CN111534527B

CN111534527B - 基因FoPao在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用

Info

Publication number: CN111534527B
Application number: CN202010315617.8A
Authority: CN
Inventors: 聂燕芳; 李云锋; 颜瑞; 李华平
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2020-04-21
Filing date: 2020-04-21
Publication date: 2022-03-25
Anticipated expiration: 2040-04-21
Also published as: CN111534527A

Abstract

本发明公开一种基因FoPao在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用，属于植物基因工程领域。本发明通过构建基因敲除载体，将其导入香蕉枯萎病菌原生质体；利用同源重组方法将该基因从香蕉枯萎病菌中敲除，获得敲除突变体ΔFoPao；通过构建基因回补载体，将其导入ΔFoPao原生质体；利用随机插入方法，将该基因回补到敲除突变体中，获得回补突变体ΔFoPao‑com。致病性试验表明，基因FoPao的缺失显著增加了香蕉枯萎病菌的毒力；将该基因回补后，回补突变体的毒力与香蕉枯萎病菌野生型一致。本发明证实FoPao与香蕉枯萎病菌的致病性有关。我们的研究有助于深入阐明香蕉枯萎病菌的致病分子机制。

Description

基因FoPao在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，特别涉及一种基因FoPao在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用。

背景技术

香蕉枯萎病，又称为巴拿马病，是由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporumf.sp.cubense,Foc)引起的一种毁灭性的土传维管束病害，被老百姓称为“香蕉癌症”。由于该病蔓延迅速，很难根治，严重影响香蕉产业的发展。

在香蕉枯萎病菌的分泌蛋白质组学研究中，我们鉴定到一个预测的多胺氧化酶(N1-acetylpolyamine oxidase，predicted，PAO)，含有氨基氧化酶(Amino oxidase)结构域。多胺氧化酶是真菌多胺代谢通路中的一个重要酶，可以将乙酰亚精胺氧化成亚精胺，或者将乙酰精胺氧化成精胺；多胺代谢有助于维持生物体内多胺的动态平衡。

目前关于多胺氧化酶的研究主要集中在植物和人类癌症细胞中，在病原真菌中的报道较少。在玉米黑粉菌(Ustilago maydis)中，敲除UmPao基因后，其突变体的致病性下降(Vald′es-Santiago，2010)。而在大豆猝死综合症病原菌(Fusarium virguliforme)中，敲除FvPao基因对其致病性没有明显影响(Jordan等，2018)。在香蕉枯萎病菌中，还没有关于多胺氧化酶相关功能的报道。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种基因FoPao在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用。

本发明公开一种香蕉枯萎病菌致病相关基因FoPao及其编码蛋白PAO的新功能。基因FoPao为SEQ ID NO：1所示的基因序列，其所编码的蛋白PAO为SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。本发明通过构建基因敲除载体，将其导入香蕉枯萎病菌原生质体；利用同源重组方法将该基因从香蕉枯萎病菌中敲除，获得敲除突变体ΔFoPao；通过构建基因回补载体，将其导入ΔFoPao原生质体；利用随机插入方法，将该基因回补到敲除突变体中，获得回补突变体ΔFoPao-com。敲除该基因后，敲除突变体在生长速率、菌丝形态、产孢能力上与香蕉枯萎病菌野生型没有明显差异；在抗高渗胁迫、离子胁迫能力、细胞壁完整性上与香蕉枯萎病菌野生型没有明显差异。致病性测定结果表明，敲除突变体ΔFoPao的致病性显著升高；回补突变体ΔFoPao-com的致病性则恢复到野生型的致病性水平。上述试验证明，香蕉枯萎病菌FoPao基因为香蕉枯萎病菌的致病相关基因。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明提供一种基因FoPao在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用。

本发明提供一种基因FoPao在香蕉抗病品种选育和抗病性鉴定中的应用。

本发明提供一种基因FoPao在筛选和/或鉴定香蕉枯萎病菌拮抗菌中的应用。

一种通过下调FoPao基因提高香蕉枯萎病菌致病力的方法，通过使香蕉枯萎病菌的FoPao基因功能缺失或下调，来提高香蕉枯萎病菌的致病力。

所述的FoPao基因功能下调为通过RNA干涉技术(RNAi)或者基因组编辑技术(CRISPRI-CAS9)来下调香蕉枯萎病菌内的FoPao活性，达到提高致病力的目的。

本发明提供一种基因FoPao在防治由香蕉枯萎病菌导致的香蕉枯萎病中的应用。

本发明提供一种基因FoPao作为用于植物病害防治药物的靶标的应用，所述的植物病害是由香蕉枯萎病菌导致的香蕉枯萎病。

本发明再提供一种治疗由香蕉枯萎病菌导致的香蕉枯萎病的方法，包含促进香蕉枯萎病菌中基因FoPao的表达(例如该基因的促进剂或含有该基因的过表达载体等)。

促进香蕉枯萎病菌中基因FoPao表达的试剂(例如该基因的促进剂或含有该基因的过表达载体等)在制备药物中的应用，所述药物用于控制由香蕉枯萎病菌导致的香蕉枯萎病。

其中，所述的基因FoPao，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，或者是如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列通过一个或多个氨基酸替换、插入、缺失而获得的仍具有控制香蕉枯萎病菌致病力功能的类似物；

所述的基因FoPao，其核苷酸序列为下列A、B、C、D之一：

A、编码SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的DNA序列；

B、如SEQ ID NO：2所示的CDS序列；

C、如SEQ ID NO：1所示的基因序列；

D、以上A、B和C通过碱基插入、缺失、或替换而获得的仍具有控制香蕉枯萎病菌致病力功能的类似物；

进一步的，所述的香蕉枯萎病菌为香蕉枯萎病菌4号生理小种(Foc4)。

含有上述基因FoPao的过表达载体、敲除载体、重组菌在上述方面的应用也属于本发明的保护范围。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明提供了香蕉枯萎病菌4号小种(Fusarium oxysporum f.sp.cubense Race4，Foc4)一种预测的多胺氧化酶(N1-acetylpolyamine oxidase，predicted，PAO)基因FoPao及其编码蛋白PAO的新功能。所述基因FoPao为SEQ ID NO：1所示的基因序列，其所编码的蛋白PAO为SEQ ID NO：3所示的蛋白质。PAO蛋白参与多胺代谢途径，但其在Foc4中的生物学功能及对致病性的影响并不清楚。试验证明，将蛋白PAO编码的基因FoPao被潮霉素磷酸转移酶基因(hph)置换后，所得到的敲除突变体ΔFoPao在生长速率、菌丝形态、产孢能力上与Foc4野生型没有显著差异；在抗高渗能力、抗离子胁迫能力、及细胞壁完整性上与Foc4野生型也没有明显差异。致病性试验表明，基因FoPao的缺失显著增加了香蕉枯萎病菌的毒力；将该基因回补后，回补突变体的毒力与香蕉枯萎病菌野生型一致。本发明证实FoPao与香蕉枯萎病菌的致病性有关。我们的研究有助于深入阐明香蕉枯萎病菌的致病分子机制。

附图说明

图1是香蕉枯萎病菌基因FoPao敲除载体的构建示意图。

图2是香蕉枯萎病菌基因FoPao回补载体的示意图。

图3是部分潮霉素抗性转化子hph基因的PCR扩增；其中，M：DNA Marker；泳道1：pUC19-HPH质粒；泳道2-6：转化子7、12、18、19、24。

图4是转化子Southern blot分析(以hph片段为探针)；其中，ΔFoPao-7是转化子7、ΔFoPao-12是转化子12、ΔFoPao-18是转化子18、ΔFoPao-19是转化子19、ΔFoPao-24是转化子24。

图5是部分博来霉素抗性回补转化子FoPao的PCR扩增；其中，M：DNA Marker；泳道1：Foc4野生型；泳道2：阴性对照；泳道3-6：回补转化子1、2、17、19。

图6是敲除突变体ΔFoPao和回补突变体ΔFoPao-com抗高渗能力的测定；其中，ΔFoPao-7是指转化子7；ΔFoPao-7-com是指由ΔFoPao-7获得的回补转化子2。

图7是敲除突变体ΔFoPao和回补突变体ΔFoPao-com细胞壁完整性的测定。

图8是敲除突变体ΔFoPao和回补突变体ΔFoPao-com对巴西蕉的致病性分析。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1

1、实验材料

1.1供试菌株及植物

香蕉枯萎病菌4号生理小种(Foc4)，供试香蕉品种为巴西蕉Cavendish(AAA)。

1.2宿主菌及质粒载体

宿主菌为大肠杆菌DH5α，克隆载体为pMD18-T vector，基因敲除载体为pUC19-HPH(由本实验室在pUC19质粒基础上改造得来，即在pUC19上的Kpn I和BamHⅠ位点之间插入TrpC+HPH片段)，基因回补载体为pCTZN(由本实验室在pCT74质粒基础上改造得来，即将pCT74上的SGFP和hph基因替换成博来霉素(Zeocin)基因)，也在专利“201910986131.4、基因FoPDCD5在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用”中公开。

2、实验方法

2.1香蕉枯萎病菌FoPao基因上下游同源片段的扩增

香蕉枯萎病菌FoPao基因敲除载体的构建如图1所示。在FoPao基因的上游和下游各选取长度大小约为1000bp左右的序列(分别命名为同源臂A片段和同源臂B片段，即FoPao-A和FoPao-B)，并设计引物(表1)。

表1 FoPao基因同源臂A片段和B片段的扩增引物

引物名称	引物序列5’-3’	酶切位点
			FoPao-AF	GC<u>GTCGAC</u>TAATTCGCCCAGCATCGTAG	Sal I
FoPao-AR	CG<u>GGATCC</u>CAGATAGCGTAGGCTGTTGGT	BamH I
			FoPao-BF	GG<u>GGTACC</u>ATGTCTTGAATGAGAACAAGCC	Kpn I
FoPao-BR	CG<u>GAATTC</u>GTAGTGGTTAATATACTTGTCTGGT	EcoR I

用真菌DNA提取试剂盒(OMEGA Fungal DNA Kit)，提取Foc4基因组DNA；以该基因组DNA为模板，用引物FoPao-AF和FoPao-AR进行PCR扩增，获得FoPao基因的同源臂A片段(FoPao-A)；用引物FoPao-BF和FoPao-BR进行PCR扩增，获得FoPao基因的同源臂B片段(FoPao-B)。

具体的PCR反应体系为：

模板DNA	1.0μL
		FoPao-AF/BF(10μmol/L)	1.0μL
FoPao-AR/BR(10μmol/L)	1.0μL
		10×Taq Buffer(Mg<sup>2+</sup>plus)	5.0μL
dNTPs(2.5mmol/L)	4.0μL
		Taq(5U/μL)	0.5μL
ddH<sub>2</sub>O	37.5μL
		Total	50.0μL

PCR反应条件为：94℃反应5min；94℃反应1min，55℃反应1min，72℃反应1min，共35个循环；72℃反应10min。用OMEGA Cycle Pure Kit试剂盒，对PCR扩增产物进行清洁回收。

2.2 FoPao基因敲除载体的构建

参考pMD 18-T Vector Cloning Kit(TakaRa公司)试剂盒说明书，将FoPao-A和FoPao-B分别与T载体连接，获得重组质粒pMD18T-FoPao-A和pMD18T-FoPao-B。具体为：取1μL pMD 18-T载体，分别加入4μL上述PCR回收产物(同源臂A片段或同源臂B片段)和5μLsolution I，于16℃连接3h。取10μL连接产物加入到100μL大肠杆菌DH 5α感受态细胞中，冰上放置30min；于42℃水浴热击90s，冰上冷却2min；加入800μL LB液体培养基，于37℃、150rpm摇床中振荡培养1h；再于10000rpm离心1min，弃上清，留100μL菌液与沉淀混匀，涂布于LB固体培养基(含50μg/mL Amp)；于37℃下培养12～16h。

挑取具有Amp抗性的阳性转化子，提取重组质粒DNA，并进行测序鉴定。用Sal I、BamH I分别对pMD18T-FoPao-A和pUC19-HPH载体进行双酶切，回收A片段和pUC19-HPH载体。用T4DNA连接酶将A片段与pUC19-HPH连接，转化大肠杆菌DH5α；获得重组质粒pUC19-HPH-FoPao-A。按同样程序，用Kpn I和EcoR I双酶切pMD18T-FoPao-B和重组质粒pUC19-HPH-FoPao-A，回收B片段和重组质粒。用T4DNA连接酶将B片段与pUC19-HPH-FoPao-A连接，转化大肠杆菌DH5α；经酶切鉴定，获得基因敲除载体pUC19-HPH-FoPao-KO。

2.3 FoPao回补片段的扩增

FoPao基因回补载体的构建如图2所示。在FoPao基因的上游选取长度为1500bp的启动子序列，下游选取长度为500bp的终止子序列，并设计引物(表2)。

表2 FoPao基因回补片段的扩增引物

引物名称	引物序列5’-3’	酶切位点
			C-FoPao-F	ACGC<u>GTCGAC</u>ACAAGCACTGATGTAAGCAAAGC	Sal I
C-FoPao-R	GG<u>GGTACC</u>GCCGCAAGCCATTTTAGCAG	Kpn I

用真菌DNA提取试剂盒(OMEGA Fungal DNA Kit)，提取Foc4基因组DNA；以该基因组DNA为模板，用引物C-FoPao-F和C-FoPao-R进行PCR扩增，获得FoPao基因的回补片段(记为FoPao-com)。

具体的PCR反应体系为：

模板DNA	1.0μL
		C-FoPao-F(10μmol/L)	1.0μL
C-FoPao-R(10μmol/L)	1.0μL
		10×Taq Buffer(Mg<sup>2+</sup>plus)	5.0μL
dNTPs(2.5mmol/L)	4.0μL
		ExTaq(5U/μL)	0.5μL
ddH<sub>2</sub>O	37.5μL
		Total	50.0μL

PCR反应条件为：94℃反应5min；94℃反应1min，60℃反应1min，72℃反应5min，共30个循环；72℃反应10min，即获得PCR扩增产物。用OMEGA Cycle Pure Kit试剂盒，对PCR扩增产物进行清洁回收。

2.4 FoPao基因回补载体的构建

用Sal I和Kpn I分别对FoPao的回补片段和pCTZN载体进行双酶切，回收FoPao的回补片段和pCTZN载体。用T4DNA连接酶将FoPao的回补片段与pCTZN连接，转化大肠杆菌DH5α；获得重组质粒pCTZN-FoPao-com。经酶切鉴定，获得基因回补载体pCTZN-FoPao-com。

2.5 Foc4原生质体的制备

将Foc4接种到查氏培养基(硝酸钠3g，三水合磷酸氢二钾1g，氯化钾0.5g，七水合硫酸镁0.5g，七水合硫酸亚铁0.018g，蔗糖30g，蒸馏水定容至1L，pH为6.0)中，于28℃、150rpm振荡培养3d；将培养液用200目细胞筛过滤，于4℃下10000×g离心10min，弃上清。用NCM培养基(葡萄糖10g，天冬氨酸4g，20×硝酸盐50mL，1000×维生素1mL，1000×微量元素1mL，200×铁盐5mL，定容至1L，pH 6.5)重悬沉淀并进行稀释后，制得Foc4分生孢子悬浮液。将制备好的分生孢子悬浮液接种于NCM培养基中，使分生孢子终浓度为1×10⁶个/mL；于28℃下120rpm震荡培养11～12h，用200目细胞筛过滤，并用0.8mol/L NaCl溶液(渗透压稳定剂)冲洗3～5次，获得新鲜菌丝体。按酶液与菌丝比例(体积质量比10:1)，加入适量15g/L崩溃酶酶液，于30℃下120rpm条件下酶解3h，得到原生质体酶解液。于4℃下400×g离心10min，弃上清。加入1mL预冷的STC溶液(含10mmol/L Tris-Hcl(pH 7.5)，1.2mol/L山梨醇，50mmol/L CaCl₂)重悬沉淀；离心，弃上清。再加入10～20mL预冷的STC将沉淀重悬，得到Foc4原生质体悬液，使原生质体终浓度约为1×10⁷个/mL。

香蕉枯萎病菌敲除突变体原生质体的制备，参照上述香蕉枯萎病菌原生质体的制备步骤得到。

2.6 Foc4原生质体的转化

用Sal I和EcoR I对敲除载体pUC19-HPH-FoPao-KO进行双酶切，获得A-hph-B片段。将5μg的重组片段A-hph-B片段与200μL的Foc4原生质体混匀，或者，将5μg的pCTZN-FoPao-com质粒与200μL香蕉枯萎病菌敲除突变体原生质体混匀；冰浴15min；逐滴加入新鲜配制的PSTC转化缓冲液(40％PEG4000，1.2mol/L山梨醇，50mmol/L CaCl₂，10mmol/L Tris-HCl，pH7.5)1mL，混匀后冰上放置15min。加入10mL预冷的STC，混匀；于4℃下4000rpm离心15min；去掉6mL上清，用3mL PSB再生培养基(马铃薯200.0g，蔗糖273.6g，蒸馏水定容至1L)重悬沉淀，于28℃、100rpm震荡培养12h～16h。于4℃下4000rpm离心15min，去掉5mL上清，加入12mL PSA再生培养基(PSB再生培养基中加入1.5％琼脂粉、150μg/mL潮霉素或200μg/mL博来霉素)，混匀倒板，于28℃黑暗培养2～3d；挑取潮霉素(或博来霉素)抗性转化子，转移到含有150μg/mL潮霉素(或200μg/mL博来霉素)的PDA培养基(含马铃薯200.0g，无水葡萄糖20.0g，琼脂15.0g，蒸馏水定容至1L)，于28℃黑暗培养3～4d，挑取单菌落用于鉴定。

2.7 Foc4敲除突变体ΔFoPao的PCR验证分析

按照真菌DNA提取试剂盒(OMEGA Fungal DNA Kit)说明书，提取上述潮霉素阳性转化子的基因组DNA，进行PCR验证分析。所用的筛选引物如下：

FoPao-F：5′-CCATTTGGAGATTGGCGCAG-3′，

FoPao-R：5′-TTGTCGCTCGACTTGGTAGG-3′，

hph-F：5′-TGCTGCTCCATACAAGCCAA-3′，

hph-R：5′-GACATTGGGGAGTTCAGCGA-3′；

PCR反应体系如下：

模板DNA	0.5μL
		FoPao-F/hph-F(10μmol/L)	0.5μL
FoPao-R/hph-R(10μmol/L)	0.5μL
		10×Taq Buffer(Mg<sup>2+</sup>plus)	2.5μL
dNTPs(2.5mmol/L)	2.0μL
		Taq(5U/μL)	0.25μL
ddH<sub>2</sub>O	18.75μL
		Total	25.0μL

PCR反应条件为：94℃反应5min；94℃反应1min，58℃反应1min，72℃反应1min，共30个循环；72℃反应10min，得到扩增产物。

2.8FoPao回补突变体ΔFoPao-com的PCR验证分析

按照真菌DNA提取试剂盒法(OMEGA Fungal DNA Kit)说明书，提取上述博来霉素阳性转化子的基因组DNA，进行PCR验证分析。用引物FoPao-F/FoPao-R进行基因片段FoPao的PCR扩增。

FoPao-F：5′-CCATTTGGAGATTGGCGCAG-3′，

FoPao-R：5′-TTGTCGCTCGACTTGGTAGG-3′；

PCR反应体系如下：

模板DNA	0.5μL
		FoPao-F(10μmol/L)	0.5μL
FoPao-R(10μmol/L)	0.5μL
		10×Taq Buffer(Mg<sup>2+</sup>plus)	2.5μL
dNTPs(2.5mmol/L)	2.0μL
		Taq(5U/μL)	0.25μL
ddH<sub>2</sub>O	18.75μL
		Total	25.0μL

2.9 Foc4敲除突变体ΔFoPao的Southern blot分析

按照DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I(Roche公司)说明书，进行Southern blot杂交。用引物FoPao-F/FoPao-R扩增目的基因探针，用hph-F/hph-R扩增hph基因探针。

FoPao-F：5′-CCATTTGGAGATTGGCGCAG-3′，

FoPao-R：5′-TTGTCGCTCGACTTGGTAGG-3′，

hph-F：5′-TGCTGCTCCATACAAGCCAA-3′，

hph-R：5′-GACATTGGGGAGTTCAGCGA-3′；

DNA探针的PCR扩增体系如下：

模板DNA	1.0μL
		FoPao-F/hph-F(20μmol/L)	1.0μL
FoPao-R/hph-R(20μmol/L)	1.0μL
		10×Ex Taq Buffer(Mg<sup>2+</sup>plus)	5.0μL
dNTPs(2.5mmol/L)	4.0μL
		Ex Taq(5U/μL)	0.5μL
ddH<sub>2</sub>O	37.5μL
		Total	50.0μL

2.10敲除突变体ΔFoPao的表型观察

(1)菌落形态观察及生长速度测定。将Foc4野生型和ΔFoPao接种于PDA培养基上，于28℃黑暗条件下培养。连续测量7d的菌落直径，并观察其菌落形态。

(2)分生孢子的形态观察。将Foc4野生型和ΔFoPao接种至查氏培养基，置于28℃、120rpm震荡培养，7d后统计产孢量，并观察分生孢子的形态。

2.11敲除突变体ΔFoPao和回补突变体ΔFoPao-com抗胁迫能力分析

(1)抗高渗(高渗透压)能力测定

将Foc4野生型、ΔFoPao和ΔFoPao-com的分生孢子液(10⁵个/mL和10⁶个/mL)分别接种在含有1mol/L NaCl和1m/L山梨醇的PDA培养基，于28℃培养箱倒置培养2d后，观察菌落生长情况。

(2)细胞壁完整性测定

将Foc4野生型、ΔFoPao和ΔFoPao-com的分生孢子液(1×10⁵个/mL和1×10⁶个/mL)分别接种在含有100μg/mL和200μg/mL刚果红的PDA培养基上，于28℃培养箱倒置培养2d后，观察菌落生长情况。

2.12敲除突变体ΔFoPao和回补突变体ΔFoPao-com的致病性分析

取4叶期的巴西蕉，分别用Foc4野生型、ΔFoPao和ΔFoPao-com的分生孢子悬浮液(2×10⁵个/mL)进行伤根接种；于28℃、光/暗12h/12h交替培养，30d后观察并统计香蕉苗叶片和球茎的发病情况。

3结果与分析

3.1香蕉枯萎病菌FoPao基因敲除载体和回补载体的构建

3.1.1香蕉枯萎病菌FoPao基因敲除载体的构建

采用PCR扩增方法，分别克隆获得FoPao基因同源臂A片段和同源臂B片段；分别将其与T载体连接，经转化大肠杆菌、Amp抗性筛选、质粒提取与测序鉴定，获得重组质粒pMD18T-FoPao-A和pMD18T-FoPao-B。将pMD18T-FoPao-A与pUC19-HPH质粒连接，获得重组质粒pUC19-HPH-FoPao-A；将其与pMD18T-FoPao-B进行双酶切，经DNA连接、大肠杆菌转化、酶切鉴定，获得基因敲除载体pUC19-HPH-FoPao-KO(图1)。

3.1.2香蕉枯萎病菌FoPao基因回补载体的构建

采用PCR扩增方法，克隆获得FoPao基因回补片段；将其与pCTZN载体连接，经大肠杆菌转化、Amp抗性筛选、质粒提取与测序鉴定，获得重组质粒pCTZN-FoPao-com(图2)。

3.2敲除突变体ΔFoPao的筛选

3.2.1基因片段FoPao的PCR验证

利用同源重组方法，将基因敲除载体转化香蕉枯萎病菌原生质体，共获得了24个潮霉素阳性转化子。经DNA的提取，利用FoPao基因特异性引物，对24个潮霉素阳性转化子进行了PCR验证分析。结果表明，在24个潮霉素阳性转化子中有5个转化子未能扩增出目的基因片段，初步鉴定这5个转化子为阳性转化子。

3.2.2基因片段hph的PCR验证

以初步鉴定的5个阳性转化子的基因组DNA为模板，利用hph特异性引物进行PCR扩增；结果表明，上述没有扩增到FoPao基因5个转化子，扩增到了约900bp的潮霉素片段，进一步说明这5个转化子为阳性转化子(图3)。

3.2.3 Foc4敲除突变体ΔFoPao的Southern blot验证

对上述5个阳性转化子进行了Southern blot分析。结果表明，以目的基因FoPao片段作为探针进行杂交，5个转化子均未有杂交条带。以hph基因片段为探针进行杂交，5个转化子中有3个为单拷贝条带(图4)。上述试验证明这3个转化子为阳性转化子。

3.3回补突变体ΔFoPao-com的筛选

利用随机插入的方法，将基因回补载体pCTZN-FoPao-com转化香蕉枯萎病菌敲除突变体原生质体，获得了48个博来霉素阳性转化子。经基因组DNA的提取，利用FoPao基因特异性引物，对48个博来霉素阳性转化子进行了PCR验证分析。结果表明，有4个阳性转化子可扩增到目的基因片段，初步鉴定这4个转化子为阳性转化子(图5)。

3.4敲除突变体ΔFoPao的菌落形态和生长速率测定

将ΔFoPao接种于PDA培养基中，分别在不同时间对其生长情况进行了观察。结果表明，与Foc4野生型相比，ΔFoPao的菌落形态没有明显区别，生长速率没有显著差异。

3.5敲除突变体ΔFoPao的产孢量分析。

将ΔFoPao接种于查氏培养基，培养7d后进行分析。结果表明，突变体ΔFoPao的分生孢子大小和形态、以及产孢量与Foc4野生型均没有显著差异。

3.6敲除突变体ΔFoPao和回补突变体ΔFoPao-com抗高渗能力测定

将ΔFoPao、ΔFoPao-com分别接种于含1mol/L NaCl和1mol/L山梨醇的PDA培养基，对其菌落直径进行了测定。结果表明，与Foc4野生型，ΔFoPao和ΔFoPao-com的抗高渗能力无显著差异(图6)。

3.7敲除突变体ΔFoPao和回补突变体ΔFoPao-com的细胞壁完整性的测定

将ΔFoPao和ΔFoPao-com分别接种于含有100μg/mL和200μg/mL刚果红(CR)的PDA培养基，对其菌落直径进行了测定。结果表明，与Foc4野生型相比，ΔFoPao和ΔFoPao-com对刚果红的敏感性无明显差异(图7)。

3.8敲除突变体ΔFoPao和回补突变体ΔFoPao-com的致病性分析

将Foc4野生型、ΔFoPao和ΔFoPao-com分生孢子接种四叶期巴西蕉苗，于30d后进行观察。结果表明，与Foc4野生型相比，ΔFoPao接种后的香蕉叶片黄化面积和球茎的褐变面积均更大。经病情指数统计，结果表明ΔFoPao的病情指数显著高于Foc4野生型。ΔFoPao-com的发病情况则与Foc4野生型相似(图8)。该结果说明敲除FoPao基因后，香蕉枯萎病菌致病力明显上升。

因此，本发明提供的基因可以用于植物病害防治，特别是由香蕉枯萎病菌所导致的香蕉枯萎病。另，本发明提供的基因可以作为用于植物病害防治的药物的靶标。本领域技术人员可以跟进本说明书的教导和启示，开发用于防治植物病害、特别是香蕉枯萎病的药物。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 基因FoPao在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1982

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 香蕉枯萎病菌FoPao基因的碱基序列

<400> 1

caatggcctc ggctcagcat tggggcgggg agttcctcgg ctccaccgga gaagttgggc 60

gaacgaagct aaggaatcat cgcggcctac gtatgctcgg cgtgatagag cgtgcgatag 120

tttaattact ccccgggggg ttcgtacaaa accaaactcc ctcctcctag ctctctcaga 180

actgttgatc tcggacactc ccgttaccaa agaccaccaa catgaagcaa tcaccagcac 240

agcttctgac tgtccttaca gccttcttta ccgcagccga cgcagtcagc ctcccacctc 300

gagataaagg aacctgcagg aagaccaagg ttgctattct cggagctggt gttgctggta 360

ttgctgcagc tcagaacctg acccaagcga aaatcaccga cttccttatc gttgaacata 420

atgactatat tggaggtcgc ctgcgaagtc aacaatttgg ccgaaacacc aagaccggca 480

agccatacac tattgagcta ggtgccaact gggtggaagg catcggatcg ctcgagacgc 540

acgagaaccc catttggaga ttggcgcaga agcacggttt aaagacaact tacgccgatt 600

acgatgccct caagacgttt gaccacaagg gcgccaagaa ctggaccgac aaaatcgccg 660

agctagatgc cgcttttgag aatgcgtcag gcgactccgg tcacatcttg ctggataacc 720

tccaggacct atctgctcgc gctggtcttc gtactggagg ctggagacca gataagaacg 780

atatgtatgc gcaggcagca gattggtggg gatgggactt tgaggctgct tggacgcctg 840

atgagagcgg tcttgttttt ggcgtcgctg gagacaatgc tacctttggt tatttcagcg 900

atgtcagcaa cctagttatc gaccagcgcg gttataacta ctttctcaag caggaagcca 960

aaactttcct caaggagaac gatctacgac tcctcctcaa gactaccgtt gaaggtattg 1020

agtataacaa gaagggcgtc aaggtcacaa ccaaggatgg tggctgtata gaagctaact 1080

atgctatctg tacattttct ctcggtgtat tgcagaagga cgtcgttgag ttcaaaccca 1140

agctgcctca ctggaagcag agcgctatcg accaatttgc gatgggtaca tacaccaaga 1200

tttttatgca attcaacgag tcattctggg atactgatgc ccagtatcag ctctacgccg 1260

accccattga gcgtggacgt tatcctctgt ttcagccgct caatggtaaa ggtttccttg 1320

agggatccaa catcatcttc gcgacagtca ctggcgagca ggcctaccaa gtcgagcgac 1380

aaacggacga ggagaccgaa gcgcaagtcg tggaggtcct gcagtccatg taccctgata 1440

agaaggtcca taagcctaca gcattcactt acccacgctg gagcaccgaa ccgtaagttg 1500

ataaacagcc ccttgtacct aatttcccat ccataattaa catgacatgt atagctgggc 1560

gtatggatcc tatagcaact ggcctgtagg catgactctt gagaagcacc aaaatatacg 1620

tgccaacctg gaacgcctgt ggtttgccgg cgaggctaat tcagctgaat tctttggctt 1680

tgtccatggt ggatacaccg agggtcgcga aattggtcat agaattggta ggatcattaa 1740

tggagaggct ggtgatgatg aatttgatat ggagagatat gaggttctgc atggaaccac 1800

tcataaggac gagtacaacg atgagaacgg atggttgttt ccttacgatg ttgacggtga 1860

caactgatca aatcatgttt cagacattca cagtacatat tcataaagcg cagtgctcat 1920

agtgcttcgg gcatatacac aaattttcta atgtattacc aatcgaattc aagagtgcaa 1980

aa 1982

<210> 2

<211> 1584

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 香蕉枯萎病菌FoPao基因的CDS序列

<400> 2

atgaagcaat caccagcaca gcttctgact gtccttacag ccttctttac cgcagccgac 60

gcagtcagcc tcccacctcg agataaagga acctgcagga agaccaaggt tgctattctc 120

ggagctggtg ttgctggtat tgctgcagct cagaacctga cccaagcgaa aatcaccgac 180

ttccttatcg ttgaacataa tgactatatt ggaggtcgcc tgcgaagtca acaatttggc 240

cgaaacacca agaccggcaa gccatacact attgagctag gtgccaactg ggtggaaggc 300

atcggatcgc tcgagacgca cgagaacccc atttggagat tggcgcagaa gcacggttta 360

aagacaactt acgccgatta cgatgccctc aagacgtttg accacaaggg cgccaagaac 420

tggaccgaca aaatcgccga gctagatgcc gcttttgaga atgcgtcagg cgactccggt 480

cacatcttgc tggataacct ccaggaccta tctgctcgcg ctggtcttcg tactggaggc 540

tggagaccag ataagaacga tatgtatgcg caggcagcag attggtgggg atgggacttt 600

gaggctgctt ggacgcctga tgagagcggt cttgtttttg gcgtcgctgg agacaatgct 660

acctttggtt atttcagcga tgtcagcaac ctagttatcg accagcgcgg ttataactac 720

tttctcaagc aggaagccaa aactttcctc aaggagaacg atctacgact cctcctcaag 780

actaccgttg aaggtattga gtataacaag aagggcgtca aggtcacaac caaggatggt 840

ggctgtatag aagctaacta tgctatctgt acattttctc tcggtgtatt gcagaaggac 900

gtcgttgagt tcaaacccaa gctgcctcac tggaagcaga gcgctatcga ccaatttgcg 960

atgggtacat acaccaagat ttttatgcaa ttcaacgagt cattctggga tactgatgcc 1020

cagtatcagc tctacgccga ccccattgag cgtggacgtt atcctctgtt tcagccgctc 1080

aatggtaaag gtttccttga gggatccaac atcatcttcg cgacagtcac tggcgagcag 1140

gcctaccaag tcgagcgaca aacggacgag gagaccgaag cgcaagtcgt ggaggtcctg 1200

cagtccatgt accctgataa gaaggtccat aagcctacag cattcactta cccacgctgg 1260

agcaccgaac cctgggcgta tggatcctat agcaactggc ctgtaggcat gactcttgag 1320

aagcaccaaa atatacgtgc caacctggaa cgcctgtggt ttgccggcga ggctaattca 1380

gctgaattct ttggctttgt ccatggtgga tacaccgagg gtcgcgaaat tggtcataga 1440

attggtagga tcattaatgg agaggctggt gatgatgaat ttgatatgga gagatatgag 1500

gttctgcatg gaaccactca taaggacgag tacaacgatg agaacggatg gttgtttcct 1560

tacgatgttg acggtgacaa ctga 1584

<210> 3

<211> 527

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 基因FoPao编码的氨基酸序列

<400> 3

Met Lys Gln Ser Pro Ala Gln Leu Leu Thr Val Leu Thr Ala Phe Phe

1 5 10 15

Thr Ala Ala Asp Ala Val Ser Leu Pro Pro Arg Asp Lys Gly Thr Cys

20 25 30

Arg Lys Thr Lys Val Ala Ile Leu Gly Ala Gly Val Ala Gly Ile Ala

35 40 45

Ala Ala Gln Asn Leu Thr Gln Ala Lys Ile Thr Asp Phe Leu Ile Val

50 55 60

Glu His Asn Asp Tyr Ile Gly Gly Arg Leu Arg Ser Gln Gln Phe Gly

65 70 75 80

Arg Asn Thr Lys Thr Gly Lys Pro Tyr Thr Ile Glu Leu Gly Ala Asn

85 90 95

Trp Val Glu Gly Ile Gly Ser Leu Glu Thr His Glu Asn Pro Ile Trp

100 105 110

Arg Leu Ala Gln Lys His Gly Leu Lys Thr Thr Tyr Ala Asp Tyr Asp

115 120 125

Ala Leu Lys Thr Phe Asp His Lys Gly Ala Lys Asn Trp Thr Asp Lys

130 135 140

Ile Ala Glu Leu Asp Ala Ala Phe Glu Asn Ala Ser Gly Asp Ser Gly

145 150 155 160

His Ile Leu Leu Asp Asn Leu Gln Asp Leu Ser Ala Arg Ala Gly Leu

165 170 175

Arg Thr Gly Gly Trp Arg Pro Asp Lys Asn Asp Met Tyr Ala Gln Ala

180 185 190

Ala Asp Trp Trp Gly Trp Asp Phe Glu Ala Ala Trp Thr Pro Asp Glu

195 200 205

Ser Gly Leu Val Phe Gly Val Ala Gly Asp Asn Ala Thr Phe Gly Tyr

210 215 220

Phe Ser Asp Val Ser Asn Leu Val Ile Asp Gln Arg Gly Tyr Asn Tyr

225 230 235 240

Phe Leu Lys Gln Glu Ala Lys Thr Phe Leu Lys Glu Asn Asp Leu Arg

245 250 255

Leu Leu Leu Lys Thr Thr Val Glu Gly Ile Glu Tyr Asn Lys Lys Gly

260 265 270

Val Lys Val Thr Thr Lys Asp Gly Gly Cys Ile Glu Ala Asn Tyr Ala

275 280 285

Ile Cys Thr Phe Ser Leu Gly Val Leu Gln Lys Asp Val Val Glu Phe

290 295 300

Lys Pro Lys Leu Pro His Trp Lys Gln Ser Ala Ile Asp Gln Phe Ala

305 310 315 320

Met Gly Thr Tyr Thr Lys Ile Phe Met Gln Phe Asn Glu Ser Phe Trp

325 330 335

Asp Thr Asp Ala Gln Tyr Gln Leu Tyr Ala Asp Pro Ile Glu Arg Gly

340 345 350

Arg Tyr Pro Leu Phe Gln Pro Leu Asn Gly Lys Gly Phe Leu Glu Gly

355 360 365

Ser Asn Ile Ile Phe Ala Thr Val Thr Gly Glu Gln Ala Tyr Gln Val

370 375 380

Glu Arg Gln Thr Asp Glu Glu Thr Glu Ala Gln Val Val Glu Val Leu

385 390 395 400

Gln Ser Met Tyr Pro Asp Lys Lys Val His Lys Pro Thr Ala Phe Thr

405 410 415

Tyr Pro Arg Trp Ser Thr Glu Pro Trp Ala Tyr Gly Ser Tyr Ser Asn

420 425 430

Trp Pro Val Gly Met Thr Leu Glu Lys His Gln Asn Ile Arg Ala Asn

435 440 445

Leu Glu Arg Leu Trp Phe Ala Gly Glu Ala Asn Ser Ala Glu Phe Phe

450 455 460

Gly Phe Val His Gly Gly Tyr Thr Glu Gly Arg Glu Ile Gly His Arg

465 470 475 480

Ile Gly Arg Ile Ile Asn Gly Glu Ala Gly Asp Asp Glu Phe Asp Met

485 490 495

Glu Arg Tyr Glu Val Leu His Gly Thr Thr His Lys Asp Glu Tyr Asn

500 505 510

Asp Glu Asn Gly Trp Leu Phe Pro Tyr Asp Val Asp Gly Asp Asn

515 520 525

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> FoPao-AF

<400> 4

gcgtcgacta attcgcccag catcgtag 28

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> FoPao-AR

<400> 5

cgggatccca gatagcgtag gctgttggt 29

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> FoPao-BF

<400> 6

ggggtaccat gtcttgaatg agaacaagcc 30

<210> 7

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> FoPao-BR

<400> 7

cggaattcgt agtggttaat atacttgtct ggt 33

<210> 8

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> C-FoPao-F

<400> 8

acgcgtcgac acaagcactg atgtaagcaa agc 33

<210> 9

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> C-FoPao-R

<400> 9

ggggtaccgc cgcaagccat tttagcag 28

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> FoPao-F

<400> 10

ccatttggag attggcgcag 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> FoPao-R

<400> 11

ttgtcgctcg acttggtagg 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> hph-F

<400> 12

tgctgctcca tacaagccaa 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> hph-R

<400> 13

gacattgggg agttcagcga 20

Claims

1.基因FoPao在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用，其特征在于：

所述的基因FoPao，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：

所述的基因FoPao，其核苷酸序列为下列A、B、C之一：

A、编码SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的DNA序列；

B、如SEQ ID NO：2所示的CDS序列；

C、如SEQ ID NO：1所示的基因序列。

3.一种通过下调FoPao基因提高香蕉枯萎病菌致病力的方法，其特征在于：通过使香蕉枯萎病菌的权利要求1所述的FoPao基因功能缺失或下调，来提高香蕉枯萎病菌的致病力。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：

所述的FoPao基因功能下调为通过RNA干涉技术或者基因组编辑技术来下调香蕉枯萎病菌内的FoPao活性，达到提高致病力的目的。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：

所述的FoPao基因，其核苷酸序列为下列A、B、C之一：

A、编码SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的DNA序列；

B、如SEQ ID NO：2所示的CDS序列；

C、如SEQ ID NO：1所示的基因序列。