CN103409322A - 一种用于防治空心莲子草真菌孢子菌剂的制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种防治空心莲子草真菌孢子菌剂的制备方法和应用。其真菌孢子菌剂的制备方法是，将活化的莲子草假链格孢sf 193菌饼移入PD液体培养基中培养，获得菌丝液，用电动搅拌器搅拌，将粉碎的菌丝液稀释并涂布到CSNA平板上，置于荧光灯下照射，然后黑暗、低温培养。产孢后加无菌水，用毛笔涮轻轻洗落孢子，获得含大量分生孢子和少量菌丝的孢子菌剂。上述的真菌孢子菌剂的应用是：在高温少雨季节将所述的真菌孢子菌剂稀释后均匀地喷雾在空心莲子草叶面，每平方米喷雾量为稀释后的孢子液50ml，浓度为10⁵孢子/毫升。其优点是：sf 193菌株制备的真菌孢子菌剂稳定性好、抗逆性强、货架期长且对空心莲子草具有高效、稳定的防除效果，对人畜、作物、环境安全。

Description

一种用于防治空心莲子草真菌孢子菌剂的制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种莲子草假隔链格孢(Nimbya alternantherae(Holcomb & Antonopoulos)Simmons &Alcorn)sf 193菌株分生孢子的制备方法以及该真菌孢子菌剂的应用。属于利用有益微生物对空心莲子草进行生物防治的领域。 

背景技术

空心莲子草(Alternanthera philoxeroides Griseb)又名喜旱莲子草，俗称水花生，为苋科(Amaranthaceae)，莲子草属(Alternanthera)，是多年生宿根草本植物。原产于巴西、阿根廷等地，现已遍及美洲、澳洲、亚洲及非洲，是一种世界性恶性杂草。空心莲子草是20世纪30年代末随日军侵华引种至我国作为牧草栽培的，20世纪50年代，我国南方一些省市将空心莲子草作为猪羊饲料推广，随后又被进一步引入我国长江流域及南方各省。20世纪80年代以后，空心莲子草自然扩展成为水域和陆地两个生态类型的重要植被。2003年被原国家环保总局列入公布的“中国第一批外来入侵生物名单”。空心莲子草靠营养器官进行无性繁殖，由地下(水下)根茎越冬，抗逆性极强，地上匍匐茎、根状茎和根系都具有分株能力，入侵某一植被后所呈现出的斑块状镶嵌体是由一个植株通过不断的克隆生长而形成的，所以能够快速形成庞大的植物种群。我国空心莲子草主要分布于北纬44°以南、东经97°以东的海拔低、气候相对较暖湿的地区，几乎遍及黄河流域和南方各省市。近年来，发现空心莲子草体内含有皂甙等有毒物质，能传播家畜寄生虫，猪羊不爱取食，因此，农民现已不再将其作为饲料利用。由于大面积扩散蔓延，空心莲子草已对种植、水产、水利、航运、物种资源、生态环境等造成极为不利的影响，成为我国亟待继续防除的重要外来恶性杂草。 

空心莲子草生命力强，地上匍匐茎、根状茎和根系都具有分株能力，因此生长繁殖非常迅速，是一种入侵性很强的杂草，侵入后通过自然资源竞争，导致周边其它植物局部绝灭，对生态系统造成不可逆转的破坏。空心莲子草主要在农田、河道、沟渠、鱼塘等环境中生长危害。空心莲子草在农田中大量生长，与农作物争夺水分、肥料、阳光和生长空间，导致农作物严重减产，据报道空心莲子草为害水稻发生密度为339.6株/m2时，可使水稻减产约45％，甘薯减产约63％，小麦减产约36％，为害蔬菜引起产量损失一般为5％～15％，严重时达到20％以上；空心莲子草在鱼塘等水生环境中生长迅速，其覆盖在水面会影响沉水植物的光合作用；生长在水面的空心莲子草腐败后污染水质，水体中生物耗氧升高，鱼虾等水生生物会因缺乏溶解氧而窒息死亡，腐败后水中有机质含量增加，促进有害微生物生长或产生有毒物质，从而导致鱼病发生。空心莲子草在河道和沟渠中的生长会堵塞航道，限制水流，增加沉积，对水上运输和农田灌溉造成极为不利的影响。空心莲子草在路边、草坪、居民区等地生长蔓延，影响环境美观和卫生，增加草坪养护成本。空心莲子草为蚊蝇、人畜共患寄生虫等害虫滋生提供场所，危害人类健康。 

目前农业生产上空心莲子草防治的三种策略： 

(1)化学除草剂防除。目前常用的化学除草剂有草甘膦、使它隆和复配剂水花生净。但是这些除草剂都有它们的不足之处。草甘膦对空心莲子草地上部分的杀灭作用较好，但抑杀作用不明显；使它隆有效控制空心莲子草时间较长，但根除不彻底；水花生净因含甲磺隆，作物易产生药害，使用时受到限制。另外，在水面防除时，易污染水质，以及空心莲子草腐败后会导致水中有害微生物和有毒物质的产生。 

(2)机械或人工打捞。国内已有一些水域杂草打捞机，在不能使用化学除草剂，同时专食性昆虫种群尚未建立的情况下，使用打捞机清除水域、航道的空心莲子草是最有效的办法。不适宜打捞机的区域可采用人丁打捞。这种方式不仅需要投入大量的人力和物力，如果对打捞在植株处理不当容易造成空心莲子草人为的传播，加剧空心莲子草为害。 

(3)生物防除。1964年美国南部各州、1977年澳大利亚悉尼等地分别引进曲纹叶甲(Agasicles hygrophilaSelman & Vogt)防治空心莲子草获得成功。我国1987年中国农科院生防所从美国引进曲纹叶甲，先后已在重庆、广西、福建等地建立种群，在水域空心莲子草的防除上取得初步成功。但是，曲纹叶甲在我国五岭以北地区难以自然越冬，高温季节易滞育，严重影响该叶甲的大量扩繁和种群建立。除了曲纹叶甲，我国还发现虾钳披龟甲(Cassida piperata Hope)是嗜食空心莲子草的一种狭食性昆虫，但是它只取食空心莲子草上部幼嫩部分，不取食茎秆。在利用微生物防除空心莲子草方面，国内外已筛选获得多种具有开发潜力的致病真菌，如镰刀菌Fusarium sp.、胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides(Penz.)Penz.& Sacc.、莲子草尾孢Cercospora alternantherae Ellis & Langl.和莲子草假隔链格孢Nimbya alternantherae(Holcomb &Antonopoulos)Simmons & Alcorn等，其中以莲子草假隔链格孢研究得较为深入，对该菌的报道主要集中在致病性测定、防治效果评价、寄主范围、菌株产孢特性、毒素及其致病机理等领域。目前利用空心莲子草相关致病菌进行生防菌剂的制备及应用方面报道较少，我单位江苏省农业科学院植物保护研究所分离获得了一株莲子草假隔链格孢，并形成了以菌丝体为有效成分的生防制剂，获得国家发明专利(专利号为ZL200710019832.8)，但是该生防菌剂有效含量不易定量、货架期短、抗逆性差、防效不稳定。因此，研制开发新型菌剂成为空心莲子草防治的关键。目前，大多数真菌除草剂是利用真菌产生的孢子制备成生防制剂，因为孢子具有可定量、稳定性好、活性高、货架期长等方面的优势。因此，研究廉价、高效、可大量生产孢子的培养基及其规模生产技术是开发真菌微生物制剂成功的关键。 

发明内容

本发明的目的在于：针对外来入侵杂草——空心莲子草传播迅速、适应性强、危害性大和现有防治措施单一、不安全、成本高等特点，提出一种可定量、稳定性好、抗逆性强、货架期长且对空心莲子草致病性强而对人畜、作物和环境安全的真菌孢子菌剂的制备方法及该孢子菌剂的用途。 

本发明的目的是这样实现的：一种对空心莲子草具有强致病力的莲子草假隔链格孢(Nimbyaalternantherae(Holcomb & Antonopoulos)Simmons & Alcorn)sf 193菌株，其特征在于：保藏号CGMCC.NO. 1824的菌株，菌落在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上，25℃培养10天，直径达77～78mm，灰褐色，絮状；培养基内菌丝黄褐色；菌落反面黄褐色；菌丝无色至浅褐色，多隔，简单分枝，直径2.0～3.4μm；分生孢子梗褐色，单生，与菌丝分化不明显；分生孢子链生，浅黄褐色，倒棒状，表面光滑，单细胞或6～9个细胞，18.5～60.5(-95)×6.4～8.6(-18.7)μm，喙柱状。该菌株的ITS的Genbank登录号为GU357631，18S rRNA的Genbank登录号GU357630。 

一种利用保藏号为CGMCC.NO.1824的莲子草假隔链格孢(Nimbya alternantherae)sf 193菌株的分生孢子的制备方法，其特征在于：将莲子草假链格孢菌的保藏菌种sf 193移植于试管PDA斜面培养基中进行活化，将活化后的菌株移入PDA培养基平板上，28℃培养5～7天，用灭菌打孔器在菌落边缘取直径3mm的菌饼，移入到马铃薯葡萄糖(PD)液体培养基中，每100ml液体培养基中接入3块菌饼，置于28℃、150r/min条件下振荡培养3天，用电动搅拌器(Waring Blender 8011S)搅拌1min，转速为3000r/min，将搅拌的菌丝液稀释涂布到产孢培养基上，28℃培养48h后置于荧光灯下照射，然后放置于黑暗、低温的培养箱中培养。产孢后每个平板加入无菌水，用毛笔涮轻轻洗落孢子，获得含分生孢子和少量菌丝的液体菌剂。 

在上述的真菌孢子菌剂的制备方法中：所述的PDA培养基的配方为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉15g，pH6.8～7.2，水1000ml；所述的PD液体培养基配方为马铃薯200g，葡萄糖20g，pH6.8～7.2，水1000ml；所述的CSNA培养基的配方为：胡萝卜800g，磷酸二氢钾1g，硝酸钾1g，硫酸镁0.5g，氯化钾0.5g，葡萄糖0.2g，蔗糖0.2g，1N·NaOH 0.6ml，琼脂粉15g，加去离子水至1000mL。其中：所述PDA培养基是这样配制的：称取去皮马铃薯200g，放入1000ml水中，煮沸后温火煮20min，用双层纱布过滤获得马铃薯汁液，分别加入蔗糖20g和琼脂粉15g，加热至琼脂溶化，补足体积至1000ml，调整pH至6.8～7.2，适当冷却后封装到试管和三角瓶中，试管规格为15×150(ml/mm)，试管中的装量为4.0ml，三角瓶中装量为1000ml的三角瓶装培养液400ml，用塞子塞好试管口和三角瓶口，121℃湿热灭菌30min，趁热取出试管摆好斜面至冷却后备用；所述的PD液体培养基是上述PDA培养基中无琼脂粉，制备方法相同；所述CSNA培养基是这样配制的：称取胡萝卜800g，放入1000ml水中，煮沸后温火煮20min，用双层纱布过滤获得胡萝卜汁液，分别加入蔗糖20g和琼脂粉15g，加热至琼脂溶化，适当冷却后分别加入磷酸二氢钾、硝酸钾、硫酸镁、氯化钾、葡萄糖、蔗糖、1N·NaOH，补足体积至1000ml后封装，三角瓶中装量为1000ml的三角瓶装培养液400ml，用双层玻璃纸封好三角瓶口，121℃湿热灭菌30min，待培养基冷却至40～50℃时倒入直径为160mm无菌的玻璃培养皿中，冷却后作为产孢培养基备用。 

在所述的真菌孢子菌剂的制备方法中：搅拌后获得的菌丝液稀释倍数为10倍，涂布至产孢培养基上的菌丝液用量为500μl，荧光灯照度为200lux左右，产孢培养温度为25℃，荧光灯照射时间为24h，黑暗 培养温度为20℃、时间为16h。 

在所述的真菌孢子菌剂的制备方法中：分生孢子的收集方法为，取50ml无菌水，加到产孢的CSNA平极上，用无菌的毛笔涮轻轻洗落孢子，收集的孢子液用血球计数板记数，获得浓度为10⁶孢子/毫升和少量菌丝的液体菌剂。 

在上述的真菌孢子菌剂的制备方法中，液体菌剂中加入防腐防霉剂和助剂，所述的防腐防霉剂为双乙酸钠，防腐剂的用量为0.2～0.4％，所述的助剂为土温80，助剂的用量为0.1～0.5％。 

一种上述的真菌孢子菌剂的应用，其特征在于：在适合喷雾的环境条件下将所述的真菌孢子菌剂稀释后均匀地喷雾在空心莲子草叶面，每平方米喷雾用量为稀释后的菌液50ml。 

在真菌孢子菌剂的应用中：将所述的将真菌孢子菌剂稀释是指：将真菌孢子菌剂按1∶9稀释，即孢子浓度为10⁵孢子/毫升。所述适合喷雾的环境条件是指：喷雾环境条件应为高温少雨天气，日喷雾时间为15～17点。 

本发明的优点在于：莲子草假隔链格孢(Nimbya alternantherae)sf193孢子菌剂有效成分可定量、稳定性好、抗逆性强、货架期长且对空心莲子草致病性强等方面的优势，通过研究该菌株孢子的制备方法，可获得高效、规模化生产该菌株分生孢子的培养基及其生产技术；同时该菌株制备的孢子菌剂对不同生长季节的空心莲子草均有良好的防除效果；对人畜安全，对环境没有污染，对绝大多数同期生长的周边植物的止常生长没有影响。 

具体实施方式

实施例1： 

莲子草假隔链格孢sf 193菌株及其鉴定 

莲子草假隔链格孢(Nimbya alternantherae)sf 193，该菌株的基本特征是：将菌落在马铃薯琼脂培养基上，25℃10天，直径达77～78mm，灰褐色，絮状。培养基内菌丝黄褐色；菌落反面黄褐色；菌丝无色至浅褐色，多隔，简单分枝，直径2.0～3.4μm；分生孢子梗褐色，单生，与菌丝分化不明显；分生孢子链生，浅黄褐色，倒棒状，表面光滑，单细胞或6～9个细胞，18.5～60.5(-95)×6.4～8.6(-18.7)μm，喙柱状。 

该菌株的ITS序列大小为550bp，与莲子草假隔链格孢的ITS序列同源性为99％，其Genbank的登陆号为GU357631，18S rRNA序列大小为1760bp，其链格孢同源性最高，其Genbank的登陆号GU357630。结合中国科学院微生物研究所的鉴定，该菌株属于假格孢属(Nimbya)，分类命名为莲子草假格孢(Nimbyaalternantherae)。 

该菌株由江苏省农业科学院采用斜面法(短期)和冷冻干燥法(长期)保藏菌种，为进一步研究提供保藏菌种。 

该菌株己于2006年09月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)， 保藏单位地址为北京市海淀区中关村北一条13号，保藏号为CGMCC.NO.1824，分类命名为莲子草假格孢Nimbya alternantherae。

该菌株已于2010年2月3日获得国家发明专利证书，发明名称为一种莲子草假格孢菌株及其生防制剂的制备方法和应用，专利号为ZL 200710019832.8。专利权人为江苏省农业科学院。 

实施例2： 

莲子草假隔链格孢sf 193分生孢子菌剂在配制过程中涉及的各种培养基的配制 

a、试管PDA斜面、培养皿PDA平板培养基的配制： 

称取去皮马铃薯200g，加入1000ml水中，煮沸后温火煮20min，用双层纱布过滤获得马铃薯汁液，分别加入蔗糖20g和琼脂粉15g，加热至琼脂溶化，补足体积至1000ml，调整pH至6.8～7.2，适当冷却后封装到试管和三角瓶中，试管规格为15×150(ml/mm)，试管中的装量为4.0ml，三角瓶中装量为1000ml的三角瓶装培养液400ml，用塞子塞好试管口和三角瓶口，121℃湿热灭菌30min，趁热取出试管摆好斜面至冷却后备用；适当冷却三角瓶中的培养基，倒入直径为90mm的玻璃培养皿中，每平皿约20ml。 

b、CSNA培养基的配制： 

称取胡萝卜800g，放入1000ml水中，煮沸后温火煮20min，用双层纱布过滤获得胡萝卜汁液，分别加入蔗糖20g和琼脂粉15g，加热至琼脂溶化，适当冷却后分别加入磷酸二氢钾、硝酸钾、硫酸镁、氯化钾、葡萄糖、蔗糖、1N-NaOH，补足体积至1000ml后封装，三角瓶中装量为1000ml的三角瓶装培养液400ml，用双层玻璃纸封好三角瓶口，121℃湿热灭菌30min，待培养基冷却至40～50℃时倒入直径为160mm无菌的玻璃培养皿中，每平皿约40ml，冷却后作为产孢培养基备用。 

实施例3： 

莲子草假隔链格孢sf 193菌株分生孢子菌剂(下称：sf 193孢子菌剂)的制备与使用 

本发明采用的莲子草假隔链格孢sf 193菌株是由江苏省农业科学院利用斜面法(短期)保藏的菌种。 

(1)菌种活化： 

在斜面保藏的菌种中挑取一块菌落移植于PDA平板上，在28℃条件下培养5-7天后备用。 

(2)产孢接种体的制备： 

用直径为3mm的灭菌打孔器在PDA平板上的菌落边缘打孔，取直径3mm的菌饼移入至PD培养液中，每个装有100ml液体培养基的250ml的三角瓶接入3块菌饼，置于28℃、150r/min条件下振荡培养3天， 用电动搅拌器(Waring Blender 8011S)搅拌1min，转速为3000r/min，获得产孢接种体。 

(3)产孢培养： 

将搅拌的菌丝液稀释10倍后，均匀地涂布到CSNA培养基上，28℃培养48h，用照度计将荧光灯照度调节至200lux左右，然后将涂有菌丝液的CSNA平板置于荧光灯下照射24h，产孢培养温度为25℃，之后取出CSNA平板放置于黑暗、低温的培养箱中培养，黑暗培养温度为20℃、时间为16h。 

(4)分生孢子的收集： 

取50ml无菌水，加到产孢的CSNA平板上，用无菌的毛笔涮轻轻洗落孢子，收集的孢子液用血球计数板记数，获得浓度为10⁶孢子/毫升和少量菌丝的液体菌剂。 

(5)分生孢子菌剂的制备： 

液体菌剂中加入防腐防霉剂和助剂，所述的防腐防霉剂为双乙酸钠，防腐剂的用量为0.2～0.4％，所述的助剂为土温80，助剂的用量为0.1～0.5％。 

(6)sf 193孢子菌剂的使用： 

将sf 193真菌孢子菌剂按10稀释，即孢子浓度为10⁵孢子/毫升，在高温少雨的季节，日喷雾时间为15～17点均匀地喷雾在空心莲子草叶面，每平方米喷雾用量为稀释后的菌液50ml。 

实施例4： 

莲子草假隔链格孢sf 193孢子菌剂田间病情严重度分级及病情指数计算 

(1)田间病情严重度分级及致病症状描述 

表1病情严重度分级及其症状描述 

(2)病情指数计算 

田间防控效果采用病情指数计算。当严重度用分级代表值表示时，病情指数计算按公式： 

$\mathrm{DI}=(\underset{i=0}{\overset{i\max }{\mathrm{\Σ}}}{n}_i\·i/N\·i_{\max })\×100$

DI：病情指数 

i：病害分级标准各级级值 

n_i：植株发病为i级的株数 

N：调查植株总数 

i_max：植株发病最高级值 

实施例5： 

荧光灯照射时间和照射后不同光条件对莲子草假隔链格孢sf 193菌株产孢量的影响 

用无菌打孔器取PDA平板上菌落边缘直径为3mm的菌饼3块，等边接入距CSNA平板(直径90mm)中心25mm处。先将接有菌饼的CSNA平板放置于28℃的培养箱中分别培养72、66、60、48、24、12、0、0和0h，对应的照荧光灯照射时间分别为0、6、12、24、48、60、72、96和120h，将不同处理依次从培养箱中取出并放置于照度为200lux左右的荧光等下照射，每个处理设3～5次重复，照射后的CSNA平板分别在白炽灯、荧光灯和黑暗条件下继续培养，培养至菌落上出现黑色的孢子层时，每个产孢平板加10ml无菌水，用毛笔涮轻轻洗落，用血球计数板记数孢子量。 

表2莲子草假隔链格孢sf 193菌株在不同荧光灯照射时间和照射后光照条件下的产孢量 

注：同列数据后不同小写字母表示差异显著(P＜0.05) 

荧光灯照射时间和照射后在3种不同光条件下继续培养对莲子草假隔链格孢sf 193产孢具有显著的影响。从表2的试验结果可以看出，不同荧光灯照射时间获得产孢量之间具有显著性差异(P＜0.05)，随着荧光灯照射时间的增加，产孢量逐渐提高，照射24h后达到最大产孢量，之后则显著下降；而菌株在荧光灯 照射后继续在白炽灯、荧光灯和黑暗条件继续培养对sf 193产孢量影响显著，其中黑暗条件下获得的产孢量最大，其次为白炽灯和荧光灯。综上所述，莲子草假隔链格孢sf 193菌株在荧光灯照射24h后在黑暗继续培养下获得的产孢量最大。 

实施例6： 

荧光灯照射后不同暗培养温度对莲子草假隔链格孢sf 193菌株产孢量的影响 

先将接有莲子草假隔链格孢sf 193菌饼的CSNA平板放置于28℃的培养箱中培养48h，然后在照度为200lux左右的荧光灯下照射24h，之后将产孢平板取出，分别置于15、20、22.5、25、27.5、30和35℃的培养箱中进行黑暗培养，每个处理设3～5次重复，培养至菌落上出现黑色的孢子层时洗落孢子，用血球计数板记数孢子量。 

表3莲子草假隔链格孢sf 193菌株在荧光照射后不同暗培养温度条件下的产孢量 

注：同行数据后不同小写字母表示差异显著(P＜0.05) 

荧光灯照射24h后，将CSNA平板放入不同温度的培养箱中进行黑暗培养，试验结果表明(表3)，经不同温度暗培养后，sf 193菌株产孢量具有显著差异。其中20℃时的产孢量最大，其次为22.5℃利25℃，低于20℃或高于25℃产孢量均显著下降，高于30℃时产孢量微弱或无孢子产生。研究结果表明，低温培养有利于sf 193产生分生孢子，而高温则有利于菌丝生长。 

实施例7： 

荧光灯照射后不同暗培养时间对莲子草假隔链格孢sf 193菌株产孢量的影响 

将接有莲子草假隔链格孢sf 193菌饼的CSNA平板放置于28℃的培养箱中培养48h，然后在照度为200lux左右的荧光灯下照射24h，之后取出产孢平板，置于20℃的培养箱进行黑暗培养，分别在黑暗培养0、1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24h后取出产孢平板，对照为同样条件下荧光灯照射的产孢平板，每个处理设3～5次重复，洗落孢子，用血球计数板记数孢子量。 

从表4可以看出，随着黑暗培养时间的延长，sf 193产孢量逐渐升高，在暗培养6h之前产孢量处于低水平，8h时产孢量迅速上升，16h时产孢量达到最大值，之后产孢量则显著下降，对照在24h内的产孢量微弱或无孢子产生。由此可见，黑暗培养时间是影响sf 193产孢量一个重要的因子。 

表4莲子草假隔链格孢sf 193菌株在荧光照射后不同暗培养时间条件下的产孢量 

注：同列数据后不同小写字母表示差异显著(P＜005) 

实施例8： 

莲子草假隔链格孢(Nimbya alternantherae)sf 193菌丝液不同稀释浓度的产孢量 

将28℃、150r/min条件下振荡培养3天的菌丝液搅拌1min，将搅拌后的菌丝液按照0、10¹、10²、10³、10⁴和10⁵倍数稀释，并均匀地涂布到CSNA平板上，28℃分别培养48、24和0h后放置在荧光灯照度为200lux左右下培养24、48和72h，产孢培养温度为25℃，之后取出CSNA平板放置于20℃、黑暗条件下培养16h，对照为接3块菌饼的CSNA平板，每个处理设3～5次重复，洗落孢子，用血球计数板记数孢子量。 

表5莲子草假隔链格孢sf 193菌丝液在不同稀释浓度的产孢量 

注：同列数据后不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)，同行数据后括号内不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)。 

由表5可以看出，通过将莲子草假隔链格孢sf 193菌丝液稀释涂平板的方法获得的产孢量比对照显著 提高，达到了10⁶数量级。其中菌丝液稀释10倍在荧光灯照射24h时获得产孢量最高，其次为10²，之后随着稀释倍数的增大产孢量显著下降，10⁵平板上孢子数为0。研究结果为田间喷雾提供了足够的孢子量。 

实施例9： 

日喷雾时间对莲子草假隔链格孢(Nimbya alternantherae)sf 193孢子菌剂防效的影响 

通过将稀释10倍的菌丝液涂平板获得的分生孢子液10倍稀释，即孢子浓度为10⁵孢子/毫升。分别在空心莲子草生长茂盛的区域划分若干试验小区，小区面积为4m²，并分别于7、9、11、13、15、17和19时对小区内的空心莲子草进行喷雾，每小区喷雾量为200ml孢子菌剂，每个处理设3次重复，对照为清水喷雾。喷雾5～7天后根据田间病情严重度分级表(表1)调查病级，计算病情指数。 

表6日喷雾时间对莲子草假隔链格孢sf 193孢子菌剂的防效影响 

注：同行数据后不同小写字母表示差异显著(P＜0.05) 

从表6可以看出，不同日喷雾时间对莲子草假隔链格孢sf 193孢子菌剂的防效有显著的影响。7～13点喷雾对空心莲子草的防效没有显著差异，15点时的病情指数最高，达到了理想的防控效果，其次为17点喷雾的防效，其与15点的病情指数没有显著差异。可见，莲子草假隔链格孢sf 193孢子菌剂田间使用的合理时间是15～17点。这种结果可能是日温、湿度动态变化引起，7～13点的温度相对较低，但随着温度逐渐升高，叶表蒸腾作用增强，接种孢子液的叶片经过高温后致使叶面的湿度现在降低，对孢子的附着和萌发产生不利影响，而15点后温度呈下降趋势，叶表蒸腾作用显著降低，同时接种体为孢子液，保证了一定的湿度，有利于sf 193孢子的附着、萌发与侵染。因此，15～17点喷雾的防效比上午的防效高。 

实施例10： 

莲子草假隔链格孢sf 193孢子菌剂随喷雾季节变化对空心莲子草的防除效果 

本试验分别在2011年和2012年的5月份至9月份进行，2011年在南京市进行试验，喷雾日期为5月27日、6月8日、6月23日、7月7日、7月22日、8月1日、8月15日、8月26日、9月5日和9月21日；2012年在南京溧水县进行试验，喷雾日期为5月25日、6月9日、6月25日、7月8日、7月22日、8月4日、8月15日、8月29日、9月6日和9月22日。喷雾之前在空心莲子草生长茂盛的区域划分试验小区，小区面积为4m²，每小区喷雾量为200ml孢子菌剂，每个处理设3次重复，对照为清水喷雾，喷雾时间为15点左右。喷雾5～7天后根据田间病情严重度分级表(表1)调查病级，计算病情指数。 

表7不同季节喷雾sf 193孢子菌剂对空心莲子草的防除效果 

注：同列数据后不同小写字母表示差异显著(P＜0.05) 

从表7的田间试验结果可以看出，不同季节喷雾sf 193孢子菌剂对空心莲子草的防除效果具有显著差异。在连续两年的田间试验中，sf 193孢子菌剂对空心莲子草的最高病情指数均出现在7月22日，最低病情指数均出现在5月底和9月底，通过气象资料可以发现，这两年试验中的7月22日最低和最高温度最高且无降雨，5月底和9月底最低和最高温度最低；结合喷雾当日的气象资料可以看出，sf 193孢子菌剂的防效与温度密切相关，温度升高其防效显著提高，温度降低防效显著降低。另外，2012年相同时期的温度比2011年的高，其sf 193孢子菌剂对空心莲子草的防效也高于2011年相同时期的防效。可见，温度可能是影响sf 193孢子菌剂防效的关键因子之一。一定的湿度有利孢子的附着和萌发，本试验的接种体为孢子液，因此保证了一定的湿度，有利于防效。 

上述各实施例不是对本发明的具体限制。具体实施时，莲子草假链格孢菌(Nimbya alternantherae)sf193孢子菌剂中还应该加入防腐防霉剂和助剂，所述的防腐防霉剂为双乙酸钠，防腐剂的用量为0.2～0.4％，所述的助剂为土温80，助剂的用量为0.1～0.5％。 

Claims (10)

1.一种对空心莲子草具有强致病力的莲子草假隔链格孢(Nimbya alternantherae(Holcomb &Antonopoulos)Simmons & Alcorn)sf 193菌株，其特征在于：保藏号CGMCC.NO.1824的菌株，菌落在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上，25℃培养10天，直径达77～78mm，灰褐色，絮状；培养基内菌丝黄褐色；菌落反面黄褐色；菌丝无色至浅褐色，多隔，简单分枝，直径2.0～3.4μm；分生孢子梗褐色，单生，与菌丝分化不明显；分生孢子链生，浅黄褐色，倒棒状，表面光滑，单细胞或6～9个细胞，18.5～60.5(-95)×6.4～8.6(-18.7)μm，喙柱状；该菌株的ITS序列的Genbank登陆号为GU357631，18S rRNA序列的Genbank登陆号GU357630。

2.一种利用保藏号为CGMCC.NO.1824的莲子草假隔链格孢(Nimbya alternantherae)sf 193菌株的孢子菌剂的制备方法，其特征在于：将莲子草假链格孢菌的保藏菌种sf 193移植于试管PDA斜面培养基中进行活化，将活化后的菌株移入PDA培养基平板上，28℃培养5～7天，用灭菌打孔器在菌落边缘取直径3mm的菌饼，移入到马铃薯葡萄糖(PD)液体培养基中，每100ml液体培养基中接入3块菌饼，置于28℃、150r/min条件下振荡培养3天，用电动搅拌器搅拌1min，将搅拌的菌丝液稀释涂布到产孢培养基上，28℃培养48h后置于荧光灯下照射，然后放置于黑暗、低温的培养箱中培养，产孢后收集孢子，获得含分生孢子和少量菌丝的液体菌剂。

3.根据权利要求2所述的真菌孢子菌剂的制备方法，其特征在于：所述的PDA培养基的配方为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉15g，pH6.8～7.2，水1000ml；所述的产孢培养基(CSNA)的配方为：胡萝卜800g，磷酸二氢钾1g，硝酸钾1g，硫酸镁0.5g，氯化钾0.5g，葡萄糖0.2g，蔗糖0.2g，1N·NaOH 0.6ml，琼脂粉15g，加去离子水至1000mL。

4.根据权利要求3所述的真菌孢子菌剂的制备方法，其特征在于：所述PDA培养基是这样配制的：称取去皮马铃薯200g，放入1000ml水中，煮沸后温火煮20min，用双层纱布过滤获得马铃薯汁液，分别加入蔗糖20g和琼脂粉15g，加热至琼脂溶化，补足体积至1000ml，调整pH至6.8～7.2，适当冷却后封装到试管和三角瓶中，试管规格为15×150(ml/mm)，试管中的装量为4.0ml，三角瓶中装量为1000ml的三角瓶装培养液400ml，用塞子塞好试管口和三角瓶口，121℃湿热灭菌30min，趁热取出试管摆好斜面至冷却后备用；所述的PD液体培养基是上述PDA培养基中无琼脂粉，制备方法相同；所述产孢培养基(CSNA)是这样配制的：称取胡萝卜800g，放入1000ml水中，煮沸后温火煮20min，用双层纱布过滤获得胡萝卜汁液，分别加入蔗糖20g和琼脂粉15g，加热至琼脂溶化，适当冷却后分别加入磷酸二氢钾、硝酸钾、硫酸镁、氯化钾、葡萄糖、蔗糖、1N·NaOH，补足体积至1000ml后封装，三角瓶中装量为1000ml的三角瓶装培养液400ml，用双层玻璃纸封好三角瓶口，121℃湿热灭菌30min，待培养基冷却至40～50℃时倒入直径为160mm无菌的玻璃培养皿中，冷却后作为产孢培养基备用。

5.根据权利要求2所述的真菌孢子菌剂的制备方法，其特征在于：搅拌后获得的菌丝液稀释倍数为10倍，均匀地涂布至产孢培养基上的菌丝液用量为500μl，荧光灯照度为200lux左右，产孢培养温度为25℃，荧光灯照射时间为24h，黑暗培养温度为20℃、时间为16h。

6.根据权利要求2所述的真菌孢子菌剂的制备方法，其特征在于：分生孢子的收集方法为，取50ml无菌水，加到产孢的CSNA平板上，用无菌的毛笔涮轻轻洗落孢子，收集的孢子液用血球计数板记数，获得浓度为10⁶孢子/毫升和少量菌丝的液体菌剂。

7.根据权利要求2或6所述的真菌孢子菌剂的制备方法，其特征在于：液体菌剂中加入防腐防霉剂和助剂，所述的防腐防霉剂为双乙酸钠，防腐剂的用量为0.2～0.4％，所述的助剂为土温80，助剂的用量为0.1～0.5％。

8.根据权利要求6或7所述真菌孢子菌剂的应用，其特征在于：在适合喷雾的环境条件下将所述的真菌孢子菌剂稀释后均匀地喷雾在空心莲子草叶面，每平方米喷雾用量为稀释后的菌液50ml。

9.根据权利要求8所述的真菌孢子菌剂的应用，其特征在于：将所述的将真菌孢子菌剂稀释是指：将真菌孢子菌剂按1∶9稀释，即孢子浓度为10⁵孢子/毫升。

10.根据权利要求8所述的真菌孢子菌剂的应用，其特征在于：所述适合喷雾的环境条件是指：喷雾环境条件应为高温少雨季节，日喷雾时间为15～17点。