CN116179499A - 一种二肽合成酶突变体、其重组体及在高浓度底物连续循环催化中的应用 - Google Patents
一种二肽合成酶突变体、其重组体及在高浓度底物连续循环催化中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种二肽合成酶突变体、其重组体及在高浓度底物连续循环催化中的应用，通过二肽合成酶突变基因与辅助侵染蛋白残基突变体的基因的融合表达，构建出外泌的固定化酶，所述辅助侵染蛋白残基突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述二肽合成酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；该酶可在中性pH和室温下与其生产细胞结合，完成一步纯化‑固定化过程，形成稳定性提高的酶以及连续催化生产，为酶法工业化生产提供有效途径。该突变体耐受的pH域广，与活性酶进行融合表达，融合表达后的酶同时具有催化活性域与固定化能力，具有广泛的工业化应用场景。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物酶固定化技术领域，特别涉及一种二肽合成酶突变体、其重组体及在高浓度底物连续循环催化中的应用。
背景技术
催化剂的发现为工业化生产加速，生物酶作为一种天然高分子催化剂，具有催化效率高、特异性强，反应条件温和、无有机试剂污染的特点。然而，由于游离生物酶的物理化学性质不稳定，导致在实际应用过程中生物酶无法长期保持催化活性，也就无法发挥其最大的催化性能。生物酶固定化技术的出现不仅实现了酶的重复利用，而且可以改善酶的催化性能及活性。
L-肌肽是由β-丙氨酸和L-组氨酸缩合得到的活性二肽，被广泛用作于化妆品、药品和保健品添加剂。目前工业上肌肽的制备主要通过提取法和化学法完成，其中邻苯二甲酸酐法技术相对成熟，应用比较广泛，但此法溶剂消耗较大，副产物较多，环境污染较严重。已报道的生物酶法合成肌肽的技术，主要以β-丙氨酰胺与L-组氨酸为底物，以重组β-氨肽酶整细胞为催化剂，产量最高为3.7g/L(Microb Biotechnol.2010；3(1):74-83.)，但现在市场上β-丙氨酰胺的价格与L-肌肽相差不大，因此采用该技术进行肌肽的合成，成本非常高，缺乏工业化生产的可能性。Ueda课题组以人脑cDNA文库为模板，克隆获得的肌肽水解酶hCN1，在酵母中进行表面展示表达，并在两相体系中使用酵母整细胞作为催化剂，催化β-丙氨酸和L-组氨酸的逆水解反应合成L-肌肽，反应体系中L-组氨酸浓度为100mM，β-丙氨酸浓度为500mM，产物L-肌肽的浓度仅为4.5mM(Appl Microbiol,2010,86(6):1895-1902)。L-氨基酸连接酶和截断的肌肽合成酶具有合成肌肽的可能性，但是生产能力较低，不具有产业化的价值。其中底物产量较高的，专利CN201910040733.0中利用L-氨基酸连接酶合成肌肽，反应体系中L-组氨酸浓度为100mM，β-丙氨酸浓度为100mM，产物L-肌肽的浓度仅为31mM。许建和等通过理性设计对以来源于原核生物的二肽水解酶VaPepD进行优化。改造得到的SmPepD转化6h，产物浓度达到15.2g/L(Catal SciTechnol,2019,9,5971–5978)。但该反应体系，中β-丙氨酸极度过量，是L-组氨酸的29倍，原子经济性极差。进一步，该课题组构建突变体库，得到了不需要锰离子激活的突变体酶，能够在24h催化6.5Mβ-丙氨酸和645mM L-组氨酸生成20.8g/L肌肽(CN202011182797.3一种重组肌肽水解酶突变体及其应用)。该路线中无需对原料进行衍生化处理，并且无需使用任何有机溶剂，是一条绿色环保的L-肌肽合成工艺路线。但该体系中底物β-丙氨酸是L-组氨酸的10倍，且反应时间长，工业化生产上经济性不高。可见，现有报道中，能够合成肌肽的酶品种少，催化剂活性相对较低，反应时间长，产物浓度低，更不用说能够实现连续催化，不适合工业化生产要求。因此，需要获得活性高、稳定性好、能够连续催化获得较高浓度产物的酶，以满足工业化生产L-肌肽的需求。
总之，本领域亟需一种能够降低生产成本、提高经济效益、实现酶的重复利用，还能解决酶回收难、成本高等问题的新技术。
发明内容
针对现有技术中的不足之处，本发明构建了二肽合成酶的突变体表达菌株，该突变体具有更高的催化温度和温度耐受性，具有更高的反应速率并且能够催化更高浓度的底物反应。通过二肽合成酶突变基因与辅助侵染蛋白残基突变体的基因的融合表达，构建出外泌的固定化酶，该酶可在中性pH(7.5)和室温(25℃)下与其生产细胞结合，完成一步纯化-固定化过程，形成稳定性提高的酶以及连续催化生产，为酶法工业化生产提供有效途径。该突变体耐受的pH域广，与活性酶进行融合表达，融合表达后的酶同时具有催化活性域与固定化能力。
本发明第一方面提供了一种二肽合成酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明另一方面提供了一种二肽合成酶重组质粒，所述重组质粒为将辅助侵染蛋白残基突变体的基因与二肽合成酶突变体的基因重组；其中，所述辅助侵染蛋白残基突变体的基因，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述二肽合成酶突变体的基因，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明第二方面提供了一种外泌二肽合成酶重组菌体；所述外泌二肽合成酶重组菌体是通过将辅助侵染蛋白残基突变体的基因与二肽合成酶突变体的基因进行融合表达而得，所述辅助侵染蛋白残基突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述二肽合成酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步地，所述二肽合成酶重组菌体的宿主选自谷氨酸棒杆菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌或乳酸菌中的一种。
所述二肽合成酶重组菌体发酵过程中能够外泌表达二肽合成酶突变体，分布于发酵液中，大量生产后不会影响细胞营养的摄入和代谢空间；且外泌二肽合成酶重组菌体相对于原始菌株具有更宽的pH稳定条件。
本发明第三方面提供了一种上文所述的二肽合成酶重组菌体在高浓度底物连续循环催化中的应用；其包括利用所述重组菌体发酵获得的二肽合成酶在其生产菌株上的自固定化过程，发酵过程中的底物溶液包括L-组氨酸与β-丙氨酸以(150-450mM)：(200-550mM)计。更优选的底物溶液I包括L-组氨酸与β-丙氨酸以(200-400mM)：(250-500mM)计。
进一步优选的，所述底物溶液I包括：L-组氨酸150-450mM、β-丙氨酸200-550mM、MgSO4·7H2O 100-200mM、ATP 100-350mM，pH＝7.0-9.5。优选范围：L-组氨酸400mM、β-丙氨酸500mM、MgSO4·7H2O 150mM、ATP 300mM，pH＝7.0-9.5，温度25-35℃。
进一步地，所述自固定化过程还包括：所述重组菌体发酵所得的二肽合成酶在其生产菌株上自固定化得二肽合成酶固定化载体后，进行发酵培养，发酵过程中的二肽合成酶固定化载体浓度为40-100g/50L，发酵培养结束后，通过调节温度为室温，pH中性条件下(实施例优选了25℃，pH7.5条件)，离心分离不溶物与反应溶液，将不溶物重新投入到新的底物溶液I中重复所述固定化过程，进行新一轮发酵；如此循环不少于15次，甚至18次以上，每次发酵时间不超过16h。能够保证产物浓度不降低；这是一种纯化-固定化的连续催化工艺，其适用范围广，具有良好的工业应用价值。
本发明第四方面提供了上文所述的二肽合成酶重组菌体在耦合ATP再生系统的固定化酶的循环工艺中的应用；所述应用包括：所述重组菌体发酵所得的二肽合成酶在其生产菌株上自固定化得二肽合成酶固定化载体后，加入ppk菌体，投入底物溶液II中进行发酵；发酵过程中的二肽合成酶固定化载体浓度为50-70g/50L(实施例优选了60g/50L)，ppk菌体浓度为0.2-0.4g/L(实施例优选了0.25g/L)；进行发酵培养，在发酵培养结束后，通过调节温度为室温，pH中性条件下(实施例优选了25℃，pH7.5条件)，离心分离不溶物与反应溶液，将不溶物重新投入到新的底物溶液II中重复所述固定化过程，进行新一轮发酵；如此循环不少于20次，甚至22次以上，每次发酵时间不超过16h；能够保证产物浓度不降低。其中，所述发酵过程中的底物溶液II包括L-组氨酸、β-丙氨酸与ATP以(400-450mM)：(500-550mM)：(4-6mM)计(实施例优选了400mM：500mM：4-6mM)。
进一步优选的，所述底物溶液II包括：L-组氨酸400-430mM、β-丙氨酸500-530mM、MgSO4·7H2O 220-260mM、ATP4-6 mM，六偏磷酸钠140-160mM；pH＝7.0-9.5，温度25-35℃。所述底物溶液II实施例优选了L-组氨酸400mM、β-丙氨酸500mM、MgSO4·7H2O 250mM、ATP 5mM、六偏磷酸钠150mM。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1.本发明提供了一种催化温度和热稳定性均有提高的二肽合成酶突变体；
2.将辅助侵染蛋白IAP残基突变体与突变的二肽合成酶蛋白融合表达的设计方案，能够同时实现催化过程和外泌酶的纯化固定化；
3.与表面展示不同，培养过程中外泌二肽合成酶外泌表达，分布于发酵液中，大量生产后不会影响细胞营养的摄入和代谢空间；
4.所述固定化酶的催化工艺可放大和循环，其能够在18-22次的循环次数下仍保持催化活性；产物浓度不降低。
5.固定化酶能够高效催化高浓度底物(350-1000mM)生成肌肽。且底物溶液中的L-组氨酸与β-丙氨酸以(150-450mM)：(200-550mM)计即可，即只需要相对廉价底物β-丙氨酸过量，不需要昂贵底物(L-组氨酸)或底物极端过量。
6.通过本申请的对比例和实施例数据对比分析可知：所获得的外泌蛋白能够在特定的环境下(在pH7.5附近结合、室温)固定化到无/有活性的基质上，所述基质来源于生产蛋白的基因工程细胞——实施例为外泌蛋白的宿主细胞。
附图说明
图1不同pH下固定化酶结合效果比较；
图2不同温度下固定化酶结合效果比较；
图3催化过程的放大后的肌肽产量。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细地描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
本发明中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从商业途径购买。
热稳定性测定：用PBS将收集的细胞的浓度稀释至30g/L，在25℃和35℃下孵育，每次取一定体积使得反应体系中酶浓度为2g/L，在200mM底物体系中测定孵育不同时间的残余酶活。
实施例1
质粒和菌株构建
将密码子优化后的二肽合成酶的编码基因(SEQ ID NO:1)送生工合成并在两端引入XbaI和EcoRI酶切位点，将序列PCR后酶切连入pXMJ19质粒，获得pXMJ-YWFE质粒。质粒经菌落PCR和测序验证正确后转入到谷氨酸棒杆菌中，得到C.g-pXMJ-YWFE菌株。质粒测序获得突变体pXMJ-YWFE-SS质粒，同样转入到谷氨酸棒杆菌中，得到C.g-pXMJ-YWFE-SS菌株。
将辅助侵染蛋白IAP残基(SEQ ID No.3)的编码基因、辅助侵染蛋白IAP残基突变体V69H(SEQ ID NO:4)的编码基因在质粒pXMJ-YWFE-SS上与YWFE-SS基因的突变体YWFE-SS融合表达，经测序验证正确后同样转入谷氨酸棒杆菌中，命名为C.g-pXMJ-iap-YWFE-SS和C.g-pXMJ-iapV69H-YWFE-SS。
蛋白的表达
将C.g-pXMJ-YWFE和C.g-pXMJ-YWFE工程菌接入含有20mg/L氯霉素的BHI培养基中，35℃，200rpm过夜培养后按照10％的接种量转接入新鲜的含有50mg/L的BHI培养基中，35℃，200rpm培养至OD562＝0.6～0.8时后加入0.2mM IPTG进行诱导，诱导12h后收集细胞。
将C.g-pXMJ-iap-YWFE-SS和C.g-pXMJ-iapV69H-YWFE-SS工程菌接入含有20mg/L氯霉素的BHI培养基中，35℃，200rpm过夜培养后按照10％的接种量转接入新鲜的含有50mg/L的BHI培养基中，35℃，200rpm培养至OD562＝0.6～0.8时后加入0.2mM IPTG进行诱导，诱导12h。
融合酶的纯化固定化
将C.g-pXMJ-iap-YWFE-SS和C.g-pXMJ-iapV69H-YWFE-SS的发酵液调至25-30℃，pH7.5下结合1h，洗涤一次后即为固定于细胞表面的纯酶，亦为固定化酶。
实施例2
不同pH对二肽合成酶及其突变体效果的影响
反应体系如下：L-组氨酸200mM、β-丙氨酸250mM、MgSO4·7H2O 100mM、ATP 150mM，用30％盐酸/20％硫酸调节pH＝7.0-9.5，投入2g/L C.g-pXMJ-YWFE、C.g-pXMJ-YWFE-SS；C.g-pXMJ-iap-YWFE-SS、C.g-pXMJ-iapV69H-YWFE-SS的细胞，在25℃下反应60min取样，用10％三氯乙酸等比例终止反应，8000rpm离心5min后，HPLC检测产物肌肽的浓度及底物剩余。
在上述反应体系中，比较pH对反应效果的影响。从图1中可以看出，二肽合成酶的突变没有影响其最适pH，均为pH＝8.5，而融合表达辅助侵染残基的序列后，其最适pH有所偏移：C.g-pXMJ-iap-YWFE-SS的最佳pH＝8.0，而C.g-pXMJ-iapV69H-YWFE-SS的最佳pH＝7.5-9.0。并且可以看出，C.g-pXMJ-iap-YWFE-SS的催化效果在相同的时刻差于C.g-pXMJ-YWFE-SS和C.g-pXMJ-iapV69H-YWFE-SS。
实施例3
不同温度对结合效果的影响
反应体系如实施例2，用30％盐酸/20％硫酸调节至各自的最佳pH，投入2g/LC.g-pXMJ-YWFE、C.g-pXMJ-YWFE-SS；C.g-pXMJ-iap-YWFE-SS、C.g-pXMJ-iapV69H-YWFE-SS的细胞，在20-40℃下反应，每隔30min取样，用10％三氯乙酸等比例终止反应，8000rpm离心5min后，HPLC检测产物肌肽的浓度及底物剩余。
在上述反应体系中，比较温度对反应效果的影响。从图2中可以看出，二肽合成酶的突变使得其最适温度C.g-pXMJ-YWFE-SS比C.g-pXMJ-YWFE提高，由25℃提高至35℃，且反应速度增快；而融合表达辅助侵染残基的序列后，C.g-pXMJ-iap-YWFE-SS、C.g-pXMJ-iapV69H-YWFE-SS最适温度均为35℃。
将各个细胞分别于25℃和35℃下孵育，以未孵育时酶活为100％，测定孵育不同时间的残余酶活。从表3中的数据可见，突变体使得酶的热稳定性提升，8h时，25℃下，突变体的残余酶活是C.g-pXMJ-YWFE的1.08倍，35℃下是1.12倍；12h时该差距已增加至1.11倍和1.24倍，孵育24h，C.g-pXMJ-YWFE-SS的残余酶活是C.g-pXMJ–YWFE的1.32倍和1.91倍。融合表达对于酶的热稳定性影响不大，C.g-pXMJ-iapV69H-YWFE-SS的热稳定性相比于C.g-pXMJ-YWFE-SS略有提升，在孵育24h后可见3％的差距。
表3二肽合成酶及其突变体、固定化酶的热稳定性
实施例4催化过程的放大
配置底物溶液I：包括L-组氨酸400mM、β-丙氨酸500mM、MgSO4·7H2O 150mM、ATP300mM、去离子水定容50L；用30％盐酸/20％硫酸调节pH＝7.5-9.0。
在50L的反应体系中，用30％盐酸/20％硫酸调节pH＝7.5-9.0，分别投入40-100g固定化酶C.g-pXMJ-iapV69H-YWFE-SS，在35℃下反应，每隔2～4h取样，用10％三氯乙酸等比例终止反应，8000rpm离心5min后，HPLC检测产物肌肽的浓度及底物剩余。图3中可观察到，放大后的反应在12h达到终点，产物肌肽浓度达53.2g/L，转化率超过60％。
在底物溶液I中L-组氨酸400mM、β-丙氨酸500mM的情况下，固定化酶的投入量在40-100g/50L范围内都能够达到上述生产效率，更少的酶在16h内不足以完成这一催化过程。
实施例5
试验组-固定化酶的循环
取60g固定化酶C.g-pXMJ-iapV69H-YWFE-SS，投入到实施例4所述的底物溶液I中；反应体积为50L，在pH＝7.5-9.0，35℃下反应12h可生成53±1.5g/L的L-肌肽；
反应结束后，调节溶液pH＝7.5，降低温度至25℃，离心分离不溶物与反应溶液，将不溶物作为固定化酶重新投入到底物溶液I中，反应体积为50L，在35℃下反应，每隔2h取样检测产物浓度及底物剩余；如此循环18次产物浓度不降低，且能保证每次反应时间在16h内。
对比组1
取60g固定化酶C.g-pXMJ-iapV69H-YWFE-SS，投入到底物溶液I中；反应体积为50L，在pH＝7.5-9.0，35℃下反应12h可生成53±1g/L的L-肌肽。
反应结束后，离心分离不溶物与反应溶液，将不溶物重新投入到5.1试验组所述的底物溶液I中，反应体积为50L，在35℃下反应，每隔2h取样检测产物浓度及底物剩余；如此循环的次数有所降低，最多能够达到12次循环的情况下保证产物浓度不降低，但每次反应时间逐渐延长，甚至延长1-2小时，最后一轮的循环在20h才完成，延长的反应时间不利于规模化生产中的实际应用。
对比组2
取60g固定化酶C.g-pXMJ-iap-YWFE-SS，投入到底物溶液I中，反应体积为50L，在pH＝7.5，35℃下反应14h可生成49g/L的L-肌肽。
反应结束后降低温度至25℃，离心分离不溶物与反应溶液，将不溶物重新投入到底物溶液I中，反应体积为50L，在35℃下反应，每隔4h取样检测产物浓度及底物剩余；尽管每次将pH调至最适的回收条件，但更长的反应时间使得只能维持循环10次产物浓度不降低，且每次反应时间都有所延长，在第8次循环时，反应时间已经超过了24h，明显不适合规模化生产。
实施例6耦合ATP再生系统的固定化酶的循环
1.配置底物溶液II：包括L-组氨酸400mM、β-丙氨酸500mM、MgSO4·7H2O 250mM、ATP5mM、六偏磷酸钠150mM。
2.取60g固定化酶C.g-pXMJ-iapV69H-YWFE-SS，投入到底物溶液II中；加入专利CN110387379A中的ppk湿菌体0.25g/L，反应体积为50L，在pH＝7.5-9.0，35℃下反应，12h内可生成53±1.5g/L的L-肌肽；
3.反应结束后，调节溶液pH＝7.5，降低温度至25℃，离心分离不溶物与反应溶液，将不溶物(作为固定化酶)重新投入到底物溶液II中，重复上述的步骤2。每隔2h取样，检测产物浓度及底物剩余；如此循环22次，产物浓度不降低，且能保证每次反应时间在16h内。
实施例7
按照常规操作在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、乳酸菌中表达iapV69H-YWFE-SS的融合酶，培养结束后将发酵液调至25-30℃，pH 7.5下结合1h，洗涤一次后，将细胞浓度调整至600g/50L，取反应体积的1/10投入到底物溶液II中，加入专利CN 110387379 A中的ppk湿菌体0.25g/L，过程中小心维持混合过程中pH＝7.5-9.0，反应体积为50L，在35℃下，分别在11h、9h、13.5h达到50％转化率，生成52±2g/L的L-肌肽。反应结束后，调节溶液pH＝7.5，降低温度至25-30℃，离心分离不溶物与反应溶液，将不溶物重新投入底物溶液中进行反应，有效循环次数分别达到24次、28次和20次。
对比例1
游离酶
将获得的C.g-pXMJ-YWFE-SS工程菌接入含有20mg/L的BHI培养基中，35℃，200rpm过夜培养后按照10％的接种量转接入新鲜的含有20mg/L的BHI培养基中，35℃，200rpm培养12h后加入0.2mM IPTG进行诱导，诱导12h后收集细胞，将细胞浓度调整为600g/50L后破碎，破碎后取反应体积的1/10投入到底物溶液II中，加入专利CN 110387379 A中的ppk湿菌体0.25g/L，反应体积为50L，在35℃下反应，12h可生成53.5g/L的L-肌肽。
上清液具有较高的催化活性，但不能实现连续催化。同时，由于细胞最终反应液组分较为复杂，增加了分离成本。
对比例2
细胞表面展示
构建以C末端截短NCgl1221蛋白(SEQ NO:5)作为锚定蛋白，与YWFE-SS基因融合表达，连接于pXMJ19质粒上，转入谷氨酸棒杆菌，构建菌株命名为
C.g-pXMJ-NCg11221-YWFE-SS，接入含有20mg/L氯霉素的BHI培养基中，35℃，200rpm过夜培养后按照10％的接种量转接入新鲜的含有20mg/L的BHI培养基中，35℃，200rpm培养至OD562＝0.6～0.8时加入0.2mM IPTG进行诱导，诱导12h后分别收集不溶物和上清。不溶物洗涤一次后即为表面展示细胞。
同样培养条件下，细胞的生物量低于将酶分泌于培养液中；说明细胞表面展示的位点可能并不能完全分布于细胞表面，或者布满表面后不利于细菌物质代谢，影响了生长。
取60g表面展示细胞，投入底物溶液II中，加入专利CN 110387379 A中的ppk湿菌体0.25g/L，反应体积为50L，在35℃下反应。12h时肌肽产量仅为37.5g/L，是固定化酶催化效率的70.2％。
对比例3
包埋法固定化
1)海藻酸钠载体制备：将海藻酸钠用15g甘油浸润，然后加入约75mL去离子水，搅拌溶解后，加入1％聚乙二醇辛基苯基醚、0.8％聚乙二醇、0.5mM二硫苏糖醇，搅拌溶解，得到终浓度为4.5％海藻酸钠溶液；2)培养C.g-pXMJ-YWFE-SS细胞，收集后将细胞浓度调整至60g/50L后破碎，破碎酶液加入步骤(1)制备的海藻酸钠溶液，二者混合均匀，得到海藻酸钠酶溶液；3)用恒流泵外接注射器针头将海藻酸钠酶匀速速度滴入到5％的CaCl2溶液中搅拌固定；4)过滤，PBS缓冲液反复洗涤凝胶沉淀，干燥，得到粒状固定化二肽合成酶。
取上述固定化产物，投入底物溶液II中，加入专利CN 110387379 A中的ppk湿菌体0.25g/L，反应体积为50L，在35℃下反应，12h时肌肽产量为35.1g/L，转化率接近33％，是固定化酶催化效率的65.6％。
对比例4
专利中(CN202011182797.3一种重组肌肽水解酶突变体及其应用)来源的二肽合成酶在与辅助侵染蛋白IAP残基的基因(SEQ ID NO:1)、辅助侵染蛋白IAP残基突变体V69H的基因(SEQ ID NO:2)融合表达后，并未检测到催化活性。说明某一个基因的融合表达是否不影响自身结构域而使两者供能叠加的技术效果是本领域技术人员所不可预期的。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，本领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。
Claims (10)
1.一种二肽合成酶突变体，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种二肽合成酶重组质粒，其特征在于：所述重组质粒为将辅助侵染蛋白残基突变体的基因与二肽合成酶突变体的基因重组；其中，所述辅助侵染蛋白残基突变体的基因，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述二肽合成酶突变体的基因，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种外泌二肽合成酶重组菌体，其特征在于：所述外泌二肽合成酶重组菌体是通过将辅助侵染蛋白残基突变体的基因与二肽合成酶突变体的基因进行融合表达而得，所述辅助侵染蛋白残基突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述二肽合成酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求3所述外泌二肽合成酶重组菌体，其特征在于：所述二肽合成酶重组菌体的宿主选自谷氨酸棒杆菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌或乳酸菌中的一种。
5.如权利要求3所述二肽合成酶重组菌体在高浓度底物连续循环催化中的应用；其特征在于：包括利用所述重组菌体发酵获得的二肽合成酶在其生产菌株上的自固定化过程，发酵过程中的底物溶液包括L-组氨酸与β-丙氨酸以(150-450mM)：(200-550mM)计。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述底物溶液I包括：L-组氨酸150-450mM、β-丙氨酸200-550mM、MgSO4·7H2O 100-200mM、ATP 100-350mM，pH＝7.0-9.5，温度25-35℃。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述自固定化过程还包括：所述重组菌体发酵所得的二肽合成酶在其生产菌株上自固定化得二肽合成酶固定化载体后，进行发酵培养，发酵过程中的二肽合成酶固定化载体浓度为40-100g/50L，发酵培养结束后，通过调节温度为室温，pH中性条件下，离心分离不溶物与反应溶液，将不溶物重新投入到新的底物溶液I中重复所述固定化过程，进行新一轮发酵；如此循环不少于18次，每次发酵时间不超过16h。
8.如权利要求3所述的二肽合成酶重组菌体在耦合ATP再生系统固定化酶的循环工艺中的应用，其特征在于：所述应用包括：所述重组菌体发酵所得的二肽合成酶在其生产菌株上自固定化得二肽合成酶固定化载体后，加入ppk菌体，投入底物溶液II中进行发酵；发酵过程中的二肽合成酶固定化载体浓度为50-70g/50L，ppk菌体浓度为0.2-0.4g/L；进行发酵培养，在发酵培养结束后，通过调节温度为室温，pH中性条件下，离心分离不溶物与反应溶液，将不溶物重新投入到新的底物溶液II中重复所述固定化过程，进行新一轮发酵；如此循环不少于22次，每次发酵时间不超过16h；其中，所述发酵过程中的底物溶液II包括L-组氨酸、β-丙氨酸与ATP以(400-450mM)：(500-550mM)：(4-6mM)计。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述底物溶液II包括：L-组氨酸400-430mM、β-丙氨酸500-530mM、MgSO4·7H2O 220-260mM、ATP4-6 mM，六偏磷酸钠140-160mM；pH＝7.0-9.5，温度25-35℃。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述底物溶液II包括：L-组氨酸400mM、β-丙氨酸500mM、MgSO4·7H2O 250mM、ATP 5mM、六偏磷酸钠150mM。
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