CN114807208B - 蛋白FoAtg27在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用 - Google Patents

蛋白FoAtg27在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种蛋白FoAtg27在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用，属于植物基因工程领域。本发明通过构建基因敲除载体，将其导入Foc4原生质体，获得敲除突变体ΔFoAtg27；通过构建基因回补载体，将其导入敲除突变体原生质体，获得回补突变体ΔFoAtg27‑com。与Foc4相比，ΔFoAtg27产孢量显著降低，对刚果红胁迫的敏感性显著下降；致病性试验表明，FoAtg27的缺失使Foc4的致病力显著降低；将该基因回补后，其产孢量和致病力得到恢复。本发明证实FoAtg27基因是Foc4分生孢子产生和致病性所必需的。我们的研究有助于深入阐明Foc4的致病分子机制，为开发有效杀菌剂提供了靶标基因。

Description

蛋白FoAtg27在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，特别涉及一种香蕉枯萎病菌自噬相关蛋白(Autophagy-related protein 27)FoAtg27在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用。
背景技术
香蕉枯萎病(Fusarium wilt of banana，FWB)，又称为巴拿马病(Panamadisease)或香蕉黄叶病，是由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporumf.sp.cubense，Foc)所引致的一种具有毁灭性的土传病害，严重威胁着全球香蕉产业的发展。Foc可以侵染不同的香蕉品种，据此可将Foc分为1号小种(Foc1)、2号小种(Foc2)和4号小种(Foc4)，其中Foc4侵染能力最强且危害性最大，几乎能侵染所有的香蕉品种。本专利有助于全面了解Foc4效应蛋白的组成与功能，为进一步丰富Foc4的致病分子机理提供理论基础。
FoAtg27(Autophagy-related protein 27)是一个自噬相关蛋白，含有ATG27结构域，Uniprot分析其亚细胞定位高尔基体膜或细胞质膜囊泡上，在镰刀菌中具有高度保守性。目前关于FoAtg27同源蛋白的研究主要酿酒酵母、稻瘟菌以及禾谷镰刀菌中，发现FoAtg27同源蛋白在这三种真菌中表现出了不一样的功能。其中FoAtg27与酿酒酵母Atg27蛋白的同源性只有9.54％，与稻瘟菌MGG_02386编码的蛋白的同源性有39.15％，与禾谷镰刀菌FGSG_01574编码的蛋白的同源性具有71.59％。在禾谷镰刀菌中，FGSG_01574基因与致病力相关。关于FoAtg27在香蕉枯萎病菌中的具体功能尚不清楚。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种蛋白FoAtg27在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用。
本发明的目的是公开一种香蕉枯萎病菌基因FoAtg27及其编码蛋白FoAtg27的新功能。基因FoAtg27为SEQ ID NO：1中第1位至第1642位所示的核苷酸序列，其所编码的蛋白FoAtg27为SEQ ID NO：2所示的蛋白质。本发明通过构建基因敲除载体，将其导入Foc4原生质体；利用PEG介导的同源重组方法将该基因从Foc4中敲除，最终获得敲除突变体ΔFoAtg27；通过构建基因回补载体，将其导入ΔFoAtg27原生质体；利用随机插入的方法将该基因回补到敲除突变体中，最终获得了回补突变体ΔFoAtg27-com。ΔFoAtg27产孢量和致病性显著降低，而ΔFoAtg27-com的产孢量和致病性则恢复到野生型Foc4水平。上述试验证明，FoAtg27基因为Foc4的致病相关基因。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
本发明提供一种蛋白FoAtg27在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用。
进一步的，所述的蛋白FoAtg27在调控香蕉枯萎病菌产孢量中的应用。
进一步的，所述的蛋白FoAtg27在调控香蕉枯萎病菌抗胁迫中的应用。
优选的，所述的胁迫为刚果红胁迫。
本发明提供一种蛋白FoAtg27在防治由香蕉枯萎病菌导致的香蕉枯萎病中的应用，所述的防治是通过阻断或抑制编码蛋白FoAtg27的基因的表达来实现的。
本发明提供一种蛋白FoAtg27作为用于植物病害防治的药物的靶标的应用，所述的植物病害是由Foc4导致的香蕉枯萎病。
本发明再提供一种治疗由香蕉枯萎病菌导致的香蕉枯萎病的方法，包含阻断或抑制香蕉枯萎病菌中编码蛋白FoAtg27的基因的表达(例如利用该基因的反义RNA或siRNA等)。
阻断或抑制香蕉枯萎病菌中编码蛋白FoAtg27的基因的表达的药剂(例如利用该基因的反义RNA或siRNA等)在制备药物中的应用，所述药物用于控制由香蕉枯萎病菌导致的香蕉枯萎病。
一种降低香蕉枯萎病菌致病力的方法，所述方法是通过阻断或抑制编码蛋白FoAtg27的基因的表达来实现的。
其中，所述的蛋白FoAtg27，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，或者是如SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列通过一个或多个氨基酸替换、插入、缺失而获得的仍具有控制香蕉枯萎病菌致病力功能的类似物；
编码蛋白FoAtg27的基因，其核苷酸序列为下列A、B、C之一：
A、编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的DNA序列；
B、如SEQ ID NO：1所示的DNA序列；
C、以上A和B通过碱基插入、缺失、或替换而获得的仍具有控制香蕉枯萎病菌致病力功能的类似物；
进一步的，所述的香蕉枯萎病菌为香蕉枯萎病菌4号生理小种(Foc4)。
含有上述FoAtg27基因的敲除载体、重组菌在上述方面的应用也属于本发明的保护范围。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明提供了有一个香蕉枯萎病菌4号小种(Foc4)自噬相关蛋白FoAtg27(Autophagy-related protein 27)及其编码该蛋白FoAtg27基因的新功能。所述基因FoAtg27为SEQ ID NO：1中第1位至第1642位所示的核苷酸序列，其所编码的蛋白FoAtg27为SEQ ID NO：2所示的蛋白质；FoAtg27蛋白含有已知结构域，Uniprot分析其亚细胞定位高尔基体膜或细胞质膜囊泡上，其在Foc4中的生物学功能并不清楚。将潮霉素磷酸转移酶基因(hph)和荧光蛋白基因(gfp)置换FoAtg27基因，得到Foc4敲除突变体ΔFoAtg27；试验证明，与Foc4相比，ΔFoAtg27产孢量显著降低，对刚果红胁迫的敏感性显著下降；致病性试验表明，FoAtg27的缺失使Foc4的致病力显著降低；将该基因回补后，其产孢量和致病力得到恢复。本发明证实FoAtg27基因是Foc4分生孢子产生和致病性所必需的。我们的研究有助于深入阐明Foc4的致病分子机制，为开发有效杀菌剂提供了靶标基因。
附图说明
图1是香蕉枯萎病菌基因FoAtg27敲除载体的构建示意图。
图2是潮霉素抗性转化子hph基因的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图；其中，M：2000DNA Marker；泳道1：Foc4基因组DNA；泳道2：pCT74质粒；泳道3-8：候选阳性转化子1、5、7、15、22、24。
图3是潮霉素抗性转化子目的基因FoAtg27的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图；其中，M：1000DNA Marker；泳道1：Foc4基因组DNA；泳道2：pCT74质粒；泳道3-8：候选阳性转化子1、5、7、15、22、24。
图4是以hph片段为探针的Foc4敲除转化子的Southern blot分析；其中，泳道1：Foc4；泳道2-5：转化子5、7、15、22。
图5是以FoAtg27片段为探针的Foc4敲除转化子的Southern blot分析；其中，泳道1：Foc4；泳道2-4：转化子7、15、22。
图6是筛选候选回补转化子的琼脂糖凝胶电泳；其中，M：2000DNA Marker；泳道1：Foc4；泳道2：清水；泳道3-7：候选回补转化子1、4、5、8、10。
图7是敲除突变体ΔFoAtg27菌落形态的观察及菌落直径的测定；其中，A：ΔFoAtg27的菌落形态；B：ΔFoAtg27菌落直径统计图；ΔFoAtg27-7-com是指ΔFoAtg27-7-com-1。
图8是敲除突变体ΔFoAtg27的产孢量测定；其中，ΔFoAtg27-7-com是指ΔFoAtg27-7-com-1。
图9是敲除突变体ΔFoAtg27和回补突变体ΔFoAtg27-com对不同胁迫条件的分析；其中，A：在不同胁迫条件下的菌落形态；B：在不同胁迫条件下的菌落生长抑制率；ΔFoAtg27-7-com是指ΔFoAtg27-7-com-1。
图10是敲除突变体ΔFoAtg27和回补突变体ΔFoAtg27-com的致病性分析；其中，ΔFoAtg27-7-com是指ΔFoAtg27-7-com-1。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1
1实验材料
1.1供试菌株及植物
供试菌株为香蕉枯萎病菌4号小种(Fusarium oxysporum f.sp.cubense 4，Foc4)，供试植物为具有4～5片叶的巴西蕉(Cavendish，AAA)。
1.2宿主菌及质粒载体
宿主菌为大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α菌株。克隆载体为pMD18-T vector，基因敲除载体为丝状真菌表达载体pCT74，基因回补载体为pCTZN(由本实验室在pCT74质粒基础上改造得来，即将pCT74上的gfp和hph基因替换成博来霉素(Zeocin)基因)。
2实验方法
2.1 FoAtg27基因上下游同源片段的扩增
香蕉枯萎病菌FoAtg27基因敲除载体的构建如图1所示。分别选取FoAtg27基因的上游和下游长度大小约为1500bp的序列(分别命名为同源臂A片段和同源臂B片段)，并设计引物(表1)。
表1 FoAtg27基因同源臂A片段和B片段的扩增引物
引物名称 引物序列5′-3′ 酶切位点
FoAtg27-AF GGGGTACCTTAAGCCAAAGCCACTAGATCG KpnI
FoAtg27-AR CCGCTCGAGTTCTTAAGATGAAGAATAGCAGACG XhoI
FoAtg27-BF CGGAATTCTCCTGTCGTCTTGGCGGTT EcoRI
FoAtg27-BR GACTAGTCATGGTGGCAACCCCTCGTA SpeI
参照真菌DNA提取试剂盒(Fungal DNA KitD3390)说明书提取Foc4基因组DNA；以Foc4基因组DNA为模板，用引物FoAtg27-AF/AR进行PCR扩增，获得FoAtg27基因的同源臂A片段(FoAtg27-A)；用引物FoAtg27-BF/BR进行PCR扩增，获得FoAtg27基因的同源臂B片段(FoAtg27-B)。
PCR反应体系为：
2×TSINGKE Master Mix 12.5μL
模板DNA 0.5μL
FoAtg27-AF/BF(10μmol/L) 0.5μL
FoAtg27-AR/BR(10μmol/L) 0.5μL
ddH2O 11.0μL
Total 25.0μL
PCR反应条件为：94℃反应5min；94℃反应1min，55℃反应1min，72℃反应1min30S，共30个循环；72℃反应10min。使用PCR纯化试剂盒(PCR Cycle Pure KitD6492)，对PCR扩增产物进行回收。
2.2FoAtg27基因敲除载体的构建
参考pMD18-T Vector(pMD18-T Vector Cloning Kit 6011)试剂盒说明书，将FoAtg27-A和FoAtg27-B分别与pMD18-T Vector载体连接，获得重组质粒pMD18T-FoAtg27-A和pMD18T-FoAtg27-B。具体为：取1μL pMD18-T载体，分别加入4μL上述PCR回收产物(同源臂A片段或同源臂B片段)和5μL solution I，于16℃下连接3～4h。取10μL连接产物加入到100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞中，冰上放置30min；于42℃下水浴热击90s，冰上冷却5min；加入800μL LB液体培养基，于37℃下150rpm培养1h；再于4000rpm离心5min，弃上清，留100μL菌液与沉淀混匀，涂布于LB固体培养基(含50μg/mL Amp)；于37℃下倒置培养8～12h。
挑取具有Amp抗性的阳性转化子，提取重组质粒DNA，并进行测序鉴定。用KpnI和XhoI分别对pMD18T-FoAtg27-A和pCT74载体进行双酶切，回收A片段和pCT74载体。用T4 DNA连接酶将A片段与pCT74连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；获得重组质粒pCT74-FoAtg27-A。按同样程序，用EcoRI和SpeI分别对pMD18T-FoAtg27-B和重组质粒pCT74-FoAtg27-A进行双酶切，回收B片段和重组质粒。用T4 DNA连接酶将B片段与pCT74-FoAtg27-A连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；经酶切鉴定，获得基因敲除载体pCT74-FoAtg27-KO。
2.3FoAtg27回补片段的扩增
选取FoAtg27基因的上游长度为1500bp的启动子序列，下游长度为500bp的终止子序列，并设计引物(表2)。
表2 FoAtg27基因回补片段的扩增引物
引物名称 引物序列5′-3′ 酶切位点
FoAtg27-com-F GCCAATTGTTAAGCCAAAGCCACTAGATCG MfeI
FoAtg27-com-R AAGGAAAAAAGCGGCCGCGACCTGACAAGATAATAGTGGACA NotI
参照真菌DNA提取试剂盒(Fungal DNA KitD3390)说明书，提取Foc4基因组DNA；以该基因组DNA为模板，用引物FoAtg27-com-F/R进行PCR扩增，获得FoAtg27基因的回补片段(FoAtg27-com)。
具体的PCR反应体系为：
模板DNA 1.0μL
FoAtg27-com-F(10μmol/L) 1.0μL
FoAtg27-com-R(10μmol/L) 1.0μL
10×Ex Taq Buffer(Mg2+plus) 5.0μL
dNTPs(2.5mmol/L) 4.0μL
ExTaq(5U/μL) 0.5μL
ddH2O 37.5μL
Total 50.0μL
PCR反应条件为：94℃反应5min；94℃反应1min，55℃反应1min，72℃反应4min，共30个循环；72℃反应10min。用OMEGA Cycle Pure Kit试剂盒，对PCR扩增产物进行清洁回收。
2.4FoAtg27基因回补载体的构建
用MfeI和NotI对FoAtg27-com进行双酶切，用EcoRI和NotI对pCTZN载体进行双酶切，回收FoAtg27-com片段和pCTZN载体。用T4 DNA连接酶将FoAtg27-com片段与pCTZN连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；获得重组质粒pCTZN-FoAtg27-com。经酶切鉴定，获得基因回补载体pCTZN-FoAtg27-com。
2.5Foc4原生质体的制备
将Foc4接种到查氏培养基(FeSO4·7H2O 0.018g，KCl 0.5g，K2HPO4·3H2O1g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaNO3 3g，蔗糖30g，ddH2O定容至1L)中，于28℃下150rpm培养3d，经200目细胞筛过滤后，获得分生孢子液，于4℃下10000×g离心10min，弃上清，获得浓缩的分生孢子液，加入到CM培养基(葡萄糖10.0g，蛋白胨2.0g，水解酪蛋白1.0g，酵母浸粉1.0g，20×硝酸盐50mL，1000×维生素1mL，1000×微量元素1mL，定容至1L，调节pH至6.5，其中，20×硝酸盐、1000×维生素、1000×微量元素的成分在“201710903818.8、一种香蕉枯萎病菌培养基及其应用”中公开)中，使分生孢子液终浓度为1×106个/mL；于28℃下120rpm培养11～12h，用100目细胞筛过滤，并用0.8mol/L NaCl溶液(渗透压稳定剂)冲洗3～5次，获得新鲜菌丝体。按酶液与菌丝比例(体积质量比10：1)，加入适量15g/L崩溃酶酶液，于30℃下120rpm条件下酶解3h，得到原生质体酶解液。于4℃下4000×g离心10min，弃上清。加入1mL预冷的STC溶液(含10mmol/L Tris-Hcl(pH 7.5)，1.2mol/L山梨醇，50mmol/L CaCl2)重悬沉淀；离心，弃上清。再加入10～20mL预冷的STC将沉淀重悬，得到Foc4原生质体悬液，使原生质体终浓度约为1×107个/mL。
香蕉枯萎病菌敲除突变体原生质体，参照上述香蕉枯萎病菌原生质体的制备步骤制备得到。
2.6Foc4敲除突变体原生质体的转化
用SpeI对敲除载体pCT74-FoAtg27-KO进行单酶切，获得敲除载体线性化片段(即A-hph-gfp-B片段)。将200μL Foc4原生质体置于冰上解冻后加入约5μg的A-hph-gfp-B片段，轻弹混合均匀，冰上静置20min；或者，将pCTZN-FoAtg27-com质粒与200μL香蕉枯萎病菌敲除突变体原生质体混匀；逐滴加入1mL PTC(40％PEG-4000，1.2mol/L山梨醇，50mmol/LCaCl2，10mmol/L Tris-HCl，pH7.5)，混匀后冰上放置15min；加入15mL预冷的STC，混匀；于4℃下4000rpm离心15min；去上清，留下5mL混合液，加入3mL PSB再生培养基(马铃薯200.0g，蔗糖273.6g，蒸馏水定容至1L)重悬沉淀，于28℃下100rpm震荡培养16h。于4℃下4000rpm离心15min，去掉5mL上清，加入12mL PSA再生培养基(PSB再生培养基中加入1.5％琼脂粉、150μg/mL潮霉素或200μg/mL博来霉素)，混匀倒板，于28℃黑暗培养2～3d；挑取潮霉素(或博来霉素)抗性转化子，转移到含有150μg/mL潮霉素(或200μg/mL博来霉素)的PDA培养基(含马铃薯200.0g，无水葡萄糖20.0g，琼脂15.0g，蒸馏水定容至1L)，于28℃黑暗培养2～3d，挑取单菌落用于鉴定。
2.7Foc4敲除突变体的PCR验证分析
参照真菌DNA提取试剂盒(Fungal DNA KitD3390)说明书，提取上述潮霉素阳性转化子的基因组DNA，进行PCR验证分析。分别用引物hph-F/R(见表3)进行hph基因片段的PCR扩增；用引物FoAtg27-F/R(见表3)进行FoAtg27基因片段的PCR扩增分析。
表3 FoAtg27敲除突变体PCR验证分析所用引物
引物名称 引物序列5′-3′
hph-F 5′-TGCTGCTCCATACAAGCCAA-3′
hph-R 5′-GACATTGGGGAGTTCAGCGA-3′
FoAtg27-F 5′-CAACACAAATCAAATACAACGGCT-3′
FoAtg27-R 5′-CTTCATATGACGCTAAGCAAACCC-3′
PCR反应体系如下：
模板DNA 0.5μL
FoAtg27-F/hph-F(10μmol/L) 0.5μL
FoAtg27-R/hph-R(10μmol/L) 0.5μL
2×TSINGKE Master Mix 12.5μL
ddH2O 11μL
Total 25.0μL
PCR反应条件为：94℃反应5min；94℃反应1min，55℃反应1min，72℃反应1min(hph)或者2min(FoAtg27)，共30个循环；72℃反应10min，得到PCR扩增产物。
2.8FoAtg27回补突变体的PCR验证分析
参照真菌DNA提取试剂盒(Fungal DNA KitD3390)说明书，提取上述博来霉素阳性转化子的基因组DNA，进行PCR验证分析。用引物FoAtg27 probe-F/R(见表4)进行基因片段FoAtg27的PCR扩增。
表4 FoAtg27回补突变体PCR验证分析所用引物
引物名称 引物序列5′-3′
FoAtg27 probe-F 5′-CAGAACCCTGGCCTTTTCCT-3′
FoAtg27 probe-R 5′-TCAAGCCTAGTCCTCCCGAA-3′
PCR反应体系如下：
模板DNA 0.5μL
FoAtg27 probe-F(10μmol/L) 0.5μL
FoAtg27 probe-R(10μmol/L) 0.5μL
2×TSINGKE Master Mix 12.5μL
ddH2O 11μL
Total 25.0μL
PCR反应条件为：94℃反应5min；94℃反应1min，55℃反应1min，72℃反应1min，共30个循环；72℃反应10min，得到PCR扩增产物。
2.9Foc4敲除突变体的Southern blot分析
Southern Blot检测参考《分子克隆》(第二版)方法，使用Southern blot检测试剂盒进行进行Southern blot杂交。用引物FoAtg27 probe-F/R(见表4)扩增目的基因探针，用hph-F/R(见表3)扩增hph基因探针。
DNA探针的PCR扩增体系如下：
模板DNA 1.0μL
FoAtg27 probe-F/hph-F(20μmol/L) 1.0μL
FoAtg27 probe-R/hph-R(20μmol/L) 1.0μL
10×Ex Taq Buffer(Mg2+plus) 5.0μL
dNTPs(2.5mmol/L) 4.0μL
Ex Taq(5U/μL) 0.5μL
ddH2O 37.5μL
Total 50.0μL
PCR反应条件为：94℃反应5min；94℃反应1min，55℃反应1min，72℃反应1min，共30个循环；72℃反应10min，得到PCR扩增产物。
2.10Foc4敲除突变体ΔFoAtg27和回补突变体ΔFoAtg27-com的表型观察
(1)菌落形态观察及生长速度测定。将Foc4、ΔFoAtg27和ΔFoAtg27-com分别接种于PDA培养基上，于28℃黑暗条件下培养。在5d时采用十字交叉法测量菌落直径，并观察其菌落形态。每个处理设置3个重复。
(2)分生孢子的获得。将香蕉枯萎病菌接种至查氏培养基，于28℃下120rpm培养，3d后统计产孢量。
2.11敲除突变体ΔFoAtg27和回补突变体ΔFoAtg27-com抗胁迫分析
将Foc4、ΔFoAtg27和ΔFoAtg27-com分别接种至不同胁迫培养基(分别含1mol/LNaCl、1mol/L山梨醇、30mmol/L H2O2、0.05％SDS、100μg/mL荧光增白剂(卡尔科弗卢尔荧光增白剂，CFW)和200μg/mL刚果红(CR))中，于28℃下培养5d，以PDA培养基作为空白对照，采用十字交叉法测量菌落直径，计算不同胁迫条件下的菌落生长抑制率，每个处理设置3个重复。
2.12敲除突变体ΔFoAtg27和回补突变体ΔFoAtg27-com的致病性分析取4叶期的巴西蕉，分别用Foc4、ΔFoAtg27和ΔFoAtg27-com的分生孢子(1×105个/mL)悬浮液进行浸根40min，再移栽于营养土中；置于26℃的植物培养室内培养，于光/暗12h/12h交替培养，23d后观察香蕉苗叶片和球茎的发病情况。分别以Foc4野生菌株和无菌水作为阳性和阴性对照。
3结果与分析
3.1香蕉枯萎病菌FoAtg27基因敲除载体的构建
采用PCR扩增方法，以Foc4基因组DNA为模板分别克隆获得FoAtg27基因同源臂A片段和同源臂B片段；分别将其与pMD18-T载体连接，经转化大肠杆菌、Amp抗性筛选、质粒提取与测序鉴定，获得重组质粒pMD18T-FoAtg27-A和pMD18T-FoAtg27-B。将pMD18T-FoAtg27-A与pCT74质粒连接，获得重组质粒pCT74-FoAtg27-A；将其与pMD18T-FoAtg27-B质粒连接，经大肠杆菌转化和酶切鉴定，获得基因敲除载体pCT74-FoAtg27-KO(图1)。
3.2敲除突变体ΔFoAtg27的筛选
3.2.1基因片段hph的PCR验证
利用同源重组方法，将基因敲除载体pCT74-FoAtg27-KO转化香蕉枯萎病菌原生质体，获得了27个潮霉素抗性转化子。经DNA的提取，利用hph基因特异性引物，对27个潮霉素阳性转化子进行了PCR验证分析。结果表明，上述27个转化子均扩增到了hph基因，转化子1、5、7、15、22、24的验证结果如图2所示。
3.2.2基因片段FoAtg27的PCR验证
进一步利用FoAtg27基因特异性引物，对上述PCR扩增到hph基因的27个阳性转化子进行FoAtg27的PCR验证分析。结果表明，在27个转化子中，有6个转化子(转化子1、5、7、15、22、24)没有扩增到FoAtg27基因，进一步说明这6个转化子为阳性转化子(图3)。
3.2.3敲除突变体ΔFoAtg27的Southern blot验证
从扩增到hph基因、同时没有扩增到FoAtg27基因的6个阳性转化子中选择4个阳性转化子进行Southern blot验证。结果表明，以hph为探针进行杂交，4个阳性转化子(转化子5、7、15、22)均有单拷贝条带出现(图4)。从以上已经验证过含有hph基因的4个阳性转化子中，选择3个阳性转化子以FoAtg27基因为探针继续进行Southern blot验证。结果表明，3个转化子(转化子7、15、22)均未有杂交条带(图5)。上述试验进一步证明这3个转化子为阳性转化子。
3.3回补突变体的筛选
采用PCR扩增方法，克隆获得FoAtg27基因回补片段；将其与pCTZN载体连接，经大肠杆菌转化、Amp抗性筛选、质粒提取与测序鉴定，获得重组质粒pCTZN-FoAtg27-com。
利用随机插入的方法，将基因回补载体pCTZN-FoAtg27-com转化敲除突变体ΔFoAtg27(ΔFoAtg27-7)原生质体，获得了16个博来霉素抗性转化子。经香蕉枯萎病菌基因组DNA的提取，利用FoAtg27基因特异性引物，对上述转化子进行了PCR验证(图6)。结果表明，3个转化子(回补转化子1、5、10)可以扩增出目的基因，进一步说明这3个转化子为阳性转化子。
3.4敲除突变体ΔFoAtg27和回补突变体ΔFoAtg27-com的菌落形态和生长速率测定
将Foc4、敲除突变体ΔFoAtg27(ΔFoAtg27-7、ΔFoAtg27-15)和回补突变体ΔFoAtg27-com(ΔFoAtg27-7-com-1)分别接种于PDA培养基中，在接种5d后进行了菌落形态观察及菌落直径测定。结果表明，与Foc4相比，ΔFoAtg27的生长速率无明显变化(图7)。
3.5敲除突变体ΔFoAtg27和回补突变体ΔFoAtg27-com的产孢量分析
将Foc4、敲除突变体ΔFoAtg27(ΔFoAtg27-7、ΔFoAtg27-15)、回补突变体ΔFoAtg27-com(ΔFoAtg27-7-com-1)分别接种于查氏培养基，培养3d后进行产孢量分析。结果表明，敲除突变体ΔFoAtg27的产孢量显著低于其Foc4，而回补突变体ΔFoAtg27-com的产孢量恢复至野生型Foc4水平(图8)。
3.6敲除突变体ΔFoAtg27和回补突变体ΔFoAtg27-com对不同胁迫条件的分析
将Foc4、ΔFoAtg27(ΔFoAtg27-7、ΔFoAtg27-15)和ΔFoAtg27-com(ΔFoAtg27-7-com-1)分别接种在分别含1mol/L NaCl、1mol/L山梨醇、0.05％SDS、30mmol/L H2O2、100μg/mL荧光增白剂(CFW)和200μg/mL刚果红的PDA培养基中，于28℃下培养5d后对其菌落直径进行测定。结果表明，与Foc4相比，ΔFoAtg27对200μg/mL刚果红的敏感性显著降低，对1mol/L NaCl、1mol/L山梨醇、0.05％SDS、30mmol/L H2O2、100μg/mL荧光增白剂(CFW)的敏感性无明显差异(图9)。
3.7敲除突变体ΔFoAtg27和回补突变体ΔFoAtg27-com的致病性分析
利用伤根接种法，将Foc4、ΔFoAtg27(ΔFoAtg27-7)和ΔFoAtg27-com(ΔFoAtg27-7-com-1)分生孢子液分别接种巴西蕉，于23d后进行观察。结果表明，Foc4和ΔFoAtg27-com孢子液接种23d后，巴西蕉苗下部叶片出现黄化，叶片黄化面积约占叶面积的50～60％。纵剖发病巴西蕉苗球茎，可观察到黑褐色病变，褐变面积接近球茎面积的55％；而ΔFoAtg27-7孢子液接种23d后，巴西蕉下部叶片黄化面积约占叶面积的35％。纵剖发病巴西蕉苗，可观察到黑褐色病变，褐变面积约占球茎面积的30％。说明敲除FoAtg27基因后，香蕉枯萎病菌致病力明显下降(图10)。
因此，本发明提供的基因可以用于植物病害防治，特别是由香蕉枯萎病菌所导致的香蕉枯萎病。另，本发明提供的基因可以作为用于植物病害防治的药物的靶标。本领域技术人员可以跟进本说明书的教导和启示，开发用于防治植物病害、特别是香蕉枯萎病的药物。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 蛋白FoAtg27在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1642
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> FoAtg27基因的碱基序列
<220>
<222> (1)..(259)
<223> 非编码区1
<220>
<222> (260)..(524)
<223> 外显子1
<220>
<222> (525)..(574)
<223> 内含子1
<220>
<222> (575)..(1140)
<223> 外显子2
<220>
<222> (1141)..(1642)
<223> 非编码区2
<400> 1
gcttcatatg acgctaagca aacccgcgat agctcaaggc aacgtgacca atccatcaca 60
tcacacagca cagcacagca cagcttgatt gcttgttcta ggcacgcgct cgtagtctat 120
tctatcgagt ctcttcgttc gtttaagctg acacggccct ttctgatact gccacttcat 180
ccgtaatttt atctcgatac tatcgactag cacccgcctc tctatcaaac ttctgcgttc 240
ttctatcaaa gtcttctcga tgcatcggcc ggatctattg gcttttctac tgcctctgct 300
ggcagcccca gcttttgcgg cggaaactct agactgcgga aagattcgcg ctgatggaca 360
tactttcgat ctttctaagc tcggtggacc tcactcggtc gtgacgacgc ggttcaagcc 420
tagtcctccc gaacattata acacaactta tacattagat atctgcaagc ctttgaagaa 480
gaagggtggc aagaaggacg aagaatgtcc aaacggcact cgaggtgtgt acaagatcta 540
caagggccaa ccgagtcctg actaacaaat ccagtttgcg gtattacaca ccttctcaag 600
tctggcgaga aggagacgga tgagattacg aatgtcatcg cgatcgcagg caatctcgaa 660
aacgttggcg gctctcgatt cgatgctaca cccacgcgac tcaagacaag cgactcaact 720
tccgacaagg ataaagaggg cgtgcgacta gtcctcacag gaggcagaga tcctctcaag 780
ggtgacatca agaaaaccga tcaaaaggcc atcatcgaat tcctgtgcga tcctaaaaag 840
gagggaacag agggcgagtg ggttacttcg gaccagtacg agaagcgagc ggacgacgat 900
aagaaggaag gggatggtga tgataaggat gatggcgagt ctatgatcga gcaccagctg 960
aagcatgaca atgcttcgct tgtctgggat agctttgatg ttgaggaaaa ggccagggtt 1020
ctgcgcttga cgtggtacac taagtatgct tgcgaaaagt cagaggacaa cggcggtagt 1080
ggtgatgatg acagctcaag ctcccactgg ggcttcttca cctggttcat cattatgtga 1140
gtacccaatc agcttcatga agatttccta acaaatttag tgctttcttg ggcatcgccg 1200
gctacctcat cttctcatcc tggatcaatt tcacacggta cggcgcacgc ggctgggatc 1260
ttctccccca cagcgacacc atccgcgata ttccttacct actcaaggac tggatccgcc 1320
gtgttctcaa caccgtgcag ggaacaggaa gtcggggagg atacagcgcg gtctaggcgt 1380
ttttgacagc atgtgtatcg ttataggtct gggctgggct gggctgggcc gtgtgaggaa 1440
atggtacggc gctcatgcta gttgtatcta gctggaattg tatacatagg ttgaaattcg 1500
cgggtttcgg ttttcgtatc agtgtttaga tcaagatgct atcaagcagt gttataaact 1560
gactctgact gatgttctat gccagtgttt attgttttgt aggtaataag ttatcattga 1620
actggtggac tgtgagccgt tg 1642
<210> 2
<211> 276
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> FoAtg27蛋白质的氨基酸序列
<400> 2
Met His Arg Pro Asp Leu Leu Ala Phe Leu Leu Pro Leu Leu Ala Ala
1 5 10 15
Pro Ala Phe Ala Ala Glu Thr Leu Asp Cys Gly Lys Ile Arg Ala Asp
20 25 30
Gly His Thr Phe Asp Leu Ser Lys Leu Gly Gly Pro His Ser Val Val
35 40 45
Thr Thr Arg Phe Lys Pro Ser Pro Pro Glu His Tyr Asn Thr Thr Tyr
50 55 60
Thr Leu Asp Ile Cys Lys Pro Leu Lys Lys Lys Gly Gly Lys Lys Asp
65 70 75 80
Glu Glu Cys Pro Asn Gly Thr Arg Val Cys Gly Ile Thr His Leu Leu
85 90 95
Lys Ser Gly Glu Lys Glu Thr Asp Glu Ile Thr Asn Val Ile Ala Ile
100 105 110
Ala Gly Asn Leu Glu Asn Val Gly Gly Ser Arg Phe Asp Ala Thr Pro
115 120 125
Thr Arg Leu Lys Thr Ser Asp Ser Thr Ser Asp Lys Asp Lys Glu Gly
130 135 140
Val Arg Leu Val Leu Thr Gly Gly Arg Asp Pro Leu Lys Gly Asp Ile
145 150 155 160
Lys Lys Thr Asp Gln Lys Ala Ile Ile Glu Phe Leu Cys Asp Pro Lys
165 170 175
Lys Glu Gly Thr Glu Gly Glu Trp Val Thr Ser Asp Gln Tyr Glu Lys
180 185 190
Arg Ala Asp Asp Asp Lys Lys Glu Gly Asp Gly Asp Asp Lys Asp Asp
195 200 205
Gly Glu Ser Met Ile Glu His Gln Leu Lys His Asp Asn Ala Ser Leu
210 215 220
Val Trp Asp Ser Phe Asp Val Glu Glu Lys Ala Arg Val Leu Arg Leu
225 230 235 240
Thr Trp Tyr Thr Lys Tyr Ala Cys Glu Lys Ser Glu Asp Asn Gly Gly
245 250 255
Ser Gly Asp Asp Asp Ser Ser Ser Ser His Trp Gly Phe Phe Thr Trp
260 265 270
Phe Ile Ile Met
275
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> FoAtg27-AF
<400> 3
ggggtacctt aagccaaagc cactagatcg 30
<210> 4
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> FoAtg27-AR
<400> 4
ccgctcgagt tcttaagatg aagaatagca gacg 34
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> FoAtg27-BF
<400> 5
cggaattctc ctgtcgtctt ggcggtt 27
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> FoAtg27-BR
<400> 6
gactagtcat ggtggcaacc cctcgta 27
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> FoAtg27-com-F
<400> 7
gccaattgtt aagccaaagc cactagatcg 30
<210> 8
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> FoAtg27-com-R
<400> 8
aaggaaaaaa gcggccgcga cctgacaaga taatagtgga ca 42
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> hph-F
<400> 9
tgctgctcca tacaagccaa 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> hph-R
<400> 10
gacattgggg agttcagcga 20
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> FoAtg27-F
<400> 11
caacacaaat caaatacaac ggct 24
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> FoAtg27-R
<400> 12
cttcatatga cgctaagcaa accc 24
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> FoAtg27 probe-F
<400> 13
cagaaccctg gccttttcct 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> FoAtg27 probe-R
<400> 14
tcaagcctag tcctcccgaa 20

Claims (6)

1.蛋白FoAtg27在降低香蕉枯萎病菌致病力中的应用，其特征在于：
所述的蛋白FoAtg27的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述应用是通过敲除编码蛋白FoAtg27的基因实现的。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：
所述应用是所述的蛋白FoAtg27在降低香蕉枯萎病菌产孢量中的应用。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：
所述应用是所述的蛋白FoAtg27在降低香蕉枯萎病菌对刚果红敏感性中的应用。
4.根据权利要求1～3任一项所述的应用，其特征在于：
编码蛋白FoAtg27的基因的核苷酸序列为下列A、B之一：
A、编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的DNA序列；
B、如SEQ ID NO：1所示的DNA序列。
5.一种降低香蕉枯萎病菌致病力的方法，其特征在于：所述方法是通过敲除编码权利要求1中所述的蛋白FoAtg27的基因实现的。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：
编码蛋白FoAtg27的基因的核苷酸序列为下列A、B之一：
A、编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的DNA序列；
B、如SEQ ID NO：1所示的DNA序列。
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