CN100587058C - 一种莲子草假格孢菌株及其生防制剂的制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种莲子草假格孢菌株及其生防制剂的制备方法和应用，该菌株的保藏号为CGMCC.NO.1824。其生防制剂的制备方法是，将保藏菌种移殖于试管PDA斜面培养基中进行活化，将活化后的莲子草假格孢菌移入PDA培养基平板上培养后，然后取菌饼接种到液体培养基中，振荡培养后获得菌丝，并用电动搅拌器搅拌获得含菌丝片断和培养滤液的混合液体菌剂，或继续加工成固体菌剂。上述的生防制剂的应用是：将所述的生防制剂稀释后均匀地喷雾在空心莲子草叶面，每平方米喷雾用量为稀释后的菌液100ml。其优点是：sf 193菌株制备的生防制剂对空心莲子草均有良好的防除效果；对人畜安全，对环境没有污染。

Description

一种莲子草假格孢菌株及其生防制剂的制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种莲子草假格孢(Nimbya alternantherae)sf 193菌株，以及利用该菌株制备的生防制剂和该生防制剂的应用。属于利用有益微生物对莲子草进行生物防治的领域。

背景技术

空心莲子草(Alternanthera philoxeroides Griseb)又名喜旱莲子草，俗称水花生，为苋科(Amaranthaceae)，莲子草属(Alternanthera)，是多年生宿根草本植物。原产于巴西、阿根廷等地，现已遍及美洲、澳洲、亚洲及非洲，是一种世界性恶性杂草。空心莲子草是20世纪30年代末随日军侵华引种至我国作为牧草栽培的，20世纪50年代，我国南方一些省市将空心莲子草作为猪羊饲料推广，随后又被进一步引入我国长江流域及南方各省。20世纪80年代以后，空心莲子草自然扩展成为水域和陆地两个生态类型的重要植被。空心莲子草靠营养器官进行无性繁殖，由地下(水下)根茎越冬，适应性很强，入侵某一植被后呈现出斑块状镶嵌体，由一个基点不断的克隆生长。由于这种繁殖方式，使得空心莲子草入侵某一生境后能够快速形成庞大的植物种群。我国空心莲子草主要分布于北纬44°以南、东经97°以东的海拔低、气候相对较暖湿的地区，几乎遍及黄河流域和南方各省市。近年来，发现空心莲子草体内含有皂甙等有毒物质，能传播家畜寄生虫，猪羊不爱取食，因此，农民现已不再将其作为饲料利用。由于大面积扩散蔓延，空心莲子草已对种植、水产、水利、航运、物种资源、生态环境等造成极为不利的影响，成为我国亟待继续防除的重要外来恶性杂草。

空心莲子草生命力强，地上匍匐茎、根状茎和根系都具有分株能力，因此生长繁殖非常迅速，是一种入侵性很强的杂草，侵入后通过自然资源竞争，导致周边其它植物局部绝灭，对生态系统造成不可逆转的破坏。空心莲子草主要在农田、河道、沟渠、鱼塘等环境中生长危害。空心莲子草在农田中大量生长，与农作物争夺水分、肥料、阳光和生长空间，导致农作物严重减产。空心莲子草在鱼塘等水生环境中生长迅速，其覆盖在水面会影响沉水植物的光合作用；生长在水面的空心莲子草腐败后污染水质，水体中生物耗氧升高，鱼虾等水生生物会因缺乏溶解氧而窒息死亡，腐败后水中有机质含量增加，促进有害微生物生长或产生有毒物质，从而导致鱼病发生。空心莲子草在河道和沟渠中的生长会堵塞航道，限制水流，增加沉积，对水上运输和农田灌溉造成极为不利的影响。空心莲子草在路边、草坪、居民区等地生长蔓延，影响环境美观和卫生，增加草坪养护成本。空心莲子草为蚊蝇、人畜共患寄生虫等害虫滋生提供场所，危害人类健康。

目前空心莲子草防除方面有以下几种对策：

1、化学除草剂防除。目前常用的化学除草剂有草甘膦、使它隆和复配剂水花生净。但是这些除草剂都有它们的不足之处。草甘膦对空心莲子草地上部分的杀灭作用较好，但抑杀作用不明显；使它隆有效控制空心莲子草时间较长，但根除不彻底；水花生净因含甲磺隆，作物易产生药害，使用时受到限制。另外，在水面防除时，易污染水质，以及空心莲子草腐败后会导致水中有害微生物和有毒物质的产生。

2、机械或人工打捞。国内已有一些水域杂草打捞机，在不能使用化学除草剂，同时专食性昆虫种群尚未建立的情况下，使用打捞机清除水域、航道的空心莲子草是最有效的办法。不适宜打捞机的区域可采用人工打捞。这种方式，往往需要投入大量的人力物力。

3、生物防除。1964年美国南部各州、1977年澳大利亚悉尼等地分别引进曲纹叶甲(Agasicles hygrophila Selman & Vogt)防治空心莲子草获得成功。我国1987年中国农科院生防所从美国引进曲纹叶甲，先后已在重庆、广西、福建等地建立种群，在水域空心莲子草的防除上取得初步成功。但是，曲纹叶甲在我国五岭以北地区难以自然越冬。除了曲纹叶甲，我国还发现虾钳披龟甲(Cassida piperata Hope)是嗜食空心莲子草的一种狭食性昆虫，但是它只取食空心莲子草上部幼嫩部分，不取食茎秆。在利用微生物防除空心莲子草方面，国内向梅梅等人发现莲子草假格孢(Nimbya alternantherae)的代谢产物对空心莲子草有控制作用，万佐玺等人发现链格孢菌(Altermaria alternate Keissler)的毒素对空心莲子草有很强的致病作用。目前利用空心莲子草相关致病菌进行防治未见报道。

发明内容

本发明的目的在于：针对外来入侵恶性杂草-空心莲子草生长蔓延快，对农业、水产、运输业生产危害大，在防除空心莲子草中采用化学除草剂防除易于造成污染，机械或人工打捞往往需要投入大量的人力物力，缺乏安全、有效措施的实际情况，提出一种对空心莲子草防除效果好、对人畜安全的生防制剂、该制剂的生产方法及其该制剂的用途。

本发明的目的是这样实现的：一种莲子草假格孢(Nimbyaalternantherae)sf 193菌株，其特征在于：保藏号为CGMCC.NO.1824的菌株，菌落在马铃薯琼脂培养基上，25℃10天，直径达77～78mm，灰褐色，絮状；培养基内菌丝黄褐色；菌落反面黄褐色；菌丝无色至浅褐色，多隔，简单分枝，直径2.0～3.4μm；分生孢子梗褐色，单生，与菌丝分化不明显；分生孢子链生，浅黄褐色，倒棒状，表面光滑，单细胞或6～9个细胞，18.5～60.5(-95)×6.4～8.6(-18.7)μm，喙柱状。

一种含有保藏号为CGMCC.NO.1824的莲子草假格孢(Nimbyaalternantherae)sf 193菌株的生防制剂的制备方法，其特征在于：将莲子草假格孢(Nimbya alternantherae)的保藏菌种sf 193移殖于试管PDA斜面培养基中进行活化，将活化后的莲子草假格孢移入PDA培养基平板上，28℃培养5～7天，用灭菌打孔器在菌落边缘取直径7mm的菌饼，接种到液体培养基中，每100ml液体培养基中接种3块菌饼，置于28±2℃、130r/min条件下振荡培养4～5天，可获得湿重为7～9克的菌丝，用电动搅拌器搅拌3min，电动搅拌器的转速2500r/min，获得含菌丝片断和培养滤液的混合液体菌剂。

在上述生防制剂的制备方法中：所述的PDA培养基的配方为：在1000ml培养基中：去皮马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂18～20g，pH6.8～7.2，水适量；所述的液体培养基的配方为：在1000ml培养基中：去皮马铃薯50g，酵母膏1g，蔗糖10g，黄豆粉5g，淀粉5g，玉米粉5g，碳酸钙1.5g，水适量。其中：所述PDA培养基是这样配制的：称取去皮马铃薯，放入1000ml水中，煮沸后温火煮20分钟，用双层纱布过滤获得马铃薯汁液，加入蔗糖和琼脂，加热至琼脂溶化，补足体积至1000ml，调整pH至6.8～7.2，适当冷却后封装到试管和三角瓶中，试管中的装量为试管的1/5～1/6，三角瓶中装量为1/3～1/4后，用塞子塞好试管口和三角瓶口，121℃湿热灭菌30分钟，趁热取出试管摆好斜面至冷却后备用；所述液体培养基是这样配制的：称取去皮马铃薯，用电动搅拌器搅拌5min，电动搅拌器的转速2500r/min，捣碎后加入酵母膏、蔗糖、黄豆粉、淀粉、玉米粉、碳酸钙，用水补足体积至1000ml，调整pH至6.8～7.2。然后分装，250ml的三角瓶装培养液100ml，用棉花塞塞好瓶口，121℃湿热灭菌30分钟，冷却后备用。

所述生防制剂的制备方法，还可以将搅拌后获得的混合液体菌液静置12～24小时，用滤网过滤获得菌丝片断，接入事先灭菌处理过的固体培养基，充分搅拌，置入风干或30℃烘干后粉碎过40～60目筛，获得固体菌剂，固体菌剂中的含菌量为0.8～1g/g。

在上述生防制剂的制备方法中：所述的固体培养基为：黄豆粉，淀粉，玉米粉，碳酸氢钙，它们的质量配比为：0.5∶0.5∶1.0∶8。所述固体培养基是这样配制的：取黄豆粉，淀粉，玉米粉，碳酸氢钙装入密封的铁箱中168℃干热灭菌1小时，冷却后备用。

在所述的生防制剂的制备方法中：液体菌剂或固体菌剂中加入防腐剂和助剂，所述的防腐剂为苯甲酸，防腐剂的用量为0～0.5％，所述的助剂为土温100，助剂的用量为0～0.5％。

一种上述的生防制剂的应用，其特征在于：将所述的生防制剂稀释后均匀地喷雾在空心莲子草叶面，每平方米喷雾用量为稀释后的菌液100ml。

在生防制剂的应用中：将所述的将生防制剂稀释是指：将液体菌剂1∶10倍稀释，或将固体菌剂1∶50倍稀释并充分搅拌。

本发明的优点在于：由于莲子草假格孢(Nimbya alternantherae)sf193对空心莲子草有很强的致病力强，该菌株制备的生防制剂对各种生育期的空心莲子草均有良好的防除效果；对人畜安全，对环境没有污染，对绝大多数同期生长的周边植物的正常生长没有影响。

具体实施方式

实施例1：

莲子草假格孢(Nimbya alternantherae)sf 193菌株的分离过程

在江苏仪征、常州、南京农业大学、江苏省农科院和广西南宁等地采集发病的空心莲子草叶片、茎干，将采集到的材料在流水下冲洗干净，自来水浸泡2-3小时后取出。取有明显病斑的茎杆和叶片，在病健交界处剪5mm²的小块叶片(茎杆)组织，用75％酒精浸泡30秒，0.1％升汞3-5分钟，无菌水换洗4次，移入PDA平板上培养。28℃培养3天后，挑取叶片(茎杆)组织边缘未污染的菌丝或菌落，进行再次分离。菌株编号整理，移入斜面培养。

扩繁后，各个分离菌株分别取直径6mm的菌饼，接种于PD培养液中，每100mL接种3块。28℃130r/min培养5天。用搅拌机高速搅拌3分钟，原液稀释5倍后用毛刷蘸取菌液均匀涂布于健康的空心莲子草叶片上。每个分离菌株接种6～8片叶子。设无菌水处理为对照。接种后套袋保湿24小时。3天后调查发病情况(参见表1)。

分级标准：

0级    叶片上无病斑；

1级    叶片上1-4个病斑，不黄化；

2级    叶面病斑覆盖率小于20％，不黄化；

3级    叶面病斑覆盖率小于40％，不黄化；

4级    叶面病斑覆盖率小于60％，病斑密集，局部黄化；

5级    叶面病斑覆盖率大于80％，病斑密布连成大面积坏死斑；

6级    叶片呈火烧状卷曲枯死或脱落

表1、分离真菌菌株的致病力情况

采样地	0级	1级	2级	3级	4级	5级	6级	总计
									农科院	35	26	15	15	7	2	0	100
南农	14	11	5	2	1	0	0	33
									仪征	31	11	9	7	4	4	2	68
常州	24	8	5	4	2	3	1	47
									南宁	0	31	5	6	5	0	0	47
总计	104	87	39	34	19	9	3	295

根据分离真菌菌株的致病力情况，筛选出一个致病力强的真菌菌株——莲子草假格孢(Nimbya alternantherae)sf 193，该菌株的基本特征是：将菌落在马铃薯琼脂培养基上，25℃10天，直径达77～78mm，灰褐色，絮状。培养基内菌丝黄褐色；菌落反面黄褐色；菌丝无色至浅褐色，多隔，简单分枝，直径2.0～3.4μm；分生孢子梗褐色，单生，与菌丝分化不明显；分生孢子链生，浅黄褐色，倒棒状，表面光滑，单细胞或6～9个细胞，18.5～60.5(-95)×6.4～8.6(-18.7)μm，喙柱状。

该菌株由江苏省农业科学院采用斜面法(短期)和冷冻干燥法(长期)保藏菌种，为进一步研究提供保藏菌种。

该菌株经过中国科学院微生物研究所鉴定，该菌株属于假格孢属(Nimbya)，分类命名为莲子草假格孢(Nimbya alternantherae)。

该菌株已于2006年09月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC.NO.1824。

实施例2：

莲子草假格孢(Nimbya alternantherae)sf 193菌株生防制剂(液体菌剂和固体菌剂)在配制过程中涉及的各种培养基的配制

a、试管PDA斜面、培养皿PDA平板培养基的配制：

称取去皮马铃薯200g，放入1000ml水中，煮沸后温火煮20分钟，用双层纱布过滤获得马铃薯汁液，加入蔗糖20g和琼脂18～20g，加热至琼脂溶化，补足体积至1000ml，调整pH至6.8～7.2，适当冷却后封装到试管和三角瓶中，试管中的装量为试管的1/5～1/6，三角瓶中装量为1/3～1/4后，用塞子塞好试管口和三角瓶口，121℃湿热灭菌30分钟，趁热取出试管摆好斜面至冷却后备用。

b、液体培养基的配制：

称取去皮马铃薯50g，用电动搅拌器搅拌5min(2500r/min)捣碎，加入酵母膏1g，蔗糖10g，黄豆粉5g，淀粉5g，玉米粉5g，碳酸钙1.5g，用水补足体积至1000ml，调整pH至6.8～7.2。然后分装，250ml三角瓶装培养液100ml，用棉花塞塞好瓶口，121℃湿热灭菌30分钟，冷却后备用。

c、固体培养基的配制：

取黄豆粉，淀粉，玉米粉，碳酸氢钙，它们的质量配比为：0.5∶0.5∶1.0∶8，装入密封的铁箱中168℃干热灭菌1小时，冷却后备用。

实施例3：

莲子草假格孢(Nimbya alternantherae)sf 193菌株的液体生防制剂(下称：sf 193液体菌剂)的制备与使用

本发明采用的莲子草假格孢(Nimbya alternantherae)sf 193菌株是由江苏省农业科学院利用斜面法(短期)的保藏菌种。

(1)、菌种活化：

在斜面保藏的菌种中挑取一块菌落移殖与PDA平板上，在28±2℃条件下培养5-7天后备用。

(2)、液体生防制剂的制备：

用直径为7mm的灭菌打孔器在生长在PDA平板上的sf 193菌落边缘打孔，取直径7mm的菌饼接种到PD培养液中，每个装有100ml液体培养基的250ml的三角瓶接种3块菌饼，置于28±2℃、130r/min条件下振荡培养4-5天(可获得湿重为7～9g的菌丝)，用电动搅拌器搅拌3min(2500r/min)，获得含菌丝片断和培养滤液的(混合)液体菌液，液体菌剂中的含菌量为70～90mg/ml。

(3)、液体生防制剂的使用：

将液体生防制剂按1∶10倍稀释，均匀地喷雾在空心莲子草叶面，每平方米喷雾用量为稀释后的菌液100ml。

实施例4：

莲子草假格孢(Nimbya alternantherae)sf 193菌株的固体生防制剂(下称：sf 193固体菌剂)的制备与使用

(1)、固体生防制剂的制备：

将实施例3中振荡培养4～5天、搅拌后获得的液体菌液静置12～24小时，用滤网过滤获得菌丝片断，接入事先灭菌处理过的固体培养基，菌丝片断(湿重)与固体培养基之间的质量配比为1∶2，充分搅拌，风干或30℃烘干后粉碎过40～60目筛，获得固体菌剂。固体菌剂中的含菌量为500mg/g。

(2)、固体生防制剂的使用：

将固体生防制剂按1∶50倍用水稀释，按照土温100与固体菌剂稀释液的质量比为1∶1500加入表面活性剂土温100，充分搅拌后均匀地喷雾在空心莲子草叶面，每平方米喷雾用量为稀释后的菌液100ml。

实施例5：

不同稀释倍数的生防制剂对空心莲子草的防除效果

采集健康空心莲子草叶片，洗净，无菌水润洗2次；取4片叶片浸泡在100ml按一定比例稀释(1∶5-1∶100)sf 193液体菌剂中，浸泡1小时后取出，放在铺有灭菌滤纸的培养皿中，每皿加10ml无菌水保湿。每个处理重复3次，设浸泡无菌水处理为对照。28℃下光照培养3天后调查发病情况(室内生物测定的方法)。选择相同生境下生长旺盛的、无病斑的空心莲子草作为田间试验小区，小区面积1m²。使用常规手动喷雾器进行喷雾防除。使用sf 193液体菌剂稀释倍数分别为1∶5、1∶10、1∶25、1∶50、1∶100，用量均为100ml/m²，每处理重复3次，设无菌水处理为对照。7天后调查发病情况(田间小区试验方法)。

Sf 193液体菌剂不同稀释倍数的菌液对空心莲子草的防除效果有显著差异(见表2)。室内生物测定的防除效果略好于田间小区试验的防除效果，但二者的防除效果趋势是完全一致的。由此可见，在室内生物测定时最佳菌液稀释倍数为1∶25，在田间试验时最佳菌液稀释倍数为1∶10。在田间试验过程中观察到：当sf193液体菌剂稀释倍数为1∶10，空心莲子草发病严重，生防菌株-莲子草假格孢(Nimbya alternantherae)sf 193能够导致空心莲子草叶片绝大部分脱落，茎杆上密布病斑。处理15天后叶片新生率很低，死亡率很高。由此可见，利用莲子草假格孢(Nimbyaalternantherae)sf 193菌株制备的生防制剂对空心莲子草有良好的防除效果。

表2、生防制剂(sf 193液体菌剂)不同稀释倍数对空心莲子草的防除效果

处理	5倍	10倍	25倍	50倍	100倍	CK
							室内生物测定	100	100	95.8	85.2	76.9	0
田间小区试验	90.2	88.4	69.3	45.8	42.4	0

注：数字表示的是病情指数

实施例6：

莲子草假格孢(Nimbya alternantherae)sf 193菌株采用不同接种体对空心莲子草的防除效果

莲子草假格孢(Nimbya alternantherae)sf 193菌株采用接种体实验设置了混合液、菌丝片断悬浮液和培养滤液三种处理。其中：取培养3d的菌丝片断和培养滤液作为混合液；含菌丝片断和培养滤液的混合液10000r/min离心15分钟后，上清液用8层纱布过滤两次作为培养滤液；离心沉淀的菌丝片断用无菌水(与上清液等体积)稀释作为菌丝片断悬浮液。实验中，采集健康的空心莲子草叶片，洗净，无菌水润洗2次。在上述三种接种体(100ml)中分别浸泡健康的空心莲子草4片，浸泡1小时后取出，放在铺有灭菌滤纸的培养皿中，每皿加10ml无菌水保湿。每个处理重复3次，设无菌水处理为对照。28℃下光照培养3天后调查发病情况(室内生物测定的方法)。选择相同生境下生长旺盛的、无病空心莲子草作为田间试验小区，小区面积1m²。使用常规手动喷雾器进行喷雾防除。三种接种体的稀释倍数为1∶10，用量均为100ml/m²，每处理重复3次，设无菌水处理为对照。7天后调查发病情况(田间小区试验方法)。试验结果表明(见表3)，用混合液和菌丝悬浮液接种的防除效果较好，用培养滤液接种的没有防除效果。这说明生防菌株-莲子草假格孢(Nimbyaalternantherae)sf 193的培养滤液在sf 193侵染空心莲子草导致发病死亡的过程中基本不起作用，对空心莲子草有毒性的活性物质存在于莲子草假格孢(Nimbya alternantherae)sf 193菌株的细胞内。

表3、生防制剂(sf 193液体菌剂)不同接种物对空心莲子草的防除效果

处理	混合液	菌丝片断悬浮液	培养滤液	CK
					室内生物测定	94.87	94.43	0	0
田间小区试验	95.0	95.0	0	0

注：数字表示的是病情指数

实施例7：

莲子草假格孢(Nimbya alternantherae)sf 193菌株生防制剂——sf193液体菌剂对不同生育期的空心莲子草的防除效果

将生防制剂sf 193液体菌剂1∶10倍稀释，均匀地喷雾在不同生育期空心莲子草叶面，每平方米喷雾用量为稀释后的菌液100ml，对空心莲子草不同生育期喷施都有很好的除草效果(见表4)。由于在小苗期喷雾菌液后，空心莲子草叶片迅速死亡但是新叶大量长出，长势恢复较快，所以防除效果相对差些；在大苗期喷雾菌液后，由于空心莲子草快速生长期已过，生长势已经相对较弱，叶片死亡率高、新生率低，长势较难恢复，所以防除效果相对好些。相比之下，大苗期的防除效果要比小苗期的除草效果更好，持续时间更长。

表4、生防制剂(sf 193液体菌剂)对不同生育期的空心莲子草的防除效果

处理时间	大苗期(100天)	中苗期(60天)	小苗期(20天)
				6月份	84.4a	82.5a	75.6b
7月份	89.2a	88.3a	76.6b
				8月份	90.2a	88.4a	78.9b

注：数字表示的是病情指数；a、b表示数据差异显著水平为95％。

实施例8

莲子草假格孢(Nimbya alternantherae)sf 193菌株生防制剂对其它植物的安全性。

采用实施3空心莲子草生防制剂——sf 193液体菌剂的制备与使用方法喷雾接种在与空心莲子草同期生长的植物，供试植物涉及：22个科，88种，测定莲子草假格孢(Nimbya alternantherae)sf 193菌株对这些植物是否具有致病性。实验结果参见表4，表中的分级标准为：“+++”表示严重感病，病斑大而多，有黄化或落叶症状；“++”表示感病，叶面上病斑形态和水花生上相同，病斑周围偶有黄化，不落叶；“+”表示病斑呈小黑点状，类似于抗病品种表现出来的过敏斑；“-”表示不感病。由表4可见：除了对续断菊(菊科)、皱叶酸模、齿果酸模(廖科)、马齿苋(马齿苋科)四种植物具有一定的致病性，对其他84种与空心莲子草同期生长的植物都较安全。

表5、测定莲子草假格孢sf 193对与空心莲子草同期生长植物的安全性

科名	种名	感病程度		科名	种名	感病程度
							苋科	牛膝	+		菊科	苦苣菜	+
	苋	+			马兰	-
								凹头苋	+			毛莲菜	-
	反枝苋	+			续断菊	++
								千日红	-			黄鹌菜	-
	雁来红	+			裸柱菊	-
								空心莲子草	+++			一年蓬	-
					醴肠	-
							禾本科	小麦	-			茼蒿	-
	黑麦	-			飞廉	-
								水稻	-			小飞廉	-
	玉米	-			泥湖菜	-
								看麦娘	-			刺儿菜	-
	稗草	-
								狗尾草	-		唇形科	甘露子	-
	牛筋草	-			荔枝草	-
								狗牙根	-
	苏丹草	-		马齿苋科	马齿苋	++
								猎狗王	-
	马唐	-		大戟科	泽漆	+
								菵草	-			铁苋菜	-
							豆科	大豆	-		茄科	龙葵	-
	绿豆	-			茄子	-
								四季豆	-			辣椒	-
	三叶草	-			番茄	-
								紫花苜宿	-			烟草	-
	大巢菜	-
											蓼科	皱叶酸模	++
桑科	葎草	-			齿果酸模	++
毛莨科	石龙芮	+		藜科	苕帚菜	-
												小藜	-
旋花科	牵牛花	-
											蔷薇科	蔷薇	-
菊科	蒲公英	-			草莓	-
								菊花菜	-
酢浆草科	酢浆草	-		石竹科	蚤缀	-
												牛繁缕	-
景天科	垂盆草	-			康乃馨	-
十字花科	大白菜	-		葫芦科	丝瓜	-
								萝卜	-			南瓜	-
	油菜	-			黄瓜	-
								甘蓝	-			冬瓜	-
					西瓜	-
							三白草科	鱼腥草	+
				鸭跖草科	鸭跖草	-
							玄参科	婆婆纳	-			火柴头	-
							锦葵科	棉花	-		牦牛苗科	野老鹳	-
	茼麻	-
											旱金莲科	旱金莲	-
落葵科	落葵	-
											车前科	车前	-

实施例9

使用健康的大鼠20只，体重180～200g，雌雄各半。试验条件：环境温度22±2℃，相对湿度40～70％。大鼠禁食过夜后，以5000mg/kg.b.wt.的剂量使用生防制剂——sf 193液体菌剂经口一次灌胃，容量为10ml/kg.b.wt.，灌胃后4小时给食，观察期2周。雌雄大鼠灌胃后未见明显中毒表现，观察期内无动物死亡。雌雄大鼠急性经口LD₅₀值均大于5000mg/kg.b.wt.。可见：sf 193液体菌剂属微毒级。

使用健康的大鼠20只，体重200-300克，雌雄各半。试验条件：环境温度22±2℃，相对湿度40-70％。试验前24小时剪毛备皮，面积为体表面积的10％。以5000mg/kg.b.wt.的剂量使用sf 193液体菌剂直接均匀涂于备皮区内，4小时后用温水轻轻洗去残余，观察期2周。雌雄大鼠涂皮后未见明显中毒表现，观察期内无动物死亡。雌雄大鼠经皮LD₅₀值均大于5000mg/kg.b.wt.。可见：sf 193液体菌剂属微毒级。

实施例10

使用人工养殖的鲫鱼36条，体重350～400g；虾360只，体重1.5～3.0克。试验条件，环境温度22±2℃，相对湿度40-70％。将鲫鱼和虾分别养殖于装有30kg水的塑料盒(0.6m×0.37m×0.18m)中，在养殖的水中按1∶10000和1∶100000的比例加入生防制剂(sf 193液体菌剂)，每个塑料盒养殖4条鲫鱼或者40只虾，设有空白对照。试验重复3次。7天后，虾在sf 193液体菌剂和水的比例分别为1∶10000和1∶100000的两个浓度中的相对死亡率为0；14天后，鲫鱼在sf 193液体菌剂和水的比例分别为1∶10000和1∶100000的两个浓度中的相对死亡率为0。

上述各实施例不是对本发明的具体限制。具体实施时，莲子草假格孢(Nimbya alternantherae)sf 193菌株生防制剂中还应该加入防腐剂和助剂，所述的防腐剂为苯甲酸，防腐剂的用量为0～0.5％，所述的助剂为土温100，助剂的用量为0～0.5％。

Claims (9)

1、一种莲子草假格孢(Nimbya alternantherae)sf 193菌株，其特征在于：保藏号CGMCC.NO.1824的菌株，菌落在马铃薯琼脂培养基上，25℃10天，直径达77～78mm，灰褐色，絮状；培养基内菌丝黄褐色；菌落反面黄褐色；菌丝无色至浅褐色，多隔，简单分枝，直径2.0～3.4μm；分生孢子梗褐色，单生，与菌丝分化不明显；分生孢子链生，浅黄褐色，倒棒状，表面光滑，单细胞或6～9个细胞，18.5～60.5×6.4～8.6μm，喙柱状。

2、一种利用保藏号为CGMCC.NO.1824的莲子草假格孢(Nimbyaalternantherae)sf 193菌株的生防制剂的制备方法，其特征在于：将莲子草假格孢(Nimbya alternantherae)的保藏菌种sf 193移殖于试管斜面的PDA培养基中进行活化，将活化后的莲子草假格孢菌移入PDA培养基平板上，28℃培养5～7天，用灭菌打孔器在菌落边缘取直径7mm的菌饼，接种到液体培养基中，每100ml液体培养基中接种3块菌饼，置于28±2℃、130r/min条件下振荡培养4～5天，可获得湿重为7～9克的菌丝，用电动搅拌器搅拌3min，电动搅拌器的转速2500r/min，获得含菌丝片断和培养滤液的混合液体菌剂。

3、根据权利要求2所述的生防制剂的制备方法，其特征在于：所述的PDA培养基的配方为：在1000ml培养基中：去皮马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂18～20g，pH6.8～7.2，水适量；所述的液体培养基的配方为：在1000ml培养基中：去皮马铃薯50g，酵母膏1g，蔗糖10g，黄豆粉5g，淀粉5g，玉米粉5g，碳酸钙1.5g，水适量。

4、根据权利要求3所述的生防制剂的制备方法，其特征在于：所述PDA培养基是这样配制的：称取去皮马铃薯，放入1000ml水中，煮沸后温火煮20分钟，用双层纱布过滤获得马铃薯汁液，加入蔗糖和琼脂，加热至琼脂溶化，补足体积至1000ml，调整pH至6.8～7.2，适当冷却后封装到试管和三角瓶中，试管中的装量为试管的1/5～1/6，三角瓶中装量为1/3～1/4后，用塞子塞好试管口和三角瓶口，121℃湿热灭菌30分钟，趁热取出试管摆好斜面至冷却后备用；所述液体培养基是这样配制的：称取去皮马铃薯用电动搅拌器搅拌5min，电动搅拌器的转速2500r/min，捣碎后加入酵母膏、蔗糖、黄豆粉、淀粉、玉米粉、碳酸钙，用水补足体积至1000ml，调整pH至6.8～7.2；然后分装，250ml的三角瓶装培养液100ml，用棉花塞塞好瓶口，121℃湿热灭菌30分钟，冷却后备用。

5、根据权利要求2所述的生防制剂的制备方法，其特征在于：将搅拌后获得的混合液体菌剂静置12～24小时，用滤网过滤获得菌丝片断，接入事先灭菌处理过的固体培养基，充分搅拌，风干或30℃烘干后粉碎过40～60目筛，获得固体菌剂，固体菌剂中的含菌量为0.8～1g/g；

所述的固体培养基为：黄豆粉，淀粉，玉米粉，碳酸氢钙，它们的质量配比为：0.5∶0.5∶1.0∶8。

6、根据权利要求5所述的生防制剂的制备方法，其特征在于：所述固体培养基是这样配制的：取黄豆粉，淀粉，玉米粉，碳酸氢钙装入密封的铁箱中168℃干热灭菌1小时，冷却后备用。

7、根据权利要求2或5所述的生防制剂的制备方法，其特征在于：液体菌剂或固体菌剂中加入防腐剂和助剂，所述的防腐剂为苯甲酸，防腐剂的用量大于0，小于或等于0.5％，所述的助剂为吐温100，助剂的用量大于0，小于或等于0.5％。

8、根据权利要求2或5所述生防制剂的应用，其特征在于：将所述的生防制剂稀释后均匀地喷雾在空心莲子草叶面，每平方米喷雾用量为稀释后的菌液100ml。

9、根据权利要求8所述的生防制剂的应用，其特征在于：将所述的生防制剂稀释是指：将液体菌剂1∶10倍稀释，或将固体菌剂1∶50倍稀释并充分搅拌。