CN106432509B

CN106432509B - 一种治疗代谢疾病的重组人成纤维细胞生长因子21融合蛋白及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN106432509B
Application number: CN201610819085.5A
Authority: CN
Inventors: 叶贤龙; 齐剑英; 朱升龙; 吴云舟
Original assignee: Henan Normal University
Current assignee: Harbin Zizhi Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2016-09-13
Filing date: 2016-09-13
Publication date: 2019-05-21
Anticipated expiration: 2036-09-13
Also published as: CN106432509A

Abstract

本发明公开了一种治疗代谢疾病的重组人成纤维细胞生长因子21融合蛋白及其制备方法和应用，将重组人成纤维细胞生长因子21融合蛋白编码基因的核苷酸序列与表达载体相连接得到重组表达载体；再将该重组表达载体转化宿主细胞，然后筛选高表达阳性宿主细胞，培养细胞并诱导表达重组人成纤维细胞生长因子21融合蛋白，收集菌体、破碎、离心、澄清、纯化，得到目标产物治疗代谢疾病的重组人成纤维细胞生长因子21融合蛋白。本发明还公开了该重组人成纤维细胞生长因子21融合蛋白在制备治疗代谢疾病药物中的应用。本发明的重组人成纤维细胞生长因子21融合蛋白能够较好的控制血糖波动，稳定维持24小时血糖处于正常水平。

Description

一种治疗代谢疾病的重组人成纤维细胞生长因子21融合蛋白及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及重组蛋白领域，尤其涉及一种重组人成纤维细胞生长因子21融合蛋白及其制备方法，本发明还涉及该重组人成纤维细胞生长因子21融合蛋白在制备治疗代谢疾病药物中的用途，属于成纤维细胞生长因子技术领域。

背景技术

糖尿病（diabetes mellitus，DM），是一类由胰腺功能病变的慢性代谢类疾病，以高血糖为主要特征，是一种终身疾病。其发病机理是胰岛素抵抗或胰岛素分泌减少，导致机体糖脂代谢紊乱所致。随着世界人口的老龄化，糖尿病已成为一种常见病、多发病，现已成为继癌症和心脑血管病之后，第三大威胁人类生命的疾病（Nathan DM, et al. Medicalmanagement of hyperglycaemia in type 2 diabetes: a consensus algorithm forthe initiation and adjustment of therapy. Diabetes Care 2009; 32: 193–203.Culy CR, Jarvis B. Repaglinide: a review of its therapeutic use in type 2diabetes mellitus [J]. Drugs, 2001, 61(11): 1625）。

随着经济的日益发展，我国的糖尿病患者数量也呈上升趋势，据调查结果估计，现中国大约有1亿糖尿病患者。目前治疗糖尿病的药物大多数是以胰岛素为核心发挥作用，如胰岛素类制剂或其增敏剂类药物等，但这些药物对有些糖尿病患者特别是II型糖尿病的晚期患者效果仍然不够理想。由于没有可替代胰岛素的药物和更先进的治疗手段，尽管病人对胰岛素产生抵抗作用，导致上述药物无法奏效，胰岛素仍然是治疗II型糖尿病的首选药物。随着胰岛素抵抗作用的不断加剧，胰岛素的疗效逐渐减弱，血糖无法控制在正常水平。由于血糖长期维持在较高水平，从而导致很多严重的并发症，如失明、肾衰、心脑血管疾病和神经系统疾病等。因此II型糖尿病的临床治疗中一直迫切需要一种能取代胰岛素，解决胰岛素抵抗的新型药物。

成纤维细胞生长因子（FGF）21属于FGF家族中一名新成员，FGF21基因主要在肝脏和脂肪中表达，FGF21在体外能够促进HepG2细胞和3T3-L1脂肪细胞消耗葡萄糖，在动物体内具有降低血糖和甘油三酯等功能，并且不会产生低血糖和引起肿瘤发生等副作用（Kharitonenkov A, et al. FGF-21 as a novel metabolic regulator. J Clin Invest2005; 115:1627–35. Kharitonenkov A, et al. The metabolic state of diabeticmonkeys is regulated by fibroblast growth factor-21. Endocrinology 2007;148:774–81）。FGF21安全、有效以及不依赖胰岛素调节生物体内血糖水平的特点，使其有望成为治疗II型糖尿病的新型药物。然而，随着对FGF21的深入了解，我们发现野生型人FGF21（hFGF21）的生物学功能及临床应用受到了体内稳定性和自身免疫原性的制约（Huang Z,et al. A better anti-diabetic recombinant human fibroblast growth factor 21(rhFGF21) modified with polyethylene glycol. PLoS One 2011;6:e20669. Ye X, etal. Enhancement of the pharmacological efficacy of FGF-21 by geneticmodification and PEGylation. Curr Pharm Biotechnol 2014;14:1287–98.），故对hFGF21进行改造和修饰将逐渐成为近年来研究的热点。

人血清白蛋白（HSA）是由585个氨基酸残基组成的单链无糖基化的球形蛋白质，是人体血清内含量最高的蛋白，分子量为66kDa，第356位的苏氨酸是可能存在O-糖基化位点（He, X.M. and D.C. Carter, Atomic structure and chemistry of human serumalbumin. Nature, 1992. 358(6383): p. 209-15.），其在调节血液渗透压和促进伤口愈合等方面起着重要的作用，并且具有人体相容性好、分子量大、半衰期长及无酶活性和免疫原性等优点，这使得白蛋白融合技术在研制长效重组蛋白药物领域倍受关注（Nel, M.R.,Human albumin administration in critically ill patients. Critical analysis oforiginal studies has to take place. BMJ, 1998. 317(7162): p. 882.）。很多具有治疗功能的蛋白质，如干扰素、人生长激素和IL-2等，经过白蛋白融合技术的改造后，都可以开发成为具有药效更佳和注射次数减少等优点的重组蛋白药物。白蛋白融合技术的优势在于其不需要额外的化学修饰，生产工艺简单，产物均一，且质量控制相对容易，延长药物半衰期的效果可能要比化学修饰（如PEG修饰和乙酰化等）更有效（Muller, N., et al.,Superior serum half life of albumin tagged TNF ligands. Biochemical andBiophysical Research Communications, 2010. 396(4): p. 793-799.）。但在白蛋融合蛋白的表达和储存过程中伴有降解和聚合现象，增加了纯化的难度和临床用药时出现免疫反应的风险（Yao, X.Q., et al., Degradation of HSA-AX15(R13K) when expressed inPichia pastoris can be reduced via the disruption of YPS1 gene in this yeast.J Biotechnol, 2009. 139(2): p. 131-6. Cordes, A.A., et al., Selective domainstabilization as a strategy to reduce fusion protein aggregation. J PharmSci, 2012. 101(4): p. 1400-9. Cordes, A.A., J.F. Carpenter, and T.W.Randolph, Selective domain stabilization as a strategy to reduce human serumalbumin-human granulocyte colony stimulating factor aggregation rate. J PharmSci, 2012. 101(6): p. 2009-2016.）。近来研究发现，HSA 第 381-585位氨基酸残基构成的第3结构域（3DHSA）是HSA与新生儿Fc受体（FcRn）结合的关键部位，在受体介导的胞吞保护作用下耐受蛋白酶的降解，从而保证HSA具有较长的半衰期（Andersen, J.T., J.D.Qian, and I. Sandlie, The conserved histidine 166 residue of the humanneonatal Fc receptor heavy chain is critical for the pH-dependent binding toalbumin. Eur J Immunol, 2006. 36(11): p. 3044-3051.）。基于对白蛋白长效机制的深入认识，Kenanova 等（Kenanova, V.E., et al., Tuning the serum persistence ofhuman serum albumin domain III:diabody fusion proteins. Protein Eng Des Sel,2010. 23(10): p. 789-98.）将3DHSA 作为融合伴侣，构建了一系列抗癌胚抗原双抗体与3DHSA的融合蛋白，证明了3DHSA作为融合伴侣延长蛋白药物半衰期的可行性。

蛋白稳定性的高低直接影响其在宿主细胞中的表达量，为了提高蛋白产量及稳定性，并在不影响蛋白原有活性的基础上，需要将FGF21进行适当的突变。本发明通过对野生型hFGF21进行基因突变，并将其与HSA或3DHSA连接成融合蛋白的形式来提高FGF21的稳定性，为以后FGF21的产业化提供了重要的技术帮助。

发明内容

本发明解决的技术问题是提供了一种治疗代谢疾病的重组人成纤维细胞生长因子21融合蛋白及其制备方法，该重组人成纤维细胞生长因子21融合蛋白能够用于制备治疗糖尿病或肥胖症的药物或药物组合物。

本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，一种治疗代谢疾病的重组人成纤维细胞生长因子21融合蛋白，其特征在于是将人成纤维细胞生长因子21重组蛋白mFGF21与HSA或3DHSA连接而成的重组融合蛋白mFGF21-HSA、HSA-mFGF21、mFGF21-3DHSA和3DHSA-mFGF21，其中重组蛋白mFGF21的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示，重组融合蛋白mFGF21-HSA的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:7所示，重组融合蛋白HSA-mFGF21的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:8所示，重组融合蛋白mFGF21-3DHSA的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:9所示，重组融合蛋白3DHSA-mFGF21的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:10所示。

本发明所述的重组人成纤维细胞生长因子21融合蛋白编码基因，其特征在于：所述的重组融合蛋白mFGF21-HSA编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，重组融合蛋白HSA-mFGF21编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示，重组融合蛋白mFGF21-3DHSA编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:4所示，重组融合蛋白3DHSA-mFGF21编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:5所示。

本发明所述的重组人成纤维细胞生长因子21融合蛋白编码基因的表达载体及含有该表达载体的宿主细胞，其特征在于：所用的表达载体优选为pET30a（+），宿主细胞优选为Rossetta（DE3）。

本发明所述的重组人成纤维细胞生长因子21融合蛋白的制备方法，其特征在于具体步骤为：将重组人成纤维细胞生长因子21融合蛋白编码基因的核苷酸序列与表达载体相连接得到重组表达载体；再将该重组表达载体转化宿主细胞，然后筛选高表达阳性宿主细胞，培养细胞并诱导表达重组人成纤维细胞生长因子21融合蛋白，收集菌体、破碎、离心、澄清、纯化，得到目标产物治疗代谢疾病的重组人成纤维细胞生长因子21融合蛋白。

本发明所述的重组人成纤维细胞生长因子21融合蛋白在制备治疗代谢疾病药物中的应用，其中代谢疾病包括糖尿病、肥胖症和代谢综合症。

本发明所述的用于治疗糖尿病或肥胖症的药物组合物，其特征在于包括治疗上有效剂量的重组人成纤维细胞生长因子21融合蛋白和药学上可接受的载体或辅料。

本发明的细胞试验和动物学试验结果表明，人成纤维细胞生长因子21重组蛋白（mFGF21）相比于野生型hFGF21蛋白，活性显著提高，能够更加有效降低糖尿病小鼠体内的血糖水平。此外，人成纤维细胞生长因子21重组蛋白和重组融合蛋白能够较好的控制血糖波动，稳定维持24小时血糖处于正常水平。特别是mFGF21与HSA或3DHSA连接的重组融合蛋白，其降糖效果更佳。本发明的mFGF21或其重组融合蛋白可作为药物治疗糖尿病、肥胖症或代谢综合症等代谢疾病。

附图说明

图1是突变蛋白mFGF21与野生型hFGF21蛋白在大肠杆菌中表达量的SDS-PAGE电泳分析图；

图2是纯化后突变蛋白mFGF21和野生型hFGF21蛋白的SDS-PAGE电泳分析图；

图3是融合蛋白mFGF21-HSA、HSA-mFGF21、mFGF21-3DHSA和3DHSA-mFGF21在大肠杆菌中表达量的SDS-PAGE电泳分析图；

图4是纯化后融合蛋白mFGF21-HSA、HSA-mFGF21、mFGF21-3DHSA和3DHSA-mFGF21的SDS-PAGE电泳分析图；

图5是6种蛋白的体内半衰期比较图；

图6是6种蛋白的体外细胞活性检测图；

图7是STZ诱导的I型糖尿病小鼠长期注射6种蛋白后每周血糖水平的变化曲线；

图8是STZ诱导的I型糖尿病小鼠注射不同蛋白8周后血糖、糖化血红蛋白及甘油三脂水平的变化曲线；

图9是II型糖尿病db/db小鼠长期注射6种蛋白后每周血糖水平的变化曲线；

图10是II型糖尿病db/db小鼠注射不同蛋白8周后血糖、糖化血红蛋白及甘油三脂水平的变化曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

说明：本发明中涉及的基因的设计、合成和克隆、表达载体的构建、核酸提取、测序和鉴定，以及表达产物的分离和纯化等操作步骤，可按照本领域已知的技术进行（参见CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY）。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1

mFGF21、mFGF21-HSA、HSA-mFGF21、mFGF21-3DHSA和3DHSA-mFGF21表达载体的构建

根据大肠杆菌密码子偏好性，设计出5种基因，其核苷酸序列分别如序列表中SEQID NO:1（mFGF21）、SEQ ID NO:2（mFGF21-HSA）、SEQ ID NO:3（HSA-mFGF21）、SEQ ID NO:4（mFGF21-3DHSA）和SEQ ID NO:5（3DHSA-mFGF21）所示。将这5种基因送至上海捷瑞生物公司合成，同时在各基因两端设计NdeI与BamHI两酶切位点。

将5种合成的含有各自目的基因片段的载体和pET30a（+）分别用NdeI与Bam HI双酶切，酶切完毕后，胶回收各自需要的目标片段。使用T4 DNA连接酶将5种目的片段分别与原核表达载体pET30a（+）连接，连接反应体系为10µL，混匀，4℃连接过夜，然后各自转化至大肠杆菌DH5α中。挑取阳性克隆，经过酶切鉴定后，即分别构建得到5种重组质粒pET30a-mFGF21、pET30a-mFGF21-HSA、pET30a-HSA-mFGF21、pET30a-mFGF21-3DHSA和pET30a-3DHSA-mFGF21。

实施例2

mFGF21蛋白的表达及纯化

（1）转化、培养并诱导表达

将含有正确序列的重组质粒pET30a-mFGF21转化至表达菌株Rosseta（DE3）（北京全式金生物技术有限公司，目录号：CD801）。转化后的单菌落分别接种至20mL含Kan（50µg/mL）的LB培养基中，37℃培养8h，以体积比为1:100接种于另一20mL含Kan（50µg/mL）的LB培养基中，37℃培养，当A₆₀₀在0.35左右时，加入IPTG至终浓度为0.25mmol/L进行诱导，诱导温度为30℃，5h后收获菌体，用Lysis buffer（20mmol/L Tris，150mmol/L NaCl，pH 8.0）重悬菌体，破碎菌体后离心，分别取上清和沉淀进行12wt% SDS-PAGE电泳分析。如图1所示，泳道1：蛋白标准分子量Marker；2、3、4：hFGF21全菌、上清、沉淀；5、6、7：mFGF21全菌、上清、沉淀，结果显示突变后的mFGF21在大肠杆菌中表达量显著增加，目标蛋白大部分以包涵体形式存在。

（2）蛋白纯化

向菌体中加入一定浓度溶菌酶（1mg/mL），冰上放置30min，超声波细胞破碎菌体细胞（工作1s，间隔1s，4min/次，共3次循环）。菌体破碎彻底后，利用QuixStand预处理系统（750kD超滤中空纤维柱）处理细胞破碎液，富集包涵体，弃去膜透过端液体。当总体积约为60mL时，加入100mL wash buffer（20mmol/L Tris，2mol/L Urea，150mmol/L NaCl，pH 8.0）洗涤包涵体。当溶液体积为50mL，再向其中加入洗涤液100mL，重复上述实验4次。

洗涤完毕后，当溶液体积为50mL，关闭透过端，向洗涤后的包涵体中加入150mL的变性液（20mmol/L Tris，10mol/L Urea，150mmol/L NaCl，pH 8.0），循环变性2小时。打开透过端，膜透过端收集液即为mFGF21变性液。用5KD中空纤维柱对变性后的mFGF21进行浓缩，至体积80mL后进行复性，将装有复性液（20mmol/L Tris，50mmol/L NaCl，pH 8.0）的容器用胶皮管与中空纤维柱的储液器连接。储液器密封后，透过端流出液体后，由于储存器中产生负压，使复性液以一定的速度滴加至变性液中，缓慢匀速复性。当加入复性液体积为变性液6倍时，即复性完毕，8000rpm/min，4℃离心20min，收集上清。复性上清液经AKTA purifier100系统，与5倍柱体积IEX buffer A（20mmol/L Tris、10mmol/L NaCl，pH 8.0）平衡好的Capto Q柱（装于XK16/20空柱，柱高10cm，流速300cm/h）完全结合后，用3-4倍柱体积IEXbuffer A冲洗；当紫外曲线达到稳定的基线时，利用IEX buffer A和IEX buffer B（20mmol/L Tris，1mol/L NaCl，pH 8.0）混合液洗脱，15wt%和100wt% IEX buffer B液冲洗杂蛋白，18.5wt%-19wt% IEX buffer B液洗脱目标蛋白，收集各洗脱峰，并进行15wt% SDS-PAGE电泳分析。结果显示纯化后蛋白纯度在95%以上，如图2所示，泳道1：蛋白标准分子量Marker；2：纯化后的mFGF21；3：纯化后的hFGF21。

实施例3

mFGF21-HSA、HSA-mFGF21、mFGF21-3DHSA和3DHSA-mFGF21四种融合蛋白的表达及纯化

（1）转化、培养并诱导表达

将含有正确序列的4种重组质粒pET30a-mFGF21-HSA、pET30a-HSA-mFGF21、pET30a-mFGF21-3DHSA和pET30a-3DHSA-mFGF21分别转化至表达菌株Rosseta（DE3）（北京全式金生物技术有限公司，目录号：CD801）。转化后的单菌落分别接种至20mL含Kan（50µg/mL）的LB培养基中，37℃培养8h，以体积比为1:100接种于另一20mL含Kan（50µg/mL）的LB培养基中，37℃培养，当A₆₀₀在0.35左右时，加入IPTG至终浓度为0.25mmol/L进行诱导，诱导温度为30℃，5h后收获菌体，用Binding buffer（20mmol/L Na₃PO₄，pH 7.0）重悬菌体，破碎菌体后离心，分别取上清和沉淀进行12wt% SDS-PAGE电泳分析。结果显示mFGF21与HSA或3DHSA连接后的融合蛋白大部分以可溶性形式表达，如图3所示，A图泳道1、2：mFGF21-HSA菌体上清、菌体沉淀；3、4：HSA-mFGF21菌体上清、菌体沉淀；5：蛋白标准分子量Marker；B图泳道1：蛋白标准分子量Marker；2、3：3DHSA-mFGF21菌体上清、菌体沉淀；4、5：mFGF21-3DHSA菌体上清、菌体沉淀。

（2）蛋白纯化

向菌体中加入一定浓度溶菌酶（1mg/mL），冰上放置30min，超声破碎菌体细胞（工作1s，间隔1s，4min/次，共3次循环）。破碎彻底后，12000rpm，4℃离心15min，收集上清。上清液过0.22μm滤膜澄清后，通过泵进入AKTA purifier 100系统，与2-3倍柱体积Bindingbuffer平衡好的Blue Sepharose 6FF柱（装于XK16/20空柱，柱高10cm，流速100cm/h）完全结合后，用4-5倍柱体积的binding buffer冲洗杂蛋白，当紫外曲线达到稳定的基线时，再用2-3倍柱体积Elution buffer（20mmol/L Na₃PO₄，2 mol/L NaCl，pH 7.0）洗脱目的蛋白，把结合在填料上的融合蛋白洗脱下来并收集到试管中。

把Superdex 75凝胶过滤柱（装于Column XK26/70空柱中，柱体积340mL，流速2mL/min）接到AKTA purifier 100系统中，先用2倍柱体积的蒸馏水替换其保护液（体积分数为20%乙醇），再用2倍柱体积的Desalting buffer（20mmol/L Na₃PO₄、150mmol/L NaCl，pH7.0）平衡柱子，然后将亲和层析洗脱液通过Superloop进样。收集各洗脱峰，并进行15wt% SDS-PAGE电泳分析，结果显示经纯化过后，四种融合蛋白纯度在95%以上，如图4所示，A图泳道1：蛋白标准分子量Marker；2：纯化后的HSA-mFGF21融合蛋白；3：纯化后的mFGF21-HSA融合蛋白；B图泳道1：纯化后的mFGF21-3DHSA融合蛋白；2：纯化后的3DHSA-mFGF21融合蛋白；3：蛋白标准分子量Marker。

实施例4

5种蛋白mFGF21、mFGF21-HSA、HSA-mFGF21、mFGF21-3DHSA和3DHSA-mFGF21的体内半衰期检测

选取体重约2kg的家兔18只，随机分为6组。每组分别皮下注射6种蛋白hFGF21、mFGF21、mFGF21-HSA、HSA-mFGF21、mFGF21-3DHSA和3DHSA-mFGF21，剂量30nmol/kg，在给药后的0h、1h、3h、5h、7h、24 h，于耳缘静脉采血800μL左右。12000r/m离心10min，取上清保存于-20℃备用。

ELISA间接法测定6种蛋白的体内半衰期：用稀释好不同浓度的hFGF21、mFGF21、mFGF21-HSA、HSA-mFGF21、mFGF21-3DHSA和3DHSA-mFGF21蛋白（2μg/mL、0.2μg/mL、200ng/mL、20ng/mL和2ng/mL）分别建立蛋白浓度含量的标准曲线，将稀释后的标准蛋白和血清包被酶标板，应用ELISA间接法测定各血清中目标蛋白的含量，统计学分析并计算出6种蛋白的体内半衰期。体内半衰期t_1/2=0.301*（t₂-t₁）/log（OD₁/OD₂），其中OD₁和OD₂分别表示t1和t2时取出血清所对应酶标板上的平均光吸收值。

结果如图5所示，经公式计算出突变蛋白mFGF21和融合蛋白mFGF21-HSA、HSA-mFGF21、mFGF21-3DHSA、3DHSA-mFGF21及野生型蛋白hFGF21的体内半衰期分别约为54min、579min、596min、467min、489min和36min，说明了hFGF21蛋白经突变改造和融合表达后体内半衰期显著增加。

实施例5

5种蛋白mFGF21、mFGF21-HSA、HSA-mFGF21、mFGF21-3DHSA和3DHSA-mFGF21的体外糖吸收活性检测

HepG2细胞培养：HepG2细胞（中国医学科学院基础所细胞库）为人肝癌细胞株，其生长条件为高糖DMEM培养基，其中加入10wt%新生牛血清NCS（Invitrogen Corporation）、青霉素100μg/mL、链霉素100μg/mL，在37℃、体积分数5% CO₂、饱和湿度条件下培养。当细胞生长至高密度时，应进行传代，用0.25wt%胰蛋白酶液消化后，以体积比为1:3-1:5的比例将细胞接种于新的培养瓶内培养，取对数生长期的细胞用于实验。

HepG2细胞接种与处理：用质量浓度为0.25%胰蛋白酶消化液消化生长状态良好的HepG2细胞，离心收集细胞，按照2.5×10⁴的密度将细胞接种于96孔板中继续培养，每孔中培养液体积为200μL。当细胞生长至均匀单层时，弃去上层培养液加入新鲜的无血清培养基继续培养12h后，即可加入待测蛋白检测活性。

加样HepG2细胞饥饿12h后，分别用不同浓度（10nmol/L、100nmol/L、1000nmol/L）的hFGF21、mFGF21、mFGF21-HSA、HSA-mFGF21、mFGF21-3DHSA和3DHSA-mFGF21 六种蛋白刺激细胞24h，用GOD-POD法检测培养基中残留的葡萄糖含量。取培养基上清液2μL加入到200μL葡萄糖检测液中，每孔葡萄糖至少重复检测3次，37℃反应5-10min后，在500nm波长下测OD值。计算葡萄糖消耗率，并运用统计学分析实验结果。

培养液中残留的葡萄糖浓度和细胞葡萄糖消耗率的计算公式如下：

葡萄糖浓度（mmol/L）=OD_样品/OD_标准×5.55mmol/L

细胞葡萄糖消耗率（%）=[(C_{空白葡萄糖}-C_{给药葡萄糖}) / C_{空白葡萄糖}] ×100%

数据分析结果如图6所示，结果显示，不同浓度时经mFGF21蛋白刺激的细胞葡萄糖吸收都高于hFGF21蛋白刺激的细胞葡萄糖吸收，且在中、高浓度下的细胞葡萄糖吸收都显著高于hFGF21蛋白刺激的细胞葡萄糖吸收（^**p<0.01），呈现剂量依赖性，说明mFGF21蛋白活性优于hFGF21蛋白。而相对于mFGF21，mFGF21-HSA、HSA-mFGF21、mFGF21-3DHSA和3DHSA-mFGF21四种蛋白的体外细胞糖吸收活性也显著增加，且在低、中、高三种剂量下，差异极显著（^##p<0.01），其中3DHSA-mFGF21融合蛋白的体外活性最佳。

实施例6

5种蛋白mFGF21、mFGF21-HSA、HSA-mFGF21、mFGF21-3DHSA和3DHSA-mFGF21的体内药效检测

一、本发明5种蛋白在I型糖尿病动物模型上的活性检测

I型糖尿病动物模型制备：雄性C57BL/6小鼠（购置于上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物质量合格证号SCXK（沪）2012-0005）适应性饲喂至体重达到35g左右时开始实验。适应性喂养2周，选取体重25-30g小鼠60只随机分为6只正常对照组小鼠和52只造模组小鼠，准备开始造模。造模前小鼠需禁食不禁水12h，次日，造模组通过腹腔注射方式按体重比40mg/kg注射STZ注射液，恢复正常饮食，并给予1wt%的葡萄糖水饮用，间隔1d后再次禁食不禁水12h后，通过腹腔注射方式按体重比30mg/kg注射STZ注射液，间隔1d后第3次通过腹腔注射方式按体重比20mg/kg注射STZ注射液；对照组只注射柠檬酸-柠檬酸钠（pH 4.4）缓冲液。腹腔注射过程中，注意注射器针头插入的深度及角度，避免伤到小鼠内脏器官。STZ注射后，每隔7d检测一次小鼠空腹血糖和体重的变化。将注射4周后空腹血糖浓度>16.65mmol/L的小鼠判定为I型糖尿病动物模型。

分组，给药及指标检测：选取成模的血糖值低于25mmol/L的I型糖尿病小鼠42只，随机分为模型对照组、hFGF21组、mFGF21组、mFGF21-HSA组、HSA-mFGF21组、mFGF21-3DHSA组和3DHSA-mFGF21组，每组6只。于每天早上8点半左右给予实验组相应的受试物一次，皮下注射，剂量50nmol/kg，模型对照组注射相同体积的生理盐水，连续给药8周。实验过程中自由饮食、饮水。

于每周第一天早上8点左右尾静脉采血测定各实验组小鼠血糖水平，给药8周后，各实验组小鼠处死（前夜禁食），眼球取血测定实验小鼠血糖（BG）、糖基化血红蛋白（GHb）和甘油三脂（TG）水平。所得实验数据进行统计学分析。

实验检测数据如图7、8所示，图7结果表明，相对于模型对照组，6种给药组小鼠血糖在给药1周后下降显著，且之后每周血糖变化趋势一致，但与hFGF21组相比，mFGF21、mFGF21-HSA、HSA-mFGF21、mFGF21-3DHSA和3DHSA-mFGF21 五组小鼠血糖水平下降迅速。mFGF21、mFGF21-HSA、HSA-mFGF21、mFGF21-3DHSA和3DHSA-mFGF21 五种蛋白在I型糖尿病小鼠上的长效降糖效果明显优于hFGF21，作用持续时间长，其中3DHSA-mFGF21组小鼠长期降糖效果最佳。

糖基化血红蛋白（GHb）测试通常可以反映患者近8-12周的血糖控制情况，故本实验检测给药8周后各实验组小鼠血糖和糖基化血红蛋白水平来比较6种蛋白控制血糖波动的能力。结果如图8所示，进一步说明了mFGF21、mFGF21-HSA、HSA-mFGF21、mFGF21-3DHSA和3DHSA-mFGF21 五种蛋白对I型糖尿病小鼠的血糖水平具有长久持续的调控作用，且效果显著优于hFGF21。

给药8周后，各实验组小鼠血清甘油三脂水平结果如图8所示，相对于生理盐水组，六种蛋白都能显著降低TG含量。而与hFGF21相比，mFGF21、mFGF21-HSA、HSA-mFGF21、mFGF21-3DHSA和3DHSA-mFGF21 五种蛋白在I型糖尿病小鼠的血脂水平上表现出更佳的改善效果。

二、本发明5种蛋白在II型糖尿病动物模型上的活性检测

分组、给药及指标检测：取SPF级9-11周龄雄性db/db小鼠（购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物质量合格证号SCXK（沪）2012-0005）50只，预饲养1周后称重，次日禁食不禁水6h，尾静脉取血测定小鼠的空腹血糖，剔除体重异常，筛选血糖值相对接近均值的成模小鼠42只，随机分为模型对照组、hFGF21组、mFGF21组、mFGF21-HSA组、HSA-mFGF21组、mFGF21-3DHSA组和3DHSA-mFGF21组，每组6只。于每天早上8点半左右给予实验组相应的受试物一次，皮下注射，剂量50nmol/kg，模型对照组注射相同体积的生理盐水，连续给药8周。实验过程中自由饮食、饮水。

实验检测数据如图9、10所示，图9结果表明，相对于模型对照组，6种给药组小鼠血糖在给药1周后下降显著，且之后每周血糖变化趋势一致，但与hFGF21组相比，mFGF21、mFGF21-HSA、HSA-mFGF21、mFGF21-3DHSA和3DHSA-mFGF21五组小鼠血糖水平下降迅速。mFGF21、mFGF21-HSA、HSA-mFGF21、mFGF21-3DHSA和3DHSA-mFGF21 五种蛋白在II型糖尿病小鼠上的长效降糖效果明显优于hFGF21，作用持续时间长，其中3DHSA-mFGF21组小鼠长期降糖效果最佳。

糖基化血红蛋白（GHb）测试通常可以反映患者近8-12周的血糖控制情况，故本实验检测给药8周后各实验组小鼠血糖和糖基化血红蛋白水平来比较6种蛋白控制血糖波动的能力。结果如图10所示，进一步说明了mFGF21、mFGF21-HSA、HSA-mFGF21、mFGF21-3DHSA和3DHSA-mFGF21五种蛋白对II型糖尿病小鼠的血糖水平具有长久持续的调控作用，且效果显著优于hFGF21。

给药8周后，各实验组小鼠血清甘油三脂水平结果如图10所示，相对于生理盐水组，六种蛋白都能显著降低TG含量。而与hFGF21相比，mFGF21、mFGF21-HSA、HSA-mFGF21、mFGF21-3DHSA和3DHSA-mFGF21五种蛋白在II型糖尿病小鼠的血脂水平上表现出更佳的改善效果。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南师范大学

<120> 一种治疗代谢疾病的重组人成纤维细胞生长因子21融合蛋白及其制备方法和应用

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> SEQ ID NO:1

<211> 537

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO:1

gcagactcca gtcctctcct gcaattcggg ggccaagtcc ggcagcggta cctctacaca 60

gatgatgccc agcgtacaga agcccacctg gagatcaggg aggatgggac ggtggggggc 120

gctgctgacc agagccccga aagtctcctg cagctgaaag ccttgaagcc gggagttatt 180

caaatcttgg gagtccgtac accgaggttc ctgtgccagc ggccagatgg ggccctgtat 240

ggatcgctcc actttgaccc tgaggcctgc agcttccggg agctgcttct tgaggacgga 300

tacaatgttt accagtccga agcccacggc ctcccgctgc acctgccagg gaacaagtcc 360

ccacaccggg accctgcacc ccgaggacca gctcgcttcc tgccactacc attcctgccc 420

cccgcactcc cggagccacc cggaatcctg ggtccccagc cccccgatgt gggctcctcg 480

gaccctctga gcatggtggg accttcccag ggccgaagcc ccagctacgc ttcctga 537

<210> SEQ ID NO:2

<211> 2355

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO:2

gcagactcca gtcctctcct gcaattcggg ggccaagtcc ggcagcggta cctctacaca 60

gatgatgccc agcgtacaga agcccacctg gagatcaggg aggatgggac ggtggggggc 120

gctgctgacc agagccccga aagtctcctg cagctgaaag ccttgaagcc gggagttatt 180

caaatcttgg gagtccgtac accgaggttc ctgtgccagc ggccagatgg ggccctgtat 240

ggatcgctcc actttgaccc tgaggcctgc agcttccggg agctgcttct tgaggacgga 300

tacaatgttt accagtccga agcccacggc ctcccgctgc acctgccagg gaacaagtcc 360

ccacaccggg accctgcacc ccgaggacca gctcgcttcc tgccactacc attcctgccc 420

cccgcactcc cggagccacc cggaatcctg ggtccccagc cccccgatgt gggctcctcg 480

gaccctctga gcatggtggg accttcccag ggccgaagcc ccagctacgc ttccggtggt 540

ggtggttctg gtggtggtgg ttctggtggt ggtggttcta gaggtgtttt cagaagagac 600

gctcacaagt ctgaagttgc tcacagattc aaggacttgg gtgaagaaaa cttcaaggct 660

ttggttttga tcgctttcgc tcaatacttg caacaatgtc cattcgaaga ccacgttaag 720

ttggttaacg aagttactga atttgctaag acttgtgttg ctgacgaatc tgctgaaaac 780

tgtgacaagt ctttgcacac tttgttcggt gacaagttgt gtactgttgc tactttgaga 840

gaaacttacg gtgaaatggc tgactgttgt gctaagcaag aaccagaaag aaacgaatgt 900

ttcttgcaac acaaggacga caacccaaac ttgccaagat tggttagacc agaagttgac 960

gttatgtgta ctgctttcca cgacaacgaa gaaactttct tgaagaagta cttgtacgaa 1020

atcgctagaa gacacccata cttctacgct ccagaattgt tgttcttcgc taagagatac 1080

aaggctgctt tcactgaatg ttgtcaagct gctgacaagg ctgcttgttt gttgccaaag 1140

ttggacgaat tgagagacga aggtaaggct tcttctgcta agcaaagatt gaagtgtgct 1200

tctttgcaaa agttcggtga aagagctttc aaggcttggg ctgttgctag attgtctcaa 1260

agattcccaa aggctgaatt tgctgaagtt tctaagttgg ttactgactt gactaaggtt 1320

cacactgaat gttgtcacgg tgacttgttg gaatgtgctg acgacagagc tgacttggct 1380

aagtacatct gtgaaaacca agactctatc tcttctaagt tgaaggaatg ttgtgaaaag 1440

ccattgttgg aaaagtctca ctgtatcgct gaagttgaaa acgacgaaat gccagctgac 1500

ttgccatctt tggctgctga cttcgttgaa tctaaggacg tttgtaagaa ctacgctgaa 1560

gctaaggacg ttttcttggg tatgttcttg tacgaatacg ctagaagaca cccagactac 1620

tctgttgttt tgttgttgag attggctaag acttacgaaa ctactttgga aaagtgttgt 1680

gctgctgctg acccacacga atgttacgct aaggttttcg acgaatttaa gccattggtt 1740

gaagaaccac aaaacttgat caagcaaaac tgtgaattgt tcgaacaatt gggtgaatac 1800

aagttccaaa acgctttgtt ggttagatac actaagaagg ttccacaagt ttctactcca 1860

actttggttg aagtttctag aaacttgggt aaggttggtt ctaagtgttg taagcaccca 1920

gaagctaaga gaatgccatg tgctgaagac tacttgtctg ttgttttgaa ccaattgtgt 1980

gttttgcacg aaaagactcc agtttctgac agagttacta agtgttgtac tgaatctttg 2040

gttaacagaa gaccatgttt ctctgctttg gaagttgacg aaacttacgt tccaaaggaa 2100

tttaacgctg aaactttcac tttccacgct gacatctgta ctttgtctga aaaggaaaga 2160

caaatcaaga agcaaactgc tttggttgaa ttggttaagc acaagccaaa ggctactaag 2220

gaacaattga aggctgttat ggacgacttc gctgctttcg ttgaaaagtg ttgtaaggct 2280

gacgacaagg aaacttgttt cgctgaagaa ggtaagaagt tggttgctgc ttctcaagct 2340

gctttgggtt tgtga 2355

<210> SEQ ID NO:3

<211> 2355

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO:3

agaggtgttt tcagaagaga cgctcacaag tctgaagttg ctcacagatt caaggacttg 60

ggtgaagaaa acttcaaggc tttggttttg atcgctttcg ctcaatactt gcaacaatgt 120

ccattcgaag accacgttaa gttggttaac gaagttactg aatttgctaa gacttgtgtt 180

gctgacgaat ctgctgaaaa ctgtgacaag tctttgcaca ctttgttcgg tgacaagttg 240

tgtactgttg ctactttgag agaaacttac ggtgaaatgg ctgactgttg tgctaagcaa 300

gaaccagaaa gaaacgaatg tttcttgcaa cacaaggacg acaacccaaa cttgccaaga 360

ttggttagac cagaagttga cgttatgtgt actgctttcc acgacaacga agaaactttc 420

ttgaagaagt acttgtacga aatcgctaga agacacccat acttctacgc tccagaattg 480

ttgttcttcg ctaagagata caaggctgct ttcactgaat gttgtcaagc tgctgacaag 540

gctgcttgtt tgttgccaaa gttggacgaa ttgagagacg aaggtaaggc ttcttctgct 600

aagcaaagat tgaagtgtgc ttctttgcaa aagttcggtg aaagagcttt caaggcttgg 660

gctgttgcta gattgtctca aagattccca aaggctgaat ttgctgaagt ttctaagttg 720

gttactgact tgactaaggt tcacactgaa tgttgtcacg gtgacttgtt ggaatgtgct 780

gacgacagag ctgacttggc taagtacatc tgtgaaaacc aagactctat ctcttctaag 840

ttgaaggaat gttgtgaaaa gccattgttg gaaaagtctc actgtatcgc tgaagttgaa 900

aacgacgaaa tgccagctga cttgccatct ttggctgctg acttcgttga atctaaggac 960

gtttgtaaga actacgctga agctaaggac gttttcttgg gtatgttctt gtacgaatac 1020

gctagaagac acccagacta ctctgttgtt ttgttgttga gattggctaa gacttacgaa 1080

actactttgg aaaagtgttg tgctgctgct gacccacacg aatgttacgc taaggttttc 1140

gacgaattta agccattggt tgaagaacca caaaacttga tcaagcaaaa ctgtgaattg 1200

ttcgaacaat tgggtgaata caagttccaa aacgctttgt tggttagata cactaagaag 1260

gttccacaag tttctactcc aactttggtt gaagtttcta gaaacttggg taaggttggt 1320

tctaagtgtt gtaagcaccc agaagctaag agaatgccat gtgctgaaga ctacttgtct 1380

gttgttttga accaattgtg tgttttgcac gaaaagactc cagtttctga cagagttact 1440

aagtgttgta ctgaatcttt ggttaacaga agaccatgtt tctctgcttt ggaagttgac 1500

gaaacttacg ttccaaagga atttaacgct gaaactttca ctttccacgc tgacatctgt 1560

actttgtctg aaaaggaaag acaaatcaag aagcaaactg ctttggttga attggttaag 1620

cacaagccaa aggctactaa ggaacaattg aaggctgtta tggacgactt cgctgctttc 1680

gttgaaaagt gttgtaaggc tgacgacaag gaaacttgtt tcgctgaaga aggtaagaag 1740

ttggttgctg cttctcaagc tgctttgggt ttgggtggtg gtggttctgg tggtggtggt 1800

tctggtggtg gtggttctgc agactccagt cctctcctgc aattcggggg ccaagtccgg 1860

cagcggtacc tctacacaga tgatgcccag cgtacagaag cccacctgga gatcagggag 1920

gatgggacgg tggggggcgc tgctgaccag agccccgaaa gtctcctgca gctgaaagcc 1980

ttgaagccgg gagttattca aatcttggga gtccgtacac cgaggttcct gtgccagcgg 2040

ccagatgggg ccctgtatgg atcgctccac tttgaccctg aggcctgcag cttccgggag 2100

ctgcttcttg aggacggata caatgtttac cagtccgaag cccacggcct cccgctgcac 2160

ctgccaggga acaagtcccc acaccgggac cctgcacccc gaggaccagc tcgcttcctg 2220

ccactaccat tcctgccccc cgcactcccg gagccacccg gaatcctggg tccccagccc 2280

cccgatgtgg gctcctcgga ccctctgagc atggtgggac cttcccaggg ccgaagcccc 2340

agctacgctt cctga 2355

<210> SEQ ID NO:4

<211> 1197

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO:4

gcagactcca gtcctctcct gcaattcggg ggccaagtcc ggcagcggta cctctacaca 60

gatgatgccc agcgtacaga agcccacctg gagatcaggg aggatgggac ggtggggggc 120

gctgctgacc agagccccga aagtctcctg cagctgaaag ccttgaagcc gggagttatt 180

caaatcttgg gagtccgtac accgaggttc ctgtgccagc ggccagatgg ggccctgtat 240

ggatcgctcc actttgaccc tgaggcctgc agcttccggg agctgcttct tgaggacgga 300

tacaatgttt accagtccga agcccacggc ctcccgctgc acctgccagg gaacaagtcc 360

ccacaccggg accctgcacc ccgaggacca gctcgcttcc tgccactacc attcctgccc 420

cccgcactcc cggagccacc cggaatcctg ggtccccagc cccccgatgt gggctcctcg 480

gaccctctga gcatggtggg accttcccag ggccgaagcc ccagctacgc ttccggtggt 540

ggtggttctg gtggtggtgg ttctggtggt ggtggttctg ttgaagaacc acaaaacttg 600

atcaagcaaa actgtgaatt gttcgaacaa ttgggtgaat acaagttcca aaacgctttg 660

ttggttagat acactaagaa ggttccacaa gtttctactc caactttggt tgaagtttct 720

agaaacttgg gtaaggttgg ttctaagtgt tgtaagcacc cagaagctaa gagaatgcca 780

tgtgctgaag actacttgtc tgttgttttg aaccaattgt gtgttttgca cgaaaagact 840

ccagtttctg acagagttac taagtgttgt actgaatctt tggttaacag aagaccatgt 900

ttctctgctt tggaagttga cgaaacttac gttccaaagg aattcaacgc tgaaactttc 960

actttccacg ctgacatctg tactttgtct gaaaaggaaa gacaaatcaa gaagcaaact 1020

gctttggttg aattggttaa gcacaagcca aaggctacta aggaacaatt gaaggctgtt 1080

atggacgact tcgctgcttt cgttgaaaag tgttgtaagg ctgacgacaa ggaaacttgt 1140

ttcgctgaag aaggtaagaa gttggttgct gcttctcaag ctgctttggg tttgtaa 1197

<210> SEQ ID NO:5

<211> 1197

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO:5

gttgaagaac cacaaaactt gatcaagcaa aactgtgaat tgttcgaaca attgggtgaa 60

tacaagttcc aaaacgcttt gttggttaga tacactaaga aggttccaca agtttctact 120

ccaactttgg ttgaagtttc tagaaacttg ggtaaggttg gttctaagtg ttgtaagcac 180

ccagaagcta agagaatgcc atgtgctgaa gactacttgt ctgttgtttt gaaccaattg 240

tgtgttttgc acgaaaagac tccagtttct gacagagtta ctaagtgttg tactgaatct 300

ttggttaaca gaagaccatg tttctctgct ttggaagttg acgaaactta cgttccaaag 360

gaattcaacg ctgaaacttt cactttccac gctgacatct gtactttgtc tgaaaaggaa 420

agacaaatca agaagcaaac tgctttggtt gaattggtta agcacaagcc aaaggctact 480

aaggaacaat tgaaggctgt tatggacgac ttcgctgctt tcgttgaaaa gtgttgtaag 540

gctgacgaca aggaaacttg tttcgctgaa gaaggtaaga agttggttgc tgcttctcaa 600

gctgctttgg gtttgggtgg tggtggttct ggtggtggtg gttctggtgg tggtggttct 660

gcagactcca gtcctctcct gcaattcggg ggccaagtcc ggcagcggta cctctacaca 720

gatgatgccc agcgtacaga agcccacctg gagatcaggg aggatgggac ggtggggggc 780

gctgctgacc agagccccga aagtctcctg cagctgaaag ccttgaagcc gggagttatt 840

caaatcttgg gagtccgtac accgaggttc ctgtgccagc ggccagatgg ggccctgtat 900

ggatcgctcc actttgaccc tgaggcctgc agcttccggg agctgcttct tgaggacgga 960

tacaatgttt accagtccga agcccacggc ctcccgctgc acctgccagg gaacaagtcc 1020

ccacaccggg accctgcacc ccgaggacca gctcgcttcc tgccactacc attcctgccc 1080

cccgcactcc cggagccacc cggaatcctg ggtccccagc cccccgatgt gggctcctcg 1140

gaccctctga gcatggtggg accttcccag ggccgaagcc ccagctacgc ttcctaa 1197

<210> SEQ ID NO:6

<211> 178

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO:6

Ala Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr 20

Asp Asp Ala Gln Arg Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly 40

Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile 60

Gln Ile Leu Gly Val Arg Thr Pro Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr 80

Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly 100

Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser 120

Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Phe Leu Pro 140

Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Gly Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser 160

Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala Ser *** 178

<210> SEQ ID NO:7

<211> 784

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO:7

Asp Pro Leu Ser MET Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala Ser Gly Gly 180

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp 200

Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala 220

Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys 240

Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn 260

Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg 280

Glu Thr Tyr Gly Glu MET Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys 300

Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp 320

Val MET Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu 340

Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr 360

Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys 380

Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala 400

Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln 420

Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val 440

His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala 460

Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys 480

Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu MET Pro Ala Asp 500

Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu 520

Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly MET Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr 540

Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys 560

Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val 580

Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr 600

Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro 620

Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro 640

Glu Ala Lys Arg MET Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys 660

Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu 680

Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu 700

Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg 720

Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys 740

Glu Gln Leu Lys Ala Val MET Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala 760

Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala 780

Ala Leu Gly Leu *** 784

<210> SEQ ID NO:8

<211> 784

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO:8

Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu 20

Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys 40

Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val 60

Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu 80

Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln 100

Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg 120

Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe 140

Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu 160

Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys 180

Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala 200

Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp 220

Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu 240

Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala 260

Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys 280

Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu 300

Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp 320

Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr 340

Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu 360

Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe 380

Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu 400

Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys 420

Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly 440

Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser 460

Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr 480

Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp 500

Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys 520

Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys 540

His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe 560

Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys 580

Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 600

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg 620

Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Arg Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu 640

Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala 660

Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Arg Thr Pro Arg Phe Leu Cys Gln Arg 680

Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu 700

Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His 720

Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu 740

Pro Leu Pro Phe Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Gly Pro Gln Pro 760

Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro 780

Ser Tyr Ala Ser *** 784

<210> SEQ ID NO:9

<211> 398

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO:9

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu 200

Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu 220

Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser 240

Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro 260

Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr 280

Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys 300

Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe 320

Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr 340

Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val 360

Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys 380

Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu *** 398

<210> SEQ ID NO:10

<211> 398

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO:10

Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu 20

Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr 40

Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His 60

Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu 80

Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser 100

Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys 120

Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu 140

Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr 160

Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys 180

Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln 200

Ala Ala Leu Gly Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 220

Ala Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr 240

Asp Asp Ala Gln Arg Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly 260

Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile 280

Gln Ile Leu Gly Val Arg Thr Pro Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr 300

Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly 320

Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser 340

Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Phe Leu Pro 360

Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Gly Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser 380

Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala Ser *** 398

Claims

1.重组人成纤维细胞生长因子21融合蛋白在制备治疗糖尿病的药物中的应用，所述重组人成纤维细胞生长因子21融合蛋白是将人成纤维细胞生长因子21重组蛋白mFGF21与HSA或3DHSA连接而成的重组融合蛋白mFGF21-HSA、HSA-mFGF21、mFGF21-3DHSA和3DHSA-mFGF21，其中重组蛋白mFGF21的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示，重组融合蛋白mFGF21-HSA的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:7所示，重组融合蛋白HSA-mFGF21的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:8所示，重组融合蛋白mFGF21-3DHSA的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:9所示，重组融合蛋白3DHSA-mFGF21的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:10所示，其特征在于：mFGF21-HSA、HSA-mFGF21、mFGF21-3DHSA和3DHSA-mFGF21的制备方法包括如下步骤：

（1）mFGF21-HSA、HSA-mFGF21、mFGF21-3DHSA和3DHSA-mFGF21表达载体的构建：根据大肠杆菌密码子偏好性，设计出4种基因，其核苷酸序列分别如序列表中SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示，同时在各基因两端设计NdeI与BamHI两酶切位点，将4种合成的含有各自目的基因片段的载体和pET30a（+）分别用NdeI与Bam HI双酶切，酶切完毕后，胶回收各自需要的目标片段，使用T4 DNA连接酶将4种目的片段分别与原核表达载体pET30a（+）连接，连接反应体系为10μL，混匀，4℃连接过夜，然后各自转化至大肠杆菌DH5α中，挑取阳性克隆，经过酶切鉴定后，即分别构建得到4种重组质粒pET30a-mFGF21-HSA、pET30a-HSA-mFGF21、pET30a-mFGF21-3DHSA和pET30a-3DHSAmFGF21；

（2）mFGF21-HSA、HSA-mFGF21、mFGF21-3DHSA和3DHSA-mFGF21四种融合蛋白的表达：将含有正确序列的4种重组质粒pET30a-mFGF21-HSA、pET30a-HSA-mFGF21、pET30amFGF21-3DHSA和pET30a-3DHSA-mFGF21分别转化至表达菌株Rosseta，转化后的单菌落分别接种至20mL含50μg/mL Kan的LB培养基中，37℃培养8h，以体积比为1:100接种于另一20mL含50μg/mL Kan的LB培养基中，37℃培养，当A600在0.35左右时，加入IPTG至终浓度为0.25mmol/L进行诱导，诱导温度为30℃，5h后收获菌体，用20mmol/L Na₃PO₄，pH 7.0的Binding buffer重悬菌体，破碎菌体后离心；

（3）mFGF21-HSA、HSA-mFGF21、mFGF21-3DHSA和3DHSA-mFGF21四种融合蛋白的纯化：向菌体中加入1mg/mL的溶菌酶，冰上放置30min；超声破碎菌体细胞，超声条件为工作1s，间隔1s，4min/次，共3次循环；破碎彻底后，12000rpm，4℃离心15min，收集上清，上清液过0.22μm滤膜澄清后，通过泵进入AKTA purifier 100系统，与2-3倍柱体积Binding buffer平衡好的、装于XK16/20空柱、柱高10cm、流速100cm/h的Blue Sepharose 6FF柱完全结合后，用4-5倍柱体积的binding buffer冲洗杂蛋白，当紫外曲线达到稳定的基线时，再用2-3倍柱体积的20mmol/L Na₃PO₄、2mol/L NaCl、pH 7.0的Elution buffer洗脱目的蛋白，把结合在填料上的融合蛋白洗脱下来并收集到试管中。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的重组融合蛋白mFGF21-HSA编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，重组融合蛋白HSA-mFGF21编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示，重组融合蛋白mFGF21-3DHSA编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:4所示，重组融合蛋白3DHSA-mFGF21编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:5所示。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述药物包括治疗上有效剂量的重组人成纤维细胞生长因子21融合蛋白和药学上可接受的载体或辅料。