CN108441501B

CN108441501B - 莲子草假隔链格孢菌效应子Na2-g9900及其蛋白和应用

Info

Publication number: CN108441501B
Application number: CN201810102172.8A
Authority: CN
Inventors: 董章勇; 向梅梅; 肖永欣; 罗梅; 张云霞
Original assignee: Zhongkai University of Agriculture and Engineering
Current assignee: Zhongkai University of Agriculture and Engineering
Priority date: 2018-02-01
Filing date: 2018-02-01
Publication date: 2021-07-02
Anticipated expiration: 2038-02-01
Also published as: CN108441501A

Abstract

本发明公开了一种莲子草假隔链格孢菌效应子Na2‑g9900及其蛋白和应用。该效应子基因的核苷酸全长序列如SEQ ID NO.1所示，开放阅读框序列如SEQ ID NO.2所示，效应子Na2‑g9900蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明所发现的效应子Na2‑g9900对空心莲子草具有显著的致病性，可用于制备防治空心莲子草的制剂产品，也可用于构建生防菌，在空心莲子草的治理方面具有很好的应用前景。

Description

莲子草假隔链格孢菌效应子Na2-g9900及其蛋白和应用

技术领域

本发明属于有害生物治理技术领域。更具体地，涉及一种莲子草假隔链格孢菌效应子Na2-g9900及其蛋白和应用。

背景技术

空心莲子草（Alternanthera Philoxeroides(Mart.)Griseb.）因其具有繁殖迅速、适应性强等特点，于20世纪50年代被引入我国江苏和浙江等地作为牲畜饲料植物栽培，随后相继传入全国各地并引起草害，与农作物争夺水分、肥料、阳光和生长空间，导致农作物严重减产，同时还会对水产、水利、航运、物种资源、生态环境等产生极为不利的影响，成为全国大部分省区和水域的恶性杂草，是我国有害生物治理的重点目标之一。

目前，我国对空心莲子草以化学防治为主，有几种除草剂如水花生净，对防除空心莲子草效果比较显著，但因其残留期较长而受到限制。许多真菌毒素由于具有特异性生理活性和高度专化性作用位点，即使在很低的浓度下也能引起寄主植物的特异性反应，而且和传统的化学农药相比，往往具有化学结构新颖、低毒、低残留等特点，因此成为开发生物除草剂优先和重点考虑的对象。国内外近十年来对于空心莲子草的生物防治研究也逐渐开展了起来，其中以对假隔链格孢菌Nimbyaalternan-therae的研究居多。

莲子草假隔链格孢菌成为空心莲子草的重要生防菌，但长时间保存或继代培养会导致该菌株产孢量和致病性显著下降。而且，目前国内外主要侧重于假隔链格孢菌对空心莲子草防治的生理生化研究，但在其毒素合成路径的分子作用机制方面还未开展相关工作。而不同变异菌株的致病性、产毒能力和遗传稳定性往往存在较大差异，会给未来生产带来障碍。

因此，对其生防真菌莲子草假隔链格孢菌的致病效应因子的研究将有利于开发新型的高效低毒药剂，为有害生物空心莲子草的生物防治做出贡献。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有空心莲子草治理技术的缺陷和不足，提供一种莲子草假隔链格孢菌效应子，其真核表达产物对空心莲子草具有显著的致病性，在空心莲子草的治理方面具有很好的应用前景。

本发明的目的是提供一种莲子草假隔链格孢菌效应子Na2-g9900及其蛋白。

本发明另一目的是提供所述莲子草假隔链格孢菌效应子Na2-g9900的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明首先提供了一种莲子草假隔链格孢菌效应子Na2-g9900基因，其核苷酸全称序列如SEQ ID NO.1所示，开放阅读框全长序列如SEQ ID NO.2所示。

其编码蛋白效应子Na2-g9900的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

经过研究试验显示，该效应子Na2-g9900的表达产物对空心莲子草具有显著的致病性，因此，以下所述应用均应在本发明的保护范围之内。

所述效应子Na2-g9900基因或所述效应子Na2-g9900在防治空心莲子草方面的应用，或在制备空心莲子草的防治制剂方面的应用。

所述效应子Na2-g9900基因在构建空心莲子草的生防工程菌方面的应用。

一种含有SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示序列的重组载体。

一种含有SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示序列的重组菌。

一种能够表达SEQ ID NO.3所示蛋白的重组菌。

一种空心莲子草的防治制剂，含有所述效应子Na2-g9900基因或所述效应子Na2-g9900。

一种空心莲子草的生防工程菌，其基因组中含有SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示序列。

一种空心莲子草的生防工程菌，其能够表达SEQ ID NO.3所示蛋白。

具体地，本发明提供了一种可选择的实施方案：

一种含有SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示序列的重组载体，是将SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示序列连接到真核表达载体pPICZαA上所得。

一种能够表达SEQ ID NO.3所示蛋白的重组菌，是将所述重组载体电击转化感受态酵母所得。所得重组酵母培养即可表达获得效应子Na2-g9900。

另外，上述效应子Na2-g9900基因的检测引物组也应在本发明的保护范围之内，如检测引物为引物g9900-F/g9900-R，序列分别如SEQ ID NO.4和5所示。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了莲子草假隔链格孢菌效应子Na2-g9900，其表达产物对空心莲子草具有显著的致病性，可用于制备防治空心莲子草的制剂产品，也可用于构建生防菌，在空心莲子草的治理方面具有很好的应用前景。

附图说明

图1为莲子草假隔链格孢菌效应子Na2-g9900基因的扩增电泳图。

图2为真核表达载体pPICZαA的示意图。

图3为真核表达载体构建示意图。

图4为真核表达载体pPICZαA的双酶切图。

图5为真核表达载体pPICZαA-9900c的双酶切验证。

图6为真核表达载体pPICZαA-9900c的线性酶切。

图7为效应子Na2-g9900表达产物的SDS-PAGE电泳结果。

图8为效应子Na2-g9900表达产物离体接种实验结果。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1 莲子草假隔链格孢菌效应子Na2-g9900基因克隆

本研究对莲子草假隔链格孢菌进行全基因组测序，从中获得一个特异性诱导表达的效应因子g9900，然后对g9900进行基因克隆，构建其真核表达载体，并导入酵母菌中进行诱导表达。再进一步研究其在病原菌致病过程中的作用。

g9900基因克隆方法如下：

1、引物设计

根据前期测定的莲子草假隔链格孢菌全基因组的g9900序列，设计特异引物如下：

引物g9900-F（如SEQ ID NO.4所示）：gtgGAATTCatgaagtcctacgctgtcctc

引物g9900-R（如SEQ ID NO.5所示）：cggTCTAGAgagcagaagccaggcggc

2、基因克隆

用PD培养基培养莲子草假隔链格孢菌，收集菌丝，分别提取总DNA和总RNA。

以提取的总DNA为模板，利用上述引物对g9900-F/ g9900-R，采用PCR扩增技术，克隆得到效应子Na2-g9900的基因组序列，如SEQ ID NO.1所示（扩增电泳图如图1所示）。

另外，以所提取的总RNA为模板，利用上述引物对g9900-F/ g9900-R，采用RT-PCR技术，克隆得到效应子Na2-g9900基因的开放阅读框（ORF）全长序列，如SEQ ID NO.2所示。

同时得到效应子Na2-g9900的氨基酸序列，如SEQ ID NO.3所示。

综上所得，莲子草假隔链格孢菌效应子Na2-g9900基因全长838 bp，包含一个内含子和两个外显子，开放阅读编码框777 bp，共编码258个氨基酸残基的蛋白，拥有分泌信号肽序列以及8个半胱氨酸。

实施例2 效应子Na2-g9900的真核表达

1、构建真核表达载体

（1）构建策略：酶切含有目的片段的克隆载体和表达载体后连接转化进行表达载体的构建。

所用真核表达载体pPICZαA （如图2所示）是一个毕赤酵母真核表达专用穿梭载体，目的片段插入后可恰好与载体的读码框吻合，保证转录和翻译时三联体密码子读码正确。构建载体的方法示意图如图3所示。

（2）构建方法

对Na2-g9900引入EcoRI和XbaI酶切位点，利用此两种酶分别消化pMD19-T-g9900和真核表达载体pPICZαA，回收目的片段后进行连接，转化到大肠杆菌中进行筛选扩繁，进行菌落PCR鉴定并抽提质粒进行酶切、测序验证。

（3）结果

真核表达载体pPICZαA的双酶切图如图4所示，构建的真核表达载体pPICZαA-9900c（即重组质粒pPICZαA-9900c）的双酶切验证结果如图5所示，线性酶切结果如图6所示。

2、真核表达

（1）电击转化

采用电穿孔系统电击感受态酵母将重组质粒pPICZαA-9900c导入酵母细胞培养。转化条件为：U=1100 V，W (pulse width)=0.200 ms，I(pulse int VL)=0.200 s，N=5pulses。

（2）通过菌落PCR筛选阳性转化子，鉴定重组质粒是否整合到酵母细胞。对表达产物离心后取上清进行SDS-PAGE电泳分析。

（3）结果如图7所示，表明效应子Na2-g9900成功获得真核表达。

实施例3 效应子Na2-g9900表达产物离体接种

1、按照实施例2的方法表达效应子Na2-g9900，取72h真核表达产物10μl，针刺接种于平展保湿培养的空心莲子草叶片，观察发病情况并拍照，以接种空载体pPICZαA表达产物及无菌水的空心莲子草叶片作对照，设置3次重复。

2、结果如图8所示，表明效应子Na2-g9900的表达蛋白能引起空心莲子草叶片的发病，对空心莲子草具有显著的致病性，是重要的致病效应因子，在空心莲子草的防治方面具有潜在的应用前景。

序列表

<110> 仲恺农业工程学院

<120> 莲子草假隔链格孢菌效应子Na2-g9900及其蛋白和应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 838

<212> DNA

<213> 莲子草假隔链格孢菌效应子Na2-g9900全基因序列(Nimbyaalternantherae)

<400> 1

atgaagtcct acgctgtcct cgctgccgcc tttgctggtg tggctctgtc ccaggacctg 60

cccagtggca gctgcgccgt aagtagtcgc tcgtgccctg ccaatgcctg cctggggctc 120

agtactaacg cgcgcttaga ggctctgcat caacaacatg gcccgcattg cccagaccga 180

gttctcgtgc ggccaggacg acgtgagctg cttctgcact cagtccaact gggcttacgg 240

catccgcgat tgctcccgcc aggcctgcga tgctgaccag tccgccgccg ccgtctcgtg 300

ggcgtacgcc cgctgcgctg gtgttgctgc cactgccagt ggctctggca cacctgctgc 360

tcttcccatc ttgacctccg ctgttgctag tgccactgct gtcgcccccg gctccatggt 420

cacctcggtc gtcacgtctg tcgtgtccag cgccgcatct ggtgccgaga gcgctacctc 480

ttcgctcgcg tcggccgctt cctccgcggt tgcctctggc gagtctgcca tcagctccgc 540

ccttgcctct gccagctccg ccctcgcctc tgccagcgcc agcatctcct ctgagcttgc 600

ctctgccact gactctgccg gttccgccat cgcttccgct accgaatctg ctggcagcgc 660

tgcttcctcc gctaccgagt ctgctggaag cgctgcttct tctgctacct ctgccgctgg 720

cagtgctgcc tcctctgctg gtagcgccgc ttcctctgtc gctcagggtg ccgcccccat 780

ggtcactggc atccccttcg ccgctggtgc cggcattgcc gcctggcttc tgctctaa 838

<210> 2

<211> 777

<212> DNA

<213> 莲子草假隔链格孢菌效应子Na2-g9900编码区序列(Nimbyaalternantherae)

<400> 2

atgaagtcct acgctgtcct cgctgccgcc tttgctggtg tggctctgtc ccaggacctg 60

cccagtggca gctgcgccag gctctgcatc aacaacatgg cccgcattgc ccagaccgag 120

ttctcgtgcg gccaggacga cgtgagctgc ttctgcactc agtccaactg ggcttacggc 180

atccgcgatt gctcccgcca ggcctgcgat gctgaccagt ccgccgccgc cgtctcgtgg 240

gcgtacgccc gctgcgctgg tgttgctgcc actgccagtg gctctggcac acctgctgct 300

cttcccatct tgacctccgc tgttgctagt gccactgctg tcgcccccgg ctccatggtc 360

acctcggtcg tcacgtctgt cgtgtccagc gccgcatctg gtgccgagag cgctacctct 420

tcgctcgcgt cggccgcttc ctccgcggtt gcctctggcg agtctgccat cagctccgcc 480

cttgcctctg ccagctccgc cctcgcctct gccagcgcca gcatctcctc tgagcttgcc 540

tctgccactg actctgccgg ttccgccatc gcttccgcta ccgaatctgc tggcagcgct 600

gcttcctccg ctaccgagtc tgctggaagc gctgcttctt ctgctacctc tgccgctggc 660

agtgctgcct cctctgctgg tagcgccgct tcctctgtcg ctcagggtgc cgcccccatg 720

gtcactggca tccccttcgc cgctggtgcc ggcattgccg cctggcttct gctctaa 777

<210> 3

<211> 258

<212> PRT

<213> 莲子草假隔链格孢菌效应子Na2-g9900氨基酸序列(Nimbyaalternantherae)

<400> 3

Met Lys Ser Tyr Ala Val Leu Ala Ala Ala Phe Ala Gly Val Ala Leu

1 5 10 15

Ser Gln Asp Leu Pro Ser Gly Ser Cys Ala Arg Leu Cys Ile Asn Asn

20 25 30

Met Ala Arg Ile Ala Gln Thr Glu Phe Ser Cys Gly Gln Asp Asp Val

35 40 45

Ser Cys Phe Cys Thr Gln Ser Asn Trp Ala Tyr Gly Ile Arg Asp Cys

50 55 60

Ser Arg Gln Ala Cys Asp Ala Asp Gln Ser Ala Ala Ala Val Ser Trp

65 70 75 80

Ala Tyr Ala Arg Cys Ala Gly Val Ala Ala Thr Ala Ser Gly Ser Gly

85 90 95

Thr Pro Ala Ala Leu Pro Ile Leu Thr Ser Ala Val Ala Ser Ala Thr

100 105 110

Ala Val Ala Pro Gly Ser Met Val Thr Ser Val Val Thr Ser Val Val

115 120 125

Ser Ser Ala Ala Ser Gly Ala Glu Ser Ala Thr Ser Ser Leu Ala Ser

130 135 140

Ala Ala Ser Ser Ala Val Ala Ser Gly Glu Ser Ala Ile Ser Ser Ala

145 150 155 160

Leu Ala Ser Ala Ser Ser Ala Leu Ala Ser Ala Ser Ala Ser Ile Ser

165 170 175

Ser Glu Leu Ala Ser Ala Thr Asp Ser Ala Gly Ser Ala Ile Ala Ser

180 185 190

Ala Thr Glu Ser Ala Gly Ser Ala Ala Ser Ser Ala Thr Glu Ser Ala

195 200 205

Gly Ser Ala Ala Ser Ser Ala Thr Ser Ala Ala Gly Ser Ala Ala Ser

210 215 220

Ser Ala Gly Ser Ala Ala Ser Ser Val Ala Gln Gly Ala Ala Pro Met

225 230 235 240

Val Thr Gly Ile Pro Phe Ala Ala Gly Ala Gly Ile Ala Ala Trp Leu

245 250 255

Leu Leu

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物g9900-F(forward primer g9900-F)

<400> 4

gtggaattca tgaagtccta cgctgtcctc 30

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 引物g9900-R(reverse primer g9900-R)

<400> 5

cggtctagag agcagaagcc aggcggc 27

Claims

1.一种莲子草假隔链格孢菌效应子基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；其开放阅读框全长序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一种莲子草假隔链格孢菌效应子蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

3.权利要求1所述的效应子基因或权利要求2所述的效应子蛋白在制备空心莲子草的防治制剂方面的应用。

4.权利要求1所述效应子基因在构建空心莲子草的生防工程菌方面的应用。

5.一种重组载体，其特征在于，含有SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示序列。

6.一种重组菌，其特征在于，含有SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示序列，或能够表达SEQ ID NO.3所示蛋白。

7.一组检测权利要求1所述效应子基因的引物组，其特征在于，序列如SEQ ID NO.4和5所示。