KR100976037B1 - 살균·살충제로써 항진균 활성을 가지는 세균 Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａ ＫＣ０２８ 및 식물 추출물의 용도 - Google Patents

살균·살충제로써 항진균 활성을 가지는 세균 Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａ ＫＣ０２８ 및 식물 추출물의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 패니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus KC028 (수탁번호: KCCM10974P); 및 솔잎, 건칠, 견우자, 및 오수유 추출물로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 식물 추출물을 포함하는 살균·살충용 조성물과 이를 병원성 진균, 담배세균성마름병균(Ralstonia solanacearum) 또는 식물성 해충에 살포하는 것을 포함하는 살균·살충 방법에 관한 것이다. 본 발명은 환경 보전 및 정화 작용이 있는 다기능적 살균·살충용 조성물서 미생물 농약, 토양개량제, 퇴비부숙제, 환경정화제 등 환경친화형 제제로 이용될 수 있다.
패니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa) KC028, 항진균 활성, 솔잎, 건칠, 견우자, 오수유, 살균, 살충

Description

살균·살충제로써 항진균 활성을 가지는 세균 Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａ ＫＣ０２８ 및 식물 추출물의 용도{Use of The antifungal bacterial Paenibacillus polymyxa KC028 and plant extracts as antifungicides and insecticides}
본 발명은 패니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus KC028 (수탁번호: KCCM10974P); 및 솔잎, 건칠, 견우자, 및 오수유 추출물로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 식물 추출물을 포함하는 살균·살충용 조성물과 이를 병원성 진균, 담배세균성마름병균(Ralstonia solanacearum) 또는 식물성 해충에 살포하는 것을 포함하는 살균·살충 방법에 관한 것이다.
화학농약은 작물의 생산성을 증대시킬 목적으로 재배할 때 발생하는 병이나 해충을 방제하는데 크게 기여하였다. 화학농약은 정확하고 신속한 약효로 농민들의 신뢰를 얻게 되었고 병충해 문제는 모두 농약으로 해결 가능하다는 인식이 생겨났다. 이로 인해 필요 이상의 농약을 사용하거나 적정농도를 초과하는 일이 빈번해졌 다.
그러나 이러한 효과 이면에 화학농약의 사용은 많은 문제점이 발생했다. 첫째, 화학농약을 사용하는 농민의 피해가 상당하였다. 많은 농민들이 농사일 중에서 가장 꺼여하는 것이 농약살포 작업이다. 보호장비를 갖춘다고 하여도 살포할 때 피해를 입을 위험성이 매우 높기 때문이다. 둘째, 화학농약은 살충의 대상인 병균, 해충, 잡초만 죽이는 것이 아니라 천적이나 누에나 꿀벌 같은 익충에 피해를 주고, 뿐만 아니라 강이나 하천으로 유입되어 수서 곤충이나 어류에도 큰 피해를 준다. 실제로 과수원, 시설재배단지 그리고 골프장 주변의 생태계는 지속적인 농약사용으로 크게 변화되고 있으며 더욱이 농산물에 잔류된 농약이 식품을 통해 인체에 피해를 주고, 뿐만 아니라 토양이나 다른 생물에 축적된 농약이 만성적인 생태계에 부작용을 유발한다. 셋째, 화학농약 살포 후에 살아남은 병원균이나 해충은 농약에 저항성을 갖게 되어 오히려 병, 해충이 증가하는 경우가 생긴다. 또한, 흔히 나타나는 현상으로 종전까지는 문제가 되지 않던 새로운 병, 해충이나 잡초가 등장하여 이전보다 더 어려운 상황을 초래하기도 한다.
한편, 1992년 UN 환경개발회의 리우선언 이후 지구 환경보호를 위한 노력이 계속되었고 WTO가 창립되면서 환경과 무역을 연계시킨 국제무역 다자간 협상 즉, 그린라운드(Green Round)가 본격적으로 진행되면서 인류에게 먹거리를 제공하는 농업도 환경친화적 농업으로의 전환이 시급하게 되었다. 또, 그 일환으로 작물보호 분야에서도 화학농약 사용량의 제한 및 잔류허용량 강화를 통한 저독성, 저약량 제품 또는 생물농약의 개발과 보급이 시급하게 되었다. 이에 우리나라도 정부차원에 서 1997년도 12월에는 환경농업육성법을 공포한 이후 실행되고 있으며, 최근에는 친환경 농업육성 5개년 계획을 수립하여 화학농약 사용량을 원제 기준으로 30%를 감소시키고 저농약 재배 이사의 친환경 농업 재배면적을 현재 1만헥타로 확대시켜 친환경 농업을 구현한다는 야심 찬 계획을 세우고 있다. 이러한 계획이 실효성을 갖기 위해서는 무공해·무독성 생물농약의 개발과 보급이 필수적이다.
생물농약은 농작물의 해충, 병원미생물 및 잡초를 방제하기 위하여 자연환경에서 분리 채집된 병원균, 기주 저항성 미생물, 천연물 농약 및 천적을 제품화한 것이다. 그 역사는 1888년도 Califonia에서 호주산 베다리아 무당벌레(Vedalia beetle)를 수입 방사하여 감귤 이세리아깍지벌레 방제에 성공한 이후 영국에서는 1920년대 온실가루이좀벌을 수입하여 토마토 온실가루이에 방제하였고 1926년에는 길항미생물을 이용하여 병원균 생장억제 효과를 얻었으며 1960년대에는 European spruce sawfly(잎벌류)를 virus로, 나방류는 Bacillus thueringiensis를 이용하여 방제에 성공하였고 1991년도에는 식물저항성 유도미생물을 미생물 종자처리제로 개발하여 유도저항성을 유발시켜 식물 병의 발생을 억제하는 수준에 도달하였다. 현재 세계적으로 상품화되어 보고된 것을 보면 크게 미생물, 페로몬을 포함한 생화학 농약, 식물농약, 천적 및 기타로 구분하여 145종의 생물농약이 있다.(Biopesiticide Manual, 1998). 우리나라는 1930년대 사과면충좀벌을 이용하여 사과면충 방제에 성공한 이후 1976년도에 제주도 감귤에 발생하는 루비깍지벌레를 방제시킨 예가 있으며 1897년에는 인삼뿌리썩음병을 방제하기 위하여 바이코나를 개발, 1994년에는 역병방제용 AC-1을 개발하는 등 여러 종류의 길항 미생물들이 개발되어 소개되었다. 2003년 3월 첫 제품이 등록된 이후 2008년 12월 현재까지 살균제 16품목 살충제 14품목 제초제1 품목으로 총 31품목의 약제가 미생물농약으로 정식 등록되었다. 이와 별도로 현재 국내 친환경농자재 시장에는 농약의 효과가 있다고 주장하는 백여종 이상의 미생물자재가 판매되고 있다.
우리나라는 2000년도 6월에 미생물 농약의 등록 기준과 방법이 고시되어 토양 미생물제제들 중에서 살균 및 살충 효과가 인정되는 제품들도 미생물 농약의 범주에 들어오도록 제도적 뒷받침을 마련하게 되면서 본격적인 생물농약 시대에 접어드는 계기를 마련하였다.
이상에서와 같이 미생물 농약이 토양처리 분야에서는 몇몇 성공사례가 있지만 약효지속성, 살충 활성범위 등을 고려할 때 이제 겨우 개척단계에 불과하고 엽면 살포 분야에서는 커다란 성공사례가 아직 보고된 바가 없는 실정이다. 한편, 상업화에 있어서 무엇보다 중요한 것은 미생물제제의 효능, 상업성, 경제성 그리고 해충억제에 유리한 첨가물의 양과 가격 등을 고려하여 생산, 저장, 처리가 용이한 상태로 제품화하는 것이다.
이에, 본 발명자들은 환경 보전 및 정화 작용이 있는 다기능적 미생물제제를 개발하던 중 패니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa) KC028 (수탁번호 : KCCM10974P)가 다양한 병원성 진균류에 대해 항진균 활성이 뛰어나며 미생물 농약, 토양개량제, 퇴비부숙제, 환경정화제 등 환경친화형 제제로 이용될 수 있음을 확인 하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 패니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus KC028 (수탁번호: KCCM10974P); 및 솔잎, 건칠, 견우자, 및 오수유 추출물로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 식물 추출물을 포함하는 살균·살충용 조성물과 이를 병원성 진균, 담배세균성마름병균(Ralstonia solanacearum) 또는 식물성 해충에 살포하는 살균·살충 방법을 제공하는 것이다.
일 양태로 본 발명은 패니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa ) KC028 (수탁번호: KCCM10974P); 및 솔잎, 건칠, 견우자, 및 오수유 추출물로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 식물 추출물을 포함하는 살균·살충용 조성물을 제공한다.
상기 미생물은 선발된 세균을 순수배양하여 그람염색(Gram stain)을 행하고, 형태적 특성과 생화학적 특성을 파악하여 동정하였다. 그 결과, 본 발명의 미생물은 패니바실러스 폴리믹사로 판명되었으며, 상기 미생물을 Paenibacillus polymyxa KC028로 명명하고 사단법인 한국종균협회 한국미생물 보존센터에 2008년 12월 9일자로 기탁하였다(수탁번호: KCCM10974P).
본 발명의 살균·살충용 조성물은 솔잎, 건칠, 견우자, 및 오수유 추출물으로 이루어진 군에서 선택된 1이상의 식물 추출물을 포함한다.
상기 "솔잎"은 소나무의 잎으로 솔잎의 주요성분은 엽록소와 비타민A, 비타민C이다. 그밖에도 단백질 조지방(粗脂肪)과 인, 철, 효소, 미네랄 등 특수한 유효성분이 많이 들어 있다.
상기 "건칠"은 옻나무과의 낙엽교목으로 높이 약 7m에 이르며 잎은 4~7쌍의 긴타원형의 쪽잎이 모여서된 깃겹잎을 말한다. 초여름에 노란색 꽃이 피고 열매는 둥글납작하다. 여름에 옻나무에 상처를 내어서 흘러내린 수지를 긁어모은 것을 생칠(생옻)이라하며, 이것을 말린 것을 건칠이라 한다. 그 조성 성분은 우르시올, 고무질, 소량의 만니트이다.
상기 "견우자"는 말린 나팔꽃 종자를 말하는데, 푸르거나 붉은 나팔꽃의 종자를 흑축(黑丑), 흰 나팔꽃의 종자를 백축(白丑)이라고 한다. 수지 배당체 파르비틴을 포함한다. 파르비틴은 파르비틴산이라는 산성배당체의 결합당에 티글린산, 메틸-에틸초산, 닐산 등의 산이 에스테르 결합을 한 것이며, 파르비틴산은 이푸룰린산의 수산기에 포도당 또는 람노즈가 붙은 것이다. 파르비틴 외에 올레인, 팔미틴, 스테아린으로 된 기름도 포함한다. 여물지 않은 씨에는 식물성장호르몬인 기베텔린과 그 배당체가 있다.
상기 "오수유"는 녹갈색의 운향과 미숙과를 채취하여 말린 것을 말한다. 쌍떡잎식물로 중국 중서부가 원산이다. 어린가지에 털이 있고 잎은 마주나는데 홀수 1회 깃꼴겹잎이며 작은잎은 타원형의 달걀모양 또는 타원형이고 뒷면에 털이 밀생한다. 꽃은 녹황색으로 단성화이며 2가화이다.
본 발명의 식물 추출물은 당업계에 공지된 다양한 식물 추출물의 제조방법에 따라 제조된 것일 수 있으며, 일 예로 진탕추출법, 냉침추출법, 온침추출법, 열추출법 또는 환류추출법에 의할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 물, 탄소수 1 내지 4 알코올, 에틸아세테이트, 핵산 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군에서 선택하여 추출용매로 이용할 수 있다. 상기 추출용매가 물인 경우에는 열수추출법에 의할 수 있으며 상기 추출용매가 알콜인 경우에는 환류추출법에 의할 수 있다. 또한, 상기 용매로 추출한 추출물은 추출과정을 수행한 이후, 핵산, 메틸렌클로라이드, 아세톤, 에틸아세테이트, 클로로포름 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 용매로 분획과정을 더욱 실시할 수 있으며, 상기 분획시 용매는 1종 이상 사용할 수 있다. 상기 추출물 제조온도는 4 내지 120 ℃일 수 있으나, 이에 한정되지는 않으며, 추출시간은 특별히 한정되지는 않으나 10분 내지 300분일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 추출과정은 통상의 추출기기, 초음파분쇄 추출기 또는 분획기를 이용하여 수행할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 제조된 추출물은 이후 감압 여과하거나 건조하여 용매를 제거하여 농축할 수 있으며, 감압 여과 및 건조를 모두 수행할 수 있고 상기 감압 여과는 감압농축기를 이용한 저온 감압 농축법에 의해 수행될 수 있으며, 건조는 동결건조법에 의해 수행될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 상기 식물 추출물은 식물을 에탄올을 가하여 진탕추출한 후에 얻어진 추출물을 여과하고 농축시켰다.
패니바실러스 폴리믹사 KC028은 광범위한 항진균 활성을 가지며, 담배세균성마름병균(Ralstonia solanacearum) 및 병원성 진균에 대한 항세균 활성을 보인다. 병원성 진균 중 특히, 벼잎집무늬마름병(Rhizoctonia solani), 벼키다리병(Gibberella fujikuroi), 콩자주무늬병(Cercospora kikuchii), 고추역병(Phytophthora capsici), 고추탄저병(Colletotrichum acutatum), 고추탄저병(Colletotrichum gloeosporioides), 벼도열병(Pyricularia grisea), 사과겹무늬썩음병(Botryosphaeria dothidea) 및 오이덩굴쪼김병(Fusarium oxysporum f. sp. Cucumerinum)으로 이루어진 병원성 진균군으로부터 선택되는 1이상에 특이적인 현저한 항진균 활성을 가진다.
패니바실러스 폴리믹사 KC028의 항진균 활성을 조사한 결과, 상기 병원성 진균류 모두에 대하여 광범위한 활성 스펙트럼을 나타냈다(실시예 1).
또한, 솔잎 추출물은 담배세균성마름병균에 대한 항세균 활성을 보였으며, 건칠, 견우자, 및 오수유 추출물도 담배세균성마름병균에 대해 항세균 활성을 나타내었다(표 3). 바람직하게 상기 솔잎, 건칠, 견우자, 및 오수유 추출물이 항세균활성을 보이는 본 발명의 살균·살충용 조성물의 살균의 대상은 담배세균성마름병균(Ralstonia solanacearum)이다.
또한, 솔잎 추출물은 점박이응애(표 5)및 배추좀나방(표 6)에 대한 특이적인 살충효과를 보였으며, 특히, 점박이응애 알 및 배추좀나방에 현저한 효과를 보였다. 건칠, 견우자, 오수유 추출물도 살충효과를 나타내었다. 점박이응애 및 배추좀나방에 대한 약효검증 시험을 거친 결과 상기 솔잎, 건칠, 견우자, 및 오수유 추출물은 현저한 방제가(%)를 보였다.
본 발명에 따른 살균·살충용 조성물은 통상의 살균·살충제에 혼합되는 물질을 더욱 포함할 수 있으며, 살균·살충제 제형, 살포장소, 살포방법에 따라 조절하는 것이 더욱 바람직하다.
상기 패닐바실러스 폴리믹사 KC028과 식물 추출물 혼합물에 임의의 계면 활성제 및 당업계에 공지된 임의의 기타 불활성 성분, 예를 들어 보호 콜로이드, 접착제, 증점제, 틱소트로픽제, 침투제, 보존제, 안정화제, 소포제, 동결방지제, 금속이온봉쇄제, 염료, 안료, 착색제 및 중합체와 함께 고체 및/또는 액체 담체(예: 물)를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 식물, 종자 또는 토양 도포를 용이하게 하는 천연 또는 합성, 유기 또는 무기 물질의 담체를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 항진균 활성 및 농약에 대한 저항성을 가지는 다른 미생물 담체를 추가로 포함할 수 있다. 미생물 담체는 식물자원 고분자 재료, 미생물 기원 생체 고분자 재료, 영양제, 보조 재료, 및 첨가제 등이 포함될 수 있다. 식물자원 고분자 재료로는 감자가루, 콩가루 및 전분가루, 미생물기원 생체 고분자로는 뮤코폴리사카라이드, 폴리 -베타하이드록시-알카노에이트 및 응집제, 영양제로는 포도당, 펩톤 및 무기염류, 보조 재료로는 질석 및 왕겨 태운가루, 첨가제로는 증량제, UV 차단제 및 계면활성제 등이 있다.
바람직하게는 상기 패닐바실러스 폴리믹사 KC028과 식물 추출물에 바이오 기질을 추가로 포함할 수 있다. 상기 바이오 기질은 당업계에 공지된 다양한 성분이 포함될 수 있으나 예를 들어, 전착제, 미량요소, 자외선차단제 및 중량제로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 살균·살충용 조성물은 현탁액, 미세 현탁액, 서스포에멸젼, 습윤 가능한 분말, 과립 농축물, 마이크로에멀젼 등으로 제형화할 수 있다. 농축물로 제형화할 수도 있으며, 최종 사용자가 통상적으로 묽은 제형으로 만들어 사용할 수 있다.
본 발명의 살균·살충용 조성물은 항진균 활성이 뛰어나며 화학 물질 대신에 미생물 및 식물 추출물을 사용하기 때문에 환경 보전 및 정화에 유용한 환경친화적인 다기능제재로 미생물 농약으로 이용될 수 있다.
본 발명의 살균·살충용 조성물은 생물 농약, 토양개량제, 퇴비부숙제, 엽면살포제, 관주살포제 등에 사용될 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
또한, 다른 양태로 본 발명은 살균·살충용 조성물을 병원성 진균, 담배세균 성마름병균(Ralstonia solanacearum) 또는 식물성 해충에 살포하는 것을 포함하는 살균·살충 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 살균·살충용 조성물은 병원성 진균, 담배세균성마름병균(Ralstonia solanacearum) 또는 식물성 해충에 대하여 살균·살충의 목적으로 사용하고, 예를 들어 접촉법, 훈증법, 또는 소화중독법으로 적용시킬 수 있으나 이에 한정되지는 않는다.
본 발명은 환경 보전 및 정화 작용이 있는 다기능적 살균·살충용 조성물서 경제적인 대체 효과가 크고 고성능을 가지므로 미생물 농약, 토양개량제, 퇴비부숙제, 환경정화제 등 환경친화형 제제 등으로 다양하게 이용될 수 있다.
<실시예 1> Paenibacillus polymyxa KC028 분리 및 동정
항진균 활성을 가지는 새로운 미생물을 탐색하기 위하여 경북일원의 토양시료를 수집하고, 수집한 시료로부터 NA 배지(nutrient agar medium, Difco) 및 PDA(potato dextrose agar medium, Difco)를 이용하여 희석평판법으로 50여 후보균주를 분리하였으며, 후보균주를 대상으로 식물병원성 진균류인 고추탄저병균(Colletotrichum gloeosporioides) 이 도말된 PDA배지에 NB배지, 35℃에서 전 배양된 후보균주를 직 경 8㎜ paper disc(ADVANTEC, Toyo, Japan)에 접종, paper disc diffusion method을 통하여 1차 항진균 활성균주를 선별한 후, 선별된 균주를 다양한 식물병원성 진균류에 대한 항진균 활성시험을 통하여 최종 균주를 선별하였다.
선발된 세균을 순수 배양하여 1차적으로 그람염색(Gram stain), 전자현미경( Hitachi, Japan) 검경 등을 통하여 형태적 특징과 VITEK2 자동동정기(Biomerieux, France)을 이용하여 생화학적 특징을 분석한 후, 최종적으로 Bergey's manual of systematic Bacteriology를 이용하여 확인결과, 본 발명의 미생물은 패니바실러스 폴리믹사로 동정되었으며, 상기 미생물을 Paenibacillus polymyxa KC028로 명명하고 사단법인 한국종균협회 한국미생물 보존센터에 2008년 12월 9일자로 기탁하였다(수탁번호 : KCCM10974P).
< 실시예 2> 항진균 활성균주의 활성 분석
식물 병원성 진균류 9종 Rhizoctonia solani(벼잎집무늬마름병), Gibberella fujikuroi (벼키다리병), Cercospora kikuchii (콩자주무늬병), Phytophthora capsici (고추역병), Colletotrichum acutatum (고추탄저병), Colletotrichum gloeosporioides (고추탄저병), Pyricularia grisea (벼도열병), Botryosphaeria dothidea (사과겹무늬썩음병) 또는 Fusarium oxysporum f. sp. Cucumerinum (오이덩굴쪼김병)등에 대한 항진균 활성은 진균류가 도말된 PDA(Difco Co.) 배지에 종이 디스크 (직경 6mm)를 이용하여 영양배지에서 전 배양된 세포 배양액을 접종하고 30℃에서 2~3일간 배양함으로서 조사하였다.
상기 세균을 대상으로 항진균 활성을 조사한 결과, 상기 병원성 진균류 모두에 대하여 광범위한 활성 스펙트럼을 나타냈다.
식물병원성 진균류에 대한 Paenibacillus polymyxa KC028의 항진균 활성 스펙트럼
식물병명 학명 항진균활성
벼키다리병(馬塵苗病) Gibberella fujikuroi
(불완전세대:Fusarium moniliforme)		 ○
콩자주무늬병(紫斑病) Cercospora kikuchii ○
고추역병(疫病) Phytophthora capsici ○
고추탄저병(炭疽病) Colletotrichum acutatum ○
고추탄저병(炭疽病) Colletotrichum gloeosporioides ○
벼도열병(稻熱病) Pyricularia grisea ○
콩탄저병(炭疽病) Glomerella glycines ○
생강잎집무늬마름병(紋枯病) Rhizoctonia solani ○
사과겹무늬썩음병(輪紋病) Botryosphaeria dothidea ○
오이덩굴쪼김병(蔓割病) Fusarium oxysporum f. sp. Cucumerinum ○
< 실시예 3> 항진균 활성 세균의 최적조건 확립
상기 실시예에서 선별한 항지균 활성세균 Paenibacillus polymyxa KC028을 대상으로 배양 최적 조건을 조사한 결과, 표 2와 같이 NA(Difco Co.)와 PDA(Difco Co.)배지를 각각 동량 혼합하여 35℃, 72시간 배양한 조건에서 우수한 생장률을 나타내었다.
항진균 활성세균 Paenibacillus polymyxa KC028 균주의 배양조건
구분 25℃ 30℃ 35℃ 42.5℃
YMA ++ +++ +++++ -
NA+PDA ++ +++ +++++ -
NA - + ++ -
* +++++ : 매우우수, +++ : 우수, ++ : 보통, + : 불량
<실시예 3> 항진균 활성 세균의 최적 조건 확립
상기 실시예에서 선별한 항지균 활성세균 Paenibacillus polymyxa KC028을 대상으로 내생포자 형성 최적 조건을 조사한 결과, 도 5에서 나타나는 바와 같이 NA(Difco Co.)와 PDA(Difco Co.)을 혼합한 배지에서 35℃, 5일간 배양시에는 80%. 7일간 배양시 100% 포자가 형성되는 것을 알 수 있었다.
<실시예 4> 항진균 활성 세균의 최적 조건 확립
상기 실시예에서 선별한 항지균 활성세균 Paenibacillus polymyxa KC028을 대상으로 내생포자 형성 최적 조건을 조사한 결과, 도 5에서 나타나는 바와 같이 NA(Difco Co.)와 PDA(Difco Co.)을 혼합한 배지에서 35℃, 5일간 배양시에는 80%. 7일간 배양시 100% 포자가 형성되는 것을 알 수 있었다.
<실시예 5> 식물의 선별 및 추출방법
건칠, 견우자, 고련, 명아주, 솔잎, 야국, 정향, 황련, 오수유의 추출과정은 추출의 효율을 높이기 위하여 분쇄기(pin mill, 한국분체기계)를 이용하여 1차 마쇄과정을 거친 후 각각의분쇄물 1Kg에 75% Et-OH 2L을 잠길 정도로 가하여 80℃에서 4시간 동안 진탕 추출하였다. 위 과정을 통하여 얻어진 추출물을 종이여과지(filter paper, Watman)를 이용하여 여과 후 진공회전농축기 (Rotary vacuum evaporator, Eyela, Japan)를 이용하여 5~6배 농축, 각각의 농축액을 얻었다.
백지, 사군자, 진랑은 마쇄과정 없이 각각 물 10L에 1Kg 씩 넣은 후 80℃에서 12~24시간동안 열을 가하여 열수추출을 한다. 2차적으로 위에서 얻어진 추출액 1~1.5L에 6~9L(6배수)의75% Et-OH를 가하여 80℃에서 6시간동안 추출하여 종이여과지(filter paper, Watman)로 여과한 후 진공회전농축기를 통하여 각각의 추출농축액을 얻었다.
상기 추출방법에 따라 얻어진 각각의 농축액을 동량으로 혼합한 후 30% Et-OH로 용량을 조절하여 종이여과지로 여과한 후 최종 살균·살충활성을 나타내는 식물 농축 추출액을 얻었다.
< 실시예 6> 식물추출물의 항진균 활성 분석
상기 실시예 1에서 얻어진 식물추출액의 항진균 활성 효과를 분석하였다. 식물 병원성 진균류 9종 Rhizoctonia solani(벼잎집무늬마름병), Gibberella fujikuroi (벼키다리병), Cercospora kikuchii (콩자주무늬병), Phytophthora capsici (고추역병), Colletotrichum acutatum (고추탄저병), Colletotrichum gloeosporioides (고추탄저병), Pyricularia grisea (벼도열병), Botryosphaeria dothidea (사과겹무늬썩음병) 또는 Fusarium oxysporum f. sp. Cucumerinum (오이덩굴쪼김병)과 식물병원성 세균 1종 담배세균성마름병균( Ralstonia solanacearum)을 대상으로 하였다.
병원균이 도말된 PDA(Difco Co.) 배지에 직경 6mm의 구멍을 만들어 식물추출액을 접종하고 30℃에서 2~3일간 배양함으로서 항진균 활성을 조사하였다. 상기 식물추출액에 대한 항진균 활성을 조사한 결과, 정향, 진랑, 황련 추출물은 상기 병원성 진균류 모두에 대하여 광범위 활성 스펙트럼을 나타낸 반면 다른 추출물들은 특이적 항진균 활성을 보였다.
또한 식물병원성 세균인 담배세균성마름병균에 대해서는 건칠, 견우자, 솔잎, 오수유, 정향, 황련이 활성을 나타내었다.
식물성 병원균에 대한 식물추출물의 항진균 활성스펙트럼
구분 건칠 솔잎 견우자 고삼 명아주 오수유 정향 진랑 황련
벼 키다리병 ○ ○ ○
콩 자주무늬병 ○ ○ ○
고추 역병 ○ ○ ○
고추탄저병 ○ ○ ○ ○ ○
벼 도열병 ○ ○ ○ ○ ○ ○
콩 탄저병 ○ ○ ○
생강 잎집무늬마름병 ○ ○ ○
사과 겹무늬썩음병 ○ ○
호접란 흰비단병 ○
오이 덩굴쪼김병 ○ ○ ○
담배 세균성마름병 ○ ○ ○ ○ ○ ○
< 실시예 7> 식물추출물의 살충 활성 분석
18종류의 식물추출액을 대상으로 식물성 해충인 점박이응애(성충, 알)와 배추좀나방에 대한 살충 활성을 분석하였다. 공히 식물추출액(대상약제)을 대상 해충에 직접 살포하고 잔류법으로 검정하였다. 약효 검정은 25℃, 65% RH조건에서 하며, 알의 살충효과는 48시간, 72시간 후에 조사하였다.
그 결과, 최종 살충효능을 나타내는 8개 식물추출물을 선별하였다.
<실험예 1> 점박이응애에 대한 약효검증 시험
(1) 점박이응애 성충
건전한 강낭콩 잎 3㎝ 절편을 만든다. 멸균증류수에 100배 희석된 약액에 10초간 침지한 후 페트리디쉬 안에 젖은 솜(4×4㎝)위에 올려놓는다. 후드에서 젖은 약액이 마르게 한 후, 점박이응애를 각 15마리 내외를 접종한다. 약제 처리 후 24, 48시간 후 생충수를 조사한다. 실험은 3번 반복한다.
식물성 해충인 점박이응애 성충에 대한 식물추출물의 살충 효능검증 결과
시험약제 처리 전 밀도(마리) 생충수(마리) 방제가(%)
견우자 9.3 5.3 44.4
명아주 10.0 4.7 51.9
사군자 8.7 6.0 31.9
정 향 12.7 8.3 33.8
무처리 15.0 15 0.0
(2) 점박이응애 알
페트리디쉬 속에 솜을 깔고 물을 적신 후, 점박이응애가 전혀 없는 강낭콩잎 디스크를 절개하여 아랫면이 위로 되게 올려놓는다. 점박이응애 성충 3마리씩을 접종한다. 24시간 후에 점박이응애 성충을 제거한다. 약제는 멸균증류수로 100배 희석하여 분무법으로 처리한다. 약제당 3번 반복, 약제 처리 후, 살포된 약제가 마른 후 페트리디쉬 뚜껑(1㎝ 메쉬망)을 닫아서 습도를 보존한다. 조사는 약제처리 후 72, 96시간 후에 부화 유/약충수를 조사하였다.
식물성 해충인 점박이응애 알에 대한 식물추출물의 살충 효능검증 결과
시험약제 처리전
밀도(마리)		 생충수(마리) 방제가(%)
건 칠 16.7 6.3 64.9
고 련 9.7 2.7 69.9
명아주 20.3 6.7 62.9
백 지 20.0 10.7 44.9
솔 잎 13.3 6.0 49.4
야 국 13.3 4.3 66.1
정 향 19.0 0.0 100.0
황 련 16.0 5.0 67.8
무처리 14.7 14.0 0.0
<실험예 2> 배추좀나방에 대한 약효검증 시험
약제를 희석한 후 침지법으로 배추 잎 절편을 30초간 침지한 후 배추좀나방 유충을 붓으로 약 10마리씩 노출 시키다. 노출 시간은 1일로하고 사충수를 조사하였다.
식물성 해충인 배추좀나방에 대한 식물추출물의 살충 효능검증 결과
시험약제 처리전
밀도(마리)		 생충수(마리) 방제가(%)
고 련 10.0 7.0 30.0
고 삼 9.3 6.0 33.7
야 국 9.3 5.3 39.5
솔 잎 13.3 6.0 49.4
진 랑 9.3 6.7 29.3
무처리 14.7 14.0 0.0
<실시예 8> 항진균 활성세균이 함유된 미생물살균제 제조
항진균 활성세균 배양농축액을 그람당 세포 수가 108-109 정도 되도록 조제한 후 액상 또는 동결건조하여 분말형태의 미생물살균제를 제조하였다.
<실시예 9> 살충효과를 나타내는 식물추출물을 함유한 천연물살충제 제조
살충효과를 나타내는 식물추출물을 선별하여 추출 및 농축시킨다. 농축된 추출물을 균일하게 섞어 액상 또는 분말형태의 천연물 살충제를 제조하였다.
<실시예 10> 살균 및 살충효과를 나타내는 복합 생물농약제 제조
상기에서 1차적으로 제조된 미생물살균제와 천연물살충제를 전착제, 자외선차단제, 미생물영양원, 증량제가 포함된 바이오 기질에 호모지나이저(homogenizer)속에서 균일하게 섞어 복합 생물농약을 제조하였다.
구체적으로 본 발명의 복합생물농약은 2가지 형태(액제, 수화제)로 제조되었다.
도 1은 본 발명의 항진균 활성(AF)세균 Paenibacillus polymyxaKC028 (KCCM10974P)과 살충활성을 나타내는 식물 추출물을 함유하는 살균·살충용 복합생물농약(complex-biopesticide)의 제조과정을 도시화하여 나타낸 것이다.
도 2은 본 발명의 Paenibacillus polymyxa KC028 (KCCM10974P) 균주의 병원성 진균에 대한 항진균 활성을 나타낸 것으로 각각 a: 벼잎집무늬마름병균(Rhizoctonia solani), b: 벼도열병균(Pyricularia grisea), c: 고추탄저병균(Colletotrichum gloeosporioides), d: 고추역병균(Phytophthora capsici)를 대상으로 한 것이다.
도 3은 본 발명의 항진균 활성세균 Paenibacillus polymyxa KC028의 전자현미경 사진을 나타낸 것으로 a는 투과전자현미경(TEM) 사진이고, b는 주사전자현미경(SEM) 사진이다.
도 4은 본 발명의 항진균 활성세균 Paenibacillus polymyxa KC028의 동정결과를 나타낸 것이다.
도 5은 본 발명의 식물추출물의 식물병원균에 대한 항진균 활성을 나타낸 것으로 각각은 이와 같다.
A: 정향추출물의 사과겹무늬썩음병균(Botryosphaeria dothidea)에 대한 항진균활 성,
B: 황련추출물의 콩자주무늬병균(Cercospora kikuchii)에 대한 항진균활성,
C: 견우자추출물의 벼도열병균(Pyricularia grisea)에 대한 항진균활성,
D: 정향추출물의 벼키다리병(Gibberella fujikuroi)에 대한 항진균활성.
도 6은 발명의 식물추출물의 식물병원균에 대한 항세균 활성을 나타낸 것으로 각각은 이와 같다.
A: 솔잎추출물의 담배세균성마름병균(Ralstonia solanacearum)에 대한 항균활성,
B: 황련추출물의 담배세균성마름병균(Ralstonia solanacearum)에 대한 항균활성,
C: 견우자추출물의 담배세균성마름병균(Ralstonia solanacearum)에 대한 항균활성,
D: 정향추출물의 담배세균성마름병균(Ralstonia solanacearum)에 대한 항균활성.

Claims (7)

  1. 패니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa) KC028 (수탁번호: KCCM10974P); 및
    솔잎, 건칠, 견우자 및 오수유로 구성된 식물군에서 선택되는 1종 이상의 식물 추출물을 포함하는 살균 및 살충용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 살균의 대상은 병원성 진균 또는 담배세균성마름병균(Ralstonia solanacearum)인 것을 특징으로 하는 살균 및 살충용 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 병원성 진균은 벼잎집무늬마름병(Rhizoctonia solani), 벼키다리병(Gibberella fujikuroi), 콩자주무늬병(Cercospora kikuchii), 고추역병(Phytophthora capsici), 고추탄저병(Colletotrichum acutatum), 고추탄저병(Colletotrichum gloeosporioides), 벼도열병(Pyricularia grisea), 사과겹무늬썩음병(Botryosphaeria dothidea) 및 오이덩굴쪼김병(Fusarium oxysporum f. sp. Cucumerinum)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상인 것을 특징으로 하는 살균 및 살충용 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 살충의 대상은 점박이응애 및 배추좀나방으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 식물성 해충인 것을 특징으로 하는 살균 및 살충용 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 패니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa) KC028 (수탁번호: KCCM10974P);
    솔잎, 건칠, 견우자 및 오수유 추출물로 구성된 식물군에서 선택되는 1종 이상의 식물 추출물; 및
    전착제, 자외선차단제 및 증량제로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 바이오 기질을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 살균 및 살충용 조성물.
  6. 삭제
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 살균 및 살충용 조성물을 병원성 진균, 담배세균성마름병균(Ralstonia solanacearum) 또는 식물성 해충에 살포하는 것을 포함하는 살균 및 살충 방법.
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