CN1896106A - 一种人血清白蛋白融合长效干扰素制备工艺 - Google Patents
一种人血清白蛋白融合长效干扰素制备工艺 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1896106A CN1896106A CN 200610023785 CN200610023785A CN1896106A CN 1896106 A CN1896106 A CN 1896106A CN 200610023785 CN200610023785 CN 200610023785 CN 200610023785 A CN200610023785 A CN 200610023785A CN 1896106 A CN1896106 A CN 1896106A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- interferon
- serum albumin
- fusion rotein
- yeast
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 title claims abstract description 43
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 title claims abstract description 43
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 title claims abstract description 41
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 7
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 title description 2
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 title description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 34
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 18
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 35
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 31
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 28
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 claims description 27
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 20
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 15
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical group OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 13
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims description 13
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 11
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 10
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 10
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 9
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 9
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 9
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 9
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 8
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 7
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 claims description 7
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 claims description 5
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 claims description 5
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims description 5
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 108010079944 Interferon-alpha2b Proteins 0.000 claims description 4
- 230000005611 electricity Effects 0.000 claims description 4
- 239000006052 feed supplement Substances 0.000 claims description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 4
- 238000012868 site-directed mutagenesis technique Methods 0.000 claims description 4
- IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.NCC(O)=O IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 241000235648 Pichia Species 0.000 claims description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 3
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 claims description 3
- 241000711404 Avian avulavirus 1 Species 0.000 claims description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 claims description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 claims description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 claims description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 abstract description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 2
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 abstract 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 20
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 13
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 10
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 9
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 9
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 150000003016 phosphoric acids Chemical class 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 4
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 4
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 3
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- SBKVPJHMSUXZTA-MEJXFZFPSA-N (2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-5-amino-2-[[2-[[(2S)-1-[(2S)-6-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)propanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]acetyl]amino]-5-oxopentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)propanoic acid Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 SBKVPJHMSUXZTA-MEJXFZFPSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 2
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 2
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010038049 Mating Factor Proteins 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 101150051118 PTM1 gene Proteins 0.000 description 2
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical group C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 2
- KLOHDWPABZXLGI-YWUHCJSESA-M ampicillin sodium Chemical compound [Na+].C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C([O-])=O)(C)C)=CC=CC=C1 KLOHDWPABZXLGI-YWUHCJSESA-M 0.000 description 2
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 2
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 2
- HKZAAJSTFUZYTO-LURJTMIESA-N (2s)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-aminoacetyl)amino]acetyl]amino]acetyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoic acid Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O HKZAAJSTFUZYTO-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical group CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108010025188 Alcohol oxidase Proteins 0.000 description 1
- 206010059313 Anogenital warts Diseases 0.000 description 1
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 101000959794 Homo sapiens Interferon alpha-2 Proteins 0.000 description 1
- 206010022004 Influenza like illness Diseases 0.000 description 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 description 1
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 101710184309 Probable sucrose-6-phosphate hydrolase Proteins 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 241000220317 Rosa Species 0.000 description 1
- 102400000472 Sucrase Human genes 0.000 description 1
- 101710112652 Sucrose-6-phosphate hydrolase Proteins 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 1
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000002441 X-ray diffraction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 150000001447 alkali salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000036528 appetite Effects 0.000 description 1
- 235000019789 appetite Nutrition 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 208000002352 blister Diseases 0.000 description 1
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000024924 glomerular filtration Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 101150026546 hsa gene Proteins 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004957 immunoregulator effect Effects 0.000 description 1
- 235000011073 invertase Nutrition 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 229940029985 mineral supplement Drugs 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N n-methyl-1-(2-naphthalen-1-ylsulfanylphenyl)methanamine Chemical compound CNCC1=CC=CC=C1SC1=CC=CC2=CC=CC=C12 OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- -1 polyoxyethylene Polymers 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000012807 shake-flask culturing Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种人血清白蛋白融合的长效干扰素蛋白，编码融合蛋白的DNA序列，以及本融合蛋白工业化生产制备的工艺方法和条件。本发明的融合蛋白有比较高的干扰素生物学活性，并且能明显的延长干扰素的半衰期。
Description
技术领域
本发明涉及重组人血清白蛋白融合长效干扰素的制备，用这种制备方法生产的干扰素能明显延长干扰素在体内的作用时间，可用于人类相关疾病的治疗。
背景技术
人血清白蛋白(HSA)是一种可溶性单体蛋白质，构成血液中的蛋白质总量的一半。白蛋白作为一种基本载体，携带传递脂肪酸、类固醇和激素分子等，其稳定的惰性性质是维持血压的一个重要因素。人血清白蛋白是一种球状非糖基化的，分子量为65Kd的蛋白质。人血清白蛋白的基因位于4号染色体上，有16961个碱基对，分为15个间隔区，经RNA加工拼接后形成的mRNA可编码一个具有585个氨基酸的蛋白质。这一蛋白在经过高尔基体的转化加工，去除分泌信号而分泌到细胞外。人血清白蛋白有35个半胱氨酸，构成17个二硫键的单体(Brown JR，The structure，functional and application of human albumin，Pergamon，NY 1977)。人血清白蛋白具有多种多态形及30种不同的遗传分子(Weikamp，CR，humangenomic Annual，37：219-226，1973)。人血清白蛋白分子的三维结构已经由X光衍射法测定(Carter，Science，244，1195-1198，1989)。人血清白蛋白是血液种的主要成分，在人体内含量为每升血液含40克，半衰期寿命为14-20天。综上所述，人血清白蛋白具有极大的优势使之可抵御生物体内酶的作用，并可使治疗性蛋白质以较高的剂量使用。
目前用于临床的人血清白蛋白均是从人血浆中提取的。利用微生物重组表达白蛋白(rHSA)的生产专利已经公开，EP330451和EP361991。
干扰素(IFN)是一种多功能细胞因子，其首先被发现的生物活性是抵制抗性病毒感染。多年以来，干扰素的抗病毒活性是其唯一的生物功能。如今，发现干扰素有许多其它生物功能，如作用于细胞的生长、分化和免疫调节等活性可能具有更大的生物学意义。
干扰素有两个完全不同的家族，分为I型和II型。I型干扰素主要包括IFNα和IFNβ，II型干扰素为IFNγ。I型干扰素的主要作用是抗病毒，IFNα和IFNβ两者共同用一种受体，但具有完全不同的免疫原性。IFNα主要由人白细胞产生，称为白细胞干扰素，IFNβ主要由成纤维细胞产生，称为成纤维细胞干扰素。IFNα有很多亚型，如IFNα-1、IFNα-2、IFNα-3等约有20种亚型，此外还有亚亚型，如IFNα-1a、IFNα-1b、IFNα-2a、IFNα-2b等，IFN-α有几十种之多。IFNβ尚未发现有亚型。II型干扰素主要由T细胞产生；主要活性是参与免疫调节，是体内重要的免疫调节因子，又称免疫干扰素。IFNγ只有一种活性形式的蛋白质，没有其它的亚型。
干扰素是具有广泛生物学活性的调节蛋白质，具有抗病毒、免疫调节的作用，对多种肿瘤细胞具有辅助性杀灭或抑制增殖作用，还能抑制癌基因表达从而阻止或减慢正常细胞向肿瘤细胞转化的过程。自80年代开始研制出重组人干扰素以来，目前有60多个国家批准上市。广泛用于乙肝、丙肝；白血病；疱疹、湿疣；肾癌、膀胱癌；淋巴瘤、骨髓瘤、黑色素瘤等多种病毒性疾病和肿瘤的治疗。但普通干扰素也存在某些不够理想之处，由于干扰素分子量小，易被肾小球滤过，所以皮下注射后吸收很快，半衰期短，容易被酶水解等，一般要每天注射，至少每周注射三次，应用不够方便。而干扰素治疗肝炎、肿瘤、类风湿及多发性硬化症等疾病时，治疗周期常常长达数月甚至数年，这种长期大剂量频繁用药增加了病人的痛苦和治疗费用而且易产生发烧、疲乏、食欲减退及流感样症状等毒副作用。
聚乙二醇(PEG)修饰的干扰素是FDA批准的临床上使用的半衰期最长的长效干扰素，PEG与干扰素连结可延长血中干扰素半哀期，使干扰素活性可延续至一周，每周只肌注一次，相当于普通干扰素每日肌注效果，并可提高疗效。但是PEG价格贵，PEG与干扰素的修饰工艺复杂，从而使聚乙二醇修饰的干扰素成本太高，增大了病人的治疗费用。
军事医学科学院生物工程研究所的血清白蛋白与干扰素的融合蛋白专利(公开号CN140518A)中，在血清白蛋白与干扰素蛋白连接中设有连接肽(GlyGlyGlyGlySer)n，n为1-10的整数。在融合蛋白中包含有外源蛋白的序列，外源蛋白序列的存在对其免疫原性和治疗效果的影响尚缺乏文献资料。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人血清白蛋白与人干扰素蛋白融合蛋白的制备方法。
本发明的融合蛋白中，人血清白蛋白C末端与人干扰素蛋白的N末端直接相联，人血清白蛋白和人干扰素蛋白之间没有连接肽，融合蛋白仍具有比较高的干扰素生物学活性。
本发明的另一个目的是提供了适合于酵母表达系统的编码本发明融合蛋白的DNA序列。包括经密码子优化的人血清白蛋白DNA序列和人干扰素DNA序列，利用本发明融合蛋白DNA序列，在酵母系统中可获得高表达。
本发明的另一个目的是提供携带编码本发明蛋白的DNA序列的重组表达载体。本发明中的pAO815、pUC18等表达载体从Invitrogen Corp(San Diego California USA)公司购得，将编码本发明中的融合蛋白的核酸克隆至酵母的表达载体pAO815中，这些质粒为酵母整合型质粒，带有醇氧化酶操纵子(AOX1)5’和3’序列，用于方便编码基因整合至酵母染色体和控制编码基因的表达。
本发明的又一个目的是提供含有本发明融合蛋白编码基因的宿主。本发明的宿主为可以被重组表达载体转化，含有本发明蛋白编码基因的细菌、酵母或动物细胞；其中优选的是酵母，更优选的是毕氏酵母，最优选的是GS115。
本发明的再一个目的是提供了高效表达融合蛋白的发酵工艺和纯化工艺条件。发酵包括菌体生长阶段和融合蛋白表达两个阶段，通过对发酵条件的控制，特别是融合蛋白表达阶段的补料组成、pH、培养温度、溶解氧等条件的控制使融合蛋白得到高效表达。融合蛋白的纯化用硫酸铵分级沉淀、透析、液相层析等方法，优选的是使用组合的蛋白质液相层析方法，使目标蛋白的纯度达到95％以上。
编码人血清白蛋白的初始DNA序列是通过PCR方法从人胎肝cDNA文库(从ClontechLaboratories Inc.USA购买)中获得。根据初始的DNA序列信息，使用单个核苷酸定点突变技术，一方面使密码子转换为酵母偏爱的密码子；另一方面改变序列中的氨基酸，使其氨基酸序列与中国人群中最广泛分布的白蛋白的氨基酸序列相一致，此外，通过对RNA二级结构的改变，提高mRNA稳定性并促进蛋白质翻译的效率。编码人干扰素的初始DNA序列可以通过RT-PCR的方法从用新城鸡瘟病毒诱导的人外周血白细胞的中获得，通过定点突变技术，使密码子转换为酵母偏爱的密码子。通过重叠PCR技术获得编码融合蛋白的基因。
在酵母中表达融合蛋白时，可以分泌到酵母细胞外的培养液中或存在于酵母细胞内，优选的是从酵母细胞中分泌出来。要从酵母中分泌出来必需要有分泌所用的信号肽，可以使用酵母本身的信号肽或天然的人血清白蛋白的信号肽。优选的是使用酵母本身的信号肽，如α-交配因子前导肽、酸性磷酸酶信号肽、蔗糖酶信号肽，最优选的是α-交配因子前导肽。
转化质粒上包含的融合蛋白编码基因到酵母细胞中可以使用电穿孔等方法，转化成功的酵母经裂解并提取DNA，然后用PCR方法鉴定。转化成功的酵母工程菌经过表达筛选，选取蛋白表达量较高、传代稳定的菌种。
通过摇瓶培养和发酵罐培养工程菌，经过对发酵培养的条件的优化，使融合蛋白得到了高效的表达。一般pH控制在2.0-7.0，优选的是4.0-6.0。溶解氧控制在10％-100％，优选的是30-50％。补料组成是甘油和甲醇，甲醇含量的比例是50％-100％，优选的是70％-80％。经过72小时的发酵后，培养上清液中融合蛋白的浓度大于200mg/L，占发酵上清液中总蛋白的80％以上。
在培养过程中，融合蛋白分泌到胞外的培养液中，通过离心除去菌体。上清液调整pH到6.0-10.0，优选的是7.0-8.0，然后通过亲和层析柱干扰素抗体偶联柱收集上清液中的融合蛋白，在用甘氨酸—盐酸洗脱液洗脱融合蛋白，优选的是pH为3.0，浓度为100mM-500mM。经亲和柱纯化的融合蛋白溶液中加入3M硫酸铵溶液，调节硫酸铵的终浓度为0.5-2.0M，优选的是0.8-1.5M，然后用Phenyl High Performance(AmershamBiosciences Sweezland)精纯化融合蛋白，用含0.1-0.5M的硫酸铵洗脱目标蛋白，更优选的是0.2M-0.3M的硫酸铵溶液洗脱。
附图说明
图1为人血清白蛋白干扰素alpha2b融合基因序列。
图2为携带编码本发明蛋白的DNA序列的重组表达载体的示意图。
图3为本发明的纯化图谱。以及，
图4为融合蛋白电泳图。
具体实施方式
本发明有关于一种人血清白蛋白与人干扰素蛋白融合蛋白的制备方法，该方法至少包括以下步骤：
(a)人血清白蛋白基因的克隆和密码子优化；
(b)人干扰素alpha2b基因克隆和密码子优化；
(c)人血清白蛋白基因和人干扰素alpha2b基因连接和表达质粒的构建；
(d)电转化毕赤酵母和表达菌种筛选；
(e)发酵培养；以及，
(f)融合蛋白纯化。
其中，在步骤(a)中，用PCR法从人胎肝cDNA文库中获得HSA cDNA。ALBF除包括HSA基因的5’端序列外，还在其5’端前加入了Kex2酶切信号识别序列(下划线部分)：
ALBF：5’
AAAAGAGATGCACACAAGAGTGAGGTTGC3’
ALBB：5’TAAGCCTAAGGCAGCTTGACTTGC3’
PCR反应条件为：50μl体系中加入5μl 10X PCR反应缓冲液，5μl 25mM MgCl2，0.2μl 25mM dNTPs，25mM引物ALBF和ALBB各1μl，pfuDNA聚合酶(Cytokina Inc)5U，1μl人胎肝cDNA文库，其余用双蒸水补足。PCR反应在PCR仪中进行，程序为94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸6分钟，30个循环后，72℃延伸10分钟。凝胶电泳显示PCR产物在1.7kb左右，与预期HSA大小一致。用PCR产物回收试剂盒纯化目标条带。取纯化的HSA cDNA 4ul，加入1ul pGEM-T载体，2ul 5X缓冲液1ul T4DNA连接酶，2ul双蒸水(pGEM-T载体缓冲液和酶为Promega CorpUSA产品)，16度反应过夜，转化DH5a感受态细胞.转化菌铺于含x-gal和IPTG和氨苄青霉素(50ug/ml)的LB琼脂平皿上，37度培养过夜.挑取白色菌落，接种至3ml含氨苄青霉素(50ug/ml)的LB培养基，37度培养过夜，PCR鉴定阳性克隆。挑选一阳性克隆测序，测序结果正确。定点突变进行密码子优化。
在步骤(b)中，100μl反应体系中加入1μl逆转录产物，20μmol/L的IFNα2b-1，IFNα2b-2(或IFNα1b-1，IFNα1b-2)引物各3μl，2mmol/L的dNTP，10μl，10X反应缓冲液10μl，Taq 5U(Cytokina Inc)。用Perk-Elmer公司的9600PCR仪，PCR条件为94℃变性1分钟，56℃退火30秒，72℃延伸40秒，循环30次。通过凝胶电泳分析反应物显出一预期大小(约0.5kb)的条带，PCR产物用PCR产物回收纯化试剂盒纯化回收。用BamH I和EcoRI酶切，琼脂糖凝胶电泳纯化后，克隆到用BamH I/EcoR I酶解的pUC19质粒上，转化DH5a感受态细胞，每种PCR产物挑选若干克隆，纯化质粒，BamH I-EcoR I区DNA测序，挑选其编码的氨基酸序列分别含有IFNα1b，IFNα2b，IFNα2a序列的克隆，分别命名为pUC-IFNα1b，pUC-IFNα2b，pUC-IFNα2a等。其他亚型的IFNα的cDNA可以用相似的方法克隆，共有干扰素的基因可用人工合成的方法获得。定点突变进行密码子优化。
在步骤(c)中，通过重叠PCR技术，获得编码人血清白蛋白与干扰素融合蛋白的基因，并在两端引入BamH I和EcoR I酶切位点。融合基因用BamH I和EcoR I酶切，琼脂糖凝胶电泳纯化后，克隆到用BamH I/EcoR I酶解的pUC19质粒上，构建融合基因质粒pUC19-HAS-IFN并转化到DH5a感受态细胞中。
以酵母基因组DNA为模版扩增信号肽α因子序列，融合基因以pUC19-HSA-IFN为模版扩增融合基因。将两个PCR产物α因子和HSA-INF经重叠PCR获得编码α-factor-HSA-IFN的融合基因片断，EcoR I酶切后插入pUC19载体的相同位点，转化宿主菌DH5α，提取阳性克隆序列测序，以EcoR I酶切，回收目标片段，插入pAO815的相同位点，提取质粒，酶切鉴定片断插入的正反方向，以方向正确的单基因拷贝表达载体为出发点，进行多拷贝表达载体的构建；Bgl II和Bam H I双酶切下含有5’-AOX-α-factor-HSA-IFN-AOX(TT)-3’的表达单元，回收后进行连接反应和该双酶酶切，将此多聚体和Bam H I酶切，CIP去磷酸化的单拷贝PAO815表达载体连接，转化DH5α菌，经酶切鉴定筛选出了2拷贝和3拷贝的质粒pAO815-2α-factor-HSA-IFN和pAO815-3α-factor-HSA-IFN。携带编码本发明蛋白的DNA序列的重组表达载体示意图如图2所示。
在步骤(d)中，挑取酵母单菌落，接种至含有5ml YPD培养基的50ml三角瓶中，30℃、250-300r/min培养过夜取100-500μl的培养物接种至含有500ml新鲜培养基的2L三角摇瓶中，28～30℃、250-300r/min培养过夜，至OD600达到1.3～1.5将细胞培养物于4℃，1500g离心5min，用500ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；同上离心，用250ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；同上离心，用20ml的冰预冷的1mol的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬；按步骤3离心，用1ml的冰预冷的1mol的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终体积约为1.5ml；将5～20μg的线性化DNA溶解在5～10μl TE溶液中，与80μl的上述步骤6所得的菌体混匀，转至0.2cm冰预冷的电转化杯中；将电转化杯冰浴5min；电压1.5kV；电容25μF；电阻200Ω。电击时间为4～10msec。电击完毕后，加入1ml冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀，转至1.5ml的EP管中；将菌体悬液涂布于MD或RDB平板上，每200～600μl涂布一块平板；将平板置于30℃培养，直至单个菌落出现。
在步骤(e)中，摇瓶菌种培养：5个容量为1L的三角瓶，装YPD培养基各200ml，培养基配方为酵母提取物(1％)10g、蛋白胨(2％)20g，葡萄糖(2％)20g，用去离子水溶解并定容到1L，115℃蒸汽灭菌20分钟。每瓶接甘油菌种100ul，30℃摇床300rpm培养24小时，此时菌浓度OD600在6-20之间。
30L罐发酵培养：30L全自动发酵罐(Biostat c-dcu，Sartourius)，具体操作可参照其使用说明书。30L罐中装入基础盐培养基15L，配方为CaSO4·2H2O 0.93g/l，K2SO4 18.2g/l，MgSO4·7H2O，KOH 4.13g/l，H3PO4 26.7ml/l，甘油40g/l用去离子水溶解并定容到15L。连接好pH电极、溶氧电极，温度电极等，开动搅拌500rpm，121℃在位灭菌30分钟。灭菌结束后，待其温度降到95℃时开始通气，继续待其冷却道30℃时，加大通气量到30L每分钟，搅拌速度调到900rpm。调整溶氧电极读数到100，接上氨水调节发酵罐中的培养基pH到6.0，加入66ml经无菌过滤的微量元素添加剂70ml(GuSO4·5H2O 6g/l，NaI 0.08g/l，MnSO4·H2O3g/l，CoCl2 0.5g/l，ZnCl 20g/l，H3BO3 0.02g/l NaMoO3·2H2O 0.2g/l，FeSO4·7H2O 65g/l，Biotin 0.2g/l，6M H2SO4 30ml/l)，加入已培养好的菌种开始培养。培养条件为：温度30℃、溶氧大于30％、pH用氨水控制在6.0、搅拌速度900rpm、空气流量为30L每分钟。如此培养20小时后，培养基中的甘油逐渐被耗尽，此时溶氧开始上升。当溶氧上升后，开始以280ml/小时的速度向发酵罐中补加50％的甘油(含12ml/L的PTM1)溶液，如此再培养6小时，停止甘油补料。此时菌体浓度OD600在150左右，开始以50ml/小时向发酵罐中补加甲醇(含12ml/L PTM1)。稳定2小时后提高甲醇补料速度为100ml/小时，此流速再稳定2小时后提高甲醇补料速度到150ml/小时，以此速度补加甲醇70小时后结束发酵。取出发酵液，6000rpm离心10分钟，收集上清液。
在步骤(f)中，粗纯化：发酵上清液用6M NaOH调节pH到7.0，上样到经20mM pH为7.0的磷酸盐、500mMNaCl缓冲液平衡的干扰素抗体偶联的亲和层析柱，柱床直径50mm，柱床高度15cm，柱床体积为300ml。上样完毕后先用20mM pH为7.0的磷酸盐、500mM NaCl缓冲液冲洗去未结合的物质，再用100mM、pH为3.0的甘氨酸—盐酸的溶液洗脱结合在柱上的融合蛋白。以紫外280nM吸收检测，收集蛋白峰。
精纯化：收集的蛋白溶液用NaOH调节pH到7.0，再加入3M的硫酸铵溶液直到硫酸铵的终浓度到0.7M，调节pH到7.0。此溶液上样到经20mM的磷酸盐加0.7M硫酸铵pH为7.0缓冲液平衡的Phenyl High Performance层析柱，柱床直径50mm，柱床高度15cm，柱床体积为300ml。上样完毕后先用20mM的磷酸盐加0.7M硫酸铵pH为7.0缓冲液冲洗去未结合的物质，使紫外280nm吸收的降回到基线。再用20mM磷酸盐加上0.3M硫酸铵pH7.0的溶液洗脱结合在柱上的融合蛋白。图3为本发明的纯化图谱。
如本技术领域的人所知，本发明的附图和实施例仅为说明本发明的功能、结构和原理而不应当成为对本发明理解上的限制；同时，本发明的目的均已经实现。上述实施例可能在不脱离本发明原理的情况下有所变更，故此，本发明的保护应以权利要求书中所描述的范围为准。
Claims (10)
1.一种人血清白蛋白与人干扰素蛋白融合蛋白的制备方法，其特征是该方法至少包括以下步骤：(a)人血清白蛋白基因的克隆和密码子优化；
(b)人干扰素alpha2b基因克隆和密码子优化；
(c)人血清白蛋白基因和人干扰素alpha2b基因连接和表达质粒的构建；
(d)电转化毕赤酵母和表达菌种筛选；
(e)发酵培养；以及，
(f)融合蛋白纯化。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤(a)中编码人血清白蛋白的初始DNA序列是通过PCR方法从人胎肝cDNA文库中获得。通过定点突变技术，使密码子转换为酵母偏爱的密码子。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤(a)中编码人干扰素的初始DNA序列是通过RT-PCR的方法从用新城鸡瘟病毒诱导的人外周血白细胞的中获得，通过定点突变技术，使密码子转换为酵母偏爱的密码子。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤(a)中通过重叠PCR技术获得编码融合蛋白的基因。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤(b)中在酵母中表达融合蛋白时，通过分泌到酵母细胞外的培养液中完成。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤(b)中使用酵母本身的信号肽作为分泌所用的信号肽。
7.如权利要求7所述的方法，其特征在于：
步骤(b)中使用天然的人血清白蛋白的信号肽作为分泌所用的信号肽。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤(f)中一般pH控制在2.0-7.0，溶解氧控制在10％-100％，补料组成是甘油和甲醇，甲醇含量的比例是50％-100％，经过72小时的发酵后，培养上清液中融合蛋白的浓度大于200mg/L，占发酵上清液中总蛋白的80％以上。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤(f)中上清液调整pH到6.0-10.0，然后通过干扰素抗体亲和层析柱收集上清液中的融合蛋白，在用甘氨酸—盐酸洗脱融合蛋白，浓度为100mM-500mM。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤(f)中经亲和柱纯化的融合蛋白溶液中加入3M硫酸铵溶液，调节硫酸铵的终浓度为0.5-2.0M，然后用Phenyl High Performance(AmershamBiosciences Sweezland)精纯化融合蛋白，用含0.1-0.5M的硫酸铵洗脱目标蛋白的硫酸铵溶液洗脱。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN200610023785XA CN1896106B (zh) | 2006-02-07 | 2006-02-07 | 一种人血清白蛋白融合长效干扰素制备工艺 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN200610023785XA CN1896106B (zh) | 2006-02-07 | 2006-02-07 | 一种人血清白蛋白融合长效干扰素制备工艺 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1896106A true CN1896106A (zh) | 2007-01-17 |
| CN1896106B CN1896106B (zh) | 2011-09-14 |
Family
ID=37608763
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN200610023785XA Active CN1896106B (zh) | 2006-02-07 | 2006-02-07 | 一种人血清白蛋白融合长效干扰素制备工艺 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN1896106B (zh) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101818154A (zh) * | 2010-03-26 | 2010-09-01 | 华南农业大学 | 编码猪α、β或γ干扰素的基因片段及其应用 |
| CN101062952B (zh) * | 2007-05-16 | 2011-07-27 | 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 | 由人血清白蛋白和干扰素组成的融合蛋白及其编码基因与应用 |
| CN102199208A (zh) * | 2011-01-28 | 2011-09-28 | 武汉吉天朋生物科技发展有限公司 | 一种通用的载药系统及制备方法 |
| CN102757502A (zh) * | 2011-04-27 | 2012-10-31 | 中国医学科学院病原生物学研究所 | 一种融合人白细胞介素28b及其制备方法 |
| CN101664378B (zh) * | 2008-09-06 | 2012-11-21 | 浙江我武生物科技股份有限公司 | 一种重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白的药物组合物 |
| CN105504036A (zh) * | 2016-02-16 | 2016-04-20 | 齐鲁工业大学 | 一种具有强热稳定性的甜味蛋白monellin突变体及其制备方法 |
| CN106282216A (zh) * | 2016-08-29 | 2017-01-04 | 芜湖英特菲尔生物制品产业研究院有限公司 | 一种重组长效鸡干扰素α的制备方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101200503B (zh) * | 2001-08-10 | 2010-07-07 | 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 | 血清白蛋白与干扰素的融合蛋白 |
| CN1269840C (zh) * | 2003-06-30 | 2006-08-16 | 美国福源集团 | 长效的人干扰素类似物 |
-
2006
- 2006-02-07 CN CN200610023785XA patent/CN1896106B/zh active Active
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101062952B (zh) * | 2007-05-16 | 2011-07-27 | 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 | 由人血清白蛋白和干扰素组成的融合蛋白及其编码基因与应用 |
| CN101664378B (zh) * | 2008-09-06 | 2012-11-21 | 浙江我武生物科技股份有限公司 | 一种重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白的药物组合物 |
| CN101818154A (zh) * | 2010-03-26 | 2010-09-01 | 华南农业大学 | 编码猪α、β或γ干扰素的基因片段及其应用 |
| CN101818154B (zh) * | 2010-03-26 | 2012-12-26 | 华南农业大学 | 编码猪α干扰素的基因片段及其应用 |
| CN102199208A (zh) * | 2011-01-28 | 2011-09-28 | 武汉吉天朋生物科技发展有限公司 | 一种通用的载药系统及制备方法 |
| CN102199208B (zh) * | 2011-01-28 | 2013-06-05 | 武汉吉天朋生物科技发展有限公司 | 一种通用的载药系统及制备方法 |
| CN102757502A (zh) * | 2011-04-27 | 2012-10-31 | 中国医学科学院病原生物学研究所 | 一种融合人白细胞介素28b及其制备方法 |
| CN105504036A (zh) * | 2016-02-16 | 2016-04-20 | 齐鲁工业大学 | 一种具有强热稳定性的甜味蛋白monellin突变体及其制备方法 |
| CN106282216A (zh) * | 2016-08-29 | 2017-01-04 | 芜湖英特菲尔生物制品产业研究院有限公司 | 一种重组长效鸡干扰素α的制备方法 |
| CN106282216B (zh) * | 2016-08-29 | 2019-11-08 | 芜湖英特菲尔生物制品产业研究院有限公司 | 一种重组长效鸡干扰素α的制备方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1896106B (zh) | 2011-09-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN1896106B (zh) | 一种人血清白蛋白融合长效干扰素制备工艺 | |
| CN106220724B (zh) | 人成纤维细胞生长因子21重组蛋白及其制备方法和应用 | |
| CN106432509B (zh) | 一种治疗代谢疾病的重组人成纤维细胞生长因子21融合蛋白及其制备方法和应用 | |
| CN101525387B (zh) | 重组长效胰高血糖素样肽类似物及其制备方法 | |
| CN101200503B (zh) | 血清白蛋白与干扰素的融合蛋白 | |
| CN101514229B (zh) | 人干扰素α衍生物及其聚乙二醇化修饰物 | |
| CN102286490B (zh) | 一种鸡干扰素γ的制备复性方法 | |
| EP0656419A1 (en) | Method of highly purifying human serum albumin | |
| CN103102418B (zh) | 粒细胞集落刺激因子(G-CSF)及其突变体(mG-CSF)与人血清白蛋白第三结构域(3DHSA)的融合蛋白及应用 | |
| CN112851791A (zh) | 一种新型fgf19类似物及其应用 | |
| CN102660550B (zh) | 基因重组人胸腺素β4的制备方法 | |
| CN1287124A (zh) | 重组天然和新型人胰岛素及其制备方法 | |
| CN1177051C (zh) | 一种重组胸腺素α1的制备方法 | |
| CN101544981A (zh) | 一种具有降血糖生物活性的苦瓜多肽基因工程制备方法及应用 | |
| CN108794637A (zh) | 一种重组犬长效干扰素α及制备此长效干扰素的融合蛋白及其制备方法 | |
| CN117304344B (zh) | 一种融合蛋白、表达该融合蛋白的重组菌株及其应用 | |
| CN1291031C (zh) | 重组胸腺素α1的制备方法 | |
| CN103467604B (zh) | 一种睡眠肽融合蛋白及其应用 | |
| CN108864295A (zh) | 一种重组牛长效干扰素及制备此长效干扰素的融合蛋白及其制备方法 | |
| CN102827290A (zh) | 人血清白蛋白与人生长激素脂肪分解结构域的融合蛋白 | |
| US20230407364A1 (en) | Long-acting recombinant interleukin-18 binding protein and production method and application thereof | |
| CN102358897B (zh) | 重组人寡腺苷酸合成酶-1的制备方法 | |
| CN107383202A (zh) | 一种由鸡白蛋白、鸡干扰素γ和鸡白细胞介素2组成的融合蛋白及其制备方法 | |
| CN1451666A (zh) | 一种重组抗肿瘤侵袭转移的融合蛋白 | |
| CN114836453A (zh) | 一种编码蛋白酶k的基因及表达蛋白酶k的菌株 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: SINOBIO BIOTECH CO. Free format text: FORMER OWNER: JIANYUAN BIOLOGICAL SCIENCE AND TECHNOLOGY CO., LTD., SHANGHAI Effective date: 20110617 |
|
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: 200433 8008-11, NO. 335, GUODING ROAD, YANGPU DISTRICT, SHANGHAI TO: 201203 ROOM 201, BUILDING 2, NO. 720, CAILUN ROAD, ZHANGJIANG HIGH-TECH. PARK, SHANGHAI |
|
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20110617 Address after: 201203 Shanghai Zhangjiang hi tech Park Cailun Road 2 Building No. 201 room 720 Applicant after: Sinobio Biotech Co. Address before: 200433 No. 335, National Road, Shanghai, Yangpu District 8008-11 Applicant before: Jianyuan Biological Science and Technology Co., Ltd., Shanghai |
|
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20210113 Address after: 215200 science and technology pioneer park complex building, Wujiang Economic Development Zone, Suzhou City, Jiangsu Province Patentee after: WUJIANG NOVOPROTEIN SCIENTIFIC Inc. Address before: 201203 Room 201, building 2, 720 Cailun Road, Zhangjiang hi tech park, Shanghai Patentee before: SHANGHAI XINBAINUO BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. |
|
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder | ||
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder |
Address after: 215200 science and technology pioneer park complex building, Wujiang Economic Development Zone, Suzhou City, Jiangsu Province Patentee after: Suzhou inshore protein Technology Co.,Ltd. Address before: 215200 science and technology pioneer park complex building, Wujiang Economic Development Zone, Suzhou City, Jiangsu Province Patentee before: WUJIANG NOVOPROTEIN SCIENTIFIC Inc. |