CN102719464A - 一种新型非核糖体肽合成酶基因及其腺苷酰化结构域的克隆和表达 - Google Patents
一种新型非核糖体肽合成酶基因及其腺苷酰化结构域的克隆和表达 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种新型非核糖体肽合成酶基因，所述非核糖体肽合成酶基因命名为NRPS114，所述非核糖体肽合成酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示；同时，本发明还公开了所述非核糖体肽合成酶基因的制备方法，含有非核糖体肽合成酶基因的质粒pCC1FOSTM Fosmid-NRPS114，以及所述非核糖体肽合成酶基因中的5个腺苷酰化结构域的重组质粒pET28a-A-2his的表达载体。另外，本发明还公开了5种腺苷酰化结构域及其制备方法，将所述腺苷酰化结构域基因A1、A2、A3、A4、A5在大肠杆菌原核表达系统中过量表达，得到重组腺苷酰化结构域，具有较高的使氨基酸发生腺苷酰化的活性，为组合生物学的研究提供更多的基因操作材料，并在新药的研发中具有巨大的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种新型非核糖体肽合成酶基因及其包含的五个腺苷酰化结构域基因，尤其是一种来自南海深海沉积物微生物的新型非核糖体肽合成酶基因及其包含的五个腺苷酰化结构域基因。
背景技术
非核糖体肽类是一大类由细菌或真菌的非核糖体肽合成酶合成的，具有生物活性的天然产物，并且在生物体内具有较好的抗酶解和抗化学降解特性。它的结构非常复杂，种类繁多。应用于临床上的非核糖体肽类非常多，常见的有抗生素（达托霉素）、抗肿瘤（博来霉素）、抗真菌药物或免疫抑制剂（环孢霉素）等。随着细菌耐药性的频频出现，抗生素类药物的储备越来越不足，人类对新型抗生素的需求越来越迫切，因此寻找新型非核糖体肽合成酶基因具有十分重要的意义。
非核糖体肽类通常需要一系列后修饰过程。尽管其合成的模式和酶的催化方式都非常保守，但由于可利用的氨基酸底物非常丰富，非核糖体肽合成酶自身结构的多样性，使它的种类远远超过以核糖体合成的肽类。
非核糖体肽合成酶基因的操作潜力十分巨大，运用组合生物学技术对模块进行重排或者改造，有望得到预期的多肽或者新的药物。达托霉素就是一种新开发的脂肽类抗生素，对革兰氏阳性细菌具有很强的抑制作用。组合抗生素已经成为传统药物的竞争者。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种能够产生非核糖体肽类的非核糖体肽合成酶基因，为组合生物学提供研究材料，为新药的研发提供更多的候选化合物。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种新型非核糖体肽合成酶基因，所述非核糖体肽合成酶基因命名为NRPS114，所述非核糖体肽合成酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。
本发明的第二个目的在于提供一种所述新型非核糖体肽合成酶基因的制备方法，为实现此目的采取的技术方案为：一种如上所述新型非核糖体肽合成酶基因的制备方法，包括以下步骤：通过简并引物序列筛选的方法，从南海深海沉积物大片段文库中获得7个阳性克隆子，挑选一个进行全长测序，然后运用生物信息学软件对所得序列进行分析，即可获得所述非核糖体肽合成酶基因。
所述新型非核糖体肽合成酶基因NRPS114通过序列筛选的方法从南海深海沉积物文库中获得，NRPS114为一个17202bp大小的完整非核糖体肽合成酶基因，利用BLAST在线比对其核苷酸序列进行同源性搜索分析表明，所述新型非核糖体肽合成酶基因NRPS114与已知基因相似性很低，仅为30%左右。
本发明的第三个目的在于提供一种由上述所述非核糖体肽合成酶基因编码的非核糖体肽合成酶，所述非核糖体肽合成酶与已发现的同类蛋白的模板排列顺序不同，它含有5个模块，共16个结构域，起始模块中含有3个结构域，分别为腺苷酰化结构域、甲基转移酶结构域和酰基载体蛋白结构域；第二模块、第三模块和第五模块均为常规模块，均含有缩合结构域、腺苷酰化结构域和酰基载体蛋白结构域；第四模块含有两个缩合结构域、一个腺苷酰化结构域和一个酰基载体蛋白结构域；末端模块即第五模块不含硫酯酶结构域。
本发明的第四个目的在于提供一种含有如上所述新型非核糖体肽合成酶基因的重组质粒pCC1FOSTM Fosmid-NRPS114。所述重组质粒pCC1FOSTMFosmid-NRPS114保存于大肠埃希菌EPI300中。
本发明的第五个目的在于提供一种重组质粒pET28a-A-2his，所述重组质粒pET28a-A-2his包括重组质粒pET28a-A1-2his、pET28a-A2-2his、pET28a-A3-2hispET28a-A4-2his、pET28a-A5-2his，所述五个重组质粒分别含有如上所述的五个腺苷酰化结构域，所述五个重组质粒均采用以下方法制备所得：分别根据五个腺苷酰化结构域的序列设计引物，以权利要求4所述的重组质粒pCC1FOSTMFosmid-NRPS114为模板，进行PCR扩增，PCR产物经凝胶电泳并回收产物1，凝胶回收产物1经限制性内切酶双酶切并回收产物2，质粒pET28a经双酶切后与回收产物2连接，获得连接产物，即得五个重组质粒pET28a-A1-2his、pET28a-A2-2his、pET28a-A3-2his、pET28a-A4-2his和pET28a-A5-2his。
本发明的第六个目的在于提供一种表达菌株，所述表达菌株包括大肠杆菌BL21-pET28a-A1-2his、BL21-pET28a-A2-2his、BL21-pET28a-A3-2his、BL21-pET28a-A4-2his、BL21-pET28a-A5-2his，所述五个大肠杆菌分别含有如上所述的五个腺苷酰化结构域基因，所述五个大肠杆菌均采用以下方法构建所得：采用化转法，分别将权利要求5中所得的五个重组质粒pET28a-A1-2his、pET28a-A2-2his、pET28a-A3-2his、pET28a-A4-2his、pET28a-A5-2his转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中，将细菌悬浮液恢复培养并稀释涂布于卡那霉素抗性平板上培养，挑取阳性转化子，即得腺苷酰化结构域基因的表达菌株大肠杆菌BL21-pET28a-A1-2his、BL21-pET28a-A2-2his、BL21-pET28a-A3-2his、BL21-pET28a-A4-2his和BL21-pET28a-A5-2his。
本发明的第七个目的在于提供一种腺苷酰化结构域的制备方法，所述方法包括以下步骤：
（1）重组质粒pET 28a-A-2his的构建：根据5个腺苷酰化结构域基因的序列设计引物，以提取的质粒pCC1FOSTM Fosmid-NRPS114为模板，进行PCR扩增，PCR产物经凝胶电泳并回收产物1，凝胶回收产物1经限制性内切酶双酶切并回收产物2，质粒pET28a经双酶切后与回收产物2连接，获得连接产物，即重组质粒pET 28a-A-2his；
（2）腺苷酰化结构域基因表达菌株的构建：采用化转法，将重组质粒pET28a-A-2his转化到大肠杆菌BL 21感受态细胞中，将细菌悬浮液恢复培养并稀释涂布于卡那霉素抗性平板上培养，挑取阳性转化子；
（3）腺苷酰化结构域的诱导表达：将重组质粒转化的大肠杆菌涂布于卡那霉素抗性平板上，37℃倒置培养过夜，挑取单克隆接种于卡那霉素抗性液体培养基，37℃振荡培养过夜，按体积比1：50的比例转接至新鲜的含有100μg/mL卡那霉素抗性的液体培养基，于37℃、200rpm培养至OD600=0.5~0.6；加入0.1mmol/L IPTG，16℃,140rpm诱导培养20h；培养后经镍柱低压蛋白层析亲和纯化，即得重组腺苷酰化结构域。
将所述新型腺苷酰化结构域基因A1、A2、A3、A4、A5在大肠杆菌原核表达系统中过量表达，采用所述方法得到的重组腺苷酰化结构域，具有较高的使氨基酸发生腺苷酰化的活性，为组合生物学的研究提供更多的基因操作材料，并在新药的研发中具有巨大的应用前景。
作为本发明所述一种腺苷酰化结构域的制备方法的优选实施方式，所述方法还包括以下步骤：（4）目的蛋白的检测：取3mL诱导后的菌液，10,000×g离心1min，弃上清，用500μL水洗3次，用500μL10mM咪唑裂解缓冲液重悬，超声3s，停3s，连续超声5min。菌体破碎液于4℃，12000×g离心5min，分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳分析，分离胶浓度为10%，浓缩胶浓度5%。
作为本发明所述一种腺苷酰化结构域的制备方法的优选实施方式，所述方法还包括以下步骤：（5）目的蛋白的纯化：取2L在IPTG终浓度为0.1mM，16℃诱导表达20h的菌液，于4℃8000×g离心3min，收集菌体，水洗3次后用裂解缓冲液重悬，在300W功率下进行超声破碎，超声5s，停5s，连续超声45min，4℃13000×g离心20min，取上清，用0.22μm滤膜过滤上清除掉杂质；将过滤后的上清总蛋白通入镍柱中，收集流出液体；将收集到的液体重新上机，重复1次；分别用适量20mM、50mM、100mM、120mM、140mM、160mM、180mM、200mM、250mM咪唑缓冲液上柱，收集流出液，用于SDS-PAGE蛋白电泳分析。
其中，五个腺苷酰化结构域A1、A2、A3、A4、A5与pET28a（+）载体编码2个六联组氨酸标签融合表达，预测相对分子质量分别约为106kDa、64kDa、63.3kDa、61.7kDa和63kDa。
另外，本发明的最后一个目的在于提供一种采用如上所述方法制备得到的重组腺苷酰化结构域。所述重组腺苷酰化结构域包括A1、A2、A3、A4、A5，所述重组腺苷酰化结构域是腺苷酰化结构域基因A1、A2、43、A4、A5在大肠杆菌原核表达系统中表达后经镍柱低压蛋白亲和层析的方法纯化得到，所述A1、A2、A3、A4、A5具有腺苷酰化结构域保守的10个核心模序，即L(S/T)YXEL、LKAGXAY(V/L)P(L/Y)D、LAYXXYTSG(S/T)TGXPKG、FDXS、NXYGPTE、GELXIXGXG(V/L)ARGYL、Y(R/K)TGDL、GRXDXQVKIRGXRIELGEIE、LPXYM(I/V)P、NGK(V/L)DR。
本发明为组合生物学提供了研究材料，为新药的研发提供了更多的候选化合物。
附图说明
图1为NRPS114主要ORF在基因上的排列图。
图2为本发明所述含有非核糖体肽合成酶基因的南海深海沉积物克隆子序列的开放阅读框分析结果。
图3为本发明所述腺苷酰化结构域A1、A2、A3、A4、A5的表达载体的构建全过程的琼脂糖凝胶电泳图谱。
图3中，a为5个腺苷酰化结构域PCR扩增、pCC1FOSTM Fosmid-NRPS114及pET28a质粒的提取；b:pET28a和5个A结构域的双酶切结果；c:5个A结构域的PCR产物纯化结果。
图4为腺苷酰化结构域的诱导表达检测图谱。
图4中，a：5个腺苷酰化结构域的诱导表达（上清）；b：5个腺苷酰化结构域的诱导表达（沉淀）。
图5为A1结构域低压蛋白层析纯化结果。
图6为A2结构域低压蛋白层析纯化结果。
图7为A3结构域低压蛋白层析纯化结果。
图8为A4结构域低压蛋白层析纯化结果。
图9为A5结构域低压蛋白层析纯化结果。
图5、6、7、8和9中，M为Marker，1：未诱导；2：诱导；3：上清；4：穿流；5：20mM洗涤；6：超滤蛋白。
图10为5个腺苷酰化结构域的Western Blot鉴定结果。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步描述。
实施例1
1、新型非核糖体肽合成酶基因NRPS114的获得
利用简并引物通过序列筛选的方法，从南海深海沉积物文库中获得七个含有NRPS基因的克隆，选择一个克隆进行全长测序，测序由北京华大基因有限公司完成，然后运用生物信息学软件对所得序列进行分析，如附图1和附图2所示。该序列含有一个17202bp的完整非核糖体肽合成酶基因，命名为NRPS114。
2、根据腺苷酰化结构域的序列设计引物A1F/A1R、A2F/A2R、A3F/A3R、A4F/A4R、A5F/A5R。
3、PCR扩增
4、PCR程序如下：
5、腺苷酰化结构域基因扩增产物的凝胶回收
按照E.Z.N.A gel extraction kit说明书中步骤进行胶回收。
6、质粒pET28a的提取
将携带相应质粒的E.coli单克隆接种到5mL含100μg/mL卡那霉素液体培养基中，37℃，200rpm，振荡培养过夜。按照OMEGA质粒提取试剂盒说明书中步骤提取质粒。
7、腺苷酰化结构域基因PCR产物及载体的双酶切和产物回收，酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，反应体系如下：
体系如下：
酶切后的PCR产物和载体片段用试剂盒回收纯化后用于连接反应。
8、连接反应
在0.2mL离心管中加入如下成分，混匀后在16℃过夜连接，连接产物保存于-20℃备用或立即用于转化。
9、转化
(1)E.coli DH5α化转感受态的制备
从新鲜培养的平板上挑取单个DH5α菌落，接种到3mL液体培养基中，37℃剧烈振荡培养过夜。取1mL过夜培养物，接种到含100mL液体培养基的500mL锥形瓶中，37℃剧烈震荡，直到培养基中细菌浓度达到OD600为0.375-0.4。将培养物转入两只50mL离心管中，冰上放置10min，4,000rpm，4℃离心15min，弃上清。将菌体悬浮于10-20mL预冷的0.1M CaCl2溶液中，冰上放置20min。4,000rpm离心10min，弃上清，然后将细菌悬浮在2mL0.1M CaCl2溶液中。分装成每管100μL，即可用于后续的转化实验。若不进行实验，则缓慢滴入甘油（灭菌）至终浓度为15%，轻柔混匀，将细菌分装成0.5mL每管，立即液氮冷冻，转入-80℃冰箱中储存，可在两个月内使用。
（2）E.coli DH5α的化转
从-80℃冰箱中取出分装好的感受态，置冰上至刚好解冻，立即分装，每管100μL，加入连接产物5μL，轻轻混匀，冰上放置30min，放入42℃热激90s，迅速插冰上，放置5min，然后加入500μL液体培养基，37℃振荡培养1h。各取200μL涂布于卡那霉素抗性平板上。37℃倒置培养16-18h。
（3）阳性克隆的筛选和鉴定
随机挑取转化子进行菌落PCR，采用克隆引物进行PCR扩增，通过PCR扩增的效果以检测重组质粒插入片段是否符合要求，并选送部分克隆进行测序。
10、重组质粒的提取
挑选经测序确认无误的克隆进行质粒提取，按照OMEGA质粒提取试剂盒说明书中步骤提取质粒。
11、重组表达菌株的构建
将提取得到的重组质粒转化进BL21感受态细胞，获得BL21-pET28a-A-2his表达菌株。腺苷酰化结构域表达载体构建的全过程琼脂糖凝胶电泳如附图3所示。
12、目的蛋白的诱导表达
将菌株BL21-pET28a-A-2his涂布于卡那霉素抗性平板上，37℃倒置培养16h。挑取单克隆接种于卡那霉素液体培养基，37℃振荡培养过夜；按体积比1：50的比例转接至新鲜的卡那霉素液体培养基，于37℃、200rpm培养至OD600=0.5~0.6；加入IPTG至终浓度0.1mM,在37℃条件下诱导3h。取3mL诱导菌液，10000×g离心1min，弃上清；用500μL水洗3次，用500μL10mM咪唑裂解缓冲液重悬，超声3s，停3s，连续超声5min。菌体破碎液于4℃，12,000×g离心5min，分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳分析。分离胶浓度为10％，浓缩胶浓度为5%，如附图4所示。
13、目的蛋白腺苷酰化结构域的纯化
（1）总蛋白的提取
取2L在IPTG终浓度为0.1mM，16℃诱导表达20h的菌液，于4℃8000x g离心3min，收集菌体，水洗3次后用裂解缓冲液重悬，在300W功率下进行超声破碎，每次超声时间5s，间隔时间5s，连续超声45min，4℃13000×g离心20min，取上清，用0.22μm滤膜过滤上清除掉杂质，即可用于蛋白纯化。
（2）镍柱低压蛋白亲和层析
1）将上清总蛋白通入镍柱中，收集流出液体，重复上机1次。
2）分别用适量20mM、50mM、100mM、120mM、140mM、160mM、180mM、200mM、250mM咪唑缓冲液上柱，收集流出液，用于SDS-PAGE蛋白电泳分析，如附图5、6、7、8和9所示。
3）洗脱完毕后，依次通入适量水和20%的乙醇冲洗镍柱和导管并浸泡。
2、目的蛋白的脱盐和浓缩
将洗脱下的目的蛋白加入到滤膜孔径为30kDa的超滤管中，5000×g离心，每次15min，弃去超滤管管底的液体，直到滤膜上的液体少于500μL。
3、目的蛋白的Western Blot鉴定
按照《分子克隆》（第三版）操作。将膜置于化学发光印迹系统上，打开软件使仪器镜头进行自动对焦，然后按1:1的比例混合化学发光底物A液和B液，将其均匀滴到膜上，启动软件进行曝光并拍照，如附图10所示。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (10)
1.一种新型非核糖体肽合成酶基因，其特征在于，所述非核糖体肽合成酶基因命名为NRPS114，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。
2.一种如权利要求1所述新型非核糖体肽合成酶基因的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：通过简并引物序列筛选的方法，从南海深海沉积物大片段文库中获得7个阳性克隆子，挑选一个进行全长测序，然后运用生物信息学软件对所得序列进行分析，即可获得所述非核糖体肽合成酶基因。
3.一种由权利要求1所述基因编码的非核糖体肽合成酶，其特征在于，所述非核糖体肽合成酶含有5个模块，共16个结构域，起始模块中含有3个结构域，分别为腺苷酰化结构域、甲基转移酶结构域和酰基载体蛋白结构域；第二模块、第三模块和第五模块均为常规模块，均含有缩合结构域、腺苷酰化结构域和酰基载体蛋白结构域；第四模块含有两个缩合结构域、一个腺苷酰化结构域和一个酰基载体蛋白结构域；末端模块即第五模块不含硫酯酶结构域。
4.一种含有如权利要求1所述非核糖体肽合成酶基因的重组质粒pCC1FOSTM Fosmid-NRPS114。
5.一种重组质粒pET28a-A-2his，其特征在于，所述重组质粒pET28a-A-2his包括分别含有如权利要求3中所述的五个腺苷酰化结构域的重组质粒pET28a-A1-2his、pET28a-A2-2his、pET28a-A3-2his、pET28a-A4-2his、pET28a-A5-2his，所述五个重组质粒均采用以下方法制备所得：分别根据五个腺苷酰化结构域的序列设计引物，以权利要求4所述的重组质粒pCC1FOSTMFosmid-NRPS114为模板，进行PCR扩增，PCR产物经凝胶电泳并回收产物1，凝胶回收产物1经限制性内切酶双酶切并回收产物2，质粒pET28a经双酶切后与回收产物2连接，获得连接产物，即得五个重组质粒pET28a-A1-2his、pET28a-A2-2his、pET28a-A3-2his、pET28a-A4-2his和pET28a-A5-2his。
6.一种表达菌株，其特征在于，所述表达菌株包括分别含有如权利要求3中所述的五个腺苷酰化结构域基因的五个大肠杆菌BL21-pET28a-A1-2his、BL21-pET28a-A2-2his、BL21-pET28a-A3-2his、BL21-pET28a-A4-2his、BL21-pET28a-A5-2his，所述五个大肠杆菌均采用以下方法构建所得：采用化转法，分别将权利要求5中所得的五个重组质粒pET28a-A1-2his、pET28a-A2-2hispET28a-A3-2his、pET28a-A4-2his、pET28a-A5-2his转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中，将细菌悬浮液恢复培养并稀释涂布于卡那霉素抗性平板上培养，挑取阳性转化子，即得腺苷酰化结构域基因的表达菌株大肠杆菌BL21-pET28a-A1-2his、BL21-pET28a-A2-2his、BL21-pET28a-A3-2his、BL21-pET28a-A4-2his和BL21-pET28a-A5-2his。
7.一种腺苷酰化结构域的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）按照权利要求5所述内容构建重组质粒pET28a-A-2his；
（2）将步骤（1）中构建的重组质粒按照权利要求6所述内容构建腺苷酰化结构域基因表达载体大肠杆菌；
（3）目的蛋白腺苷酰化结构域的诱导表达：将步骤（2）中构建得到的大肠杆菌涂布于卡那霉素抗性平板上，37℃倒置培养过夜，挑取单克隆接种于含有100μg/mL卡那霉素的液体培养基，37℃振荡培养过夜，按体积比1：50的比例转接至新鲜的卡那霉素液体培养基，于37℃、200rpm培养至OD600=0.5~0.6；加入0.1mmol/L IPTG，16℃,140rpm诱导培养20h；培养后经镍柱低压蛋白层析亲和纯化，即得重组腺苷酰化结构域。
8.如权利要求7所述的腺苷酰化结构域的制备方法，其特征在于，还包括以下步骤：
（4）目的蛋白的检测：取3mL诱导后的菌液，10,000×g离心1min，弃上清，用500μL水洗3次，用500μL10mM咪唑裂解缓冲液重悬，超声3s，停3s，连续超声5min。菌体破碎液于4℃，12000×g离心5min，分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳分析，分离胶浓度为10％，浓缩胶浓度5%。
9.如权利要求8所述的腺苷酰化结构域的制备方法，其特征在于，还包括以下步骤：
（5）目的蛋白的纯化：取2L在IPTG终浓度为0.1mM，16℃诱导表达20h的菌液，于4℃8000×g离心3min，收集菌体，水洗3次后用裂解缓冲液重悬，在300W功率下进行超声破碎，超声5s，停5s，连续超声45min，4℃13000×g离心20min，取上清，用0.22μm滤膜过滤上清除掉杂质；将过滤后的上清总蛋白通入镍柱中，收集流出液体；将收集到的液体重新上机，重复1次；分别用适量20mM、50mM、100mM、120mM、140mM、160mM、180mM、200mM、250mM咪唑缓冲液上柱，收集流出液，用于SDS-PAGE蛋白电泳分析。
10.一种采用如权利要求7所述方法得到的重组腺苷酰化结构域。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20121010 |