CN114672500A - 一种莲子草假隔链格孢致病基因Unigene0007998及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种莲子草假隔链格孢致病基因Unigene0007998及其应用，属于有害生物治理技术领域。本发明公开一种莲子草假隔链格孢的致病基因Unigene0007998，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述的莲子草假隔链格孢致病基因Unigene0007998编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。本发明实验结果显示：该基因的超表达载体转化至弱致病力菌株中会导致其致病力显著增强，且超表达转化子接种后空心莲子草叶片有明显黄化坏死的现象，可见Unigene0007998基因的超表达转化子能显著防治空心莲子草，为有害生物空心莲子草的治理提供一条安全有效的生物防治途径。

Description

一种莲子草假隔链格孢致病基因Unigene0007998及其应用

技术领域

本发明涉及有害生物治理技术领域，特别是涉及一种莲子草假隔链格孢致病基因Unigene0007998及其应用。

背景技术

空心莲子草(Alternanthera philoxeroides)为水旱两生的多年生宿根草本植物，属苋科，莲子草属，又名革命草、水花生、喜旱莲子草、空心苋，原产于南美洲的巴西、巴拉圭南部和阿根廷东北部的里奥拉普拉塔盆地、巴拉圭和巴拿马河的湿地以及巴西南部沿海地带。目前在中国、美国、印度、印度尼西亚、泰国、缅甸、澳大利亚、新西兰等32个国家造成严重危害，已成为一种世界范围的恶性杂草。。由于空心莲子草传播寄生虫、营养成分低且含有皂甙等有毒物质，猪牛不爱取食，因此不再将其作为饲料利用，导致其外逸为恶性杂草。空心莲子草由于强大的克隆繁殖能力和超强的适应性，几乎遍及黄河流域以南所有地区，给生物多样性、农业生产和航运业造成了巨大的破坏。

目前空心莲子草的防除方法难以兼顾高效、低耗和环保，因此国内外科学家一直在探索其有效、安全的生物防治途径。莲子草假隔链格孢(N.alternantherae)被公认为是一种潜在的空心莲子草生防真菌，该菌寄主专一性强，除苋科莲子草属的空心莲子草和莲子草外不侵染其他植物。莲子草假隔链格孢产生的2-乙酰基3，4-二羟基-5-甲氧基苯乙酸(Vulculic acid)具有除草活性。Vulculic acid是一种聚酮类化合物，能够引起空心莲子草叶片和根尖细胞质壁分离，质膜消解；叶绿体片层紊乱，膜消解；线粒体膜破裂，内嵴消解；细胞核核膜消解，细胞核变形。Vulculic acid可人工合成，从商业购买的3,4,5-三甲氧基苯乙酸出发，经甲酯化、傅克乙酰化、脱三甲基化、选择性上单甲基以及水解等5步反应，可合成Vulculic acid。但人工合成Vulculic acid，成本高、产率低。

聚酮化合物是一类重要的次生代谢产物，其生物合成过程有一个共同特点，即均产生含有多个酮基的中间产物，聚酮合成酶(Polyketide synthase,PKS)是催化这种中间产物合成的关键酶。近年来科学家们已经对一些PKS基因进行了克隆和功能验证，并成功尝试通过基因工程技术提高聚酮化合物产率。而本发明拟通过选取致病力强弱不同的莲子草假隔链格孢，研究与莲子草假隔链格孢致病力相关的PKS基因，为防治有害生物空心莲子草提供一种新的生物防治手段。

发明内容

本发明的目的是提供一种莲子草假隔链格孢致病基因Unigene0007998及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，该基因的超表达转化子能显著防治空心莲子草，为有害生物空心莲子草的治理提供一条安全有效的生物防治途径。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种莲子草假隔链格孢致病基因Unigene0007998，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供一种上述的莲子草假隔链格孢致病基因Unigene0007998编码的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。

本发明还提供上述的莲子草假隔链格孢致病基因Unigene0007998或上述的蛋白在制备防治空心莲子草制剂中的应用。

进一步地，所述防治空心莲子草制剂包含促进所述的莲子草假隔链格孢致病基因Unigene0007998表达或提高所述的蛋白活力的制剂。

本发明还提供一种上述的莲子草假隔链格孢致病基因Unigene0007998的重组载体，所述重组载体是通过扩增引物扩增所述莲子草假隔链格孢致病基因Unigene0007998后，将其连接插入超表达载体中得到的。

进一步地，所述扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID No.6-7所示。

本发明还提供上述的重组载体在防治空心莲子草或制备防治空心莲子草制剂中的应用。

本发明还提供一种防治空心莲子草的制剂，含有上述的重组载体。

本发明公开了以下技术效果：

本发明选取致病力最强和最弱的莲子草假隔链格孢分别进行转录组测序，通过比较转录组从中鉴定与莲子草假隔链格孢致病力相关的PKS：Unigene0007998，并通过构建该基因的沉默表达载体和超表达载体，对其功能进行验证，实验结果显示：该基因的超表达载体转化至弱致病力菌株中会导致其致病力显著增强，且超表达转化子接种后空心莲子草叶片有明显黄化和坏死的现象；并经盆栽实验验证，Unigene0007998 基因的超表达转化子能显著防治空心莲子草，为有害生物空心莲子草的治理提供一条安全有效的生物防治途径。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为致病力稳定的莲子草假隔链格孢在空心莲子草叶片的致病情况；

图2为莲子草假隔链格孢中的聚酮合成酶表达情况统计结果：

图3为RNAi载体插入的正反片段扩增产物电泳图，其中M：Marker：DL 2000； 1：正向插入片段；2：反向插入片段；

图4为pSlient-1载体示意图；

图5为RNAi载体的PCR验证结果，其中M：Marker DL2000；1-8：pSlient-1载体正向插入转化子；

图6为RNAi载体的PCR验证结果，其中M：Marker DL2000；1-10：pSlient-1载体正向插入基础上反向插入的转化子；

图7为Unigene0007998基因全长扩增产物电泳图，其中Marker：DL8000；1：目的片段；

图8为超表达载体示意图；

图9为超表达载体的PCR验证结果，其中Marker：DL8000；1-18：超表达载体转化子；

图10为RNAi和超表达转化子的致病力测定结果，A为RNAi转化子，B为超表达转化子；

图11为RNAi和超表达转化子的致病力的盆栽测定结果，A为RNAi转化子接种 0天、3天和6天结果，B为超表达转化子接种0天、3天和6天结果，C为对照组接种0天、3天和6天结果。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

本试验从长沙及周边地区分离到85株致病力强弱不同的莲子草假隔链格孢，从中选取致病力最强和最弱的3个菌株分别进行转录组测序，通过比较转录组从中鉴定与莲子草假隔链格孢致病力相关的PKS，并对其功能进行了验证。在此基础上，将该 PKS在莲子草假隔链格孢中超表达，在实验室条件下对其防治空心莲子草的潜力进行了试验。具体方法如下：

1材料与方法

1.1病原菌的采集、分离与鉴定

2020年9月至2020年11月，分别从湖南长沙、株洲、湘潭、浏阳四地采集农田、池塘、沟渠环境下自然感病的空心莲子草叶片、茎秆带回实验室，并按照《植病研究法》中介绍的方法进行病原菌分离(方中达，1979)。28℃培养5天后，挑取小块病组织边缘未污染的菌丝，再次移入PDA平板上培养，编号备用。

将分离获得的菌株分别接种到PDA平板上培养7天后，每个菌株取直径6mm的菌饼采用半叶法，接种于健康的空心莲子草上，对照为琼脂块，重复3组。

半叶法具体接种方法如下：

选取6片大小相近的健康的空心莲子草叶片。取其中3片采取有伤接种，以叶脉为中心用针尖在叶片左右两侧各刺1下，人为制造伤口，然后左边接种琼脂块，右边接种菌饼；另外3片做无伤接种。然后将接种的所有叶片的基部用浸泡过水的棉花包裹(保湿)，放入保鲜盒中，并置于28℃、无光环境的培养箱中，3天后调查发病情况。

提取有致病力的菌株基因组DNA，用真菌鉴定ITS通用引物 (ITS1-TCCGTAGGTGAACCTGCGC和ITS4-TCCTCCGCTTATTGATATGC)扩增，扩增体系见表1。PCR产物送公司测序，测序结果在NCBI进行Blast N，保存ITS比对为N.alternantherae的菌株备用。

表1 PCR反应体系

反应程序：

1.2空心莲子假隔链格孢致病力鉴定

在湖南长沙、株洲、湘潭、浏阳四地采集农田、池塘、沟渠等环境下自然感病的空心莲子草叶片、茎秆上共分离85个真菌菌株，其中莲子草假隔链格孢致病力最强。在ITS鉴定中，有29个菌株被鉴定为莲子草假隔链格孢。对这29株进行复筛，最后确定14个致病力稳定的菌株，编号依次为K1、K3、K4、K5、K6、K9、K10、K13、 K17、K20、K24、K26、K27、K28(见图1)。

1.3致病力强、弱菌株转录组测序

分别选取致病力强的菌株K26、K27、K28和致病力弱的菌株K1、K3、K9进行转录组测序。测序结果拼接出9个聚酮合成酶基因，其表达量如图2所示。其中 Unigene0007998的表达量最高，且在致病力强和致病力弱的菌株之间表达量差异显著，推测Unigene0007998是莲子草假隔链格孢负责合成Vulculic acid的关键聚酮合成酶。

1.4 Unigene0007998基因的功能验证

1.4.1 Unigene0007998RNAi载体的构建

选择Unigene0007998序列(SEQ ID No.1)中一段保守序列设计2对RNAi引物(SEQID No.2；SEQ ID No.3；SEQ ID No.4；SEQ ID No.5。备注：下划线部分为酶切位点，下划线前3个碱基为保护碱基)，核苷酸序列如下：

SEQ ID No.2

CCGCTCGAGTGAAGAAGCTCCCCAAGAAC；

SEQ ID No.3

CCCAAGCTTCATGTCTCGTCGTCTTGAGAAC。

SEQ ID No.4

AAAAGGCCTCATGTCTCGTCGTCTTGAGAAC；

SEQ ID No.5

CGGGGTACCGAGTGAAGAAGCTCCCCAAGAAC。

扩增得到1个正向插入片段和1个反向插入片段(图3)，将2个片段利用酶切连接法先后插入RNAi载体pSlient-1中(图4)，PCR验证正确的克隆，图5为正向插入片段的重组载体克隆，图6为反向插入片段的重组载体克隆，送公司测序进一步验证，测序正确的载体保存用于后继转化。

1.4.2 Unigene0007998超表达载体的构建

根据Unigene0007998 5’和3’序列设计1对扩增该PKS基因全长序列的引物(下划线部分的序列是将基因克隆进超表达载体的同源重组臂)，其核苷酸序列如下：

SEQ ID No.6：

GCAGGAATTCGATATCAAGCTTATGGGCTCAACTCCTCC

SEQ ID No.7：

GTCGACGGTATCGATAAGCTTCTAATCCGAAGAAAAATAGGC

扩增得到Unigene0007998 DNA全长序列(图7)，切胶回收最大的片段(其余片段为非特异扩增)，利用同源重组法将该PKS基因全长插入超表达载体KSTNP(图 8)中，PCR检测阳性克隆(图9)，选3个PCR阳性克隆送公司测序，获得 Unigene0007998的DNA全长(SEQ IDNo.8)，测序结果与Unigene0007998比对，测序确认是全长插入的载体保存用于后继转化。Unigene0007998 SEQ ID No.1序列编码的氨基酸序列如SEQ ID No.9所示。

1.4.3莲子草假隔链格孢原生质体的制备及RNAi载体和超表达载体的转化

(1)莲子草假隔链格孢原生质体的制备及遗传转化：

取PDA平板上生长4-5天的莲子草假隔链格孢菌株菌落边缘的菌饼2块，接种到50mL灭菌YEPD液体培养基中，28℃恒温培养箱中震荡培养2d。2层灭菌擦镜纸过滤，收集菌丝体，并用灭菌的0.7M NaCl清洗菌丝体3-4次。取黄豆大小菌丝团与1％ Kitalase酶解液充分混合(注意，菌丝此时不能成团块，必须尽量均匀悬浮于酶解液中，可颠倒震荡混匀)。28℃，80r/min振荡培养1-1.5小时，取10uL酶解液镜检。镜检观察到菌丝酶解，释放大量原生质体后用2层灭菌的擦镜纸过滤，用无菌的0.7M NaCl洗涤8-10次，每次1mL(注意枪头不要戳破擦镜纸)，收集滤液，5000r/min，室温离心 5min，超净台内弃上清，收集沉淀，用灭菌的200μL STC悬浮原生质体沉淀。取10ul STC 悬浮液镜检，40倍镜头每个视野3-4个原生质体细胞以上可继续进行PEG介导的转化。取200μL原生质体，加入10～15ug质粒，缓慢滴入灭菌的1000μL PTC，轻轻颠倒混匀，冰上孵育10min后继续室温孵育10min。将离心管中全部液体加到6mL灭菌的RM液体中，28℃，80rpm，孵育2-4h后将全部液体加入到100mL灭菌的RM培养基中(含所转化质粒相对应的抗生素)，混匀倒板。28℃培养箱，2-3天可长出转化子，然后在长出转化子的平板上覆盖含抗生素的培养基3次。长出的单菌落挑到新的含抗生素的培养基上，再覆盖3次；抗生素筛选出的转化子提取DNA进行PCR检测。

(2)RNAi和超表达转化子的致病性验证

Unigene0007998基因的RNAi载体和超表达载体分别转化到强致病力菌株K27 和弱致病力菌株K1中，阳性转化子分别采用半叶法接种空心莲子草叶片，观察转化菌株的致病力变化(图10)，结果表明RNAi载体转化至强致病力菌株K27，导致其致病力显著减弱，而超表达转化子转化至弱致病力菌株K1导致其致病力显著增强，且超表达转化子接种后叶片有明显黄化和坏死的现象。在此基础上分别选取致病力显著降低的RNAi载体转化子R24和致病力显著增强的超表达转化子O48分别进行盆栽试验，将3个R24和O48菌株的菌饼分别接种到100mL PD液体培养基中，180rpm， 25℃振荡培养96h后用榨汁机将培养物匀浆，稀释5倍后喷施到空心莲子草上，以未接种的PD培养基稀释5倍为对照，接种后0天、3天和6天分别拍照记录。根据图11A 可知，RNAi载体转化子R24对空心莲子草的致病效果较弱，喷施6天后才出现少量黄化情况；而图11B中喷施超表达转化子O48的第3天就出现明显黄化情况，第6天大部分空心莲子草黄化枯萎；而对照组(图11C)空心莲子草正常生长。可见，超表达转化子对空心莲子草具有显著的防治效果。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 湖南农业大学

<120> 一种莲子草假隔链格孢致病基因Unigene0007998及其应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 6267

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgggctcaa ctcctcccac ggtccttctt tttggggaca ttacagacac atgggttcat 60

ggcatggact atgtctttga ccaggccaca aggacgccat ggctccgata cttcttggaa 120

gacctgtttt ctgccgccaa ggccgagata agaggcatgg aaagcttctt gcaagatagc 180

ttcggggctt gttccaactt ccaagagctc gcccagaaat atcgcaatac gagcgacgag 240

gttggcctgg tccacgcaat gcttctctac acagtgagag cggtcctgct attagaaact 300

gcaaaccgcg agccactgtt gctccaccca ggtgaggacg gccggcccga gacgcacctg 360

gttggcatct ctggcggtct atggaacgcc attgcggtgc cgatctcgac aaactttagc 420

actttgtaca actcctccat cgagaccggt cgggtgtggg tccgactctg gggcctcatc 480

tttgcgcggt caagggccag ggaggacggc ccgggagcct ggggctgggc tgtcttgggt 540

accacggcag atgagctcga aaagatactt gagacgttcc aaaatgccaa gggcgtcccg 600

tcttccaaaa gagccaaggt tggctttgta ggagaccgtt ggaccactat cataggaccg 660

ccttcggttt tggggctcct ttttagccag tgcccagagt tgaagaagct ccccaagaac 720

gagcttgccg gcatccgcgg cttgcagcac acgctcgaag tatccgcggc cgacatagac 780

tacatcatcg ggaactcgac cctcttggaa acgcagcttc gcccgggatt caaagtatgg 840

ggcatgagtg gcgacgacgc aaagcccacc tactccagct ggagggatct gttgagggtt 900

gcggcgttac agacgctatc gcagcgcttg gatcttgtac agatggtggg cgagctcaac 960

gcctatctcg ggacgtgtca gcatgtgcat gtcaagatga tgggccccag cggccacgcg 1020

acgtacattg ttggtgttct caagacgacg agacatgtga cggtcgacga tgagaggcag 1080

tcgtcaagcg agggtaaggg cgagggtgtt cgagaaggcg gcattgccat tgtgggcatg 1140

tcgggcaaag ggcctggcag tgaggatatg gacgagtttt ggaaggtcat cgagacgggc 1200

caagactgcc acgaagagat tcccgccgac cggatggact tggacgagta ctattgtgcc 1260

aaacacagcc caggcaagtg caccatgact tgtagacatg ggtgctttat caaaaacccg 1320

ggccatttcg accccaagtt cttccacatc tcgccgcgcg aggccctgtt gatggaaccc 1380

gcgcaccggc acttcctcat gagcgcgtac gaggccctgg agacggctgg ctactcggcc 1440

ggccacacca ggacaaccga ccccaacaag acggccgtgt tcttcgcgca gagcttcgac 1500

gactggctca aggtcagcca ccacgcgctg gggtgcgatg catacactct gcagagcatc 1560

cagcgcgcct ttggcccggg ccggctcgcc ttccagatga agtgggaggg gccgacgtac 1620

gcgctcgact cggcttgcgc aggctccacg tcggccatcc acctcgcctg catgagtctg 1680

ttatcaaagg acatcgacat ggcggttgcg ggcgccacga ccatcttgtc cgacccgcat 1740

tccttcgtct tcctgagcaa ggctggcgtg ctgtccgaaa caggcaactg taagacgtac 1800

cgggccgacg ccgacggcta ctgccgtgct gacttcagcg gcgcgcttgt cctaaagcgg 1860

ctcgacgacg ccatcgccca caacgacaac atcttggccg tcattgcctc gtcggcgaga 1920

aaccactcgg gcaacgcccc gtccatcacc acgtccgacg ccaatgccca gcaatcactc 1980

ttcagaaagg tcctccgcaa cgcgcgactg cagcccgatg acgtctcgta tattgagatg 2040

cacgggacgg gcacccaggt cggcgacaag gcggagatgg gagcggttgc agacgtcttc 2100

ttgccgagac cgcatgggaa gccgctgaca gtgggtgcca tcaaggcaaa tatcggccac 2160

agcgaagcgg ctgccggatt gtcctcggtg ctcaaaagtg ttctcatgct tcagaagggc 2220

atcatccccc ctcaggccgg catgccacac gccatgaacc cgaacgtgct agagattctg 2280

ggagacaaca gtggcgttgt gattcccaca aaggtaactg agttcaaagc ggccgatggc 2340

aagccgaaac gtattctcat caacaatttt gacgccgcgg gcggcaatgc aagcgttatc 2400

attgaagagt ataagcaaga tgcggctaag attgccagaa aaaaacagcc cgacgcccga 2460

tcaagtcatg tcatcacaat ctcagccagg acgccttcat cgcacctcgc caacatgcgt 2520

cggctcgccg cgtggctccg tgcgaacccc aacgcccgca tccaagacgt agcatactcg 2580

acgacggccc ggagagtaca ccaccccctc aggttcgcgc tcgcggcttc cacgctacaa 2640

gaggccattt ccaagctcga ggcaggcatc cagcgcacaa ccagctcgac caagaaatca 2700

gcagcccctc ccgttgtctt cgtcttcacc ggccagggct cccactacgc gggcatgggc 2760

agcgagctgt atcgcacgag ccccgtcttc cgcaagacgg ctgacctgtg tgcggccatt 2820

tgcacttcct accagttccc gccttttctg gacatcatca ccaccgacgc catcgacatg 2880

tccaccaaga acgctgccca ggtccagctc gccctcgtca cgctgcagat ttccctcacg 2940

gccttctggc gatcctctgc aggcatcgag gccgcaatgg tcatgggaca cagtctgggc 3000

gagtacgctg ccttgcacgc ggcgggagtt ctctcgttga ctgacacgct gtacctcgtc 3060

ggccagcgcg cccgcctgct cctagagcga tgcgagccta actcgtatgc catgctctcg 3120

gtatcggcgt cggcaggagc aattgtgcga gaccacctcg ccgggctcaa ggactcctgt 3180

ggggtggcat gcatcaacag ccctgtcgca accgtcatca gtgggaaggg cgaagacctg 3240

acacgcatcc aaacaaacat gaccacccag gacgccaata cacgcaccaa gatgctacct 3300

atgccgttcg ccttccactc cgctcagatg gacgccatcc tgcccgacta caaggccctc 3360

gccagcggcg tgacctacct gccccccgag atccctgtgg cgtcgacgct gcttgcgtct 3420

gtggtcgatg tgcccggcgt cttcggggaa gattacctgg cgcagcagac gcggcaggcg 3480

gtcaacttcc atggggccct cgacgccgtg aagtcggcgc ttaagaacga cgaacctttc 3540

tggctcgaga tcggtcccgg cccagtatgc acctcgtttg tgcgggctac actctcgccg 3600

ccaaccacca gcatcagcca caccatcgac gcaaatagca gcaactggac gtccgtttcc 3660

aggaccctca cggcggccta cacaagcggc atagatgttg actggctcgc gctgcacagg 3720

ccgtatgaga gcaacctcga gttgttggcg ctcccgacct atgcgtggga tgtcaagaac 3780

tactggatca cgcacactga caagaacagc ggtgaaatgg ttcctgctgc tactgctaat 3840

tcagtttcac ccgagccttt ccttaccacg acggcgcagt accttgtccg caaggccctg 3900

acccctgcgg gccagattca agttactttc cgagccggca tttcggatca tggtttcatg 3960

ggcgtgattg acggtcacag gatgcaacag attgggcttg cttcaggaac tgtcttttgc 4020

gacgccgctg caacggtggc caagtatgcg ctcgagtaca gcggcggcaa gacgggcgtg 4080

acagcctccc acctgacttt ccacgacccc aagctgctcg ccccgctcac cagggacctt 4140

gtcggtatcg acggcgacct ccataccaca gttatcatgg agagcgcgtc cgccgacgtc 4200

atcttggcca cgttcaaggc cacttccaag agcggcgaat cctacgatct cggatcggtg 4260

accgtcaagt atcgcagccc cgacaaggcc caggcggaat tggaccgcgt atctttcttt 4320

atcaaggcga agatggacga ccggatccgg ctttcgaagg agggcagcgg ccaccggatg 4380

ctgcccgacg tcttctttgc gctcttcgcc aatgcagtcg agttctcgcc cgacttccgc 4440

ggcgtccagg aggcgtacgt ggccggcgac taccaagaag ccgccgcgac gatcaaaatc 4500

cggcccgacc cgacgggcac gcggttcacc tggtcgccat actggggcga ggctctgctg 4560

catctggcag gcttcatggt gaacgggaac ccaaacacgc cgcaggaatt gacatatgcc 4620

ctcatgggct acgacagcat cgagcaactg gcccctatcc agcctgacaa ggagtaccta 4680

acatacacgc gcatctcgcg ctgggaaggg accacagcct tctgtgccgc ctatgtcttc 4740

gacccacaga cgtccaggat cgtcatgcag gcccttgacc tacgctacca acagttcaag 4800

cggaccacct ggcgctatat cctcggcaca aagccacacg ctgctgctgc aggacaccaa 4860

gatgcgattc ccaagtcggt ttccttgccc accgccagga aaaccgccat ggtccatgaa 4920

aatctctctg atgctagtat ggccacagtg ccgatgaaac aacagcgggt gagtaaagcg 4980

caagataagg ccaaggaaga ggagactcca agcaagggag aattccaggt tatcctcgac 5040

accttagcca gtgcaaccgg aagcgaccgt tccgagttta ccgacgacac agagatagtc 5100

gagattggcg tggattcaat catggccatc gagatcgttg ccgccgtcaa ggagaagggc 5160

atcaacatgc ccgctacctt tgtctttgag tatcacacaa tcggtgacct ccgtcgcgcg 5220

tttggcggtg gtgtgccgga agacgctgac accaatgata ccagcgcgac agcttccagg 5280

ggtgacgacg atagcttctt gtctgtgact ccagacgacc tctctgtctc cgtcaccccg 5340

gcgtcaagcc tggtccatgt cgagaaggaa gacctgtcga ccctaggacc ggctcctagc 5400

gtcaggatca cactgctgca gggcagcccc gaggccggca gcattccgct gtacctgata 5460

cccgacggga ccggtactgt agcatccttt atccacctgc gacccttcaa gtccaaccag 5520

cctgtctatg gcatcgactc gccctacctc cggtgcccct cacgcatgaa cggcgaagtc 5580

agtatcgagg atgtagctaa gctagtcgtc gacgcgctgg tcaaggcaca ctccaagggt 5640

cccttcatga tcggaggcta ctctgtcggc tgcttcgttg cctttgagat atcgcgcgag 5700

ctggcccgcg ccgggcacac ggtcgaaggc ctccttctaa tcgacatgcc ctgcccgcgg 5760

tcgcgcgcaa tggaccaggg caagctgctc gccgaggccg acgtcagcga ggccgtctta 5820

gagggaatcg tcagccgaga cggacagtgg agttcgttcg agtccagccg cgaccacatg 5880

cgccagttct tcctcgccat gaacaaatac tcaccggcgc caatgacgac ggccgagagg 5940

cccgctaaga cagcagtcat ctgggcggag cgagggttgg tcaaccgcat ggcgaataac 6000

cctacccgga tgcagaagct ggagagccag ggcgtgccta ccaggtcgta tccaggcttc 6060

atggaagatc ctaagctggg tacgtttgcg tgccatgttc cggacaaggg caaggagaac 6120

ctgggcccca atgggtggga aaggtacacg ggaggagacg tcatggccct ttctgttaat 6180

tgtgatcatt ttgagctgcc cataccaggg cacgttcatc ttctccaggc cgaaatggac 6240

aaagccttgg cctatttttc ttcggat 6267

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccgctcgagt gaagaagctc cccaagaac 29

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cccaagcttc atgtctcgtc gtcttgagaa c 31

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aaaaggcctc atgtctcgtc gtcttgagaa c 31

<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cggggtaccg agtgaagaag ctccccaaga ac 32

<210> 6

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gcaggaattc gatatcaagc ttatgggctc aactcctcc 39

<210> 7

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gtcgacggta tcgataagct tctaatccga agaaaaatag gc 42

<210> 8

<211> 6625

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atgggctcaa ctcctcccac ggtccttctt tttggggaca ttacagacac atgggttcat 60

ggcatggact atgtctttga ccaggccaca aggacgccat ggctccgata cttcttggaa 120

gacctgtttt ctgccgccaa ggccgagata agaggcatgg aaagcttctt gcaagatagc 180

ttcggggctt gttccaactt ccaagagctc gcccagaaat atcgcaatac gagcgacgag 240

gttggcctgg tccacgcaat gcttctctac acagtgagag cggtcctgct attagagtgc 300

gtctcctctc ctttcctccc ctccctataa tgccgactct ggctctgctt gcttgatgaa 360

ctgacggttc cgaattgaag aactgcaaac cgcgagccac tgttgctcca cccaggtgag 420

gacggccggc ccgagacgca cctggttggc atctctggcg gtctatggaa cgccattgcg 480

gtgccgatct cgacaaactt tagcactttg tacaactcct ccatcgagac cggtcgggtg 540

tgggtccgac tctggggcct catctttgcg cggtcaaggg ccagggagga cggcccggga 600

gcctggggct gggctgtctt gggtaccacg gcagatgagc tcgaaaagat acttgagacg 660

ttccaaaatg ccaaggtgag taagatcctt ccccacaggg ttatgttagg cgtgtaggca 720

agttttagga cagttgaagg aattctttat cgtgacatac taatctgaga catgcatgat 780

tagggcgtcc cgtcttccaa aagagccaag gttggctttg taggagaccg ttggaccact 840

atcataggac cgccttcggt tttggggctc ctttttagcc agtgcccaga gttgaagaag 900

ctccccaaga acgagcttgc cggcatccgc ggcttgcagc acacgctcga agtatccgcg 960

gccgacatag actacatcat cgggaactcg accctcttgg aaacgcagct tcgcccggga 1020

ttcaaagtat ggggcatgag tggcgacgac gcaaagccca cctactccag ctggagggat 1080

ctgttgaggg ttgcggcgtt acagacgcta tcgcagcgct tggatcttgt acagatggtg 1140

ggcgagctca acgcctatct cgggacgtgt cagcatgtgc atgtcaagat gatgggcccc 1200

agcggccacg cgacgtacat tgttggtgtt ctcaagacga cgagacatgt gacggtcgac 1260

gatgagaggc agtcgtcaag cgagggtaag ggcgagggtg ttcgagaagg cggcattgcc 1320

attgtgggca tgtcgggcaa agggcctggc agtgaggata tggacgagtt ttggaaggtc 1380

atcgagacgg gccaagactg ccacgaagag attcccgccg accggatgga cttggacgag 1440

tactattgtg ccaaacacag cccaggcaag tgcaccatga cttgtagaca tgggtgcttt 1500

atcaaaaacc cgggccattt cgaccccaag ttcttccaca tctcgccgcg cgaggccctg 1560

ttgatggaac ccgcgcaccg gcacttcctc atgagcgcgt acgaggccct ggagacggct 1620

ggctactcgg ccggccacac caggacaacc gaccccaaca agacggccgt gttcttcgcg 1680

cagagcttcg acgactggct caaggtcagc caccacgcgc tggggtgcga tgcatacact 1740

ctgcagagca tccagcgcgc ctttggcccg ggccggctcg ccttccagat gaagtgggag 1800

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tgcatgagtc tgttatcaaa ggacatcgac atggcggttg cgggcgccac gaccatcttg 1920

tccgacccgc attccttcgt cttcctgagc aaggctggcg tgctgtccga aacaggcaac 1980

tgtaagacgt accgggccga cgccgacggc tactgccgtg ctgacttcag cggcgcgctt 2040

gtcctaaagc ggctcgacga cgccatcgcc cacaacgaca acatcttggc cgtcattgcc 2100

tcgtcggcga gaaaccactc gggcaacgcc ccgtccatca ccacgtccga cgccaatgcc 2160

cagcaatcac tcttcagaaa ggtcctccgc aacgcgcgac tgcagcccga tgacgtctcg 2220

tatattgaga tgcacgggac gggcacccag gtcggcgaca aggcggagat gggagcggtt 2280

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attgtcctcg gtgctcaaaa gtgttctcat gcttcagaag ggcatcatcc cccctcaggc 2520

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tgtgattccc acaaaggtaa ctgagttcaa agcggccgat ggcaagccga aacgtattct 2640

catcaacaat tttgacgccg cggtaagttc tctaccctac acatgctgtg ttgtggacaa 2700

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tgaagagtat aagcaagatg cggctaagat tgccagaaaa aaacagcccg acgcccgatc 2820

aagtcatgtc atcacaatct cagccaggac gccttcatcg cacctcgcca acatgcgtcg 2880

gctcgccgcg tggctccgtg cgaaccccaa cgcccgcatc caagacgtag catactcgac 2940

gacggcccgg agagtacacc accccctcag gttcgcgctc gcggcttcca cgctacaaga 3000

ggccatttcc aagctcgagg caggcatcca gcgcacaacc agctcgacca agaaatcagc 3060

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cgagctgtat cgcacgagcc ccgtcttccg caagacggct gacctgtgtg cggccatttg 3180

cacttcctac cagttcccgc cttttctgga catcatcacc accgacgcca tcgacatgtc 3240

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cttctggcga tcctctgcag gcatcgaggc cgcaatggtc atgggacaca gtctgggcga 3360

gtacgctgcc ttgcacgcgg cgggagttct ctcgttgact gacacgctgt acctcgtcgg 3420

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ggtggcatgc atcaacagcc ctgtcgcaac cgtcatcagt gggaagggcg aagacctgac 3600

acgcatccaa acaaacatga ccacccagga cgccaataca cgcaccaaga tgctacctat 3660

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cagcggcgtg acctacctgc cccccgagat ccctgtggcg tcgacgctgc ttgcgtctgt 3780

ggtcgatgtg cccggcgtct tcggggaaga ttacctggcg cagcagacgc ggcaggcggt 3840

caacttccat ggggccctcg acgccgtgaa gtcggcgctt aagaacgacg aacctttctg 3900

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gtatgagagc aacctcgagt tgttggcgct cccgacctat gcgtgggatg tcaagaacta 4140

ctggatcacg cacactgaca agaacagcgg tgaaatggtt cctgctgcta ctgctaattc 4200

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cttggccacg ttcaaggcca cttccaagag cggcgaatcc tacgatctcg gatcggtgac 4620

cgtcaagtat cgcagccccg acaaggccca ggcggaattg gaccgcgtat ctttctttat 4680

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cgtccaggag gcgtacgtgg ccggcgacta ccaagaagcc gccgcgacga tcaaaatccg 4860

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tctggcaggc ttcatggtga acgggaaccc aaacacgccg caggaattga catatgccct 4980

catgggctac gacagcatcg agcaactggc ccctatccag cctgacaagg agtacctaac 5040

atacacgcgc atctcgcgct gggaagggac cacagccttc tgtgccgcct atgtcttcga 5100

cccacagacg tccaggatcg tcatgcaggc ccttgaccta cgctaccaac agttcaagcg 5160

gaccacctgg cgctatatcc tcggcacaaa gccacacgct gctgctgcag gacaccaaga 5220

tgcgattccc aagtcggttt ccttgcccac cgccaggaaa accgccatgg tccatgaaaa 5280

tctctctgat gctagtatgg ccacagtgcc gatgaaacaa cagcgggtga gtaaagcgca 5340

agataaggcc aaggaagagg agactccaag caagggagaa ttccaggtta tcctcgacac 5400

cttagccagt gcaaccggaa gcgaccgttc cgagtttacc gacgacacag agatagtcga 5460

gattggcgtg gattcaatca tggccatcga gatcgttgcc gccgtcaagg agaagggcat 5520

caacatgccc gctacctttg tctttgagta tcacacaatc ggtgacctcc gtcgcgcgtt 5580

tggcggtggt gtgccggaag acgctgacac caatgatacc agcgcgacag cttccagggg 5640

tgacgacgat agcttcttgt ctgtgactcc agacgacctc tctgtctccg tcaccccggc 5700

gtcaagcctg gtccatgtcg agaaggaaga cctgtcgacc ctaggaccgg ctcctagcgt 5760

caggatcaca ctgctgcagg gcagccccga ggccggcagc attccgctgt acctgatacc 5820

cgacgggacc ggtactgtag catcctttat ccacctgcga cccttcaagt ccaaccagcc 5880

tgtctatggc atcgactcgc cctacctccg gtgcccctca cgcatgaacg gcgaagtcag 5940

tatcgaggat gtagctaagc tagtcgtcga cgcgctggtc aaggcacact ccaagggtcc 6000

cttcatgatc ggaggctact ctgtcggctg cttcgttgcc tttgagatat cgcgcgagct 6060

ggcccgcgcc gggcacacgg tcgaaggcct ccttctaatc gacatgccct gcccgcggtc 6120

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gggaatcgtc agccgagacg gacagtggag ttcgttcgag tccagccgcg accacatgcg 6240

ccagttcttc ctcgccatga acaaatactc accggcgcca atgacgacgg ccgagaggcc 6300

cgctaagaca gcagtcatct gggcggagcg agggttggtc aaccgcatgg cgaataaccc 6360

tacccggatg cagaagctgg agagccaggg cgtgcctacc aggtcgtatc caggcttcat 6420

ggaagatcct aagctgggta cgtttgcgtg ccatgttccg gacaagggca aggagaacct 6480

gggccccaat gggtgggaaa ggtacacggg aggagacgtc atggcccttt ctgttaattg 6540

tgatcatttt gagctgccca taccagggca cgttcatctt ctccaggccg aaatggacaa 6600

agccttggcc tatttttctt cggat 6625

<210> 9

<211> 2089

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Met Gly Ser Thr Pro Pro Thr Val Leu Leu Phe Gly Asp Ile Thr Asp

1 5 10 15

Thr Trp Val His Gly Met Asp Tyr Val Phe Asp Gln Ala Thr Arg Thr

20 25 30

Pro Trp Leu Arg Tyr Phe Leu Glu Asp Leu Phe Ser Ala Ala Lys Ala

35 40 45

Glu Ile Arg Gly Met Glu Ser Phe Leu Gln Asp Ser Phe Gly Ala Cys

50 55 60

Ser Asn Phe Gln Glu Leu Ala Gln Lys Tyr Arg Asn Thr Ser Asp Glu

65 70 75 80

Val Gly Leu Val His Ala Met Leu Leu Tyr Thr Val Arg Ala Val Leu

85 90 95

Leu Leu Glu Thr Ala Asn Arg Glu Pro Leu Leu Leu His Pro Gly Glu

100 105 110

Asp Gly Arg Pro Glu Thr His Leu Val Gly Ile Ser Gly Gly Leu Trp

115 120 125

Asn Ala Ile Ala Val Pro Ile Ser Thr Asn Phe Ser Thr Leu Tyr Asn

130 135 140

Ser Ser Ile Glu Thr Gly Arg Val Trp Val Arg Leu Trp Gly Leu Ile

145 150 155 160

Phe Ala Arg Ser Arg Ala Arg Glu Asp Gly Pro Gly Ala Trp Gly Trp

165 170 175

Ala Val Leu Gly Thr Thr Ala Asp Glu Leu Glu Lys Ile Leu Glu Thr

180 185 190

Phe Gln Asn Ala Lys Gly Val Pro Ser Ser Lys Arg Ala Lys Val Gly

195 200 205

Phe Val Gly Asp Arg Trp Thr Thr Ile Ile Gly Pro Pro Ser Val Leu

210 215 220

Gly Leu Leu Phe Ser Gln Cys Pro Glu Leu Lys Lys Leu Pro Lys Asn

225 230 235 240

Glu Leu Ala Gly Ile Arg Gly Leu Gln His Thr Leu Glu Val Ser Ala

245 250 255

Ala Asp Ile Asp Tyr Ile Ile Gly Asn Ser Thr Leu Leu Glu Thr Gln

260 265 270

Leu Arg Pro Gly Phe Lys Val Trp Gly Met Ser Gly Asp Asp Ala Lys

275 280 285

Pro Thr Tyr Ser Ser Trp Arg Asp Leu Leu Arg Val Ala Ala Leu Gln

290 295 300

Thr Leu Ser Gln Arg Leu Asp Leu Val Gln Met Val Gly Glu Leu Asn

305 310 315 320

Ala Tyr Leu Gly Thr Cys Gln His Val His Val Lys Met Met Gly Pro

325 330 335

Ser Gly His Ala Thr Tyr Ile Val Gly Val Leu Lys Thr Thr Arg His

340 345 350

Val Thr Val Asp Asp Glu Arg Gln Ser Ser Ser Glu Gly Lys Gly Glu

355 360 365

Gly Val Arg Glu Gly Gly Ile Ala Ile Val Gly Met Ser Gly Lys Gly

370 375 380

Pro Gly Ser Glu Asp Met Asp Glu Phe Trp Lys Val Ile Glu Thr Gly

385 390 395 400

Gln Asp Cys His Glu Glu Ile Pro Ala Asp Arg Met Asp Leu Asp Glu

405 410 415

Tyr Tyr Cys Ala Lys His Ser Pro Gly Lys Cys Thr Met Thr Cys Arg

420 425 430

His Gly Cys Phe Ile Lys Asn Pro Gly His Phe Asp Pro Lys Phe Phe

435 440 445

His Ile Ser Pro Arg Glu Ala Leu Leu Met Glu Pro Ala His Arg His

450 455 460

Phe Leu Met Ser Ala Tyr Glu Ala Leu Glu Thr Ala Gly Tyr Ser Ala

465 470 475 480

Gly His Thr Arg Thr Thr Asp Pro Asn Lys Thr Ala Val Phe Phe Ala

485 490 495

Gln Ser Phe Asp Asp Trp Leu Lys Val Ser His His Ala Leu Gly Cys

500 505 510

Asp Ala Tyr Thr Leu Gln Ser Ile Gln Arg Ala Phe Gly Pro Gly Arg

515 520 525

Leu Ala Phe Gln Met Lys Trp Glu Gly Pro Thr Tyr Ala Leu Asp Ser

530 535 540

Ala Cys Ala Gly Ser Thr Ser Ala Ile His Leu Ala Cys Met Ser Leu

545 550 555 560

Leu Ser Lys Asp Ile Asp Met Ala Val Ala Gly Ala Thr Thr Ile Leu

565 570 575

Ser Asp Pro His Ser Phe Val Phe Leu Ser Lys Ala Gly Val Leu Ser

580 585 590

Glu Thr Gly Asn Cys Lys Thr Tyr Arg Ala Asp Ala Asp Gly Tyr Cys

595 600 605

Arg Ala Asp Phe Ser Gly Ala Leu Val Leu Lys Arg Leu Asp Asp Ala

610 615 620

Ile Ala His Asn Asp Asn Ile Leu Ala Val Ile Ala Ser Ser Ala Arg

625 630 635 640

Asn His Ser Gly Asn Ala Pro Ser Ile Thr Thr Ser Asp Ala Asn Ala

645 650 655

Gln Gln Ser Leu Phe Arg Lys Val Leu Arg Asn Ala Arg Leu Gln Pro

660 665 670

Asp Asp Val Ser Tyr Ile Glu Met His Gly Thr Gly Thr Gln Val Gly

675 680 685

Asp Lys Ala Glu Met Gly Ala Val Ala Asp Val Phe Leu Pro Arg Pro

690 695 700

His Gly Lys Pro Leu Thr Val Gly Ala Ile Lys Ala Asn Ile Gly His

705 710 715 720

Ser Glu Ala Ala Ala Gly Leu Ser Ser Val Leu Lys Ser Val Leu Met

725 730 735

Leu Gln Lys Gly Ile Ile Pro Pro Gln Ala Gly Met Pro His Ala Met

740 745 750

Asn Pro Asn Val Leu Glu Ile Leu Gly Asp Asn Ser Gly Val Val Ile

755 760 765

Pro Thr Lys Val Thr Glu Phe Lys Ala Ala Asp Gly Lys Pro Lys Arg

770 775 780

Ile Leu Ile Asn Asn Phe Asp Ala Ala Gly Gly Asn Ala Ser Val Ile

785 790 795 800

Ile Glu Glu Tyr Lys Gln Asp Ala Ala Lys Ile Ala Arg Lys Lys Gln

805 810 815

Pro Asp Ala Arg Ser Ser His Val Ile Thr Ile Ser Ala Arg Thr Pro

820 825 830

Ser Ser His Leu Ala Asn Met Arg Arg Leu Ala Ala Trp Leu Arg Ala

835 840 845

Asn Pro Asn Ala Arg Ile Gln Asp Val Ala Tyr Ser Thr Thr Ala Arg

850 855 860

Arg Val His His Pro Leu Arg Phe Ala Leu Ala Ala Ser Thr Leu Gln

865 870 875 880

Glu Ala Ile Ser Lys Leu Glu Ala Gly Ile Gln Arg Thr Thr Ser Ser

885 890 895

Thr Lys Lys Ser Ala Ala Pro Pro Val Val Phe Val Phe Thr Gly Gln

900 905 910

Gly Ser His Tyr Ala Gly Met Gly Ser Glu Leu Tyr Arg Thr Ser Pro

915 920 925

Val Phe Arg Lys Thr Ala Asp Leu Cys Ala Ala Ile Cys Thr Ser Tyr

930 935 940

Gln Phe Pro Pro Phe Leu Asp Ile Ile Thr Thr Asp Ala Ile Asp Met

945 950 955 960

Ser Thr Lys Asn Ala Ala Gln Val Gln Leu Ala Leu Val Thr Leu Gln

965 970 975

Ile Ser Leu Thr Ala Phe Trp Arg Ser Ser Ala Gly Ile Glu Ala Ala

980 985 990

Met Val Met Gly His Ser Leu Gly Glu Tyr Ala Ala Leu His Ala Ala

995 1000 1005

Gly Val Leu Ser Leu Thr Asp Thr Leu Tyr Leu Val Gly Gln Arg Ala

1010 1015 1020

Arg Leu Leu Leu Glu Arg Cys Glu Pro Asn Ser Tyr Ala Met Leu Ser

1025 1030 1035 1040

Val Ser Ala Ser Ala Gly Ala Ile Val Arg Asp His Leu Ala Gly Leu

1045 1050 1055

Lys Asp Ser Cys Gly Val Ala Cys Ile Asn Ser Pro Val Ala Thr Val

1060 1065 1070

Ile Ser Gly Lys Gly Glu Asp Leu Thr Arg Ile Gln Thr Asn Met Thr

1075 1080 1085

Thr Gln Asp Ala Asn Thr Arg Thr Lys Met Leu Pro Met Pro Phe Ala

1090 1095 1100

Phe His Ser Ala Gln Met Asp Ala Ile Leu Pro Asp Tyr Lys Ala Leu

1105 1110 1115 1120

Ala Ser Gly Val Thr Tyr Leu Pro Pro Glu Ile Pro Val Ala Ser Thr

1125 1130 1135

Leu Leu Ala Ser Val Val Asp Val Pro Gly Val Phe Gly Glu Asp Tyr

1140 1145 1150

Leu Ala Gln Gln Thr Arg Gln Ala Val Asn Phe His Gly Ala Leu Asp

1155 1160 1165

Ala Val Lys Ser Ala Leu Lys Asn Asp Glu Pro Phe Trp Leu Glu Ile

1170 1175 1180

Gly Pro Gly Pro Val Cys Thr Ser Phe Val Arg Ala Thr Leu Ser Pro

1185 1190 1195 1200

Pro Thr Thr Ser Ile Ser His Thr Ile Asp Ala Asn Ser Ser Asn Trp

1205 1210 1215

Thr Ser Val Ser Arg Thr Leu Thr Ala Ala Tyr Thr Ser Gly Ile Asp

1220 1225 1230

Val Asp Trp Leu Ala Leu His Arg Pro Tyr Glu Ser Asn Leu Glu Leu

1235 1240 1245

Leu Ala Leu Pro Thr Tyr Ala Trp Asp Val Lys Asn Tyr Trp Ile Thr

1250 1255 1260

His Thr Asp Lys Asn Ser Gly Glu Met Val Pro Ala Ala Thr Ala Asn

1265 1270 1275 1280

Ser Val Ser Pro Glu Pro Phe Leu Thr Thr Thr Ala Gln Tyr Leu Val

1285 1290 1295

Arg Lys Ala Leu Thr Pro Ala Gly Gln Ile Gln Val Thr Phe Arg Ala

1300 1305 1310

Gly Ile Ser Asp His Gly Phe Met Gly Val Ile Asp Gly His Arg Met

1315 1320 1325

Gln Gln Ile Gly Leu Ala Ser Gly Thr Val Phe Cys Asp Ala Ala Ala

1330 1335 1340

Thr Val Ala Lys Tyr Ala Leu Glu Tyr Ser Gly Gly Lys Thr Gly Val

1345 1350 1355 1360

Thr Ala Ser His Leu Thr Phe His Asp Pro Lys Leu Leu Ala Pro Leu

1365 1370 1375

Thr Arg Asp Leu Val Gly Ile Asp Gly Asp Leu His Thr Thr Val Ile

1380 1385 1390

Met Glu Ser Ala Ser Ala Asp Val Ile Leu Ala Thr Phe Lys Ala Thr

1395 1400 1405

Ser Lys Ser Gly Glu Ser Tyr Asp Leu Gly Ser Val Thr Val Lys Tyr

1410 1415 1420

Arg Ser Pro Asp Lys Ala Gln Ala Glu Leu Asp Arg Val Ser Phe Phe

1425 1430 1435 1440

Ile Lys Ala Lys Met Asp Asp Arg Ile Arg Leu Ser Lys Glu Gly Ser

1445 1450 1455

Gly His Arg Met Leu Pro Asp Val Phe Phe Ala Leu Phe Ala Asn Ala

1460 1465 1470

Val Glu Phe Ser Pro Asp Phe Arg Gly Val Gln Glu Ala Tyr Val Ala

1475 1480 1485

Gly Asp Tyr Gln Glu Ala Ala Ala Thr Ile Lys Ile Arg Pro Asp Pro

1490 1495 1500

Thr Gly Thr Arg Phe Thr Trp Ser Pro Tyr Trp Gly Glu Ala Leu Leu

1505 1510 1515 1520

His Leu Ala Gly Phe Met Val Asn Gly Asn Pro Asn Thr Pro Gln Glu

1525 1530 1535

Leu Thr Tyr Ala Leu Met Gly Tyr Asp Ser Ile Glu Gln Leu Ala Pro

1540 1545 1550

Ile Gln Pro Asp Lys Glu Tyr Leu Thr Tyr Thr Arg Ile Ser Arg Trp

1555 1560 1565

Glu Gly Thr Thr Ala Phe Cys Ala Ala Tyr Val Phe Asp Pro Gln Thr

1570 1575 1580

Ser Arg Ile Val Met Gln Ala Leu Asp Leu Arg Tyr Gln Gln Phe Lys

1585 1590 1595 1600

Arg Thr Thr Trp Arg Tyr Ile Leu Gly Thr Lys Pro His Ala Ala Ala

1605 1610 1615

Ala Gly His Gln Asp Ala Ile Pro Lys Ser Val Ser Leu Pro Thr Ala

1620 1625 1630

Arg Lys Thr Ala Met Val His Glu Asn Leu Ser Asp Ala Ser Met Ala

1635 1640 1645

Thr Val Pro Met Lys Gln Gln Arg Val Ser Lys Ala Gln Asp Lys Ala

1650 1655 1660

Lys Glu Glu Glu Thr Pro Ser Lys Gly Glu Phe Gln Val Ile Leu Asp

1665 1670 1675 1680

Thr Leu Ala Ser Ala Thr Gly Ser Asp Arg Ser Glu Phe Thr Asp Asp

1685 1690 1695

Thr Glu Ile Val Glu Ile Gly Val Asp Ser Ile Met Ala Ile Glu Ile

1700 1705 1710

Val Ala Ala Val Lys Glu Lys Gly Ile Asn Met Pro Ala Thr Phe Val

1715 1720 1725

Phe Glu Tyr His Thr Ile Gly Asp Leu Arg Arg Ala Phe Gly Gly Gly

1730 1735 1740

Val Pro Glu Asp Ala Asp Thr Asn Asp Thr Ser Ala Thr Ala Ser Arg

1745 1750 1755 1760

Gly Asp Asp Asp Ser Phe Leu Ser Val Thr Pro Asp Asp Leu Ser Val

1765 1770 1775

Ser Val Thr Pro Ala Ser Ser Leu Val His Val Glu Lys Glu Asp Leu

1780 1785 1790

Ser Thr Leu Gly Pro Ala Pro Ser Val Arg Ile Thr Leu Leu Gln Gly

1795 1800 1805

Ser Pro Glu Ala Gly Ser Ile Pro Leu Tyr Leu Ile Pro Asp Gly Thr

1810 1815 1820

Gly Thr Val Ala Ser Phe Ile His Leu Arg Pro Phe Lys Ser Asn Gln

1825 1830 1835 1840

Pro Val Tyr Gly Ile Asp Ser Pro Tyr Leu Arg Cys Pro Ser Arg Met

1845 1850 1855

Asn Gly Glu Val Ser Ile Glu Asp Val Ala Lys Leu Val Val Asp Ala

1860 1865 1870

Leu Val Lys Ala His Ser Lys Gly Pro Phe Met Ile Gly Gly Tyr Ser

1875 1880 1885

Val Gly Cys Phe Val Ala Phe Glu Ile Ser Arg Glu Leu Ala Arg Ala

1890 1895 1900

Gly His Thr Val Glu Gly Leu Leu Leu Ile Asp Met Pro Cys Pro Arg

1905 1910 1915 1920

Ser Arg Ala Met Asp Gln Gly Lys Leu Leu Ala Glu Ala Asp Val Ser

1925 1930 1935

Glu Ala Val Leu Glu Gly Ile Val Ser Arg Asp Gly Gln Trp Ser Ser

1940 1945 1950

Phe Glu Ser Ser Arg Asp His Met Arg Gln Phe Phe Leu Ala Met Asn

1955 1960 1965

Lys Tyr Ser Pro Ala Pro Met Thr Thr Ala Glu Arg Pro Ala Lys Thr

1970 1975 1980

Ala Val Ile Trp Ala Glu Arg Gly Leu Val Asn Arg Met Ala Asn Asn

1985 1990 1995 2000

Pro Thr Arg Met Gln Lys Leu Glu Ser Gln Gly Val Pro Thr Arg Ser

2005 2010 2015

Tyr Pro Gly Phe Met Glu Asp Pro Lys Leu Gly Thr Phe Ala Cys His

2020 2025 2030

Val Pro Asp Lys Gly Lys Glu Asn Leu Gly Pro Asn Gly Trp Glu Arg

2035 2040 2045

Tyr Thr Gly Gly Asp Val Met Ala Leu Ser Val Asn Cys Asp His Phe

2050 2055 2060

Glu Leu Pro Ile Pro Gly His Val His Leu Leu Gln Ala Glu Met Asp

2065 2070 2075 2080

Lys Ala Leu Ala Tyr Phe Ser Ser Asp

2085

Claims (8)

1.一种莲子草假隔链格孢致病基因Unigene0007998，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

2.一种权利要求1所述的莲子草假隔链格孢致病基因Unigene0007998编码的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。

3.权利要求1所述的莲子草假隔链格孢致病基因Unigene0007998或权利要求2所述的蛋白在制备防治空心莲子草制剂中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述防治空心莲子草制剂包含促进所述的莲子草假隔链格孢致病基因Unigene0007998表达或提高所述的蛋白活力的制剂。

5.一种权利要求1所述的莲子草假隔链格孢致病基因Unigene0007998的重组载体，其特征在于，所述重组载体是通过扩增引物扩增所述莲子草假隔链格孢致病基因Unigene0007998后，将其连接插入超表达载体中得到的。

6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于，所述扩增引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.6-7所示。

7.权利要求5或6所述的重组载体在防治空心莲子草或制备防治空心莲子草制剂中的应用。

8.一种防治空心莲子草的制剂，其特征在于，含有权利要求5或6所述的重组载体。

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