CN118048324A - 一种高活性和高浓度底物耐受性的天冬酰胺合成酶a突变体及其应用 - Google Patents
一种高活性和高浓度底物耐受性的天冬酰胺合成酶a突变体及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种高活性和高浓度底物耐受性的天冬酰胺合成酶A突变体及其应用，所述天冬酰胺合成酶A突变体是将来源于唾液乳杆菌Lactobacillus salivarius的天冬酰胺合成酶A氨基酸序列的第53位的赖氨酸突变为丙氨酸、第71位的组氨酸突变为缬氨酸、第100位的精氨酸突变为丙氨酸、第110位的组氨酸突变为谷氨酸、第214位精氨酸突变为谷氨酸、第218位的酪氨酸突变为甘氨酸获得。本发明通过蛋白质工程技术进行分子改造，获得了高酶活以及较高底物耐受性的天冬酰胺合成酶突变体催化剂，该突变体能够生物催化生成L‑天冬酰胺。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及到一种高活性和高浓度底物耐受性的天冬酰胺合成酶A突变体及其应用。
背景技术
天冬酰胺合成酶在各种生物体中都普遍存在，根据对反应的氨供体不同，将天冬酰胺合成酶分为两类：天冬酰胺合成酶A(AS-A，EC6.3.1.1)和天冬酰胺合成酶B(AS-B，EC6.3.5.4)。其中AS-A仅存在于原核生物中，它们只能利用铵根离子作为氨供体；而AS-B不仅存在于原核生物中，同时又能存在于真核生物中，AS-B的氨供体既可以是铵根离子，也可以是谷氨酰胺。尽管两种酶能催化合成同种物质，但AS-A和AS-B的序列一致性极低，且AS-A蛋白比AS-B小。利用AS-A催化合成L-天冬酰胺是一种绿色环保，且成本低、副产物少的方法。
L-天冬酰胺((L-Asparagine，L-Asn)，别名2-氨基-3-氨基甲酰丙酸，是生物体内常见的20种氨基酸之一，也是生糖氨基酸家族成员之一，可以通过代谢变为葡萄糖。L-Asn在各个领域都有一定的应用。如L-Asn会与糖类产生美拉德反应使得食物更具风味，但在特殊的高温环境下，L-Asn会与糖类产生反应生成丙烯酰胺。除此之外，它可以与炔诺酮进行聚合形成复合物具有医学上的作用。野生型AS-A的比酶活低，并且存在着严重的底物抑制，随着底物ASP浓度的升高，AS-A的比酶活降低。在张奇等研究中，其筛选的天冬酰胺合成酶可以催化1M的L-天冬氨酸。然而实际实验中，该种天冬酰胺合成酶的底物耐受性无法达到1M的高浓度底物。因此需要改造菌株以期可以被应用到更多的催化反应中发挥其作用。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。
因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种酶活性提高的天冬酰胺合成酶A突变体。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种酶活性提高的天冬酰胺合成酶A突变体，其特征在于：所述天冬酰胺合成酶A突变体是将来源于唾液乳杆菌Lactobacillus salivarius的天冬酰胺合成酶A氨基酸序列的第53位的赖氨酸突变为丙氨酸、第71位的组氨酸突变为缬氨酸、第100位的精氨酸突变为丙氨酸、第110位的组氨酸突变为谷氨酸、第214位精氨酸突变为谷氨酸、第218位的酪氨酸突变为甘氨酸，其中的一种或组合获得。
作为本发明所述突变体的一种优选方案，其中：所述天冬酰胺合成酶A的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述天冬酰胺合成酶A突变体为下述任意一种：
(i)第53位的赖氨酸突变为丙氨酸,其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
(ii)第71位的组氨酸突变为缬氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
(iii)第100位的精氨酸突变为丙氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；
(iv)第110位的组氨酸突变为谷氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；
(v)第214位的精氨酸突变为谷氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；
(vi)第218位的酪氨酸突变为甘氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；
(vii)第71位的组氨酸突变为缬氨酸以及第110位的组氨酸突变为谷氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；
(viii)第71位的组氨酸突变为缬氨酸以及第214位的精氨酸突变为谷氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；
(ix)第110位的组氨酸突变为谷氨酸以及第214位的精氨酸突变为谷氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；
(x)第110位的组氨酸突变为谷氨酸以及第218位的酪氨酸突变为甘氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示；
(xi)第214位的精氨酸突变为谷氨酸以及第218位的酪氨酸突变为甘氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示；
(xii)第71位的组氨酸突变为缬氨酸、第110位的组氨酸突变为谷氨酸以及第214位的精氨酸突变为谷氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示；
(xiii)第71位的组氨酸突变为缬氨酸、第110位的组氨酸突变为谷氨酸以及第218位的酪氨酸突变为甘氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示；
(xiv)第71位的组氨酸突变为缬氨酸、第214位的精氨酸突变为谷氨酸以及第218位的酪氨酸突变为甘氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示；
(xv)第110位的组氨酸突变为谷氨酸、第214位的精氨酸突变为谷氨酸以及第218位的酪氨酸突变为甘氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示；
(xvi)第71位的组氨酸突变为缬氨酸、第110位的组氨酸突变为谷氨酸、第214位的精氨酸突变为谷氨酸以及第218位的酪氨酸突变为甘氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示。
本发明的再一个目的是，克服现有技术中的不足，提供编码所述突变体天冬酰胺合成酶A的基因。
本发明的再一个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种重组质粒，包括天冬酰胺合成酶A的基因。
本发明的再一个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种宿主细胞，包括上述重组质粒。
作为本发明所述宿主细胞的一种优选方案，其中：所述宿主细胞包括大肠杆菌枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、乳酸菌、毕赤酵母中的一种。
本发明的再一个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种表达天冬酰胺合成酶A突变体的重组菌株。
作为本发明所述突变体的一种优选方案，其中：所述突变体能提高天冬酰胺合成酶A的酶活性以及底物耐受浓度。
本发明的另一个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种酶活性提高的天冬酰胺合成酶A突变体在生产L-天冬酰胺中的应用。
作为本发明所述应用的一种优选方案，其中：所述以L-天冬酰胺、氯化铵、ATP/葡萄糖为底物，以天冬酰胺合成酶A突变体为催化剂催化转化生产L-天冬酰胺。
本发明有益效果：
1.本发明通过半理性设计、定点突变技术和饱和突变改造ASA分子结构，最终获得了酶活性提高278.74％的突变体酶H71V/H110E/R214E/Y218G。
2.在30℃下孵育，ASA突变体H71V/H110E/R214E/218G底物耐受浓度为500mM，野生型的底物耐受浓度为100mM，ASA突变体H71V/H110E/R214E/Y218G的底物催化浓度比野生型提高了500％。
3.本发明的ASA突变体催化天冬氨酸生产L-天冬酰胺的催化浓度大，具有极高的工业价值。
4.本发明的ASA突变体催化天冬氨酸生产L-天冬酰胺，以葡萄糖作为供能物质来替代ATP，降低了实验成本。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为实施例2中的天冬酰胺合成酶A的序列比对图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
本发明所用原料：胰蛋白胨、氯化钠、琼脂、葡萄糖、Tris、氯化铵、氯化镁、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、盐酸、ATP、葡萄糖均购买于国药集团化学试剂有限公司。酵母提取物、卡那霉素、IPTG购买于上海生工生物工程有限公司；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，则均为本领域的常规方法。
HPLC检测方法：
采用氨基酸柱前在线衍生HPLC方法，色谱柱为Diamonsil C18(5μm，4.6mm×250mm)。流动A相为10mM Na2HPO4-H2B4O7(pH 8.2)的缓冲液，流动B相为甲醇：乙腈：水(v/v)＝45：45：10；流动相使用0.22μm微孔滤膜抽滤之后超声30min；控制条件为：柱温40℃，检测波长338nm，流速1.0mL·min-1，进样体积10μL，分析时间18min，泵程序以流动相B比例为参照：0-2min：5％，2-12min：5％-57％，13-17min：100％，17-18min：5％。
实施例1ASA酶活测定
1、重组工程菌的诱导表达
LB液体培养基组成：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L；LB固体培养基在LB液体培养基中添加20g/L琼脂粉；121℃高压灭菌20min；使用前添加终浓度100μg/mL氨苄青霉素。
将基因工程菌接种至含终浓度100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，在37℃、200r/min培养10-12h，获得种子液；将种子液以体积浓度1％接种量接种至新鲜的含有终浓度50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，于37℃、150r/min培养OD600至0.6～0.8，再向培养液中加入终浓度为0.1mM的IPTG，于16℃下诱导表达12h后，4℃、8000r/min离心10min，弃去上清液，用Tris-HCl缓冲液(100mM，pH8.0)清洗两遍，并使用15mLTris-HCl缓冲液重悬湿菌体备用。同时用空载体基因工程菌使用相同的方法培养，其核苷酸序列(如SEQ ID NO.19所示)，作为对照组。
2、重组工程菌超声破碎
采用超声破碎法对湿菌体进行破碎。破碎条件：破1s停2s，功率35％，直到溶液变清为止，破碎总时间不超过30min；8000r/min离心10min，收集上清液。
3、酶分离纯化
对于蛋白纯化，将经过0.22μm滤膜超滤后的上清液装载于Ni-NTA凝胶柱，采用重力法控制流速，使用含有50mM咪唑的Tris-HCl(100mM，PH8.0)缓冲液去杂蛋白，使用含有500mM咪唑的Tris-HCl(100mM，PH8.0)缓冲液收集目的蛋白。洗脱液经过SDS凝胶电泳分析。使用MWCO 30KDa的滤柱超滤除去咪唑。纯化的酶于PBS中收集。根据Bradford法测定纯化后酶液的蛋白浓度，通过SDS-PAGE检测蛋白纯度。得到条带正确的、高纯度的纯酶后，留存备用。
4、ASA酶活性测定
天冬酰胺合成酶酶活力通过高效液相色谱法进行测定。反应体系为1mL，其中包括20mM L-天冬氨酸、10mM氯化铵、10mM氯化镁、10mMATP、100mM的Tris-HCl(PH8.0)以及适量的酶液。在37℃下反应15min，并于338nm下检测产物的峰面积，代入产物标准曲线换算成产物的量。
酶活定义：以每分钟产生1μmol L-天冬酰胺所需要的酶量作为酶活单位；
酶活计算公式：酶活力(U)＝C×V×D×103；C—单位时间单位体积所产生的产物(mmoL)；V—反应体积(mL)；D—酶液的稀释倍数；
酶比活力(U·mg-1)定义为：每毫克酶蛋白所含的酶活力单位数；
酶比活力计算公式为：酶比活力(U·mg-1)＝酶活力(U)/蛋白量(mg)。
经酶活检测，ASA的酶活为12.16U/mg。
实施例2ASA单位点突变体的构建与筛选
1、突变文库构建
根据图1的ASA序列比对，选取了K53A(序列如SEQ ID NO.2所示)、Y218A、H71A、R100A(序列如SEQ ID NO.4所示)、H110A、R214A共6个位点进行突变作为第一轮突变文库。
2、突变体构建
根据ASA的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示，可从NCBI数据库(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)中下载，ASAGene ID:MK948096.1设计突变引物，利用全质粒PCR技术，以重组载体pET28a/ASA为模板，核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示，对ASA氨基酸序列(如SEQ ID NO.1所示)引入单点突变，所用引物如表1所示。
PCR反应体系：2×PhantaMax MasterMix 10μL，正/反向引物1μL，模板DNA1μL，加入ddH2O至20μL。
PCR扩增条件为：98℃5min；(98℃10s，60℃5s，72℃30s)35循环；72℃5min。
向PCR产物中加入Dnp I酶0.5μL、duffer 1μL，37℃1h、70℃15min。
取10μL的PCR产物，加入100μL冰浴的感受态细胞悬液中，冰上静置30min后立即42℃热激90s，冰浴2～5min后加入LB培养基1mL复苏1h，10000r/min离心1min，弃掉部分上清，将剩余的菌液悬浮后涂板，37℃倒置培养12h。
表1
3、高通量筛选阳性转化子
挑取单菌落接种至含300μL LB培养基(含50μg/mL Kana)的96深孔板中，于37℃、180r/min培养8h后转接至另一96深孔板中，培养3-5h，加入终浓度为0.1mM的IPTG，在16℃、125r/min培养18h诱导目的蛋白表达。诱导结束后，在4500r/min离心15min收集菌体，将菌体用Tris-HCL(100mM，PH8.0)重悬离心洗涤2次后利用液氮反复冻融4-5次，4℃、4500r/min离心15min收集上清。转移各孔10μL上清至含190μL反应体系的96微孔板的相应位置，将96微孔板置于30℃恒温仪中孵育30min，随后加入1/10体积1MHCl失活。利用氯化铵和奈斯勒试剂反应物在470nm下具有特殊吸收峰来进行初步筛选。
4、阳性转化子发酵产酶
同实施例1第2部分的“重组工程菌的诱导表达”。
5、酶活检测
同实施例1第5部分的“ASA酶活性测定”。
运用高通量的筛选方法，对构建的30株重组转化菌初筛，筛选出6株底物耐受浓度以及酶活提高的突变株，对其进行酶活检测，具体结果如表2所示。
表2
实施例3饱和突变体的构建与筛选
根据实施例2构建的单突变体序列设计定点饱和突变的突变引物，利用全质粒PCR技术，以重组载体pET28a/ASA为模板，对ASA氨基酸序列的71位引入突变，天冬酰胺合成酶A突变体H71V的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；对ASA氨基酸序列的110位引入突变，天冬酰胺合成酶A突变体H110E的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；对ASA氨基酸序列的214位引入突变，天冬酰胺合成酶A突变体R214E的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；对ASA氨基酸序列的218位引入突变，天冬酰胺合成酶A突变体Y218G的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示
引物序列如表3所示。
PCR反应体系及反应条件同实施例2第2部分的“突变体的构建”。
PCR产物转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，挑单克隆于含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜。利用上述提到的高通量的筛选方法对突变体进行初筛，方法同实施例2的“高通量筛选阳性转化子”。
对初筛的阳性突变株进行酶活的检测，方法同实施例1的“ASA酶活性测定”。
运用高通量的筛选方法，对建立的突变文库进行初筛，筛选出了4株酶活提高的突变株，具体结果如表4所示。
表3
表4
实施例4两点组合突变体的构建与筛选
根据实施例2构建的单突变体序列设计组合突变，利用全质粒PCR技术，以重组载体pET28a/ASA为模板，对ASA氨基酸序列的71、110位进行两点突变，天冬酰胺合成酶A突变体H71V/H110E的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；对ASA氨基酸序列的71、214位进行两点突变，天冬酰胺合成酶A突变体H71V/R214E的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；对ASA氨基酸序列的110、214位进行两点突变，天冬酰胺合成酶A突变体H110E/R214E的氨基酸序列如SEQID NO.10所示；对ASA氨基酸序列的110、218位进行两点突变，天冬酰胺合成酶A突变体H110E/Y218G的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示；对ASA氨基酸序列的214、218位进行两点突变，天冬酰胺合成酶A突变体R214E/Y218G的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。
PCR反应体系及反应条件同实施例2第2部分的“突变体的构建”。
PCR产物转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，挑单克隆于含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜。利用上述提到的液相筛选方法对突变体进行筛选，方法同实施例1的“ASA酶活性测定”。具体结果如表5所示。
表5
经过检测，突变体H110E/R214E(M2)相比WT比酶活提升最高，为206.33％。在500mMASP浓度下，比酶活保留34.56％。
实施例5三点组合突变体的构建与筛选
根据实施例2构建的单突变体序列设计组合突变，利用全质粒PCR技术，以重组载体pET28a/ASA为模板，对ASA氨基酸序列的71、110、214位进行三点突变，天冬酰胺合成酶A突变体H71V/H110E/R214E的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示；对ASA氨基酸序列的71、110、218位进行三点突变，天冬酰胺合成酶A突变体H71V/H110E/Y218G的氨基酸序列如SEQ IDNO.14所示；对ASA氨基酸序列的71、214、218位进行三点突变，天冬酰胺合成酶A突变体H71V/R214E/Y218G的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示；对ASA氨基酸序列的110、214、218位进行三点突变，天冬酰胺合成酶A突变体H110E/R214E/Y218G的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示；。
PCR反应体系及反应条件同实施例2第2部分的“突变体的构建”。
PCR产物转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，挑单克隆于含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜。利用上述提到的HPLC检测方法对突变体进行测定，方法同实施例1的“ASA酶活性测定”。具体结果如表6所示。
表6
对建立的突变文库进行筛选，获得了1株酶活提高的突变株H110E/R214E/Y218G(M3)，其相对酶活力是WT的248.52％。在500mMASP浓度下，比酶活保留67.68％。
实施例6四点组合突变体的构建与筛选
根据实施例2构建的单突变体序列设计组合突变，利用全质粒PCR技术，以重组载体pET28a/ASA为模板，对ASA氨基酸序列的71、110、214、218位进行四点突变，天冬酰胺合成酶A突变体H71V/H110E/R214E/Y218G的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示。
PCR反应体系及反应条件同实施例2第2部分的“突变体的构建”。
PCR产物转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞，挑单克隆于含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜。利用上述提到的液相筛选方法对突变体进行筛选，方法同实施例1的“ASA酶活性测定”。
利用上述提到的HPLC检测方法对突变体进行测定，筛选出了1株酶活提高的突变株H71V/H110E/R214E/Y218G(M4)，其相对酶活力是WT的278.74％。在500mMASP浓度下，比酶活保留96.24％。
实施例7粗酶液催化转化
在两个20mL的催化体系里，分别按照终浓度加入200mMNH4Cl、200mM ATP、20mMMnCl2、200mM ASP；500mM NH4Cl、500mMATP、50mM MnCl2、500mMASP。配置好的体系，用盐酸和氢氧化钠调节pH至8.0。分别加入70g/L湿菌重破碎后粗酶液，之后不足20mL用0.1MTris-HCl缓冲液(pH 8.0)补足。通过HPLC检测底物在35℃、180转/分条件下不同反应时间的转化率。
M4催化200mM的底物在10小时内生成的天冬酰胺达13.1g/L，转化率接近100％。催化500mM的底物在10小时内生成的天冬酰胺达64.9g/L，转化率接近99％。
实施例8全细胞催化转化
以20mL体系为例，按照终浓度为500mMASP、500mM NH4Cl、50mM葡萄糖、50mM MnCl2将上述配置好的母液按照比例加入体系中。配置好的体系，用盐酸和氢氧化钠调节pH至8.0。之后不足20mL用0.1M Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)补足。将配置好的体系加入60g/LM4湿菌重细胞，然后放入35℃中开始催化反应。其中每隔4h取一次样进行终止反应，截止反应时间为24h。将样品进行HPLC检测。
利用HPLC检测方法，得出M4全细胞催化500mMASP时，葡萄糖作为供能物质，在20h时天冬氨酸转化率达到98％以上，L-天冬酰胺产量在64.7g/L。
实施例9全细胞补料催化转化
以20mL体系为例，按照终浓度为500mMASP、500mM NH4Cl、50mM葡萄糖、50mM MnCl2将上述配置好的母液按照比例加入体系中。配置好的体系，用盐酸和氢氧化钠调节pH至8.0。之后不足20mL用0.1M Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)补足。将配置好的体系加入60g/LM4湿菌重细胞，然后放入35℃中开始催化反应，截止反应时间为20h。将反应结束的菌离心出后，重新加入新的同样的体系反应20h，重复至菌体不再具有催化能力。
利用HPLC检测方法，得出M4全细胞催化1500mMASP时，葡萄糖作为供能物质，当重组菌中酶不再催化时，此时的L-天冬酰胺产量在136.79g/L。
对比例1
根据张奇等(中国生物工程杂志，2016，36(1):63-67；CN201510445290.5)在生物转化法制备L-天冬酰胺中提出，其挖掘的E.coli BL21(DE3)/pET28a-asnA可以在1M的天冬氨酸中进行催化，并且L-天冬氨酸的转化率为可以达到95.8％。经过重复该实验后发现，在条件一致情况下，当底物天冬氨酸浓度达到100mM时，开始产生底物抑制，当浓度达到200mM时，酶不再催化底物产生天冬酰胺。因此，确定上述酶并不具有催化1M底物的能力。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
synthetic construct
序列表
SEQ ID NO.1
人工序列
MKTAYIAKQRQISFVKSHFSRQLEERLGLIEVQAPILSRVGDGTQDNLSGCEKA
VQVKVKALPDAQFEVVHSLAKWKRQTLGQHDFSAGEGLYTHMKALRPDED
RLSPLHSVYVDQWDWERVMGDGERQFSTLKSTVEAIWAGIKATEAAVSEEFG
LAPFLPDQIHFVHSQELLSRYPDLDAKGRERAIAKDLGAVFLVGIGGKLSDGH
CHDVRAPDYDDWSTPSELGHAGLNGDILVWNPVLEDAFELSSMGIRVDADT
LKHQLALTGDEDRLQLEWHQALLRGEMPQTIGGGIGQSRLTMLLLQLPHIGQ
VQCGVWPAAVRENVPSLL
SEQ ID NO.2
MKTAYIAKQRQISFVKSHFSRQLEERLGLIEVQAPILSRVGDGTQDNLSGCEAA
VQVKVKALPDAQFEVVHSLAKWKRQTLGQHDFSAGEGLYTHMKALRPDED
RLSPLHSVYVDQWDWERVMGDGERQFSTLKSTVEAIWAGIKATEAAVSEEFG
LAPFLPDQIHFVHSQELLSRYPDLDAKGRERAIAKDLGAVFLVGIGGKLSDGH
CHDVRAPDYDDWSTPSELGHAGLNGDILVWNPVLEDAFELSSMGIRVDADT
LKHQLALTGDEDRLQLEWHQALLRGEMPQTIGGGIGQSRLTMLLLQLPHIGQ
VQCGVWPAAVRENVPSLL
SEQ ID NO.3
MKTAYIAKQRQISFVKSHFSRQLEERLGLIEVQAPILSRVGDGTQDNLSGCEKA
VQVKVKALPDAQFEVVVSLAKWKRQTLGQHDFSAGEGLYTHMKALRPDED
RLSPLHSVYVDQWDWERVMGDGERQFSTLKSTVEAIWAGIKATEAAVSEEFG
LAPFLPDQIHFVHSQELLSRYPDLDAKGRERAIAKDLGAVFLVGIGGKLSDGH
CHDVRAPDYDDWSTPSELGHAGLNGDILVWNPVLEDAFELSSMGIRVDADT
LKHQLALTGDEDRLQLEWHQALLRGEMPQTIGGGIGQSRLTMLLLQLPHIGQ
VQCGVWPAAVRENVPSLL
SEQ ID NO.4
MKTAYIAKQRQISFVKSHFSRQLEERLGLIEVQAPILSRVGDGTQDNLSGCEKA
VQVKVKALPDAQFEVVHSLAKWKRQTLGQHDFSAGEGLYTHMKALAPDED
RLSPLHSVYVDQWDWERVMGDGERQFSTLKSTVEAIWAGIKATEAAVSEEFG
LAPFLPDQIHFVHSQELLSRYPDLDAKGRERAIAKDLGAVFLVGIGGKLSDGH
CHDVRAPDYDDWSTPSELGHAGLNGDILVWNPVLEDAFELSSMGIRVDADT
LKHQLALTGDEDRLQLEWHQALLRGEMPQTIGGGIGQSRLTMLLLQLPHIGQ
VQCGVWPAAVRENVPSLL
SEQ ID NO.5
MKTAYIAKQRQISFVKSHFSRQLEERLGLIEVQAPILSRVGDGTQDNLSGCEKA
VQVKVKALPDAQFEVVHSLAKWKRQTLGQHDFSAGEGLYTHMKALRPDED
RLSPLESVYVDQWDWERVMGDGERQFSTLKSTVEAIWAGIKATEAAVSEEFG
LAPFLPDQIHFVHSQELLSRYPDLDAKGRERAIAKDLGAVFLVGIGGKLSDGH
CHDVRAPDYDDWSTPSELGHAGLNGDILVWNPVLEDAFELSSMGIRVDADT
LKHQLALTGDEDRLQLEWHQALLRGEMPQTIGGGIGQSRLTMLLLQLPHIGQ
VQCGVWPAAVRENVPSLL
SEQ ID NO.6
MKTAYIAKQRQISFVKSHFSRQLEERLGLIEVQAPILSRVGDGTQDNLSGCEKA
VQVKVKALPDAQFEVVHSLAKWKRQTLGQHDFSAGEGLYTHMKALRPDED
RLSPLHSVYVDQWDWERVMGDGERQFSTLKSTVEAIWAGIKATEAAVSEEFG
LAPFLPDQIHFVHSQELLSRYPDLDAKGRERAIAKDLGAVFLVGIGGKLSDGH
CHDVEAPDYDDWSTPSELGHAGLNGDILVWNPVLEDAFELSSMGIRVDADT
LKHQLALTGDEDRLQLEWHQALLRGEMPQTIGGGIGQSRLTMLLLQLPHIGQ
VQCGVWPAAVRENVPSLL
SEQ ID NO.7
MKTAYIAKQRQISFVKSHFSRQLEERLGLIEVQAPILSRVGDGTQDNLSGCE
KAVQVKVKALPDAQFEVVHSLAKWKRQTLGQHDFSAGEGLYTHMKALRP
DEDRLSPLHSVYVDQWDWERVMGDGERQFSTLKSTVEAIWAGIKATEAAV
SEEFGLAPFLPDQIHFVHSQELLSRYPDLDAKGRERAIAKDLGAVFLVGIGG
KLSDGHCHDVRAPDGDDWSTPSELGHAGLNGDILVWNPVLEDAFELSSMG
IRVDADTLKHQLALTGDEDRLQLEWHQALLRGEMPQTIGGGIGQSRLTMLL
LQLPHIGQVQCGVWPAAVRENVPSLLSEQ ID NO.8
MKTAYIAKQRQISFVKSHFSRQLEERLGLIEVQAPILSRVGDGTQDNLSGCEK
AVQVKVKALPDAQFEVVVSLAKWKRQTLGQHDFSAGEGLYTHMKALRPDE
DRLSPLESVYVDQWDWERVMGDGERQFSTLKSTVEAIWAGIKATEAAVSEE
FGLAPFLPDQIHFVHSQELLSRYPDLDAKGRERAIAKDLGAVFLVGIGGKLSD
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DTLKHQLALTGDEDRLQLEWHQALLRGEMPQTIGGGIGQSRLTMLLLQLPHI
GQVQCGVWPAAVRENVPSLL
SEQ ID NO.9
MKTAYIAKQRQISFVKSHFSRQLEERLGLIEVQAPILSRVGDGTQDNLSGCEK
AVQVKVKALPDAQFEVVVSLAKWKRQTLGQHDFSAGEGLYTHMKALRPDE
DRLSPLHSVYVDQWDWERVMGDGERQFSTLKSTVEAIWAGIKATEAAVSEE
FGLAPFLPDQIHFVHSQELLSRYPDLDAKGRERAIAKDLGAVFLVGIGGKLSD
GHCHDVEAPDYDDWSTPSELGHAGLNGDILVWNPVLEDAFELSSMGIRVDA
DTLKHQLALTGDEDRLQLEWHQALLRGEMPQTIGGGIGQSRLTMLLLQLPHI
GQVQCGVWPAAVRENVPSLL
SEQ ID NO.10
MKTAYIAKQRQISFVKSHFSRQLEERLGLIEVQAPILSRVGDGTQDNLSGCEK
AVQVKVKALPDAQFEVVHSLAKWKRQTLGQHDFSAGEGLYTHMKALRPDE
DRLSPLESVYVDQWDWERVMGDGERQFSTLKSTVEAIWAGIKATEAAVSEE
FGLAPFLPDQIHFVHSQELLSRYPDLDAKGRERAIAKDLGAVFLVGIGGKLSD
GHCHDVEAPDYDDWSTPSELGHAGLNGDILVWNPVLEDAFELSSMGIRVDA
DTLKHQLALTGDEDRLQLEWHQALLRGEMPQTIGGGIGQSRLTMLLLQLPHI
GQVQCGVWPAAVRENVPSLL
SEQ ID NO.11
MKTAYIAKQRQISFVKSHFSRQLEERLGLIEVQAPILSRVGDGTQDNLSGCE
KAVQVKVKALPDAQFEVVHSLAKWKRQTLGQHDFSAGEGLYTHMKALRP
DEDRLSPLESVYVDQWDWERVMGDGERQFSTLKSTVEAIWAGIKATEAAV
SEEFGLAPFLPDQIHFVHSQELLSRYPDLDAKGRERAIAKDLGAVFLVGIGG
KLSDGHCHDVRAPDGDDWSTPSELGHAGLNGDILVWNPVLEDAFELSSMG
IRVDADTLKHQLALTGDEDRLQLEWHQALLRGEMPQTIGGGIGQSRLTML
LLQLPHIGQVQCGVWPAAVRENVPSLL
SEQ ID NO.12
MKTAYIAKQRQISFVKSHFSRQLEERLGLIEVQAPILSRVGDGTQDNLSGCEK
AVQVKVKALPDAQFEVVHSLAKWKRQTLGQHDFSAGEGLYTHMKALRPDE
DRLSPLESVYVDQWDWERVMGDGERQFSTLKSTVEAIWAGIKATEAAVSEE
FGLAPFLPDQIHFVHSQELLSRYPDLDAKGRERAIAKDLGAVFLVGIGGKLSD
GHCHDVEAPDGDDWSTPSELGHAGLNGDILVWNPVLEDAFELSSMGIRVDA
DTLKHQLALTGDEDRLQLEWHQALLRGEMPQTIGGGIGQSRLTMLLLQLPHI
GQVQCGVWPAAVRENVPSLL
SEQ ID NO.13
MKTAYIAKQRQISFVKSHFSRQLEERLGLIEVQAPILSRVGDGTQDNLSGCEK
AVQVKVKALPDAQFEVVVSLAKWKRQTLGQHDFSAGEGLYTHMKALRPDE
DRLSPLESVYVDQWDWERVMGDGERQFSTLKSTVEAIWAGIKATEAAVSEE
FGLAPFLPDQIHFVHSQELLSRYPDLDAKGRERAIAKDLGAVFLVGIGGKLSD
GHCHDVEAPDYDDWSTPSELGHAGLNGDILVWNPVLEDAFELSSMGIRVDA
DTLKHQLALTGDEDRLQLEWHQALLRGEMPQTIGGGIGQSRLTMLLLQLPHI
GQVQCGVWPAAVRENVPSLL
SEQ ID NO.14
MKTAYIAKQRQISFVKSHFSRQLEERLGLIEVQAPILSRVGDGTQDNLSGCEK
AVQVKVKALPDAQFEVVHSLAKWKRQTLGQHDFSAGEGLYTHMKALRPDE
DRLSPLESVYVDQWDWERVMGDGERQFSTLKSTVEAIWAGIKATEAAVSEE
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GHCHDVRAPDGDDWSTPSELGHAGLNGDILVWNPVLEDAFELSSMGIRVDA
DTLKHQLALTGDEDRLQLEWHQALLRGEMPQTIGGGIGQSRLTMLLLQLPHI
GQVQCGVWPAAVRENVPSLL
SEQ ID NO.15
MKTAYIAKQRQISFVKSHFSRQLEERLGLIEVQAPILSRVGDGTQDNLSGCEK
AVQVKVKALPDAQFEVVVSLAKWKRQTLGQHDFSAGEGLYTHMKALRPDE
DRLSPLHSVYVDQWDWERVMGDGERQFSTLKSTVEAIWAGIKATEAAVSEE
FGLAPFLPDQIHFVHSQELLSRYPDLDAKGRERAIAKDLGAVFLVGIGGKLSD
GHCHDVEAPDGDDWSTPSELGHAGLNGDILVWNPVLEDAFELSSMGIRVDA
DTLKHQLALTGDEDRLQLEWHQALLRGEMPQTIGGGIGQSRLTMLLLQLPHI
GQVQCGVWPAAVRENVPSLL
SEQ ID NO.16
MKTAYIAKQRQISFVKSHFSRQLEERLGLIEVQAPILSRVGDGTQDNLSGCEK
AVQVKVKALPDAQFEVVHSLAKWKRQTLGQHDFSAGEGLYTHMKALRPDE
DRLSPLESVYVDQWDWERVMGDGERQFSTLKSTVEAIWAGIKATEAAVSEE
FGLAPFLPDQIHFVHSQELLSRYPDLDAKGRERAIAKDLGAVFLVGIGGKLSD
GHCHDVEAPDGDDWSTPSELGHAGLNGDILVWNPVLEDAFELSSMGIRVDA
DTLKHQLALTGDEDRLQLEWHQALLRGEMPQTIGGGIGQSRLTMLLLQLPHI
GQVQCGVWPAAVRENVPSLL
SEQ ID NO.17
MKTAYIAKQRQISFVKSHFSRQLEERLGLIEVQAPILSRVGDGTQDNLSGCEKA
VQVKVKALPDAQFEVVVSLAKWKRQTLGQHDFSAGEGLYTHMKALRPDED
RLSPLESVYVDQWDWERVMGDGERQFSTLKSTVEAIWAGIKATEAAVSEEFG
LAPFLPDQIHFVHSQELLSRYPDLDAKGRERAIAKDLGAVFLVGIGGKLSDGH
CHDVEAPDGDDWSTPSELGHAGLNGDILVWNPVLEDAFELSSMGIRVDADT
LKHQLALTGDEDRLQLEWHQALLRGEMPQTIGGGIGQSRLTMLLLQLPHIGQ
VQCGVWPAAVRENVPSLL。
Claims (10)
1.一种酶活性提高的天冬酰胺合成酶A突变体，其特征在于：所述天冬酰胺合成酶A突变体是将来源于唾液乳杆菌Lactobacillus salivarius的天冬酰胺合成酶A氨基酸序列的第53位的赖氨酸突变为丙氨酸、第71位的组氨酸突变为缬氨酸、第100位的精氨酸突变为丙氨酸、第110位的组氨酸突变为谷氨酸、第214氨酸突变为谷氨酸、第218位的酪氨酸突变为甘氨酸其中的一种或组合获得。
2.如权利要求1所述的天冬酰胺合成酶A突变体，其特征在于：所述天冬酰胺合成酶A的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述天冬酰胺合成酶A突变体为下述任意一种：
(i)第53位的赖氨酸突变为丙氨酸,其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
(ii)第71位的组氨酸突变为缬氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
(iii)第100位的精氨酸突变为丙氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；
(iv)第110位的组氨酸突变为谷氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；
(v)第214位的精氨酸突变为谷氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；
(vi)第218位的酪氨酸突变为甘氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；
(vii)第71位的组氨酸突变为缬氨酸以及第110位的组氨酸突变为谷氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；
(viii)第71位的组氨酸突变为缬氨酸以及第214位的精氨酸突变为谷氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；
(ix)第110位的组氨酸突变为谷氨酸以及第214位的精氨酸突变为谷氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；
(x)第110位的组氨酸突变为谷氨酸以及第218位的酪氨酸突变为甘氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示；
(xi)第214位的精氨酸突变为谷氨酸以及第218位的酪氨酸突变为甘氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示；
(xii)第71位的组氨酸突变为缬氨酸、第110位的组氨酸突变为谷氨酸以及第214位的精氨酸突变为谷氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示；
(xiii)第71位的组氨酸突变为缬氨酸、第110位的组氨酸突变为谷氨酸以及第218位的酪氨酸突变为甘氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示；
(xiv)第71位的组氨酸突变为缬氨酸、第214位的精氨酸突变为谷氨酸以及第218位的酪氨酸突变为甘氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示；
(xv)第110位的组氨酸突变为谷氨酸、第214位的精氨酸突变为谷氨酸以及第218位的酪氨酸突变为甘氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示；
(xvi)第71位的组氨酸突变为缬氨酸、第110位的组氨酸突变为谷氨酸、第214位的精氨酸突变为谷氨酸以及第218位的酪氨酸突变为甘氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示。
3.编码权利要求1所述突变体天冬酰胺合成酶A的基因。
4.一种重组质粒，其特征在于：所述重组质粒包含权利要求3所述的基因。
5.一种宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞含有权利要求4所述的重组质粒。
6.如权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞包括大肠杆菌枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、乳酸菌、毕赤酵母中的一种。
7.一种表达权利要求1所述天冬酰胺合成酶A突变体的重组菌株。
8.如权利要求1所述的天冬酰胺合成酶A突变体能提高天冬酰胺合成酶A的酶活性以及底物耐受浓度。
9.如权利要求1所述的天冬酰胺合成酶A突变体在生产L-天冬酰胺中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于：所述以天冬酰胺、氯化铵以及ATP/葡萄糖为底物，以天冬酰胺合成酶A突变体为催化剂催化生产L-天冬酰胺。
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