CN111748562B - 一种水稻纹枯病菌Atg 22蛋白编码基因及其靶标片段Rsatg22和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水稻纹枯病菌Atg 22蛋白编码基因及其靶标片段Rsatg22和应用。本发明提供的水稻纹枯病菌Atg 22蛋白编码基因，其全长cDNA序列如SEQ ID NO：1所示，其全长DNA序列如SEQ ID NO：2所示，其编码序列如SEQ ID NO：3所示。该基因在水稻纹枯病菌侵染水稻的前期过程中被显著诱导表达，根据该水稻纹枯病菌Atg 22蛋白编码基因的靶标片段Rsatg22合成的dsRNA，体外处理使得水稻纹枯病菌Atg 22蛋白编码基因沉默，进而显著降低水稻纹枯病菌的致病力，有效地解决了生产上由纹枯病菌引起的土传真菌病害的难题；因此，该水稻纹枯病菌Atg 22蛋白编码基因或其靶标片段Rsatg22在防治水稻纹枯病菌、制备水稻纹枯病菌防治制剂以及构建抗水稻纹枯病菌转基因植物中的应用前景良好。

Description

一种水稻纹枯病菌Atg 22蛋白编码基因及其靶标片段 Rsatg22和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域。更具体地，涉及一种水稻纹枯病菌Atg 22蛋白编码基因及其靶标片段Rsatg22和应用。

背景技术

细胞自噬是真核生物中高度保守的一种亚细胞降解途径，它通过降解受损细胞器、大分子蛋白等细胞质物质来维持细胞内生理平衡并使之度过饥饿或环境压力等逆境。近年来，越来越多的研究表明细胞自噬在哺乳动物胚胎分化、防卫反应和病原菌侵染进程中起若至关重要的作用。在真菌中，酿酒酵母是研究细胞自噬机制的模式生物，目前共证实有34个细胞自噬相关基因(ATG)，按其编号分别为ATG1，ATG2，ATG3等。在稻瘟病菌中，细胞自噬参与了真菌的生长发育、产孢和致病力等进程(Liu,X.H et al，Autophagy duringconidiation,conidial germination and turgor generation in Magnaporthegrisea.Autophagy，2007)。在小麦赤霉病菌中，对与酵母同源所有Atg蛋白进行了鉴定及敲除分析，发现禾谷镰刀菌中自噬参与调控病菌生长、产孢、致病力及毒素的产生以及对胁迫的响应(Lv,W.Y.et al，Genome-wide functional analysis reveals that autophagy isnecessary for growth,sporulation,deoxynivalenol production and virulence inFusarium graminearum.Scientific reports，2017)。在水稻纹枯病菌中，舒灿伟等获得了在水稻纹枯病菌菌核发育过程中差异表达的6个自噬相关基因，丝氨酸/苏氨酸激酶和ssp1、ATG13和Vam6基因的表达量在白色菌核形成阶段的表达量显著升高，而在菌核发育成熟阶段的表达量明显下降；而丝氨酸/苏氨酸-蛋白磷酸酶基因和丝氨酸/苏氨酸激酶受体相关蛋白基因的表达量在菌核发育阶段呈现出连续下降的趋势，这些基因也高度响应了菌核的发育过程(舒灿伟等，细胞自噬相关基因在水稻纹枯病菌菌核发育过程中的定量分析，华中农业大学学报，2018)。

自噬的目的之一是降解细胞质成分并回收产生的大分子，这些大分子在营养缺乏时对细胞存活至关重要。因此，必须分解自噬小体与液泡融合形成的单膜自噬体。这个分解进程取决于液泡腔的酸性pH值和Prb1蛋白。另外，Atg15蛋白和Atg22蛋白也被报道参与了这一进程，Atg15蛋白是一种假定的脂肪酶，似乎可能直接作用于自噬体的液泡内裂解。相反，Atg22蛋白是一个假定的完整膜蛋白，位于液泡的限制膜，与通透酶有限的同源性；有研究表明，自噬体的分解取决于Atg22蛋白，因为atg22突变细胞在饥饿条件下表现出在液泡内轻微的自噬体积累(Suriapranata et al，The breakdown of autophagic vesiclesinside the vacuole depends on Aut4p.J.Cell Sci，2000)。

蛋白Atg22的功能在植物病原真菌的报道非常少，目前在水稻纹枯病菌中没有被报道。水稻纹枯病(Rice sheath blight)是水稻的重要病害之一，危害程度仅次于稻瘟病，在种植密集和髙产稻区危害最严重；导致的减产约在10％-30％，严重时可达到50％。近年来，该病每年在我国的发生面积均超过2亿亩，发病率高且广；但是目前缺乏高抗水稻品种，其原因之一是有关该菌的基因功能研究很少。因此，筛选和克隆水稻纹枯病菌的致病相关基因是研究水稻与纹枯病菌互作的前提，对于防治纹枯病菌引起的病害具有重要意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有对水稻纹枯病的致病相关基因研究的缺陷和不足，提供一种水稻纹枯病菌Atg 22蛋白编码基因及其靶标片段Rsatg22和应用。

本发明的目的是提供一种水稻纹枯病菌Atg 22蛋白编码基因。

本发明另一目的是提供所述编码基因所编码的蛋白质。

本发明又一目的是提供一种水稻纹枯病菌Atg 22蛋白编码基因的靶标片段Rsatg22。

本发明又一目的是提供所述编码基因或所述靶标片段Rsatg22在防治水稻纹枯病菌或制备水稻纹枯病菌防治制剂中的应用。

本发明又一目的是提供所述编码基因或所述靶标片段Rsatg22在构建抗水稻纹枯病菌转基因植物中的应用。

本发明再一目的是提供一种水稻纹枯病菌防治制剂。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明提供了一种水稻纹枯病菌Atg 22蛋白编码基因，其全长cDNA序列如SEQ IDNO：1所示，序列长度为1947bp。其全长DNA序列如SEQ ID NO：2所示，序列长度为2462bp，包含9个内含子，分别位于第97～154位、276～328位、432～486位、1137～1186位、834～920位、1007～1059位，1626～1681位，1898～1955位，2153～2198位。其编码序列如SEQ ID NO：3所示，序列长度为1947bp，其编码648个氨基酸。

本发明还提供了一种水稻纹枯病菌Atg 22蛋白编码基因所编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，由648个氨基酸组成，蛋白质的分子量为69.13kDa。

本发明还提供了一种水稻纹枯病菌Atg 22蛋白编码基因的靶标片段Rsatg22，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

本发明研究发现，水稻纹枯病菌Atg 22蛋白编码基因是水稻纹枯病菌与致病力有关的基因，该基因在水稻纹枯病菌侵染水稻的前期过程中被诱导，表达量在48h至120h阶段持续升高；因此，以下应用均应在本发明的保护范围之内：

所述编码基因或所述靶标片段Rsatg22在防治水稻纹枯病菌或制备水稻纹枯病菌防治制剂中的应用，以及在构建抗水稻纹枯病菌转基因植物中的应用。

本发明还提供了一种水稻纹枯病菌防治制剂，含有能够抑制所述水稻纹枯病菌Atg 22蛋白编码基因表达的物质。

优选地，所述物质为dsRNA或包含靶标片段Rsatg22的重组载体或重组菌。

更优选地，所述dsRNA的核酸序列如SEQ ID NO：6所示。

另外，本发明还提供了一种构建抗水稻纹枯病菌转基因植物的方法，体外合成含有水稻纹枯病菌Atg 22蛋白编码基因的靶标片段Rsatg22的dsRNA，用于体外处理并沉默水稻纹枯病菌Atg 22蛋白编码基因；

或者将水稻纹枯病菌Atg 22蛋白编码基因的靶标片段Rsatg22构建到TRV2载体中，用注射法将该载体注射到植株中，获得表达水稻纹枯病菌Atg 22蛋白编码基因的靶标片段Rsatg22的转基因植株；

或者利用转基因植株中产生dsRNA，用于沉默接种的水稻纹枯病菌Atg 22蛋白编码基因，降低水稻纹枯病菌在植株上的致病力。

根据本发明提供的水稻纹枯病菌Atg 22蛋白编码基因或所述靶标片段Rsatg22的序列信息，本领域技术人员可以通过以下方法容易地获得与靶标片段Rsatg22等同的基因：

(1)通过数据库检索获得；(2)以靶标片段Rsatg22为探针筛选其它丝核菌基因组文库或cDNA文库获得；(3)根据靶标片段Rsatg22序列信息设计寡核苷酸引物，用PCR扩增的方法从丝核菌或其它近缘真菌的基因组、mRNA和cDNA中获取；(4)在靶标片段Rsatg22的基础上用基因工程方法改造获得；(5)用化学合成的方法获得该基因。

本发明提供的水稻纹枯病菌Atg 22蛋白编码基因的靶标片段Rsatg22具有重要的应用价值：应用之一是将所述的靶标片段Rsatg22连接到水稻的表达载体中，用转基因技术可以获得永久抗性的作物(水稻、玉米)，能显著降低纹枯病的发病程度；应用之二是将所述的靶标片段Rsatg22连接到十字花科蔬菜的表达载体上，用转基因技术可以获得抗十字花科蔬菜立枯病的蔬菜品种，减少土传病害的发生。

本发明具有以下有益效果：

本发明获得了一种水稻纹枯病菌Atg 22蛋白编码基因，该基因是水稻纹枯病菌的致病力关键基因，该基因在水稻纹枯病菌侵染水稻的前期过程中被显著诱导表达，根据该水稻纹枯病菌Atg 22蛋白编码基因的靶标片段Rsatg22合成的dsRNA，体外处理使得水稻纹枯病菌Atg 22蛋白编码基因沉默，进而显著降低水稻纹枯病菌的致病力；

本发明还提供了一种水稻纹枯病菌防治制剂，含有能够抑制所述水稻纹枯病菌Atg 22蛋白编码基因表达的物质，所述物质为dsRNA或包含靶标片段Rsatg22的重组载体或重组菌；将高效沉默水稻纹枯病菌Atg 22蛋白编码基因的重组载体转化入植株，得到抗水稻纹枯病菌转基因植物，该植物对水稻纹枯病菌具有显著的抗病性，有效地解决了生产上由纹枯病菌引起的土传真菌病害的难题，有效地防控土传真菌病害；

另外，该方法只是在植物中表达一个小片段的基因，不产生蛋白质等产物，不会产生转基因食品带来的潜在风险；因此，该水稻纹枯病菌Atg 22蛋白编码基因或其靶标片段Rsatg22在防治水稻纹枯病菌、制备水稻纹枯病菌防治制剂、以及构建抗水稻纹枯病菌转基因植物中均具有广泛的应用前景。

附图说明

图1是水稻纹枯病菌Atg22蛋白编码基因的靶标片段Rsatg22的扩增结果图；其中，M：DNA分子量标准；1：PCR产物。

图2是Atg22蛋白编码基因的靶标片段Rsatg22在水稻纹枯病菌侵染过程的基因表达分析结果图。

图3是dsRNA体外处理水稻纹枯病菌24、48、72和96h的RNA提取结果图；其中，M：DNA分子量标准；1：24h提取的RNA；2：48h提取的RNA；3：72h提取的RNA；4：96h提取的RNA。

图4是dsRNA体外处理水稻纹枯病菌0h、24h、48h、72h和96h的转录水平结果图。

图5是VIGS载体信息图。

图6是本发明构建得到的TRV2-Rsatg22沉默载体的图谱。

图7是本发明构建得到的TRV2-Rsatg22沉默载体转化至根癌农杆菌GV3101的菌落验证结果图；其中，M：DNA分子量标准；1：菌落。

图8是接种水稻纹枯病菌5d后的本氏烟草的表型图。

图9是接种水稻纹枯病菌5d后的本氏烟草的真菌生物量和靶基因转录水平分析结果图；其中，(A)图为接种水稻纹枯病菌5d后的本氏烟草的真菌生物量分析结果图；(B)图为接种水稻纹枯病菌5d后的本氏烟草的靶基因转录水平分析结果图。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1 水稻纹枯病菌Atg22蛋白编码基因的靶标片段Rsatg22的克隆

1、实验方法

水稻纹枯病菌Atg22蛋白编码基因的靶标片段Rsatg22的克隆，包括以下步骤：

S1.水稻纹枯病菌RNA的提取

水稻纹枯病菌RNA的提取使用TaKaRa总RNA提取试剂盒(code No.9769)。称取0.1g水稻纹枯病菌菌丝于液氮中迅速研磨成粉末，加入到含有裂解液的1.5mL灭菌离心管中，将裂解液12,000rpm，4℃离心5min。将上清液小心吸取到新的1.5mL灭菌离心管中。加入样品裂解步骤中上清液1/2体积的无水乙醇，立即将混合液(含沉淀)全部转入到过滤柱(含2mL收集管)中。12,000rpm，离心1min，弃滤液。依次将500μL的RWA缓冲液，600μL的RWA缓冲液，600μL的RWB缓冲液加入至过滤柱中，12,000rpm离心30秒钟，弃滤液。然后空管12,000rpm离心1min。将过滤柱安置于1.5mL的无RNA酶收集管，在过滤柱膜中央处加入50μL的无RNA酶水(65℃预热)，室温静置5min。12,000rpm离心2min洗脱RNA。

S2.cDNA第一链的合成

以水稻纹枯病菌的总RNA为模板，利用TARAKA PrimeScript反转录试剂盒(codeNo.6210A)合成cDNA。在微量离心管中加入2000ng总RNA、1μL Oligo _dT引物、1μL dNTP(10mM)、补充无RNA酶水至10μL。轻轻混匀，离心数秒后，65℃保温5min，冰上迅速冷却。依次加入4μL 5×PrimeScript II缓冲液、0.5μL RNase抑制剂(40U/μL)、1μL PrimeScript IIRTase(200U/μl)、补充无RNA酶水至20μL，缓慢混匀。42℃保温50min，95℃保温5min(酶失活)，冰上冷却后-20℃保存备用。

S3.靶标片段Rsatg22克隆

靶标片段Rsatg22的克隆引物0281F:5'-ccacattcattccacttactc-3'，如SEQ IDNO:7所示；0281R:5'-ccgctcatagacacaatca-3'，如SEQ ID NO:8所示。以水稻纹枯病菌cDNA为模板，使用擎科公司高保真聚合酶(code No.TP001)，进行PCR扩增反应。反应条件为：98℃，2min；98℃，10s，58℃，15s，40个循环；最后72℃，10min。使用TAE缓冲液制作1.0％的琼脂糖凝胶，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。使用Axygen PCR清洁试剂盒进行PCR产物纯化。

2、实验结果

水稻纹枯病菌Atg22蛋白编码基因的全长cDNA序列如SEQ ID NO：1所示，全长DNA序列如SEQ ID NO：2所示，编码序列如SEQ ID NO：3所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

水稻纹枯病菌Atg22蛋白编码基因的靶标片段Rsatg22的核苷酸序列如SEQ IDNO：5所示。

水稻纹枯病菌Atg22蛋白编码基因的靶标片段Rsatg22的扩增结果如图1所示，可以看出，本发明成功扩增得到水稻纹枯病菌Atg22蛋白编码基因的靶标片段Rsatg22，大小为296bp。

实施例2 Atg22蛋白编码基因的靶标片段Rsatg22在水稻纹枯病菌侵染水稻过程的表达分析

1、实验方法

Atg22蛋白编码基因的靶标片段Rsatg22在水稻纹枯病菌侵染水稻过程的荧光定量PCR分析，包括以下步骤：

S1.接种喷雾的制备

首先使用PDA平板(培养皿直径90mm，8mL PDA培养基)将本实验室保存的水稻纹枯病菌菌株GD118活化，黑暗条件下，28℃培养2d。之后使用灭菌后的刀片将带有真菌的PDA平板切割成边长约为1mm大小的正方形菌丝块，转移至锥形瓶中(含200mL PDB)，黑暗条件下，28℃，180r/min，震荡培养2d后，整瓶匀浆成液体，使OD₆₀₀为1.0，即可用于接种。

S2.水稻的种植和接种

分别使用10％的次氯酸钠与30％的双氧水对水稻种子(水稻品种:日本晴)进行消毒，再将种子置于无菌培养皿内，使用无菌水浸泡3d以上直至发芽，然后将发芽的种子转移至含有10cm无菌土的方盆(长：80cm；宽：40cm；高：15cm)内。接种选择水稻三叶一心期，在盆内无水干燥条件下使用S1中匀浆后的液体进行接种，每株水稻接种5mL，30℃，湿度90％以上利于发病。

S3.样品的荧光定量PCR分析

为了验证不同基因在水稻纹枯病菌侵染水稻过程中的表达量，选取了接种后的6个时间点，24h，48h，72h，96h，120h后，收集整株水稻为样品。使用TaKaRa植物总RNA提取试剂盒(code No.9769)进行不同时间的水稻样品总RNA的提取，具体方法同“实施例1S1”。利用TARAKA PrimeScript反转录试剂盒(code No.6210A)进行RNA反转录，具体方法同“实施例1S2”将反转录所得的cDNA产物稀释10倍后用于实时荧光定量PCR。利用Primer Premier5.0软件设计Atg22蛋白编码基因的靶标片段Rsatg22的荧光定量PCR引物，引物0281qPCRF:5'-ctccagcatggctctcgt-3'，如SEQ ID NO:9所示；引物0281qPCR R:5'-ttctttgttcgaagtgggacg-3'，如SEQ ID NO:10所示。引物的特异性通过凝胶电泳、测序和溶解曲线检验。试验使用Bio-Rad CFX荧光定量PCR仪，反应体系为20μL，其中包含10μL MIX、0.2μM上/下游引物、2μL cDNA模板和适量的纯水。每个样品进行三次技术重复。水稻纹枯病菌的内参基因使用GAPDH进行样品间的基因表达的均一化处理，引物GAPDH F：5'-ggtcggcaaagtcataccat-3'，如SEQ ID NO:11所示；引物GAPDH R：5'-tctgcgtccttcttggagata-3'，如SEQ ID NO:12所示。结果采用2^-ΔΔCt法进行分析。

2、实验结果

Atg22蛋白编码基因的靶标片段Rsatg22在水稻纹枯病菌侵染过程的基因表达分析结果如图2所示，可以看出，Atg22蛋白编码基因的靶标片段Rsatg22在水稻纹枯病菌侵染水稻的前期过程中被诱导，且随着时间延长表达量持续升高，表明该基因在水稻纹枯病菌与水稻的互作过程中可能起到关键作用。

实施例3 Atg22蛋白编码基因的靶标片段Rsatg22的dsRNA的合成和体外沉默实验

1、实验方法

S1.dsRNA的体外合成

使用T7 RNA Polymerase合成Atg22蛋白编码基因的靶标片段Rsatg22的dsRNA。通过在任一扩增引物的5'末端添加T7启动子序列，可以使用PCR将T7 RNA聚合酶启动子添加到任何DNA序列中。最小的T7 RNA聚合酶启动子序列是：5'-TAATACGACTCACTATAGG-3'。在上下游引物5'末端分别添加T7启动子序列，即上游引物T7-0281 F:5'-taatacgactcactataggatcgccacattcattccact-3'；如SEQ ID NO:13所示；下游引物T7-0281 R:5'-taatacgactcactatagggggttcagcatccaacagac-3'，如SEQ ID NO:14所示。以水稻纹枯病菌的cDNA为模板进行PCR扩增，得到dsRNA的模板，经过转录纯化后，得到Atg22蛋白编码基因的靶标片段Rsatg22的dsRNA。

S2.dsRNA对水稻纹枯病菌的体外沉默实验

从培养2d的水稻纹枯病菌PDA平板边缘取边长2mm正方形菌饼放入直径60mm的培养皿中(含有7mL PDB)，静置培养48h后，以500ng/mL加入dsRNA，并在0h、24h、48h、72h和96h收集菌丝样品，并使用TaKaRa植物RNA提取试剂盒提取总RNA，具体方法同“实施例1S1”每次处理重复三次，实验重复三次。

2、实验结果

dsRNA的核酸序列如SEQ ID NO：6所示。

dsRNA体外处理水稻纹枯病菌24、48、72和96h的RNA提取结果如图3所示，可以看出，各时间段样品提取出的RNA质量良好。

dsRNA体外处理水稻纹枯病菌0h、24h、48h、72h和96h的转录水平结果如图4所示，可以看出，Atg22蛋白编码基因的靶标片段Rsatg22的转录水平在24h有显著降低，并随着处理时间的增加持续降低，72h的沉默效率在80％以上，证明体外施用dsRNA处理病原菌沉默相关基因的表达是切实可行的。

实施例4 TRV2-Rsatg22沉默载体构建和转化烟草研究

1、实验方法

S1.载体构建及农杆菌转化

根据水稻纹枯病菌Atg22蛋白编码基因的靶标片段Rsatg22的序列，设计引物两端包含EcoRI和BamHI酶切位点的特异性引物，上游引物VIGS-0281F：5'-ccg gaattcccacattcattccacttactc-3'，如SEQ ID NO:15所示；下游引物VIGS-0281R：5'-cgc ggatccccgctcatagacacaatca-3'，如SEQ ID NO:16所示。VIGS载体信息图如图5所示。

以水稻纹枯病菌cDNA为模板，利用擎科公司高保真酶(code No.TP001)进行PCR扩增，将扩增产物回收后，和载体pYL156同时在37℃下双酶切5h。将酶切后的目的片段和载体利用T₄DNA连接酶，16℃过夜连接，将连接好的产物转化入E.coil DH5α感受态，测序确定无误后，扩繁提取质粒，保存备用。

S2.根癌农杆菌感受态的制备及电击转化

将根癌农杆菌单菌落接于4mL含Rif(25μg/mL)的LB液体培养基中，28℃，200r/min振荡培养2d。取培养液3mL的接种量转接至200mL LB培养液中，200r/min，28℃振荡培养至对数生长期(细胞浓度OD₆₀₀为0.55)。离心弃去废液，收集菌体。用预冷的无菌双蒸水将菌液重悬洗涤3次，后用2mL无菌预冷的10％w/v甘油重悬菌体。取100μL菌悬液于1.5mL离心管，-80℃保存备用。加3μL质粒于菌液中，轻轻混匀并转移至无菌预冷的电击杯中，电击后迅速加入1mL LB液体培养基，混匀并转移细胞至1.5mL的离心管中，在28℃摇床中200r/min培养2.5h；取100μL菌液涂布于含Rif(25μg/mL)和Kan(50μg/mL)的LB平板中，倒置放于28℃培养箱中培养2天，观察转化子生长情况，取未质粒DNA的农杆菌在同样电击条件下的结果作为对照。挑取单菌落使用pYL156载体引物进行PCR验证。上游引物PYL156 F:5'-aattcactgggagatgatacgctg-3'，如SEQ ID NO:17所示；下游引物PYL156 R:5'-cctatggtaagacaatgagtcggc-3'，如SEQ ID NO:18所示。

S3.农杆菌培养和烟草瞬时转化

农杆菌单克隆加入5mL的液体LB培养基(25μg/mL Rif和50μg/mL Kan)中，放于28℃摇床中进行200r/min过夜培养，将1mL菌液加入50mL LB(25μg/mL Rif和50μg/mL Kan)中，放于28℃摇床中进行200r/min振荡培养。当培养物O_D600到0.55时，6000rpm，5min低温离心收集菌体，弃去废液。将菌体重悬于注射基质(10mM MES、10mM MgCl₂、100μM乙酰丁香酮)中，使OD₆₀₀为0.9。把两种农杆菌菌株(TRV1与TRV2+靶基因片段)以1:1混合，室温静置4h，不要摇动。最后利用注射器将含有注射基质的农杆菌注射于最嫩的叶片中。

S4.致病力检测和生物量测定

从注射后的第10天起，本氏烟草的白化现象就非常明显，这表明了在本氏烟草体内VIGS载体已经产生出大量dsRNA，并发挥着干扰作用。因此，我们选择了从注射VIGS系列载体后的第10天，进行活体接种。对接菌后第6天(post-inoculation day，dpi)进行本氏烟草的病情指数统计，通过统计叶片病斑和凋萎叶片的数量进行致病力的检测。提取接种水稻纹枯病菌6d后本氏烟草(转基因植株和阴性对照)中部叶片的总DNA，以水稻纹枯病菌内转录间隔区ITS序列为靶标片段。上游引物Rs F:5'-gccttttctaccttaatttggcag-3'，如SEQID NO:19所示；下游引物Rs R:5'-gtgtgtaaattaagtagacagcaaatg-3'，如SEQ ID NO:20所示。同时以烟草actin基因为内参基因，上游引物EF1a:5'-tggtgtcctcaagcctggtat-3'，如SEQ ID NO:21所示；下游引物EF1b:5'-acgcttgagatccttaaccgc-3'，如SEQ ID NO:22所示。具体方法同“实施例2S3”结果采用2-^ΔΔCt法进行分析。

2、实验结果

本发明构建得到的TRV2-Rsatg22沉默载体的图谱如图6所示，可以看出，所构载体全长9931bp，经对比与实际测序结果相同。

本发明构建得到的TRV2-Rsatg22沉默载体转化至根癌农杆菌GV3101的菌落验证结果如图7所示，条带大小为718bp，条带单一明亮且大小正确，载体TRV2-Rsatg22已成功转进根癌农杆菌GV3101。

接种水稻纹枯病菌5d后的本氏烟草的表型如图8所示，可以看出，转基因烟草对病原菌的抗性明显提高，发病程度减弱，抗性增强。

接种水稻纹枯病菌5d后的本氏烟草的真菌生物量和靶基因转录水平分析结果如图9所示，可以看出，转基因阳性烟草的真菌生物量明显降低，仅为野生型的50％，转基因植物体内Atg22蛋白编码基因的靶标片段Rsatg22的表达量下降了约65％。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种水稻纹枯病菌Atg 22蛋白编码基因及其靶标片段Rsatg22和应用

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1947

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgagcaccc caaaaccttg tattcaggtt gccgctgcta aatatcatta tgagatgctg 60

gaatttaagc ccaggcctac tgtagctttg tccctgcccc acaccttcgt ggcactgcca 120

ccatcgcgag ttgtgatcga ctccagcatg gctctcgtgc ccaacacgaa cagttgtgct 180

cccgtcctgc ctgatgcggg actgaccgac caatctgcgt ctggacctga atcttcaacc 240

gatagtgacg agactgcggt gggacccact tacccaggcg aagatactcg tcccacttcg 300

aacaaagaac tccgggcctg gtatgcatac gcgtgggcgg ccgagcccta tgttgtagtc 360

gcaatcgcca cattcattcc acttactctc gaagctctcg cgcgcgaaaa cggacacctg 420

ctcggaaaac cagacgttcc atgtaccccc aaatcgttcc ccatacccat tccgggacca 480

gaacctggtc cacctcacac gttcccaaag acgccggccg cgtttttcaa gcccgatcca 540

aaccaatgta ttattcatct ccttggagtt cggatggcga gttcgagttt tgctatgtac 600

acgttttcca tcagtgtgct tttgcagagt ttagtgattg tgtctatgag cggcgcggcc 660

gatcatgttt tgggcagtgt atcgaccatg ttgtttatta ttgtcaagcc aggagcgtat 720

ccgcttgccg ctctgtggac catactctcc aacgttagct tcggcgcctc gtttgtcctg 780

ttgaatgcat ttctccctgt cctcgttcgg aatcacccga ctgtgcaatc tcaactcaag 840

tccagtctgt tggatgctga acccgactct gaatcggctc cgactgagag cacagcgctc 900

ctctcgtctc gagcctccgc gccgcctcct ttggttacag ccaccgcact cgcactctca 960

accaaaatat catcgacggg agttgcgatc gggtatctgg ctggcgcact tctccaggtc 1020

ttggctatat tcattatccg cgcgttcagc tccgcgccca tccttggact cgaagcgatc 1080

ttgttcattg tgggcgcttg gtgggctggg ttttccatat ttgtggcgct gtggatgagg 1140

ccccgtccgg gccctccttt gccccgggca gatgtgaagc cagacgaact tgtggatgag 1200

cggattgggt gggatgtaat tgtttatgct tggaagaaac tttggcgtac gatcaggctc 1260

gccggtcaat tgaaagacgt aatgctgttc ctcgctgcgt ggttctgcat gtctgatgga 1320

atcgctactg tgacctcgac cgcagtgttg ttcgccaaga ctgagttaca catggaacct 1380

gcctctctgg catctatgtc cgtaatcggg atggcatgtg gaatttctgg cgcacttttg 1440

tggcccgtca tctcgcgctt atcgtggctt aatctgacac cgcctcgcac agtacttttg 1500

tgcgtgtcaa tgatggcttg cgtccctgca tatggcctcc ttgggttctt tccaatcgtt 1560

cagcggatgg ggtggggtgg gttgactcat ccggctgaga tgtatggcgt aggtgcaatc 1620

tatggattcg cgatgagtgg ggtcagcgcg tatgctcgaa gtgtattcgg agagcttatc 1680

cctccgggaa gtgaaagcgc attgtttgcg ttatacgcaa ttacggataa gggctcgtct 1740

atatttggcc ccgctattgc aggattcatc acggacaaga cgggcaatat tcgctacgca 1800

ttttggttcc ttctagtact gttgctcatc ccgcttcccc ttttgggaat gattgatgtg 1860

cagcgtggta agcgcgatag ccgaaaggtg tcactcgacg cacttggtgt accagcaaat 1920

cagagcactg cagccatcgg acattaa 1947

<210> 2

<211> 2462

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgagcaccc caaaaccttg tattcaggtt gccgctgcta aatatcatta tgagatgctg 60

gaatttaagc ccaggcctac tgtagctttg tccctggtcc agtctcacta ctaatacgta 120

atcatgatca cctgaaagtt gtacgatgaa atagccccac accttcgtgg cactgccacc 180

atcgcgagtt gtgatcgact ccagcatggc tctcgtgccc aacacgaaca gttgtgctcc 240

cgtcctgcct gatgcgggac tgaccgacca atctggtaaa cccaataaac taatactcct 300

atgttcgttt tactcagaat attcccagcg tctggacctg aatcttcaac cgatagtgac 360

gagactgcgg tgggacccac ttacccaggc gaagatactc gtcccacttc gaacaaagaa 420

ctccgggcct ggtatgtatc tcattttcgg ctgctcaggc tagcccttac actactcgtg 480

gatcaggtat gcatacgcgt gggcggccga gccctatgtt gtagtcgcaa tcgccacatt 540

cattccactt actctcgaag ctctcgcgcg cgaaaacgga cacctgctcg gaaaaccaga 600

cgttccatgt acccccaaat cgttccccat acccattccg ggaccagaac ctggtccacc 660

tcacacgttc ccaaagacgc cggccgcgtt tttcaagccc gatccaaacc aatgtattat 720

tcatctcctt ggagttcgga tggcgagttc gagttttgct atgtacacgt tttccatcag 780

tgtgcttttg cagagtttag tgattgtgtc tatgagcggc gcggccgatc atggtgagtg 840

agctggacac atatttggct gtatgttatt tacgttatga ttaggttcgt atagaaagaa 900

attgttgtta ttttttgcag ttttgggcag tgtatcgacc atgttgttta ttattgtcaa 960

gccaggagcg tatccgcttg ccgctctgtg gaccatactc tccaacgtat gcacatctcg 1020

tcttccaact ttgcatttca actaataccc gcccgatagg ttagcttcgg cgcctcgttt 1080

gtcctgttga atgcatttct ccctgtcctc gttcggaatc acccgactgt gcaatctcaa 1140

ctcaagtcca gtctgttgga tgctgaaccc gactctgaat cggctccgac tgagagcaca 1200

gcgctcctct cgtctcgagc ctccgcgccg cctcctttgg ttacagccac cgcactcgca 1260

ctctcaacca aaatatcatc gacgggagtt gcgatcgggt atctggctgg cgcacttctc 1320

caggtcttgg ctatattcat tatccgcgcg ttcagctccg cgcccatcct tggactcgaa 1380

gcgatcttgt tcattgtggg cgcttggtgg gctgggtttt ccatatttgt ggcgctgtgg 1440

atgaggcccc gtccgggccc tcctttgccc cgggcagatg tgaagccaga cgaacttgtg 1500

gatgagcgga ttgggtggga tgtaattgtt tatgcttgga agaaactttg gcgtacgatc 1560

aggctcgccg gtcaattgaa agacgtaatg ctgttcctcg ctgcgtggtt ctgcatgtct 1620

gatgggtatg tttacctatt cctttctggc tctgtttcac tcaaaccaat gcccaataca 1680

gaatcgctac tgtgacctcg accgcagtgt tgttcgccaa gactgagtta cacatggaac 1740

ctgcctctct ggcatctatg tccgtaatcg ggatggcatg tggaatttct ggcgcacttt 1800

tgtggcccgt catctcgcgc ttatcgtggc ttaatctgac accgcctcgc acagtacttt 1860

tgtgcgtgtc aatgatggct tgcgtccctg catatgggta cggaataatg tctacctcgc 1920

tcactccttg gtttgctgac ctttgtgctg tatagcctcc ttgggttctt tccaatcgtt 1980

cagcggatgg ggtggggtgg gttgactcat ccggctgaga tgtatggcgt aggtgcaatc 2040

tatggattcg cgatgagtgg ggtcagcgcg tatgctcgaa gtgtattcgg agagcttatc 2100

cctccgggaa gtgaaagcgc attgtttgcg ttatacgcaa ttacggataa gggtgagata 2160

ttacatgcgt atcttaatat tttctaatac cttgataggc tcgtctatat ttggccccgc 2220

tattgcaggt acgtttctta cagcccagcg cttgtactgt tctaaccgga cttaaaggat 2280

tcatcacgga caagacgggc aatattcgct acgcattttg gttccttcta gtactgttgc 2340

tcatcccgct tccccttttg ggaatgattg atgtgcagcg tggtaagcgc gatagccgaa 2400

aggtgtcact cgacgcactt ggtgtaccag caaatcagag cactgcagcc atcggacatt 2460

aa 2462

<210> 3

<211> 1947

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgagcaccc caaaaccttg tattcaggtt gccgctgcta aatatcatta tgagatgctg 60

gaatttaagc ccaggcctac tgtagctttg tccctgcccc acaccttcgt ggcactgcca 120

ccatcgcgag ttgtgatcga ctccagcatg gctctcgtgc ccaacacgaa cagttgtgct 180

cccgtcctgc ctgatgcggg actgaccgac caatctgcgt ctggacctga atcttcaacc 240

gatagtgacg agactgcggt gggacccact tacccaggcg aagatactcg tcccacttcg 300

aacaaagaac tccgggcctg gtatgcatac gcgtgggcgg ccgagcccta tgttgtagtc 360

gcaatcgcca cattcattcc acttactctc gaagctctcg cgcgcgaaaa cggacacctg 420

ctcggaaaac cagacgttcc atgtaccccc aaatcgttcc ccatacccat tccgggacca 480

gaacctggtc cacctcacac gttcccaaag acgccggccg cgtttttcaa gcccgatcca 540

aaccaatgta ttattcatct ccttggagtt cggatggcga gttcgagttt tgctatgtac 600

acgttttcca tcagtgtgct tttgcagagt ttagtgattg tgtctatgag cggcgcggcc 660

gatcatgttt tgggcagtgt atcgaccatg ttgtttatta ttgtcaagcc aggagcgtat 720

ccgcttgccg ctctgtggac catactctcc aacgttagct tcggcgcctc gtttgtcctg 780

ttgaatgcat ttctccctgt cctcgttcgg aatcacccga ctgtgcaatc tcaactcaag 840

tccagtctgt tggatgctga acccgactct gaatcggctc cgactgagag cacagcgctc 900

ctctcgtctc gagcctccgc gccgcctcct ttggttacag ccaccgcact cgcactctca 960

accaaaatat catcgacggg agttgcgatc gggtatctgg ctggcgcact tctccaggtc 1020

ttggctatat tcattatccg cgcgttcagc tccgcgccca tccttggact cgaagcgatc 1080

ttgttcattg tgggcgcttg gtgggctggg ttttccatat ttgtggcgct gtggatgagg 1140

ccccgtccgg gccctccttt gccccgggca gatgtgaagc cagacgaact tgtggatgag 1200

cggattgggt gggatgtaat tgtttatgct tggaagaaac tttggcgtac gatcaggctc 1260

gccggtcaat tgaaagacgt aatgctgttc ctcgctgcgt ggttctgcat gtctgatgga 1320

atcgctactg tgacctcgac cgcagtgttg ttcgccaaga ctgagttaca catggaacct 1380

gcctctctgg catctatgtc cgtaatcggg atggcatgtg gaatttctgg cgcacttttg 1440

tggcccgtca tctcgcgctt atcgtggctt aatctgacac cgcctcgcac agtacttttg 1500

tgcgtgtcaa tgatggcttg cgtccctgca tatggcctcc ttgggttctt tccaatcgtt 1560

cagcggatgg ggtggggtgg gttgactcat ccggctgaga tgtatggcgt aggtgcaatc 1620

tatggattcg cgatgagtgg ggtcagcgcg tatgctcgaa gtgtattcgg agagcttatc 1680

cctccgggaa gtgaaagcgc attgtttgcg ttatacgcaa ttacggataa gggctcgtct 1740

atatttggcc ccgctattgc aggattcatc acggacaaga cgggcaatat tcgctacgca 1800

ttttggttcc ttctagtact gttgctcatc ccgcttcccc ttttgggaat gattgatgtg 1860

cagcgtggta agcgcgatag ccgaaaggtg tcactcgacg cacttggtgt accagcaaat 1920

cagagcactg cagccatcgg acattaa 1947

<210> 4

<211> 648

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Ser Thr Pro Lys Pro Cys Ile Gln Val Ala Ala Ala Lys Tyr His

1 5 10 15

Tyr Glu Met Leu Glu Phe Lys Pro Arg Pro Thr Val Ala Leu Ser Leu

20 25 30

Pro His Thr Phe Val Ala Leu Pro Pro Ser Arg Val Val Ile Asp Ser

35 40 45

Ser Met Ala Leu Val Pro Asn Thr Asn Ser Cys Ala Pro Val Leu Pro

50 55 60

Asp Ala Gly Leu Thr Asp Gln Ser Ala Ser Gly Pro Glu Ser Ser Thr

65 70 75 80

Asp Ser Asp Glu Thr Ala Val Gly Pro Thr Tyr Pro Gly Glu Asp Thr

85 90 95

Arg Pro Thr Ser Asn Lys Glu Leu Arg Ala Trp Tyr Ala Tyr Ala Trp

100 105 110

Ala Ala Glu Pro Tyr Val Val Val Ala Ile Ala Thr Phe Ile Pro Leu

115 120 125

Thr Leu Glu Ala Leu Ala Arg Glu Asn Gly His Leu Leu Gly Lys Pro

130 135 140

Asp Val Pro Cys Thr Pro Lys Ser Phe Pro Ile Pro Ile Pro Gly Pro

145 150 155 160

Glu Pro Gly Pro Pro His Thr Phe Pro Lys Thr Pro Ala Ala Phe Phe

165 170 175

Lys Pro Asp Pro Asn Gln Cys Ile Ile His Leu Leu Gly Val Arg Met

180 185 190

Ala Ser Ser Ser Phe Ala Met Tyr Thr Phe Ser Ile Ser Val Leu Leu

195 200 205

Gln Ser Leu Val Ile Val Ser Met Ser Gly Ala Ala Asp His Val Leu

210 215 220

Gly Ser Val Ser Thr Met Leu Phe Ile Ile Val Lys Pro Gly Ala Tyr

225 230 235 240

Pro Leu Ala Ala Leu Trp Thr Ile Leu Ser Asn Val Ser Phe Gly Ala

245 250 255

Ser Phe Val Leu Leu Asn Ala Phe Leu Pro Val Leu Val Arg Asn His

260 265 270

Pro Thr Val Gln Ser Gln Leu Lys Ser Ser Leu Leu Asp Ala Glu Pro

275 280 285

Asp Ser Glu Ser Ala Pro Thr Glu Ser Thr Ala Leu Leu Ser Ser Arg

290 295 300

Ala Ser Ala Pro Pro Pro Leu Val Thr Ala Thr Ala Leu Ala Leu Ser

305 310 315 320

Thr Lys Ile Ser Ser Thr Gly Val Ala Ile Gly Tyr Leu Ala Gly Ala

325 330 335

Leu Leu Gln Val Leu Ala Ile Phe Ile Ile Arg Ala Phe Ser Ser Ala

340 345 350

Pro Ile Leu Gly Leu Glu Ala Ile Leu Phe Ile Val Gly Ala Trp Trp

355 360 365

Ala Gly Phe Ser Ile Phe Val Ala Leu Trp Met Arg Pro Arg Pro Gly

370 375 380

Pro Pro Leu Pro Arg Ala Asp Val Lys Pro Asp Glu Leu Val Asp Glu

385 390 395 400

Arg Ile Gly Trp Asp Val Ile Val Tyr Ala Trp Lys Lys Leu Trp Arg

405 410 415

Thr Ile Arg Leu Ala Gly Gln Leu Lys Asp Val Met Leu Phe Leu Ala

420 425 430

Ala Trp Phe Cys Met Ser Asp Gly Ile Ala Thr Val Thr Ser Thr Ala

435 440 445

Val Leu Phe Ala Lys Thr Glu Leu His Met Glu Pro Ala Ser Leu Ala

450 455 460

Ser Met Ser Val Ile Gly Met Ala Cys Gly Ile Ser Gly Ala Leu Leu

465 470 475 480

Trp Pro Val Ile Ser Arg Leu Ser Trp Leu Asn Leu Thr Pro Pro Arg

485 490 495

Thr Val Leu Leu Cys Val Ser Met Met Ala Cys Val Pro Ala Tyr Gly

500 505 510

Leu Leu Gly Phe Phe Pro Ile Val Gln Arg Met Gly Trp Gly Gly Leu

515 520 525

Thr His Pro Ala Glu Met Tyr Gly Val Gly Ala Ile Tyr Gly Phe Ala

530 535 540

Met Ser Gly Val Ser Ala Tyr Ala Arg Ser Val Phe Gly Glu Leu Ile

545 550 555 560

Pro Pro Gly Ser Glu Ser Ala Leu Phe Ala Leu Tyr Ala Ile Thr Asp

565 570 575

Lys Gly Ser Ser Ile Phe Gly Pro Ala Ile Ala Gly Phe Ile Thr Asp

580 585 590

Lys Thr Gly Asn Ile Arg Tyr Ala Phe Trp Phe Leu Leu Val Leu Leu

595 600 605

Leu Ile Pro Leu Pro Leu Leu Gly Met Ile Asp Val Gln Arg Gly Lys

610 615 620

Arg Asp Ser Arg Lys Val Ser Leu Asp Ala Leu Gly Val Pro Ala Asn

625 630 635 640

Gln Ser Thr Ala Ala Ile Gly His

645

<210> 5

<211> 283

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccacattcat tccacttact ctcgaagctc tcgcgcgcga aaacggacac ctgctcggaa 60

aaccagacgt tccatgtacc cccaaatcgt tccccatacc cattccggga ccagaacctg 120

gtccacctca cacgttccca aagacgccgg ccgcgttttt caagcccgat ccaaaccaat 180

gtattattca tctccttgga gttcggatgg cgagttcgag ttttgctatg tacacgtttt 240

ccatcagtgt gcttttgcag agtttagtga ttgtgtctat gag 283

<210> 6

<211> 539

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

uaauacgacu cacuauagga ucgccacauu cauuccacuu acucucgaag cucucgcgcg 60

cgaaaacgga caccugcucg gaaaaccaga cguuccaugu acccccaaau cguuccccau 120

acccauuccg ggaccagaac cugguccacc ucacacguuc ccaaagacgc cggccgcguu 180

uuucaagccc gauccaaacc aauguauuau ucaucuccuu ggaguucgga uggcgaguuc 240

gaguuuugcu auguacacgu uuuccaucag ugugcuuuug cagaguuuag ugauuguguc 300

uaugagcggc gcggccgauc auguuuuggg caguguaucg accauguugu uuauuauugu 360

caagccagga gcguauccgc uugccgcucu guggaccaua cucuccaacg uuagcuucgg 420

cgccucguuu guccuguuga augcauuucu cccuguccuc guucggaauc acccgacugu 480

gcaaucucaa cucaagucca gucuguugga ugcugaaccc ccuauaguga gucguauua 539

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ccacattcat tccacttact c 21

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ccgctcatag acacaatca 19

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ctccagcatg gctctcgt 18

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ttctttgttc gaagtgggac g 21

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggtcggcaaa gtcataccat 20

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tctgcgtcct tcttggagat a 21

<210> 13

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

taatacgact cactatagga tcgccacatt cattccact 39

<210> 14

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

taatacgact cactataggg ggttcagcat ccaacagac 39

<210> 15

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ccggaattcc cacattcatt ccacttactc 30

<210> 16

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

cgcggatccc cgctcataga cacaatca 28

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

aattcactgg gagatgatac gctg 24

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

cctatggtaa gacaatgagt cggc 24

<210> 19

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gccttttcta ccttaatttg gcag 24

<210> 20

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

gtgtgtaaat taagtagaca gcaaatg 27

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

tggtgtcctc aagcctggta t 21

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

acgcttgaga tccttaaccg c 21

Claims (5)

1.一种水稻纹枯病菌Atg22蛋白编码基因或其靶标片段Rsatg22在防治水稻纹枯病菌或制备水稻纹枯病菌防治制剂中的应用，其特征在于，所述水稻纹枯病菌Atg22蛋白编码基因全长cDNA序列如SEQ ID NO：1～2所示，所述靶标片段Rsatg22其核苷酸序列如SEQ IDNO：5所示。

2.一种水稻纹枯病菌Atg22蛋白编码基因或其靶标片段Rsatg22在构建抗水稻纹枯病菌转基因植物中的应用，其特征在于，所述水稻纹枯病菌Atg22蛋白编码基因全长cDNA序列如SEQ ID NO：1～2所示，所述靶标片段Rsatg22其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

3.一种水稻纹枯病菌防治制剂，其特征在于，含有能够抑制序列如SEQ ID NO：1～2所示任一所述编码基因表达的物质。

4.根据权利要求3所述的制剂，其特征在于，所述物质为dsRNA或包含靶标片段Rsatg22的重组载体或重组菌。

5.根据权利要求4所述的制剂，其特征在于，所述dsRNA的核酸序列如SEQ ID NO：6所示。

Images