CN114350692A - 一种全细胞催化制备脱羧肌肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种磷酸转移酶与非核糖体肽合成酶融合蛋白的编码序列及基于该序列的重组蛋白、表达质粒和表达菌株。本发明通过构建重组基因工程菌，使用生物酶催化的方法制备脱羧肌肽，比现有化学合成法更加绿色环保。本发明的方法通过全细胞催化法制备脱羧肌肽，是生物法制备脱羧肌肽的首次报道。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种制备脱羧肌肽的方法，具体涉及一种全细胞催化制备脱羧肌肽的方法。
(二)背景技术
脱羧肌肽(Carcinine)，学名为β-丙氨酰-L-组氨(β-alanyl histamine)，是一种由β-丙氨酸和组胺构成的咪唑类二肽。1975年，脱羧肌肽最早在甲壳类动物体内被发现，随后在一些哺乳动物心脏中也有发现。相比于肌肽、维生素C和茶多酚等，脱羧肌肽抗氧化效果更强，同时还具备抗糖化、隔离紫外线、对抗皮肤光老化、改善肌肤皱纹和晒后修复等功效。此外，还具有显著的“逆转”功能，有效逆转皮肤的糖化、氧化作用。而且代谢速度慢，结构稳定，可以更有效的发挥功能。相关实验表明，使用品牌HMA的脱羧肌肽精华一至两个肌肤周期，黄皮粗糙降低30％，肌肤紧致度提升24％，润弹细腻增加37％；志愿者口服脱羧肌肽显著增加了皮肤生物表面的抗氧化潜力，是目前化妆品领域极具市场前景的二肽。
脱羧肌肽除了在化妆品行业有广泛应用外，其在抗肿瘤、保护视网膜病变等方面都有很好的药理作用。在医学方面，脱羧肌肽可以用于治疗癫痫、运动或认知缺陷等疾病；可以显著抑制肿瘤细胞的生长,并且这一现象表现为浓度依赖性。
目前，脱羧肌肽的主要合成方法为化学合成法，化学合成是通过短肽合成技术。方法为：Boc-β-Ala-OH与N-羟基丁二酰亚胺反应得到Boc-β-Ala-OSU，所述Boc-β-Ala-OSU再与组胺二盐酸盐、NaHCO3反应得到Boc-β-Ala-组胺，最后脱去Boc保护基得到成品脱羧肌肽，但是该方法在中间步骤去除ACN时，有大量副产物固体析出。目前，未见生物法合成脱羧肌肽的相关报告。相关文献报道，在果蝇体内的非核糖体肽合成酶Ebony能够合成脱羧肌肽，但Ebony在合成脱羧肌肽的过程中，结构域之间的相互连接需要磷酸转移酶进行辅助。前期相关文章重点在于Ebony的相关结构，未涉及对产物脱羧肌肽的合成。
为了使用更绿色环保的方法制备脱羧肌肽，本发明使用反应条件温和、对环境友好的全细胞法制备脱羧肌肽，为脱羧肌肽的生物合成奠定了基础。
(三)发明内容
针对现有技术的化学合成方法制备脱羧肌肽副产物多、污染较大等缺陷，本发明的提供一种全细胞催化制备脱羧肌肽的方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
第一方面，本发明提供一种磷酸转移酶与非核糖体肽合成酶融合蛋白的编码序列。
优选所述磷酸转移酶的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述非核糖体肽合成酶的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
进一步优选，所述磷酸转移酶与非核糖体肽合成酶融合蛋白的编码序列如SEQ IDNO：3所示。
值得注意的是，所述磷酸转移酶与非核糖体肽合成酶融合蛋白的编码序列所编码的磷酸转移酶与非核糖体肽合成酶融合蛋白也应在本发明的保护范围内。
第二方面，本发明提供一种包含上述磷酸转移酶与非核糖体肽合成酶的融合蛋白的编码序列的重组表达质粒。
优选地，所述重组表达质粒的载体为pTrc99A。
具体地，所述重组表达质粒按以下方法构建：
(1)构建Bacillus subtilis磷酸转移酶Sfp的重组表达质粒：
利用引物对Bsusfp-F和Bsusfp-R对枯草芽孢杆菌的基因组进行PCR扩增，得到Bsusfp基因；
Bsusfp-F 5’-3’:
ACCATCATCACCACAGCCAG ATGAAGATTTACGGAATTTATATGGA
Bsusfp-R 5’-3’:
GTGGCAGCAGCCTAGGTTAA TTATAAAAGCTCTTCGTACGAGACC
利用引物对pACYC-F和pACYC-R对pACYCDuet-1质粒进行反向PCR，得到线性化pACYC质粒；
pACYC-F 5’-3’:TTAACCTAGGCTGCTGCCAC
pACYC-R 5’-3’:CTGGCTGTGGTGATGATGGT
利用一步克隆试剂盒(ClonExpress II One Step Cloning Kit)将所述Bsusfp基因和所述线性化pACYCDuet-1质粒连接，获得插入Bsusfp基因的重组表达质粒pACYC-sfp；
(2)构建非核糖体肽合成酶Ebony的重组表达质粒：
将SEQ ID NO：2所示的优化后的果蝇(Drosophila melanogaster)ebony基因插在质粒pET28a的EcoRⅠ和HindⅢ两个酶切位点之间，获得果蝇ebony基因的重组表达质粒pET28a-ebony；
(3)构建替换复制子的重组表达质粒
利用引物对p15A-F和p15A-R对pACYCDuet-1质粒进行PCR扩增，得到p15A复制子；
p15A-F 5’-3’:TTTCCATAGGCTCCGCCC
p15A-R 5’-3’:TTGAGATCGTTTTGGTCTGCG
利用引物对pTrc99A-F和pTrc99A-R对pTrc99A质粒进行反向PCR，得到线性化pTrc99A片段；
pTrc99A-F 5’-3’:CCAAAACGATCTCAA AACGCCAGCAACGCGG
pTrc99A-R5’-3’:CGGAGCCTATGGAAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTA CGG
利用一步克隆试剂盒(ClonExpress II One Step Cloning Kit)将所述p15A复制子和所述线性化pTrc99A质粒连接，获得替换复制子的重组表达质粒pTrc99A-p15A(pTrc-p15A)；
(4)构建B.subtilis磷酸转移酶Sfp与D.melanogaster非核糖体肽合成酶Ebony融合蛋白的重组表达质粒：
以步骤(2)中所述的重组表达质粒pET28a-ebony为模板，利用引物对ebony-F和ebony-R进行PCR扩增，得到ebony基因；
ebony-F 5’-3’AGGAAACAGACC ATGGGCAGCTTACCGCAGCT
ebony-R 5’-3’TCCGCCAAAACAGCC TTATTTACCAACTTCTTTCCAATG
利用引物对pTrc-F和pTrc-R对pTrc-p15A质粒进行反向PCR，得到线性化pTrc-p15A片段；
pTrc-F 5’-3’GAAGTTGGTAAATAA GGCTGTTTTGGCGGATG
pTrc-R 5’-3’CTGCGGTAAGCTGCC CATGGTCTGTTTCCTGTGTGAA
利用一步克隆试剂盒(ClonExpress II One Step Cloning Kit)将所述ebony基因和所述线性化pTrc-p15A质粒连接，获得插入ebony基因的重组表达质粒pTrc-p15A-ebony；
以重组表达质粒pACYC-sfp为模板，利用引物对sfp-F1和sfp-R1进行PCR扩增，得到sfp基因；在引物的同源臂中带有两个蛋白的连接点GSG(下划线表示)；
sfp-F1 5’-3’
CACAGGAAACAGACC ATGAAGATTTACGGAATTTATATGG
sfp-R1 5’-3’
TGCCCATACCGCTACC TAAAAGCTCTTCGTACGAGACC
利用引物对pTrc-ebony-F和pTrc-ebony-R对pTrc-p15A-ebony质粒进行反向PCR，得到线性化pTrc-p15A-ebony质粒，在引物的同源臂中带有两个蛋白的连接点GSG(下划线表示)；
pTrc-ebony-F 5’-3’
CTTTTAGGTAGCGGT ATGGGCAGCTTACCGCA
pTrc-ebony-R 5’-3’
TCCGTAAATCTTCAT GGTCTGTTTCCTGTGTGAAATT
利用一步克隆试剂盒(ClonExpress II One Step Cloning Kit)将所述sfp基因和所述线性化pTrc-p15A-ebony质粒连接，获得所述重组表达质粒pTrc-p15A-sfp-GSG-ebony(pTrc-p15A-SGE)。
该重组质粒在大肠杆菌中有效表达，可产生相关产物--脱羧肌肽。
本发明提供枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)磷酸转移酶Sfp与果蝇(Drosophila melanogaster)非核糖体肽合成酶Ebony的两种不同表达方式。
第三方面，本发明还提供上述表达质粒转化宿主细胞获得的重组基因工程菌。
优选地，所述宿主细胞为E.coli BL21(DE3)或E.coli W3110，特别优选E.coliW3110。
构建融合蛋白进行表达时，所述的重组表达质粒的载体为pTrc99A-p15A(pTrc-p15A)，该载体是将pTrc99A质粒的原pBR322复制子改为p15A复制子所述的宿主细胞包括但不限于本领域的各种常规宿主细胞，本发明优选E.coli W3110。
优选地，所述重组基因工程菌按以下方法制备：利用热激法将所述的重组表达质粒转入E.coli W3110感受态细胞，所得转化产物均匀涂布在含有100μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，经37℃过夜培养，挑取单克隆测序验证，获得所述重组基因工程菌。
第四方面，本发明提供一种上述重组基因工程菌经诱导表达得到的湿菌体。
具体地，所述湿菌体按如下方法制备：
将所述重组基因工程菌接种于LB培养基中，37℃，200rpm摇床震荡12h，获得种子液；将所述种子液以2％的接种量转接于新鲜LB培养基中，在37℃，200rpm摇床震荡至OD600为0.6-0.8，加入终浓度为0.3mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，在20℃，180rpm条件下诱导表达12h，12000rpm高速离心15min，弃上清，所得沉淀用pH 8，50mM的三氨基甲烷(Tris-HCl)缓冲液重悬，8000rpm离心15min，弃上清，得到所述湿菌体。
需要注意的是，从上述湿菌体中提取出来的重组酶也应在本发明的保护范围内。
第五方面，本发明提供一种上述湿菌体在全细胞催化制备脱羧肌肽的应用。
具体地，所述应用为：
取所述湿菌体、β-丙氨酸、氯化镁、ATP溶于pH 7的磷酸钠缓冲溶液，在25℃恒温振荡仪中进行反应，振荡反应转速为600～800r/min；反应30min后加入组胺，继续反应12-48h(优选36h)，得到含脱羧肌肽的反应液；所述湿菌体的质量以所述磷酸钠缓冲溶液的体积计为5g/L-50g/L(优选25g/L)，所述β-丙氨酸的质量以所述磷酸钠缓冲溶液的体积计为0.22g/L-8.91g/L(优选0.89g/L)；所述氯化镁的质量以所述磷酸钠缓冲溶液的体积计为0.24g/L-3.81g/L(优选0.95g/L)，所述ATP的质量以所述磷酸钠缓冲溶液的体积计为0.55g/L-22.04g/L(优选2.20g/L)；所述组胺的质量以所述磷酸钠缓冲溶液的体积计为0.56g/L-11.11g/L(优选2.22g/L)。
优选地，所述β-丙氨酸和组胺的物质的量之比为1:0.1～10，优选1:2。
本发明所阐述LB培养基组成为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，溶剂为去离子水，pH值自然。
所述LB固体培养基组成：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉2％，溶剂为去离子水，pH值自然。
本发明所阐述的pH 7缓冲溶液为磷酸钠缓冲液，组成为：1mol/L Na2HPO4，1mol/LNaH2PO4。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明通过构建重组基因工程菌，使用生物酶催化的方法制备脱羧肌肽，比现有化学合成法更加绿色环保。本发明的方法通过全细胞催化法制备脱羧肌肽，是生物法制备脱羧肌肽的首次报道。
(四)附图说明
图1Ebony蛋白的SDS-PAGE分析；1：pET28a-ebony重组载体诱导前蛋白条带；2：pET28a-ebony重组载体诱导后蛋白条带；M：Marker。
图2Sfp和Ebony蛋白的SDS-PAGE分析；M：Marker；1：pACYC-sfp重组载体诱导前蛋白条带；2、3：pACYC-Sfp重组载体诱导后蛋白条带；4：pET28a-ebony重组载体诱导前蛋白条带；5、6：pET28a-ebony重组载体诱导后蛋白条带。
图3Sfp和Ebony重组蛋白的SDS-PAGE分析；M：Marker；1：pTrc-p15A-SGE重组载体诱导前蛋白条带；2、3：pTrc-p15A-SGE重组载体诱导后蛋白条带。
图4不同菌株全细胞催化的脱羧肌肽产量：误差线表示三个生物学重复的标准差。(a)菌株pACYC-sfp+pET28a-ebony合成脱羧肌肽的产量；(b)菌株pTrc-p15A-SGE合成脱羧肌肽的产量。
图5菌株pTrc-p15A-SGE在不同浓度梯度底物对脱羧肌肽产量的影响：误差线表示三个生物学重复的标准差。
图6脱羧肌肽液相图：(a)脱羧肌肽标样(浓度)液相图；(b)菌株pET28a-ebony合成脱羧肌肽液相图；(c)菌株pACYC-sfp+pET28a-ebony合成脱羧肌肽液相图；(d)菌株pTrc-p15A-SGE合成脱羧肌肽液相图。(其中衍生化试剂DNS的出峰时间为2.3min、3.2min、4.2min，组胺出峰时间为5.1min，脱羧肌肽出峰时间为8.7～8.8min)
图7脱羧肌肽液质图：(a)脱羧肌肽标样液质图；(b)菌株pACYC-sfp+pET28a-ebony合成脱羧肌肽液质图。
图8丹磺酰氯衍生化脱羧肌肽标样，标准曲线图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此，本领域的普通技术人员根据这些实施方式所做出的方法上的变换均包含在本发明的保护范围内。
LB液体培养基组成为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，溶剂为去离子水，pH值自然；
LB固体培养基组成：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉2％，溶剂为去离子水，pH值自然。
50mM pH 7的磷酸钠缓冲液组成为：1mol/L Na2HPO4，1mol/LNaH2PO4。
实施例1：构建重组表达质粒
1、引物
对sfp、ebony基因、p15A复制子及pET28a、pACYC、pTrc99A、pTrc-p15A载体进行体外扩增，分别如下：
(1)构建pACYC-sfp质粒；本实施例所用到的PCR引物序列列于表5，在体外扩增Bsusfp基因(核酸序列如SEQ ID NO.1所示，来源于枯草芽孢杆菌基因组，引物对为Bsusfp-F、Bsusfp-R)，在MCS位点反向PCR线性化pACYC质粒(pACYCDuet-1质粒，引物对为pACYC-F、pACYC-R)。上述质粒PCR扩增后产物经内切酶Dpn I 37℃消化1h，去除模板DNA，用纯化试剂盒纯化后，利用ClonExpress II One Step Cloning Kit(诺维赞生物科技有限公司，货号：C112-01)将Bsusfp基因和线性化pACYC片段进行一步克隆(一步克隆体系如表1)，一步克隆体系直接热激转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，转化产物均匀涂布在含有100μg/mL氯霉素抗性(CHL)的琼脂平板上，经37℃过夜培养，得到包含重组表达质粒pACYC-sfp的转化子；挑取单克隆测序验证，获得重组基因工程菌。
表1一步克隆体系构建pACYC-sfp
(2)构建pET28a-ebony质粒；该D.melanogaster非核糖体肽合成酶Ebony基因由北京擎科生物技术有限公司合成，将该基因进行密码子优化后(优化后的序列如SEQ ID NO：2所示)插在质粒pET28a的EcoRⅠ和HindⅢ两个酶切位点中，获得果蝇ebony基因的重组表达质粒pET28a-ebony。在该合成质粒的干粉管中加入40μL的ddH20混匀，取混匀后的质粒3μL直接热激转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，转化产物均匀涂布在含有100μg/mL卡那霉素抗性(Kan)的琼脂平板上，经37℃过夜培养，得到包含重组表达质粒pET28a-ebony的转化子；挑取单克隆测序验证，获得重组基因工程菌。
(3)构建pACYC-sfp+pET28a-ebony质粒；将(2)中所述的包含pET28a-ebony重组表达质粒的基因工程菌制备成为E.coli BL21(DE3)+pET28a-ebony感受态细胞，利用热激法将pACYC-sfp重组表达质粒转入E.coli BL21(DE3)+pET28a-ebony感受态细胞，转化产物均匀涂布在含有100μg/mL卡那霉素(Kan)和含有100μg/mL氯霉素(CHL)的LB固体培养基上，经37℃过夜培养，得到包含重组表达质粒pACYC-sfp+pET28a-ebony的转化子；挑取单克隆测序验证，获得重组基因工程菌。
(4)构建pTrc-p15A质粒；本实施例所用到的PCR引物序列列于表5，在体外扩增p15A复制子(核酸序列如SEQ ID NO.4所示，来源于质粒pACYC，引物对为p15A-F、p15A-R)，通过在MCS位点反向PCR线性化pTrc质粒(pTrc99A质粒来源于实验室，引物对为pTrc99A-F、pTrc99A-R)，上述质粒PCR扩增后产物经内切酶Dpn I 37℃消化1h，去除模板DNA，用纯化试剂盒纯化后，利用ClonExpress II One Step Cloning Kit(诺维赞生物科技有限公司，货号：C112-01)将p15A复制子和线性化pTrc片段进行一步克隆(一步克隆体系如表2)，一步克隆体系直接热激转化E.coli W3110感受态细胞，转化产物均匀涂布在含有100μg/mL卡那霉素抗性(Kan)的琼脂平板上，经37℃过夜培养，得到包含重组表达质粒pTrc-p15A的转化子；
表2一步克隆体系构建pTrc-p15A
(5)构建pTrc-p15A-ebony质粒；本实施例所用到的PCR引物序列列于表5，在体外扩增ebony基因(核酸序列如SEQ ID NO.2所示，来源于合成质粒pET28a-Ebony，引物对为ebony-F、ebony-R)，该pET28a-ebony质粒由北京擎科生物技术有限公司合成，将ebony基因进行密码子优化后插在质粒pET28a的EcoRⅠ和HindⅢ两个酶切位点中得到。通过在MCS位点反向PCR线性化pTrc-p15A质粒(pTrc-p15A质粒为上一步所构，引物对为pTrc-F、pTrc-R)，上述质粒PCR扩增后产物经内切酶Dpn I 37℃消化1h，去除模板DNA，用纯化试剂盒纯化后，利用ClonExpress II One Step Cloning Kit(诺维赞生物科技有限公司，货号：C112-01)将ebony基因和线性化线性化pTrc-p15A片段进行一步克隆(一步克隆体系如表3)，一步克隆体系直接热激转化E.coli W3110感受态细胞，转化产物均匀涂布在含有100μg/mL卡那抗性(Kan)的琼脂平板上，经37℃过夜培养，得到包含重组表达质粒pTrc-p15A-ebony的转化子；
表3一步克隆体系构建pTrc-p15A-ebony
(6)构建Sfp与Ebony融合蛋白表达质粒；本实施例所用到的PCR引物序列列于表5，在体外扩增sfp基因(核酸序列如SEQ ID NO.1所示来源于构建质粒pACYC-sfp，引物对为sfp-F1、sfp-R1)，通过在MCS位点反向PCR线性化pTrc-p15A-ebony质粒(引物对为pTrc-ebony-F、pTrc-ebony-R)，上述质粒PCR扩增后产物经内切酶Dpn I 37℃消化1h，去除模板DNA，用纯化试剂盒纯化后，利用ClonExpress II One Step Cloning Kit(诺维赞生物科技有限公司，货号：C112-01)将sfp基因和线性化线性化pTrc-p15A-ebony片段进行一步克隆(一步克隆体系如表4)，一步克隆体系直接热激转化E.coli W3110感受态细胞，转化产物均匀涂布在含有100μg/mL卡那抗性(Kan)的琼脂平板上，经37℃过夜培养，得到包含重组表达质粒pTrc-p15A-sfp-GSG-ebony(pTrc-p15A-SGE，sfp-GSG-ebony的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示)的转化子；挑取单克隆测序验证，获得重组基因工程菌。
表4一步克隆体系构建pTrc-p15A-SGE
2、PCR反应体系与反应条件(50μL体系)
1μL浓度1ng/μL的DNA为模板，浓度10μM的引物F和引物R(表5)各1μL，2×PrimeSTAR HSDNA Polymerase高保真DNA聚合酶25μL，超纯水22μL。
表5构建重组质粒及验证相关引物
PCR反应条件为：预变性98℃，5min，然后进入温度循环98℃，10sec；58℃，10sec；72℃，1min；共30个循环，72℃，终延伸5min，最后终止温度为4℃。
实施例2：构建重组基因工程菌
对实施例1得到的转化子进行如下操作：
1、测序验证：用灭菌的枪头挑选平板上的5个转化子用于菌落PCR(所用引物见表6)。条带正确的接种于含有相应抗性(见表7)的LB液体培养基中，37℃，200r/min振荡培养12h，测序及保菌，构建的菌株如表7。
表6实施例1中转化子所需菌落PCR引物
表7实施例2中所构建的菌株
2、重组质粒的诱导表达：无菌条件下，从步骤1的LB液体培养基中取1mL种子液，转接到50mL LB培养基(含终浓度为100μg/mL的Kana；含终浓度为100μg/mL的Kana和CHL)中，37℃，200r/min振荡培养2h左右直到OD600为0.6～0.8，加入终浓度为0.3mM的IPTG 180rpm震荡培养12h进行表达，得到诱导液。验证步骤如下：取1mL的诱导液，12,000rpm，离心2min；去上清，加入超纯水悬浮沉淀，然后加入6×Loading Buffer混匀，100℃水浴10min，12,000rpm，离心2min，取20μL样品进行SDS-PAGE电泳分析(见附图1、2)。
实施例3：脱羧肌肽的制备反应及检测
1、将含有所述重组基因工程菌诱导后的菌体12000rpm高速离心15min，弃上清收集菌体；收集的菌体使用20mL pH 8，50mM的三氨基甲烷(Tris-HCl)缓冲液重悬，8000rpm，高速离心15min，弃上清收集菌体。取收集的菌体0.05g、β-丙氨酸0.0017g、氯化镁0.0019g、ATP 0.0044g溶于2mL pH 7的磷酸钠缓冲溶液，在25℃恒温振荡仪中进行反应，振荡反应转速为600～800r/min，体系反应30min后加入组胺0.0044g，之后反应48h。
2、取步骤1的反应样品，12000rpm，离心2min，取上清300μL，加入40μL NaOH(0.1M)以及600μL DNS(丹磺酰氯，10mg/mL)混合在40℃下进行衍生化反应20min。后采用高效液相色谱(HPLC)检测反应生成的脱羧肌肽的含量。HPLC检测方法：色谱柱为Welchrom C18(4.6mm×250mm)，紫外检测波长为245nm，流速为1mL/min，进样量为10μL，柱温35℃，流动相为70％乙腈，进行液相检测。
实施例4：脱羧肌肽反应体系的底物优化
1、在实施例3中，脱羧肌肽相关反应体系的基础上，对底物β-丙氨酸和组胺添加量的比例进行优化。将含有所述重组基因工程菌诱导后的菌体12000rpm高速离心15min，弃上清收集菌体；收集的菌体使用20mL pH 8，50mM的三氨基甲烷(Tris-HCl)缓冲液重悬，8000rpm，高速离心15min，弃上清收集菌体。对反应体系进行底物比例优化，底物浓度梯度设置为1:1，1:2，1:4，1:6，1:8，1:10，2:1，4:1，6:1，8:1，10:1(见表8)。2mL pH 7的磷酸钠缓冲溶液的反应体系中其余成为：收集的菌体0.05g，氯化镁0.0019g、ATP 0.0044g，在25℃恒温振荡仪中进行反应，振荡反应转速为600～800r/min，体系反应30min后加入对应浓度的组胺(见表8)，之后反应48h。液相检测后底物浓度梯度最佳反应比例为1:2。
表8底物浓度梯度
全细胞催化结果显示，单独的Ebony酶不能催化底物产生脱羧肌肽，菌株pET28a-ebony在48h内没有任何产量。随后，将磷酸转移酶Sfp在含有Ebony酶的菌株中表达，菌株pACYC-sfp+pET28a-ebony在反应48h后，最大产量为2.17mM。为了进一步提高产量，将Ebony酶和Sfp酶构建为融合蛋白，所得菌株pTrc-p15A-SGE的最大产量为7.45mM(原数据见表9)，底物浓度梯度优化后，最佳反应比例为1:2。
表9脱羧肌肽产量-原始数据
“--”表示未检测到有效信号，即无产物生成。
SEQ ID NO:1(Bacillus subtilis sfp)
ATGAAGATTTACGGAATTTATATGGACCGCCCGCTTTCACAGGAAGAAAATGAACGGTTCATGACTTTCATATCACCTGAAAAACGGGAGAAATGCCGGAGATTTTATCATAAAGAAGATGCTCACCGCACCCTGCTGGGAGATGTGCTCGTTCGCTCAGTCATAAGCAGGCAGTATCAGTTGGACAAATCCGATATCCGCTTTAGCACGCAGGAATACGGGAAGCCGTGCATCCCTGATCTTCCCGACGCTCATTTCAACATTTCTCACTCCGGCCGCTGGGTCATTGGTGCGTTTGATTCACAGCCGATCGGCATAGATATCGAAAAAACGAAACCGATCAGCCTTGAGATCGCCAAGCGCTTCTTTTCAAAAACAGAGTACAGCGACCTTTTAGCAAAAGACAAGGACGAGCAGACAGACTATTTTTATCATCTATGGTCAATGAAAGAAAGCTTTATCAAACAGGAAGGCAAAGGCTTATCGCTTCCGCTTGATTCCTTTTCAGTGCGCCTGCATCAGGACGGACAAGTATCCATTGAGCTTCCGGACAGCCATTCCCCATGCTATATCAAAACGTATGAGGTCGATCCCGGCTACAAAATGGCTGTATGCGCCGCACACCCTGATTTCCCCGAGGATATCACAATGGTCTCGTACGAAGAGCTTTTATAA
SEQ ID NO:2(密码子优化后的Drosophila melanogaster ebony)
ATGGGCAGCTTACCGCAGCTGAGCATTGTTAAAGGACTGCAGCAGGACTTTGTTCCGCGCGCGCTGCACCGCATTTTTGAAGAACAGCAGCTGCGTCACGCGGACAAAGTTGCGCTGATTTATCAGCCGTCTACCACCGGACAGGGTATGGCACCTTCACAGAGCAGCTATCGTCAAATGAATGAACGTGCAAATCGTGCAGCACGTCTGTTAGTTGCAGAAACCCATGGTCGTTTTCTGCAGCCGAATAGCGACGGAGATTTTATTGTTGCCGTTTGTATGCAGCCGAGCGAAGGTCTGGTGACCACCCTGCTGGCAATTTGGAAAGCAGGTGGTGCGTATCTGCCGATTGATCCGTCATTTCCGGCAAATCGGATTCACCACATTTTACTGGAAGCAAAACCGACCCTGGTTATTCGTGATGATGATATTGATGCCGGTCGTTTCCAGGGTACACCTACTTTAAGCACCACCGAACTGTATGCAAAAAGCCTGCAATTAGCAGGTAGTAATCTGCTGAGCGAAGAAATGCTGCGTGGAGGAAATGATCATACAGCAATTGTTTTATACACCTCAGGCAGCACCGGCGTTCCGAAAGGTGTACGCCTGCCTCACGAAAGCATTCTGAACCGTTTACAGTGGCAGTGGGCCACCTTTCCGTACACCGCAAATGAAGCGGTTTCTGTCTTTAAAACCGCACTGACATTTGTTGACAGTATTGCAGAATTATGGGGTCCGCTGATGTGCGGTCTGGCAATTTTAGTTGTTCCGAAAGCTGTTACCAAAGATCCGCAGCGTCTGGTTGCCCTGTTAGAACGTTATAAAATTCGGCGTCTGGTTCTGGTTCCGACACTGTTACGCTCTCTGTTAATGTATCTGAAAATGGAAGGAGGTGGTGCCGCACAGAAATTACTGTACAATTTACAAATCTGGGTGTGCTCAGGGGAACCTCTGAGTGTTAGCTTAGCCTCTAGTTTTTTTGATTATTTCGACGAAGGTGTTCATCGTTTATATAATTTTTACGGTTCCACCGAGGTGCTGGGTGATGTTACCTATTTTGCATGTGAATCTAAAAAGCAGCTGTCATTATATGATAACGTTCCGATTGGTATTCCGCTGTCTAATACCGTTGTTTACCTGCTGGATGCAGATTATCGTCCGGTTAAAAATGGTGAGATTGGTGAAATTTTCGCATCAGGTCTGAATCTGGCAGCAGGTTATGTTAATGGTCGTGACCCGGAACGCTTTCTGGAAAACCCGTTAGCAGTTGAGAAAAAGTATGCACGTCTGTATCGTACAGGCGACTATGGTAGCCTGAAAAACGGTAGTATTATGTATGAGGGCCGTACCGATTCACAGGTTAAAATTCGTGGCCATCGTGTTGATCTGAGCGAAGTGGAAAAAAATGTTGCAGAACTGCCGCTGGTTGATAAAGCAATTGTTCTGTGTTATCATGCAGGTCAGGTTGATCAGGCAATTCTGGCATTTGTTAAACTGCGTGATGATGCACCGATGGTTACCGAAACCCAGATGGAAGCACGTCTGAAAGATAAACTGGCAGATTATATGACCCCGCAGGTTGTTATTCTGGAACATGTTCCGCTGCTGGTTAATGGTAAAGTTGATCGTCAGGCACTGCTGAAAACCTATGAAACCGCAAATAATAATGAAGGTGATAGCAGCATTGTTCTGGATTTTGATTATAGCCAGGTTCCGGAAGATCTGAAACTGACCGCACGTGATCTGTTTGAAACCGTTGGTGGTGTTATTGGTCGTAGCACCGAAACCACCCTGCCGCCGCATAGCAATTTTTATGAACTGGGTGGTAATAGCCTGAATAGCATTTTTACCGTTACCCTGCTGCGTGAAAAAGGTTATAATATTGGTATTAGCGAATTTATTGCAGCAAAAAATCTGGGTGAAATTATTGAAAAAATGGCAGCAAATCATGATGCAGTTCAGCTGGAAGAAGAAAGCCTGAATGCATGTCCGCATCTGAAAATGGAAGCAGTTCCGCTGCGTCTGGAACATCGTCAGGAAGTTATTGATATTATTGTTGCAAGTTTTTATAATAAAGCAGATCTGGAACAGTGGCTGAAACCGGGTGTTCTGCGTACCGATTATAGCGATATTCTGAATGATATTTGGAATGTTCTGGTTGAACGTGATCTGAGCTTTGTTGTTTATGATACCAATACCGATCGTATTATTGGTACCGCACTGAATTTTGATGCACGTAATGAACCGGAAGTTGATATTAAAAGCAAACTGCTGATTGTTTTTGAATTTCTGGAATTTTGTGAAGGTCCGATTCGTGATAATTATCTGCCGAAAGGTCTGAATCAGATTCTGCATAGCTTTATGATGGGTACCGCAGAAAAACTGAATCCGCGTGAAAATATTGCATGTATGCATTTTATGGAACATGAAGTTCTGCGTGTTGCACGTGAAAAACAGTTTGCAGGTATTTTTACCACCAATACCAGCCCGCTGACCCAGCAGCTGGCAGATGTTTATCATTATAAAACCCTGCTGAATTTTCAGGTTAATGAATATGTTCATAGCGATGGTAGCCGTCCGTTTGGTGATGCACCGGATGAACAGCGTGCAATTGTTCATTGGAAAGAAGTTGGTAAATAA
SEQ ID NO:3(sfp-GSG-ebony)
ATGAAGATTTACGGAATTTATATGGACCGCCCGCTTTCACAGGAAGAAAATGAACGGTTCATGACTTTCATATCACCTGAAAAACGGGAGAAATGCCGGAGATTTTATCATAAAGAAGATGCTCACCGCACCCTGCTGGGAGATGTGCTCGTTCGCTCAGTCATAAGCAGGCAGTATCAGTTGGACAAATCCGATATCCGCTTTAGCACGCAGGAATACGGGAAGCCGTGCATCCCTGATCTTCCCGACGCTCATTTCAACATTTCTCACTCCGGCCGCTGGGTCATTGGTGCGTTTGATTCACAGCCGATCGGCATAGATATCGAAAAAACGAAACCGATCAGCCTTGAGATCGCCAAGCGCTTCTTTTCAAAAACAGAGTACAGCGACCTTTTAGCAAAAGACAAGGACGAGCAGACAGACTATTTTTATCATCTATGGTCAATGAAAGAAAGCTTTATCAAACAGGAAGGCAAAGGCTTATCGCTTCCGCTTGATTCCTTTTCAGTGCGCCTGCATCAGGACGGACAAGTATCCATTGAGCTTCCGGACAGCCATTCCCCATGCTATATCAAAACGTATGAGGTCGATCCCGGCTACAAAATGGCTGTATGCGCCGCACACCCTGATTTCCCCGAGGATATCACAATGGTCTCGTACGAAGAGCTTTTAGGTAGCGGTATGGGCAGCTTACCGCAGCTGAGCATTGTTAAAGGACTGCAGCAGGACTTTGTTCCGCGCGCGCTGCACCGCATTTTTGAAGAACAGCAGCTGCGTCACGCGGACAAAGTTGCGCTGATTTATCAGCCGTCTACCACCGGACAGGGTATGGCACCTTCACAGAGCAGCTATCGTCAAATGAATGAACGTGCAAATCGTGCAGCACGTCTGTTAGTTGCAGAAACCCATGGTCGTTTTCTGCAGCCGAATAGCGACGGAGATTTTATTGTTGCCGTTTGTATGCAGCCGAGCGAAGGTCTGGTGACCACCCTGCTGGCAATTTGGAAAGCAGGTGGTGCGTATCTGCCGATTGATCCGTCATTTCCGGCAAATCGGATTCACCACATTTTACTGGAAGCAAAACCGACCCTGGTTATTCGTGATGATGATATTGATGCCGGTCGTTTCCAGGGTACACCTACTTTAAGCACCACCGAACTGTATGCAAAAAGCCTGCAATTAGCAGGTAGTAATCTGCTGAGCGAAGAAATGCTGCGTGGAGGAAATGATCATACAGCAATTGTTTTATACACCTCAGGCAGCACCGGCGTTCCGAAAGGTGTACGCCTGCCTCACGAAAGCATTCTGAACCGTTTACAGTGGCAGTGGGCCACCTTTCCGTACACCGCAAATGAAGCGGTTTCTGTCTTTAAAACCGCACTGACATTTGTTGACAGTATTGCAGAATTATGGGGTCCGCTGATGTGCGGTCTGGCAATTTTAGTTGTTCCGAAAGCTGTTACCAAAGATCCGCAGCGTCTGGTTGCCCTGTTAGAACGTTATAAAATTCGGCGTCTGGTTCTGGTTCCGACACTGTTACGCTCTCTGTTAATGTATCTGAAAATGGAAGGAGGTGGTGCCGCACAGAAATTACTGTACAATTTACAAATCTGGGTGTGCTCAGGGGAACCTCTGAGTGTTAGCTTAGCCTCTAGTTTTTTTGATTATTTCGACGAAGGTGTTCATCGTTTATATAATTTTTACGGTTCCACCGAGGTGCTGGGTGATGTTACCTATTTTGCATGTGAATCTAAAAAGCAGCTGTCATTATATGATAACGTTCCGATTGGTATTCCGCTGTCTAATACCGTTGTTTACCTGCTGGATGCAGATTATCGTCCGGTTAAAAATGGTGAGATTGGTGAAATTTTCGCATCAGGTCTGAATCTGGCAGCAGGTTATGTTAATGGTCGTGACCCGGAACGCTTTCTGGAAAACCCGTTAGCAGTTGAGAAAAAGTATGCACGTCTGTATCGTACAGGCGACTATGGTAGCCTGAAAAACGGTAGTATTATGTATGAGGGCCGTACCGATTCACAGGTTAAAATTCGTGGCCATCGTGTTGATCTGAGCGAAGTGGAAAAAAATGTTGCAGAACTGCCGCTGGTTGATAAAGCAATTGTTCTGTGTTATCATGCAGGTCAGGTTGATCAGGCAATTCTGGCATTTGTTAAACTGCGTGATGATGCACCGATGGTTACCGAAACCCAGATGGAAGCACGTCTGAAAGATAAACTGGCAGATTATATGACCCCGCAGGTTGTTATTCTGGAACATGTTCCGCTGCTGGTTAATGGTAAAGTTGATCGTCAGGCACTGCTGAAAACCTATGAAACCGCAAATAATAATGAAGGTGATAGCAGCATTGTTCTGGATTTTGATTATAGCCAGGTTCCGGAAGATCTGAAACTGACCGCACGTGATCTGTTTGAAACCGTTGGTGGTGTTATTGGTCGTAGCACCGAAACCACCCTGCCGCCGCATAGCAATTTTTATGAACTGGGTGGTAATAGCCTGAATAGCATTTTTACCGTTACCCTGCTGCGTGAAAAAGGTTATAATATTGGTATTAGCGAATTTATTGCAGCAAAAAATCTGGGTGAAATTATTGAAAAAATGGCAGCAAATCATGATGCAGTTCAGCTGGAAGAAGAAAGCCTGAATGCATGTCCGCATCTGAAAATGGAAGCAGTTCCGCTGCGTCTGGAACATCGTCAGGAAGTTATTGATATTATTGTTGCAAGTTTTTATAATAAAGCAGATCTGGAACAGTGGCTGAAACCGGGTGTTCTGCGTACCGATTATAGCGATATTCTGAATGATATTTGGAATGTTCTGGTTGAACGTGATCTGAGCTTTGTTGTTTATGATACCAATACCGATCGTATTATTGGTACCGCACTGAATTTTGATGCACGTAATGAACCGGAAGTTGATATTAAAAGCAAACTGCTGATTGTTTTTGAATTTCTGGAATTTTGTGAAGGTCCGATTCGTGATAATTATCTGCCGAAAGGTCTGAATCAGATTCTGCATAGCTTTATGATGGGTACCGCAGAAAAACTGAATCCGCGTGAAAATATTGCATGTATGCATTTTATGGAACATGAAGTTCTGCGTGTTGCACGTGAAAAACAGTTTGCAGGTATTTTTACCACCAATACCAGCCCGCTGACCCAGCAGCTGGCAGATGTTTATCATTATAAAACCCTGCTGAATTTTCAGGTTAATGAATATGTTCATAGCGATGGTAGCCGTCCGTTTGGTGATGCACCGGATGAACAGCGTGCAATTGTTCATTGGAAAGAAGTTGGTAAATAA
SEQ ID NO:4(p15A复制子)
TTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACAAGCATCACGAAATCTGACGCTCAAATCAGTGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCTGGCGGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCTGCCTTTCGGTTTACCGGTGTCATTCCGCTGTTATGGCCGCGTTTGTCTCATTCCACGCCTGACACTCAGTTCCGGGTAGGCAGTTCGCTCCAAGCTGGACTGTATGCACGAACCCCCCGTTCAGTCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGAAAGACATGCAAAAGCACCACTGGCAGCAGCCACTGGTAATTGATTTAGAGGAGTTAGTCTTGAAGTCATGCGCCGGTTAAGGCTAAACTGAAAGGACAAGTTTTGGTGACTGCGCTCCTCCAAGCCAGTTACCTCGGTTCAAAGAGTTGGTAGCTCAGAGAACCTTCGAAAAACCGCCCTGCAAGGCGGTTTTTTCGTTTTCAGAGCAAGAGATTACGCGCAGACCAAAACGATCTCAA
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求保护范围内。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 一种全细胞催化制备脱羧肌肽的方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 675
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400> 1
atgaagattt acggaattta tatggaccgc ccgctttcac aggaagaaaa tgaacggttc 60
atgactttca tatcacctga aaaacgggag aaatgccgga gattttatca taaagaagat 120
gctcaccgca ccctgctggg agatgtgctc gttcgctcag tcataagcag gcagtatcag 180
ttggacaaat ccgatatccg ctttagcacg caggaatacg ggaagccgtg catccctgat 240
cttcccgacg ctcatttcaa catttctcac tccggccgct gggtcattgg tgcgtttgat 300
tcacagccga tcggcataga tatcgaaaaa acgaaaccga tcagccttga gatcgccaag 360
cgcttctttt caaaaacaga gtacagcgac cttttagcaa aagacaagga cgagcagaca 420
gactattttt atcatctatg gtcaatgaaa gaaagcttta tcaaacagga aggcaaaggc 480
ttatcgcttc cgcttgattc cttttcagtg cgcctgcatc aggacggaca agtatccatt 540
gagcttccgg acagccattc cccatgctat atcaaaacgt atgaggtcga tcccggctac 600
aaaatggctg tatgcgccgc acaccctgat ttccccgagg atatcacaat ggtctcgtac 660
gaagagcttt tataa 675
<210> 2
<211> 2640
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgggcagct taccgcagct gagcattgtt aaaggactgc agcaggactt tgttccgcgc 60
gcgctgcacc gcatttttga agaacagcag ctgcgtcacg cggacaaagt tgcgctgatt 120
tatcagccgt ctaccaccgg acagggtatg gcaccttcac agagcagcta tcgtcaaatg 180
aatgaacgtg caaatcgtgc agcacgtctg ttagttgcag aaacccatgg tcgttttctg 240
cagccgaata gcgacggaga ttttattgtt gccgtttgta tgcagccgag cgaaggtctg 300
gtgaccaccc tgctggcaat ttggaaagca ggtggtgcgt atctgccgat tgatccgtca 360
tttccggcaa atcggattca ccacatttta ctggaagcaa aaccgaccct ggttattcgt 420
gatgatgata ttgatgccgg tcgtttccag ggtacaccta ctttaagcac caccgaactg 480
tatgcaaaaa gcctgcaatt agcaggtagt aatctgctga gcgaagaaat gctgcgtgga 540
ggaaatgatc atacagcaat tgttttatac acctcaggca gcaccggcgt tccgaaaggt 600
gtacgcctgc ctcacgaaag cattctgaac cgtttacagt ggcagtgggc cacctttccg 660
tacaccgcaa atgaagcggt ttctgtcttt aaaaccgcac tgacatttgt tgacagtatt 720
gcagaattat ggggtccgct gatgtgcggt ctggcaattt tagttgttcc gaaagctgtt 780
accaaagatc cgcagcgtct ggttgccctg ttagaacgtt ataaaattcg gcgtctggtt 840
ctggttccga cactgttacg ctctctgtta atgtatctga aaatggaagg aggtggtgcc 900
gcacagaaat tactgtacaa tttacaaatc tgggtgtgct caggggaacc tctgagtgtt 960
agcttagcct ctagtttttt tgattatttc gacgaaggtg ttcatcgttt atataatttt 1020
tacggttcca ccgaggtgct gggtgatgtt acctattttg catgtgaatc taaaaagcag 1080
ctgtcattat atgataacgt tccgattggt attccgctgt ctaataccgt tgtttacctg 1140
ctggatgcag attatcgtcc ggttaaaaat ggtgagattg gtgaaatttt cgcatcaggt 1200
ctgaatctgg cagcaggtta tgttaatggt cgtgacccgg aacgctttct ggaaaacccg 1260
ttagcagttg agaaaaagta tgcacgtctg tatcgtacag gcgactatgg tagcctgaaa 1320
aacggtagta ttatgtatga gggccgtacc gattcacagg ttaaaattcg tggccatcgt 1380
gttgatctga gcgaagtgga aaaaaatgtt gcagaactgc cgctggttga taaagcaatt 1440
gttctgtgtt atcatgcagg tcaggttgat caggcaattc tggcatttgt taaactgcgt 1500
gatgatgcac cgatggttac cgaaacccag atggaagcac gtctgaaaga taaactggca 1560
gattatatga ccccgcaggt tgttattctg gaacatgttc cgctgctggt taatggtaaa 1620
gttgatcgtc aggcactgct gaaaacctat gaaaccgcaa ataataatga aggtgatagc 1680
agcattgttc tggattttga ttatagccag gttccggaag atctgaaact gaccgcacgt 1740
gatctgtttg aaaccgttgg tggtgttatt ggtcgtagca ccgaaaccac cctgccgccg 1800
catagcaatt tttatgaact gggtggtaat agcctgaata gcatttttac cgttaccctg 1860
ctgcgtgaaa aaggttataa tattggtatt agcgaattta ttgcagcaaa aaatctgggt 1920
gaaattattg aaaaaatggc agcaaatcat gatgcagttc agctggaaga agaaagcctg 1980
aatgcatgtc cgcatctgaa aatggaagca gttccgctgc gtctggaaca tcgtcaggaa 2040
gttattgata ttattgttgc aagtttttat aataaagcag atctggaaca gtggctgaaa 2100
ccgggtgttc tgcgtaccga ttatagcgat attctgaatg atatttggaa tgttctggtt 2160
gaacgtgatc tgagctttgt tgtttatgat accaataccg atcgtattat tggtaccgca 2220
ctgaattttg atgcacgtaa tgaaccggaa gttgatatta aaagcaaact gctgattgtt 2280
tttgaatttc tggaattttg tgaaggtccg attcgtgata attatctgcc gaaaggtctg 2340
aatcagattc tgcatagctt tatgatgggt accgcagaaa aactgaatcc gcgtgaaaat 2400
attgcatgta tgcattttat ggaacatgaa gttctgcgtg ttgcacgtga aaaacagttt 2460
gcaggtattt ttaccaccaa taccagcccg ctgacccagc agctggcaga tgtttatcat 2520
tataaaaccc tgctgaattt tcaggttaat gaatatgttc atagcgatgg tagccgtccg 2580
tttggtgatg caccggatga acagcgtgca attgttcatt ggaaagaagt tggtaaataa 2640
<210> 3
<211> 3321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgaagattt acggaattta tatggaccgc ccgctttcac aggaagaaaa tgaacggttc 60
atgactttca tatcacctga aaaacgggag aaatgccgga gattttatca taaagaagat 120
gctcaccgca ccctgctggg agatgtgctc gttcgctcag tcataagcag gcagtatcag 180
ttggacaaat ccgatatccg ctttagcacg caggaatacg ggaagccgtg catccctgat 240
cttcccgacg ctcatttcaa catttctcac tccggccgct gggtcattgg tgcgtttgat 300
tcacagccga tcggcataga tatcgaaaaa acgaaaccga tcagccttga gatcgccaag 360
cgcttctttt caaaaacaga gtacagcgac cttttagcaa aagacaagga cgagcagaca 420
gactattttt atcatctatg gtcaatgaaa gaaagcttta tcaaacagga aggcaaaggc 480
ttatcgcttc cgcttgattc cttttcagtg cgcctgcatc aggacggaca agtatccatt 540
gagcttccgg acagccattc cccatgctat atcaaaacgt atgaggtcga tcccggctac 600
aaaatggctg tatgcgccgc acaccctgat ttccccgagg atatcacaat ggtctcgtac 660
gaagagcttt taggtagcgg tatgggcagc ttaccgcagc tgagcattgt taaaggactg 720
cagcaggact ttgttccgcg cgcgctgcac cgcatttttg aagaacagca gctgcgtcac 780
gcggacaaag ttgcgctgat ttatcagccg tctaccaccg gacagggtat ggcaccttca 840
cagagcagct atcgtcaaat gaatgaacgt gcaaatcgtg cagcacgtct gttagttgca 900
gaaacccatg gtcgttttct gcagccgaat agcgacggag attttattgt tgccgtttgt 960
atgcagccga gcgaaggtct ggtgaccacc ctgctggcaa tttggaaagc aggtggtgcg 1020
tatctgccga ttgatccgtc atttccggca aatcggattc accacatttt actggaagca 1080
aaaccgaccc tggttattcg tgatgatgat attgatgccg gtcgtttcca gggtacacct 1140
actttaagca ccaccgaact gtatgcaaaa agcctgcaat tagcaggtag taatctgctg 1200
agcgaagaaa tgctgcgtgg aggaaatgat catacagcaa ttgttttata cacctcaggc 1260
agcaccggcg ttccgaaagg tgtacgcctg cctcacgaaa gcattctgaa ccgtttacag 1320
tggcagtggg ccacctttcc gtacaccgca aatgaagcgg tttctgtctt taaaaccgca 1380
ctgacatttg ttgacagtat tgcagaatta tggggtccgc tgatgtgcgg tctggcaatt 1440
ttagttgttc cgaaagctgt taccaaagat ccgcagcgtc tggttgccct gttagaacgt 1500
tataaaattc ggcgtctggt tctggttccg acactgttac gctctctgtt aatgtatctg 1560
aaaatggaag gaggtggtgc cgcacagaaa ttactgtaca atttacaaat ctgggtgtgc 1620
tcaggggaac ctctgagtgt tagcttagcc tctagttttt ttgattattt cgacgaaggt 1680
gttcatcgtt tatataattt ttacggttcc accgaggtgc tgggtgatgt tacctatttt 1740
gcatgtgaat ctaaaaagca gctgtcatta tatgataacg ttccgattgg tattccgctg 1800
tctaataccg ttgtttacct gctggatgca gattatcgtc cggttaaaaa tggtgagatt 1860
ggtgaaattt tcgcatcagg tctgaatctg gcagcaggtt atgttaatgg tcgtgacccg 1920
gaacgctttc tggaaaaccc gttagcagtt gagaaaaagt atgcacgtct gtatcgtaca 1980
ggcgactatg gtagcctgaa aaacggtagt attatgtatg agggccgtac cgattcacag 2040
gttaaaattc gtggccatcg tgttgatctg agcgaagtgg aaaaaaatgt tgcagaactg 2100
ccgctggttg ataaagcaat tgttctgtgt tatcatgcag gtcaggttga tcaggcaatt 2160
ctggcatttg ttaaactgcg tgatgatgca ccgatggtta ccgaaaccca gatggaagca 2220
cgtctgaaag ataaactggc agattatatg accccgcagg ttgttattct ggaacatgtt 2280
ccgctgctgg ttaatggtaa agttgatcgt caggcactgc tgaaaaccta tgaaaccgca 2340
aataataatg aaggtgatag cagcattgtt ctggattttg attatagcca ggttccggaa 2400
gatctgaaac tgaccgcacg tgatctgttt gaaaccgttg gtggtgttat tggtcgtagc 2460
accgaaacca ccctgccgcc gcatagcaat ttttatgaac tgggtggtaa tagcctgaat 2520
agcattttta ccgttaccct gctgcgtgaa aaaggttata atattggtat tagcgaattt 2580
attgcagcaa aaaatctggg tgaaattatt gaaaaaatgg cagcaaatca tgatgcagtt 2640
cagctggaag aagaaagcct gaatgcatgt ccgcatctga aaatggaagc agttccgctg 2700
cgtctggaac atcgtcagga agttattgat attattgttg caagttttta taataaagca 2760
gatctggaac agtggctgaa accgggtgtt ctgcgtaccg attatagcga tattctgaat 2820
gatatttgga atgttctggt tgaacgtgat ctgagctttg ttgtttatga taccaatacc 2880
gatcgtatta ttggtaccgc actgaatttt gatgcacgta atgaaccgga agttgatatt 2940
aaaagcaaac tgctgattgt ttttgaattt ctggaatttt gtgaaggtcc gattcgtgat 3000
aattatctgc cgaaaggtct gaatcagatt ctgcatagct ttatgatggg taccgcagaa 3060
aaactgaatc cgcgtgaaaa tattgcatgt atgcatttta tggaacatga agttctgcgt 3120
gttgcacgtg aaaaacagtt tgcaggtatt tttaccacca ataccagccc gctgacccag 3180
cagctggcag atgtttatca ttataaaacc ctgctgaatt ttcaggttaa tgaatatgtt 3240
catagcgatg gtagccgtcc gtttggtgat gcaccggatg aacagcgtgc aattgttcat 3300
tggaaagaag ttggtaaata a 3321
<210> 4
<211> 545
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tttccatagg ctccgccccc ctgacaagca tcacgaaatc tgacgctcaa atcagtggtg 60
gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc ctggcggctc cctcgtgcgc 120
tctcctgttc ctgcctttcg gtttaccggt gtcattccgc tgttatggcc gcgtttgtct 180
cattccacgc ctgacactca gttccgggta ggcagttcgc tccaagctgg actgtatgca 240
cgaacccccc gttcagtccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa 300
cccggaaaga catgcaaaag caccactggc agcagccact ggtaattgat ttagaggagt 360
tagtcttgaa gtcatgcgcc ggttaaggct aaactgaaag gacaagtttt ggtgactgcg 420
ctcctccaag ccagttacct cggttcaaag agttggtagc tcagagaacc ttcgaaaaac 480
cgccctgcaa ggcggttttt tcgttttcag agcaagagat tacgcgcaga ccaaaacgat 540
ctcaa 545
Claims (10)
1.一种磷酸转移酶与非核糖体肽合成酶融合蛋白的编码序列。
2.如权利要求1所述的磷酸转移酶与非核糖体肽合成酶融合蛋白的编码序列，其特征在于：所述磷酸转移酶的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述非核糖体肽合成酶的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
3.如权利要求1所述的磷酸转移酶与非核糖体肽合成酶融合蛋白的编码序列，其特征在于：所述磷酸转移酶与非核糖体肽合成酶融合蛋白的编码序列如SEQ ID NO：3所示。
4.一种包含如权利要求1所述的磷酸转移酶与非核糖体肽合成酶的融合蛋白的编码序列的重组表达质粒。
5.如权利要求4所述的所述重组表达质粒，其特征在于所述重组表达质粒按以下方法构建：
(1)构建B.subtilis磷酸转移酶Sfp的重组表达质粒：
利用引物对Bsusfp-F和Bsusfp-R对枯草芽孢杆菌的基因组进行PCR扩增，得到Bsusfp基因；
Bsusfp-F 5’-3’:
ACCATCATCACCACAGCCAG ATGAAGATTTACGGAATTTATATGGA
Bsusfp-R 5’-3’:
GTGGCAGCAGCCTAGGTTAATTATAAAAGCTCTTCGTACGAGACC
利用引物对pACYC-F和pACYC-R对pACYCDuet-1质粒进行反向PCR，得到线性化pACYC质粒；
pACYC-F 5’-3’:TTAACCTAGGCTGCTGCCAC
pACYC-R 5’-3’:CTGGCTGTGGTGATGATGGT
利用一步克隆试剂盒将所述Bsusfp基因和所述线性化pACYCDuet-1质粒连接，获得插入Bsusfp基因的重组表达质粒pACYC-sfp；
(2)构建非核糖体肽合成酶Ebony的重组表达质粒：
将SEQ ID NO：2所示的优化后的果蝇ebony基因插在质粒pET28a的EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ两个酶切位点之间，获得果蝇ebony基因的重组表达质粒pET28a-ebony；
(3)构建替换复制子的重组表达质粒
利用引物对p15A-F和p15A-R对pACYCDuet-1质粒进行PCR扩增，得到p15A复制子；
p15A-F 5’-3’:TTTCCATAGGCTCCGCCC
p15A-R 5’-3’:TTGAGATCGTTTTGGTCTGCG
利用引物对pTrc99A-F和pTrc99A-R对pTrc99A质粒进行反向PCR，得到线性化pTrc99A片段；
pTrc99A-F 5’-3’:CCAAAACGATCTCAAAACGCCAGCAACGCGG
pTrc99A-R 5’-3’:CGGAGCCTATGGAAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGG
利用一步克隆试剂盒将所述p15A复制子和所述线性化pTrc99A质粒连接，获得替换复制子的重组表达质粒pTrc-p15A；
(4)构建B.subtilis磷酸转移酶Sfp与D.melanogaster非核糖体肽合成酶Ebony融合蛋白的重组表达质粒：
以步骤(2)中所述的重组表达质粒pET28a-ebony为模板，利用引物对ebony-F和ebony-R进行PCR扩增，得到ebony基因；
ebony-F 5’-3’AGGAAACAGACC ATGGGCAGCTTACCGCAGCT
ebony-R 5’-3’TCCGCCAAAACAGCC TTATTTACCAACTTCTTTCCAATG
利用引物对pTrc-F和pTrc-R对pTrc-p15A质粒进行反向PCR，得到线性化pTrc-p15A片段；
pTrc-F 5’-3’GAAGTTGGTAAATAAGGCTGTTTTGGCGGATG
pTrc-R 5’-3’CTGCGGTAAGCTGCC CATGGTCTGTTTCCTGTGTGAA
利用一步克隆试剂盒将所述ebony基因和所述线性化pTrc-p15A质粒连接，获得插入ebony基因的重组表达质粒pTrc-p15A-ebony；
以重组表达质粒pACYC-sfp为模板，利用引物对sfp-F1和sfp-R1进行PCR扩增，得到sfp基因；
sfp-F1 5’-3’
CACAGGAAACAGACC ATGAAGATTTACGGAATTTATATGG
sfp-R1 5’-3’
TGCCCATACCGCTACC TAAAAGCTCTTCGTACGAGACC
利用引物对pTrc-ebony-F和pTrc-ebony-R对pTrc-p15A-ebony质粒进行反向PCR，得到线性化pTrc-p15A-ebony质粒；
pTrc-ebony-F 5’-3’
CTTTTAGGTAGCGGT ATGGGCAGCTTACCGCA
pTrc-ebony-R 5’-3’
TCCGTAAATCTTCAT GGTCTGTTTCCTGTGTGAAATT
利用一步克隆试剂盒将所述sfp基因和所述线性化pTrc-p15A-ebony质粒连接，获得所述重组表达质粒。
6.如权利要求4所述重组表达质粒转化宿主细胞获得的重组基因工程菌。
7.如权利要求6所述的重组基因工程菌，其特征在于所述重组基因工程菌按以下方法制备：利用热激法将所述的重组表达质粒转入E.coli W3110感受态细胞，所得转化产物均匀涂布在含有100μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，经37℃过夜培养，挑取单克隆测序验证，获得所述重组基因工程菌。
8.如权利要求7所述的重组基因工程菌经诱导表达得到的湿菌体。
9.如权利要求8所述的湿菌体在全细胞催化制备脱羧肌肽的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于所述应用为：
取所述湿菌体、β-丙氨酸、氯化镁、ATP溶于pH 7的磷酸钠缓冲溶液，在25℃恒温振荡仪中进行反应，振荡反应转速为600～800r/min；反应30min后加入组胺，继续反应12-48h，得到含脱羧肌肽的反应液；所述湿菌体的质量以所述磷酸钠缓冲溶液的体积计为5g/L-50g/L，所述β-丙氨酸的质量以所述磷酸钠缓冲溶液的体积计为0.22g/L-8.91g/L；所述氯化镁的质量以所述磷酸钠缓冲溶液的体积计为0.24g/L-3.81g/L，所述ATP的质量以所述磷酸钠缓冲溶液的体积计为0.55g/L-22.04g/L；所述组胺的质量以所述磷酸钠缓冲溶液的体积计为0.56g/L-11.11g/L。
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| CN110981810A (zh) * | 2019-12-19 | 2020-04-10 | 东莞市维琪科技有限公司 | 一种脱羧肌肽的合成方法 |
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