CN1661037A - 重组胸腺素α1的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种重组胸腺素α1的制备方法：按大肠杆菌密码子偏好性化学合成胸腺素α1基因，扩增出目的基因片段，将目的基因定向克隆到原核融合表达载体pTRX上，构建融合表达质粒pTRX－Tα1。含表达质粒pTRX－Tα1的工程菌可表达出硫氧还蛋白—胸腺素α1融合蛋白，通过亲和层析和离子交换层析纯化融合蛋白，肠激酶酶切释放出Tα1，再通过亲和层析和HPLC纯化出Tα1。试验结果表明，Tα1的生物学活性与化学合成的胸腺素α1(日达仙)相当。
Description
技术领域
本发明涉及医药生物工程技术领域，是一种重组胸腺素α1的其制备方法。
背景技术
胸腺素α1(thymosin α1，简称Tα1)是一个由28个氨基酸残基组成的多肽，具有免疫活性，临床上应用广泛，多用于治疗病毒性肝炎和作为免疫调节剂。天然Tα1的氨基酸序列为NH2-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-COOH，N端为乙酰化(GoldsteinA L，Low T L，McAdoo M，McClure J，Thurman GB，Rossio J，Lai C Y，Chang D，Wang S S，Harvey C，Ramel A H，Meienhofer.J.Thymosin alpha 1：isolation and sequenceanalysis of an immunological active thymic peptide.Proc Natl Acad Sci USA，1977，74(2)：725～729)。目前Tα1单体只有一种来源，即采用固相合成法全合成，成本高，易造成环境污染。至今国内临床所用均为国外进口合成Tα1制剂，由于制备工艺成本高，故售价昂贵，如美国Sciclone公司生产的Zadaxin(中文名为日达仙)国内零售价高达900元/1.6毫克。
发明内容
本发明采用基因工程技术制备重组胸腺素α1，以克服化学合成成本高且污染环境等缺点。
本发明采用原核融合表达的方法来制备重组胸腺素α1，包括：(1)具有工程菌密码子偏好性胸腺素α1基因的合成以及融合表达载体的构建；(2)工程菌的构建及发酵；(3)重组胸腺素α1的制备与纯化。
本发明具体采用大肠杆作为工程菌，其具体步骤如下：
(1)具有大肠杆菌工程菌密码子偏好性胸腺素α1基因的合成以及融合表达载体的构建的具体方法如下：按大肠杆菌密码子偏好性化学合成胸腺素α1基因，其核苷酸序列为5’-TCT GAT GCT GCG GTC GAT ACC AGC AGT GAA ATA ACT ACG AAA GACTTA AAA GAA AAG AAA GAG GTT GTG GAA GAA GCC GAG AAC-3’，以5’-GGGGTACC
TCTGATGCTGCGGTCGAT-3’为上游引物、5’-GTCAT
GCGGCCGC
GTTCTCGGCTTCTTCCACAA-3’为下游引物，扩增出目的基因片段，通过Kpn I/Not I双酶切后，将目的基因定向克隆到原核融合表达载体pTRX上，构建融合表达质粒pTRX-Tα1。
(2)大肠杆菌工程菌的构建及发酵培养：将上述的融合表达质粒pTRX-Tα1转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)株，经测序鉴定后得到工程菌DE3/pTRX-Tα1。该工程菌采用发酵培养，以终浓度为1mmol的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导，诱导3.5小时，终止发酵，收获菌体。
(3)重组胸腺素α1的制备与纯化：含表达质粒pTRX-Tα1的工程菌可表达出硫氧还蛋白—胸腺素α1融合蛋白，通过亲和层析和离子交换层析纯化融合蛋白，肠激酶酶切释放出Tα1，再通过亲和层析和HPLC纯化出Tα1。
该重组胸腺素α1与由28个氨基酸残基组成的天然Tα1的氨基酸序列完全一致，且具有与天然Tα1相当的生物活性。
本发明制备方法简单，成本低廉，且不会造成环境污染。
具体实施方式
现结合实施例对本发明重组胸腺素α1(Tα1)的制备作详细描述：
实施例1：融合表达质粒pTRX-Tα1的构建
1.试剂与材料
载体质粒pTRX由中山大学生命科学学院彭立胜博士构建，已申请国家发明专利，申请号为00124832；大肠杆菌E.coli BL21(DE3)购自Stratagene公司，胸腺素α1基因由上海博亚生物技术公司合成；限制性内切酶和T4DNA连接酶购自New England公司，PCR引物由上海博亚生物技术公司合成，胶回收试剂盒购自Omega生物技术公司。
2.方法
(1)寡核苷酸引物：
上游引物：5’-GG
GGTACC
TCTGATGCTGCGGTCGAT-3’
下游引物：5’-GTCAT
GCGGCCGC
GTTCTCGGCTTCTTCCACAA-3’
上游引物内含Kpn I酶切位点(单下划线)、肠激酶识别位点(双下划线)，下游引物内含Not I(单下划线)酶切位点和强终止子(双下划线)。
(2)胸腺素α1基因的合成：
根据大肠杆菌密码子的偏好性，合成胸腺素α1基因，其序列如下：5’-TCT GAT GCTGCG GTC GAT ACC AGC AGT GAA ATA ACT ACG AAA GAC TTA AAA GAA AAGAAA GAG GTT GTG GAA GAA GCC GAG AAC-3’。
(3)PCR扩增：以合成胸腺素α1基因为模板，取上游引物和下游引物然后进行PCR反应，反应条件为：94℃变性5分钟，进入循环，94℃变性30秒、58℃退火30秒、72℃延伸30秒，共25个循环，再在72℃延伸10分钟。
(4)重组质粒的构建：将PCR扩增产物经2％的琼脂糖凝胶电泳鉴定，胶回收，经Kpn I和Not I分别双酶切后回收的DNA片段，然后与经Kpn I和Not I酶切后的质粒载体pTRX连接，转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)株，通过酶切鉴定转化子。
将上述酶切鉴定的重组质粒测序，获得正确序列和读码框的重组质粒，称为融合表达质粒pTRX-Tα1。重组胸腺素α1的核苷酸序列与其相应的氨基酸序列见序列表。上述含重组质粒pTRX-Tα1的大肠杆菌BL21(DE3)为工程菌，将工程菌DE3/pTRX-Tα1用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)可诱导表达融合蛋白Trx-Tα1。
实施例2：大肠杆菌工程菌DE3/pTRX-Tα1的发酵
1.工程菌和质粒：工程菌BL21(DE3)/pTRX-Tα1；
2.培养基：
一级种子菌活化用LB培养基(g/L)：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g；
二级种子菌活化用2YT培养基(g/L)：蛋白胨16g，酵母粉10g，NaCl 5g；
发酵罐发酵培养基(g/L)：蛋白胨12g，酵母粉12g，NaCl 5g，KH2PO4 4g，MgSO4·7H2O 1g，K2HPO4 5g，葡萄糖2g；发酵时将上述培养基混合；
补料碳源(400ml)：葡萄糖40g，MgSO4·7H2O 3g；
补料氮源(g/L)：37g蛋白胨，37g酵母粉；
3.种子菌的活化：取在-70℃、20％甘油中保藏的工程菌株划板，37℃培养约16hr，挑单克隆接种于含200ml LB培养基(含氨苄青霉素100μg/ml)的锥形瓶中，37℃、250rpm培养10hr左右，然后按2YT培养基量的1％转种1次，在相同条件下培养14.5hr即成为活化种子菌。
4.高密度发酵培养：10L发酵罐中加入8L发酵用培养基，按1∶25的比例加入活化种子菌，另加入少量消泡剂(按50μl单位体积加入)，发酵温度37℃，起始转速300rpm。
发酵过程的几个重要参数：
1)溶氧量及转速：溶解氧量制在30％-60％左右，起始转速控制在300rpm，菌体生长旺盛、溶氧不足时最大转速可达800rpm；
2)pH值：自动流加2N的HCL或4N的NaOH调节pH至7.0；
3)补料的流加：当加入种子菌后2hr开始补加碳源，10L发酵罐补充400ml，诱导前30min左右完成；当加入种子菌后3hr开始补加氮源，10L发酵罐补充2000ml，诱导完毕前1hr左右完成。
5.IPTG诱导表达：接种5hr后加入IPTG进行诱导表达，诱导的终浓度为0.6mM，诱导1hr后将IPTG的浓度补充至1mM，IPTG的终浓度为1mM，37℃诱导后3.5小时结束。
6.菌体收集：4℃，5000rpm离心10min收集菌体，得到湿菌体300克(10L发酵罐)。
实施例3：重组Tα1多肽的制备与纯化：
按每克湿菌加入10ml的比例加入超声缓冲液，冰浴中超声破碎菌体，离心，取上清，进行Ni2+-Chelating Sepharose柱进行亲和层析和Q Sepharose Fast Flow离子交换层析纯化融合蛋白。按每μl肠激酶酶切4mg融合蛋白的比例加入肠激酶，20℃反应16小时。将肠激酶酶切的裂解液过Ni2+-Chelating Sepharose柱，收集穿过峰，通过HPLC纯化获得重组胸腺素α1，其分子量为3066道尔顿。具体步骤如下：
1.将发酵菌液离心收集菌体，按10ml溶液/g湿菌的比例，用50mM Tris-HCl(pH8.0)，0.5M NaCl溶液重新悬浮菌体。采用Branson 450型超声波细胞粉碎机破碎细菌，探头型号为1/2″，以70％的功率在冰浴下超声15-25min(超声8sec，间歇4sec)。4℃、10,000rpm离心30min(BECKMAN AVANTITM J-25)，收集上清。
2.上清过Ni2+-Chelating Sepharose亲和层析柱，弃去穿过峰；用Tris-HCl(pH7.0)，0.5M NaCl，20mM咪唑溶液洗脱，直至平台期；用Tris-HCl(pH7.0)，0.5M NaCl，150mM咪唑溶液洗脱，收集洗脱峰；通过Sephadex G-25柱更换成20mM Tris-HCl(pH8.0)，20mM NaCl缓冲液后上Q Sepharose Fast Flow柱，用50mM Tris-HCl(pH8.0)，150mM NaCl进行洗脱，收集洗脱峰用于酶切。
3.将获得的融合蛋白样品用肠激酶(EK)切割，在Trx-Tα1融合蛋白溶液中加入肠激酶(EK)，在20℃切割16hr后(或20hr)，按每μl肠激酶切割4mg融和蛋白的比例酶切。
4.酶切裂解液过过Ni2+-Chelating Sepharose亲和层析柱，收集含Tα1的穿过峰，通过Sephadex G-10柱将Tα1更换成超纯水。
5.过HPLC柱(C18)，流动相A(100％乙晴)，流动相B(0.01 M KH2PO4)，按5％流动相A到30％流动相A剃度进行洗脱，洗脱时间为30分钟，收集洗脱峰4。
实施例4：重组胸腺素α1的活性测定
1.E玖瑰花结实验：按常规方法分离健康人外周血单核细胞，小牛血清调整细胞数至2×105/ml。各取200ul细胞液入试管，分别加入样品。37℃水浴90分钟。每支试管中加入200μl绵羊红细胞(2×108/ml)，4℃放置2-3小时；涂片，染色，于高倍镜下计数200个淋巴细胞中形成玖瑰花结的细胞数(结合3个及3个以上绵羊红细胞)，计算玖瑰花形成细胞的百分数，按公式“样品活力＝供试品测定管E玫瑰花结百分率—对照管E玫瑰花结百分率”计算激活率。供试品测定管E玫瑰花结百分率与对照管E玫瑰花结百分率之差不得低于10.0％，结果见表1。
表1 重组Tα1对E-玫瑰花结形成率的影响
由表1可见：Tα1可显著提高人外周血淋巴细胞E-玫瑰花结形成率，且其作用与进口的合成Tα1(日达仙)相当。
本发明具有以下优点：
1.采用基因工程方法制备重组胸腺素α1(Tα1)，克服了化学合成成本高，且污染环境的缺点。
2.获得的重组Tα1经E-玫瑰花结试验显示，重组Tα1可显著提高人外周血淋巴细胞E-玫瑰花结形成率，对小鼠脾细胞增殖具有显著促进作用，且重组Tα1的生物学活性与进口的合成Tα1(日达仙)相当。
Claims (5)
1.重组胸腺素α1的制备方法，按照以下步骤进行：
(1)具有工程菌密码子偏好性胸腺素α1基因的融合表达载体的构建；
(2)工程菌的构建及发酵；
(3)重组胸腺素α1的制备与纯化。
2.按权利要求1所述的重组胸腺素α1的制备方法，其特征在于：选用大肠杆菌作为工程菌，按照以下步骤进行
(1)具有大肠杆菌工程菌密码子偏好性胸腺素α1基因的融合表达载体的构建：
(1.a)按大肠杆菌密码子偏好性化学合成胸腺素α1基因，其核苷酸序列为5’-TCTGAT GCT GCG GTC GAT ACC AGC AGT GAA ATA ACT ACG AAA GAC TTA AAAGAA AAG AAA GAG GTT GTG GAA GAA GCC GAG AAC-3’；
(1.b)以5’-GG
GGTACC TCTGATGCTGCGGTCGAT-3’为上游引物、5’-GTCAT
GCGGCCGC 
GTTCTCGGCTTCTTCCACAA-3’为下游引物，扩增出目的基因片段；
(1.c)目的基因片段通过酶切后，将目的基因定向克隆到原核融合表达载体pTRX上，构建融合表达质粒pTRX-Tα1。
(2)工程菌的构建及发酵培养：
(2.a)将上述的融合表达质粒pTRX-Tα1转化大肠杆菌；
(2.b)大肠杆菌工程菌发酵培养；
(3)重组胸腺素α1的制备与纯化。
3.按权利要求2所述的重组胸腺素α1的制备方法，其特征在于：步骤(2.b)大肠杆菌工程菌发酵培养采用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导后，终止发酵，收获菌体。
4.按权利要求2所述的重组胸腺素α1的制备方法，其特征在于：步骤(3)重组胸腺素α1的制备与纯化是将含表达质粒pTRX-Tα1的工程菌表达出的硫氧还蛋白-胸腺素α1融合蛋白通过亲和层析和离子交换层析纯化融合蛋白，肠激酶酶切释放出Tα1，再通过亲和层析和HPLC纯化出Tα1。
5.按权利要求2所述的重组胸腺素α1的制备方法，其特征在于所用的大肠杆菌工程菌为BL21-DE3/pTRX-Tα1。
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