CN1896106A - 一种人血清白蛋白融合长效干扰素制备工艺 - Google Patents

一种人血清白蛋白融合长效干扰素制备工艺 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种人血清白蛋白融合的长效干扰素蛋白,编码融合蛋白的DNA序列,以及本融合蛋白工业化生产制备的工艺方法和条件。本发明的融合蛋白有比较高的干扰素生物学活性,并且能明显的延长干扰素的半衰期。

Description

一种人血清白蛋白融合长效干扰素制备工艺
技术领域
本发明涉及重组人血清白蛋白融合长效干扰素的制备,用这种制备方法生产的干扰素能明显延长干扰素在体内的作用时间,可用于人类相关疾病的治疗。
背景技术
人血清白蛋白(HSA)是一种可溶性单体蛋白质,构成血液中的蛋白质总量的一半。白蛋白作为一种基本载体,携带传递脂肪酸、类固醇和激素分子等,其稳定的惰性性质是维持血压的一个重要因素。人血清白蛋白是一种球状非糖基化的,分子量为65Kd的蛋白质。人血清白蛋白的基因位于4号染色体上,有16961个碱基对,分为15个间隔区,经RNA加工拼接后形成的mRNA可编码一个具有585个氨基酸的蛋白质。这一蛋白在经过高尔基体的转化加工,去除分泌信号而分泌到细胞外。人血清白蛋白有35个半胱氨酸,构成17个二硫键的单体(Brown JR,The structure,functional and application of human albumin,Pergamon,NY 1977)。人血清白蛋白具有多种多态形及30种不同的遗传分子(Weikamp,CR,humangenomic Annual,37:219-226,1973)。人血清白蛋白分子的三维结构已经由X光衍射法测定(Carter,Science,244,1195-1198,1989)。人血清白蛋白是血液种的主要成分,在人体内含量为每升血液含40克,半衰期寿命为14-20天。综上所述,人血清白蛋白具有极大的优势使之可抵御生物体内酶的作用,并可使治疗性蛋白质以较高的剂量使用。
目前用于临床的人血清白蛋白均是从人血浆中提取的。利用微生物重组表达白蛋白(rHSA)的生产专利已经公开,EP330451和EP361991。
干扰素(IFN)是一种多功能细胞因子,其首先被发现的生物活性是抵制抗性病毒感染。多年以来,干扰素的抗病毒活性是其唯一的生物功能。如今,发现干扰素有许多其它生物功能,如作用于细胞的生长、分化和免疫调节等活性可能具有更大的生物学意义。
干扰素有两个完全不同的家族,分为I型和II型。I型干扰素主要包括IFNα和IFNβ,II型干扰素为IFNγ。I型干扰素的主要作用是抗病毒,IFNα和IFNβ两者共同用一种受体,但具有完全不同的免疫原性。IFNα主要由人白细胞产生,称为白细胞干扰素,IFNβ主要由成纤维细胞产生,称为成纤维细胞干扰素。IFNα有很多亚型,如IFNα-1、IFNα-2、IFNα-3等约有20种亚型,此外还有亚亚型,如IFNα-1a、IFNα-1b、IFNα-2a、IFNα-2b等,IFN-α有几十种之多。IFNβ尚未发现有亚型。II型干扰素主要由T细胞产生;主要活性是参与免疫调节,是体内重要的免疫调节因子,又称免疫干扰素。IFNγ只有一种活性形式的蛋白质,没有其它的亚型。
干扰素是具有广泛生物学活性的调节蛋白质,具有抗病毒、免疫调节的作用,对多种肿瘤细胞具有辅助性杀灭或抑制增殖作用,还能抑制癌基因表达从而阻止或减慢正常细胞向肿瘤细胞转化的过程。自80年代开始研制出重组人干扰素以来,目前有60多个国家批准上市。广泛用于乙肝、丙肝;白血病;疱疹、湿疣;肾癌、膀胱癌;淋巴瘤、骨髓瘤、黑色素瘤等多种病毒性疾病和肿瘤的治疗。但普通干扰素也存在某些不够理想之处,由于干扰素分子量小,易被肾小球滤过,所以皮下注射后吸收很快,半衰期短,容易被酶水解等,一般要每天注射,至少每周注射三次,应用不够方便。而干扰素治疗肝炎、肿瘤、类风湿及多发性硬化症等疾病时,治疗周期常常长达数月甚至数年,这种长期大剂量频繁用药增加了病人的痛苦和治疗费用而且易产生发烧、疲乏、食欲减退及流感样症状等毒副作用。
聚乙二醇(PEG)修饰的干扰素是FDA批准的临床上使用的半衰期最长的长效干扰素,PEG与干扰素连结可延长血中干扰素半哀期,使干扰素活性可延续至一周,每周只肌注一次,相当于普通干扰素每日肌注效果,并可提高疗效。但是PEG价格贵,PEG与干扰素的修饰工艺复杂,从而使聚乙二醇修饰的干扰素成本太高,增大了病人的治疗费用。
军事医学科学院生物工程研究所的血清白蛋白与干扰素的融合蛋白专利(公开号CN140518A)中,在血清白蛋白与干扰素蛋白连接中设有连接肽(GlyGlyGlyGlySer)n,n为1-10的整数。在融合蛋白中包含有外源蛋白的序列,外源蛋白序列的存在对其免疫原性和治疗效果的影响尚缺乏文献资料。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人血清白蛋白与人干扰素蛋白融合蛋白的制备方法。
本发明的融合蛋白中,人血清白蛋白C末端与人干扰素蛋白的N末端直接相联,人血清白蛋白和人干扰素蛋白之间没有连接肽,融合蛋白仍具有比较高的干扰素生物学活性。
本发明的另一个目的是提供了适合于酵母表达系统的编码本发明融合蛋白的DNA序列。包括经密码子优化的人血清白蛋白DNA序列和人干扰素DNA序列,利用本发明融合蛋白DNA序列,在酵母系统中可获得高表达。
本发明的另一个目的是提供携带编码本发明蛋白的DNA序列的重组表达载体。本发明中的pAO815、pUC18等表达载体从Invitrogen Corp(San Diego California USA)公司购得,将编码本发明中的融合蛋白的核酸克隆至酵母的表达载体pAO815中,这些质粒为酵母整合型质粒,带有醇氧化酶操纵子(AOX1)5’和3’序列,用于方便编码基因整合至酵母染色体和控制编码基因的表达。
本发明的又一个目的是提供含有本发明融合蛋白编码基因的宿主。本发明的宿主为可以被重组表达载体转化,含有本发明蛋白编码基因的细菌、酵母或动物细胞;其中优选的是酵母,更优选的是毕氏酵母,最优选的是GS115。
本发明的再一个目的是提供了高效表达融合蛋白的发酵工艺和纯化工艺条件。发酵包括菌体生长阶段和融合蛋白表达两个阶段,通过对发酵条件的控制,特别是融合蛋白表达阶段的补料组成、pH、培养温度、溶解氧等条件的控制使融合蛋白得到高效表达。融合蛋白的纯化用硫酸铵分级沉淀、透析、液相层析等方法,优选的是使用组合的蛋白质液相层析方法,使目标蛋白的纯度达到95%以上。
编码人血清白蛋白的初始DNA序列是通过PCR方法从人胎肝cDNA文库(从ClontechLaboratories Inc.USA购买)中获得。根据初始的DNA序列信息,使用单个核苷酸定点突变技术,一方面使密码子转换为酵母偏爱的密码子;另一方面改变序列中的氨基酸,使其氨基酸序列与中国人群中最广泛分布的白蛋白的氨基酸序列相一致,此外,通过对RNA二级结构的改变,提高mRNA稳定性并促进蛋白质翻译的效率。编码人干扰素的初始DNA序列可以通过RT-PCR的方法从用新城鸡瘟病毒诱导的人外周血白细胞的中获得,通过定点突变技术,使密码子转换为酵母偏爱的密码子。通过重叠PCR技术获得编码融合蛋白的基因。
在酵母中表达融合蛋白时,可以分泌到酵母细胞外的培养液中或存在于酵母细胞内,优选的是从酵母细胞中分泌出来。要从酵母中分泌出来必需要有分泌所用的信号肽,可以使用酵母本身的信号肽或天然的人血清白蛋白的信号肽。优选的是使用酵母本身的信号肽,如α-交配因子前导肽、酸性磷酸酶信号肽、蔗糖酶信号肽,最优选的是α-交配因子前导肽。
转化质粒上包含的融合蛋白编码基因到酵母细胞中可以使用电穿孔等方法,转化成功的酵母经裂解并提取DNA,然后用PCR方法鉴定。转化成功的酵母工程菌经过表达筛选,选取蛋白表达量较高、传代稳定的菌种。
通过摇瓶培养和发酵罐培养工程菌,经过对发酵培养的条件的优化,使融合蛋白得到了高效的表达。一般pH控制在2.0-7.0,优选的是4.0-6.0。溶解氧控制在10%-100%,优选的是30-50%。补料组成是甘油和甲醇,甲醇含量的比例是50%-100%,优选的是70%-80%。经过72小时的发酵后,培养上清液中融合蛋白的浓度大于200mg/L,占发酵上清液中总蛋白的80%以上。
在培养过程中,融合蛋白分泌到胞外的培养液中,通过离心除去菌体。上清液调整pH到6.0-10.0,优选的是7.0-8.0,然后通过亲和层析柱干扰素抗体偶联柱收集上清液中的融合蛋白,在用甘氨酸—盐酸洗脱液洗脱融合蛋白,优选的是pH为3.0,浓度为100mM-500mM。经亲和柱纯化的融合蛋白溶液中加入3M硫酸铵溶液,调节硫酸铵的终浓度为0.5-2.0M,优选的是0.8-1.5M,然后用Phenyl High Performance(AmershamBiosciences Sweezland)精纯化融合蛋白,用含0.1-0.5M的硫酸铵洗脱目标蛋白,更优选的是0.2M-0.3M的硫酸铵溶液洗脱。
附图说明
图1为人血清白蛋白干扰素alpha2b融合基因序列。
图2为携带编码本发明蛋白的DNA序列的重组表达载体的示意图。
图3为本发明的纯化图谱。以及,
图4为融合蛋白电泳图。
具体实施方式
本发明有关于一种人血清白蛋白与人干扰素蛋白融合蛋白的制备方法,该方法至少包括以下步骤:
(a)人血清白蛋白基因的克隆和密码子优化;
(b)人干扰素alpha2b基因克隆和密码子优化;
(c)人血清白蛋白基因和人干扰素alpha2b基因连接和表达质粒的构建;
(d)电转化毕赤酵母和表达菌种筛选;
(e)发酵培养;以及,
(f)融合蛋白纯化。
其中,在步骤(a)中,用PCR法从人胎肝cDNA文库中获得HSA cDNA。ALBF除包括HSA基因的5’端序列外,还在其5’端前加入了Kex2酶切信号识别序列(下划线部分):
ALBF:5’ AAAAGAGATGCACACAAGAGTGAGGTTGC3’
ALBB:5’TAAGCCTAAGGCAGCTTGACTTGC3’
PCR反应条件为:50μl体系中加入5μl 10X PCR反应缓冲液,5μl 25mM MgCl2,0.2μl 25mM dNTPs,25mM引物ALBF和ALBB各1μl,pfuDNA聚合酶(Cytokina Inc)5U,1μl人胎肝cDNA文库,其余用双蒸水补足。PCR反应在PCR仪中进行,程序为94℃变性30秒,55℃退火30秒,72℃延伸6分钟,30个循环后,72℃延伸10分钟。凝胶电泳显示PCR产物在1.7kb左右,与预期HSA大小一致。用PCR产物回收试剂盒纯化目标条带。取纯化的HSA cDNA 4ul,加入1ul pGEM-T载体,2ul 5X缓冲液1ul T4DNA连接酶,2ul双蒸水(pGEM-T载体缓冲液和酶为Promega CorpUSA产品),16度反应过夜,转化DH5a感受态细胞.转化菌铺于含x-gal和IPTG和氨苄青霉素(50ug/ml)的LB琼脂平皿上,37度培养过夜.挑取白色菌落,接种至3ml含氨苄青霉素(50ug/ml)的LB培养基,37度培养过夜,PCR鉴定阳性克隆。挑选一阳性克隆测序,测序结果正确。定点突变进行密码子优化。
在步骤(b)中,100μl反应体系中加入1μl逆转录产物,20μmol/L的IFNα2b-1,IFNα2b-2(或IFNα1b-1,IFNα1b-2)引物各3μl,2mmol/L的dNTP,10μl,10X反应缓冲液10μl,Taq 5U(Cytokina Inc)。用Perk-Elmer公司的9600PCR仪,PCR条件为94℃变性1分钟,56℃退火30秒,72℃延伸40秒,循环30次。通过凝胶电泳分析反应物显出一预期大小(约0.5kb)的条带,PCR产物用PCR产物回收纯化试剂盒纯化回收。用BamH I和EcoRI酶切,琼脂糖凝胶电泳纯化后,克隆到用BamH I/EcoR I酶解的pUC19质粒上,转化DH5a感受态细胞,每种PCR产物挑选若干克隆,纯化质粒,BamH I-EcoR I区DNA测序,挑选其编码的氨基酸序列分别含有IFNα1b,IFNα2b,IFNα2a序列的克隆,分别命名为pUC-IFNα1b,pUC-IFNα2b,pUC-IFNα2a等。其他亚型的IFNα的cDNA可以用相似的方法克隆,共有干扰素的基因可用人工合成的方法获得。定点突变进行密码子优化。
在步骤(c)中,通过重叠PCR技术,获得编码人血清白蛋白与干扰素融合蛋白的基因,并在两端引入BamH I和EcoR I酶切位点。融合基因用BamH I和EcoR I酶切,琼脂糖凝胶电泳纯化后,克隆到用BamH I/EcoR I酶解的pUC19质粒上,构建融合基因质粒pUC19-HAS-IFN并转化到DH5a感受态细胞中。
以酵母基因组DNA为模版扩增信号肽α因子序列,融合基因以pUC19-HSA-IFN为模版扩增融合基因。将两个PCR产物α因子和HSA-INF经重叠PCR获得编码α-factor-HSA-IFN的融合基因片断,EcoR I酶切后插入pUC19载体的相同位点,转化宿主菌DH5α,提取阳性克隆序列测序,以EcoR I酶切,回收目标片段,插入pAO815的相同位点,提取质粒,酶切鉴定片断插入的正反方向,以方向正确的单基因拷贝表达载体为出发点,进行多拷贝表达载体的构建;Bgl II和Bam H I双酶切下含有5’-AOX-α-factor-HSA-IFN-AOX(TT)-3’的表达单元,回收后进行连接反应和该双酶酶切,将此多聚体和Bam H I酶切,CIP去磷酸化的单拷贝PAO815表达载体连接,转化DH5α菌,经酶切鉴定筛选出了2拷贝和3拷贝的质粒pAO815-2α-factor-HSA-IFN和pAO815-3α-factor-HSA-IFN。携带编码本发明蛋白的DNA序列的重组表达载体示意图如图2所示。
在步骤(d)中,挑取酵母单菌落,接种至含有5ml YPD培养基的50ml三角瓶中,30℃、250-300r/min培养过夜取100-500μl的培养物接种至含有500ml新鲜培养基的2L三角摇瓶中,28~30℃、250-300r/min培养过夜,至OD600达到1.3~1.5将细胞培养物于4℃,1500g离心5min,用500ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬;同上离心,用250ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬;同上离心,用20ml的冰预冷的1mol的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬;按步骤3离心,用1ml的冰预冷的1mol的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬,其终体积约为1.5ml;将5~20μg的线性化DNA溶解在5~10μl TE溶液中,与80μl的上述步骤6所得的菌体混匀,转至0.2cm冰预冷的电转化杯中;将电转化杯冰浴5min;电压1.5kV;电容25μF;电阻200Ω。电击时间为4~10msec。电击完毕后,加入1ml冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀,转至1.5ml的EP管中;将菌体悬液涂布于MD或RDB平板上,每200~600μl涂布一块平板;将平板置于30℃培养,直至单个菌落出现。
在步骤(e)中,摇瓶菌种培养:5个容量为1L的三角瓶,装YPD培养基各200ml,培养基配方为酵母提取物(1%)10g、蛋白胨(2%)20g,葡萄糖(2%)20g,用去离子水溶解并定容到1L,115℃蒸汽灭菌20分钟。每瓶接甘油菌种100ul,30℃摇床300rpm培养24小时,此时菌浓度OD600在6-20之间。
30L罐发酵培养:30L全自动发酵罐(Biostat c-dcu,Sartourius),具体操作可参照其使用说明书。30L罐中装入基础盐培养基15L,配方为CaSO4·2H2O 0.93g/l,K2SO4 18.2g/l,MgSO4·7H2O,KOH 4.13g/l,H3PO4 26.7ml/l,甘油40g/l用去离子水溶解并定容到15L。连接好pH电极、溶氧电极,温度电极等,开动搅拌500rpm,121℃在位灭菌30分钟。灭菌结束后,待其温度降到95℃时开始通气,继续待其冷却道30℃时,加大通气量到30L每分钟,搅拌速度调到900rpm。调整溶氧电极读数到100,接上氨水调节发酵罐中的培养基pH到6.0,加入66ml经无菌过滤的微量元素添加剂70ml(GuSO4·5H2O 6g/l,NaI 0.08g/l,MnSO4·H2O3g/l,CoCl2 0.5g/l,ZnCl 20g/l,H3BO3 0.02g/l NaMoO3·2H2O 0.2g/l,FeSO4·7H2O 65g/l,Biotin 0.2g/l,6M H2SO4 30ml/l),加入已培养好的菌种开始培养。培养条件为:温度30℃、溶氧大于30%、pH用氨水控制在6.0、搅拌速度900rpm、空气流量为30L每分钟。如此培养20小时后,培养基中的甘油逐渐被耗尽,此时溶氧开始上升。当溶氧上升后,开始以280ml/小时的速度向发酵罐中补加50%的甘油(含12ml/L的PTM1)溶液,如此再培养6小时,停止甘油补料。此时菌体浓度OD600在150左右,开始以50ml/小时向发酵罐中补加甲醇(含12ml/L PTM1)。稳定2小时后提高甲醇补料速度为100ml/小时,此流速再稳定2小时后提高甲醇补料速度到150ml/小时,以此速度补加甲醇70小时后结束发酵。取出发酵液,6000rpm离心10分钟,收集上清液。
在步骤(f)中,粗纯化:发酵上清液用6M NaOH调节pH到7.0,上样到经20mM pH为7.0的磷酸盐、500mMNaCl缓冲液平衡的干扰素抗体偶联的亲和层析柱,柱床直径50mm,柱床高度15cm,柱床体积为300ml。上样完毕后先用20mM pH为7.0的磷酸盐、500mM NaCl缓冲液冲洗去未结合的物质,再用100mM、pH为3.0的甘氨酸—盐酸的溶液洗脱结合在柱上的融合蛋白。以紫外280nM吸收检测,收集蛋白峰。
精纯化:收集的蛋白溶液用NaOH调节pH到7.0,再加入3M的硫酸铵溶液直到硫酸铵的终浓度到0.7M,调节pH到7.0。此溶液上样到经20mM的磷酸盐加0.7M硫酸铵pH为7.0缓冲液平衡的Phenyl High Performance层析柱,柱床直径50mm,柱床高度15cm,柱床体积为300ml。上样完毕后先用20mM的磷酸盐加0.7M硫酸铵pH为7.0缓冲液冲洗去未结合的物质,使紫外280nm吸收的降回到基线。再用20mM磷酸盐加上0.3M硫酸铵pH7.0的溶液洗脱结合在柱上的融合蛋白。图3为本发明的纯化图谱。
如本技术领域的人所知,本发明的附图和实施例仅为说明本发明的功能、结构和原理而不应当成为对本发明理解上的限制;同时,本发明的目的均已经实现。上述实施例可能在不脱离本发明原理的情况下有所变更,故此,本发明的保护应以权利要求书中所描述的范围为准。

Claims (10)

1.一种人血清白蛋白与人干扰素蛋白融合蛋白的制备方法,其特征是该方法至少包括以下步骤:(a)人血清白蛋白基因的克隆和密码子优化;
(b)人干扰素alpha2b基因克隆和密码子优化;
(c)人血清白蛋白基因和人干扰素alpha2b基因连接和表达质粒的构建;
(d)电转化毕赤酵母和表达菌种筛选;
(e)发酵培养;以及,
(f)融合蛋白纯化。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于:
步骤(a)中编码人血清白蛋白的初始DNA序列是通过PCR方法从人胎肝cDNA文库中获得。通过定点突变技术,使密码子转换为酵母偏爱的密码子。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于:
步骤(a)中编码人干扰素的初始DNA序列是通过RT-PCR的方法从用新城鸡瘟病毒诱导的人外周血白细胞的中获得,通过定点突变技术,使密码子转换为酵母偏爱的密码子。
4.如权利要求1所述的方法,其特征在于:
步骤(a)中通过重叠PCR技术获得编码融合蛋白的基因。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于:
步骤(b)中在酵母中表达融合蛋白时,通过分泌到酵母细胞外的培养液中完成。
6.如权利要求1所述的方法,其特征在于:
步骤(b)中使用酵母本身的信号肽作为分泌所用的信号肽。
7.如权利要求7所述的方法,其特征在于:
步骤(b)中使用天然的人血清白蛋白的信号肽作为分泌所用的信号肽。
8.如权利要求1所述的方法,其特征在于:
步骤(f)中一般pH控制在2.0-7.0,溶解氧控制在10%-100%,补料组成是甘油和甲醇,甲醇含量的比例是50%-100%,经过72小时的发酵后,培养上清液中融合蛋白的浓度大于200mg/L,占发酵上清液中总蛋白的80%以上。
9.如权利要求1所述的方法,其特征在于:
步骤(f)中上清液调整pH到6.0-10.0,然后通过干扰素抗体亲和层析柱收集上清液中的融合蛋白,在用甘氨酸—盐酸洗脱融合蛋白,浓度为100mM-500mM。
10.如权利要求1所述的方法,其特征在于:
步骤(f)中经亲和柱纯化的融合蛋白溶液中加入3M硫酸铵溶液,调节硫酸铵的终浓度为0.5-2.0M,然后用Phenyl High Performance(AmershamBiosciences Sweezland)精纯化融合蛋白,用含0.1-0.5M的硫酸铵洗脱目标蛋白的硫酸铵溶液洗脱。
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