CN106434611A - 一种以l‑精氨酸为原料的l‑鸟氨酸双酶耦合制备方法 - Google Patents

一种以l‑精氨酸为原料的l‑鸟氨酸双酶耦合制备方法 Download PDF

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Abstract

一种以L‑精氨酸为原料的L‑鸟氨酸双酶耦合制备方法，属于生物工程技术领域。本发明涉及一株芽孢杆菌（Rummeliibacillus pycnus ）SK31.001，利用分子生物技术，将来源于该菌株的精氨酸酶异源过量表达。该精氨酸酶区别于其他精氨酸酶，在Ni2+催化下，在pH6.5环境下具有较高酶活。经镍柱纯化后得到的精氨酸酶与商业化的刀豆脲酶双酶耦合制备L‑鸟氨酸。以L‑精氨酸为底物，在40‑50℃、pH6.5的反应条件下，经5h的转化反应，可得37.8 g/L的L‑鸟氨酸。L‑精氨酸的转化率达99.7%，且反应中生成的尿素被除去。本发明经济环保、速度快，产品纯度高，应用前景广泛。

Description

一种以L-精氨酸为原料的L-鸟氨酸双酶耦合制备方法
技术领域
本发明涉及一种L-鸟氨酸的双酶耦合制备方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
L-鸟氨酸是一种不参与蛋白质组成、含有两个-NH2和一个-COOH的碱性氨基酸。L-鸟氨酸普遍存在于生物体内，是尿素循环的中间代谢产物，是瓜氨酸、L-精氨酸等多种氨基酸代谢的前体物质，对体内聚集的氨具有解毒作用，可促进氨态氮的排出，因而对人体肝脏细胞具有重要意义。近年来的研究还发现，L-鸟氨酸具有以下生理或物理化学功能：1、保肝护肝；2、减肥保健；3、促进伤口愈合及增强免疫力；4、抑制苦味。2002年12月日本厚生劳动省发布通告，将L-鸟氨酸作为食品原料来看待；在欧美L-鸟氨酸也被广泛用于提高基础代谢、预防肥胖以及增强肌肉合成的膳食补充剂。正是基于L-鸟氨酸所具有的诸多作用，目前对有关L-鸟氨酸的功能、制备及应用等各方面研究也悄然成为研究的热点领域。
目前用于L-鸟氨酸生产的方法主要有4种：发酵法、天然提取法、化学合成法和酶法。但L-鸟氨酸在自然界中存量较小，不足以大量提取；化学合成法也因合成所需的化学物质有毒且会产生消旋体而受到限制；发酵法生产虽然原料价格低廉，但对菌种的依赖性强；菌种有回复突变的问题；补料发酵和连续发酵控制起来难度较大，产量较低，发酵液中成分复杂，不利于L-鸟氨酸下游的分离纯化工作等。而利用精氨酸酶酶法水解L-精氨酸制备L-鸟氨酸就是一个经济实用且绿色环保的方法，因此对精氨酸酶研究的热点、广度及深度也进一步增强。
酶法是利用动植物或微生物体内的精氨酸酶作为催化剂，水解L-精氨酸生成L-鸟氨酸和尿素，反应式如下。
精氨酸酶的来源不易，传统的酶法采用的精氨酸酶取自动物肝脏，但动物来源的精氨酸酶其热稳定性较差且酶活不高。生物酶法是目前工业上的热点方法，利用分子生物技术和基因工程技术，可以将外源的精氨酸酶基因表达于合适的载体，从而高效表达得到大量稳定性好且高活性的精氨酸酶。相比于传统动物来源精氨酸酶具有较强的竞争力。
酶法生产L-鸟氨酸会产生唯一的副产物尿素，而脲酶可以高效的分解尿素，生成碳酸氢铵。本发明深入调查和研究了多种微生物来源的精氨酸酶，发现来源于Rummeliibacillus pycnus SK31.001的精氨酸酶具有在微酸性环境下受二价镍离子催化的特性。验证了该来源的精氨酸酶可与刀豆脲酶在同一反应条件下共同作用。实现了一步法将L-精氨酸转化为L-鸟氨酸并除去副产物尿素，并在后续的纯化过程中，只需简单的通过加热及酸碱环境微调整即可得到高纯度的L-鸟氨酸。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够在同一条件下反应的双酶体系。
本发明的另一个目的是提供一种以L-精氨酸为原料的L-鸟氨酸双酶耦合制备方法，它能够得到高转化率的L-鸟氨酸。
本发明的再一个目的是提供一种以L-精氨酸为原料的L-鸟氨酸双酶耦合制备方法，它能够除去反应过程中生成的尿素。
为实现上述目的，本发明提供一种由实验室保藏的芽孢杆菌（Rummeliibacillus pycnus ）SK31.001（已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号 CCTCC NO：M 2011466，发明专利公开号：CN102433288A）。能够生产精氨酸酶的菌株，并利用分子生物技术，将其精氨酸酶基因异源表达于E.coli BL21（DE3）中，得到能够在pH6.5环境下受Ni2+催化的精氨酸酶。纯化的精氨酸酶与刀豆来源的脲酶耦合作用，得到高转化率的L-鸟氨酸并除去了反应过程中生成的尿素。
本发明技术方案：
一株产精氨酸酶的菌株，其分类命名为芽孢杆菌（Rummeliibacillus pycnus ）SK31.001，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为 CCTCC NO：M2011466，发明专利公开号：CN102433288A。一种从微生物Rummeliibacillus pycnus SK31.001 的基因组扩增获得的编码精氨酸酶的基因序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1，其氨基酸序列为SEQ IDNO：2。
一种以L-精氨酸为原料的L-鸟氨酸双酶耦合制备方法，其步骤包括：
（1）异源过量表达精氨酸酶
首先PCR扩增来源于Rummeliibacillus pycnus SK31.001的精氨酸酶基因，采用基因工程方法构建重组表达质粒pET-28a（+）-arg；将重组表达载体转化至E.coli BL21（DE3），获得基因工程菌株BL21（DE3）-pET-28a（+）-arg，该重组菌株能高效表达有高活性的精氨酸酶；
（2）精氨酸酶的提取
将重组菌株BL21（DE3）-pET-28a（+）-arg阳性菌落转接于LB培养基中，过夜培养作为种子液；将种子液接入LB发酵培养基中，培养至OD600为0.6，加入终浓度为0.4mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG进行诱导，12h后收集菌体；将收集的菌体超声破碎，离心取上清得到粗酶液；将粗酶液过镍柱纯化，得到纯精氨酸酶；
酶学性质研究
分别对重组精氨酸酶与刀豆来源的脲酶进行酶学性质研究。精氨酸酶受Ni2+催化，最适温度为70℃，最适pH为6.5，于50℃下保温24h其残余酶活仍有80%以上；脲酶受Ni2+催化，最适温度为50℃，最适pH为7.0，于50℃下保温24h其残余酶活仍有80%以上；
（3）双酶耦合制备L-鸟氨酸
将精氨酸酶与脲酶投入转化液中进行转化，其转化条件为：底物L-精氨酸浓为50g/L，加入精氨酸酶与脲酶各0.1μmol，转化温度为40-50℃，转化液缓冲体系pH为6.5，转化时间为5h，L-鸟氨酸可达37.8 g/L，转化率为99.7%；
（4）产物鉴定及L-鸟氨酸产量检测。
本发明的有益效果：通过分子生物学手段从微生物中克隆获得精氨酸酶基因，可外源表达获得大量的精氨酸酶，且刀豆脲酶已经可以商业化生产，易于获得。Rummeliibacillus pycnus 来源的精氨酸酶具有在pH6.5条件下受Ni2+催化的特性，该特性与刀豆脲酶性质相近可用于双酶耦合制备L-鸟氨酸并去除副产物尿素。在L-精氨酸底物浓度为50g/L，转化温度40-50℃，转化pH为6.5的条件下，添加两种酶制剂可在5h转化得到37.8 g/L L-鸟氨酸，转化率为99.7%。
附图说明
图1. pH对精氨酸酶与脲酶的影响
图2. 温度对精氨酸酶与脲酶的影响
图3. 精氨酸酶与脲酶的pH稳定性
图4. 精氨酸酶与脲酶的热稳定性
图5. 双酶耦合转化L-精氨酸反应。
具体实施方式
在下面的实施例中进一步说明了本发明，但不限制本发明的范围。
实施例1：Rummeliibacillus pycnus SK31.001精氨酸酶编码基因的核苷酸序列及基因克隆
1. 提取Rummeliibacillus pycnus SK31.001的总DNA，以其基因组为模板，使用特异性引物P1（加入BamH Ⅰ酶切位点）和P2（加入Xho Ⅰ酶切位点），经PCR扩增得到所要的DNA片段。引物设计如下：
上游引物P1：5’-cgcggatcca tggaatcatt aaaaatatca atga-3’，
下游引物P2：5’-ccgctcgagt taaactaaag tctcaccaaa taa-3’，
聚合酶链式反应条件：采用TKARA公司的PrimeSTAR DNA polymerase，95℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸5s，进行30个循环；最后于4℃保温。PCR反应结束后，用1%的琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物，于凝胶成像仪观察照相。
2. 将电泳分离的特异性目的片段进行切胶，然后利用胶回收试剂盒回收目的片段PCR产物，经限制性内切酶BamH Ⅰ和Xho Ⅰ进行双酶切，与经过同样双酶切的质粒pET-28a（+）在T4连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pET-28a（+）-arg。
3. 将重组质粒pET-28a（+）-arg转化至感受态E.coli BL21（DE3）中，涂布在含有50μg/L卡那霉素抗性的LB固体培养基上，37℃培养过夜，得到初步阳性菌落。挑取阳性克隆菌落于5mL LB液体培养基（含卡那霉素）中，37℃摇床振荡培养12h。提取质粒，限制性内切酶BamH Ⅰ和Xho Ⅰ进行双酶切验证，根据电泳结果判断是否为具有目的基因片段的质粒，并将确定的质粒送去上海生物工程有限公司测序。目的基因测序结果为SEQ ID NO：1，编码氨基酸序列为SEQ ID NO：2。
实施例2：Rummeliibacillus pycnus SK31.001精氨酸酶的异源表达和分离纯化
1. 将重组质粒pET-28a（+）-arg转化至感受态E.coli BL21（DE3）中，涂布在含有50μg/L卡那霉素抗性的LB固体培养基上，37℃培养过夜，得到初步阳性菌落。
2. 挑取阳性克隆菌落于5mL LB液体培养基（含卡那霉素）中，37℃摇床振荡培养12h作为种子液。以1%的添加量转接至LB发酵培养基中，37℃培养至OD600为0.6，加入终浓度为0.4mmol/L的IPTG并在28℃下进行诱导，12h后收集菌体。4℃、8000rpm离心弃上清。
3. 收集的菌体用Tris缓冲液（pH7.0）重新悬浮，并超声破碎细胞，4℃、 10000rpm离心，取上清即得到精氨酸酶的粗酶液。
4. 利用镍柱纯化的方法，获得重组Rummeliibacillus pycnus SK31.001精氨酸酶。
实施例3：精氨酸酶与脲酶的酶学性质检测
1.底物浓度为100mmol/L，精氨酸酶浓度为0.06μmol，反应温度为70℃，反应时间10min，在pH 5.0-10.0间进行反应并加入接触媒氯化镍（1mmol/L）。测定精氨酸酶最适pH。结果表明（图1）重组精氨酸酶最适pH范围为6.0-7.0。
2. 底物浓度为100mmol/L，脲酶浓度为0.06μmol，反应温度为50℃，反应时间10min，在pH 5.0-10.0间进行反应并加入接触媒氯化镍（1mmol/L）。测定脲酶最适pH。结果表明（图1）重组刀豆脲酶最适pH范围为6.0-7.5。
3.底物浓度为100mmol/L，精氨酸酶浓度为0.06μmol，pH6.5，反应时间10min，在30-80℃间进行反应并加入接触媒氯化镍（1mmol/L）。测定精氨酸酶最适温度。结果表明（图2）重组精氨酸酶适于反应的温度范围为60-70℃。
4. 底物浓度为100mmol/L，脲酶浓度为0.06μmol，pH7.0，反应时间10min，在30-80℃间进行反应并加入接触媒氯化镍（1mmol/L）。测定脲酶最适温度。结果表明（图2）刀豆脲酶适于反应的温度范围为30-60℃。
5. 将精氨酸酶与脲酶置于不同pH，4℃下保存24h，测定精氨酸酶与脲酶的残余酶活，研究其pH稳定性。结果表明（图3）精氨酸酶与脲酶在pH6.0-8.0间24h内能保持90%以上酶活。
6. 将精氨酸酶与脲酶置于不同温度下，pH6.5下保存24h，每隔一定时间测定精氨酸酶与脲酶的残余酶活，研究其温度稳定性。结果表明（图4）精氨酸酶与脲酶在40-50℃下24h能够保持80%以上酶活。
实施例4：酶反应转化生产L-鸟氨酸
200mL反应体系中：底物浓度50g/L，盐酸调节pH至6.5，接触媒氯化镍至终浓度1mmol/L，反应温度为45℃，加入精氨酸酶与脲酶各0.1μmol。酶反应进行中在各时间点测定底物与产物的量并记录。发现该双酶耦合法具有高效的L-鸟氨酸合成能力且能有效的去除反应副产物尿素，见图5。在50 g/L底物浓度的生产中，反应5h即可得到99.7%摩尔转化的L-鸟氨酸产物，且尿素被脲酶消耗掉。
SEQ ID NO.1
<211>906
<212>DNA
<213>芽孢杆菌（Rummeliibacillus pycnus ）SK31.001
<400>1
atggaatcat taaaaatatc aatgattggg gttcctatgg atatggggca gttacgcaga 60
ggtgttgata tgggtccaag tgcaattcgc tatgctggcg cggttgaacg tttaataaat 120
attggtcata cagtaataga tgatggggat atctatattg accattcaaa aaaagaaagt 180
tctacaaatt cagcattaag aaatttagag gcagttattg aagcaaatac taagttagct 240
caaaaagttc atgaaatagt agagaaagga agattccctt tagtactggg tggtgatcat 300
agtattgcga taggtacgtt agctggaatt tcagatcact acgaaaatct aggtgttatt 360
tggtatgatg ctcatgcaga tatgaataca agtgaaacat caccctcagg aaatattcat 420
ggcatgccat tagctgttag catgggtatt ggtgatgaag gtttggtaaa tattaaagga 480
tatgcgccta aagtaaaacc tgagaatatt gttattatcg gtgcacgttc tattgatcag 540
ggtgagaagc aattaattcg tgaaaaaggt ataaaagtat attcaatgca tgaaattgat 600
cgtctaggca tgactgatgt tatacaagat gcaattattt atttaaaagg tcaaaatgta 660
gatggcgttc atttatctct agatttagat ggcattgatc cgatatatac tccaggagta 720
ggaacaccag tgccaggtgg aataacatac agagaaagtc atctagccat ggaaatgttg 780
caagaatcag gtttagttac atctgcagaa tttgtagaag tcaatccaat acttgatgaa 840
agaaataaaa cagctgacgt agcagttgct ttaatgggtt cattatttgg tgagacttta 900
gtttaa 906
SEQ ID NO.1
<211>301
<212>PRT
<213>精氨酸酶
<400>2
MET Glu Ser Leu Lys Ile Ser MET Ile Gly Val Pro MET Asp MET
5 10 15
Gly Gln Leu Arg Arg Gly Val Asp MET Gly Pro Ser Ala Ile Arg
20 25 30
Tyr Ala Gly Ala Val Glu Arg Leu Ile Asn Ile Gly His Thr Val
35 40 45
Ile Asp Asp Gly Asp Ile Tyr Ile Asp His Ser Lys Lys Glu Ser
50 55 60
Ser Thr Asn Ser Ala Leu Arg Asn Leu Glu Ala Val Ile Glu Ala
65 70 75
Asn Thr Lys Leu Ala Gln Lys Val His Glu Ile Val Glu Lys Gly
80 85 90
Arg Phe Pro Leu Val Leu Gly Gly Asp His Ser Ile Ala Ile Gly
95 100 105
Thr Leu Ala Gly Ile Ser Asp His Tyr Glu Asn Leu Gly Val Ile
110 115 120
Trp Tyr Asp Ala His Ala Asp MET Asn Thr Ser Glu Thr Ser Pro
125 130 135
Ser Gly Asn Ile His Gly MET Pro Leu Ala Val Ser MET Gly Ile
140 145 150
Gly Asp Glu Gly Leu Val Asn Ile Lys Gly Tyr Ala Pro Lys Val
155 160 165
Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Ile Gly Ala Arg Ser Ile Asp Gln
170 175 180
Gly Glu Lys Gln Leu Ile Arg Glu Lys Gly Ile Lys Val Tyr Ser
185 190 195
MET His Glu Ile Asp Arg Leu Gly MET Thr Asp Val Ile Gln Asp
200 205 210
Ala Ile Ile Tyr Leu Lys Gly Gln Asn Val Asp Gly Val His Leu
215 220 225
Ser Leu Asp Leu Asp Gly Ile Asp Pro Ile Tyr Thr Pro Gly Val
230 235 240
Gly Thr Pro Val Pro Gly Gly Ile Thr Tyr Arg Glu Ser His Leu
245 250 255
Ala MET Glu MET Leu Gln Glu Ser Gly Leu Val Thr Ser Ala Glu
260 265 270
Phe Val Glu Val Asn Pro Ile Leu Asp Glu Arg Asn Lys Thr Ala
275 280 285
Asp Val Ala Val Ala Leu MET Gly Ser Leu Phe Gly Glu Thr Leu
290 295 300
Val ***
301

Claims (5)

1.一种从微生物Rummeliibacillus pycnus SK31.001 的基因组扩增获得的编码精氨酸酶的基因序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1，其氨基酸序列为SEQ ID NO：2。
2.一种以L-精氨酸为原料的L-鸟氨酸双酶耦合制备方法，其特征在于步骤包括：
（1）异源过量表达精氨酸酶
首先PCR扩增来源于Rummeliibacillus pycnus SK31.001的精氨酸酶基因，采用基因工程方法构建重组表达质粒pET-28a（+）-arg；将重组表达载体转化至E.coli BL21（DE3），获得基因工程菌株BL21（DE3）-pET-28a（+）-arg，该重组菌株能高效表达有高活性的精氨酸酶；
（2）精氨酸酶的提取
将重组菌株BL21（DE3）-pET-28a（+）-arg阳性菌落转接于LB培养基中，过夜培养作为种子液；将种子液接入LB发酵培养基中，培养至OD600为0.6，加入终浓度为0.4mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG进行诱导，12h后收集菌体；将收集的菌体超声破碎，离心取上清得到粗酶液；将粗酶液过镍柱纯化，得到纯精氨酸酶；
（3）双酶耦合制备L-鸟氨酸
将精氨酸酶与脲酶投入转化液中进行转化，其转化条件为：底物L-精氨酸浓为50g/L，加入精氨酸酶与脲酶各0.1μmol，转化温度为40-50℃，转化液缓冲体系pH为6.5，转化时间为5h；
（4）产物鉴定及L-鸟氨酸产量检测。
3.根据权利要求2所述以L-精氨酸为原料的L-鸟氨酸双酶耦合制备方法，其特征在于所用脲酶来源于刀豆，从阿拉丁试剂公司购得。
4.根据权利要求2所述以L-精氨酸为原料的L-鸟氨酸双酶耦合制备方法，其特征在于转化液缓冲体系pH为6.5，且反应过程中用盐酸调节控制pH在6.5。
5.根据权利要求2所述以L-精氨酸为原料的L-鸟氨酸双酶耦合制备方法，其特征在于，转化液体系中接触媒为镍离子Ni2+。
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