CN114350721A

CN114350721A - 微生物酶法生产l-鸟氨酸的方法

Info

Publication number: CN114350721A
Application number: CN202111449726.XA
Authority: CN
Inventors: 曹华杰; 岳明瑞; 谢沛; 郭永胜
Original assignee: Xintai Jiahe Biotech Co ltd
Current assignee: Xintai Jiahe Biotech Co ltd
Priority date: 2021-11-30
Filing date: 2021-11-30
Publication date: 2022-04-15
Anticipated expiration: 2041-11-30
Also published as: CN114350721B

Abstract

本发明公开了一种微生物酶法生产L‑鸟氨酸的方法，包括以下步骤：向含有L‑精氨酸的底物溶液中加入经定点突变改造的人重组精氨酸酶I，在25‑45℃、pH7.2‑7.3的条件下搅拌反应4‑6h，将精氨酸转化生成L‑鸟氨酸；所述底物溶液中含有L‑精氨酸80‑120g/L，磷酸吡哆醛1‑3mg/L，二甲基亚砜0.1‑0.2mg/L；所述经定点突变改造的人重组精氨酸酶I的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。本发明通过对精氨酸酶进行定点突变改造处理，提高了精氨酸酶的催化活性；通过构建生产菌株和优化发酵工艺，实现了对突变改造后的精氨酸酶的工业化生产；通过优化底物溶液的组成，解决了产物鸟氨酸对精氨酸酶反馈抑制的问题，提高了底物中精氨酸的浓度。

Description

微生物酶法生产L-鸟氨酸的方法

技术领域

本发明涉及氨基酸生产技术领域，具体涉及一种微生物酶法生产L-鸟氨酸的方法。

背景技术

L-鸟氨酸(L-ornithine)是碱性氨基酸的一种，但并不参与蛋白质的合成，而是以游离态存在。在生物体内，L-鸟氨酸主要参与尿素循环，对于氨态氮的排出有重要作用。近年来，L-鸟氨酸产品的开发逐渐升温，在医药、保健领域及化学工业的应用也日益广泛，前景一致看好。

现有制备L-鸟氨酸的方法主要有提取法、化学法、微生物发酵法和酶法。其中，提取法制备L-鸟氨酸的成本太高，且提供工艺繁琐，现已很少报道；化学法合成鸟氨酸，原料来源广泛且成本低，但该法经过多步化学反应合成，收率偏低，且合成出的鸟氨酸为DL型混合物，产物的手性拆分亦给该工艺增加了难度和成本；微生物发酵法制备L-鸟氨酸是近年来主要采用的制备工艺之一，用发酵法生产鸟氨酸原料成本低廉，但产量不高；酶法生产鸟氨酸是利用动植物或微生物体内的精氨酸酶作催化剂，水解精氨酸生成鸟氨酸和尿酸。

微生物酶法生产L-鸟氨酸专一性强，反应条件温和，同时底物转化率高，产品较纯，有利于后续分离，但是，微生物酶法生产L-鸟氨酸所面临的主要问题有：精氨酸酶的来源受限，目前工业化生产精氨酸酶的报道相对较少；精氨酸酶的活性也有待提高；另外，产物鸟氨酸对精氨酸酶有着很强的反馈抑制作用，导致现有转化体系中底物精氨酸的浓度一般都不高。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种微生物酶法生产L-鸟氨酸的方法。本发明通过对精氨酸酶进行定点突变改造处理，提高了精氨酸酶的催化活性；通过构建生产菌株和优化发酵工艺，实现了对突变改造后的精氨酸酶的工业化生产；通过优化底物溶液的组成，解决了产物鸟氨酸对精氨酸酶反馈抑制的问题，提高了底物中精氨酸的浓度。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种微生物酶法生产L-鸟氨酸的方法，包括以下步骤：

向含有L-精氨酸的底物溶液中加入经定点突变改造的人重组精氨酸酶I，在25-45℃、pH7.2-7.3的条件下搅拌反应4-6h，将精氨酸转化生成L-鸟氨酸；

所述底物溶液中含有L-精氨酸80-120g/L，磷酸吡哆醛1-3mg/L，二甲基亚砜(DMSO)0.1-0.2mg/L；

所述经定点突变改造的人重组精氨酸酶I的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

优选的，所述底物溶液中含有L-精氨酸100g/L，磷酸吡哆醛2mg/L，二甲基亚砜(DMSO)0.1mg/L。

优选的，在37℃、pH7.25的条件下搅拌反应4-6h。

优选的，所述经定点突变改造的人重组精氨酸酶I由如下方法制备得到：

(1)将人重组精氨酸酶I生产菌的种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养，发酵培养的温度为32-34℃，pH为6.8-7.2，溶氧(DO)为20-40％，搅拌转速180-220rpm；发酵培养至发酵液稀释100倍后的OD₆₀₀值为0.50-0.60时，降温至22℃，向体系中加入IPTG，使IPTG在体系中的终浓度为0.2mmol/L，诱导培养20-28h；

培养过程中监测体系的甘油含量，当体系的甘油含量≤1.0g/L时开始添加补料，通过流加补料使体系中的甘油含量保持在0.5-1g/L；

(2)将步骤(1)诱导培养后的培养液的pH值调至7.1-7.3，过均质机破碎；将细胞破碎后的混合匀浆过陶瓷膜，收集滤液；将滤液稀释至滤液中人重组精氨酸酶I的浓度为8-12g/L，采用镍柱亲和层析，将稀释后的滤液进行挂柱，然后加入牛凝血酶溶液进行切割，用生理盐水洗脱，收集洗脱液；将洗脱液过苯甲脒-琼脂糖凝胶树脂，除去牛凝血酶；将过完苯甲脒-琼脂糖凝胶树脂的洗脱液再过Sephadex G-150葡聚糖凝胶，收集3h-8h流出的液体。将收集的液体通过电渗析进行脱盐，收集淡水，浓缩、干燥，即生产得到人重组精氨酸酶I。

更优选的，步骤(1)中，所述人重组精氨酸酶I生产菌由如下方法构建而成：

将pHT304质粒用NdeⅠ和HincⅡ双酶切处理，将SEQ ID NO.1所示的Pg3启动子序列整合到双酶切处理后的pHT304质粒上，得到质粒pHT304-Pg3，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；再用SphⅠ和SacⅠ对质粒pHT304-Pg3进行双酶切处理，将SEQ ID NO.7所示的arg1基因整合到双酶切处理后的质粒pHT304-Pg3上，获得重组表达载体(pHT304-Pg3-arg1)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；将获得的重组表达载体导入到枯草芽孢杆菌中，构建得到人重组精氨酸酶I生产菌。

更优选的，步骤(1)中，发酵培养基的组成为：蛋白胨12g/L、甘油10g/L、酵母膏8g/L、氯化钠3g/L、硫酸铵2.5g/L、三水磷酸氢二钾4g/L、柠檬酸铁铵0.3g/L、柠檬酸2.1g/L、七水硫酸镁0.5g/L、氨苄青霉素100ppm。

更优选的，步骤(1)中，所述补料中含有甘油400g/L、蛋白胨30g/L、酵母膏100g/L。

本发明的有益效果：

(1)本发明首先采用分子动力学模拟的方法对人重组精氨酸酶I进行了结构优化，将人重组精氨酸酶I的第158位的天冬氨酸突变为谷氨酸。突变后的人重组精氨酸酶I的酶活与野生型人重组精氨酸酶I相比，有了显著的提高。针对突变处理后的人重组精氨酸酶I，本发明进一步构建了相应的生产菌株，选择pHT304质粒作为基础质粒，并对其进行了改造，将Pg3启动子整合到pHT304质粒，Pg3启动子只有在加入IPTG后才开始表达，因此，将启动子进行替换后，菌株前期生长快，进入稳定期所需时间短，进而提高了人重组精氨酸酶I的表达量。

(2)本发明对底物溶液的组成进行了优化，通过添加磷酸吡哆醛和二甲基亚砜，降低了产物鸟氨酸对精氨酸酶反馈抑制，提高了精氨酸酶的转化效率。

附图说明

图1：质粒pHT304-Pg3的结构示意图。

图2：人精氨酸酶I的三维结构示意图。

图3：野生型精氨酸酶I(W-Arginase1)与突变型精氨酸酶I(R-Arginase1)的蛋白主链的均方根偏差(RMSD)曲线。

图4：不同浓度DMSO存在时对突变前后精氨酸酶I催化反应初始速率的影响。

图5：本发明构建的重组表达载体(pHT304-Pg3-arg1)的结构示意图。

图6：本发明构建的重组表达载体(pHT304-Pg3-arg1)的电泳验证。

图7：本发明构建的人重组精氨酸酶I生产菌的菌落PCR验证。

图8：本发明构建的人重组精氨酸酶I生产菌的western blot验证；图中，右侧泳道为Marker。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例和对比例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。其中：

本实施例和对比例中所使用的枯草芽孢杆菌为BS168枯草芽孢杆菌，购自上海北诺生物科技有限公司。

需要说明的是，本发明人重组精氨酸酶I生产菌的构建方法，均采用的是现有的基因工程技术的手段，是本领域技术人员能够重复实施的方法，故无需对其进行生物保藏。

实施例1：人重组精氨酸酶I生产菌的构建

1、质粒改造：

将pHT304质粒(购自优宝生物)用NdeⅠ和HincⅡ双酶切处理，然后将Pg3启动子(序列如SEQ ID NO.1所示)整合到双酶切处理后的pHT304质粒上，构建得到质粒pHT304-Pg3(图1)。

构建得到质粒pHT304-Pg3为单一氨苄青霉素抗性，有乳糖操纵子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

对pHT304质粒进行改造的目的是：一是减少载体的长度，提高其在枯草芽孢杆菌中的表达稳定性；二是将Pg3启动子整合到pHT304质粒中，Pg3启动子只有在加入IPTG后才开始表达，因此，整合Pg3启动子后，菌株前期生长快，进入稳定期所需时间短，进而缩短了人重组精氨酸酶I的表达时间，并且提高了人重组精氨酸酶I的表达量；三是降低诱导表达后对枯草芽孢杆菌菌体生长的影响。

2、arg1基因的优化改造：

从现有数据库中获得人源精氨酸酶I的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；其编码基因arg1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

为提高人重组精氨酸酶I的活性，采用分子动力学模拟的方法对人重组精氨酸酶I进行了结构优化，将人重组精氨酸酶I的第158位的天冬氨酸突变为谷氨酸，突变后的人重组精氨酸酶I的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

人精氨酸酶I的三维结构示意图如图2所示，第158位天冬氨酸(D)是向外突起的，突变为谷氨酸(E)后，不向外突起，且P和V之间的夹角也缩小，所以整体的结构也更加紧凑。

经过50ns的分子动力学模拟，野生型精氨酸酶I(W-Arginase1)与突变型精氨酸酶I(R-Arginase1)的蛋白主链的均方根偏差(RMSD)曲线如图3所示。结果表明，二者在15ns后就接近平衡状态，25ns后基本平衡，RMSD值在0.13-0.15之间，说明点突变对精氨酸酶I的整体结构几乎没有影响。

通过测定不同浓度DMSO存在时对突变前后精氨酸酶I催化反应初始速率的影响，结果如图4所示，当DMSO浓度为30％时，突变型精氨酸酶I的活力上升10.2倍，野生型精氨酸酶I的活力上升4.7倍。

上述结果表明：将人重组精氨酸酶I的第158位的天冬氨酸突变为谷氨酸，能够显著提高精氨酸酶I的催化活性。

为使arg1基因能够更适用于枯草芽孢杆菌表达系统，进一步对编码突变后的人重组精氨酸酶I的arg1基因的核苷酸序列进行了密码子优化；为提高人重组精氨酸酶I在枯草芽孢杆菌中的分泌表达，在密码子优化后的arg1基因的核苷酸序列的基础上，增加了一段信号肽，具体如下：

ATGAAAAGATTTTTGTCCACTTTGTTGATTGGAATGATGCTGGTTACATGTGCCTCGCCGGCATTTGCC。(SEQ ID NO.6)

为方便所表达的人重组精氨酸酶I的分离纯化，进一步的在上述核苷酸序列中增加了凝血酶的酶切位点和10His序列。

最终优化改造后的arg1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

3、重组表达载体的构建：

将改造后的质粒pHT304-Pg3用SphⅠ和SacⅠ双酶切双酶切处理，再将最终优化改造后的arg1基因(SEQ ID NO.7所示)整合到双酶切处理后的质粒pHT304-Pg3上，获得重组表达载体(pHT304-Pg3-arg1)。重组表达载体的结构示意图如图5所示。

将构建的重组表达载体进行电泳验证，结果如图6所示。结果表明：arg1基因(SEQID NO.7所示)已成功整合到质粒pHT304-Pg3上。经测序验证，所构建的重组表达载体(pHT304-Pg3-arg1)的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

4、人重组精氨酸酶I生产菌的构建

将构建的重组表达载体(pHT304-Pg3-arg1)导入到到BS168枯草芽孢杆菌中，获得转化子。将转化子在AMP平板(含100μg/ml AMP的LB平板)上接种，挑出能够在AMP平板中生长的单菌落，将其作为阳性转化子。

对阳性转化子进行菌落PCR验证和western blot验证，菌落PCR验证结果如图7所示，western blot验证结果如图8所示。结果表明：实施例3构建的重组表达载体已成功导入到受体菌中。

由此证明：本实施例已成功构建得到稳定的人重组精氨酸酶I生产菌。

实施例2：人重组精氨酸酶I的发酵生产

(1)菌种活化：

将实施例1构建的人重组精氨酸酶I生产菌划线接种到含有100μg/ml氨苄青霉素的LB平板中，33℃、培养24h。

(2)一级种培养：

从平板划取1接种环菌体接到一级种子培养基(添加50ppm氨苄青霉素的LB液体培养基)中，在33℃、pH7.0、转速200rpm的条件下培养18h。

(3)二级种培养：

以1％(体积分数)接种量，将一级种子液接种于二级种子培养基(添加50ppm氨苄青霉素的LB液体培养基)中，33℃、溶氧(DO)20-40％，培养至稀释100倍的OD_600nm值0.5。

(4)发酵培养：

将L-鸟氨酸生产菌的二级种子液接种至含有发酵培养基的发酵罐(18L)中进行发酵培养，二级种子液的接种量为发酵培养基重量的4％，发酵培养的温度为33℃，pH为7.0，溶氧(DO)为20-40％，搅拌转速200rpm；发酵培养至发酵液稀释100倍后的OD₆₀₀值为0.60时，降温至22℃，向体系中加入IPTG，使IPTG在体系中的终浓度为0.2mmol/L，诱导培养26h；

发酵培养基的组成为：蛋白胨12g/L、甘油10g/L、酵母膏8g/L、氯化钠3g/L、硫酸铵2.5g/L、三水磷酸氢二钾4g/L、柠檬酸铁铵0.3g/L、柠檬酸2.1g/L、七水硫酸镁0.5g/L、氨苄青霉素100ppm。

培养过程中监测体系的甘油含量，当体系的甘油含量≤1.0g/L时开始添加补料，通过流加补料使体系中的甘油含量保持在0.5-1g/L。所述补料中含有甘油400g/L、蛋白胨30g/L、酵母膏100g/L。

上述发酵生产过程中，溶氧(DO)采用溶氧电极测定，溶氧以溶氧电极在空气中的溶氧水平设定为100％，以饱和亚硫酸钠溶液中的溶氧为0。OD₆₀₀和pH值采用取样测定。

(5)人重组精氨酸酶I的收集：

将步骤(4)中诱导培养后的发酵液的pH值调至7.2，过匀质机破碎。将细胞破碎后的混合匀浆过陶瓷膜，收集滤液；陶瓷膜的孔径为100nm，压力0.5MPa。

将滤液稀释至精氨酸酶浓度为10g/L，加入PBS，使PBS的浓度为50mM，过镍柱，流速3m³/h。

镍柱亲和层析条件：以50mM的PBS作为结合缓冲液，将滤液挂柱。

将酶活为2000000U、比活大于2000U/mgpr的牛凝血酶溶于生理盐水得到牛凝血酶溶液，然后加入牛凝血酶溶液进行切割，消化缓冲液采用150mM NaCl，pH7.0，消化温度30℃，切割10h。用生理盐水洗脱，此处洗脱液为洗脱液1。

洗脱液1过苯甲脒-琼脂糖凝胶树脂除去牛凝血酶，苯甲脒-琼脂糖凝胶树脂平衡缓冲液：50mM Tris-HCl，0.5M NaCl，pH7.4，用结合缓冲液(50mM Tris-HCl，0.5M NaCl，pH7.4100cm/h 0.3MPa)吸收牛凝血酶，然后再回收牛凝血酶，牛凝血酶测定比活后可重新使用。

过完苯甲脒-琼脂糖凝胶树脂的洗脱液1再过Sephadex G-150葡聚糖凝胶，收集3h-8h流出的液体。将收集的液体通过电渗析进行脱盐。电渗析的pH控制在7.25，温度控制在40℃以下；淡室电导≤1000μs/cm时，关闭电渗析，将淡水放出。

对淡水进行旋蒸，温度50℃。结晶后放入烘箱烘干，温度40℃。

对精氨酸酶进行冷冻干燥，条件为：

预冻：每分钟温度降低15℃，降至-35℃；速冻：制冷板层-40℃，放入制品机器全速制冷，等待2h开始抽真空；升华干燥：真空值控制在10-30Pa；解析干燥：缓慢升温至+40℃，真空值小于20Pa；关闭冻干箱与冷凝器之间的真空阀门，观察60s，若压力上升小于0.5Pa，冻干结束，得到人重组精氨酸酶I冻干粉。

实施例3：微生物酶法生产L-鸟氨酸

向含有L-精氨酸的底物溶液中加入实施例2制备的人重组精氨酸酶I，人重组精氨酸酶I的加入量为：0.32g/L，即：每L底物溶液中加入0.32g人重组精氨酸酶I；在37℃、pH7.25的条件下搅拌反应5h，将精氨酸转化生成L-鸟氨酸；

所述底物溶液中含有L-精氨酸100g/L，磷酸吡哆醛2mg/L，二甲基亚砜(DMSO)0.1mg/L。

对比例1：

将实施例3中所加入的人重组精氨酸酶I替换为氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的人源精氨酸酶I；其余同实施例2。

对比例2：

将实施例3中的底物溶液调整为L-精氨酸100g/L，磷酸吡哆醛2mg/L；其余同实施例2。

对比例3：

将实施例3中的底物溶液调整为L-精氨酸100g/L，二甲基亚砜0.1mg/L；其余同实施例2。

试验例：

对实施例3、对比例1-对比例3的L-精氨酸转化率进行计算。

L-精氨酸转化率＝(转化了的精氨酸/所有投入的精氨酸)×100％。

结果见表1。

表1：

组别	转化率
		实施例3	99％以上
对比例1	<40％
		对比例2	<20％
对比例3	5-15％

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 新泰市佳禾生物科技有限公司

<120> 微生物酶法生产L-鸟氨酸的方法

<130> 2021

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 366

<212> DNA

<213> Pg3启动子

<400> 1

atatgagcac tctttccact atccctacag tgttatggct tgaacaatca cgaaacaata 60

attggtacgt acgatctttc agccgactca aacatcaaat cttacaaatg tagtctttga 120

aagtattaca tatgtaagat ttaaatgcaa ccgttttttc ggaaggaaat gatgacctcg 180

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<210> 2

<211> 3461

<212> DNA

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<400> 2

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ccttacgcat ctgtgcggta tttcacaccg catatggtgc actctcagta caatctgctc 3120

tgatgccgca tagttaagcc agccccgaca cccgccaaca cccgctgacg cgccctgacg 3180

ggcttgtctg ctcccggcat ccgcttacag acaagctgtg accgtctccg ggagctgcat 3240

gtgtcagagg ttttcaccgt catcaccgaa acgcgcgaga cgaaagggcc tcgtgatacg 3300

cctattttta taggttaatg tcatgataat aatggtttct tagacgtcag gtggcacttt 3360

tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 3420

tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa t 3461

<210> 3

<211> 322

<212> PRT

<213> 人源精氨酸酶I

<400> 3

Met Ser Ala Lys Ser Arg Thr Ile Gly Ile Ile Gly Ala Pro Phe Ser

1 5 10 15

Lys Gly Gln Pro Arg Gly Gly Val Glu Glu Gly Pro Thr Val Leu Arg

20 25 30

Lys Ala Gly Leu Leu Glu Lys Leu Lys Glu Gln Glu Cys Asp Val Lys

35 40 45

Asp Tyr Gly Asp Leu Pro Phe Ala Asp Ile Pro Asn Asp Ser Pro Phe

50 55 60

Gln Ile Val Lys Asn Pro Arg Ser Val Gly Lys Ala Ser Glu Gln Leu

65 70 75 80

Ala Gly Lys Val Ala Glu Val Lys Lys Asn Gly Arg Ile Ser Leu Val

85 90 95

Leu Gly Gly Asp His Ser Leu Ala Ile Gly Ser Ile Ser Gly His Ala

100 105 110

Arg Val His Pro Asp Leu Gly Val Ile Trp Val Asp Ala His Thr Asp

115 120 125

Ile Asn Thr Pro Leu Thr Thr Thr Ser Gly Asn Leu His Gly Gln Pro

130 135 140

Val Ser Phe Leu Leu Lys Glu Leu Lys Gly Lys Ile Pro Asp Val Pro

145 150 155 160

Gly Phe Ser Trp Val Thr Pro Cys Ile Ser Ala Lys Asp Ile Val Tyr

165 170 175

Ile Gly Leu Arg Asp Val Asp Pro Gly Glu His Tyr Ile Leu Lys Thr

180 185 190

Leu Gly Ile Lys Tyr Phe Ser Met Thr Glu Val Asp Arg Leu Gly Ile

195 200 205

Gly Lys Val Met Glu Glu Thr Leu Ser Tyr Leu Leu Gly Arg Lys Lys

210 215 220

Arg Pro Ile His Leu Ser Phe Asp Val Asp Gly Leu Asp Pro Ser Phe

225 230 235 240

Thr Pro Ala Thr Gly Thr Pro Val Val Gly Gly Leu Thr Tyr Arg Glu

245 250 255

Gly Leu Tyr Ile Thr Glu Glu Ile Tyr Lys Thr Gly Leu Leu Ser Gly

260 265 270

Leu Asp Ile Met Glu Val Asn Pro Ser Leu Gly Lys Thr Pro Glu Glu

275 280 285

Val Thr Arg Thr Val Asn Thr Ala Val Ala Ile Thr Leu Ala Cys Phe

290 295 300

Gly Leu Ala Arg Glu Gly Asn His Lys Pro Ile Asp Tyr Leu Asn Pro

305 310 315 320

Pro Lys

<210> 4

<211> 969

<212> DNA

<213> 人源精氨酸酶I

<400> 4

atgagcgcca agtccagaac catagggatt attggagctc ctttctcaaa gggacagcca 60

cgaggagggg tggaagaagg ccctacagta ttgagaaagg ctggtctgct tgagaaactt 120

aaagaacaag agtgtgatgt gaaggattat ggggacctgc cctttgctga catccctaat 180

gacagtccct ttcaaattgt gaagaatcca aggtctgtgg gaaaagcaag cgagcagctg 240

gctggcaagg tggcagaagt caagaagaac ggaagaatca gcctggtgct gggcggagac 300

cacagtttgg caattggaag catctctggc catgccaggg tccaccctga tcttggagtc 360

atctgggtgg atgctcacac tgatatcaac actccactga caaccacaag tggaaacttg 420

catggacaac ctgtatcttt cctcctgaag gaactaaaag gaaagattcc cgatgtgcca 480

ggattctcct gggtgactcc ctgtatatct gccaaggata ttgtgtatat tggcttgaga 540

gacgtggacc ctggggaaca ctacattttg aaaactctag gcattaaata cttttcaatg 600

actgaagtgg acagactagg aattggcaag gtgatggaag aaacactcag ctatctacta 660

ggaagaaaga aaaggccaat tcatctaagt tttgatgttg acggactgga cccatctttc 720

acaccagcta ctggcacacc agtcgtggga ggtctgacat acagagaagg tctctacatc 780

acagaagaaa tctacaaaac agggctactc tcaggattag atataatgga agtgaaccca 840

tccctgggga agacaccaga agaagtaact cgaacagtga acacagcagt tgcaataacc 900

ttggcttgtt tcggacttgc tcgggagggt aatcacaagc ctattgacta ccttaaccca 960

cctaagtaa 969

<210> 5

<211> 322

<212> PRT

<213> 人重组精氨酸酶I

<400> 5

Met Ser Ala Lys Ser Arg Thr Ile Gly Ile Ile Gly Ala Pro Phe Ser

1 5 10 15

Lys Gly Gln Pro Arg Gly Gly Val Glu Glu Gly Pro Thr Val Leu Arg

20 25 30

Lys Ala Gly Leu Leu Glu Lys Leu Lys Glu Gln Glu Cys Asp Val Lys

35 40 45

Asp Tyr Gly Asp Leu Pro Phe Ala Asp Ile Pro Asn Asp Ser Pro Phe

50 55 60

Gln Ile Val Lys Asn Pro Arg Ser Val Gly Lys Ala Ser Glu Gln Leu

65 70 75 80

Ala Gly Lys Val Ala Glu Val Lys Lys Asn Gly Arg Ile Ser Leu Val

85 90 95

Leu Gly Gly Asp His Ser Leu Ala Ile Gly Ser Ile Ser Gly His Ala

100 105 110

Arg Val His Pro Asp Leu Gly Val Ile Trp Val Asp Ala His Thr Asp

115 120 125

Ile Asn Thr Pro Leu Thr Thr Thr Ser Gly Asn Leu His Gly Gln Pro

130 135 140

Val Ser Phe Leu Leu Lys Glu Leu Lys Gly Lys Ile Pro Glu Val Pro

145 150 155 160

Gly Phe Ser Trp Val Thr Pro Cys Ile Ser Ala Lys Asp Ile Val Tyr

165 170 175

Ile Gly Leu Arg Asp Val Asp Pro Gly Glu His Tyr Ile Leu Lys Thr

180 185 190

Leu Gly Ile Lys Tyr Phe Ser Met Thr Glu Val Asp Arg Leu Gly Ile

195 200 205

Gly Lys Val Met Glu Glu Thr Leu Ser Tyr Leu Leu Gly Arg Lys Lys

210 215 220

Arg Pro Ile His Leu Ser Phe Asp Val Asp Gly Leu Asp Pro Ser Phe

225 230 235 240

Thr Pro Ala Thr Gly Thr Pro Val Val Gly Gly Leu Thr Tyr Arg Glu

245 250 255

Gly Leu Tyr Ile Thr Glu Glu Ile Tyr Lys Thr Gly Leu Leu Ser Gly

260 265 270

Leu Asp Ile Met Glu Val Asn Pro Ser Leu Gly Lys Thr Pro Glu Glu

275 280 285

Val Thr Arg Thr Val Asn Thr Ala Val Ala Ile Thr Leu Ala Cys Phe

290 295 300

Gly Leu Ala Arg Glu Gly Asn His Lys Pro Ile Asp Tyr Leu Asn Pro

305 310 315 320

Pro Lys

<210> 6

<211> 69

<212> DNA

<213> 信号肽

<400> 6

atgaaaagat ttttgtccac tttgttgatt ggaatgatgc tggttacatg tgcctcgccg 60

gcatttgcc 69

<210> 7

<211> 1103

<212> DNA

<213> 优化改造后的arg1基因

<400> 7

gcatatgaaa agatttttgt ccactttgtt gattggaatg atgctggtta catgtgcctc 60

gccggcattt gccggccgcg gcgatgtctg ctaaatctcg tacaatcggc atcatcggcg 120

ctcctttctc taaaggccaa cctcgtggcg gcgttgaaga aggccctaca gttcttcgta 180

aagctggcct tcttgaaaaa cttaaagaac aagaatgcga tgttaaagat tacggcgatc 240

ttcctttcgc tgatatccct aacgattctc ctttccaaat cgttaaaaac cctcgttctg 300

ttggcaaagc ttctgaacaa cttgctggca aagttgctga agttaaaaaa aacggccgta 360

tctctcttgt tcttggcggc gatcattctc ttgctatcgg ctctatctct ggccatgctc 420

gtgttcatcc tgatcttggc gttatctggg ttgatgctca tacagatatc aacacacctc 480

ttacaacaac atctggcaac cttcatggcc aacctgtttc tttccttctt aaagaactta 540

aaggcaaagg acctgaagtt cctggcttct cttgggttac accttgcatc tctgctaaag 600

atatcgttta catcggcctt cgtgatgttg atcctggcga acattacatc cttaaaacac 660

ttggcatcaa atacttctct atgacagaag ttgatcgtct tggcatcggc aaagttatgg 720

aagaaacact ttcttacctt cttggccgta aaaaacgtcc tatccatctt tctttcgatg 780

ttgatggcct tgatccttct ttcacacctg ctacaggcac acctgttgtt ggcggcctta 840

cataccgtga aggcctttac atcacagaag aaatctacaa aacaggcctt ctttctggcc 900

ttgatatcat ggaagttaac ccttctcttg gcaaaacacc tgaagaagtt acacgtacag 960

ttaacacagc tgttgctatc acacttgctt gcttcggcct tgctcgtgaa ggcaaccata 1020

aacctatcga ttaccttaac cctcctaaag gccgcggcgc atcatcatca tcatcatcat 1080

catcatcatt aataataagt acc 1103

<210> 8

<211> 4525

<212> DNA

<213> 重组表达载体(pHT304- Pg3- arg1)

<400> 8

ccatcctcca aagttggaga gtgagtttta tgtcgcaaat attaatgttt ctggtgaacc 60

ttatcaaatt ttcgttgatt taatagaaac atagcggtaa aattagcagt aacttaatag 120

aacggaaatg aaaaaagcca ctctcatatg agcactcttt ccactatccc tacagtgtta 180

tggcttgaac aatcacgaaa caataattgg tacgtacgat ctttcagccg actcaaacat 240

caaatcttac aaatgtagtc tttgaaagta ttacatatgt aagatttaaa tgcaaccgtt 300

ttttcggaag gaaatgatga cctcgtttcc accggaatta gcttggtacc agctattgta 360

acataatcgg tacgggggtg aaaaagctaa cggaaaaggg agcggaaaag aatgatgtaa 420

gcgtgaaaaa ttttttatct tatcacttga cattggaagg gagattcttt ataataagaa 480

tgtggaattg tgagcggata acaatttcaa ctcaactgtt tactaaaaat cagtttcatc 540

aagcaatgaa acacgccaaa gtaaacaatt taagtaccat tacttatgag caagtattgt 600

ctatttttaa tagttatcta ttatttaacg ggaggaaata attctatgag tcgctttttt 660

aaatttggaa agttacacgt tactaaaggg aatggagata aattattaga tatactactg 720

acagcttcca agaaggtaaa gaggtcccta gcgcctacgg ggaatttgta tcgggattga 780

aaaaggaaga gtatgagtat tcaacatttc cgtgtcgccc ttattccctt ttttgcggca 840

ttttgccttc ctgtttttgc tcacccagaa acgctggtga aagtaaaaga tgctgaagat 900

cagttgggtg cacgagtggg ttacatcgaa ctggatctca acagcggtaa gatccttgag 960

agttttcgcc ccgaagaacg ttttccaatg atgagcactt ttaaagttct gctatgtggc 1020

gcggtattat cccgtattga cgccgggcaa gagcaactcg gtcgccgcat acactattct 1080

cagaatgact tggttgagta ctcaccagtc acagaaaagc atcttacgga tggcatgaca 1140

gtaagagaat tatgcagtgc tgccataacc atgagtgata acactgcggc caacttactt 1200

ctgacaacga tcggaggacc gaaggagcta accgcttttt tgcacaacat gggggatcat 1260

gtaactcgcc ttgatcgttg ggaaccggag ctgaatgaag ccataccaaa cgacgagcgt 1320

gacaccacga tgcctgtagc aatggcaaca acgttgcgca aactattaac tggcgaacta 1380

cttactctag cttcccggca acaattaata gactggatgg aggcggataa agttgcagga 1440

ccacttctgc gctcggccct tccggctggc tggtttattg ctgataaatc tggagccggt 1500

gagcgtgggt ctcgcggtat cattgcagca ctggggccag atggtaagcc ctcccgtatc 1560

gtagttatct acacgacggg gagtcaggca actatggatg aacgaaatag acagatcgct 1620

gagataggtg cctcactgat taagcattgg taactgtcag accaagttta ctcatatata 1680

ctttagattg atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa gatccttttt 1740

gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc 1800

gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg 1860

caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact 1920

ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg 1980

tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg 2040

ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac 2100

tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca 2160

cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga 2220

gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc 2280

ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct 2340

gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg 2400

agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct 2460

tttgctcaca tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc 2520

tttgagtgag ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc 2580

gaggaagcgg aagagcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat 2640

taatgcagct ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg caacgcaatt 2700

aatgtgagtt agctcactca ttaggcaccc caggctttac actttatgct tccggctcgt 2760

atgttgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagcta tgaccatgat 2820

tacgccaagc ttgcatatga aaagattttt gtccactttg ttgattggaa tgatgctggt 2880

tacatgtgcc tcgccggcat ttgccggccg cggcgatgtc tgctaaatct cgtacaatcg 2940

gcatcatcgg cgctcctttc tctaaaggcc aacctcgtgg cggcgttgaa gaaggcccta 3000

cagttcttcg taaagctggc cttcttgaaa aacttaaaga acaagaatgc gatgttaaag 3060

attacggcga tcttcctttc gctgatatcc ctaacgattc tcctttccaa atcgttaaaa 3120

accctcgttc tgttggcaaa gcttctgaac aacttgctgg caaagttgct gaagttaaaa 3180

aaaacggccg tatctctctt gttcttggcg gcgatcattc tcttgctatc ggctctatct 3240

ctggccatgc tcgtgttcat cctgatcttg gcgttatctg ggttgatgct catacagata 3300

tcaacacacc tcttacaaca acatctggca accttcatgg ccaacctgtt tctttccttc 3360

ttaaagaact taaaggcaaa ggacctgaag ttcctggctt ctcttgggtt acaccttgca 3420

tctctgctaa agatatcgtt tacatcggcc ttcgtgatgt tgatcctggc gaacattaca 3480

tccttaaaac acttggcatc aaatacttct ctatgacaga agttgatcgt cttggcatcg 3540

gcaaagttat ggaagaaaca ctttcttacc ttcttggccg taaaaaacgt cctatccatc 3600

tttctttcga tgttgatggc cttgatcctt ctttcacacc tgctacaggc acacctgttg 3660

ttggcggcct tacataccgt gaaggccttt acatcacaga agaaatctac aaaacaggcc 3720

ttctttctgg ccttgatatc atggaagtta acccttctct tggcaaaaca cctgaagaag 3780

ttacacgtac agttaacaca gctgttgcta tcacacttgc ttgcttcggc cttgctcgtg 3840

aaggcaacca taaacctatc gattacctta accctcctaa aggccgcggc gcatcatcat 3900

catcatcatc atcatcatca ttaataataa gtaccgagct cgaattcact ggccgtcgtt 3960

ttacaacgtc gtgactggga aaaccctggc gttacccaac ttaatcgcct tgcagcacat 4020

ccccctttcg ccagctggcg taatagcgaa gaggcccgca ccgatcgccc ttcccaacag 4080

ttgcgcagcc tgaatggcga atggcgcctg atgcggtatt ttctccttac gcatctgtgc 4140

ggtatttcac accgcatatg gtgcactctc agtacaatct gctctgatgc cgcatagtta 4200

agccagcccc gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct gacgggcttg tctgctcccg 4260

gcatccgctt acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct gcatgtgtca gaggttttca 4320

ccgtcatcac cgaaacgcgc gagacgaaag ggcctcgtga tacgcctatt tttataggtt 4380

aatgtcatga taataatggt ttcttagacg tcaggtggca cttttcgggg aaatgtgcgc 4440

ggaaccccta tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct catgagacaa 4500

taaccctgat aaatgcttca ataat 4525

Claims

1.一种微生物酶法生产L-鸟氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

所述底物溶液中含有L-精氨酸80-120g/L，磷酸吡哆醛1-3mg/L，二甲基亚砜0.1-0.2mg/L；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述底物溶液中含有L-精氨酸100g/L，磷酸吡哆醛2mg/L，二甲基亚砜0.1mg/L。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在37℃、pH7.25的条件下搅拌反应4-6h。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述经定点突变改造的人重组精氨酸酶I由如下方法制备得到：

(1)将人重组精氨酸酶I生产菌的种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养，发酵培养的温度为32-34℃，pH为6.8-7.2，溶氧为20-40％，搅拌转速180-220rpm；发酵培养至发酵液稀释100倍后的OD₆₀₀值为0.50-0.60时，降温至22℃，向体系中加入IPTG，使IPTG在体系中的终浓度为0.2mmol/L，诱导培养20-28h；

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述人重组精氨酸酶I生产菌由如下方法构建而成：

将pHT304质粒用NdeⅠ和HincⅡ双酶切处理，将SEQ ID NO.1所示的Pg3启动子序列整合到双酶切处理后的pHT304质粒上，得到质粒pHT304-Pg3，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；再用SphⅠ和SacⅠ对质粒pHT304-Pg3进行双酶切处理，将SEQ ID NO.7所示的arg1基因整合到双酶切处理后的质粒pHT304-Pg3上，获得重组表达载体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；将获得的重组表达载体导入到枯草芽孢杆菌中，构建得到人重组精氨酸酶I生产菌。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，发酵培养基的组成为：蛋白胨12g/L、甘油10g/L、酵母膏8g/L、氯化钠3g/L、硫酸铵2.5g/L、三水磷酸氢二钾4g/L、柠檬酸铁铵0.3g/L、柠檬酸2.1g/L、七水硫酸镁0.5g/L、氨苄青霉素100ppm。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述补料中含有甘油400g/L、蛋白胨30g/L、酵母膏100g/L。