CN110628806A - 一种高产β-紫罗兰酮基因工程菌及其构建方法和应用 - Google Patents

一种高产β-紫罗兰酮基因工程菌及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种高产β‑紫罗兰酮基因工程菌及其构建方法和应用，属于微生物发酵领域。该方法是通过强化MVA途经和引入磷酸转酮酶途径以提高胞浆中乙酰辅酶A的供应量及其萜类化合物合成通路的代谢流从而成功构建得到高产β‑紫罗兰酮基因工程菌。按照本发明的方法获得的基因工程菌在常规发酵条件下都可以生产得到β‑紫罗兰酮，摇瓶发酵产量可达约358mg/L，3L发酵罐产量可达约0.98g/L，接近产业化水平。本发明可利用简单培养基发酵生产香料β‑紫罗兰酮，可实现多基因一次性高效转化与整合，可明显缩短工程菌构建时间，所得工程菌可利用葡萄糖、甘油等简单碳源进行香料β‑紫罗兰酮的发酵生产，具有良好的工业应用前景。

Description

一种高产β-紫罗兰酮基因工程菌及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于微生物发酵领域，具体地说，是关于一种高产β-紫罗兰酮基因工程菌及其构建方法和应用。
背景技术
紫罗兰酮是一种高级香料，是调香中不可或缺的重要的原香料，用途广，需求量大。紫罗兰酮的分子式为C13H20O，根据双键位置的不同，可将紫罗兰酮划分为α体，β体和γ体3种同分异构体，而自然界中多以α体，β体这两种异构的混合形式存在，其中β-紫罗兰酮是用于高档级精细日用化妆品的调香剂和增香剂，也是医药工业上合成维生素A的重要原料。在食品行业中，紫罗兰酮常用作高档食品、饮料的增香剂，是中国GB2760-2011规定允许使用的食用香料，主要用以配制龙眼、树莓、黑莓、樱桃、柑橘等香精，全球年需求量达近万吨。由于国内目前的生产工艺限制，缺口超过1000吨，特别是医药级的，基本全靠进口。产品的市场潜力大，也急需高效的高产方法。
目前生产β-紫罗兰酮(β-Ionone)的方法主要有化学合成。化学合成法是以柠檬醛和丙酮为原料，经缩合、环化、分离提纯得到的。国外由于原材料的缺乏，主要侧重利用石油化工产品为原料进行合成。而我国的山苍子油年产量已达2000吨，而从山苍子油中可直接提取获得柠檬醛，故我国主要改用该方法进行β-紫罗兰酮的工业合成。但该方法具有总回收率低(仅为40％～45％)、工艺较为复杂、合成周期较长等缺点。相对来讲，生物发酵法生产β-紫罗兰酮在一定程度上克服了化学合成法的缺点，具有生产工艺简单、成本低、产品质量好等优点。
β-紫罗兰酮生物体内合成是以β-类胡萝卜素为前体，在类胡萝卜素裂解双加氧酶的催化下合成的。目前发现许多微生物都具有生产类胡萝卜素的能力，而且由解脂耶氏酵母出发构建的工程菌株已经实现了β-类胡萝卜素的高产[CN201210525553.X，CN201410243227.9]。然而，关于β-紫罗兰酮生物异源合成的报道非常少。Congqiang Zhang等人在大肠杆菌(非GRAS菌株)中通过引入外源MVA途径和表达优化，最终在发酵罐水平获得了500mg/L的β-紫罗兰酮.[Congqiang Zhang et al.A “plug-n-play”modularmetabolic system for the production of apocarotenoids.BiotechnolBioeng.2018Jan；115(1):174-183.doi:10.1002/bit.26462]；Jeffrey J.Czajka等人在解脂耶氏酵母中通过引入β-紫罗兰酮合成途径和代谢优化，最终在发酵罐水平获得了380mg/L的β-紫罗兰酮。由于代谢调控机理及宿主本身的限制，β-紫罗兰酮的目前的产量距商业化应用还有一定的距离。
解脂耶氏酵母是一种一般安全(Generally recognized as safe，GRAS)的微生物，主要分布在富含脂肪和蛋白质的环境中，因其在脂类和萜类合成上的优势而引起越来越多的研究兴趣。目前，由解脂耶氏酵母工程菌生产的DHA和EPA两种功能性脂类产品已在杜邦公司实现了商业化生产[WO2012027689]。还有更多的产品正走向工业生产规模的水平，如萜类化合物胡萝卜素的产量已经达4.5g/L的水平[CN201410243227.9]，而且帝斯曼公司也开始利用解脂耶氏酵母进行冷杉醇的合成[WO2016094178]。证明了解脂耶氏酵母在异源表达萜类化合物上有一定的优势，有望开发用于多种萜类香料的合成。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种高产β-紫罗兰酮基因工程菌的构建方法。该方法是通过强化MVA途经和引入磷酸转酮酶途径以提高胞浆中乙酰辅酶A的供应量及其萜类化合物合成通路的代谢流从而成功构建得到高产β-紫罗兰酮基因工程菌。
本发明的另一目的在于提供通过上述构建方法获得的高产β-紫罗兰酮基因工程菌。
本发明的再一目的在于提供上述高产β-紫罗兰酮基因工程菌的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
本发明提供的一种高产β-紫罗兰酮基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：
1)构建基因表达模块，所述基因表达模块包括β-紫罗兰酮生产相关的基因、所述β-紫罗兰酮生产相关的基因上游的启动子和所述β-紫罗兰酮生产相关的基因下游的终止子；
2)构建酵母MVA途径相关基因表达模块，所述相关基因表达模块包括解脂耶氏酵母MVA途径9个相关基因、所述MVA途径9个相关基因上游的启动子和所述MVA途径9个相关基因下游的终止子；
3)构建磷酸转酮酶途径表达模块，所述磷酸转酮酶途径表达模块包括磷酸转酮酶途径相关的基因、所述磷酸转酮酶途径相关的基因上游的启动子和所述磷酸转酮酶途径相关的基因下游的终止子；
4)构建CRISPR/cas9操作载体，包括导向染色体整合位点的sgRNA转录模块、cas9蛋白表达模块和筛选标记；
5)将步骤1)所述基因表达模块、步骤2)所述酵母MVA途径相关基因表达模块或步骤3)磷酸转酮酶途径表达模块分步与步骤4)相应的所述CRISPR/cas9操作载体共转化至201810695855.9中构建的产β-紫罗兰酮基因工程菌中，经多轮基因工程操作，获得高产β-紫罗兰酮基因工程菌。
根据本发明，步骤1)中所述的基因表达模块还包括如：ku70基因整合位点上下游同源臂、可丢失的筛选标记基因表达盒。
根据本发明，步骤1)中所述的构建基因表达模块包括以下步骤：
1.1通过PCR扩增获得所述β-紫罗兰酮生产相关的基因、所述β-紫罗兰酮生产相关的基因上游的启动子片段、所述β-紫罗兰酮生产相关的基因下游的终止子片段，所述ku70基因整合位点上下游同源臂、所述可丢失的筛选标记基因表达盒；
1.2将所述β-紫罗兰酮生产相关的基因、所述β-紫罗兰酮生产相关的基因上游的启动子片段、所述β-紫罗兰酮生产相关的基因下游的终止子片段、所述ku70基因整合位点上下游同源臂、所述可丢失的筛选标记基因表达盒片段分别通过gibson assembly组装法进行组装获得基因表达模块。
根据本发明的优选实施例，步骤1)中所述β-紫罗兰酮生产相关的基因为CarB，CarRP，CCD1。
根据本发明的优选实施例，所述CarB和CarRP来源于卷枝毛霉菌，CCD1来源于矮牵牛。
根据本发明的优选实施例，步骤1)中所述启动子选自TEF1p，EXP1p，GPD2p。
根据本发明的优选实施例，所述启动子来源于解脂耶氏酵母。
根据本发明的优选实施例，步骤1)所述终止子选自xpr2t，lip2t，mig1t。
根据本发明的优选实施例，所述终止子来源于解脂耶氏酵母。
根据本发明，步骤2)中所述的酵母MVA途径相关基因表达模块还包括如：ku80、D17、lip1、POX3、POX5基因整合位点上下游同源臂、可丢失的筛选标记基因表达盒。
根据本发明，步骤2)中所述的构建酵母MVA途径相关基因表达模块包括以下步骤：
2.1通过PCR扩增获得所述酵母MVA途径相关的9个基因、所述酵母MVA途径相关的9个基因上游的启动子片段、所述酵母MVA途径相关的9个基因下游的终止子片段，所述ku80、D17、lip1、POX3、POX5基因整合位点上下游同源臂、所述可丢失的筛选标记基因表达盒；
2.2将所述酵母MVA途径相关的9个基因、所述酵母MVA途径相关的9个基因上游的启动子片段、所述酵母MVA途径相关的9个基因下游的终止子片段，所述ku80、D17、lip1、POX3、POX5基因整合位点上下游同源臂、所述可丢失的筛选标记基因表达盒分别通过gibson assembly组装法进行组装获得酵母MVA途径相关基因表达模块。
步骤2)中所述酵母MVA途径相关的9个基因为GGS1，tHMG1，ERG8，ERG10，ERG12，ERG13，ERG19，ERG20，IDI。
根据本发明的优选实施例，所述GGS1，tHMG1，ERG8，ERG10，ERG12，ERG13，ERG19，ERG20，IDI来源于解脂耶氏酵母。
根据本发明的优选实施例，步骤2)中所述启动子选自TEF1p，EXP1p，GPD2p。
根据本发明的优选实施例，所述启动子来源于解脂耶氏酵母。
根据本发明的优选实施例，步骤2)所述终止子选自xpr2t，lip2t，erg8t，erg10t，erg12t，erg13t，erg19t，erg20t，idit。
根据本发明的优选实施例，所述终止子来源于解脂耶氏酵母。
根据本发明，步骤3)中所述的磷酸转酮酶途径表达模块还包括如：XPR2基因整合位点上下游同源臂、可丢失的筛选标记基因表达盒。
根据本发明，步骤3)中所述的构建磷酸转酮酶途径表达模块包括以下步骤：
3.1通过PCR扩增获得所述磷酸转酮酶途径相关的基因、所述磷酸转酮酶途径相关的基因上游的启动子片段、所述磷酸转酮酶途径相关的基因下游的终止子片段，所述XPR2基因整合位点上下游同源臂、所述可丢失的筛选标记基因表达盒；
3.2将所述磷酸转酮酶途径相关的基因、所述磷酸转酮酶途径相关的基因上游的启动子片段、所述磷酸转酮酶途径相关的基因下游的终止子片段，所述XPR2基因整合位点上下游同源臂、所述可丢失的筛选标记基因表达盒分别通过gibson assembly组装法进行组装获得磷酸转酮酶途径表达模块。
步骤3)中所述的磷酸转酮酶途径相关的基因为PK(磷酸转酮酶基因)和PTA(磷酸转乙酰酶基因)。
根据本发明的优选实施例，所述PK来源于两岐双岐杆菌，PTA来源于枯草芽孢杆菌。
根据本发明的优选实施例，步骤3)中所述启动子选自TEF1p，GPD2p。
根据本发明的优选实施例，所述启动子来源于解脂耶氏酵母。
根据本发明的优选实施例，步骤3)所述终止子选自xpr2t，mig1t。
根据本发明的优选实施例，所述终止子来源于解脂耶氏酵母。
根据本发明的优选实施例，所述可丢失的筛选标记基因表达盒包括筛选标记基因表达盒和筛选标记丢失模块；
根据本发明的优选实施例，所述筛选标记基因为Ura3。
根据本发明的优选实施例，所述筛选标记基因来源于解脂耶氏酵母。
根据本发明的优选实施例，所述筛选标记丢失模块为hisG-hisG。
根据本发明的优选实施例，所述筛选标记丢失模块来源为pNKY51质粒(ADDGENE编号：14839)。
根据本发明，步骤4)中所述的构建CRISPR/cas9操作载体包括以下步骤：
通过在线设计染色体整合位点的sgRNA靶序列，将sgRNA靶序列引入到引物中，通过PCR的方法，将sgRNA靶序列引入到CRISPR/cas9操作载体上。
根据本发明的优选实施例，步骤4)中所述载体以pCAS1yl为出发载体。
根据本发明的优选实施例，所述sgRNA靶序列设计网站为：http://e-crisp-test.dkfz.de/E-CRISP/designcrispr.html。
根据本发明的优选实施例，所述染色体整合位点可以为染色体上的非必需基因位点，优选ku70、ku80、D17、lip1、POX3、POX5、XPR2位点。
优选的，所述的ku70位点的sgRNA靶序列为AACTCTTCATAAGGCCTTGGAGG，SEQ IDNO：1；
所述的ku80位点的sgRNA靶序列为TCCTAGCCAGAACAACCTTCAGG，SEQ ID NO：2；
所述的D17位点的sgRNA靶序列为TCCGTAATATAGGTGACGACAGG，SEQ ID NO：3；
所述的lip1位点的sgRNA靶序列为GCTCGGCAACCAGGAATGGAAGG，SEQ ID NO：4；
所述的POX3位点的sgRNA靶序列为CCCTTGTACCGGTAGCTAATAGG，SEQ ID NO：5；
所述的POX5位点的sgRNA靶序列为CCTCTGACTTCACCCTATCCAGG，SEQ ID NO：6；
所述的XPR2位点的sgRNA靶序列为GCTGGACTCTCTGGTCGACGAGG，SEQ ID NO：7；
其中，下划线部分为PAM位点。
优选的，所述的sgRNA序列如201810695855.9中序列表的SEQ ID NO：1所示。
一种高产β-紫罗兰酮基因工程菌，通过上述构建方法构建得到。
优选的，所述的高产β-紫罗兰酮基因工程菌，名称为解脂耶罗维亚酵母(Yarrowialipolytica)YLBI3118，其保藏信息：保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期：2019年07月23日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC NO：18286。
根据本发明，通过上述构建方法构建得到的高产β-紫罗兰酮基因工程菌在常规发酵条件下都可以生产得到β-紫罗兰酮。
优选的，本发明选用YPDm作为培养基，在发酵罐中采用连续补料的批次发酵方法，并控制较高溶氧。
具体包括如下步骤：
将高产β-紫罗兰酮基因工程菌的过夜培养种子液接种至初始培养基YPDm，初始OD600值控制为0.2，初始体积为1.2L，有机相为正十二烷(10％V/V)，温度为20℃，转速为400rpm，pH控制为5.5；当溶氧下降到20～22％时，以20mL/hour流加250mL的10×YPDm，当溶氧下降至12～18％(优选为15％)，通过溶氧转速联动控制溶氧的稳定，流加结束后以0.1ml/min的速度补加600g/L葡萄糖，发酵培养16～18d(优选为17d)。
所述的高产β-紫罗兰酮基因工程菌在发酵生产β-紫罗兰酮中的应用，尤其可应用于利用多种碳源为底物发酵生产β-紫罗兰酮。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明以解脂耶氏酵母为底盘细胞，将β-紫罗兰酮表达模块(约14.5kb)线性化后转入解脂耶氏酵母体内并整合到设计的染色体整合位点位置，具有简单快速高效的优点，2～3周即可获得大片段整合工程菌株，明显缩短工程菌构建周期。并在此工程菌株的基础上，将MVA途径中9个相关基因整合至其染色体相关位点，以增强甲羟戊酸代谢途径代谢强度，进一步增强β-紫罗兰酮产量；
(2)本发明以(1)中所获工程菌为基础，将磷酸转酮酶途径(PK-PTA途径)整合至XPR2位点，该途径可以在细胞质将通过两步反应将F6P转化为乙酰辅酶A，提高碳原子利用率和乙酰辅酶A产量，以提高胞质中乙酰辅酶A的供应量，进一步提高β-紫罗兰酮产量；最终获得高产β-紫罗兰酮的基因工程菌株。按照本发明的方法获得的基因工程菌的β-紫罗兰酮的摇瓶发酵产量可达到约358mg/L，3L发酵罐产量可达到约0.98g/L，接近商业化生产水平，具有良好的工业应用前景。
(3)本发明可利用简单培养基发酵生产香料β-紫罗兰酮，可实现多基因一次性高效转化与整合，可明显缩短工程菌构建时间，所得工程菌可利用葡萄糖、甘油等简单碳源进行香料β-紫罗兰酮的发酵生产，有较好的应用前景。
附图说明
图1是β-紫罗兰酮在解脂耶氏酵母体内的合成途径示意图。
图2是整合在ku70位点的β-紫罗兰酮基因表达模块的组装顺序示意图，其中，HUH表示hisG-Ura3-hisG。
图3是酵母MVA途径相关基因表达模块的组装顺序示意图，其中，A为整合在ku80位点的GGS1整合片段组装顺序示意图，B为整合在D17位点的tHMG1整合片段组装顺序示意图，C为整合在lip1位点的ERG10-ERG13整合片段组装顺序示意图，D为整合在POX3位点的IDI-ERG20整合片段组装顺序示意图，E图为整合在POX5位点的ERG8-ERG12-ERG19整合片段组装顺序示意图；HUH表示hisG-Ura3-hisG。
图4是整合在XPR2位点的磷酸转酮酶途径表达模块示意图，该模块共有一个整合片段，HUH表示hisG-Ura3-hisG。
图5是CRISPR/cas9操作载体pCAS1yl-ku70的示意图，可根据实际需求通过引物设计替换为ku80、D17、lip1、POX3、POX5、XPR2。
图6是整合了MVA途径相关基因和磷酸转酮酶途径相关基因的工程菌的PCR鉴定结果图，其中，图中标注为1、2、3、4、5、6分别代表6个不同单克隆子，各基因部分序列扩增结果如图6中标注。
图7是β-紫罗兰酮工程菌摇瓶及发酵罐发酵的产量图；其中，A为β-紫罗兰酮基因工程菌以不同碳源为底物摇瓶发酵产量结果；B图为β-紫罗兰酮基因工程菌以不同氮源为底物摇瓶发酵产量结果；C为3L发酵罐发酵的产量结果；mg/L表示每L发酵液中的β-紫罗兰酮含量；mg/g DCW表示每g细胞干重(DCW)中的β-紫罗兰酮含量。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂商所建议的实验条件。
β-紫罗兰酮在解脂耶氏酵母体内的合成途径示意图，如图1所示。
实施例1实验方案及引物设计
本实施例的实验方案设计如下：
在专利“201810695855.9、一种产β-紫罗兰酮基因工程菌及其构建方法与应用”中公开的产β-紫罗兰酮基因工程菌的基础上，以Ura3基因作为筛选标记，选择酵母染色体非必需基因位点作为整合位点，通过整合过表达与甲羟戊酸(MVA)途径相关的9个基因以及再整合一个β-紫罗兰酮表达盒，并同时引入能在胞浆中通过两步反应将果糖-6-磷酸转化生成乙酰辅酶A的磷酸转酮酶途径，以提高原工程菌中β-紫罗兰酮的产量。各基因模块的组装顺序如图2～4所示。CRISPR/cas9操作载体，以pCAS1yl(ADDGENE编号73226)为出发载体，构建如图5所示。
利用gibson assembly的方法构建以下基因表达模块和CRISPR/cas9操作载体：
ku70up-TEF1p-CarB-xpr2t-EXP1p-CarRP，lip2t-GPD2p-CCD1-mig1t，hisG-Ura3-hisG-ku70down；D17up-hisG-Ura3-hisG，EXP1p-tHMG1-lip2t-D17down；ku80up-hisG-Ura3-hisG，TEF1p-GGS1-xpr2t-ku80down；lip1up-TEF1p-ERG10-erg10t，GPD2p-ERG13-erg13t，hisG-Ura3-hisG-lip1down；POX3up-EXP1p-IDI-idit，TEF1p-ERG20-erg20t，hisG-Ura3-hisG-POX3down；POX5up-EXP1p-ERG8-erg8t，TEF1p-ERG12-erg12t，GPD2p-ERG19-erg19t，hisG-Ura3-hisG-POX5down；XPR2up-hisG-Ura3-hisG，GPD2p-B.b PK-mig1t，TEF1p-B.c PTA-xpr2t-XPR2down；pCAS1yl-ku70-1，pCAS1yl-ku70-2；pCAS1yl-ku80-1，pCAS1yl-ku80-2；pCAS1yl-D17-1，pCAS1yl-D17-2；pCAS1yl-lip1-1，pCAS1yl-lip1-2；pCAS1yl-pox3-1，pCAS1yl-pox3-2；pCAS1yl-pox5-1，pCAS1yl-pox5-2；pCAS1yl-XPR2-1，pCAS1yl-XPR2-2。各DNA片段信息如表1所示：
表1各DNA片段信息
其中，表1中的启动子TEF1p的序列如201810695855.9中序列表的SEQ ID NO：6所示，启动子EXP1p的序列如201810695855.9中序列表的SEQ ID NO：9所示，启动子GPD2p的序列如201810695855.9中序列表的SEQ ID NO：12所示；终止子xpr2t的序列如201810695855.9中序列表的SEQ ID NO：8所示，终止子lip2t的序列如201810695855.9中序列表的SEQ ID NO：11所示，终止子mig1t的序列如201810695855.9中序列表的SEQ ID NO：14所示；hisG-Ura3-hisG的序列是201810695855.9中序列表的SEQ ID NO：4与SEQ ID NO：5组装得到，长度为4230bp。
pCAS1yl-ku70-1的序列如SEQ ID NO：10所示，可根据实际需求通过表2的引物替换为ku80、D17、lip1、POX3、POX5、XPR2，分别得到pCAS1yl-ku80-1、pCAS1yl-D17-1、pCAS1yl-lip1-1、pCAS1yl-POX3-1、pCAS1yl-POX5-1、pCAS1yl-XPR2-1的序列；
pCAS1yl-ku70-2的序列如SEQ ID NO：11所示，可根据实际需求通过表2的引物替换为ku80、D17、lip1、POX3、POX5、XPR2，分别得到pCAS1yl-ku80-2、pCAS1yl-D17-2、pCAS1yl-lip1-2、pCAS1yl-POX3-2、pCAS1yl-POX5-2、pCAS1yl-XPR2-2的序列；
按照gibson assembly组装的技术要求，使用Oligo6设计PCR引物序列用于扩增以上各DNA片段，引物序列如表2所示。
表2引物序列
实施例2基因工程菌的构建
2.1基因的获得：
β-紫罗兰酮合成基因选择来源于卷枝毛霉菌的CarB，CarRP和来源于矮牵牛的CCD1，经密码子优化，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；参照201810695855.9中实施例2的步骤2.1，分别扩增获得CarB，CarRP，CCD1基因片段；其序列分别如201810695855.9中序列表的SEQ ID NO：7、10、13所示。
MVA途径相关基因选择来源于解脂耶氏酵母内源基因，利用表2中的引物，以酵母基因组为模板，分别扩增获得GGS1(CP028451.1：2084792-2085775)，tHMG1(CP028452.1：571078-572577)[该基因在使用时需在标注中的序列5′端添加起始密码子ATG]，ERG8(CP028452.1：746796-748052)，ERG10(CP028449.1：1141697-1143297)，ERG12(CP028449.1：2082357-2083706)，ERG13(CP028453.1：3780129-3781469)，ERG19(CP028459.1：814770-815933)，ERG20(CP028452.1：672034-673068)，IDI(CP028459.1：584544-585356)基因片段。
磷酸转酮酶途径相关基因选择来源于两岐双岐杆菌的PK(记为B.b PK)和来源于枯草芽孢杆菌的PTA(记为B.c PTA)，经密码子优化，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；利用表2中的引物，分别扩增获得PK和PTA基因片段。其序列分别如SEQ ID NO：8、9所示。
表1中的整合位点片段ku70up(CP028450.1：1161989-1162774))、ku70down(CP028450.1:1161089-1161838)、ku80up(CP028452.1：250546-251257)、ku80down(CP028452.1：251492-252275)、D17up(CP017556.1：2136781-2137777)、D17down(CP017556.1：2137804-2138693)、lip1up(CP028453.1：1337171-1338184)、lip1down(CP028453.1：1339278-1340365)、POX3up(CP017558.1：3274887-3275787)、POX3down(CP017558.1：3277388-3278291)、POX5up(CP017558.1：3286007-3287003)、POX5down(CP017558.1：3288682-3289700)、XPR2up(CP017558.1：3949231-3950223)，XPR2down(CP017558.1：3948204-3949167)，均来源于解脂耶氏酵母。
表1中的终止子erg8t(CP028452.1：746517-746795)、erg10t(CP028458.1：1351217-1351623)、erg12t(CP028449.1：2083707-2084123)、erg13t(CP028453.1：3781470-3781902)、erg19t(CP028453.1：819934-820310)、erg20t(CP017557.1：674471-674873)、idit(CP028459.1：584190-584543)，均来源于解脂耶氏酵母。
2.2酵母基因组DNA的提取
解脂耶氏酵母po1f(解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica po1f，购至YEASTERNBIOTECH公司，还在专利“201810695855.9、一种产β-紫罗兰酮基因工程菌及其构建方法与应用”中公开)基因组的提取方法如下：从新鲜复苏的平板中挑取单克隆菌落接于5mL YPD液体培养基试管，28℃，250rpm，培养24小时，收集1mL菌液，使用酵母基因组提取试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司)提取基因组。
质粒的提取方法如下：接种含有相应质粒的DH5α菌于5mL LB液体培养基，其中含有氨苄青霉素终浓度为50μg/mL，37℃，220rpm，过夜培养约14小时，使用质粒提取试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司)抽提质粒。
2.3表2所述DNA片段的PCR扩增
各DNA片段的PCR扩增均使用Q5高保真DNA聚合酶(购自New England Biolabs公司)，按照50μL PCR体系配制PCR扩增反应液(表3)。
表3PCR扩增反应液配制体系
成分 体积(μL)
5×Q5 Reaction Buffer 10
dNTPs(10mM) 2
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase 0.5
引物F(20μM) 1.25
引物R(20μM) 1.25
模板DNA 1ng
ddH<sub>2</sub>O 补齐至50
PCR程序设置参照说明书并根据引物Tm值设置退火温度值。
将PCR产物使用超薄DNA产物纯化试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司)纯化回收片段，-20℃保存备用。
2.4基因表达模块的构建
将2.3中获得的DNA片段通过gibson assembly组装方法构建以下各表达模块，ku70up-TEF1p-CarB-xpr2t-EXP1p-CarRP，lip2t-GPD2p-CCD1-mig1t，hisG-Ura3-hisG-ku70down，所采用的试剂为Gibson Assembly Master Mix(购自New England Biolabs公司)。在获得各表达模块后，再通过gibson assembly按顺序进行组装，构建β-紫罗兰酮表达模块：ku70up-TEF1p-CarB-xpr2t-EXP1p-CarRP-lip2t-GPD2p-CCD1-mig1t-hisG-Ura3-hisG-ku70down，简称为ku70up-carB-carRP-CCD1-HUH-ku70down，示意图如图2所示。构建得到的重组子通过PCR和测序验证正确。其中，以pUC19(ADDGENE编号：50005)为克隆载体。
2.5酵母MVA途径相关基因表达模块
将2.3中获得的DNA片段通过gibson assembly组装方法构建以下各表达模块，D17up-hisG-Ura3-hisG，EXP1p-tHMG1-lip2t-D17down；ku80up-hisG-Ura3-hisG，TEF1p-GGS1-xpr2t-ku80down；lip1up-TEF1p-ERG10-erg10t，GPD2p-ERG13-erg13t，hisG-Ura3-hisG-lip1down；POX3up-EXP1p-IDI-idit，TEF1p-ERG20-erg20t，hisG-Ura3-hisG-POX3down；POX5up-EXP1p-ERG8-erg8t，TEF1p-ERG12-erg12t，GPD2p-ERG19-erg19t，hisG-Ura3-hisG-POX5down。所采用的试剂为Gibson Assembly Master Mix(购自New EnglandBiolabs公司)。在获得各模块后，再通过gibson assembly按顺序进行组装，构建6个整合片段模块：ku80up-HUH-GGS1-ku80down(见图3A)；D17up-HUH-tHMG1-D17down(见图3B)；lip1up-ERG10-ERG13-HUH-lip1down(见图3C)；POX3up-IDI-ERG20-HUH-POX3down(见图3D)；POX5up-ERG8-ERG12-ERG19-HUH-POX5down(见图3E)。构建得到的重组子通过PCR和测序验证正确。其中，以pUC19(ADDGENE编号：50005)为克隆载体。
2.6构建磷酸转酮酶途径表达模块
将2.3中获得的DNA片段通过gibson assembly组装方法构建以下各表达模块，XPR2up-hisG-Ura3-hisG，GPD2p-B.b PK-mig1t，TEF1p-B.c PTA-xpr2t-XPR2down。所采用的试剂为GibsonAssembly Master Mix(购自New England Biolabs公司)。在获得各片段后，再通过gibson assembly按顺序进行组装，构建磷酸转酮酶途径表达模块：XPR2up-HUH-B.b PK-B.c PTA-XPR2down，示意图如图4所示。构建得到的重组子通过PCR和测序验证正确。其中，以pUC19(ADDGENE编号：50005)为克隆载体。
2.7CRISPR/cas9操作载体的构建
参照专利“201810695855.9、一种产β-紫罗兰酮基因工程菌及其构建方法与应用”中实施例2的步骤2.5，按相同方法构建获得pCAS1yl-ku70(如图5所示)、pCAS1yl-ku80、pCAS1yl-D17、pCAS1yl-lip1、pCAS1yl-POX3、pCAS1yl-POX5、pCAS1yl-XPR2。构建得到的重组子通过PCR和测序验证正确。
2.8基因表达模块和相应CRISPR/cas9操作载体共转化至产β-紫罗兰酮基因工程菌＝
采用化学转化方法将2.5中获得的酵母MVA途径相关基因表达模块ku80up-HUH-GGS1-ku80down和2.7中获得的CRISPR/cas9操作载体pCAS1yl-ku80转化至201810695855.9获得的产β-紫罗兰酮基因工程。
操作方法如下：挑取单克隆菌落接于10mL YPD液体培养基，28℃，250rpm，培养至OD600达到0.8～1.0，500×g，4min离心收集菌体，弃尽上清。按照酵母感受态细胞制备试剂盒(Frozen-EZ Yeast Transformation II，购自ZYMO公司)说明书步骤制得转化感受态细胞。取20μL感受态细胞并加入DNA片段400ng，按说明书步骤进行转化，涂布于缺尿嘧啶和亮氨酸的SD固体培养基，于28℃培养3～4天。
2.9鉴定
β-紫罗兰酮显微黄色，因此产β-紫罗兰酮的菌株会有颜色变化。在转化平板上挑选显微黄色的菌株，按2.2中的基因组提取方法提取基因组为PCR模板，并将上下游引物设计在启动子和各基因编码框区域，进行PCR扩增目的基因片段，经电泳分析，结果如图6所示，成功获得整个所有片段的β-紫罗兰酮工程菌株。
2.10Ura3抗性丢失
将含有hisG-Ura3-hisG筛选标记的整合子接种到5mL YPD液体培养基，30℃培养过夜，至OD600约1～2，用YPD稀释1000倍后取100μL涂布于含有1mg/mL 5-氟乳清酸的YPD固体平板上，30℃培养2～3天，挑取其中颜色较深的较大单克隆分别划线于SD和SD/△ura固体培养基中，获得Ura3成功丢失的菌株并进行菌落PCR鉴定筛选得到阳性整合子，进行下一阶段工程菌株的构建。
重复步骤2.8、2.9和2.10，将酵母MVA途径相关基因表达模块D17up-HUH-tHMG1-D17down和pCAS1yl-D17转化至2.9鉴定成功的菌株上，然后再将酵母MVA途径相关基因表达模块lip1up-ERG10-ERG13-HUH-lip1down与pCAS1yl-lip1，酵母MVA途径相关基因表达模块POX3up-IDI-ERG20-HUH-POX3down与pCAS1yl-POX3，酵母MVA途径相关基因表达模块POX5up-ERG8-ERG12-ERG19-HUH-POX5down与pCAS1yl-POX5，磷酸转酮酶途径表达模块XPR2up-HUH-PK-PTA-XPR2down与pCAS1yl-XPR2，β-紫罗兰酮表达模块ku70up-carB-carRP-CCD1-HUH-ku70down与pCAS1yl-ku70，依次转化至上一轮转化鉴定成功且URA3成功丢失的菌株上，最终获得高产β-紫罗兰酮基因工程菌，名称为解脂耶罗维亚酵母(Yarrowialipolytica)YLBI3118，其保藏信息：保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期：2019年07月23日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC NO：18286。
实施例3基因工程菌的发酵及β-紫罗兰酮的检测
3.1发酵
种子液培养方法如下：选取实施例2中最终构建的高产β-紫罗兰酮基因工程菌，挑选单克隆，接种到YPD培养液中(50mL/250mL锥形瓶)，28℃，250rpm，培养至OD600为3～5。
摇瓶发酵培养方法如下：将种子液接种到20mL YPD培养基中(50mL摇瓶)，初始OD600值为0.1，有机相为正十二烷(10％V/V)，20℃，250rpm，培养12天。
碳源选择葡萄糖(D-Glucose)，蔗糖(Sucrose)，淀粉(Starch)，甘油(Glycerol)，油酸(Oil Acid)，浓度为20g/L。
氮源选择tryptone(胰蛋白胨)和peptone(蛋白胨)。
当使用tryptone作为氮源时，培养基命名为YPDm，各成分浓度均与YPD保持一致。
发酵罐(3L)发酵培养方法如下：将过夜培养种子液接种至初始培养基YPDm，初始OD600值控制为0.2，初始体积为1.2L，有机相为正十二烷(10％V/V)，温度为20℃，转速为400rpm，pH控制为5.5。当溶氧下降到20％时，以20mL/hour流加250mL的10×YPDm，当溶氧下降至15％左右，通过溶氧转速联动控制溶氧的稳定，流加结束后以0.1ml/min的速度补加600g/L葡萄糖，定时取样，并制备样品。
3.2β-紫罗兰酮的检测
发酵结束后，小心吸取发酵液上层有机相，12000rpm离心5min，吸取1mL上清液至一新1.5mL离心管，经0.22μm滤头过滤至气相瓶，进行气相色谱检测。内参为异长叶烯(终浓度为200μM)。
气相色谱检测方法如下：
仪器型号：安捷伦7890A；
分析柱：DB-FFAP毛细管柱(60m×0.25mm id,0.25μm film thickness或J&WScientific,Agilent Technologies)；
进样量：1μL；
升温程序：80℃保持1min；以10℃/min上升到120℃，保持1min；再以10℃/min上升到240℃，保持18min；程序结束。
3.3β-胡萝卜素的检测
样品制备：离心收集一定量菌体于1.5mL EP管，用0.7mL DMSO重悬菌体，55℃温浴10分钟；再加入0.7mL丙酮，45℃温浴15分钟；12000rpm离心5分钟，吸取上清液经0.22μm滤头过滤至气相瓶，进行HPLC检测。
HPLC检测方法如下：
仪器：安捷伦1260高效液相色谱；检测器：紫外检测器；检测波长：450nm；流动相组成：甲醇：乙腈：二氯甲烷＝42：42：16；流速为1.0ml/min，温度为30℃，检测时间为16分钟。
3.3β-紫罗兰酮的产量测定
经过检测，通过以上步骤构建的基因工程菌在以葡萄糖为碳源，胰蛋白胨和酵母抽提物为氮源时，β-紫罗兰酮摇瓶产量可达358±25mg/L，发酵罐产量达0.98g/L。
产β-紫罗兰酮工程菌发酵产量如图7所示，其中，A为β-紫罗兰酮基因工程菌以不同碳源为底物摇瓶发酵产量结果；B为β-紫罗兰酮基因工程菌以不同氮源为底物摇瓶发酵产量结果；C为3L发酵罐发酵的产量结果。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南理工大学
<120> 一种高产β-紫罗兰酮基因工程菌及其构建方法和应用
<160> 127
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ku70位点的sgRNA靶序列
<400> 1
aactcttcat aaggccttgg agg 23
<223> ku80位点的sgRNA靶序列
<400> 2
tcctagccag aacaaccttc agg 23
<223> D17位点的sgRNA靶序列
<400> 3
tccgtaatat aggtgacgac agg 23
<223> lip1位点的sgRNA靶序列
<400> 4
gctcggcaac caggaatgga agg 23
<223> POX3位点的sgRNA靶序列
<400> 5
cccttgtacc ggtagctaat agg 23
<223> POX5位点的sgRNA靶序列
<400> 6
cctctgactt caccctatcc agg 23
<223> XPR2位点的sgRNA靶序列
<400> 7
gctggactct ctggtcgacg agg 23
<223> B. b PK
<400> 8
atgactagcc ccgtgatcgg cacaccctgg aagaagctga acgcccccgt ctctgaggag 60
tcccttgagg gcgttgacaa gtactggcga gttgctaact acctgtctat cggtcagatc 120
tacctccgat ctaaccccct gatgaaggcc cccttcaccc gagaggatgt gaagcaccga 180
ctggtgggcc actggggtac cactcccggt ctgaacttcc tcattggcca cattaaccga 240
ttcatcgctg accacggcca gaacaccgtc atcattatgg gccctggcca cggtggccct 300
gccggtactt cccagtccta cctggacggt acctacaccg agaccttccc caagatcacc 360
aaggacgagg ccggccttca gaagttcttc cgacagttct cataccctgg aggaatcccc 420
tcgcatttcg cccctgagac ccctggctcg atccacgagg gcggtgagct tggctacgcc 480
ctcagccacg cctacggcgc cattatggac aacccctcgc tgttcgtccc tgctattgtc 540
ggtgacggag aggccgagac cggccctctc gccacgggat ggcagtccaa caagctcgtc 600
aacccccgaa ccgacggaat cgtcctgccc atcctccacc tgaacggtta caagatcgct 660
aaccctacca tcctgtctcg aatctccgac gaggagctgc atgaattctt ccacggtatg 720
ggttacgagc cctacgagtt cgtcgccggt tttgacgacg aggaccacat gtccattcac 780
cgacgattcg ccgagctctg ggagaccatc tgggacgaga tctgcgacat taaggcagcc 840
gctcagactg acaacgttca tcggcccttc taccccatgc tgatctttcg gacccccaag 900
ggctggacct gtcctaagta cattgacggc aagaagaccg agggctcctg gcgagctcac 960
caggtgcccc tggcctccgc ccgagacact gaggcccact ttgaggttct caagaactgg 1020
ctggagtcgt acaagcctga ggaactgttt gacgccaacg gcgccgtgaa ggatgacgtc 1080
ctcgccttca tgcccaaggg tgagctccga atcggcgcta acccgaacgc taacggcggc 1140
gtcattcgag atgacctgaa gctgcccaac ctggaagact acgaggtgaa ggaggtcgct 1200
gagtacggtc atggatgggg ccagctggag gctacccgaa ccctcggcgc ctacacacgg 1260
gacatcatcc gaaacaaccc cagagacttc cgaattttcg gtcccgacga gaccgcctct 1320
aacagactcc aggccagcta cgaggtgacc aacaagcagt gggacgccgg ctacatttcc 1380
gatgaggtcg acgagcacat gcatgtctcc ggccaggtcg tggagcagct ctctgagcac 1440
cagatggagg gcttccttga ggcttacctt ctgaccggcc gacacggcat ttggtcctcc 1500
tacgagtcct tcgttcacgt gattgactcc atgctgaacc agcacgccaa gtggctcgag 1560
gccaccgtcc gggagatccc ttggcgaaag cccatcgcct ccatgaacct gctcgtgtcc 1620
tctcacgtct ggcgacagga ccacaacggt ttctctcacc aggaccccgg tgtgacctct 1680
gtccttctga acaagtgctt ccacaacgac cacgttatcg gcatctactt cgccactgac 1740
gctaacatgc tcctcgccat tgctgagaag tgctacaagt ccaccaataa gatcaacgct 1800
atcatcgccg gaaagcagcc tgctgccacc tggctcaccc tggacgaggc ccgagctgag 1860
ctggcaaagg gcgccgccgc ctgggactgg gcttctaccg ccaagaacaa cgacgaggcc 1920
gaggttgtcc tggccgccgc tggagacgtc cccacccagg agatcatggc cgcttcggac 1980
aagctgaagg agctcggcgt gaagttcaag gtcgtcaacg tcgctgacct gctgtccctg 2040
cagtctgcta aggagaacga cgaggccctg tccgacgagg agttcgccga cattttcacc 2100
gccgacaagc ccgtcctgtt cgcctaccac tcttacgccc acgacgtccg aggcctgatc 2160
tacgaccgac ccaaccacga caactttaac gtccacggtt acgaggagga gggctctacc 2220
accaccccct acgatatggt ccgagtgaac cgaatcgacc gatacgagct gaccgccgag 2280
gctctgcgaa tgatcgacgc tgacaagtac gccgacaaga tcgacgagct ggagaagttc 2340
cgagacgagg ccttccagtt cgccgtcgac aagggctacg accaccccga ctacactgac 2400
tgggtgtact ccggcgtgaa caccgacaag aagggcgccg tgaccgccac cgccgctacc 2460
gccggcgaca acgagtaa 2478
<223> B. c PTA
<400> 9
atggttgccg acctgttctc caccgtccag gagaaggtcg ccggcaagga cgtgaagatc 60
gtcttccccg agggcctgga cgagcgaatc ctggaggccg tctccaagct cgcaggcaac 120
aaggtcctga accccatcgt gattggcaac gagaacgaga tccaggccaa ggccaaggag 180
ctgaacctga ccctgggcgg cgtgaagatc tacgaccccc acacctacga gggcatggag 240
gatctggtgc aggccttcgt cgagcgacga aagggcaagg ccaccgagga gcaggcccga 300
aaggccctgc tggacgagaa ctacttcggt accatgctgg tctacaaggg cctggctgac 360
ggcctggtct ccggcgccgc ccactccacc gccgacaccg tgcgacccgc cctgcagatc 420
atcaagacca aggagggtgt gaagaagacc tccggtgtct tcatcatggc ccgaggcgag 480
gagcagtacg tcttcgccga ctgtgccatc aacatcgccc ccgactccca ggacctggcc 540
gagatcgcca ttgagtccgc caacaccgct aagatgttcg acatcgagcc ccgagttgcc 600
atgctctcct tctccaccaa gggctctgcc aagtccgacg agaccgagaa ggtggccgac 660
gccgtcaaga ttgccaagga gaaggccccc gagctgaccc tcgacggcga gttccagttc 720
gacgccgcct tcgtcccctc tgtcgccgag aagaaggccc ctgactccga gatcaagggc 780
gacgccaacg tcttcgtctt cccctccctc gaagccggca acatcggcta caagatcgct 840
cagcgactgg gaaactttga ggccgttggt cccattctgc agggactgaa catgcctgtt 900
aatgatctgt ctagaggttg taacgctgag gacgtttaca acctggctct gattaccgcc 960
gctcaggctc tgtaa 975
<223> pCAS1yl-ku70-1
<400> 10
gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt 60
ggcaccgagt cggtgctttt ggccggcatg gtcccagcct cctcgctggc gccggctggg 120
caacatgctt cggcatggcg aatgggacca ctggccggtc gataatttaa cgtgctgagc 180
tcagcacacg cattgcccat tggctgtata tagatgaatg taatgatacc gtaagagaat 240
gagagcacgg tattgtatta caggggatta agtacacatt acttggagtt ctgtaccaga 300
agacactact atacatggta tcacttacat tagagtcggt gaccgtattc gtctcgtata 360
gacataatat tttcctaccc cacattgttc ctgggccttc ggagcacatc tacagtgagt 420
gactgtttca gttgagcttg aggggttaag taagtggggg aagggtttgc gattctgaaa 480
aagagcatga ctaatctctc tgtggaggag caatgaagtc acgtgatgca atcataccgg 540
tgtatcggat ctgcctgggt gtctgattac taatcattta ctcacctgtt ttccccagct 600
atctcatcca tctcagagcc tcggcccagc cttcggccct tttgggtttg tcgacagaga 660
ccgggttggc ggcgtatttg tgtcccaaaa aacagcccca attgccccaa ttgaccccaa 720
attgacccag tagcgggccc aaccccggcg agagccccct tcaccccaca tatcaaacct 780
cccccggttc ccacacttgc cgttaagggc gtagggtact gcagtctgga atctacgctt 840
gttcagactt tgtactagtt tctttgtctg gccatccggg taacccatgc cggacgcaaa 900
atagactact gaaaattttt ttgctttgtg gttgggactt tagccaaggg tataaaagac 960
caccgtcccc gaattacctt tcctcttctt ttctctctct ccttgtcaac tcacacccga 1020
aatcgttaag catttccttc tgagtataag aatcattcaa aatggtgagt ttcagaggca 1080
gcagcaattg ccacgggctt tgagcacacg gccgggtgtg gtcccattcc catcgacaca 1140
agacgccacg tcatccgacc agcacttttt gcagtactaa ccgcaggaca agaagtactc 1200
cattgggctc gatatcggca caaacagcgt cggctgggcc gtcattacgg acgagtacaa 1260
ggtgccgagc aaaaaattca aagttctggg caataccgat cgccacagca taaagaagaa 1320
cctcattggc gccctcctgt tcgactccgg ggagacggcc gaagccacgc ggctcaaaag 1380
aacagcacgg cgcagatata cccgcagaaa gaatcggatc tgctacctgc aggagatctt 1440
tagtaatgag atggctaagg tggatgactc tttcttccat aggctggagg agtccttttt 1500
ggtggaggag gataaaaagc acgagcgcca cccaatcttt ggcaatatcg tggacgaggt 1560
ggcgtaccat gaaaagtacc caaccatata tcatctgagg aagaagcttg tagacagtac 1620
tgataaggct gacttgcggt tgatctatct cgcgctggcg catatgatca aatttcgggg 1680
acacttcctc atcgaggggg acctgaaccc agacaacagc gatgttgaca aactctttat 1740
ccaactggtt cagacttaca atcagctttt cgaagagaac ccgatcaacg catccggagt 1800
tgacgccaaa gcaatcctga gcgctaggct gtccaaatcc cggcggctcg aaaacctcat 1860
cgcacagctc cctggggaga agaagaacgg cctgtttggt aatcttatcg ccctgtcact 1920
cgggctgacc cccaacttta aatctaactt cgacctggcc gaagatgcca agcttcaact 1980
gagcaaagac acctacgatg atgatctcga caatctgctg gcccagatcg gcgaccagta 2040
cgcagacctt tttttggcgg caaagaacct gtcagacgcc attctgctga gtgatattct 2100
gcgagtgaac acggagatca ccaaagctcc gctgagcgct agtatgatca agcgctatga 2160
tgagcaccac caagacttga ctttgctgaa ggcccttgtc agacagcaac tgcctgagaa 2220
gtacaaggaa attttcttcg atcagtctaa aaatggctac gccggataca ttgacggcgg 2280
agcaagccag gaggaatttt acaaatttat taagcccatc ttggaaaaaa tggacggcac 2340
cgaggagctg ctggtaaagc ttaacagaga agatctgttg cgcaaacagc gcactttcga 2400
caatggaagc atcccccacc agattcacct gggcgaactg cacgctatcc tcaggcggca 2460
agaggatttc tacccctttt tgaaagataa cagggaaaag attgagaaaa tcctcacatt 2520
tcggataccc tactatgtag gccccctcgc ccggggaaat tccagattcg cgtggatgac 2580
tcgcaaatca gaagagacca tcactccctg gaacttcgag gaagtcgtgg ataagggggc 2640
ctctgcccag tccttcatcg aaaggatgac taactttgat aaaaatctgc ctaacgaaaa 2700
ggtgcttcct aaacactctc tgctgtacga gtacttcaca gtttataacg agctcaccaa 2760
ggtcaaatac gtcacagaag ggatgagaaa gccagcattc ctgtctggag agcagaagaa 2820
agctatcgtg gacctcctct tcaagacgaa ccggaaagtt accgtgaaac agctcaaaga 2880
agactatttc aaaaagattg aatgtttcga ctctgttgaa atcagcggag tggaggatcg 2940
cttcaacgca tccctgggaa cgtatcacga tctcctgaaa atcattaaag acaaggactt 3000
cctggacaat gaggagaacg aggacattct tgaggacatt gtcctcaccc ttacgttgtt 3060
tgaagatagg gagatgattg aagaacgctt gaaaacttac gctcatctct tcgacgacaa 3120
agtcatgaaa cagctcaaga ggcgccgata tacaggatgg gggcggctgt caagaaaact 3180
gatcaatggg atccgagaca agcagagtgg aaagacaatc ctggattttc ttaagtccga 3240
tggatttgcc aaccggaact tcatgcagtt gatccatgat gactctctca cctttaagga 3300
ggacatccag aaagcacaag tttctggcca gggggacagt cttcacgagc acatcgctaa 3360
tcttgcaggt agcccagcta tcaaaaaggg aatactgcag accgttaagg tcgtggatga 3420
actcgtcaaa gtaatgggaa ggcataagcc cgagaatatc gttatcgaga tggcccgaga 3480
gaaccaaact acccagaagg gacagaagaa cagtagggaa aggatgaaga ggattgaaga 3540
gggtataaaa gaactggggt cccaaatcct taaggaacac ccagttgaaa acacccagct 3600
tcagaatgag aagctctacc tgtactacct gcagaacggc agggacatgt acgtggatca 3660
ggaactggac atcaatcggc tctccgacta cgacgtggat catatcgtgc cccagtcttt 3720
tctcaaagat gattctattg ataataaagt gttgacaaga tccgataaaa atagagggaa 3780
gagtgataac gtcccctcag aagaagttgt caagaaaatg aaaaattatt ggcggcagct 3840
gctgaacgcc aaactgatca cacaacggaa gttcgataat ctgactaagg ctgaacgagg 3900
tggcctgtct gagttggata aagccggctt catcaaaagg cagcttgttg agacacgcca 3960
gatcaccaag cacgtggccc aaattctcga ttcacgcatg aacaccaagt acgatgaaaa 4020
tgacaaactg attcgagagg tgaaagttat tactctgaag tctaagctgg tctcagattt 4080
cagaaaggac tttcagtttt ataaggtgag agagatcaac aattaccacc atgcgcatga 4140
tgcctacctg aatgcagtgg taggcactgc acttatcaaa aaatatccca agcttgaatc 4200
tgaatttgtt tacggagact ataaagtgta cgatgttagg aaaatgatcg caaagtctga 4260
gcaggaaata ggcaaggcca ccgctaagta cttcttttac agcaatatta tgaatttttt 4320
caagaccgag attacactgg ccaatggaga gattcggaag cgaccactta tcgaaacaaa 4380
cggagaaaca ggagaaatcg tgtgggacaa gggtagggat ttcgcgacag tccggaaggt 4440
cctgtccatg ccgcaggtga acatcgttaa aaagaccgaa gtacagaccg gaggcttctc 4500
caaggaaagt atcctcccga aaaggaacag cgacaagctg atcgcacgca aaaaagattg 4560
ggaccccaag aaatacggcg gattcgattc tcctacagtc gcttacagtg tactggttgt 4620
ggccaaagtg gagaaaggga agtctaaaaa actcaaaagc gtcaaggaac tgctgggcat 4680
cacaatcatg gagcgatcaa gcttcgaaaa aaaccccatc gactttctcg aggcgaaagg 4740
atataaagag gtcaaaaaag acctcatcat taagcttccc aagtactctc tctttgagct 4800
tgaaaacggc cggaaacgaa tgctcgctag tgcgggcgag ctgcagaaag gtaacgagct 4860
ggcactgccc tctaaatacg ttaatttctt gtatctggcc agccactatg aaaagctcaa 4920
agggtctccc gaagataatg agcagaagca gctgttcgtg gaacaacaca aacactacct 4980
tgatgagatc atcgagcaaa taagcgaatt ctccaaaaga gtgatcctcg ccgacgctaa 5040
cctcgataag gtgctttctg cttacaataa gcacagggat aagcccatca gggagcaggc 5100
agaaaacatt atccacttgt ttactctgac caacttgggc gcgcctgcag ccttcaagta 5160
cttcgacacc accatagaca gaaagcggta cacctctaca aaggaggtcc tggacgccac 5220
actgattcat cagtcaatta cggggctcta tgaaacaaga atcgacctct ctcagctcgg 5280
tggagacagc agggctgacc ccaagaagaa gaggaaggtg tgattttgga cctcgagtca 5340
ttggacctcg agtcatgtaa ttagttatgt cacgcttaca ttcacgccct ccccccacat 5400
ccgctctaac cgaaaaggaa ggagttagac aacctgaagt ctaggtccct atttattttt 5460
ttatagttat gttagtatta agaacgttat ttatatttca aatttttctt ttttttctgt 5520
acagacgcgt cgggggggcc gatccccctt tcatcaaatt tagggatgcc atcaactttc 5580
agttcataat taatatctta ccaaattagg taatctgcaa aagttcagac tgtgaaatgt 5640
aacattttat atatcaagct ctatttaacg cctcacagta gttaacataa agagatacag 5700
aattgtcgtg tcagtgtata ctatccatgt gtatactctg gatatccatt tgtattccat 5760
tatctacgaa aagcgggtac cgagctcgaa ttcactggcc gtcgttttac aacgtcgtga 5820
ctgggaaaac cctggcgtta cccaacttaa tcgccttgca gcacatcccc ctttcgccag 5880
ctggcgtaat agcgaagagg cccgcaccga tcgcccttcc caacagttgc gcagcctgaa 5940
tggcgaatgg cgcctgatgc ggtattttct ccttacgcat ctgtgcggta tttcacaccg 6000
catatggtgc actctcagta caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agccccgaca 6060
cccgccaaca cccgctgacg cgccctgacg ggcttgtctg ctcccggcat ccgcttacag 6120
acaagctgtg accgtctccg ggagctgcat gtgtcagagg ttttcaccgt catcaccgaa 6180
acgcgcgaga cgaaagggcc agatctgttc ggaaatcaac ggatgctcaa ccgatttcga 6240
cagtaataat ttgaatcgaa tcggagccta aaatgaaccc gagtatatct cataaaattc 6300
tcggtgagag gtctgtgact gtcagtacaa ggtgccttca ttatgccctc aaccttacca 6360
tacctcactg aatgtagtgt acctctaaaa atgaaataca gtgccaaaag ccatggcact 6420
gagctcgtct aacggacttg atatacaacc aattaaaaca aatgaaaaga aatacagttc 6480
tttgtatcat ttgtaacaat taccctgtac aaactaaggt attgaaatcc cacaatattc 6540
ccaaagtcca cccctttcca aattgtcatg cctacaactc atataccaag c 6591
<223> pCAS1yl-ku70-2
<400> 11
acaactcata taccaagcac taacctacca aacaccacta aaaccccaca aaatatatct 60
taccgaatat acagtaacaa gctaccacca cactcgttgg gtgcagtcgc cagcttaaag 120
atatctatcc acatcagcca caactccctt cctttaataa accgactaca cccttggcta 180
ttgaggttat gagtgaatat actgtagaca agacactttc aagaagactg tttccaaaac 240
gtaccactgt cctccactac aaacacaccc aatctgcttc ttctagtcaa ggttgctaca 300
ccggtaaatt ataaatcatc atttcattag cagggcaggg ccctttttat agagtcttat 360
acactagcgg accctgccgg tagaccaacc cgcaggcgcg tcagtttgct ccttccatca 420
atgcgtcgta gaaacgactt actccttctt gagcagctcc ttgaccttgt tggcaacaag 480
tctccgacct cggaggtgga ggaagagcct ccgatatcgg cggtagtgat accagcctcg 540
acggactcct tgacggcagc ctcaacagcg tcaccggcgg gcttcatgtt aagagagaac 600
ttgagcatca tggcggcaga cagaatggtg gcaatggggt tgaccttctg cttgccgaga 660
tcgggggcag atccgtgaca gggctcgtac agaccgaacg cctcgttggt gtcgggcaga 720
gaagccagag aggcggaggg cagcagaccc agagaaccgg ggatgacgga ggcctcgtcg 780
gagatgatat cgccaaacat gttggtggtg atgatgatac cattcatctt ggagggctgc 840
ttgatgagga tcatggcggc cgagtcgatc agctggtggt tgagctcgag ctgggggaat 900
tcgtccttga ggactcgagt gacagtcttt cgccaaagtc gagaggaggc cagcacgttg 960
gccttgtcaa gagaccacac gggaagaggg gggttgtgct gaagggccag gaaggcggcc 1020
attcgggcaa ttcgctcaac ctcaggaacg gagtaggtct cggtgtcgga agcgacgcca 1080
gatccgtcat cctcctttcg ctctccaaag tagatacctc cgacgagctc tcggacaatg 1140
atgaagtcgg tgccctcaac gtttcggatg ggggagagat cggcgagctt gggcgacagc 1200
agctggcagg gtcgcaggtt ggcgtacagg ttcaggtcct ttcgcagctt gaggagaccc 1260
tgctcgggtc gcacgtcggt tcgtccgtcg ggagtggtcc atacggtgtt ggcagcgcct 1320
ccgacagcac cgagcataat agagtcagcc tttcggcaga tgtcgagagt agcgtcggtg 1380
atgggctcgc cctccttctc aatggcagct cctccaatga gtcggtcctc aaacacaaac 1440
tcggtgccgg aggcctcagc aacagacttg agcaccttga cggcctcggc aatcacctcg 1500
gggccacaga agtcgccgcc gagaagaaca atcttcttgg agtcagtctt ggtcttctta 1560
gtttcgggtt ccattgtgga tgtgtgtggt tgtatgtgtg atgtggtgtg tggagtgaaa 1620
atctgtggct ggcaaacgct cttgtatata tacgcacttt tgcccgtgct atgtggaaga 1680
ctaaacctcc gaagattgtg actcaggtag tgcggtatcg gctagggacc caaaccttgt 1740
cgatgccgat agcgctatcg aacgtacccc agccggccgg gagtatgtcg gaggggacat 1800
acgagatcgt caagggtttg tggccaactg gtaaataaat gatgactcag gcgacgacgg 1860
aattcgacag caactactcc tttcaccaac catgtgcatt ttagctcgaa taacattcac 1920
aggcttggtg atctacatcc atggtgtctg gccgattacc gtggtgtttt ggcagtaacg 1980
agaatattga gtgaactctt cccatcacca ataaagactc atactacaat cacgagcgct 2040
tcagctgcca ctatagtgtt ggtgacacaa tacccctcga tgctgggcat tactgtagca 2100
agagatattc atttcatggc gcattttcca gtctacctga ctttttagtg ccgatttctt 2160
ctccacattt tacgctcagt gtgaaaagtt ggagtgcaca cttaattatc gccggttttc 2220
ggaaaagtac tatgtgctca aggttgcacc ccacgttacg tatgcagcac attgagcagc 2280
ctttggaccg tggagataac ggtgtggaga tagcaacggg tagtcttcgt aataagcaat 2340
gcattgttag ttttatatga tatggtgtcg aagcggccgc atactactgt atattcaagc 2400
aagtatatcc gtgggtgcgg gtgatttgga tctaaggttc gtactcaaca ctcacgagca 2460
gcttgcctat gttacatcct tttatcagac atagcggccg cttcgactct agaggatctg 2520
ggcctcgtga tacgcctatt tttataggtt aatgtcatga taataatggt ttcttagacg 2580
tcaggtggca cttttcgggg aaatgtgcgc ggaaccccta tttgtttatt tttctaaata 2640
cattcaaata tgtatccgct catgagacaa taaccctgat aaatgcttca ataatattga 2700
aaaaggaaga gtatgagtat tcaacatttc cgtgtcgccc ttattccctt ttttgcggca 2760
ttttgccttc ctgtttttgc tcacccagaa acgctggtga aagtaaaaga tgctgaagat 2820
cagttgggtg cacgagtggg ttacatcgaa ctggatctca acagcggtaa gatccttgag 2880
agttttcgcc ccgaagaacg ttttccaatg atgagcactt ttaaagttct gctatgtggc 2940
gcggtattat cccgtattga cgccgggcaa gagcaactcg gtcgccgcat acactattct 3000
cagaatgact tggttgagta ctcaccagtc acagaaaagc atcttacgga tggcatgaca 3060
gtaagagaat tatgcagtgc tgccataacc atgagtgata acactgcggc caacttactt 3120
ctgacaacga tcggaggacc gaaggagcta accgcttttt tgcacaacat gggggatcat 3180
gtaactcgcc ttgatcgttg ggaaccggag ctgaatgaag ccataccaaa cgacgagcgt 3240
gacaccacga tgcctgtagc aatggcaaca acgttgcgca aactattaac tggcgaacta 3300
cttactctag cttcccggca acaattaata gactggatgg aggcggataa agttgcagga 3360
ccacttctgc gctcggccct tccggctggc tggtttattg ctgataaatc tggagccggt 3420
gagcgtgggt ctcgcggtat cattgcagca ctggggccag atggtaagcc ctcccgtatc 3480
gtagttatct acacgacggg gagtcaggca actatggatg aacgaaatag acagatcgct 3540
gagataggtg cctcactgat taagcattgg taactgtcag accaagttta ctcatatata 3600
ctttagattg atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa gatccttttt 3660
gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc 3720
gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg 3780
caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact 3840
ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg 3900
tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg 3960
ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac 4020
tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca 4080
cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagcattga 4140
gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc 4200
ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct 4260
gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg 4320
agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct 4380
tttgctcaca tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc 4440
tttgagtgag ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc 4500
gaggaagcgg aagagcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat 4560
taatgcagct ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg caacgcaatt 4620
aatgtgagtt agctcactca ttaggcaccc caggctttac actttatgct tccggctcgt 4680
atgttgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagcta tgaccatgat 4740
tacgccaagc ttgtttaaac agagaccggg ttggcggcgt atttgtgtcc caaaaaacag 4800
ccccaattgc cccaattgac cccaaattga cccagtagcg ggcccaaccc cggcgagagc 4860
ccccttcacc ccacatatca aacctccccc ggttcccaca cttgccgtta agggcgtagg 4920
gtactgcagt ctggaatcta cgcttgttca gactttgtac tagtttcttt gtctggccat 4980
ccgggtaacc catgccggac gcaaaataga ctactgaaaa tttttttgct ttgtggttgg 5040
gactttagcc aagggtataa aagaccaccg tccccgaatt acctttcctc ttcttttctc 5100
tctctccttg tcaactcaca cccgaaatcg ttaagcattt ccttctgagt ataagaatca 5160
ttcaaaatgg tgagtttcag aggcagcagc aattgccacg ggctttgagc acacggccgg 5220
gtgtggtccc attcccatcg acacaagacg ccacgtcatc cgaccagcac tttttgcagt 5280
actaaccgca gtccagtctg atgagtccgt gaggacgaaa cgagtaagct cgtc 5334
<223> ku80up-NotI-F
<400> 12
gctatgacca tgattacgcc acgcgtgcgg ccgctaattg aactcacttc tttgg 55
<223> ku80up-R
<400> 13
attgactgga acagcacggc tttgaccttg gggata 36
<223> ku80-hisG-F
<400> 14
caaggtcaaa gccgtgctgt tccagtcaat cagggtatt 39
<223> Ura3-R
<400> 15
ccccctcaag gaacttgctc ttaa 24
<223> Ura3-F
<400> 16
gaagaaaccg tgcttaagag caagt 25
<223> ku80-hisG-R
<400> 17
gccaacccgg tctctcggat cttccagtgg tgcatgaa 38
<223> TEF1p-GGS1-F
<400> 18
ccactggaag atccgagaga ccgggttggc ggcgtat 37
<223> GGS1-p-R
<400> 19
tataatccat tttgaatgat tcttatactc aga 33
<223> GGS1-F
<400> 20
atcattcaaa atggattata acagcgcgga ttt 33
<223> GGS1-R
<400> 21
tggggacagg tcactgcgca tcctcaaagt actt 34
<223> GGS1-t-F
<400> 22
tgcgcagtga cctgtcccca cgttgccggt c 31
<223> XPR2t-GGS1-R
<400> 23
tttccgccaa tcccgtcgga cacgggcatc tcactt 36
<223> ku80down-F
<400> 24
gatgcccgtg tccgacggga ttggcggaaa gaagga 36
<223> ku80down-NotI-R
<400> 25
aaacgacggc cagtgaattc acgcgtgcgg ccgctcgctt cttggcttct ctaaa 55
<223> D17up- NotI-F
<400> 26
gctatgacca tgattacgcc acgcgtgcgg ccgcatagct cgctcgaact gccac 55
<223> D17up-R
<400> 27
attgactgga acagcagtgg tactcaagct cagaac 36
<223> D17-hisG-F
<400> 28
agcttgagta ccactgctgt tccagtcaat cagggtatt 39
<223> D17-hisG-R
<400> 29
tgaccttggg gatatcctcc acctgtgtca atcttc 36
<223> EXP1p-tHMG1-F
<400> 30
tgacacaggt ggaggatatc cccaaggtca aagccg 36
<223> tHMG1-p-R
<400> 31
actgggtcat tgctgtagat atgtcttgtg 30
<223> tHMG1-F
<400> 32
atctacagca atgacccagt ctgtgaaggt ggttg 35
<223> tHMG1-R
<400> 33
gataaatagc ctatgaccgt atgcaaatat tcga 34
<223> tHMG1-t-F
<400> 34
acggtcatag gctatttatc actctttaca acttc 35
<223> lip2t-tHMG1-R
<400> 35
gctagtcttc tatctacggc tttgaccttg gggata 36
<223> D17down-F
<400> 36
caaggtcaaa gccgtagata gaagactagc ttggac 36
<223> D17down-NotI-R
<400> 37
aaacgacggc cagtgaattc acgcgtgcgg ccgcccacta tatcacccct ccaac 55
<223> Lip1up-NotI-F
<400> 38
gctatgacca tgattacgcc acgcgtgcgg ccgccgtcgc tcatggaaaa gccc 54
<223> lip1up-R
<400> 39
caacccggtc tcttgcactt tgacagcaac ttgta 35
<223> TEF1p-ERG10-F
<400> 40
tgtcaaagtg caagagaccg ggttggcggc gt 32
<223> ERG10-p-R
<400> 41
gtagacgggc tccattttga atgattctta tactcaga 38
<223> ERG10-F
<400> 42
taagaatcat tcaaaatgga gcccgtctac attgttt 37
<223> erg10t-ERG13-R
<400> 43
ggacatccta ctgcgtgccg accaagctct aagaac 36
<223> GPD2p-ERG13-F
<400> 44
gagcttggtc ggcacgcagt aggatgtcct gcac 34
<223> ERG13-p-R
<400> 45
ctggggttgc gacattgttg atgtgtgttt aattca 36
<223> ERG13-F
<400> 46
aaacacacat caacaatgtc gcaaccccag aacgtt 36
<223> erg13t-R
<400> 47
ctggggttgc gacattggaa cagccccgga gtaacagcac gtatcgca 48
<223> lip1-hisG-F
<400> 48
gtgctgttac tccggggctg ttccagtcaa tcag 34
<223> lip1-hisG-R
<400> 49
actcgtctct ttcggatctt ccagtggtgc atgaa 35
<223> lip1down-F
<400> 50
actggaagat ccgaaagaga cgagtgtcca gcttac 36
<223> Lip1down-NotI-R
<400> 51
aaacgacggc cagtgaattc acgcgtgcgg ccgcagcacc tgcaactggt gcatg 55
<223> POX3up-NotI-F
<400> 52
gctatgacca tgattacgcc acgcgtgcgg ccgcagcgca agtttcagcg ctc 53
<223> IDI-POX3up-R
<400> 53
ggcgccaaac tcgcctcatt tcgcgctgta tata 34
<223> EXP1p-IDI-F
<400> 54
cgcgaaatga ggcgagtttg gcgcccgttt tttc 34
<223> IDI-p-R
<400> 55
gtaagacgtc gtcattgctg tagatatgtc ttgtgtg 37
<223> IDI-F
<400> 56
gacatatcta cagcaatgac gacgtcttac agcgac 36
<223> idit-ERG20-R
<400> 57
gccaacccgg tctctgactc gatactactc cagtc 35
<223> TEF1p-ERG20-F
<400> 58
gagtagtatc gagtcagaga ccgggttggc ggcgt 35
<223> ERG20-p-R
<400> 59
tttcgccttg gacattttga atgattctta tactcaga 38
<223> ERG20-F
<400> 60
taagaatcat tcaaaatgtc caaggcgaaa ttcgaa 36
<223> erg20t-R
<400> 61
tggaacagcc ccaggactcg ggtcagaagt tc 32
<223> ERG20-hisG-F
<400> 62
tgacccgagt cctggggctg ttccagtcaa tcag 34
<223> POX3-hisG-R
<400> 63
ctgtatcatg gatttgatct tccagtggtg catgaa 36
<223> POX3down-F
<400> 64
ctggaagatc cgcatcaaat ccatgataca gaagacct 38
<223> POX3down-NotI-R
<400> 65
aaacgacggc cagtgaattc acgcgtgcgg ccgcgccaag atcatgtgat tatgg 55
<223> Pox5up-NotI-F
<400> 66
gctatgacca tgattacgcc acgcgtgcgg ccgcacaccg aacctggtcg tctac 55
<223> ERG8-pox5up-R
<400> 67
ggcgccaaac tcggcaacta agcctgttga cg 32
<223> EXP1p-ERG8-F
<400> 68
aggcttagtt gccgagtttg gcgcccgttt tttc 34
<223> ERG8-p-R
<400> 69
cgaataggtg gtcattgctg tagatatgtc ttgtgtg 37
<223> ERG8-F
<400> 70
gacatatcta cagcaatgac cacctattcg gctcc 35
<223> erg8t-ERG12-R
<400> 71
gccaacccgg tctcttcact tgacttacac cgtccc 36
<223> TEF1p-ERG12-F
<400> 72
gtgtaagtca agtgaagaga ccgggttggc ggcgt 35
<223> ERG12-p-R
<400> 73
aatgatgtag tccattttga atgattctta tactcaga 38
<223> ERG12-F
<400> 74
taagaatcat tcaaaatgga ctacatcatt tcggc 35
<223> erg12t-ERG19-R
<400> 75
ggacatccta ctgcgtcctc tcattctggt caagc 35
<223> GPD2p-ERG19-F
<400> 76
accagaatga gaggacgcag taggatgtcc tgcac 35
<223> ERG19-p-R
<400> 77
ggcctggtgg atcattgttg atgtgtgttt aattca 36
<223> ERG19-F
<400> 78
aaacacacat caacaatgat ccaccaggcc tccac 35
<223> erg19t-R
<400> 79
tggaacagcc cctggagccc gttgagggag at 32
<223> ERG19-hisG-F
<400> 80
tcaacgggct ccaggggctg ttccagtcaa tcag 34
<223> POX5-hisG-R
<400> 81
tggtgaacta tgcggatctt ccagtggtgc atgaa 35
<223> POX5down-F
<400> 82
actggaagat ccgcatagtt caccatcttt cggg 34
<223> Pox5down-NotI-R
<400> 83
aaacgacggc cagtgaattc acgcgtgcgg ccgcaaatgt tcattgacgt gtccat 56
<223> ku70up-NotI-F
<400> 84
gctatgacca tgattacgcc acgcgtgcgg ccgctgtttc aaatcagcct gtcgttt 57
<223> ku70up-R
<400> 85
gccaacccgg tctctacatc gtcatcgttc tccaga 36
<223> ku70up-BPC-F
<400> 86
gaacgatgac gatgtagaga ccgggttggc ggcgta 36
<223> BPC-R
<400> 87
gaagtagcca gagaaatgtc c 21
<223> BPC-F
<400> 88
gctggaactt gggacatttc t 21
<223> ku70-mig1t-R
<400> 89
gttctccaga tgtgaaaacc caaaagggcc gaaggctg 38
<223> ku70-hisG-F
<400> 90
ggcccttttg ggttttcaca tctggagaac gatgac 36
<223> hisG-ku70-R
<400> 91
ataacgccgg tgtaacggat cttccagtgg tgca 34
<223> ku70down-F
<400> 92
ccactggaag atccgttaca ccggcgttat gctgtt 36
<223> ku70down-NotI-R
<400> 93
aaacgacggc cagtgaattc acgcgtgcgg ccgcgtgaaa ggaacatagt cattt 55
<223> XPR2up-NotI-F
<400> 94
gctatgacca tgattacgcc acgcgtgcgg ccgctacatt atcgagaccg ttgtt 55
<223> XPR2up-R
<400> 95
gactggaaca gccccttgac cagatcgcct ccgaaa 36
<223> XPR2up-hisG-ura-F
<400> 96
agatcgcctc cgaaaggggc tgttccagtc aatca 35
<223> hisG-GPD2p-R
<400> 97
ggacatccta ctgcgcggat cttccagtgg tgca 34
<223> GPD2p-PK-F
<400> 98
ccactggaag atccgcgcag taggatgtcc tgcacg 36
<223> PK-p-R
<400> 99
cacggggcta gtcattgttg atgtgtgttt aattca 36
<223> PK-F
<400> 100
aaacacacat caacaatgac tagccccgtg atcggc 36
<223> PK-R
<400> 101
atcgaccggc cagtgttact cgttgtcgcc ggcggt 36
<223> mig1t-PK-F
<400> 102
ggcgacaacg agtaacactg gccggtcgat aattta 36
<223> mig1t-PK-R
<400> 103
gccaacccgg tctctaaacc caaaagggcc gaaggc 36
<223> TEF1p-PTA-F
<400> 104
ggcccttttg ggtttagaga ccgggttggc ggcgta 36
<223> PTA-p-R
<400> 105
caggtcggca accattttga atgattctta tactcaga 38
<223> PTA-F
<400> 106
taagaatcat tcaaaatggt tgccgacctg ttctcc 36
<223> PTA-R
<400> 107
caacgtgggg acaggttaca gagcctgagc ggcggt 36
<223> xpr2t-PTA-F
<400> 108
gctcaggctc tgtaacctgt ccccacgttg ccggtc 36
<223> xpr2t-PTA-R
<400> 109
ccgtgtagac aggaatcgga cacgggcatc tcact 35
<223> XPR2down-F
<400> 110
gatgcccgtg tccgattcct gtctacacgg atggat 34
<223> XPR2down-NotI-R
<400> 111
aaacgacggc cagtgaattc acgcgtgcgg ccgctgccca ggtcgaggct cttat 55
<223> ku70-sgRNA-F
<400> 112
aactcttcat aaggccttgg gttttagagc tagaaatagc a 41
<223> sgRNA-R
<400> 113
gcttggtata tgagttgtag g 21
<223> sgRNA-F
<400> 114
acaactcata taccaagcac t 21
<223> ku70-sgRNA-R
<400> 115
ccaaggcctt atgaagagtt gacgagctta ctcgtttcgt 40
<223> ku80-sgRNA-F
<400> 116
tcctagccag aacaaccttc gttttagagc tagaaatagc a 41
<223> ku80-sgRNA-R
<400> 117
gaaggttgtt ctggctagga gacgagctta ctcgtttcgt 40
<223> D17-sgRNA-F
<400> 118
tccgtaatat aggtgacgac gttttagagc tagaaatagc a 41
<223> D17-sgRNA-R
<400> 119
gtcgtcacct atattacgga gacgagctta ctcgtttcgt 40
<223> lip1-sgRNA-F
<400> 120
gctcggcaac caggaatgga gttttagagc tagaaatagc a 41
<223> lip1-sgRNA-R
<400> 121
tccattcctg gttgccgagc gacgagctta ctcgtttcgt 40
<223> POX3-sgRNA-F
<400> 122
cccttgtacc ggtagctaat gttttagagc tagaaatagc a 41
<223> POX3-sgRNA-R
<400> 123
attagctacc ggtacaaggg gacgagctta ctcgtttcgt 40
<223> POX5-sgRNA-F
<400> 124
cctctgactt caccctatcc gttttagagc tagaaatagc a 41
<223> POX5-sgRNA-R
<400> 125
ggatagggtg aagtcagagg gacgagctta ctcgtttcgt 40
<223> XPR2-sgRNA-F
<400> 126
gctggactct ctggtcgacg gttttagagc tagaaatagc a 41
<223> XPR2-sgRNA-R
<400> 127
cgtcgaccag agagtccagc gacgagctta ctcgtttcgt 40

Claims (10)

1.一种高产β-紫罗兰酮基因工程菌的构建方法，其特征在于包括以下步骤：
1)构建基因表达模块，所述基因表达模块包括β-紫罗兰酮生产相关的基因、所述β-紫罗兰酮生产相关的基因上游的启动子和所述β-紫罗兰酮生产相关的基因下游的终止子；
2)构建酵母MVA途径相关基因表达模块，所述相关基因表达模块包括解脂耶氏酵母MVA途径9个相关基因、所述MVA途径9个相关基因上游的启动子和所述MVA途径9个相关基因下游的终止子；
3)构建磷酸转酮酶途径表达模块，所述磷酸转酮酶途径表达模块包括磷酸转酮酶途径相关的基因、所述磷酸转酮酶途径相关的基因上游的启动子和所述磷酸转酮酶途径相关的基因下游的终止子；
4)构建CRISPR/cas9操作载体，包括导向染色体整合位点的sgRNA转录模块、cas9蛋白表达模块和筛选标记；
5)将步骤1)所述基因表达模块、步骤2)所述酵母MVA途径相关基因表达模块或步骤3)磷酸转酮酶途径表达模块分步与步骤4)相应的所述CRISPR/cas9操作载体共转化至201810695855.9中构建的产β-紫罗兰酮基因工程菌中，经多轮基因工程操作，获得高产β-紫罗兰酮基因工程菌。
2.根据权利要求1所述的高产β-紫罗兰酮基因工程菌的构建方法，其特征在于：
步骤1)中所述的基因表达模块还包括ku70基因整合位点上下游同源臂、可丢失的筛选标记基因表达盒；
步骤2)中所述的酵母MVA途径相关基因表达模块还包括ku80、D17、lip1、POX3、POX5基因整合位点上下游同源臂、可丢失的筛选标记基因表达盒；
步骤3)中所述的磷酸转酮酶途径表达模块还包括XPR2基因整合位点上下游同源臂、可丢失的筛选标记基因表达盒。
3.根据权利要求2所述的高产β-紫罗兰酮基因工程菌的构建方法，其特征在于：
步骤1)中所述的构建基因表达模块包括以下步骤：
1.1通过PCR扩增获得所述β-紫罗兰酮生产相关的基因、所述β-紫罗兰酮生产相关的基因上游的启动子片段、所述β-紫罗兰酮生产相关的基因下游的终止子片段，所述ku70基因整合位点上下游同源臂、所述可丢失的筛选标记基因表达盒；
1.2将所述β-紫罗兰酮生产相关的基因、所述β-紫罗兰酮生产相关的基因上游的启动子片段、所述β-紫罗兰酮生产相关的基因下游的终止子片段、所述ku70基因整合位点上下游同源臂、所述可丢失的筛选标记基因表达盒片段分别通过gibson assembly组装法进行组装获得基因表达模块；
步骤2)中所述的构建酵母MVA途径相关基因表达模块包括以下步骤：
2.1通过PCR扩增获得所述酵母MVA途径相关的9个基因、所述酵母MVA途径相关的9个基因上游的启动子片段、所述酵母MVA途径相关的9个基因下游的终止子片段，所述ku80、D17、lip1、POX3、POX5基因整合位点上下游同源臂、所述可丢失的筛选标记基因表达盒；
2.2将所述酵母MVA途径相关的9个基因、所述酵母MVA途径相关的9个基因上游的启动子片段、所述酵母MVA途径相关的9个基因下游的终止子片段，所述ku80、D17、lip1、POX3、POX5基因整合位点上下游同源臂、所述可丢失的筛选标记基因表达盒分别通过gibsonassembly组装法进行组装获得酵母MVA途径相关基因表达模块；
步骤3)中所述的构建磷酸转酮酶途径表达模块包括以下步骤：
3.1通过PCR扩增获得所述磷酸转酮酶途径相关的基因、所述磷酸转酮酶途径相关的基因上游的启动子片段、所述磷酸转酮酶途径相关的基因下游的终止子片段，所述XPR2基因整合位点上下游同源臂、所述可丢失的筛选标记基因表达盒；
3.2将所述磷酸转酮酶途径相关的基因、所述磷酸转酮酶途径相关的基因上游的启动子片段、所述磷酸转酮酶途径相关的基因下游的终止子片段，所述XPR2基因整合位点上下游同源臂、所述可丢失的筛选标记基因表达盒分别通过gibson assembly组装法进行组装获得磷酸转酮酶途径表达模块；
步骤4)中所述的构建CRISPR/cas9操作载体包括以下步骤：
通过在线设计染色体整合位点的sgRNA靶序列，将sgRNA靶序列引入到引物中，通过PCR的方法，将sgRNA靶序列引入到CRISPR/cas9操作载体上。
4.根据权利要求1～3任一项所述的高产β-紫罗兰酮基因工程菌的构建方法，其特征在于：
步骤1)中所述β-紫罗兰酮生产相关的基因为CarB，CarRP，CCD1；
步骤2)中所述酵母MVA途径相关的9个基因为GGS1，tHMG1，ERG8，ERG10，ERG12，ERG13，ERG19，ERG20，IDI；
步骤3)中所述的磷酸转酮酶途径相关的基因为PK和PTA。
5.根据权利要求1～3任一项所述的高产β-紫罗兰酮基因工程菌的构建方法，其特征在于：
步骤1)中所述启动子选自TEF1p，EXP1p，GPD2p；
步骤1)所述终止子选自xpr2t，lip2t，mig1t；
步骤2)中所述启动子选自TEF1p，EXP1p，GPD2p；
步骤2)所述终止子选自xpr2t，lip2t，erg8t，erg10t，erg12t，erg13t，erg19t，erg20t，idit；
步骤3)中所述启动子选自TEF1p，GPD2p；
步骤3)所述终止子选自xpr2t，mig1t。
6.根据权利要求2～3任一项所述的高产β-紫罗兰酮基因工程菌的构建方法，其特征在于：
所述可丢失的筛选标记基因表达盒包括筛选标记基因表达盒和筛选标记丢失模块；
所述筛选标记基因为Ura3；
所述筛选标记丢失模块为hisG-hisG。
7.根据权利要求3所述的高产β-紫罗兰酮基因工程菌的构建方法，其特征在于：
步骤4)中所述载体以pCAS1yl为出发载体；
所述染色体整合位点为染色体上的非必需基因位点，具体为ku70、ku80、D17、lip1、POX3、POX5、XPR2位点；
所述的ku70位点的sgRNA靶序列为SEQ ID NO：1；
所述的ku80位点的sgRNA靶序列为SEQ ID NO：2；
所述的D17位点的sgRNA靶序列为SEQ ID NO：3；
所述的lip1位点的sgRNA靶序列为SEQ ID NO：4；
所述的POX3位点的sgRNA靶序列为SEQ ID NO：5；
所述的POX5位点的sgRNA靶序列为SEQ ID NO：6；
所述的XPR2位点的sgRNA靶序列为SEQ ID NO：7；
所述的sgRNA序列如201810695855.9中序列表的SEQ ID NO：1所示。
8.一种高产β-紫罗兰酮基因工程菌，其特征在于通过权利要求1～7任一项所述的构建方法构建得到。
9.一种高产β-紫罗兰酮基因工程菌，其特征在于：
所述的高产β-紫罗兰酮基因工程菌，名称为解脂耶罗维亚酵母(Yarrowialipolytica)YLBI3118，于2019年07月23日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCCNO：18286。
10.权利要求8或9所述的高产β-紫罗兰酮基因工程菌在发酵生产β-紫罗兰酮中的应用。
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