CN112877228B - 一种高产红没药烯的酿酒酵母工程菌及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高产红没药烯的酿酒酵母工程菌及应用，所述酿酒酵母工程菌按如下方法构建：在增强甘油代谢途径的酿酒酵母菌中，转入红没药烯合成酶基因Agbis，同时敲除葡萄糖阻遏转录因子MIG1，构建得到高产红没药烯的酵母工程菌。本发明在酵母工程菌中采用增强甘油利用途径和敲除葡萄糖阻遏转录因子MIG1的组合策略，使得红没药烯摇瓶产量最终提高了91.1％，达到868.6mg/L，为目前报道的甘油蔗糖合成最小培养基摇瓶发酵最高产量。

Description

一种高产红没药烯的酿酒酵母工程菌及应用

(一)技术领域

本发明涉及一种采用增强甘油代谢和敲除葡萄糖阻遏转录因子MIG1的组合策略，提高酿酒酵母红没药烯产量的工程菌及方法。

(二)背景技术

酿酒酵母具有遗传操作简便、生物安全性高和发酵稳定等优点，是一种应用广泛的生物细胞工厂。萜类化合物的通用C5前体为异戊烯基焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)，它们在酵母中通过甲羟戊酸(MVA)途径合成。通过提高乙酰辅酶A和甲羟戊酸途径代谢水平，研究者已经成功地将酿酒酵母改造为异源生物合成萜类化合物的高产微生物。红没药烯是一种有类似果香和香脂气味的倍半萜精油成分，广泛应用于食用香精及日化香精，也是极具潜力的新型生物燃料；β-红没药烯和γ-红没药烯还具有抗痒、消炎的功能和抗癌活性。此外，红没药烯也是多种高附加值工业产品合成的前体物质，如生物燃料、生物塑料、化妆品、保健品及药品等。Jay D.Keasling等在酿酒酵母中合成红没药烯，摇瓶产量达到994mg/L(Identification and microbial production of a terpene-basedadvanced biofuel.Jay D.Keasling,et al.Nature Communications.)。但是该研究使用YPD作为发酵培养基，成本较昂贵。

2012年以来我国甘油产量总体呈现上升趋势。生物基甘油已成为一种廉价且丰富的资源。Lv等使用甘油替代培养基中的蔗糖，利用来源于BY4741的工程酵母菌发酵合成异戊二烯，1.4％甘油+0.6％蔗糖培养基中的产量比2％蔗糖培养基中的产量提高了超过200％(Enhanced isoprene biosynthesis in Saccharomyces cerevisiae byengineering of the native acetyl-CoA and mevalonic acid pathways with a push-pull-restrain strategy.Lv X,et al.Journal of Biotechnology,2014,186:128-136.)。文献报道，CEN.PK2相比BY4714(S288C)更适合作为萜类合成的宿主菌株(LinkingGenotype and Phenotype of Saccharomyces cerevisiae Strains Reveals MetabolicEngineering Targets and Leads to Triterpene Hyper-Producers.Madsen K M,etal.Plos One,2011,6(3):e14763.)，然而CEN.PK2相比BY4714的甘油利用能力较差(本实验测得，见图1)，本发明以来源于CEN.PK2-1D的YS036为出发菌株，增强其甘油代谢能力。

在代谢工程中，导入新代谢途径可能导致细胞产生代谢压力或对细胞有毒性的中间代谢物，导致细胞蛋白负荷增大，使得菌体的比生长速率下降，发酵启动延迟，发酵产量降低，或生物量降低。为了解决这个问题，研究者已设计了基于酵母GAL启动子的二次生长诱导系统，在该系统中，敲除GAL80基因的菌株，GAL启动子在培养基中糖耗尽后开始转录，无需半乳糖诱导。该系统成功地将细胞生长和产物积累阶段分离，减轻了产物对菌体的毒性，已在本发明酿酒酵母宿主菌YS036中实现。本发明中基于GAL启动子增强了菌株的甘油代谢能力。然而，该系统下，酿酒酵母工程菌倾向于先利用蔗糖碳源，甘油碳源得不到共同、充分利用，导致相比于蔗糖单一碳源，甘油蔗糖混合碳源培养基中的酿酒酵母工程菌比生长速率下降，生物量降低。

MIG1是酿酒酵母葡萄糖阻遏效应的关键调控因子之一。邹静等发现GAL80和MIG1双敲除菌株的半乳糖代谢流量同野生型相比增加15％，且半乳糖利用速率提高、半乳糖诱导所需时间减少、发酵周期缩短(Lac+酿酒酵母工程菌中GAL80基因敲除对乳糖利用的影响.邹静等.酿酒科技,2013,000(012):36-41.)。蔡艳青等发现MIG1和SNF1双敲除菌株利用葡萄糖加快，且葡萄糖和木糖可以被同时利用(敲除MIG1和SNF1基因对酿酒酵母共利用葡萄糖和木糖的影响.蔡艳青等.生物工程学报,2018(1):54-67.)。为了提高酿酒酵母工程菌同时利用蔗糖和甘油的能力，本发明通过敲除MIG1基因，部分解除葡萄糖阻遏效应。实验证明MIG1敲除有助于促进蔗糖和甘油的共利用，平衡细胞生长和目标倍半萜代谢产物产生，从而显著提高目标代谢产物的合成。

本发明以酵母工程菌中红没药烯的合成为例，采用增强甘油代谢和敲除葡萄糖阻遏转录因子MIG1的组合策略，提供了一种酿酒酵母工程菌中增加倍半萜产量的新方法。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种高产红没药烯的酿酒酵母工程菌及提高红没药烯产量的方法，所述工程菌是增强转入红没药烯合成酶基因Agbis的酿酒酵母菌甘油利用途径，同时敲除葡萄糖阻遏转录因子MIG1，在已经构建好的高产倍半萜的酵母工程菌中，导入甘油代谢途径，构建蔗糖和甘油协同利用的菌株，同时通过敲除MIG1，部分解除葡萄糖阻遏，平衡细胞生长和目标倍半萜代谢产物产生，采用增强甘油代谢和敲除葡萄糖阻遏转录因子MIG1的组合策略，显著提高目标代谢产物的合成。

本发明采用的具体技术方案是：

本发明提供一种高产红没药烯的酿酒酵母工程菌，所述酿酒酵母工程菌按如下方法构建：在增强甘油代谢途径的酿酒酵母菌中，转入红没药烯合成酶基因Agbis，同时敲除葡萄糖阻遏转录因子MIG1，构建得到高产红没药烯的酿酒酵母工程菌；

所述增强酿酒酵母菌甘油代谢的酿酒酵母菌按如下步骤制备：第一步使用Gal10启动子高表达甘油转运通道基因PtFPS2；第二步用Gal1启动子高表达甘油脱氢酶基因Opgdh；第三步用Gal7启动子高表达二羟基丙酮激酶基因DAK1；第四步用Gal2启动子高表达NADH氧化酶基因NOXE。

本发明所述红没药烯合成酶基因Agbis来源于北美冷杉(Abiesgrandis)，核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，通过将基因Agbis(SEQ ID NO.1所示)克隆至pYES2载体Gal1启动子之后，乙酸锂化学转化法(Gietz,et al.Method.Enzymol.2002,350,87–96)导入酿酒酵母基因组YPRCtau3位点进行表达。

所述甘油转运通道蛋白基因PtFPS2来源于管囊酵母(Pachysolen tannophilus)，核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示，将基因PtFPS2连接Gal10启动子，构建基因PtFPS2表达盒；所述甘油脱氢酶基因Opgdh来源于Ogataea parapolymorpha，核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示，将基因Opgdh连接Gal1启动子，构建基因Opgdh表达盒。

所述NADH氧化酶基因NOXE来源于乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)，核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示，将基因NOXE连接Gal2启动子，构建基因NOXE表达盒；所述二羟基丙酮激酶基因DAK1核苷酸序列为SEQ ID NO.7所示，将基因DAK1连接Gal7启动子，构建因DAK1表达盒组。

将上述基因PtFPS2表达盒、基因Opgdh表达盒、基因NOXE表达盒和基因DAK1表达盒组装后，整合至酿酒酵母基因组(优选YPRCtau3位点)进行表达。

所述葡萄糖阻遏转录因子MIG1核苷酸序列为SEQ ID NO.15所示。本发明敲除葡萄糖阻遏转录因子MIG1的方法为使用CRISPR-Cas9技术，将开放阅读框中间有缺失的MIG1片段(SEQ ID NO.15)整合至基因组MIG1位点处。

进一步，所述酿酒酵母菌为酵母菌株YS036，已在专利申请CN110484572A中公开。

本发明增强酿酒酵母菌甘油代谢途径的方法为：以YS036基因组为模板，采用表4引物，在表1和表2条件下经PCR扩增得到整合位点上游同源臂(SEQ ID NO.5，记为片段1)；以带有PtFPS2基因(SEQ ID NO.2)和带有Opgdh基因(SEQ ID NO.NO.3)的pESC载体为模板，在表1反应体系和表2PCR条件下经扩增得到PtFPS2-PGAL10/1-Opgdh(记为片段2)；分别以酵母CEN.PK2-1D基因组为模板，在表1和表2条件下经PCR扩增，得到GAL7启动子(SEQ IDNO.6，记为片段3)、DAK1(SEQ ID NO.7，记为片段4)、His(SEQ ID NO.8，记为片段5)、GAL2启动子(SEQ ID NO.9，记为片段6)、NOXE(SEQ ID NO.4，记为片段7)；以YS036基因组为模板，采用表4引物，在表1和表2条件下经PCR扩增得到整合位点下游同源臂(SEQ ID NO.10，记为片段8)；使用重叠延伸PCR方法将片段1、片段2、片段3拼接成第一个大片段，将片段3、片段4、片段5拼接成第二个大片段，将片段5、片段6、片段7、片段8拼接成第三个大片段；将上述带有同源臂和重叠区的DNA长片段(第一个大片段、第二个大片段、第三个大片段)，通过乙酸锂化学转化法，整合至YS036酵母基因组上，得到增强甘油代谢途径的酿酒酵母菌，记为菌株HJW04。

本发明还提供一种所述酿酒酵母工程菌高产红没药烯的方法，所述方法为：将所述酿酒酵母工程菌接种至甘油蔗糖合成最小培养基，加入体积终浓度5-15％(优选10％)的十二烷，培养温度28-32℃，转速180-220rpm，摇瓶发酵培养OD₆₀₀达到8-10(优选培养温度30℃，转速200rpm，OD₆₀₀达到9)，培养物离心，取上清，分离提取，获得红没药烯；所述甘油蔗糖合成最小培养基质量终浓度组成：0.5-1.5％蔗糖，0.5-1.5％甘油，0.17％酵母氮源，0.5％硫酸铵和微量营养素，溶剂为蒸馏水，pH 5.0；其中微量营养素是指组氨酸、亮氨酸或尿嘧啶中的一种或多种，在培养基中的终浓度均为20mg/L，根据筛选不同选择标记的需要，在培养基中添加不同微量营养素。

进一步，所述蔗糖和甘油在培养基中的添加量均优选为1％。

进一步，所述酿酒酵母工程菌发酵前先在葡萄糖合成最小固体培养基上划线活化，温度30℃培养箱培养48h，单菌落接种至葡萄糖合成最小培养基，培养温度30℃，转速200rpm，摇瓶培养过夜，作为种子液；取种子液以体积浓度1-5％(优选2％)的接种量接种至甘油蔗糖合成最小培养基；所述葡萄糖合成最小培养基质量终浓度组成：2％葡萄糖，0.17％酵母氮源，0.5％硫酸铵和微量营养素，溶剂为蒸馏水，pH 5.0；其中微量营养素是指组氨酸、亮氨酸或尿嘧啶中的一种或多种，在培养基中的终浓度均为20mg/L。根据筛选不同选择标记的需要，在培养基中添加不同微量营养素。

所述蔗糖合成最小培养基为上述葡萄糖合成最小培养基中2％葡萄糖替换为2％蔗糖。

本发明以酵母菌株YS036为宿主菌，导入甘油代谢途径，构建蔗糖和甘油协同利用的菌株，平衡甘油代谢途径的影响，同时通过敲除MIG1，部分解除葡萄糖阻遏，平衡细胞生长和红没药烯产生，采用增强甘油代谢和敲除葡萄糖阻遏转录因子MIG1的组合策略，显著提高红没药烯的产量。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明导入甘油代谢途径，构建蔗糖和甘油协同利用的菌株，混合碳源最佳比例(蔗糖和甘油的比例为1∶1时，即1％蔗糖和1％甘油培养基)下，可以降低约20％的碳源原料成本，红没药烯摇瓶产量提高了18.2％，达到537.1mg/L。采用增强甘油代谢和敲除葡萄糖阻遏转录因子MIG1的组合策略，显著提高红没药烯的合成，红没药烯摇瓶产量最终提高了91.1％，达到868.6mg/L，为目前报道的甘油蔗糖合成最小培养基摇瓶发酵最高产量。

(四)附图说明

图1为酵母菌株CEN.PK2-1D和BY4714分别在YPG培养基中发酵60h的生长曲线。

图2为酵母菌株HJW05在不同浓度梯度甘油蔗糖合成最小培养基中摇瓶培养96h后的红没药烯产量。

图3为出发菌株HJW03和代谢改造后的菌株HJW05和HJW11分别在蔗糖合成最小培养基和甘油蔗糖合成最小培养基中摇瓶培养96h后的红没药烯产量。

图4为酵母菌株HJW05和HJW11分别在甘油蔗糖合成最小培养基中发酵96h的生长曲线。

图5为酵母菌株HJW05和HJW11分别在甘油蔗糖合成最小培养基中发酵96h的红没药烯合成曲线。

(五)具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整的描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。除非另作定义，本专利公开所使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内有一般技能的人士所理解的通常意义。

实施例1蔗糖和甘油协同利用菌株的构建

(1)基因和引物

将来源于北美冷杉(Abiesgrandis)的红没药烯合成酶基因Agbis(GenBank数据库登录号O81086.1)，按酿酒酵母密码子偏好性，委托天霖生物科技有限公司合成核苷酸序列(SEQ ID NO.1所示)，通过限制性内切酶BamHI/EcoRI克隆至pYES2载体(Invitrogen，美国)。

将来源于管囊酵母(Pachysolen tannophilus)的甘油转运通道基因PtFPS2(GenBank数据库登录号AFN43531.1)，按酿酒酵母密码子偏好性，委托天霖生物科技有限公司合成核苷酸序列(SEQ ID NO.2所示)，通过限制性内切酶NotI/SacI克隆至pESC载体(Invitrogen，美国)。将来源于Ogataea parapolymorpha的甘油脱氢酶基因Opgdh(GenBank数据库登录号XP_018210953.1)，按酿酒酵母密码子偏好性，委托天霖生物科技有限公司合成核苷酸序列(SEQ ID NO.3所示)，通过限制性内切酶BamHI-XhoI克隆至上述带有PtFPS2基因的pESC载体(Invitrogen，美国)上，获得Gal10/1双向启动子两侧带有PtFPS2基因(SEQID NO.2)和Opgdh基因(SEQ ID NO.NO.3)的pESC载体。

将来源于乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的NADH氧化酶NOXE(GenBank数据库登录号EQC87502.1)，按酿酒酵母密码子偏好性，委托天霖生物科技有限公司合成核苷酸序列(SEQ ID NO.4所示)，通过限制性内切酶NotI/SacI克隆至pESC载体(Invitrogen，美国)。

本实施例所用到的PCR引物序列和模板列于表4，菌株构建所用到的内源性启动子片段、内源酶编码基因及其终止子片段和同源臂片段，非特殊说明，均从酵母CEN.PK2-1D(EUROSCARF公司，德国)的基因组DNA中扩增，同时菌株构建过程中所有内源启动子和基因序列均可在酿酒酵母基因组数据库(www.yeastgenome.org)查询得到。

(2)菌株构建

菌株HJW04的构建：使用表4中所列引物和模板，以YS036基因组为模板，采用表4引物，在表1和表2条件下经PCR扩增得到整合位点上游同源臂(SEQ ID NO.5，记为片段1)。以Gal10/1双向启动子两侧带有PtFPS2基因(SEQ ID NO.2)和Opgdh基因(SEQ ID NO.NO.3)的pESC载体为模板，在表1和表2条件下经PCR扩增得到PtFPS2-PGAL10/1-Opgdh(记为片段2)。分别以酵母CEN.PK2-1D基因组为模板，在表1和表2条件下经PCR扩增，分别得到GAL7启动子(SEQ ID NO.6，记为片段3)、DAK1(SEQ ID NO.7，记为片段4)、His(SEQ ID NO.8，记为片段5)、GAL2启动子(SEQ ID NO.9，记为片段6)、NOXE(SEQ ID NO.4，记为片段7)。以YS036基因组为模板，采用表4引物，在表1和表2条件下经PCR扩增得到整合位点下游同源臂(SEQ IDNO.10，记为片段8)。

按照文献(Modular pathway engineering of diterpenoid synthases and themevalonic acid pathway for miltiradiene production,J.Am.Chem.Soc.(2012)134:3234-3241)的方法，使用重叠延伸PCR将这些DNA片段拼接为有重叠区的长片段。例如需要将上述8个片段整合到基因组上，可以使用重叠延伸PCR方法将片段1、片段2、片段3拼接成第一个大片段，将片段3、片段4、片段5拼接成第二个大片段，将片段5、片段6、片段7、片段8拼接成第三个大片段，其中片段1和8为基因组同源臂，片段3和片段5为重叠区。按照文献(DNA assembler,an in vivo genetic method for rapid construction ofbiochemical pathways,Nucleic.Acid.s Res.(2009)37:16)中的DNA装配方法，将上述带有同源臂和重叠区的DNA长片段(第一个大片段、第二个大片段、第三个大片段)，通过乙酸锂化学转化法，整合至YS036酵母基因组上，通过His标记筛选阳性转化子，菌落PCR验证得到菌株HJW04。

表1、PCR扩增体系：

表2、PCR条件：

上述菌株YS036通过乙酸锂化学转化法转入带有红没药烯合成酶基因Agbis(SEQID NO.1)的pYES2质粒，通过ura3标记筛选阳性转化子，菌落PCR验证，构建含红没药烯合成酶基因Agbis的菌株HJW03。

同样条件下，将菌株YS036替换为HJW04，构建菌株HJW05。

(3)菌株培养

葡萄糖合成最小培养基质量终浓度组成：2％葡萄糖，0.17％酵母氮源，0.5％硫酸铵，微量营养素，溶剂为蒸馏水，pH 5.0；其中微量营养素是指组氨酸、亮氨酸和尿嘧啶中的一种或多种，在培养基中的终浓度均为20mg/L。根据筛选不同选择标记的需要，在培养基中添加不同微量营养素。

蔗糖合成最小培养基为上述葡萄糖合成最小培养基中2％葡萄糖替换为2％蔗糖。

甘油蔗糖合成最小培养基为上述葡萄糖合成最小培养基中2％葡萄糖替换为1％蔗糖和1％甘油。

YPD培养基质量终浓度组成：1％酵母粉，2％蛋白胨，2％葡萄糖，溶剂为蒸馏水，pH值自然。

YPG培养基为上述YPD培养基中2％葡萄糖替换为2％甘油。

固体平板在上述组分基础上再加入2％琼脂。

本发明所述酿酒酵母工程菌培养方法为：将本发明构建的酿酒酵母工程菌HJW03和HJW05分别在葡萄糖合成最小固体培养基上划线活化，温度30℃培养箱培养48h，单菌落接种至葡萄糖合成最小培养基(HJW03培养基中加入组氨酸、亮氨酸，HJW05培养基中加入亮氨酸)，培养温度30℃，转速200rpm，摇瓶培养过夜，作为种子液；取种子液以体积浓度2％的接种量接种至蔗糖合成最小培养基，加入体积终浓度10％的十二烷，用于红没药烯的边合成边萃取。培养温度30℃，转速200rpm，摇瓶培养96h后(OD₆₀₀达到9)，培养物离心，取上层十二烷，采用气相色谱测定待测红没药烯产量。红没药烯气相色谱测定条件：使用安捷伦7890A GC系统测定，进样口温度280℃，进样量1μl，分流比1:10，色谱柱：HP-5MS(30m×0.25μm×0.25μm)；色谱条件：氦气流量1mL/min，100℃，5min，10℃/min升温到250℃。

表3本发明涉及到的菌株

表4本发明中所使用的引物列表

注：引物序列中的小写字母序列为与相邻片段的重叠序列，以便进行重叠延伸PCR。引物名称带有“up”为整合位点上游同源臂，“down”为下游同源臂。

实施例2不同梯度浓度的甘油蔗糖合成最小培养基中红没药烯产量测定

将实施例1构建的菌株HJW05作为导入甘油代谢途径的出发菌株，在葡萄糖合成最小固体培养基(培养基中加入亮氨酸)上划线活化，温度30℃培养箱培养48h，单菌落接种至葡萄糖合成最小培养基(培养基中加入亮氨酸)，培养温度30℃，转速200rpm，培养过夜，作为种子液；取种子液以体积浓度2％的接种量接种至四个梯度浓度的甘油蔗糖合成最小培养基(2％蔗糖、1.5％蔗糖+0.5％甘油、1％蔗糖+1％甘油、0.5％蔗糖+1.5％甘油，加入亮氨酸，组成同实施例1)。加入体积终浓度10％的十二烷，用于红没药烯的边合成边萃取。培养温度30℃，转速200rpm，摇瓶培养96h后(OD₆₀₀达到9)，培养物离心，取上层十二烷，采用气相色谱测定待测红没药烯产量，结果见图2。

红没药烯气相色谱测定条件：使用安捷伦7890A GC系统测定，进样口温度280℃，进样量1μl，分流比1:10，色谱柱：HP-5MS(30m×0.25μm×0.25μm)；色谱条件：氦气流量1mL/min，100℃，5min，10℃/min升温到250℃。

菌株HJW05在1％甘油+1％蔗糖的甘油蔗糖合成最小培养基中，红没药烯产量最高，达537.1mg/L，相比蔗糖合成最小培养基的产量提高了18.2％，且实验所实施的1％甘油+1％蔗糖、1.5％甘油+0.5％蔗糖的甘油蔗糖合成最小培养基中的产量均显著高于蔗糖合成最小培养基(p<0.05)。经计算，1％蔗糖+1％甘油组和蔗糖对照组t＝4.295，P＜0.005，差异显著；0.5％蔗糖+1.5％甘油组和蔗糖对照组t＝3.11，P＜0.025，差异显著。但是，1.5％蔗糖+0.5％甘油组和蔗糖对照组t＝1.97，0.05＜P＜0.1，差异不显著。证明实施例1中菌株导入甘油代谢途径的构建与平衡能有效增加红没药烯产量，且可以降低发酵碳源成本。

实施例3敲除Mig1，部分解除葡萄糖阻遏对红没药烯合成的影响

本实施例所构建的菌株在表3列出，所用到的引物和模板在表4列出。

1、CAS9-gRNA载体的构建：以商业化质粒p414-TEF1p-Cas9-CYC1(Addgene公司)为模板，使用表4中所列引物，在表1和表2条件下PCR扩增得到CAS9片段(SEQ ID NO.11，记为片段12)。以商业化质粒p426-SNR52p-gRNA.CAN1.Y-SUP4t(Addgene公司)为模板，使用表4中所列引物，在表1和表2条件下扩增得到gRNA质粒骨架(SEQ ID NO.12，记为片段13)，通过一步克隆试剂盒(诺唯赞，ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit，C115)拼接成一个大片段，转化大肠DH5α菌株，通过氨苄青霉素抗性筛选阳性转化子，菌落PCR验证后，提质粒得到CAS9-gRNA表达盒。

2、靶位点为MIG1基因的CAS9-gRNA载体：利用chopchop网站，根据靶位点MIG1基因设计靶标序列(SEQ ID NO.15)，以步骤1的CAS9-gRNA表达盒基因组为模板，使用表4中所列引物，在表1和表2条件下PCR扩增得到含SEQ ID NO.15所示靶标序列的CAS9-gRNA载体骨架(记为片段9)，转化大肠DH5α菌株，菌落PCR验证后，提质粒得到靶位点为MIG1基因的CAS9-gRNA载体。

3、带有同源臂的DNA长片段：分别以菌株HJW05基因组为模板，使用表4中所列引物，在表1和表2条件下PCR扩增得到整合位点上游同源臂(SEQ ID NO.13，记为片段10)、整合位点下游同源臂(SEQ ID NO.14，记为片段11)。DNA拼接方法如前所述，将片段10、片段11拼接，获得带有同源臂的DNA长片段(不完整的MIG1编码区)。

4、菌株HJW10的构建：将步骤3带有同源臂的DNA长片段(不完整的MIG1编码区)和上述步骤2的CAS9-gRNA载体，通过乙酸锂化学转化法，整合至菌株HJW04基因组上，通过ura3标记筛选阳性转化子，菌落PCR验证。将上述步骤所得的阳性转化子在YPD培养基中30℃培养1-2天，吸取100μL培养物离心后用无菌水清洗，涂布在含有1mg/mL的5-氟乳清酸的葡萄糖合成最小培养基平板上，生长出的菌落即为去除筛选标记ura3(即成功丢失基因组编辑载体CAS9-gRNA)的菌株，得到菌株HJW10。

上述菌株HJW10，通过乙酸锂化学转化法转入带有红没药烯合成酶基因Agbis(SEQID NO.1)的pYES2质粒(含有ura3标记)，通过ura3标记筛选阳性转化子，菌落PCR验证，构建红没药烯合成菌株HJW11。

实施例4不同菌株产红没药烯的影响

将实施例1和3构建的菌株HJW03、HJW05和HJW11，分别接种在蔗糖合成最小培养基(2％蔗糖)和甘油蔗糖合成最小培养基(1％蔗糖+1％甘油)中，其中HJW03的培养基中加入组氨酸、亮氨酸，HJW05的培养基中加入亮氨酸，HJW11的培养基中加入亮氨酸，30℃、200rpm摇瓶培养96h后，同实施例1方法测定红没药烯产量(图3)。

将实施例1和3构建的菌株HJW05和HJW11，分别接种在甘油蔗糖合成最小培养基(1％蔗糖+1％甘油)，HJW05的培养基中加入亮氨酸，HJW11的培养基中加入亮氨酸，30℃、200rpm摇瓶培养，分别在12h、18h、24h、36h、48h、60h、72h、96h时取样，检测OD600，绘制生长曲线(图4)；分别在36h、48h、72h、96h时，采用实施例1方法检测红没药烯产量，绘制红没药烯合成曲线(图5)。

如图3所示，PtFPS2、Opgdh、DAK1等甘油代谢基因过表达势必会加剧细胞体内氧化还原的不平衡，通过noxE基因可以氧化过剩的NADH以缓解这种不平衡。导入甘油代谢途径后，HJW05比HJW03在蔗糖合成最小培养基中，红没药烯产量有所下降，为454.5mg/L，下降4.6％；而HJW05在甘油蔗糖合成最小培养基中相比HJW03在蔗糖合成最小培养基中有所上升，为537.1mg/L，提高12.9％。

如图3所示，MIG1敲除后的HJW11相对于HJW05，在蔗糖合成最小培养基中摇瓶培养红没药烯产量降低，然而敲除后的菌株生物量均有增加，表现为OD_600nm的增大。蔗糖单一碳源情况下，虽然部分被阻遏的基因的表达能够上调，但是MIG1的敲除破坏了细胞生长和产物积累两阶段的分离，使得该环境下菌体的碳源更多地倾向于细胞生长而非目标倍半萜代谢产物产生，一定程度上缓解了代谢压力。因此通过敲除MIG1，部分解除葡萄糖阻遏，具有在甘油蔗糖混合碳源中平衡细胞生长和目标红没药烯代谢产物产生的潜力(如图4和图5所示)。

图3明显观察到，相比于导入甘油代谢途径、优化混合碳源后的红没药烯产量小幅增加和敲除MIG1部分解除葡萄糖阻遏后的红没药烯产量同比下降，两者联用对红没药烯产量的增加有显著效果。HJW11在蔗糖合成最小培养基中摇瓶培养红没药烯产量为363.6mg/L，在甘油蔗糖合成最小培养基中红没药烯产量提高了138.8％，达到868.6mg/L；MIG1敲除有助于促进蔗糖和甘油的共利用，平衡细胞生长和红没药烯产生。最终，相比HJW05菌株在蔗糖合成最小培养基中红没药烯产量454.5mg/L，采用增强甘油代谢和敲除葡萄糖阻遏转录因子MIG1的组合策略的HJW11菌株在甘油蔗糖合成最小培养基中红没药烯产量达到868.6mg/L，产量提高了91.1％，为目前报道的甘油蔗糖合成最小培养基摇瓶发酵最高产量。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求保护范围内。

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 一种高产红没药烯的酿酒酵母工程菌及应用

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2454

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

atggcgggag ttagcgctgt ttctaaagtt agcagcctgg tatgcgatct ttcctcaact 60

tctggtttaa taagaaggac ggcgaaccct catcctaacg tttggggtta cgacttggta 120

cattctttga agagccctta cattgactca agctacagag agcgtgctga ggtgctggtc 180

tctgaaatta aagctatgct aaacccggcc atcactggcg acggcgaatc tatgataacg 240

cctagtgctt acgatacagc gtgggtcgca agggtgcccg ccatagatgg gagcgcaaga 300

ccgcaatttc ctcagaccgt cgactggatc ttgaagaatc aattgaaaga cggcagttgg 360

ggcatccaaa gtcacttcct actgtctgat agattattag caacgttgtc ctgcgttctt 420

gtgttactaa aatggaacgt cggagacttg caggtcgaac agggaattga gttcataaag 480

tctaatcttg aactagtgaa agatgaaacg gaccaagata gcctggtcac tgactttgag 540

ataatttttc caagtctgtt gcgtgaggcc caaagcctaa ggcttggcct tccttacgat 600

ctaccttata tacatctact gcaaacgaag agacaggaaa ggttggctaa gctatcacgt 660

gaggagattt acgccgttcc ctctccttta ctgtactctt tagaaggtat ccaggacatt 720

gttgaatggg agaggataat ggaggtccag agtcaagatg gttccttctt atcaagccca 780

gcgagcacgg cctgtgtttt catgcacacg ggtgatgcga aatgccttga gtttttaaat 840

tcagtaatga taaagttcgg caatttcgta ccgtgcctgt acccagttga tttacttgaa 900

aggctgttga tagtagacaa tatcgtccgt ttggggattt accgtcattt tgaaaaagaa 960

ataaaggagg ctctggatta tgtttatagg cattggaacg aacgtggaat aggttggggg 1020

aggctgaacc caatagcgga cttagagacc actgctttag gattccgtct gctgcgtttg 1080

cacagataca atgtcagtcc tgcgatcttt gacaatttta aagacgcaaa tgggaagttc 1140

atctgctcta caggacaatt taataaagac gtcgcctcaa tgttaaattt ataccgtgcg 1200

tcccagctag cattcccggg tgaaaatatt cttgatgaag cgaagagctt tgctaccaaa 1260

tacttacgtg aggcgttgga gaaaagcgag actagtagcg cctggaataa taagcagaac 1320

ttaagccagg agattaaata tgcactaaaa acttcatggc acgcatcagt gcccagggta 1380

gaggccaaaa ggtattgcca agtatacaga cccgattacg ctcgtatcgc aaagtgcgta 1440

tacaagctgc cctacgtgaa caatgaaaaa tttcttgaac tgggcaagct ggatttcaat 1500

attatccagt caatacacca ggaggaaatg aaaaatgtga cgagctggtt cagggactca 1560

ggtttgcctc tattcacttt tgccagggaa cgtccgttgg agttttactt ccttgttgcg 1620

gctgggactt acgagccaca gtatgcgaaa tgcaggttcc tatttactaa ggtcgcatgt 1680

cttcagaccg tgcttgatga tatgtatgat acgtatggaa cgttggatga actaaaactt 1740

tttaccgagg ctgtaaggag atgggattta tcttttacag agaatttacc tgattatatg 1800

aaactttgct accaaatata ttacgatatc gttcatgagg tagcatggga agcagaaaaa 1860

gagcagggga gagaacttgt gagtttcttc cgtaagggct gggaagacta cttgcttggt 1920

tattacgaag aggcagaatg gcttgcagca gaatacgttc cgacgcttga cgagtacatc 1980

aagaatggta tcacgtcaat aggacaacgt attttacttt tgagcggagt cttgatcatg 2040

gatggacaat tgcttagcca ggaggcgctg gagaaggtcg actatccggg aaggcgtgtt 2100

ctaacggaac ttaatagctt aatcagcaga ttggccgatg acacaaaaac gtataaggcg 2160

gaaaaggcaa ggggggaact ggccagtagc attgaatgtt acatgaagga ccaccccgag 2220

tgcacggagg aggaggctct ggaccacatt tactctatac tggagcccgc cgttaaggaa 2280

ctgaccagag aatttttgaa acctgatgac gtcccatttg cttgtaagaa aatgcttttc 2340

gaagaaacta gggtgactat ggtcattttc aaggacggtg acgggtttgg cgtgagtaag 2400

ctggaagtaa aggaccacat caaagagtgt ctaattgaac cgctgcccct ataa 2454

<210> 2

<211> 972

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

atgcaaatag agaatgtgca gggatcaagc acgagttcaa atgagctatt ggccccagac 60

aagatcatta tcgaagaaga cgagatcatt gacgtccctc agtttaataa tgtttgggag 120

aggataaggc atgagtatag ggcctacttc gctgaatttt taggcactct gatcttagta 180

gcgtttggcg atggggtagt cgcccaaaaa aaactgagtg gcggggctgc aggttcttat 240

acgaatgtgt ctatgagttg gggttttgct gtaatgatgg gtttcctagt atctggtggg 300

atctctggcg gacatatgaa ccccgcagtc accctggtag cagcggcctt taggggtttt 360

tcctggagga aagtacctgg gtacatcttt tcccaacttt taggtgggct tataggcgcg 420

tatgtagtat acggaaccta ctaccaatct tttgatgatt acgaaggcgt aggcatcaga 480

acagttacgg gggacacagc tacagctggg atcttctgca cttttccggc cggggactac 540

ctaacaacta ggggacaagt tctgagcgaa tttgttagta gtgtattgct tgagataggg 600

atattcgcac tatcagatgc atgcaacgtc gagtccgcga agcattggtt ccctataggc 660

ttatttttcc ttatatacgg aattggcgct tgtttcggat accaaacggg gtacgcaatt 720

aatatggcaa gggacttcgc accgagagta gctgcaactt ctgtaggata cggcagagag 780

atgtggactg caggtaatgg ttatgcatgg gttccagtgg tcatgccgat cattggttgc 840

tttaccgggg cgattatcta cgatttattc atctatcagg ggcaagactc tccgttaaat 900

aagccttatt tcggctttgg acgtttcttc ggcaagggca ggcaaactaa agatgtcgaa 960

aatcagtact aa 972

<210> 3

<211> 1143

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 3

atgaaaggtc ttctatacta tggcaccaac gacatcaggt actcagagac agtccctgag 60

cctgaaataa aaaatccgaa tgacgtcaag ataaaagtga gctattgtgg gatttgcggt 120

acggatctaa aagagttcac ttattccgga gggcctgtat tctttccgaa gcagggtacc 180

aaagataaaa tctccggcta tgagttgcca ctgtgtcccg gtcacgaatt ctccgggacc 240

gtagttgaag ttgggagcgg cgttacaagt gtaaaaccag gggacagggt tgccgtagaa 300

gcgacctctc actgcagtga caggagcagg tataaagaca ccgtggcaca agatttgggc 360

ctgtgcatgg catgtcagtc aggctcacct aactgctgcg ccagtttgag cttctgtggt 420

ttgggtggag cttccggcgg ttttgcggaa tatgtagtat acggagagga tcacatggtg 480

aagttgcctg attccattcc agatgacatc ggcgcactgg ttgagccgat aagcgtggcg 540

tggcacgccg tggaaagagc aagatttcag cccggtcaga cagccctggt actgggcgga 600

ggcccgatag gtcttgcgac gatattagcc ttacaagggc atcacgccgg aaaaattgtt 660

tgctctgagc cagctctaat caggaggcag tttgccaaag agttaggagc agaggttttt 720

gatccaagta cgtgtgatga tgcaaacgcg gtattaaagg caatggtacc ggaaaacgaa 780

ggttttcacg cggcattcga ttgtagcggt gtcccgcaaa ccttcaccac atctatagtt 840

gctacaggcc ccagcgggat cgcggtgaac gtcgctgtat ggggagacca tccgattggc 900

ttcatgccta tgtcccttac ttatcaggag aaatacgcca cgggaagcat gtgttacacc 960

gttaaagatt ttcaggaagt cgtcaaagcg ctagaagacg ggttgattag cctggataaa 1020

gccaggaaaa tgataaccgg aaaggtacac ttgaaggacg gcgtagagaa gggattcaaa 1080

caacttatcg agcataagga aaacaacgtt aaaatcttgg taacgcccaa tgaagtatct 1140

taa 1143

<210> 4

<211> 1341

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 4

atgaagatag tcgtgatcgg cacgaaccac gccggaatag cgacggcgaa cacattacta 60

gaacaatatc ccggtcatga gatcgtcatg atcgacagga atagtaacat gtcctatctt 120

gggtgcggga cagcaatttg ggttggccgt caaatcgaaa aacctgatga gctgttttac 180

gctaaggccg aggatttcga agccaaaggt gtaaaaattc ttacggagac cgaggtcagc 240

gaaatagatt ttgctaataa gaaggtatac gcgaaaacta aatccgacga cgagattata 300

gaagcctatg ataaattagt actagccacc ggcagcaggc ctataatccc caatcttcca 360

ggtaaagacc taaaaggtat ccactttctg aagcttttcc aggagggcca agcgattgac 420

gcagaatttg cgaaggagaa ggtaaagagg atagccgtta ttggagctgg ctatattggt 480

acagagattg cggaggcggc aaagcgtaga ggcaaggaag tacttttgtt cgatgccgaa 540

aatacttcac ttgcatctta ttatgatgag gagttcgcca agggcatgga cgaaaacctg 600

gcccagcacg gcattgagtt acacttcggt gaactagcga aggagtttaa agccaatgag 660

gaaggttacg tttctcagat tgtcacgaac aaagcaactt acgacgtaga tcttgtaatc 720

aactgcatcg gttttacagc taactcagcc ctagctagcg ataaactagc tacgtttaaa 780

aatggtgcca tcaaggtaga taaacatcaa cagagtagcg acccagacgt ttacgccgtg 840

ggggatgtgg caacaattta ctctaatgct ttacaagatt ttacctacat agctttggcc 900

tctaacgccg ttcgtagcgg tattgttgcg ggacacaata taggagggaa agaactagag 960

tctgtcggcg tgcagggatc aaacggtata tcaatctttg gttacaacat gacgtccaca 1020

ggtttatctg tcaaggccgc taagaaactt ggcttggagg tatccttctc agactttgaa 1080

gacaagcaaa aggcctggtt tttgcacgag aacaatgact ctgtcaagat taggattgtt 1140

tatgagacca aaagcagaag aatcataggt gcccaactag ctagtaagag cgaaataata 1200

gccggtaaca taaacatgtt ttccttggcc atacaggaga aaaaaactat tgatgagcta 1260

gctttacttg acttgttctt ccttcctcac ttcaacagtc cctacaatta catgacagta 1320

gcggcgctta acgcaaagta a 1341

<210> 5

<211> 592

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 5

cgataagtgc taaaggaggt gcacgcatta tggagaccac tacgatacga tagctgcgtt 60

gttgttgaag gggtttctta aggttgtttt cgttgaaggt aaatattggt cgtttttgtg 120

cagcatattg tcctctagat gcaaactctg caggtccatt tgcagtaaag tgagttgcct 180

ctcgaagaat cattaatttc gtataaccgt cactattaaa gtcagaaaat aaattctgtc 240

gtagacaatg ttaccataat gttcttgtcc attttgcata cactttaaat attcatttga 300

tttctcaggg ttcatgatca taataaattg cgcattcgca aggcggtagt attataatgg 360

ggtccatcat tctgtagcaa gaagttacag tacgctgttc aagcgttaaa caagataagt 420

aatctcgaat gaaacattca tatttcgcat gagccaacat acagttgctg agtaatcttc 480

attgcgctta tttatcggca ttgagattgt aaaggaagta aaacgcattt ttgcagatct 540

gttctcttat gtatttttaa tcgtccttgt atggaagtat caaaggggac gt 592

<210> 6

<211> 601

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 6

agtgtcacag cgaatttcct cacatgtagg gaccgaattg tttacaagtt ctctgtacca 60

ccatggagac atcaaaaatt gaaaatctat ggaaagatat ggacggtagc aacaagaata 120

tagcacgagc cgcggagttc atttcgttac ttttgatatc actcacaact attgcgaagc 180

gcttcagtga aaaaatcata aggaaaagtt gtaaatatta ttggtagtat tcgtttggta 240

aagtagaggg ggtaattttt cccctttatt ttgttcatac attcttaaat tgctttgcct 300

ctccttttgg aaagctatac ttcggagcac tgttgagcga aggctcatta gatatatttt 360

ctgtcatttt ccttaaccca aaaataaggg aaagggtcca aaaagcgctc ggacaactgt 420

tgaccgtgat ccgaaggact ggctatacag tgttcacaaa atagccaagc tgaaaataat 480

gtgtagctat gttcagttag tttggctagc aaagatataa aagcaggtcg gaaatattta 540

tgggcattat tatgcagagc atcaacatga taaaaaaaaa cagttgaata ttccctcaaa 600

a 601

<210> 7

<211> 1976

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 7

atgtccgcta aatcgtttga agtcacagat ccagtcaatt caagtctcaa agggtttgcc 60

cttgctaacc cctccattac gctggtccct gaagaaaaaa ttctcttcag aaagaccgat 120

tccgacaaga tcgcattaat ttctggtggt ggtagtggac atgaacctac acacgccggt 180

ttcattggta agggtatgtt gagtggcgcc gtggttggcg aaatttttgc atccccttca 240

acaaaacaga ttttaaatgc aatccgttta gtcaatgaaa atgcgtctgg cgttttattg 300

attgtgaaga actacacagg tgatgttttg cattttggtc tgtccgctga gagagcaaga 360

gccttgggta ttaactgccg cgttgctgtc ataggtgatg atgttgcagt tggcagagaa 420

aagggtggta tggttggtag aagagcattg gcaggtaccg ttttggttca taagattgta 480

ggtgccttcg cagaagaata ttctagtaag tatggcttag acggtacagc taaagtggct 540

aaaattatca acgacaattt ggtgaccatt ggatcttctt tagaccattg taaagttcct 600

ggcaggaaat tcgaaagtga attaaacgaa aaacaaatgg aattgggtat gggtattcat 660

aacgaacctg gtgtgaaagt tttagaccct attccttcta ccgaagactt gatctccaag 720

tatatgctac caaaactatt ggatccaaac gataaggata gagcttttgt aaagtttgat 780

gaagatgatg aagttgtctt gttagttaac aatctcggcg gtgtttctaa ttttgttatt 840

agttctatca cttccaaaac tacggatttc ttaaaggaaa attacaacat aaccccggtt 900

caaacaattg ctggcacatt gatgacctcc ttcaatggta atgggttcag tatcacatta 960

ctaaacgcca ctaaggctac aaaggctttg caatctgatt ttgaggagat caaatcagta 1020

ctagacttgt tgaacgcatt tacgaacgca ccgggctggc caattgcaga ttttgaaaag 1080

acttctgccc catctgttaa cgatgacttg ttacataatg aagtaacagc aaaggccgtc 1140

ggtacctatg actttgacaa gtttgctgag tggatgaaga gtggtgctga acaagttatc 1200

aagagcgaac cgcacattac ggaactagac aatcaagttg gtgatggtga ttgtggttac 1260

actttagtgg caggagttaa aggcatcacc gaaaaccttg acaagctgtc gaaggactca 1320

ttatctcagg cggttgccca aatttcagat ttcattgaag gctcaatggg aggtacttct 1380

ggtggtttat attctattct tttgtcgggt ttttcacacg gattaattca ggtttgtaaa 1440

tcaaaggatg aacccgtcac taaggaaatt gtggctaagt cactcggaat tgcattggat 1500

actttataca aatatacaaa ggcaaggaag ggatcatcca ccatgattga tgctttagaa 1560

ccattcgtta aagaatttac tgcatctaag gatttcaata aggcggtaaa agctgcagag 1620

gaaggtgcta aatccactgc tacattcgag gccaaatttg gcagagcttc gtatgtcggc 1680

gattcatctc aagtagaaga tcctggtgca gtaggcctat gtgagttttt gaagggggtt 1740

caaagcgcct tgtaagtact tggctcacga atacatatca agatacttat gatatatata 1800

tatagaaaaa gcttactttt cttggagtta ttgttattat catcgcgaag aacgattgta 1860

taacccggtt caacgcgaaa cgaatcgtta aactggtgaa atgttaacgc gagtgtcaga 1920

gatatacata gtatgagagt agctagatgt tgaatcggtg gtaagaacaa gaagga 1976

<210> 8

<211> 1171

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 8

cacggcatta gtcagggaag tcataacaca gtcctttccc gcaattttct ttttctatta 60

ctcttggcct cctctagtac actctatatt tttttatgcc tcggtaatga ttttcatttt 120

tttttttccc ctagcggatg actctttttt tttcttagcg attggcatta tcacataatg 180

aattatacat tatataaagt aatgtgattt cttcgaagaa tatactaaaa aatgagcagg 240

caagataaac gaaggcaaag atgacagagc agaaagccct agtaaagcgt attacaaatg 300

aaaccaagat tcagattgcg atctctttaa agggtggtcc cctagcgata gagcactcga 360

tcttcccaga aaaagaggca gaagcagtag cagaacaggc cacacaatcg caagtgatta 420

acgtccacac aggtataggg tttctggacc atatgataca tgctctggcc aagcattccg 480

gctggtcgct aatcgttgag tgcattggtg acttacacat agacgaccat cacaccactg 540

aagactgcgg gattgctctc ggtcaagctt ttaaagaggc cctactggcg cgtggagtaa 600

aaaggtttgg atcaggattt gcgcctttgg atgaggcact ttccagagcg gtggtagatc 660

tttcgaacag gccgtacgca gttgtcgaac ttggtttgca aagggagaaa gtaggagatc 720

tctcttgcga gatgatcccg cattttcttg aaagctttgc agaggctagc agaattaccc 780

tccacgttga ttgtctgcga ggcaagaatg atcatcaccg tagtgagagt gcgttcaagg 840

ctcttgcggt tgccataaga gaagccacct cgcccaatgg taccaacgat gttccctcca 900

ccaaaggtgt tcttatgtag tgacaccgat tatttaaagc tgcagcatac gatatatata 960

catgtgtata tatgtatacc tatgaatgtc agtaagtatg tatacgaaca gtatgatact 1020

gaagatgaca aggtaatgca tcattctata cgtgtcattc tgaacgaggc gcgctttcct 1080

tttttctttt tgctttttct ttttttttct cttgaactcg acggatctat gcggtgtgaa 1140

ataccgcaca gatgcgtaag gagaaaatac c 1171

<210> 9

<211> 704

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 9

tgtactaatc caaggaggtt tacggaccag gggaactttc cagattcaga tcacagcaat 60

ataggactag aaaatatcag gtagccgcac tcaacttgta actggcaact actttgcatc 120

aaactccaat taaatgcggt agaatctttt cacaaaaggt actcaacgtc aattcggaaa 180

gcttccttcc ggaatggctt aagtaggttg caatttcttt ttctattagt agctaaaaat 240

gggtcacgtg atctatattc gaaaggggcg gttgcctcag gaaggcaccg gcggtctttc 300

gtccgtgcgg agatatctgc gccgttcagg ggtccatgtg ccttggacga tattaaggca 360

gaaggcagta tcggggcgga tcactccgaa ccgagattag ttaagccctt cccatctcaa 420

gatggggagc aaatggcatt atactcctgc tagaaagtta actgtgcaca tattcttaaa 480

ttatacaaca ttctggagag ctattgttca aaaaacaaac atttcgcagg ctaaaatgtg 540

gagataggat aagttttgta gacatatata aacaatcagt aattggattg aaaatttggt 600

gttgtgaatt gctcttcatt atgcacctta ttcaattatc atcaagaata gtaatagtta 660

agtaaacaca agattaacat aataaaaaaa ataattcttt cata 704

<210> 10

<211> 736

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 10

tatgccgagt cttgggttgc caaactaaga ggccatggaa tatatttgaa tgtttgtgat 60

ttggcttcat tgtaacatgt aagtgaacat caaaagagta ggcattaaaa gatgggacgt 120

cagcactgta cttgtttttg cgactagatt gtaaatcatt ctttatttaa tctctttctt 180

taactactgc ttaaagtata atttggtccg tagtttaata actatactaa gcgtaacaat 240

gcatactgac attataagcc tgaacattac gagtttaagt tgtatgtagg cgttctgtaa 300

gaggttactg cgtaaattat caacgaatgc attggtgtat ttgcgaaagc tacttctttt 360

aacaagtatt tacataagaa taatggtgat ctgctcaact gatttggtga taactctaac 420

ttttttagca acaatttaaa agataattcg aacatatata acagtaggaa gaatttgtgt 480

acgtcaaatt aagataattt agcattacca aagttattaa cctaaacata aaatatatat 540

gagacacatg tggaaatcgt atgaaacaac tgttatgaaa ctgacaagaa tgaatatata 600

gagtaagctc cgcttgtaaa gaggaatcac ttaagtgtat aaatgtctcg acgattactt 660

tagatccaag attgatgatt gatattactc tgtaatactt aagctctttt aatagctcac 720

tgttgtatta cgggct 736

<210> 11

<211> 5156

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 11

taaccgtatt accgcctttg gttacctcac tcattaggca ccccaggctt tacactttat 60

gcttccggct cctatgttgt gtggaattgt gagcggataa caatttcaca caggaaacag 120

ctatgaccat gattacgcca agcgcgcaat taaccctcac taaagggaac aaaagctgga 180

gctcatagct tcaaaatgtt tctactcctt ttttactctt ccagattttc tcggactccg 240

cgcatcgccg taccacttca aaacacccaa gcacagcata ctaaatttcc cctctttctt 300

cctctagggt gtcgttaatt acccgtacta aaggtttgga aaagaaaaaa gagaccgcct 360

cgtttctttt tcttcgtcga aaaaggcaat aaaaattttt atcacgtttc tttttcttga 420

aaattttttt tttgattttt ttctctttcg atgacctccc attgatattt aagttaataa 480

acggtcttca atttctcaag tttcagtttc atttttcttg ttctattaca acttttttta 540

cttcttgctc attagaaaga aagcatagca atctaatcta agttttctag aactagtgga 600

tcccccggga aaaatggaca agaagtactc cattgggctc gatatcggca caaacagcgt 660

cggttgggcc gtcattacgg acgagtacaa ggtgccgagc aaaaaattca aagttctggg 720

caataccgat cgccacagca taaagaagaa cctcattggc gccctcctgt tcgactccgg 780

ggagacggcc gaagccacgc ggctcaaaag aacagcacgg cgcagatata cccgcagaaa 840

gaatcggatc tgctacctgc aggagatctt tagtaatgag atggctaagg tggatgactc 900

tttcttccat aggctggagg agtccttttt ggtggaggag gataaaaagc acgagcgcca 960

cccaatcttt ggcaatatcg tggacgaggt ggcgtaccat gaaaagtacc caaccatata 1020

tcatctgagg aagaagcttg tagacagtac tgataaggct gacttgcggt tgatctatct 1080

cgcgctggcg catatgatca aatttcgggg acacttcctc atcgaggggg acctgaaccc 1140

agacaacagc gatgtcgaca aactctttat ccaactggtt cagacttaca atcagctttt 1200

cgaagagaac ccgatcaacg catccggagt tgacgccaaa gcaatcctga gcgctaggct 1260

gtccaaatcc cggcggctcg aaaacctcat cgcacagctc cctggggaga agaagaacgg 1320

cctgtttggt aatcttatcg ccctgtcact cgggctgacc cccaacttta aatctaactt 1380

cgacctggcc gaagatgcca agcttcaact gagcaaagac acctacgatg atgatctcga 1440

caatctgctg gcccagatcg gcgaccagta cgcagacctt tttttggcgg caaagaacct 1500

gtcagacgcc attctgctga gtgatattct gcgagtgaac acggagatca ccaaagctcc 1560

gctgagcgct agtatgatca agcgctatga tgagcaccac caagacttga ctttgctgaa 1620

ggcccttgtc agacagcaac tgcctgagaa gtacaaggaa attttcttcg atcagtctaa 1680

aaatggctac gccggataca ttgacggcgg agcaagccag gaggaatttt acaaatttat 1740

taagcccatc ttggaaaaaa tggacggcac cgaggagctg ctggtaaagc ttaacagaga 1800

agatctgttg cgcaaacagc gcactttcga caatggaagc atcccccacc agattcacct 1860

gggcgaactg cacgctatcc tcaggcggca agaggatttc tacccctttt tgaaagataa 1920

cagggaaaag attgagaaaa tcctcacatt tcggataccc tactatgtag gccccctcgc 1980

ccggggaaat tccagattcg cgtggatgac tcgcaaatca gaagagacca tcactccctg 2040

gaacttcgag gaagtcgtgg ataagggggc ctctgcccag tccttcatcg aaaggatgac 2100

taactttgat aaaaatctgc ctaacgaaaa ggtgcttcct aaacactctc tgctgtacga 2160

gtacttcaca gtttataacg agctcaccaa ggtcaaatac gtcacagaag ggatgagaaa 2220

gccagcattc ctgtctggag agcagaagaa agctatcgtg gacctcctct tcaagacgaa 2280

ccggaaagtt accgtgaaac agctcaaaga agactatttc aaaaagattg aatgtttcga 2340

ctctgttgaa atcagcggag tggaggatcg cttcaacgca tccctgggaa cgtatcacga 2400

tctcctgaaa atcattaaag acaaggactt cctggacaat gaggagaacg aggacattct 2460

tgaggacatt gtcctcaccc ttacgttgtt tgaagatagg gagatgattg aagaacgctt 2520

gaaaacttac gctcatctct tcgacgacaa agtcatgaaa cagctcaaga ggcgccgata 2580

tacaggatgg gggcggctgt caagaaaact gatcaatggg atccgagaca agcagagtgg 2640

aaagacaatc ctggattttc ttaagtccga tggatttgcc aaccggaact tcatgcagtt 2700

gatccatgat gactctctca cctttaagga ggacatccag aaagcacaag tttctggcca 2760

gggggacagt cttcacgagc acatcgctaa tcttgcaggt agcccagcta tcaaaaaggg 2820

aatactgcag accgttaagg tcgtggatga actcgtcaaa gtaatgggaa ggcataagcc 2880

cgagaatatc gttatcgaga tggcccgaga gaaccaaact acccagaagg gacagaagaa 2940

cagtagggaa aggatgaaga ggattgaaga gggtataaaa gaactggggt cccaaatcct 3000

taaggaacac ccagttgaaa acacccagct tcagaatgag aagctctacc tgtactacct 3060

gcagaacggc agggacatgt acgtggatca ggaactggac atcaatcggc tctccgacta 3120

cgacgtggat catatcgtgc cccagtcttt tctcaaagat gattctattg ataataaagt 3180

gttgacaaga tccgataaaa atagagggaa gagtgataac gtcccctcag aagaagttgt 3240

caagaaaatg aaaaattatt ggcggcagct gctgaacgcc aaactgatca cacaacggaa 3300

gttcgataat ctgactaagg ctgaacgagg tggcctgtct gagttggata aagccggctt 3360

catcaaaagg cagcttgttg agacacgcca gatcaccaag cacgtggccc aaattctcga 3420

ttcacgcatg aacaccaagt acgatgaaaa tgacaaactg attcgagagg tgaaagttat 3480

tactctgaag tctaagctgg tctcagattt cagaaaggac tttcagtttt ataaggtgag 3540

agagatcaac aattaccacc atgcgcatga tgcctacctg aatgcagtgg taggcactgc 3600

acttatcaaa aaatatccca agcttgaatc tgaatttgtt tacggagact ataaagtgta 3660

cgatgttagg aaaatgatcg caaagtctga gcaggaaata ggcaaggcca ccgctaagta 3720

cttcttttac agcaatatta tgaatttttt caagaccgag attacactgg ccaatggaga 3780

gattcggaag cgaccactta tcgaaacaaa cggagaaaca ggagaaatcg tgtgggacaa 3840

gggtagggat ttcgcgacag tccggaaggt cctgtccatg ccgcaggtga acatcgttaa 3900

aaagaccgaa gtacagaccg gaggcttctc caaggaaagt atcctcccga aaaggaacag 3960

cgacaagctg atcgcacgca aaaaagattg ggaccccaag aaatacggcg gattcgattc 4020

tcctacagtc gcttacagtg tactggttgt ggccaaagtg gagaaaggga agtctaaaaa 4080

actcaaaagc gtcaaggaac tgctgggcat cacaatcatg gagcgatcaa gcttcgaaaa 4140

aaaccccatc gactttctcg aggcgaaagg atataaagag gtcaaaaaag acctcatcat 4200

taagcttccc aagtactctc tctttgagct tgaaaacggc cggaaacgaa tgctcgctag 4260

tgcgggcgag ctgcagaaag gtaacgagct ggcactgccc tctaaatacg ttaatttctt 4320

gtatctggcc agccactatg aaaagctcaa agggtctccc gaagataatg agcagaagca 4380

gctgttcgtg gaacaacaca aacactacct tgatgagatc atcgagcaaa taagcgaatt 4440

ctccaaaaga gtgatcctcg ccgacgctaa cctcgataag gtgctttctg cttacaataa 4500

gcacagggat aagcccatca gggagcaggc agaaaacatt atccacttgt ttactctgac 4560

caacttgggc gcgcctgcag ccttcaagta cttcgacacc accatagaca gaaagcggta 4620

cacctctaca aaggaggtcc tggacgccac actgattcat cagtcaatta cggggctcta 4680

tgaaacaaga atcgacctct ctcagctcgg tggagacagc agggctgacc ccaagaagaa 4740

gaggaaggtg tgatctcttc tcgagtcatg taattagtta tgtcacgctt acattcacgc 4800

cctcccccca catccgctct aaccgaaaag gaaggagtta gacaacctga agtctaggtc 4860

cctatttatt tttttatagt tatgttagta ttaagaacgt tatttatatt tcaaattttt 4920

cttttttttc tgtacagacg cgtgtacgca tgtaacatta tactgaaaac cttgcttgag 4980

aaggttttgg gacgctcgaa ggctttaatt tgcggccggt acccaattcg ccctatagtg 5040

agtcgtatta cgcgcgctca ctggccgtcg ttttacaacg tcgtgactgg gaaaaccctg 5100

gctatatatt taataaagag tatcatcttt caaagcgtga gcgaggaagc ggaaga 5156

<210> 12

<211> 6224

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 12

gtgagcgagg aagcggaaga gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg 60

attcattaat gcagctggca cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac 120

gcaattaatg tgagttacct cactcattag gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg 180

gctcctatgt tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa cagctatgac 240

catgattacg ccaagcgcgc aattaaccct cactaaaggg aacaaaagct ggagcttctt 300

tgaaaagata atgtatgatt atgctttcac tcatatttat acagaaactt gatgttttct 360

ttcgagtata tacaaggtga ttacatgtac gtttgaagta caactctaga ttttgtagtg 420

ccctcttggg ctagcggtaa aggtgcgcat tttttcacac cctacaatgt tctgttcaaa 480

agattttggt caaacgctgt agaagtgaaa gttggtgcgc atgtttcggc gttcgaaact 540

tctccgcagt gaaagataaa tgatcgagtg ggagggtccc gtcctgtttt agagctagaa 600

atagcaagtt aaaataaggc tagtccgtta tcaacttgaa aaagtggcac cgagtcggtg 660

gtgctttttt tgttttttat gtcttcgagt catgtaatta gttatgtcac gcttacgttc 720

acgccctccc cccacatccg ctctaaccga aaaggaagga gttagacaac ctgaagtcta 780

ggtccctatt tattttttta tagttatgtt agtattaaga acgttattta tatttcaaat 840

ttttcttttt tttctgtaca gacgcgtgta cgcatgtaac attatactga aaaccttgct 900

tgagaaggtt ttgggacgct cgaaggcttt aatttgcggc cggtacccaa ttcgccctat 960

agtgagtcgt attacgcgcg ctcactggcc gtcgttttac aacgtcgtga ctgggaaaac 1020

cctggcgtta cccaacttaa tcgccttgca gcacatcccc ctttcgccag ctggcgtaat 1080

agcgaagagg cccgcaccga tcgcccttcc caacagttgc gcagcctgaa tggcgaatgg 1140

cgcgacgcgc cctgtagcgg cgcattaagc gcggcgggtg tggtggttac gcgcagcgtg 1200

accgctacac ttgccagcgc cctagcgccc gctcctttcg ctttcttccc ttcctttctc 1260

gccacgttcg ccggctttcc ccgtcaagct ctaaatcggg ggctcccttt agggttccga 1320

tttagtgctt tacggcacct cgaccccaaa aaacttgatt agggtgatgg ttcacgtagt 1380

gggccatcgc cctgatagac ggtttttcgc cctttgacgt tggagtccac gttctttaat 1440

agtggactct tgttccaaac tggaacaaca ctcaacccta tctcggtcta ttcttttgat 1500

ttataaggga ttttgccgat ttcggcctat tggttaaaaa atgagctgat ttaacaaaaa 1560

tttaacgcga attttaacaa aatattaacg tttacaattt cctgatgcgg tattttctcc 1620

ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tagggtaata actgatataa ttaaattgaa 1680

gctctaattt gtgagtttag tatacatgca tttacttata atacagtttt ttagttttgc 1740

tggccgcatc ttctcaaata tgcttcccag cctgcttttc tgtaacgttc accctctacc 1800

ttagcatccc ttccctttgc aaatagtcct cttccaacaa taataatgtc agatcctgta 1860

gagaccacat catccacggt tctatactgt tgacccaatg cgtctccctt gtcatctaaa 1920

cccacaccgg gtgtcataat caaccaatcg taaccttcat ctcttccacc catgtctctt 1980

tgagcaataa agccgataac aaaatctttg tcgctcttcg caatgtcaac agtaccctta 2040

gtatattctc cagtagatag ggagcccttg catgacaatt ctgctaacat caaaaggcct 2100

ctaggttcct ttgttacttc ttctgccgcc tgcttcaaac cgctaacaat acctgggccc 2160

accacaccgt gtgcattcgt aatgtctgcc cattctgcta ttctgtatac acccgcagag 2220

tactgcaatt tgactgtatt accaatgtca gcaaattttc tgtcttcgaa gagtaaaaaa 2280

ttgtacttgg cggataatgc ctttagcggc ttaactgtgc cctccatgga aaaatcagtc 2340

aagatatcca catgtgtttt tagtaaacaa attttgggac ctaatgcttc aactaactcc 2400

agtaattcct tggtggtacg aacatccaat gaagcacaca agtttgtttg cttttcgtgc 2460

atgatattaa atagcttggc agcaacagga ctaggatgag tagcagcacg ttccttatat 2520

gtagctttcg acatgattta tcttcgtttc ctgcaggttt ttgttctgtg cagttgggtt 2580

aagaatactg ggcaatttca tgtttcttca acactacata tgcgtatata taccaatcta 2640

agtctgtgct ccttccttcg ttcttccttc tgttcggaga ttaccgaatc aaaaaaattt 2700

caaggaaacc gaaatcaaaa aaaagaataa aaaaaaaatg atgaattgaa ttgaaaagct 2760

gtggtatggt gcactctcag tacaatctgc tctgatgccg catagttaag ccagccccga 2820

cacccgccaa cacccgctga cgcgccctga cgggcttgtc tgctcccggc atccgcttac 2880

agacaagctg tgaccgtctc cgggagctgc atgtgtcaga ggttttcacc gtcatcaccg 2940

aaacgcgcga gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata 3000

ataatggttt cttagtatga tccaatatca aaggaaatga tagcattgaa ggatgagact 3060

aatccaattg aggagtggca gcatatagaa cagctaaagg gtagtgctga aggaagcata 3120

cgataccccg catggaatgg gataatatca caggaggtac tagactacct ttcatcctac 3180

ataaatagac gcatataagt acgcatttaa gcataaacac gcactatgcc gttcttctca 3240

tgtatatata tatacaggca acacgcagat ataggtgcga cgtgaacagt gagctgtatg 3300

tgcgcagctc gcgttgcatt ttcggaagcg ctcgttttcg gaaacgcttt gaagttccta 3360

ttccgaagtt cctattctct agaaagtata ggaacttcag agcgcttttg aaaaccaaaa 3420

gcgctctgaa gacgcacttt caaaaaacca aaaacgcacc ggactgtaac gagctactaa 3480

aatattgcga ataccgcttc cacaaacatt gctcaaaagt atctctttgc tatatatctc 3540

tgtgctatat ccctatataa cctacccatc cacctttcgc tccttgaact tgcatctaaa 3600

ctcgacctct acatttttta tgtttatctc tagtattact ctttagacaa aaaaattgta 3660

gtaagaacta ttcatagagt gaatcgaaaa caatacgaaa atgtaaacat ttcctatacg 3720

tagtatatag agacaaaata gaagaaaccg ttcataattt tctgaccaat gaagaatcat 3780

caacgctatc actttctgtt cacaaagtat gcgcaatcca catcggtata gaatataatc 3840

ggggatgcct ttatcttgaa aaaatgcacc cgcagcttcg ctagtaatca gtaaacgcgg 3900

gaagtggagt caggcttttt ttatggaaga gaaaatagac accaaagtag ccttcttcta 3960

accttaacgg acctacagtg caaaaagtta tcaagagact gcattataga gcgcacaaag 4020

gagaaaaaaa gtaatctaag atgctttgtt agaaaaatag cgctctcggg atgcattttt 4080

gtagaacaaa aaagaagtat agattctttg ttggtaaaat agcgctctcg cgttgcattt 4140

ctgttctgta aaaatgcagc tcagattctt tgtttgaaaa attagcgctc tcgcgttgca 4200

tttttgtttt acaaaaatga agcacagatt cttcgttggt aaaatagcgc tttcgcgttg 4260

catttctgtt ctgtaaaaat gcagctcaga ttctttgttt gaaaaattag cgctctcgcg 4320

ttgcattttt gttctacaaa atgaagcaca gatgcttcgt tcaggtggca cttttcgggg 4380

aaatgtgcgc ggaaccccta tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct 4440

catgagacaa taaccctgat aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat 4500

tcaacatttc cgtgtcgccc ttattccctt ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc 4560

tcacccagaa acgctggtga aagtaaaaga tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg 4620

ttacatcgaa ctggatctca acagcggtaa gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg 4680

ttttccaatg atgagcactt ttaaagttct gctatgtggc gcggtattat cccgtattga 4740

cgccgggcaa gagcaactcg gtcgccgcat acactattct cagaatgact tggttgagta 4800

ctcaccagtc acagaaaagc atcttacgga tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc 4860

tgccataacc atgagtgata acactgcggc caacttactt ctgacaacga tcggaggacc 4920

gaaggagcta accgcttttt tgcacaacat gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg 4980

ggaaccggag ctgaatgaag ccataccaaa cgacgagcgt gacaccacga tgcctgtagc 5040

aatggcaaca acgttgcgca aactattaac tggcgaacta cttactctag cttcccggca 5100

acaattaata gactggatgg aggcggataa agttgcagga ccacttctgc gctcggccct 5160

tccggctggc tggtttattg ctgataaatc tggagccggt gagcgtgggt ctcgcggtat 5220

cattgcagca ctggggccag atggtaagcc ctcccgtatc gtagttatct acacgacggg 5280

gagtcaggca actatggatg aacgaaatag acagatcgct gagataggtg cctcactgat 5340

taagcattgg taactgtcag accaagttta ctcatatata ctttagattg atttaaaact 5400

tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa gatccttttt gataatctca tgaccaaaat 5460

cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc 5520

ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct 5580

accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg 5640

cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg tagccgtagt taggccacca 5700

cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc 5760

tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga 5820

taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac 5880

gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga 5940

agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag 6000

ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg 6060

acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag 6120

caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca tgttctttcc 6180

tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc tttg 6224

<210> 13

<211> 909

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 13

agaagttagc gagccagcac gtttccttcg cgccggtttt tttttttatt ttttatttaa 60

tttttttcaa aacttgacgt gtagaagatt gacgtctggg gttggcccca tgaatttttt 120

atctatttct tccctgtgcc taattcgtaa tatctccact gatagcgtaa aaaagcgctt 180

tatttttccg aaagttgtga tggcattcca tacagtttat aggatggtag caagtgataa 240

gagcttgggg cccacaatta agcagcagaa aagcgcaatt gcgacactag cagtgtaact 300

cgataggatt ttatggagtg ttgatgaatg tagttgccat tataatggct tctcaggaaa 360

cctgtagcgg ccgggccccg cgagaaactc cagagtggcg taggccggct tgtttagttg 420

ctagcatact tgttcgagct cttgagttct cctggctttt ctccacgtgt ctgcttgttg 480

cctttgattt cgcgagagac tgcggactgc caccccactc cgggaaaacc tggagtgatg 540

gtaaaggccc tgcggcgctt tctttcggaa aaactaatac gaaagaagca acaacaaatt 600

tttacaacag gctggacgag aaaagtgggg aagagcaagc agaaaaaaga aaagagaata 660

gtcgttcttg gataatttat ttattataac cctttttttt caccccagta ctcattaacg 720

aagacaaagg agagtaagaa agcccggtaa agcatttcga agataagaga gccatttatt 780

ctagctcgct tgtaactaca cgagagttga gtatagtgga gacgacatac taccatagcc 840

atgcaaagcc catatccaat gacacaagtg tctaacgttg atgatgggtc actattgaag 900

gagagtaaa 909

<210> 14

<211> 717

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 14

caacagcagc aagagcaaca taccctactg caatcacaaa atacgtcaaa ccaaagtcaa 60

aatcaaaatc aaaatcaaat gatggcttcc agtagttcgt taagtacaac cccgttatta 120

ttgtcaccaa gggtgaatat gattaatact gctatatcca cccaacaaac ccccatttct 180

cagtcggatt cacaagttca agaactggaa acattaccac ccataagaag tttaccgttg 240

cccttcccac acatggactg atacgctgac aagtttttgg cggtgcagat aaatcaaaag 300

acaatagaca agaattaata atattaacaa ttaataatta ataaataata aataataata 360

ataataataa taataataat aataatagta ataataataa taattaataa cgataaaaat 420

atttaattat gatagtaaga atacatattt tgattgtctt agtcttccgc agagataatt 480

aattgttctc attttcaaag tcatctatat gtattgattg agctctactg ttgtttttaa 540

ctttattgtg gccccctaaa atataatttt taccagtatt aaccattttg ctcttattag 600

tacttttact gatggtggaa cccttgaaat ttgtcatggg cgattcaatc catagattgt 660

tattgctgct tccactagtg ttcttgtatg gaattggtgt cgtaggtgcc gtagtca 717

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 15

catacaaact cccaccctcg 20

Claims (4)

1.一种高产红没药烯的酿酒酵母工程菌，其特征在于所述酿酒酵母工程菌按如下方法构建：在增强甘油代谢途径的酿酒酵母菌中，转入红没药烯合成酶基因Agbis，同时敲除葡萄糖阻遏转录因子MIG1，构建得到高产红没药烯的酿酒酵母工程菌；

所述增强甘油代谢途径的酿酒酵母菌按如下步骤制备：第一步使用Gal10启动子高表达甘油转运通道基因PtFPS2；第二步用Gal1启动子高表达甘油脱氢酶基因Opgdh；第三步用Gal7启动子高表达二羟基丙酮激酶基因DAK1；第四步用Gal2启动子高表达NADH氧化酶基因NOXE；

所述红没药烯合成酶基因Agbis核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示；所述葡萄糖阻遏转录因子MIG1核苷酸序列为SEQ ID NO.15所示；

所述甘油转运通道基因PtFPS2核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示；所述甘油脱氢酶基因Opgdh核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示；

所述NADH氧化酶基因NOXE核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示；所述二羟基丙酮激酶基因DAK1核苷酸序列为SEQ ID NO.7所示；

所述酿酒酵母菌为酿酒酵母菌株YS036。

2.一种权利要求1所述酿酒酵母工程菌产红没药烯的方法，其特征在于所述方法为：将权利要求1所述的酿酒酵母工程菌接种至甘油蔗糖合成最小培养基中，加入体积终浓度5-15%的十二烷，培养温度 28-32 ℃ ，转速180-220 rpm，摇瓶发酵培养OD₆₀₀达到8-10，培养物离心，取上清，分离提取，获得红没药烯；所述甘油蔗糖合成最小培养基质量终浓度组成：0.5-1.5%蔗糖，0.5-1.5%甘油，0.17%酵母氮源，0.5%硫酸铵，微量营养素，溶剂为蒸馏水，pH5.0；其中微量营养素是指组氨酸、亮氨酸或尿嘧啶中的一种或多种，在培养基中的终浓度均为20 mg/L。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述蔗糖和甘油在培养基中的质量添加量均为1%。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述酿酒酵母工程菌发酵前先在葡萄糖合成最小固体培养基上划线活化， 30 ℃ 培养48h，取单菌落接种至葡萄糖合成最小培养基，培养温度 30 ℃ ，转速200 rpm，摇瓶培养过夜，作为种子液；取种子液以体积浓度1-5%的接种量接种至甘油蔗糖合成最小培养基；

所述葡萄糖合成最小培养基质量终浓度组成：2%葡萄糖，0.17%酵母氮源，0.5%硫酸铵，微量营养素，溶剂为蒸馏水，pH 5.0；其中微量营养素是指组氨酸、亮氨酸或尿嘧啶中的一种或多种，在培养基中的终浓度均为20 mg/L。

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