CN116179521A - 一种精氨酸酶突变体、其重组体及其在连续催化中的应用 - Google Patents
一种精氨酸酶突变体、其重组体及其在连续催化中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种精氨酸酶突变体、其重组体及其在连续催化中的应用，该精氨酸酶与辅助侵染蛋白残基突变体基因的融合表达后，构建出外泌的固定化酶，能够外泌到培养基中，在温度和偏中性的pH下与其生产细胞结合。本发明利用其与自身生产细胞一步纯化‑固定化的功能，获得稳定性提高的活性酶，为酶法工业化生产提供有效途径。该突变体耐受的pH域宽，解决了原始蛋白残基与活性酶融合表达最适pH不匹配的难点，且融合表达后的酶同时具有催化活性域与固定化能力，具有广泛的工业化应用场景。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物酶固定化技术领域，特别涉及一种精氨酸酶突变体、其重组体及其在连续催化中的应用。
背景技术
催化剂的发现为工业化生产加速，生物酶作为一种天然高分子催化剂，具有催化效率高、特异性强，反应条件温和、无有机试剂污染的特点。然而，由于游离生物酶的物理化学性质不稳定，导致在实际应用过程中生物酶无法长期保持催化活性，也就无法发挥其最大的催化性能。生物酶固定化技术的出现不仅实现了酶的重复利用，而且可以改善酶的催化性能及活性。
L-鸟氨酸是生物体内的一种非蛋白氨基酸，参与蛋白质、糖以及脂肪的分解代谢。研究表明，L-鸟氨酸在保肝护肝、促进病人康复方面疗效显著，同时作为一种功能性氨基酸，L-鸟氨酸能够改善营养，具有保健作用，目前L-鸟氨酸已被广泛应用于制药、工业、保健和食品生产，其市场前景远大。目前精氨酸酶的工业应用主要在于酶法生产L-鸟氨酸。专利CN201510287808中的催化体系底物浓度低，酶不能循环，不具备工业化前景；专利CN201510376778和专利CN2015105264161利用菌的全细胞转化生产L-鸟氨酸，精氨酸转化率高于98％，但反应体系所需的缓冲盐给分离造成了较大困扰，且酶无法循环。基因编码区随机的突变可使酶的结构改变，从而提高热力学稳定性或者动力学稳定性，从而提高酶的催化活性。专利CN201610895796获得了一种耐热精氨酸酶的基因，但催化底物浓度低，不具备工业化前景。
微生物表面展示技术是近年来应用极为广泛的一种基因工程技术，通过锚定蛋白和外源蛋白的基因序列共表达，使表达的外源蛋白以融合蛋白的形式展现于微生物细胞表面，并保持相对独立的空间结构和生物活性。将外源蛋白表面展示于微生物细胞表面，提高酶的稳定性并且实现了酶的固定化。而整个微生物细胞可以直接作为全细胞催化剂，减少了底物和产物的胞内运输过程，克服了跨膜阻力的影响，提高了反应速率；此外，与胞内酶相比，一方面避免了胞内蛋白酶和肽酶的水解作用，有利于维持酶活力的稳定和产物的积累；然而，一般所选择的锚定蛋白都是外膜蛋白或转运蛋白，在细胞外表面上的位点有限，且表达后过多的结合，富集于细胞表面，不利于细胞摄取营养物质进行生长和代谢。另一方面，锚定蛋白本身作为蛋白质，其组成氨基酸，与酶催化所需要的最适条件匹配的概率并不高，表面展示后用于催化反应，与细胞固定化的结合力可能大打折扣。这也是现有的细胞固定化体系不能应用于所有酶的原因之一。
总之，本领域亟需一种能够降低生产成本、提高经济效益、实现酶的重复利用，还能解决酶回收难、成本高等问题的新技术。
发明内容
针对现有技术中的不足之处，本发明中的精氨酸酶的突变体具有提高的热稳定性及催化温度，进一步将精氨酸酶突变基因与辅助侵染蛋白残基突变体的基因的融合表达，构建出外泌的固定化酶，该酶可在合适的pH和温度下与其生产细胞结合，完成一步纯化-固定化过程，形成稳定性提高的酶以及连续催化生产，为酶法工业化生产提供有效途径。该突变体耐受的pH域广，与活性酶进行融合表达，融合表达后的酶同时具有催化活性域与固定化能力。
本发明第一方面提供了一种精氨酸酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明另一方面提供了一种精氨酸酶重组质粒，所述重组质粒为将辅助侵染蛋白残基突变体的基因与精氨酸酶突变体的基因重组；其中，所述辅助侵染蛋白残基突变体的基因，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述精氨酸酶突变体的基因，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明第二方面提供了一种重组质粒的外泌精氨酸酶重组菌体，所述重组菌体是通过将辅助侵染蛋白残基突变体的基因与精氨酸酶突变体的基因进行融合表达而得，其中，所述辅助侵染蛋白残基突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述精氨酸酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步地，所述重组菌体的宿主选自谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或乳酸菌中的一种。
所述突变体精氨酸酶蛋白能够在重组菌体发酵过程中外泌表达，分布于发酵液中，大量生产后不会影响细胞营养的摄入和代谢空间；且突变体与突变的酶蛋白融合表达后的菌体相对于原始菌株具有更宽的pH稳定条件(pH7.5-9.5)。
本发明第三方面提供了一种上文所述的精氨酸酶重组菌体在在连续催化中的应用，包括利用所述精氨酸酶重组菌体发酵获得的精氨酸酶在其生产菌株上的自固定化过程。
进一步地，所述发酵过程中的底物溶液为浓度50-650g/L的L-精氨酸溶液、1.8-8.5g/L氯化锰；pH为7.5-9.5。
进一步地，所述发酵过程中的底物溶液为浓度600-650g/的L-精氨酸溶液、1.8-7g/L氯化锰；pH为8.0-8.5。
进一步地，所述重组菌体发酵所得的精氨酸酶在其生产菌株上自固定化得精氨酸酶固定化载体后，进行发酵培养，发酵过程中的精氨酸酶固定化载体的浓度为40-100g/50L，发酵培养结束后，通过调节温度为室温，pH中性条件下，离心分离不溶物与反应溶液，将不溶物重新投入到新的底物溶液中重复所述固定化过程，进行新一轮发酵；如此循环不少于23次，每次发酵时间不超过6h。这是一种纯化-固定化的连续催化工艺，其适用范围广，具有良好的工业应用价值。
进一步地，所述发酵的条件为40～60℃、pH7.5-9.5。更进一步地，所述发酵的条件为55℃、pH8.0-8.5。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1.一种热稳定性提高的精氨酸酶突变体；
2.辅助侵染蛋白IAP残基突变体与突变的精氨酸酶蛋白融合表达的设计方案，能够同时实现催化过程和外泌酶的纯化固定化；
3.与表面展示不同，培养过程中外泌精氨酸酶外泌表达，分布于发酵液中，大量生产后不会影响细胞营养的摄入和代谢空间；
4.所述固定化酶的催化工艺可放大和循环，其能够在25次的循环次数下仍保持催化活性；产物浓度不降低。
5.固定化酶能够高效催化高浓度精氨酸(600g/L)生成鸟氨酸。
6.通过本申请的对比例和实施例数据对比分析可知：所获得的外泌蛋白能够在特定的环境下(在pH7.5附近结合、室温)固定化到基质上，所述基质来源于生产蛋白的基因工程细胞——实施例为外泌蛋白的宿主细胞。
附图说明
图1不同pH下固定化酶结合效果比较；
图2不同温度下固定化酶结合效果比较
图3催化过程的放大后的鸟氨酸产量。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细地描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
本发明中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从商业途径购买。
热稳定性测定：用PBS将含有活性酶的细胞稀释至10g/L，在45℃和55℃下孵育，每次取一定体积使得反应体系中活性酶的细胞浓度为0.5g/L，在50g/L底物体系中测定孵育不同时间的残余酶活。
实施例1
1.质粒和菌株构建
将密码子优化后的精氨酸酶的编码基因(SEQ ID NO:1)送生工合成并在两端引入XbaI和EcoRI酶切位点，连入pXMJ19质粒，获得pXMJ-BSA质粒。质粒经菌落PCR和测序验证正确后转入到谷氨酸棒杆菌中，得到C.g-pXMJ-BSA菌株。质粒测序获得突变体pXMJ-BSA-SS质粒，同样转入到谷氨酸棒杆菌中，得到C.g-pXMJ-BSA-SS菌株。
将辅助侵染蛋白IAP残基(SEQ ID No.3)的编码基因、辅助侵染蛋白IAP残基突变体V69H(SEQ ID NO:4)的编码基因在质粒pXMJ-BSA-SS上与BSA基因的突变体BSA-SS融合表达，经测序验证正确后同样转入谷氨酸棒杆菌中，命名为C.g-pXMJ-iap-BSA-SS和C.g-pXMJ-iapV69H-BSA-SS。
④蛋白的表达
将C.g-pXMJ-BSA和C.g-pXMJ-BSA-SS工程菌接入含有20mg/L氯霉素的BHI培养基中，35℃，200rpm过夜培养后按照10％的接种量转接入新鲜的含有50mg/L的BHI培养基中，35℃，200rpm培养至OD562＝0.6～0.8时后加入0.2mMIPTG进行诱导，诱导12h后收集细胞。
将C.g-pXMJ-iap-BSA-SS和C.g-pXMJ-iapV69H-BSA-SS工程菌接入含有20mg/L氯霉素的BHI培养基中，35℃，200rpm过夜培养后按照10％的接种量转接入新鲜的含有50mg/L氯霉素的BHI培养基中，35℃，200rpm培养至OD562＝0.6～0.8时后加入0.2mMIPTG进行诱导，诱导12h。
⑤融合酶的纯化固定化
将C.g-pXMJ-iap-BSA-SS和C.g-pXMJ-iapV69H-BSA-SS的发酵液调至25-30℃，pH7.5下结合1h，洗涤一次后即为固定于细胞表面的纯酶，亦为固定化酶。
实施例2
不同pH对精氨酸酶及其突变体效果的影响
反应体系如下：50g/L的精氨酸溶液中加入2g/L氯化锰，用30％盐酸/20％硫酸调节pH＝7.5-9.5，投入0.5g/L的C.g-pXMJ-BSA-SS、C.g-pXMJ-BSA；C.g-pXMJ-iap-BSA-SS、C.g-pXMJ-iapV69H-BSA-SS的细胞，在45℃下反应60min取样，用10％三氯乙酸等比例终止反应，8000rpm离心5min后，HPLC检测产物鸟氨酸的浓度及底物精氨酸剩余。
在上述反应体系中，比较pH对反应效果的影响。从图1中可以看出，精氨酸酶的突变没有影响其最适pH，均为pH＝8.0-8.5，而融合表达辅助侵染残基的序列后，其最适pH略有扩张。C.g-pXMJ-iap-BSA-SS的最佳范围为pH＝7.5-8.5、C.g-pXMJ-iapV69H-BSA-SS的则是pH＝7.5-9.0。并且可以看出，C.g-pXMJ-iap-BSA-SS的催化效果在相同的时刻差于C.g-pXMJ-iapV69H-BSA-SS。
实施例3
不同温度对结合效果的影响
反应体系如下：50g/L的精氨酸溶液中加入2g/L氯化锰，用30％盐酸/20％硫酸调节至各自的最佳pH，投入0.5g/L的C.g-pXMJ-BSA-SS、C.g-pXMJ-BSA；C.g-pXMJ-iap-BSA-SS、C.g-pXMJ-iapV69H-BSA-SS的细胞，在40～60℃下反应，每隔10～30min取样，用10％三氯乙酸等比例终止反应，8000rpm离心5min后，HPLC检测产物鸟氨酸的浓度及底物精氨酸剩余。
在上述反应体系中，比较温度对反应效果的影响。从图2中可以看出，精氨酸酶的突变使得其最适温度C.g-pXMJ-BSA-SS比C.g-pXMJ-BSA提高，由45℃提高至55℃，且反应速度增快；而融合表达辅助侵染残基的序列后，C.g-pXMJ-iap-BSA-SS、C.g-pXMJ-iapV69H-BSA-SS最适温度均为55℃。
将各个细胞分别于45℃和55℃下孵育，以未孵育时酶活为100％，测定孵育不同时间的残余酶活。突变体C.g-pXMJ-BSA-SS相对于C.g-pXMJ-BSA的热稳定性明显提升，6h时，45℃下，突变体的残余酶活是C.g-pXMJ-BSA的1.07倍，55℃下是1.11倍；12h时该差距已增加至1.15倍和1.31倍，孵育24h，C.g-pXMJ-BSA-SS的残余酶活是C.g-pXMJ–BSA的1.39倍和2.48倍。融合表达对于酶的热稳定性影响不大，C.g-pXMJ-iapV69H-BSA-SS的热稳定性相比于C.g-pXMJ-BSA-SS略有提升，在孵育24h后可见3.7％的差距。
表3精氨酸酶及其突变体、固定化酶的热稳定性
实施例4催化过程的放大
在50L的反应体系中，将600g/L的精氨酸溶液，额外添加6.5g/L氯化锰，用30％盐酸/20％硫酸调节pH8.0-8.5，分别投入40～100g固定化酶C.g-pXMJ-iapV69H-BSA-SS，在55℃下反应，每隔1-2h取样，用10％三氯乙酸等比例终止反应，8000rpm离心5min后，HPLC检测产物鸟氨酸的浓度及底物精氨酸剩余。图3中可观察到，放大后的反应在2-6h达到终点，产物鸟氨酸浓度达430g/L，转化率达99.5％。
在50L反应体系下，酶的投入量在40-100g范围内都能够将600g/L的精氨酸完全催化生成鸟氨酸，更少的酶在6h内不足以完成这一催化过程。
实施例5
试验组-固定化酶的循环
取60g固定化酶C.g-pXMJ-iapV69H-BSA-SS，投入到600g/L，pH＝8.0-8.5的L-精氨酸溶液中，加入6.5g/L氯化锰，反应体积为50L，在55℃下反应4h可生成430±5g/L的L-鸟氨酸。
反应结束后，调节溶液pH＝7.5，降低温度至25-30℃，离心分离不溶物与反应溶液，将不溶物重新投入到600g/L，pH＝8.0-8.5的L-精氨酸溶液中，加入6.5g/L氯化锰，反应体积为50L，在55℃下反应，每隔1h取样检测产物浓度及底物剩余；如此循环25次产物浓度不降低，且能保证每次反应时间在4-6h内。
对比组1
取60g固定化酶C.g-pXMJ-iapV69H-BSA-SS，投入到600g/L，pH＝8.0-8.5的L-精氨酸中，加入6.5g/L氯化锰，反应体积为50L，在55℃下反应4h可生成430±5g/L的L-鸟氨酸。
反应结束后，离心分离不溶物与反应溶液，将不溶物重新投入到600g/L，pH＝8.0-8.5的L-精氨酸溶液中，反应体积为50L，在55℃下反应，每隔1h取样检测产物浓度及底物剩余；如此循环的次数有所降低，最多能够达到15次循环的情况下保证产物浓度不降低，但每次反应时间逐渐延长，甚至延长1-2小时，最后的循环在10h才完成，延长的反应时间不利于规模化生产中的实际应用。
对比组2
取60g固定化酶C.g-pXMJ-iap-BSA-SS，投入到600g/L，pH＝8.0的L-精氨酸中，反应体积为50L，在55℃下反应6h可生成380±3g/L的L-鸟氨酸，继续反应，可在反应进行8h后检测到415±5g/L的L-鸟氨酸。
反应结束后，调节溶液pH＝7.5，降低温度至25-30℃，离心分离不溶物与反应溶液，将不溶物重新投入到600g/L，pH＝8.0的L-精氨酸溶液中，反应体积为50L，在55℃下反应，每隔2h取样检测产物浓度及底物剩余；尽管每次将pH调至最适的回收条件，但更长的反应时间使得只能维持循环11次产物浓度不降低，且每次反应时间都有所延长，在第11次循环时，反应时间已经超过了16h，明显不适合规模化生产。
实施例6
按照常规操作在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、乳酸菌中表达iapV69H-BSA-SS的融合酶，培养结束后将发酵液调至25-30℃，pH7.5下结合1h，洗涤一次后，将细胞浓度调整至600g/50L，与一定浓度精氨酸溶液按合适比例混合，使得精氨酸溶度为600g/L，细胞浓度为60g/50L，小心维持混合过程中pH＝8.0-8.5，加入6.5g/L氯化锰，反应体积为50L，在55℃下，分别在3.6h、3h、5h检测不到底物峰，L-鸟氨酸浓度435±5g/L。反应结束后，调节溶液pH＝7.5，降低温度至25-30℃，离心分离不溶物与反应溶液，将不溶物重新投入底物溶液中进行反应，有效循环次数分别达到26次、30次和22次。
对比例1
游离酶
将获得的C.g-pXMJ-BSA-SS工程菌接入含有20mg/L的BHI培养基中，35℃，200rpm过夜培养后按照10％的接种量转接入新鲜的含有20mg/L的BHI培养基中，35℃，200rpm培养12h后加入0.2mMIPTG进行诱导，诱导12h后收集细胞，将细胞浓度调整为600g/50L后破碎，与一定浓度精氨酸溶液按合适比例混合，使得精氨酸溶度为600g/L，细胞浓度为60g/50L，小心维持混合过程中pH＝8.0-8.5，加入6.5g/L氯化锰，反应体积为50L，在55℃下反应4h可生成435g/L的L-鸟氨酸。
上清液具有较高的催化活性，但不能实现连续催化。同时，由于细胞最终反应液组分较为复杂，增加了分离成本。
对比例2
细胞表面展示
构建以C末端截短NCgl1221蛋白(SEQNO:5)作为锚定蛋白，与BSA基因融合表达，连接于pXMJ19质粒上，转入谷氨酸棒杆菌，构建菌株命名为C.g-pXMJ-NCg11221-BSA-SS，接入含有20mg/L氯霉素的BHI培养基中，35℃，200rpm过夜培养后按照10％的接种量转接入新鲜的含有20mg/L的BHI培养基中，35℃，200rpm培养至OD562＝0.6～0.8时加入0.2mMIPTG进行诱导，诱导12h后分别收集不溶物和上清。不溶物洗涤一次后即为表面展示细胞。
同样培养条件下，细胞的生物量低于将酶分泌于培养液中；说明细胞表面展示的位点可能并不能完全分布于细胞表面，或者布满表面后不利于细菌物质代谢，影响了生长。
取60g表面展示细胞，投入到600g/L，pH＝8.0-8.5的精氨酸溶液中，额外加入6.5g/L氯化锰，反应体积为50L，在55℃下反应，每隔1h取样检测产物浓度及底物剩余。在4h时鸟氨酸产量达269g/L，是固定化酶催化效率的62％。
对比例3
包埋法固定化
1)海藻酸钠载体制备：将海藻酸钠用15g甘油浸润，然后加入约75mL去离子水，搅拌溶解后，加入1％聚乙二醇辛基苯基醚、0.8％聚乙二醇、0.5mM二硫苏糖醇，搅拌溶解，得到终浓度为4.5％海藻酸钠溶液；2)培养C.g-pXMJ-BSA-SS细胞，收集后将细胞浓度调整至60g/50L后破碎，破碎酶液加入步骤(1)制备的海藻酸钠溶液，二者混合均匀，得到海藻酸钠酶溶液；3)用恒流泵外接注射器针头将海藻酸钠酶匀速速度滴入到5％的CaCl2溶液中搅拌固定；4)过滤，PBS缓冲液反复洗涤凝胶沉淀，干燥，得到粒状固定化精氨酸酶。
取上述固定化产物，投入到600g/L，pH＝8.0-8.5的精氨酸溶液中，额外加入6.5g/L氯化锰，反应体积为50L，在55℃下反应，取样检测产物浓度及底物剩余。9.5h时可检测到底物消失，鸟氨酸产量达430g/L，转化率接近99％，是固定化酶催化效率的42.1％。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，本领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。
Claims (10)
1.一种精氨酸酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种精氨酸酶重组质粒，其特征在于，所述重组质粒为将辅助侵染蛋白残基突变体的基因与精氨酸酶突变体的基因重组；其中，所述辅助侵染蛋白残基突变体的基因，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述精氨酸酶突变体的基因，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种含权利要求1所述重组质粒的外泌精氨酸酶重组菌体，其特征在于，所述重组菌体是通过将辅助侵染蛋白残基突变体的基因与精氨酸酶突变体的基因进行融合表达而得，其中，所述辅助侵染蛋白残基突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述精氨酸酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求3所述的重组菌体，其特征在于，所述重组菌体的宿主选自谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或乳酸菌中的一种。
5.如权利要求3所述的精氨酸酶重组菌体在在连续催化中的应用，其特征在于：包括利用所述精氨酸酶重组菌体发酵获得的精氨酸酶在其生产菌株上的自固定化过程。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述发酵过程中的底物溶液为浓度50-650g/L的L-精氨酸溶液或者L-精氨酸盐酸盐溶液、1.8-8.5g/L氯化锰；pH为7.5-9.5。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述发酵过程中的底物溶液为浓度600-650g/的L-精氨酸溶液或者L-精氨酸盐酸盐溶液、1.8-7g/L氯化锰；pH为8.0-8.5。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述重组菌体发酵所得的精氨酸酶在其生产菌株上自固定化得精氨酸酶固定化载体后，进行发酵培养，发酵过程中的精氨酸酶固定化载体的浓度为40-100g/50L，发酵培养结束后，通过调节温度为室温，pH中性条件下，离心分离不溶物与反应溶液，将不溶物重新投入到新的底物溶液中重复所述固定化过程，进行新一轮发酵；如此循环不少于25次，每次发酵时间不超过6h。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述发酵的条件为40～60℃、pH7.5-9.5。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述发酵的条件为55℃、pH8.0-8.5。
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