CN1291031C - 重组胸腺素α1的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种重组胸腺素α1的制备方法:按大肠杆菌密码子偏好性化学合成胸腺素α1基因,扩增出目的基因片段,将目的基因定向克隆到原核融合表达载体pTRX上,构建融合表达质粒pTRX-Tα1。含表达质粒pTRX-Tα1的工程菌可表达出硫氧还蛋白-胸腺素α1融合蛋白,通过亲和层析和离子交换层析纯化融合蛋白,肠激酶酶切释放出Tα1,再通过亲和层析和HPLC纯化出Tα1。试验结果表明,Tα1的生物学活性与化学合成的胸腺素α1(日达仙)相当。
Description
技术领域
本发明涉及医药生物工程技术领域,是一种重组胸腺素α1的其制备方法。
背景技术
胸腺素α1(thymosin α1,简称Tα1)是一个由28个氨基酸残基组成的多肽,具有免疫活性,临床上应用广泛,多用于治疗病毒性肝炎和作为免疫调节剂。天然Tα1的氨基酸序列为NH2-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-COOH,N端为乙酰化(GoldsteinA L,Low T L,McAdoo M,McClure J,Thurman GB,Rossio J,Lai C Y,Chang D,Wang S S,Harvey C,Ramel A H,Meienhofer.J.Thymosin alpha 1:isolation and sequenceanalysis of an immunological active thymic peptide.Proc Natl Acad Sci USA,1977,74(2):725~729)。目前Tα1单体只有一种来源,即采用固相合成法全合成,成本高,易造成环境污染。至今国内临床所用均为国外进口合成Tα1制剂,由于制备工艺成本高,故售价昂贵,如美国Sciclone公司生产的Zadaxin(中文名为日达仙)国内零售价高达900元/1.6毫克。
发明内容
本发明采用基因工程技术制备重组胸腺素α1,以克服化学合成成本高且污染环境等缺点。
本发明采用原核融合表达的方法来制备重组胸腺素α1,包括:(1)具有工程菌密码子偏好性胸腺素α1基因的合成以及融合表达载体的构建;(2)工程菌的构建及发酵;(3)重组胸腺素α1的制备与纯化。
本发明具体采用大肠杆作为工程菌,其具体步骤如下:
(1)具有大肠杆菌工程菌密码子偏好性胸腺素α1基因的合成以及融合表达载体的构建的具体方法如下:按大肠杆菌密码子偏好性化学合成胸腺素α1基因,其核苷酸序列为5’-TCT GAT GCT GCG GTC GAT ACC AGC AGT GAA ATA ACT ACG AAA GACTTA AAA GAA AAG AAA GAG GTT GTG GAA GAA GCC GAG AAC-3’,以5’-GGGGTACC TCTGATGCTGCGGTCGAT-3’为上游引物、5’-GTCAT
GCGGCCGC GTTCTCGGCTTCTTCCACAA-3’为下游引物,扩增出目的基因片段,通过Kpn I/Not I双酶切后,将目的基因定向克隆到原核融合表达载体pTRX上,构建融合表达质粒pTRX-Tα1。
(2)大肠杆菌工程菌的构建及发酵培养:将上述的融合表达质粒pTRX-Tα1转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)株,经测序鉴定后得到工程菌DE3/pTRX-Tα1。该工程菌采用发酵培养,以终浓度为1mmol的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导,诱导3.5小时,终止发酵,收获菌体。
(3)重组胸腺素α1的制备与纯化:含表达质粒pTRX-Tα1的工程菌可表达出硫氧还蛋白-胸腺素α1融合蛋白,通过亲和层析和离子交换层析纯化融合蛋白,肠激酶酶切释放出Tα1,再通过亲和层析和HPLC纯化出Tα1。
该重组胸腺素α1与由28个氨基酸残基组成的天然Tα1的氨基酸序列完全一致,且具有与天然Tα1相当的生物活性。
本发明制备方法简单,成本低廉,且不会造成环境污染。
具体实施方式
现结合实施例对本发明重组胸腺素α1(Tα1)的制备作详细描述:
实施例1:融合表达质粒pTRX-Tα1的构建
1.试剂与材料
载体质粒pTRX由中山大学生命科学学院彭立胜博士构建,已申请国家发明专利,申请号为00124832;大肠杆菌E.coli BL21(DE3)购自Stratagene公司,胸腺素α1基因由上海博亚生物技术公司合成;限制性内切酶和T4DNA连接酶购自New England公司,PCR引物由上海博亚生物技术公司合成,胶回收试剂盒购自Omega生物技术公司。
2.方法
(1)寡核苷酸引物:
上游引物:5’-GG
GGTACC TCTGATGCTGCGGTCGAT-3’
下游引物:5’-GTCAT
GCGGCCGC GTTCTCGGCTTCTTCCACAA-3’上游引物内含Kpn I酶切位点(单下划线)、肠激酶识别位点(双下划线),下游引物内含Not I(单下划线)酶切位点和强终止子(双下划线)。
(2)胸腺素α1基因的合成:
根据大肠杆菌密码子的偏好性,合成胸腺素α1基因,其序列如下:5’-TCT GAT GCTGCG GTC GAT ACC AGC AGT GAA ATA ACT ACG AAA GAC TTA AAA GAA AAGAAA GAG GTT GTG GAA GAA GCC GAG AAC-3’。
(3)PCR扩增:以合成胸腺素α1基因为模板,取上游引物和下游引物然后进行PCR反应,反应条件为:94℃变性5分钟,进入循环,94℃变性30秒、58℃退火30秒、72℃延伸30秒,共25个循环,再在72℃延伸10分钟。
(4)重组质粒的构建:将PCR扩增产物经2%的琼脂糖凝胶电泳鉴定,胶回收,经Kpn I和Not I分别双酶切后回收的DNA片段,然后与经Kpn I和Not I酶切后的质粒载体pTRX连接,转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)株,通过酶切鉴定转化子。
将上述酶切鉴定的重组质粒测序,获得正确序列和读码框的重组质粒,称为融合表达质粒pTRX-Tα1。重组胸腺素α1的核苷酸序列与其相应的氨基酸序列见序列表。上述含重组质粒pTRX-Tα1的大肠杆菌BL21(DE3)为工程菌,将工程菌DE3/pTRX-Tα1用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)可诱导表达融合蛋白Trx-Tα1。
实施例2:大肠杆菌工程菌DE3/pTRX-Tα1的发酵
1.工程菌和质粒:工程菌BL21(DE3)/pTRX-Tα1;
2.培养基:
一级种子菌活化用LB培养基(g/L):蛋白胨10g,酵母粉5g,NaCl 10g;
二级种子菌活化用2YT培养基(g/L):蛋白胨16g,酵母粉10g,NaCl 5g;
发酵罐发酵培养基(g/L):蛋白胨12g,酵母粉12g,NaCl 5g,KH2PO4 4g,MgSO4·7H2O 1g,K2HPO4 5g,葡萄糖2g;发酵时将上述培养基混合;
补料碳源(400ml):葡萄糖40g,MgSO4·7H2O 3g;
补料氮源(g/L):37g蛋白胨,37g酵母粉;
3.种子菌的活化:取在-70℃、20%甘油中保藏的工程菌株划板,37℃培养约16hr,挑单克隆接种于含200ml LB培养基(含氨苄青霉素100μg/ml)的锥形瓶中,37℃、250rpm培养10hr左右,然后按2YT培养基量的1%转种1次,在相同条件下培养14.5hr即成为活化种子菌。
4.高密度发酵培养:10L发酵罐中加入8L发酵用培养基,按1∶25的比例加入活化种子菌,另加入少量消泡剂(按50μl单位体积加入),发酵温度37℃,起始转速300rpm。
发酵过程的几个重要参数:
1)溶氧量及转速:溶解氧量制在30%-60%左右,起始转速控制在300rpm,菌体生长旺盛、溶氧不足时最大转速可达800rpm;
2)pH值:自动流加2N的HCL或4N的NaOH调节pH至7.0;
3)补料的流加:当加入种子菌后2hr开始补加碳源,10L发酵罐补充400ml,诱导前30min左右完成;当加入种子菌后3hr开始补加氮源,10L发酵罐补充2000ml,诱导完毕前1hr左右完成。
5.IPTG诱导表达:接种5hr后加入IPTG进行诱导表达,诱导的终浓度为0.6mM,诱导1hr后将IPTG的浓度补充至1mM,IPTG的终浓度为1mM,37℃诱导后3.5小时结束。
6.菌体收集:4℃,5000rpm离心10min收集菌体,得到湿菌体300克(10L发酵罐)。
实施例3:重组Tα1多肽的制备与纯化:
按每克湿菌加入10ml的比例加入超声缓冲液,冰浴中超声破碎菌体,离心,取上清,进行Ni2+-Chelating Sepharose柱进行亲和层析和Q Sepharose Fast Flow离子交换层析纯化融合蛋白。按每μl肠激酶酶切4mg融合蛋白的比例加入肠激酶,20℃反应16小时。将肠激酶酶切的裂解液过Ni2+-Chelating Sepharose柱,收集穿过峰,通过HPLC纯化获得重组胸腺素α1,其分子量为3066道尔顿。具体步骤如下:
1.将发酵菌液离心收集菌体,按10ml溶液/g湿菌的比例,用50mM Tris-HCl(pH8.0),0.5M NaCl溶液重新悬浮菌体。采用Branson 450型超声波细胞粉碎机破碎细菌,探头型号为1/2″,以70%的功率在冰浴下超声15-25min(超声8sec,间歇4sec)。4℃、10,000rpm离心30min(BECKMAN AVANTITM J-25),收集上清。
2.上清过Ni2+-Chelating Sepharose亲和层析柱,弃去穿过峰;用Tris-HCl(pH 7.0),0.5M NaCl,20mM咪唑溶液洗脱,直至平台期;用Tris-HCl(pH 7.0),0.5M NaCl,150mM咪唑溶液洗脱,收集洗脱峰;通过Sephadex G-25柱更换成20mM Tris-HCl(pH8.0),20mM NaCl缓冲液后上Q Sepharose Fast Flow柱,用50mM Tris-HCl(pH8.0),150mM NaCl进行洗脱,收集洗脱峰用于酶切。
3.将获得的融合蛋白样品用肠激酶(EK)切割,在Trx-Tα1融合蛋白溶液中加入肠激酶(EK),在20℃切割16hr后(或20hr),按每μl肠激酶切割4mg融和蛋白的比例酶切。
4.酶切裂解液过过Ni2+-Chelating Sepharose亲和层析柱,收集含Tα1的穿过峰,通过Sephadex G-10柱将Tα1更换成超纯水。
5.过HPLC柱(C18),流动相A(100%乙晴),流动相B(0.01M KH2PO4),按5%流动相A到30%流动相A剃度进行洗脱,洗脱时间为30分钟,收集洗脱峰4。
实施例4:重组胸腺素α1的活性测定
1.E玖瑰花结实验:按常规方法分离健康人外周血单核细胞,小牛血清调整细胞数至2×105/ml。各取200ul细胞液入试管,分别加入样品。37℃水浴90分钟。每支试管中加入200μl绵羊红细胞(2×108/ml),4℃放置2-3小时;涂片,染色,于高倍镜下计数200个淋巴细胞中形成玖瑰花结的细胞数(结合3个及3个以上绵羊红细胞),计算玖瑰花形成细胞的百分数,按公式“样品活力=供试品测定管E玫瑰花结百分率-对照管E玫瑰花结百分率”计算激活率。供试品测定管E玫瑰花结百分率与对照管E玫瑰花结百分率之差不得低于10.0%,结果见表1。
表1 重组Tα1对E-玫瑰花结形成率的影响
由表1可见:Tα1可显著提高人外周血淋巴细胞E-玫瑰花结形成率,且其作用与进口的合成Tα1(日达仙)相当。
本发明具有以下优点:
1.采用基因工程方法制备重组胸腺素α1(Tα1),克服了化学合成成本高,且污染环境的缺点。
2.获得的重组Tα1经E-玫瑰花结试验显示,重组Tα1可显著提高人外周血淋巴细胞E-玫瑰花结形成率,对小鼠脾细胞增殖具有显著促进作用,且重组Tα1的生物学活性与进口的合成Tα1(日达仙)相当。
Claims (4)
1.重组胸腺素α1的制备方法,其特征在于:选用大肠杆菌作为工程菌,按照以下步骤进行
(1)具有大肠杆菌工程菌密码子偏好性胸腺素α1基因的融合表达载体的构建:
(1.a)按大肠杆菌密码子偏好性化学合成胸腺素α1基因,其核苷酸序列为5’-TCTGAT GCT GCG GTC GAT ACC AGC AGT GAA ATA ACT ACG AAA GAC TTA AAAGAA AAG AAA GAG GTT GTG GAA GAA GCC GAG AAC-3’:
(1.b)以5’-GG
GGTACC
TCTGATGCTGCGGTCGAT-3’为上游引物、5’-GTCAT
GCGGCCGC
GTTCTCGGCTTCTTCCACAA-3’为下游引物,扩增出目的基因片段;
(1.c)目的基因片段通过酶切后,将目的基因定向克隆到原核融合表达载体pTRX上,构建融合表达质粒pTRX-Tα1。
(2)工程菌的构建及发酵培养:
(2.a)将上述的融合表达质粒pTRX-Tα1转化大肠杆菌;
(2.b)大肠杆菌工程菌发酵培养;
(3)重组胸腺素α1的制备与纯化。
2.按权利要求1所述的重组胸腺素α1的制备方法,其特征在于:步骤(2.b)大肠杆菌工程菌发酵培养采用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导后,终止发酵,收获菌体。
3.按权利要求1所述的重组胸腺素α1的制备方法,其特征在于:步骤(3)重组胸腺素α1的制备与纯化是将含表达质粒pTRX-Tα1的工程菌表达出的硫氧还蛋白-胸腺素α1融合蛋白通过亲和层析和离子交换层析纯化融合蛋白,肠激酶酶切释放出Tαl,再通过亲和层析和HPLC纯化出Tαl。
4.按权利要求1所述的重组胸腺素α1的制备方法,其特征在于所用的大肠杆菌工程菌为BL21-DE3/pTRX-Tα1。
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