggt gtcgggcaga 720

gaagccagag aggcggaggg cagcagaccc agagaaccgg ggatgacgga ggcctcgtcg 780

gagatgatat cgccaaacat gttggtggtg atgatgatac cattcatctt ggagggctgc 840

ttgatgagga tcatggcggc cgagtcgatc agctggtggt tgagctcgag ctgggggaat 900

tcgtccttga ggactcgagt gacagtcttt cgccaaagtc gagaggaggc cagcacgttg 960

gccttgtcaa gagaccacac gggaagaggg gggttgtgct gaagggccag gaaggcggcc 1020

attcgggcaa ttcgctcaac ctcaggaacg gagtaggtct cggtgtcgga agcgacgcca 1080

gatccgtcat cctcctttcg ctctccaaag tagatacctc cgacgagctc tcggacaatg 1140

atgaagtcgg tgccctcaac gtttcggatg ggggagagat cggcgagctt gggcgacagc 1200

agctggcagg gtcgcaggtt ggcgtacagg ttcaggtcct ttcgcagctt gaggagaccc 1260

tgctcgggtc gcacgtcggt tcgtccgtcg ggagtggtcc atacggtgtt ggcagcgcct 1320

ccgacagcac cgagcataat agagtcagcc tttcggcaga tgtcgagagt agcgtcggtg 1380

atgggctcgc cctccttctc aatggcagct cctccaatga gtcggtcctc aaacacaaac 1440

tcggtgccgg aggcctcagc aacagacttg agcaccttga cggcctcggc aatcacctcg 1500

gggccacaga agtcgccgcc gagaagaaca atcttcttgg agtcagtctt ggtcttctta 1560

gtttcgggtt ccattgtgga tgtgtgtggt tgtatgtgtg atgtggtgtg tggagtgaaa 1620

atctgtggct ggcaaacgct cttgtatata tacgcacttt tgcccgtgct atgtggaaga 1680

ctaaacctcc gaagattgtg actcaggtag tgcggtatcg gctagggacc caaaccttgt 1740

cgatgccgat agcgctatcg aacgtacccc agccggccgg gagtatgtcg gaggggacat 1800

acgagatcgt caagggtttg tggccaactg gtaaataaat gatgactcag gcgacgacgg 1860

aattcgacag caactactcc tttcaccaac catgtgcatt ttagctcgaa taacattcac 1920

aggcttggtg atctacatcc atggtgtctg gccgattacc gtggtgtttt ggcagtaacg 1980

agaatattga gtgaactctt cccatcacca ataaagactc atactacaat cacgagcgct 2040

tcagctgcca ctatagtgtt ggtgacacaa tacccctcga tgctgggcat tactgtagca 2100

agagatattc atttcatggc gcattttcca gtctacctga ctttttagtg ccgatttctt 2160

ctccacattt tacgctcagt gtgaaaagtt ggagtgcaca cttaattatc gccggttttc 2220

ggaaaagtac tatgtgctca aggttgcacc ccacgttacg tatgcagcac attgagcagc 2280

ctttggaccg tggagataac ggtgtggaga tagcaacggg tagtcttcgt aataagcaat 2340

gcattgttag ttttatatga tatggtgtcg aagcggccgc atactactgt atattcaagc 2400

aagtatatcc gtgggtgcgg gtgatttgga tctaaggttc gtactcaaca ctcacgagca 2460

gcttgcctat gttacatcct tttatcagac atagcggccg cttcgactct agaggatctg 2520

ggcctcgtga tacgcctatt tttataggtt aatgtcatga taataatggt ttcttagacg 2580

tcaggtggca cttttcgggg aaatgtgcgc ggaaccccta tttgtttatt tttctaaata 2640

cattcaaata tgtatccgct catgagacaa taaccctgat aaatgcttca ataatattga 2700

aaaaggaaga gtatgagtat tcaacatttc cgtgtcgccc ttattccctt ttttgcggca 2760

ttttgccttc ctgtttttgc tcacccagaa acgctggtga aagtaaaaga tgctgaagat 2820

cagttgggtg cacgagtggg ttacatcgaa ctggatctca acagcggtaa gatccttgag 2880

agttttcgcc ccgaagaacg ttttccaatg atgagcactt ttaaagttct gctatgtggc 2940

gcggtattat cccgtattga cgccgggcaa gagcaactcg gtcgccgcat acactattct 3000

cagaatgact tggttgagta ctcaccagtc acagaaaagc atcttacgga tggcatgaca 3060

gtaagagaat tatgcagtgc tgccataacc atgagtgata acactgcggc caacttactt 3120

ctgacaacga tcggaggacc gaaggagcta accgcttttt tgcacaacat gggggatcat 3180

gtaactcgcc ttgatcgttg ggaaccggag ctgaatgaag ccataccaaa cgacgagcgt 3240

gacaccacga tgcctgtagc aatggcaaca acgttgcgca aactattaac tggcgaacta 3300

cttactctag cttcccggca acaattaata gactggatgg aggcggataa agttgcagga 3360

ccacttctgc gctcggccct tccggctggc tggtttattg ctgataaatc tggagccggt 3420

gagcgtgggt ctcgcggtat cattgcagca ctggggccag atggtaagcc ctcccgtatc 3480

gtagttatct acacgacggg gagtcaggca actatggatg aacgaaatag acagatcgct 3540

gagataggtg cctcactgat taagcattgg taactgtcag accaagttta ctcatatata 3600

ctttagattg atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa gatccttttt 3660

gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc 3720

gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg 3780

caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact 3840

ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg 3900

tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg 3960

ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac 4020

tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca 4080

cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagcattga 4140

gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc 4200

ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct 4260

gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg 4320

agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct 4380

tttgctcaca tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc 4440

tttgagtgag ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc 4500

gaggaagcgg aagagcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat 4560

taatgcagct ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg caacgcaatt 4620

aatgtgagtt agctcactca ttaggcaccc caggctttac actttatgct tccggctcgt 4680

atgttgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagcta tgaccatgat 4740

tacgccaagc ttgtttaaac agagaccggg ttggcggcgt atttgtgtcc caaaaaacag 4800

ccccaattgc cccaattgac cccaaattga cccagtagcg ggcccaaccc cggcgagagc 4860

ccccttcacc ccacatatca aacctccccc ggttcccaca cttgccgtta agggcgtagg 4920

gtactgcagt ctggaatcta cgcttgttca gactttgtac tagtttcttt gtctggccat 4980

ccgggtaacc catgccggac gcaaaataga ctactgaaaa tttttttgct ttgtggttgg 5040

gactttagcc aagggtataa aagaccaccg tccccgaatt acctttcctc ttcttttctc 5100

tctctccttg tcaactcaca cccgaaatcg ttaagcattt ccttctgagt ataagaatca 5160

ttcaaaatgg tgagtttcag aggcagcagc aattgccacg ggctttgagc acacggccgg 5220

gtgtggtccc attcccatcg acacaagacg ccacgtcatc cgaccagcac tttttgcagt 5280

actaaccgca gtccagtctg atgagtccgt gaggacgaaa cgagtaagct cgtcggagta 5340

actatgctct ctta 5354

<210> 18

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> rDNAu-F

<400> 18

gctatgacca tgattacgcc acgcgtgcgg ccgcatcgat cctaaggggt ggcat 55

<210> 19

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> rDNAu-R

<400> 19

ccactggaag atccgttgaa tttcttcact ttgacattc 39

<210> 20

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> hisG-F

<400> 20

gccaacccgg tctctggggc tgttccagtc aatcaggg 38

<210> 21

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Ura3-R

<400> 21

ccccctcaag gaacttgctc ttaa 24

<210> 22

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Ura3-F

<400> 22

gaagaaaccg tgcttaagag caagt 25

<210> 23

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> hisG-R

<400> 23

agtgaagaaa ttcaacggat cttccagtgg tgcatgaa 38

<210> 24

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> TEF1p-F

<400> 24

gactggaaca gccccagaga ccgggttggc ggcgta 36

<210> 25

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> TEF1p-R

<400> 25

cttcttggac attttgaatg attcttatac tcagaa 36

<210> 26

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CarB-F

<400> 26

agaatcattc aaaatgtcca agaagcacat cgt 33

<210> 27

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CarB-R

<400> 27

acgtggggac aggtcaaatc acgttagagt tatg 34

<210> 28

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> XPR2t-F

<400> 28

aacgtgattt gacctgtccc cacgttgccg g 31

<210> 29

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> XPR2t-R

<400> 29

aaaaaacggg cgccaaactc tcggacacgg gcatctcact 40

<210> 30

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> EXP1p-F

<400> 30

agtgagatgc ccgtgtccga gagtttggcg cccgtttttt 40

<210> 31

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> EXP1p-R

<400> 31

aggtcagcag cattgctgta gatatgtctt gtg 33

<210> 32

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CarRP-F

<400> 32

atatctacag caatgctgct gacctacatg ga 32

<210> 33

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CarRP-R

<400> 33

agtgataaat agcttagatg gtgttcaggt ttc 33

<210> 34

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Lip2t-F

<400> 34

aacaccatct aagctattta tcactcttta caac 34

<210> 35

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Lip2t-R

<400> 35

gtgcaggaca tcctactgcg cctccacctg tgtcaatctt 40

<210> 36

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GPD2p-F

<400> 36

aagattgaca caggtggagg cgcagtagga tgtcctgc 38

<210> 37

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GPD2p-R

<400> 37

cctttctacc cattgttgat gtgtgtttaa ttca 34

<210> 38

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CCD1-F

<400> 38

cacacatcaa caatgggtag aaaggagtct gac 33

<210> 39

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CCD1-R

<400> 39

gaccggccag tgttacagct tagcctgctc ct 32

<210> 40

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> mig1t-F

<400> 40

ggctaagctg taacactggc cggtcgataa ttta 34

<210> 41

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> mig1t-R

<400> 41

cgaggcattt ggctaaaacc caaaagggcc gaaggctg 38

<210> 42

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> rDNAd-F

<400> 42

ggcccttttg ggttttagcc aaatgcctcg tcatcta 37

<210> 43

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> rDNAd-R

<400> 43

aaacgacggc cagtgaattc acgcgtgcgg ccgccttcgg tatgatagga agagc 55

<210> 44

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> rDNA-sgRNA-F

<400> 44

ggagtaacta tgctctctta gttttagagc tagaaatagc a 41

<210> 45

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> sgRNA-R

<400> 45

gcttggtata tgagttgtag g 21

<210> 46

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> sgRNA-F

<400> 46

acaactcata taccaagcac t 21

<210> 47

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> rDNA-sgRNA-R

<400> 47

taagagagca tagttactcc gacgagctta ctcgtttcgt 40

Claims (10)

1.一种产β-紫罗兰酮基因工程菌的构建方法，其特征在于包括以下步骤：

1)构建基因表达模块，所述基因表达模块包括β-紫罗兰酮生产相关的基因、所述β-紫罗兰酮生产相关的基因上游的启动子和所述β-紫罗兰酮生产相关的基因下游的终止子；

2)构建CRISPR/cas9操作载体，包括导向染色体整合位点的sgRNA转录模块、cas9蛋白表达模块和筛选标记；

3)将步骤1)所述基因表达模块和步骤2)所述CRISPR/cas9操作载体共转化至解脂耶氏酵母中，获得产β-紫罗兰酮基因工程菌。

2.根据权利要求1所述的产β-紫罗兰酮基因工程菌的构建方法，其特征在于：

步骤1)中所述的基因表达模块还包括rDNA基因整合上下游同源臂、可丢失的筛选标记基因表达盒。

3.根据权利要求2所述的产β-紫罗兰酮基因工程菌的构建方法，其特征在于：

步骤1)中所述的构建基因表达模块包括以下步骤：

1.1通过PCR扩增获得所述β-紫罗兰酮生产相关的基因、所述β-紫罗兰酮生产相关的基因上游的启动子片段、所述β-紫罗兰酮生产相关的基因下游的终止子片段，所述rDNA基因整合上下游同源臂、所述可丢失的筛选标记基因表达盒；

1.2将所述β-紫罗兰酮生产相关的基因、所述β-紫罗兰酮生产相关的基因上游的启动子片段、所述β-紫罗兰酮生产相关的基因下游的终止子片段、所述rDNA基因整合上下游同源臂、所述筛选标记基因表达盒和筛选标记丢失模块片段分别通过gibson assembly组装法进行组装获得基因表达模块。

4.根据权利要求1～3任一项所述的产β-紫罗兰酮基因工程菌的构建方法，其特征在于：

步骤1)中所述β-紫罗兰酮生产相关的基因为CarB，CarRP，CCD1。

5.根据权利要求1～3任一项所述的产β-紫罗兰酮基因工程菌的构建方法，其特征在于：

步骤1)中所述启动子选自TEF1p，EXP1p，GPD2p；

步骤1)所述终止子选自XPR2t，LIP2t，MIG1t。

6.根据权利要求3所述的产β-紫罗兰酮基因工程菌的构建方法，其特征在于：

所述筛选标记基因为Ura3；

所述筛选标记丢失模块为hisG-hisG。

7.根据权利要求1所述的产β-紫罗兰酮基因工程菌的构建方法，其特征在于：

步骤2)中所述的构建CRISPR/cas9操作载体包括以下步骤：

通过在线设计染色体整合位点的sgRNA靶序列，将sgRNA靶序列引入到引物中，通过PCR的方法，将sgRNA靶序列引入到CRISPR/cas9操作载体上。

8.根据权利要求1或8所述的产β-紫罗兰酮基因工程菌的构建方法，其特征在于：

步骤2)中所述载体以pCAS1yl为出发载体；

所述染色体整合位点为染色体上的非必需基因位点；

所述的sgRNA靶序列为SEQ ID NO：2；

所述的sgRNA序列如SEQ ID NO：1。

9.一种产β-紫罗兰酮基因工程菌，其特征在于通过权利要求1～8任一项所述的构建方法构建得到。

10.权利要求9所述的产β-紫罗兰酮基因工程菌在发酵生产β-紫罗兰酮中的应用。