CN117327200B - 一种调控糖脂代谢和抗衰老的双功能重组蛋白gik及其制备方法 - Google Patents
一种调控糖脂代谢和抗衰老的双功能重组蛋白gik及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种调控糖脂代谢和抗衰老的双功能重组蛋白GIK及其制备方法。重组蛋白GIK包含N端、中段和C端，N端为优化的人GLP‑1多肽，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1；中段为人IgG4的Fc区，其氨基酸序列为SEQ ID NO:2；C端为s‑klotho多肽，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3；N端与中段通过连结肽1连接，其氨基酸序列为SEQ ID NO:4；中段与C端通过连结肽2连接，其氨基酸序列为SEQ ID NO:5；在其N端引入人血清白蛋白的信号肽，其氨基酸序列为SEQ ID NO:7，获得能在哺乳动物细胞中分泌表达的双功能重组蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO:8。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种调控糖脂代谢和抗衰老的双功能重组蛋白GIK及其制备方法。
背景技术
糖尿病是世界性的临床常见慢性疾病之一，我国成人糖尿病患病率已高达12.8%。随病情发展，糖尿病人会产生多种并发症，例如血管病变、末梢神经病变、脆性骨折、远指端糜烂等。目前大量的临床和基础研究发现，糖尿病与衰老存在紧密关联，衰老能引起多种慢性代谢性疾病，而糖尿病的发生和发展也会促进细胞的衰老进程。有研究表明，衰老细胞能够分泌激活素Ａ、IL-6和TNF-α等衰老相关因子促进胰岛素抵抗，衰老的脂肪细胞可以诱导巨噬细胞进入内脏脂肪组织，释放趋化因子，加剧2型糖尿病的病情发展[Xu M, TchkoniaT, Ding H, Ogrodnik M, Lubbers ER, Pirtskhalava T, White TA, Johnson KO,Stout MB, Mezera V, Giorgadze N, JensenMD, LeBrasseur NK, Kirkland JL. JAKinhibition alleviates the cellular senescence-associated secretory phenotypeand frailty in old age. Proc Natl AcadSci U S A. 2015 Nov 17; 112(46): E6301-10. doi: 10.1073/pnas.1515386112.]。糖尿病患者体内高糖高脂的环境会引发体内活性氧（ROS）生成增加，造成线粒体和DNA损伤，由此触发细胞的周期停滞以及衰老。高糖微环境还会增加晚期糖基化终末产物（AGEs），导致衰老细胞的更易扩散并阻碍机体清除衰老细胞。更有甚者，糖尿病引发的脂肪堆积会诱发慢性无菌性炎症和脂肪毒，进一步加速衰老[Berlanga-AcostaJA, Guillén-Nieto GE, Rodríguez-Rodríguez N, Mendoza-Mari Y,Bringas-Vega ML, Berlanga-Saez JO, García Del Barco Herrera D, Martinez-Jimenez I,Hernandez-Gutierrez S, Valdés-Sosa PA. Cellular Senescence as thePathogenic Hub of Diabetes-Related Wound Chronicity.Front Endocrinol(Lausanne). 2020 Sep 16; 11: 573032. doi: 10.3389/fendo.2020.573032.]。
糖尿病的治疗大多先通过生活方式改善控制血糖，随后辅以降糖类药物。传统的降糖药物大多存在不良反应，如二甲双胍、格列奈类、α-糖苷酶抑制剂等降糖效果不明显且会诱发胃肠道不适；胰岛素、磺酰脲类药物会增加低血糖和肥胖风险。近年来新研发的胰高血糖素样肽-l受体激动剂(GLP-1 Receptor Agonists，GLP-1 RA)和胰高血糖素样肽-1(Glucagon-like Peptide-1，GLP-1)类似物，通过作用于GLP-1受体，激活胰岛B细胞以血糖依赖的方式分泌胰岛素，具有降低低血糖风险和治疗窗口宽的特点，显著提高了用药安全[RomeraI, Cebrián-Cuenca A, Álvarez-Guisasola F, Gomez-Peralta F, ReviriegoJ. A Review of Practical Issues on the Use ofGlucagon-Like Peptide-1 ReceptorAgonists for the Management of Type 2 Diabetes. Diabetes Ther. 2019 Feb; 10(1): 5-19. doi:10.1007/s13300-018-0535-9.]。临床实践表明，很多治疗糖尿病的药物也具有治疗衰老相关疾病的效果，例如，二甲双胍是一种衰老相关分泌表型（SenescentAssociated SecretoryPhenotype, SASP）的弱抑制剂，对衰老导致的心血管疾病和癌症发展有一定治疗作用[Huffman DM, Justice JN, Stout MB, Kirkland JL, Barzilai N,Austad SN. Evaluating HealthSpan in Preclinical Models of Aging and Disease:Guidelines, Challenges, and Opportunities for Geroscience. J Gerontol A BiolSci Med Sci. 2016 Nov; 71(11):1395-1406. doi: 10.1093/gerona/glw106.]。鲁索利替尼能够降低老年小鼠的胰岛素抵抗及减缓衰老导致的干细胞功能障碍[Anderson R,Lagnado A, Maggiorani D, Walaszczyk A, Dookun E, Chapman J, Birch J,Salmonowicz H, Ogrodnik M, Jurk D, Proctor C, Correia-Melo C, Victorelli S,Fielder E, Berlinguer-Palmini R, Owens A, Greaves LC, Kolsky KL, Parini A,Douin-Echinard V, LeBrasseur NK, Arthur HM, Tual-Chalot S, Schafer MJ, RoosCM,Miller JD, Robertson N, Mann J, Adams PD, Tchkonia T, Kirkland JL, Mialet-Perez J, Richardson GD, Passos JF. Length-independent telomere damagedrivespost-mitotic cardiomyocyte senescence. EMBO J. 2019 Mar 1; 38(5):e100492. doi: 10.15252/embj.2018100492.]。
目前，尽管糖尿病与衰老的许多内在的关联机制尚未完全揭示，但可以预见，两者的联合治疗是良好的切入点，对于慢性疾病防治有极大的现实意义。
发明内容
本发明为实现糖尿病与衰老的联合治疗，提供了一种调控糖脂代谢和抗衰老的双功能重组蛋白GIK及其制备方法。
本发明的具体技术方案如下：
本发明提供的调控糖脂代谢和抗衰老的双功能重组蛋白GIK，其特征在于，包含3个结构单元，N端、中段和C端；其中，N端为优化的人GLP-1多肽，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1；中段为人IgG4的Fc区，该人IgG4的Fc区内同时引入S010P、F016A和L017A突变，其氨基酸序列为SEQ ID NO:2；C端为s-klotho多肽，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3；N端与中段通过连结肽1连接，中段与C端通过连结肽2连接。
本发明提供的调控糖脂代谢和抗衰老的双功能重组蛋白GIK，还具有这样的技术特征，其中，连接肽1的氨基酸序列为SEQ ID NO:4，连接肽2的氨基酸序列为SEQ ID NO:5。
本发明提供的调控糖脂代谢和抗衰老的双功能重组蛋白GIK，还具有这样的技术特征，其中，为了使双功能重组蛋白GIK在哺乳动物细胞中正常分泌，在双功能重组蛋白GIK的N端引入人血清白蛋白的信号肽，该信号肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:7。
本发明提供的调控糖脂代谢和抗衰老的双功能重组蛋白GIK，还具有这样的技术特征，能在哺乳动物细胞中分泌表达的双功能重组蛋白GIK的氨基酸序列为SEQ ID NO:8；未在双功能重组蛋白GIK的N端引入人血清白蛋白的信号肽，不能在哺乳动物细胞中分泌表达的双功能重组蛋白GIK的氨基酸序列为SEQ ID NO:6。
本发明还提供了一种编码能在哺乳动物细胞中分泌表达的双功能重组蛋白GIK的编码DNA，其特征在于，编码DNA的序列为SEQ ID NO:9或其密码子优化序列（针对宿主细胞做的密码子优化）。
本发明还提供了一种GIK表达载体，其特征在于，该GIK表达载体含有上述编码DNA。
本发明还提供了一种GIK宿主细胞，其特征在于，该GIK宿主细胞含有上述GIK表达载体，或者GIK宿主细胞的基因组中整合有上述编码DNA，该GIK宿主细胞为真核细胞。
本发明提供的GIK宿主细胞，还具有这样的技术特征，上述真核细胞选自哺乳动物细胞、酵母和丝状真菌，真核细胞优选为哺乳动物细胞或酵母，真核细胞更优选为哺乳动物细胞。
本发明还提供了一种上述调控糖脂代谢和抗衰老的双功能重组蛋白GIK的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤S1，构建GIK表达载体：将编码DNA的序列置于真核基因表达调控序列内，得到能在真核细胞内表达的GIK表达载体；步骤S2，将GIK表达载体转染入真核细胞：通过基因转染技术将GIK表达载体导入真核细胞内，实现GIK表达框架稳定整合在真核细胞的染色体上进行稳定表达或以细胞外遗传物质的形式进行瞬时表达，得到GIK宿主细胞（即含有GIK表达框架的真核细胞）；步骤S3，高密度悬浮培养GIK宿主细胞，以高密度、长时间的方式表达双功能重组蛋白GIK，得到含有双功能重组蛋白GIK的培养物；步骤S4，从含有双功能重组蛋白GIK的培养物中纯化双功能重组蛋白GIK。
本发明提供的调控糖脂代谢和抗衰老的双功能重组蛋白GIK的制备方法，还具有这样的技术特征，其中，步骤S4中纯化双功能重组蛋白GIK的具体过程为：步骤S4-1，将含有双功能重组蛋白GIK的培养物进行浓缩、过滤，得到前处理液；步骤S4-2，亲和层析处理前处理液，得到亲和层析纯化产物；步骤S4-3，将亲和层析纯化产物用离子交换层析处理，得到离子交换层析纯化产物；步骤S4-4，利用分子筛去除离子交换层析纯化产物中的单体，获得二聚体形式的双功能重组蛋白GIK。
本发明还提供了一种重组蛋白，其特征在于，该重组蛋白的氨基酸序列与能在哺乳动物细胞中分泌表达的双功能重组蛋白GIK的氨基酸序列的同源性≥85%，优选同源性≥90%，更优选同源性≥95%。
本发明还提供了一种DNA序列，其特征在于，该DNA序列编码上述重组蛋白，且与上述编码DNA的序列（SEQ ID NO:9或其密码子优化序列）的同源性≥85%，优选同源性≥90%，更优选同源性≥95%。
本发明还提供了一种药物制剂，其特征在于，该药物制剂含有上述调控糖脂代谢和抗衰老的双功能重组蛋白GIK和/或上述重组蛋白。
发明的作用与效果
与现有技术相比，本发明提供的调控糖脂代谢和抗衰老的双功能重组蛋白GIK及其制备方法具有如下技术优势：
（1）本发明的双功能重组蛋白GIK含有两个功能性结构域，分别为N端的优化的人GLP-1多肽和C端的s-Klotho多肽，具有降糖、减轻体重和抗衰老等多重功效。天然GLP-1是由肠道细胞产生的一种激素，会刺激增强胰岛素的分泌，抑制胰高血糖素分泌，还会延缓胃排空的速度。基于GLP-1的氨基酸序列，目前已经开发了多款治疗糖尿病和减轻体重的药物，例如利拉鲁肽、艾塞那肽、利司那肽、杜拉鲁肽、索马鲁肽等。本发明中优化的人GLP-1多肽，是将天然GLP-1第2位的Ala置换为Gly，由此可以抵抗体内二肽基肽酶4（DPP-4）的酶解，提高体内半衰期。s-Klotho多肽是一种抗衰老蛋白，Klotho过表达可延长小鼠30%的寿命。s-Klotho不仅调节磷酸盐代谢，还调节钙代谢；抑制胰岛素/IGF-1信号通路，激活FoxO转录因子，产生抗氧化酶，通过去除ROS降低氧化应激，从而下调细胞凋亡；抑制TNF-α诱导的氧化损伤，并阻止活化B细胞中NF-κB易位到细胞核；抑制TGF-β1和Wnt/β-catenin信号通路。
（2）为了进一步提高优化的人GLP-1多肽和s-Klotho多肽的体内半衰期，本发明将人IgG4的Fc片段融合入重组蛋白。IgG4的铰链区较短，且与FcγRI（CD64）之外的FcγRs结合较弱，不能引起CDC和ADCC，可以更有效降低重复用药的免疫反应。同时，本发明在IgG4的Fc区内同时引入S010P、F016A和L017A突变，进一步去除了Fc区的效应器功能。S010P突变还能够稳定双功能重组蛋白GIK分子的二聚体状态，阻止半分子的形成。这种引入突变的Fc区的引入可以同时提高GLP-1和s-Klotho两者的体内半衰期，并使得两蛋白处于双分子状态，增加了局部配基密度，有效提高它们与受体的结合效率，提高体内功能。同时，IgG4 Fc区的引入使得双功能重组蛋白GIK可以很方便地通过ProteinA或Protein G亲和层析得到纯化，易于放大。
（3）为保障双功能重组蛋白GIK中各个功能区的功效发挥，本发明通过两种连结肽将三个结构单元连接在一起。为适应GLP-1短肽的特点，本发明使用了柔性连结肽1将优化的GLP-1与Fc区的N端连接，实现两功能域不互相干扰。为适应s-Klotho和Fc区均相对较大，本发明将连接肽2延长到了23个氨基酸。
（4）本发明采用哺乳动物细胞制备双功能重组蛋白GIK，一方面是因为哺乳动物细胞能够完成复杂的翻译后修饰，保障双功能重组蛋白GIK各区域的功能；另一方面，哺乳动物细胞培养系统已被广泛用于治疗性抗体、双特异性抗体和复杂蛋白的医药级生产，生产体系成熟。在本发明中，人血清白蛋白的分泌肽被用于双功能重组蛋白GIK的分泌表达，这是因为与天然免疫球蛋白的信号肽相比，白蛋白信号肽能够介导更好的抗体蛋白表达。
（5）本发明的双功能重组蛋白GIK制备方法是通过真核细胞进行的，这不但保障了双功能重组蛋白GIK获得充分的翻译后修饰，使其具备更完全的生物学功能；同时，真核细胞特别是哺乳动物细胞（例如CHO等）有成熟的生产工艺可方便扩大生产规模。
附图说明
图1是本发明实施例的GIK前体蛋白的结构示意图。
图2是本发明实施例的GIK基因的真核表达载体pCMV-GIK质粒图谱。
图3是本发明实施例的pCMV-GIK质粒酶切电泳图谱。图中，M为DNA Ladder (0.1-10 kb）；1为KpnI线性化的pCMV-GIK；2为pCMV-GIK的NotI+EcoR双酶切结果。
图4是本发明实施例的GIK整合CHO-K1细胞（GIK宿主细胞）克隆。
图5是本发明实施例的GIK相对高效率表达的克隆Dot-bloting检测。
图6是本发明实施例的双功能重组蛋白GIK的Protein A-sehparose 亲和层析。图中，A为ProteinA亲和层析色谱图；B为亲和层析各峰SDS-PAGE结果。
图7是本发明实施例的双功能重组蛋白GIK的DEAE-sepharose离子交换层析。图中，A为DEAE离子交换层析色谱图；B为离子交换层析各峰SDS-PAGE结果。
图8是本发明测试例1的双功能重组蛋白GIK的降糖效果。
图9是本发明测试例2的双功能重组蛋白GIK的抗衰老效果。
具体实施方式
在本发明中使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
下述实施例中所采用的试剂为普通商业途径购得，未注明的实验操作及实验条件参考本领域的常规操作及常规条件。
以下结合实施例和附图来说明本发明的具体实施方式。
<实施例>
本实施例提供了一种调控糖脂代谢和抗衰老的双功能重组蛋白GIK及其制备方法。该双功能重组蛋白GIK能在哺乳动物细胞中分泌表达，其制备方法的步骤如下：
步骤S1，构建GIK表达载体：将编码DNA的序列置于真核基因表达调控序列内，得到能在真核细胞内表达的GIK表达载体。具体过程为：
为实现兼具糖脂代谢调控和抗衰老的双重功能，设计将优化的人GLP-1多肽和s-Klotho多肽两种功能域分别置于人IgG4的Fc区的N端和C端，N端优化的人GLP-1多肽和中段人IgG4的Fc区通过连结肽1（氨基酸序列为SEQ ID NO:4）连接，中段人IgG4的Fc区和C端s-Klotho多肽通过连结肽2（氨基酸序列为SEQ ID NO:5）连接，形成不能在哺乳动物细胞中分泌表达的双功能重组蛋白GIK，其氨基酸序列为SEQ ID NO:6。
为保障双功能重组蛋白GIK在哺乳动物细胞中正常有效分泌表达，在其N端引入人血清白蛋白的分泌肽（信号肽），该信号肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:7，形成能在哺乳动物细胞中分泌表达的双功能重组蛋白GIK（GIK前体蛋白），其氨基酸序列为SEQ ID NO:8，其结构如图1所示。
根据GIK前体蛋白的氨基酸序列设计出其编码DNA序列，并在其两端分别加入NotI和EcoRI位点方便亚克隆入表达载体，最终得到的编码GIK前体蛋白的编码DNA序列为SEQID NO:9。
最后委托苏州金唯智生物科技有限公司完成全基因合成，获得含GIK前体蛋白编码DNA序列的pUC-GIK质粒。用NotI和EcoRI双酶切pUC-GIK质粒，琼脂糖凝胶电泳，切胶回收GIK基因，将之定向克隆入NotI+EcoRI双酶切的表达载体pCMV-Express，形成GIK基因的真核表达载体pCMV-GIK质粒（即GIK表达载体）。GIK基因的真核表达载体pCMV-GIK质粒图谱如图2所示。pCMV-GIK质粒酶切电泳图谱如图3所示。
步骤S2，将GIK表达载体转染入真核细胞：通过基因转染技术将GIK表达载体导入真核细胞内，实现GIK表达框架稳定整合在真核细胞的染色体上进行稳定表达或以细胞外遗传物质的形式进行瞬时表达，得到GIK宿主细胞（即含有GIK表达框架的真核细胞）。并进行高产稳定整合单克隆细胞株的筛选，具体过程为：
细胞转染：
用限制性内切酶KpnI线性化pCMV-GIK，1%琼脂糖凝胶电泳，切胶回收线性化片段，调整DNA（即KpnI线性化的pCMV-GIK）浓度0.5µg/µl，0.22µm过滤后用于细胞转染。
复苏液氮保存的CHO-K1细胞，用完全培养基（含有10%胎牛血清的DEME)进行正常传代培养，培养箱培养条件设置为37℃、5% CO2。DNA转染方法采用PEI方法，该方法为：转染前1天，消化并传代细胞至12孔培养皿，传代细胞数量为2.5×105/ml。转染当天，CHO-K1细胞汇合度达到70~80%时开始转染。转染时DNA用量为：DNA/培养总体积=1µg/ml。准备DNA-PEI 复合物：将DNA、PEI 40000和DMEM基础培养基平衡至室温，用DMEM基础培养基做稀释液，将 DNA稀释至20µg/ml， 将PEI 40000稀释至60µg/ml。按DNA:PEI=1:3的质量比混合(100µl DNA+100µl PEI 40000)，用移液器上下吹吸2-3次，使DNA与PEI充分混合，室温静置30 min 以形成 DNA-PEI复合物；将200µl DNA-PEI复合物逐滴加入CHO细胞培养板中，6小时后更换新鲜培养液，24小时后按1:20传至10cm培养皿中，并加入选择培养基（含有10µg/ml嘌呤霉素的完全培养基）。
高产稳定整合单克隆细胞株的筛选：
pCMV-GIK转染后细胞（即GIK宿主细胞），每3天换液1次，持续选择培养12天，培养条件为：含有10µg/ml嘌呤霉素的完全培养基。有明显单克隆长成，如图4所示。
挑取单克隆：用PBS缓冲液清洗细胞，克隆环套住细胞克隆，加入胰酶消化下细胞，并传入96孔板。一共挑取了111个细胞克隆。待96孔板细胞长满后（3-5天），细胞克隆依次传代至24孔、12孔、6孔和10cm皿，每次传代保留培养上清用于双功能重组蛋白GIK表达分析。
双功能重组蛋白GIK表达情况通过Dot-bloting方法筛选，Dot-bloting方法为：取2µl细胞培养上清点在硝酸纤维素膜上，晾干后，5%脱脂奶粉4℃封闭过夜，然后用1:2000（适量）稀释的兔抗人IgG-HRP抗体室温杂交3小时，PBS-T洗膜后，ECL试剂盒显色。用人IgG作为阳性对照。结果在111个细胞克隆中，筛选出了12株双功能重组蛋白GIK相对高效率表达的克隆，如图5所示，分别为：9#，17#，23#，32#，67#，53#，66#，69#，76#，91#，95#，110#。将这12株GIK高效表达克隆细胞冻存于液氮罐中，用于后续进一步无血清驯化。
步骤S3，高密度悬浮培养GIK宿主细胞，以高密度、长时间的方式表达双功能重组蛋白GIK，得到含有双功能重组蛋白GIK的培养物。具体过程为：
在高密度悬浮培养GIK高效表达克隆细胞前，需对其进行无血清驯化。从液氮罐中取出各株GIK高效表达克隆细胞，复苏入10cm培养板中，培养液为含10%血清的完全培养液，按1:3传代。在第3次传代时，培养液更换为75%完全培养液+25%无血清培养液（Vega CHOMedium，P106390，奥浦迈）。细胞长满后，做第4次传代，培养液更换为50%完全培养液+50%无血清培养液。第5和第6次传代，培养液均更换为25%完全培养液+75%无血清培养液。第7次传代，将3个10cm皿的细胞合并在一起，加入25ml的100%无血清培养液，置于125ml摇瓶进行悬浮培养，培养条件为：120rpm、37℃、5% CO2。每天跟踪测定悬浮培养细胞的细胞密度和活力，待细胞密度到达(2-4)×106/ml进行1:3传代。直至连续3代，细胞传代48-96小时后，密度能达到(2-3)×106/ml，活力≥90%，且倍增时间稳定，即为无血清驯化成功。取驯化成功的各细胞株，按(0.4-0.6)×106/ml初始细胞密度进行培养，至细胞密度为2×106/ml，取上清进行Dot-blotting检测GIK的表达水平，筛选出其中表达量最高的69#细胞株。取驯化成功的细胞，用冻存液（含有10% DMSO的无血清培养液）调整细胞密度至20×106/ml，于液氮中长期保存。
将无血清驯化成功的69#细胞株，按照125ml摇瓶→250ml摇瓶→1L摇瓶→5L摇瓶依次放大培养，培养条件为：无血清培养基，120rpm、37℃、5% CO2。待细胞密度生长至(2-3)×106/ml时进行转接瓶，转接瓶后细胞的起始密度控制在(0.4-0.6)×106/ml，各级摇瓶的培养液体积分别为25ml、60ml、250ml、1600ml。共持续培养10-15天，待5L摇瓶中的细胞密度达到(4-6)×106/ml时，每2天加入一次5%培养液体积的补料液（Vega CHO Feed，P120826，奥浦迈），待细胞密度达到10×106/ml时或者培养至第7天时，降低培养温度至32℃，每天检测1次细胞活力。待细胞活力降至≤80%时，收获含有双功能重组蛋白GIK的培养物约2L/瓶，共3瓶，总共6L。将培养物经3000g低温离心20min，去除细胞沉淀，上清液储存于-20℃直至开始双功能重组蛋白GIK的纯化工作。
步骤S4，从含有双功能重组蛋白GIK的培养物中纯化双功能重组蛋白GIK。步骤如下：
步骤S4-1，将含有双功能重组蛋白GIK的进行浓缩、过滤，得到前处理液。具体过程为：将步骤S3中获得的-20℃冻存的上清液取出，置于15℃缓慢融化；融化的上清液用0.22µm滤膜过滤，滤液再通过10kDa截留分子量的超滤膜超滤浓缩，最终上清液被浓缩5倍，终体积约1.2L，得到前处理液。
步骤S4-2，亲和层析处理前处理液，得到亲和层析纯化产物。具体过程为：前处理液通过Protein A-Sepharose 6FF亲合层析纯化，流动相为20 mmol/L磷酸钠缓冲溶液，pH7.4；洗脱溶液为20 mmol/L 磷酸钠缓冲溶液，pH 2.5；流速为3ml/min，收集洗脱峰，如图6所示。用1M Tris-HCl、pH8.0，调节洗脱液pH至7.0，得到亲和层析纯化产物。
步骤S4-3，将亲和层析纯化产物用离子交换层析处理，得到离子交换层析纯化产物。具体过程为：将亲和层析纯化产物进行DEAE-sepharose离子交换层析，流动相为20mmol/L磷酸钠缓冲溶液，pH7.0。通过0-1M NaCl线性洗脱，收集含有GIK的洗脱峰，如图7所示。如图7中的SDS-PAGE结果所示，GIK为清晰单一条带。用截留分子量为50kDa的超滤膜浓缩洗脱液，至蛋白浓度为5.0mg/ml，得到离子交换层析纯化产物。
步骤S4-4，利用分子筛去除离子交换层析纯化产物中的单体，获得二聚体形式的双功能重组蛋白GIK。具体过程为：将离子交换层析纯化产物进行分子筛层析，所用填料为S-200，流动相为PBS，收集目标蛋白峰（即二聚体形式的双功能重组蛋白GIK），用截留分子量为50kDa的超滤膜超滤浓缩至蛋白浓度为10mg/ml，4℃短时存放＜3周，-20℃长期保存。
<测试例1>
本测试例对上述实施例得到的二聚体形式的双功能重组蛋白GIK的降糖效果进行测定。测定过程如下：
健康8周龄C57BL/6小鼠购于上海南方模式生物科技股份有限公司，使用许可证号为SYXK（沪）2023-0005。小鼠饲养于20±2℃，相对湿度55±5％条件下，给予正常的饮食和饮水。
适应性喂养7天后，将C57BL/6小鼠分为空白对照组、阳性对照组、实验组三组，每组6只。小鼠禁食过夜后再开展腹腔注射。空白对照组小鼠注射200μ1 40%葡萄糖溶液，实验组小鼠注射200μ1 40%葡萄糖溶液+50μg 双功能重组蛋白GIK，阳性对照组小鼠注射200μ140%葡萄糖溶液+10μg GLP-1(7-36)NH2，GLP-1(7-36)NH2购于Sigma。
每只小鼠注射完成后，立刻用肝素浸润的玻璃吸管从小鼠眼角取血20μl，置于300μ1生理盐水中混匀，3000rpm离心除去红血球，上清液用于测定血糖浓度。随后，分别于注射后30min、60min和120min采用同上操作取一次血，并保留上清液用于血糖浓度测定，测定结果如图8所示。
由图8可知，空白对照组小鼠血糖浓度大幅升高，后逐渐回落到正常水平。实验组和阳性对照组小鼠的血糖浓度一直保持在正常水平附近，没有出现大幅升高现象，说明注射GLP-1(7-36)NH2和双功能重组蛋白GIK具有降血糖作用，符合理论预期双功能重组蛋白GIK的降糖功能。
<测试例2>
本测试例对上述实施例得到的二聚体形式的双功能重组蛋白GIK的抗衰老效果进行测定。测定过程如下：
通过D-半乳糖衰老小鼠模型评估双功能重组蛋白GIK的抗衰老效果。将8周龄C57BL/6J小鼠随机分为3组：正常对照组、D-半乳糖衰老组、GIK干预组，每组6只。用药情况列于表1。
表1
试验期间每周称量小鼠体重，观察小鼠的摄食、饮水和行为的变化。末次给药后禁食12h，眼球丛静脉取血，分离血清，同时解剖取脑组织、肝脏、肾脏、胸腺和脾脏等，生理盐水漂洗后，置于-80℃保存，供后续实验使用。
眼球丛静脉取血，置于离心管中，4℃下2500r/min离心10min获得血清，按照试剂盒说明书，分别测定小鼠血清中超氧化物歧化酶活性、谷胱甘肽过氧化物酶活性、总抗氧化能力和丙二醛的含量，测定结果如图9所示。
由图9可知，D-半乳糖衰老组与正常对照组相比，血清中超氧化物歧化酶活性、谷胱甘肽过氧化物酶活性和总抗氧化能力显著降低，丙二醛含量显著升高。GIK干预组与D-半乳糖衰老组相比，GIK干预血清超氧化物歧化酶活性、谷胱甘肽过氧化物酶活性和总抗氧化能力水平显著升高，丙二醛含量降低。结果表明皮下注射双功能重组蛋白GIK可增强小鼠血清中的抗氧化酶活性，对D-半乳糖致小鼠衰老有一定的保护作用。
以上是对实施例的详细描述，方便本领域的技术人员能正确理解和使用本发明。凡本领域的技术人员依据本发明在现有技术基础上，不经过创新性的劳动，仅通过分析、类推或有限列举等方法得到的改进或修改技术方案，都应该在由权利要求书所确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种调控糖脂代谢和抗衰老的双功能重组蛋白GIK，其特征在于，包含3个结构单元，N端、中段和C端，
其中，N端为优化的人GLP-1多肽，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1，中段为人IgG4的Fc区，所述人IgG4的Fc区内同时引入S010P、F016A和L017A突变，其氨基酸序列为SEQ ID NO:2，
C端为s-klotho多肽，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3，
所述N端与所述中段通过连结肽1连接，
所述中段与所述C端通过连结肽2连接，
其中，所述连接肽1的氨基酸序列为SEQ ID NO:4，
所述连接肽2的氨基酸序列为SEQ ID NO:5。
2.根据权利要求1所述的调控糖脂代谢和抗衰老的双功能重组蛋白GIK，其特征在于，
其中，为了使所述双功能重组蛋白GIK在哺乳动物细胞中正常分泌，在所述双功能重组蛋白GIK的所述N端引入人血清白蛋白的信号肽，该信号肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:7。
3.根据权利要求1或2所述的调控糖脂代谢和抗衰老的双功能重组蛋白GIK，其特征在于，所述双功能重组蛋白GIK能在哺乳动物细胞中分泌表达，其氨基酸序列为SEQ ID NO:8。
4.一种编码如权利要求3所述的双功能重组蛋白GIK的编码DNA，其特征在于，所述编码DNA的序列为SEQ ID NO:9或其密码子优化序列。
5.一种GIK表达载体，其特征在于，所述GIK表达载体含有如权利要求4所述的编码DNA。
6.一种GIK宿主细胞，其特征在于，所述GIK宿主细胞含有如权利要求5所述的GIK表达载体，或者所述GIK宿主细胞的基因组中整合有如权利要求4所述的编码DNA，所述GIK宿主细胞为真核细胞。
7.根据权利要求6所述的GIK宿主细胞，其特征在于，所述真核细胞选自哺乳动物细胞、酵母和丝状真菌。
8.一种如权利要求1-3中任一项所述的调控糖脂代谢和抗衰老的双功能重组蛋白GIK的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤S1，构建如权利要求5所述的GIK表达载体：将如权利要求4所述的编码DNA的序列置于真核基因表达调控序列内，得到能在真核细胞内表达的GIK表达载体；
步骤S2，将所述GIK表达载体转染入真核细胞：通过基因转染技术将所述GIK表达载体导入真核细胞内，得到如权利要求6或7所述的GIK宿主细胞；
步骤S3，高密度悬浮培养所述GIK宿主细胞，表达双功能重组蛋白GIK，得到含有双功能重组蛋白GIK的培养物；
步骤S4，从所述含有双功能重组蛋白GIK的培养物中纯化双功能重组蛋白GIK。
9.根据权利要求8所述的调控糖脂代谢和抗衰老的双功能重组蛋白GIK的制备方法，其特征在于，
其中，步骤S4中所述纯化双功能重组蛋白GIK的具体过程为：
步骤S4-1，将所述含有双功能重组蛋白GIK的培养物进行浓缩、过滤，得到前处理液；
步骤S4-2，亲和层析处理所述前处理液，得到亲和层析纯化产物；步骤S4-3，将所述亲和层析纯化产物用离子交换层析处理，得到离子交换层析纯化产物；
步骤S4-4，利用分子筛去除所述离子交换层析纯化产物中的单体，获得二聚体形式的双功能重组蛋白GIK。
10.一种药物制剂，其特征在于，所述药物制剂含有如权利要求1-3中任一项所述的调控糖脂代谢和抗衰老的双功能重组蛋白GIK。
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