CN111499764B - 一种具有促红细胞生成素活性的长效融合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基因工程药物领域，具体涉及一种具有促进红细胞生成素活性的长效融合蛋白，是一种采用基因工程技术制备的重组蛋白质。该融合蛋白由两条链组成，第一链含有具有人类促红细胞生成素活性的突变体NESP或其同源序列、人绒毛膜促性腺激素β亚基羧基末端肽或其同源序列和人IgG1Fc段或其同源序列等三个功能单元，第二链含有人IgG1Fc段或其同源序列。发明采用Knob into hole技术，利于两条链组成异源二聚体。所述融合蛋白具有于EPO活性和更长的半衰期。发明还涉及到所述融合蛋白的制备方法和医药用途。

Description

一种具有促红细胞生成素活性的长效融合蛋白
技术领域
本发明涉及基因工程药物领域，具体涉及一种具有促进红细胞生成素活性的长效融合蛋白，是一种采用基因工程技术制备的重组蛋白质。本发明还公开了上述化合物的制备方法及其医药用途。
背景技术
促红细胞生成素(EPO)又称红细胞刺激因子、促红素，属唾液糖蛋白激素，是最早于1906年被发现的，是一种人体内源性化合物，分子量为34000道尔顿，由165个氨基酸组成。它主要来源于肾脏(少量来源于肝脏)，由皮质管周围的间质细胞合成。天然EPO分子含4个稳定的α螺旋结构，这是维持促红细胞生成素生物活性所必须的空间构象。天然的EPO分子含有二硫键，连接方式为Cys7-Cys161、Cys29-Cys33。天然人EPO分子含有1个O糖链和三个N糖链，O-糖基化位点为Ser126，N-糖基化位点为Asn24、Asn38、Asn83。
EPO是一种集落刺激因子，生理功能主要是与红系祖细胞的表面受体结合，促进骨髓内红系定向干细胞分化为红系母细胞、有核红细胞的血红蛋白合成以及骨髓内网织红细胞和红细胞的释放。
已经有重组人促红细胞生成素(recombinant human erythropoietin，rHuEPO)产品在临床上使用，是第一个被批准的用于治疗疾病的人类造血因子。重组人EPO被用于治疗肾功能不全引起的贫血、获得性免疫缺陷综合征/艾滋病本身或治疗引起的贫血、恶性肿瘤伴发的贫血及风湿病贫血等多种贫血。同时，该产品还被用于对中枢神经系统损伤保护，在脑外伤、脑缺血、神经变性疾病等领域的应用研究也很为广泛。当前上市的主要是rHuEPOα、rHuEPOβ和darbepoetin alpha，共三种重组EPO或类似物。此三种药物都能与促红细胞生成素受体结合，但它们的受体亲和力、糖基化程度和代谢特征不尽相同。自从重组人EPO问世以来，临床上很快就发现了重组天然人EPO太短给患者带来的不便。前两者的人体内半衰期分别为8.5和17小时，需要频繁注射给药，患者依从性不好，临床上的用药实践也不方便。因此，近10多年来，由于天然EPO半衰期相对较短，新型的长效制剂产品的研发一直有着客观的临床需求和技术进步的内在动力。
提到蛋白质的长效化，产业界和科学界进行了多年的探索，并形成一些现实可行的技术。近年来，随着生物技术的发展，许多手段被考虑用来延长药物半衰期。在考虑延长药物分子半衰期的同时，往往需要兼顾保持产品活性，这也是技术创新的难点和重点。当前实现蛋白质长效化的主要方法包括：糖基化改造、融合蛋白技术、聚乙二醇化学修饰等。科学家们采用不同的技术手段分别达到了延长不同药物半衰期的目的。例如，技术人员成功地将聚乙二醇修饰到重组人粒细胞集落刺激因子的N末端，得到了长效粒细胞集落刺激因子，并成功进入市场，商品名为NEULASTA的产品就是这类药物的代表之一；再如，美国礼来公司采用人IgG的Fc段与人GLP-1多肽融合，其产品上市后为糖尿病患者带来了更好的用药选择；又如，把人绒毛膜促性腺激素的C末端多肽(含有糖基化位点)融合表达到人卵泡刺激激素(FSH)的C末端，从而制备了长效的FSH，该长效产品也成功进入市场(默克在欧盟最上市的长效FSH，Elonva即采用半CTP融合技术)，为相应患者提供了药物治疗方面的便利。
具体到EPO蛋白，也已经有科学技术人员进行了有益的探索。darbepoetin alpha是Amgen公司开发的全球第三个EPO类药物(商品名ARANESP，下称NESP)，是第一款长效的人促红细胞生成素。这是通过在天然EPO序列上替换了5个氨基酸而设计的，它比原型分子多了两个的N-糖基化位点，糖基化位点发生在24，30，38，83和88位氨基酸，因而增加了糖和唾液酸含量，极大地增加了蛋白的分子量，唾液酸残基比rhEPO高2倍，使得其在动物模型中的血浆半衰期比重组人促红细胞生成素(rhEPO)长3倍，浓度-时间曲线下面积也显著增大。而NESP的分布容量与原型药物相似。NESP半衰期的延长使其比天然EPO具备了临床使用优势，即给药次数减少。普通的重组人促红细胞生成素用于需透析的慢性肾病治疗时一般采用静注，于1～2分钟注完，每周3次；而相同疾病采用NESP治疗时，给药间隔可以达到一周，对于不需透析治疗的慢性肾病患者，其给药间隔更长。
中国的一家生物制药公司采用了一个方法对NESP进行了改造[中国生物工程杂志，2015，35(4)：80-85]，通过NESP和IgG2的铰链区、CH2和CH3基因的连接，并突变部分位点，从而形成了一种融合蛋白。实验表明，该融合蛋白具有与天然EPO同样的生物活性，体内外实验也表明，与对照EPO相比，该融合蛋白的生物半衰期显著延长，因此它具有长效的能力。该分子设计已经申请了中国发明专利，并获得了授权，专利公开号是CN101870735B。但目前并未有产品上市的报道。同理，也有研究采用Fc来修饰EPO(见专利申请号200880005733.7)。
另外，还有报道采用HSA来修饰EPO(见专利申请号200410053319.7)或者采用CTP短肽来修饰EPO[见文献：Development of a Long-Acting Erythropoietin by Fusingthe Carboxyl-Terminal Peptide of Human Chorionic Gonadotropin Subunit to theCoding Sequence of Human Erythropoietin]。CTP短肽是人绒毛膜促性腺激素β亚基羧基末端肽。人绒毛膜促性腺激素β亚基羧基末端肽能够增加唾液酸含量，增加分子量，延长半衰期而不影响EPO蛋白活性。后者半衰期可以达到与NESP半衰期接近的水平。
进一步地，还有采用聚乙二醇修饰EPO的尝试(专利号200880021159.4)。但PEG化可能改变EPO的结构，导致活性下降明显。文献回顾中还发现有制备EPO二聚体的研究报道。
在采用抗体Fc段进行蛋白修饰的应用中，有一些潜在的技术同样具有应用潜力，如KIH技术。应为本发明会用到该手段，在此也简要介绍。KIH技术的英文名称是Knobs-into-Holes，是由基因泰克开发的促使抗体重链有效异源二聚化(heterodimerization)的方法。该技术更多地被用于制备双特异性抗体，成为研制双特异性抗体的典型技术。这类双特异性抗体有近似天然IgG的结构及稳定性，在表达及下游工艺方面也有了很大提高。
无论如何，所有的修饰设计的关键点在于：修饰产物在增加半衰期的同时，不应该非常明显地降低修饰物的促进红细胞生成的活性。
本发明参考了上述发明的设计经验，创造性地将糖基化改造、CTP修饰和Fc修饰集中在一个分子上，获得了有益效果。
发明内容
在本发明的实施设计过程中，一个基本目标就是所使用的手段在延长半衰期的同时不能导致产品的活性显著下降甚至丧失活性。
EPO分子结构复杂，在引入外来基团的时候需要特别谨慎。很显然，前述采取增加糖基化程度、引入CTP和融合Fc段等手段是成功的设计。但是因为需要EPO治疗的疾病往往需要长期反复用药，延长EPO的半衰期以减少给药次数仍然是产业界的待解的课题。
本发明的一个目的是提供一种具有EPO活性的长半衰期融合蛋白。
本发明的另一个目的是提供制备具有EPO活性的长效蛋白分子的结构框架、结构中的功能单元构成及具体连接顺序。
为了制备半衰期更长的具有EPO活性的分子，本专利的发明者设想，通过上述延长半衰期手段的组合来制备新的具有EPO活性的分子。目标融合蛋白由两条链组成，第一链包含三个从N端到C端顺次连接的功能单元，第一功能单元是具有人类促红细胞生成素活性的突变体NESP(氨基酸序列如SEQ IN NO.12所示)或其同源序列，第二功能单元是人绒毛膜促性腺激素β亚基羧基末端肽(CTP短肽，序列如SEQ IN NO.14所示)或其同源序列，第三功能单元是人IgG1Fc段或其同源序列。第二链是人IgG1Fc段或其同源序列。第一链和第二链所述的人IgG1Fc段或其同源序列包括完整的人IgG1的铰链区、CH2和CH3区。如果以A、B和C分别代表第一功能单元、第二功能单元和第三功能单元，则所设计的融合蛋白分子可以描述为A-B-C2。这样的结构可以更好地保护第一功能单元的活性。
所述融合蛋白第一链中三个功能单元之间可以由连接肽进行连接，连接肽是5-30个甘氨酸和丝氨酸的短肽，如(GGGGS)n，n选自0、1、2、3、4、5、6。优选地，n为0-4；更优选的，n为0。
为了在制造实践中形成更多的目的二聚体，IgG1Fc段或其同源序列的设计采用Knobs-into-holes技术，具体方法是将融合蛋白第一链中人IgG1Fc段的CH3区第366位体积较小的苏氨酸(T)突变为体积较大的酪氨酸(Y)，形成突出的“Knobs”型结构(T366Y)；同时将融合蛋白第二链人IgG1Fc段的CH3区407位较大的酪氨酸(Y)残基突变成较小的苏氨酸(T)，形成凹陷的“holes”型结构(Y407T)。
更优选地，所设计的融合蛋白分子的第一链是由NESP、CTP短肽和人IgG1的Fc段顺次从N端到C端连接组成，其中的IgG1的Fc段含有突变(T366Y，knob)；目标融合蛋白分子的第二链是含有对应突变的人IgG1的Fc段(Y407T，hole)。该优选设计的完整的融合蛋白具体结构框架为NESP-CTP-IgG1Fc：IgG1Fc’，如附图1A所示，这里IgG1Fc含有“T366Y”突变，而IgG1Fc’含有“Y407T”突变；该结构框架下融合蛋白的第一链编码DNA序列和氨基酸序列如1B所示，其中含有27个氨基酸的信号肽及编码序列；第二链编码DNA序列和氨基酸序列如附图1C所示，其中含16个氨基酸的信号肽及编码序列。
本发明采用人类IgG1完整的Fc段，目的是让融合蛋白保持足够的柔性，使得NESP与受体结合时有充分的自由度，不至于造成大的空间位阻。
本发明所设计的融合蛋白第二链的N端并没有融合NESP-CTP，即没有采用融合蛋白第一链NESP-CTP-IgG1Fc的二聚体形式，主要考虑是：假如使用所述二聚体结构，那么当(NESP-CTP-IgG1Fc)2中的一个NESP与受体结合后，该二聚体上的另一个NESP与受体结合的几率将极大地下降。其原因主要有二；其一，当二聚体上的第二个NESP基团与第一个NESP竞争同一受体时，生物效应不会增加；其二，限于当前科学的知识，我们还不清楚靶细胞表面的相邻的NESP受体的之间的距离是否恰好相当于(NESP-CTP-IgG1Fc)2二聚体分子上两个NESP之间的距离，并且恰好能够让二聚体上的两个NESP分别结合靶细胞表面的两个相近或相邻的受体。因此，如果采用(NESP-CTP-IgG1Fc)2二聚体的设计，那么该二聚体分子内的一个活性区域就是多余的。
本发明中，NESP-CTP-IgG1Fc：IgG1Fc’融合蛋白第二链的作用主要是提供第一链中IgG1Fc片段的配对体，以便于形成完整的抗体Fc段，借此来增加目标蛋白分子的分子量和稳定性。
本发明采用的CTP多肽是为了增加4个糖基化位点，进一步增加分子量，以增加药物半衰期。
本发明的另一个目的是提供所述融合蛋白的制备方法，包括表达载体、纯化方法等。
本发明提供了所述优选目标融合蛋白的全部氨基酸序列和DNA编码序列，如SEQID NO.1是编码含27个氨基酸信号肽的NESP-CTP-IgG1Fc：IgG1Fc’融合蛋白第一链的DNA，SEQ ID NO.2是含27个氨基酸信号肽的NESP-CTP-IgG1Fc：IgG1Fc’融合蛋白第一链的氨基酸序列，SEQ ID NO.3是编码NESP-CTP-IgG1Fc：IgG1Fc’融合蛋白第一链成熟肽的DNA序列，SEQ ID NO.4是NESP-CTP-IgG1Fc：IgG1Fc’融合蛋白第一链成熟肽的氨基酸序列，SEQ IDNO.5是编码含16个氨基酸信号肽的NESP-CTP-IgG1Fc：IgG1Fc’融合蛋白第二链的DNA序列，SEQ ID NO.6是含16个氨基酸信号肽的NESP-CTP-IgG1Fc：IgG1Fc’融合蛋白第二链的氨基酸序列，SEQ ID NO.7是编码NESP-CTP-IgG1Fc：IgG1Fc’融合蛋白第二链成熟肽的DNA序列，SEQ ID NO.8是，SEQ ID NO.是NESP-CTP-IgG1Fc：IgG1Fc’融合蛋白第二链成熟肽的氨基酸序列，SEQ ID NO.9是编码27个氨基酸信号肽的DNA序列，SEQ ID NO.10是27个氨基酸信号肽的氨基酸序列，SEQ ID NO.11是编码人EPO突变体NESP的DNA序列，SEQ ID NO.12是人EPO突变体NESP的氨基酸序列，SEQ ID NO.13是编码人绒毛膜促性腺激素β亚基羧基末端28肽的DNA序列，SEQ ID NO.14是人绒毛膜促性腺激素β亚基羧基末端28肽的氨基酸序列，SEQID NO.15是编码含‘T366Y’突变的人IgG1Fc突变体(铰链区-CH2-CH3)的DNA序列，SEQ IDNO.16是含‘T366Y’突变的人IgG1Fc突变体(铰链区-CH2-CH3)的氨基酸序列，SEQ ID NO.17是编码16个氨基酸信号肽的DNA序列，SEQ ID NO.18是16个氨基酸信号肽的氨基酸序列。
在下文的描述中，显示了特定的发明内容，以便全面理解本发明。但是，实施本发明并不限于以下的描述的具体方法和流程。
在本发明的一个实施例中，编码融合蛋白两条链的基因序列(如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.5所示)由南京金斯瑞公司人工合成，并分别连入到pUC57载体上。经过一系列的酶切和连接后，将所合成的分别编码融合蛋白两条链的两条基因先后连接到同一载体pCHO1.0(该载体为商业化载体，序列可方便从科技媒体获得)，质粒命名为pCHO-NESP-Fc，质粒结构如图2所示。分别用AvrII和Bstz17I双酶切、EcoRI和PacI双酶切获得的pCHO-NESP-Fc质粒，电泳得到1380bp和770bp左右的条带(如图3所示)，表明连接正确。
在本发明的另一个实施例中，将重组表达载体pCHO-NESP-Fc用电穿孔转化CHO-S细胞。转化后，首先加入非选择性CD-CHO培养基进行培养24h，然后将培养基换成含有嘌呤霉素和MTX的筛选培养基CDFortiCHO。再过48h后，ELISA双抗夹心法分别检测培养上清中重组蛋白的含量。优选出表达最高的混合克隆群，继续用筛选培养基继续培养，提高嘌呤霉素和MTX浓度，单克隆化。选取表达融合蛋白最高的单克隆放大培养并制备成至原始细胞库。
在本发明的另一个实施例中，将原始细胞放大培养到5升发酵罐中，当细胞长到200万/毫升时，每隔3天加一次feed C补料，体积不超过10％，当细胞活力在50％左右时，停止培养，离心收获细胞培养上清用作后续的纯化。
在本发明的另一个实施例中，采取下列步骤的组合对上述细胞培养的上清进行了纯化：首先采用Mabselect SuRe LX捕获NESP-CTP-IgG1Fc：IgG1Fc’融合蛋白；再用Capto QImpRes离子交换层析进一步去除降解片段；再用CHTI型填料去除多聚物，获得纯度达到95％以上的NESP-CTP-IgG1Fc：IgG1Fc’融合蛋白。
在本发明的又一个实施例中，采用网织红细胞法对发明的融合蛋白的活性进行了测定。测定结果显示目标融合蛋白的比活性约为86666IU/mg。说明本发明所设计的分子结构最大限度地保留了NESP的活性。
附图说明
图1A.本图是本发明目标分子的结构示意图，其显示了本发明的重组NESP-CTP-IgG1Fc：IgG1Fc’融合蛋白的一般结构
图1B.本图是本发明目标分子第一链的序列表，其显示了重组NESP-CTP-IgG1Fc：IgG1Fc’融合蛋白第一链的核苷酸序列和推导的氨基酸序列。DNA总长度为1362bp。推导的融合蛋白总长度为453个氨基酸，其中包含长度为27个氨基酸的信号肽和完整的426个氨基酸的NESP-CTP-IgG1Fc：IgG1Fc’融合蛋白第一链。所述完整的426个氨基酸的NESP-CTP-IgG1Fc：IgG1Fc’融合蛋白第一链由166个氨基酸的NESP、28个氨基酸的CTP和232个氨基酸的人IgG1Fc段组成，后者包括铰链区、CH2和CH3三个结构域。在该第一链成熟肽的第345位氨基酸的T被Y取代。
图1C.本图是本发明目标分子第二链的序列表，其显示了重组NESP-CTP-IgG1Fc：IgG1Fc’融合蛋白第二链的核苷酸序列和推导的氨基酸序列。该DNA总长度为747bp。推导的融合蛋白总长度为248个氨基酸，其中包含长度为16个氨基酸的信号肽和完整的232个氨基酸的NESP-CTP-IgG1Fc：IgG1Fc’融合蛋白第二链。所述完整的232个氨基酸的NESP-CTP-IgG1Fc：IgG1Fc’融合蛋白第二链由包括人IgG的Fc段的铰链区、CH2和CH3三个结构域。在该第二链成熟肽的第169位氨基酸的Y被T取代。
图2.本图显示了本发明的一个实施例中构建的表达质粒。编码发明所述融合蛋白的两条链的基因被分别置于质粒的两个表达框。
图3.本图是表达融合蛋白第一链和第二链的质粒分别经过AvrII和Bstz17I双酶切、EcoRI和PacI双酶切的电泳结果。其中，1-4电泳道为AvrII和Bstz17I双酶切的电泳条带，目测在1360左右的位置有编码融合蛋白第一链的基因条带。第5泳道为DNA分子量标准。第6-9泳道为EcoRI和PacI双酶切的电泳条带，目测在750bp左右的位置有编码融合蛋白第二链的基因条带。
图4.本图是实施例3纯化产物电泳图。采用普通的非还原电泳。第1泳道是分子量标准；第2泳道是最终纯化步骤洗脱峰3，是IgG1Fc’二聚体形成的杂质峰；第3泳道是纯化最终层析步骤洗脱峰的峰2，是NESP-CTP-IgG1Fc：IgG1Fc’融合蛋白纯品(凝胶成像扫描显示纯度为95.3％，分子量约为108kDa)；
具体实施方式
本发明列举了一些实施例进一步描述本发明。实施例是对本发明的举例说明，而不是对本发明的限制。鉴于生物技术手段的发展，采取与下述实施例不同的技术路线也能实现本发明，但不论采取什么途径来实现本发明的目的，都在本发明的专利权保护范围内。
实施例1.编码NESP-CTP-IgG1Fc：IgG1Fc’融合蛋白的载体的构建。
编码第一链和第二链的核酸序列由南京金斯瑞公司人工合成并分别连入PUC57载体上，分别命名为pUC57nesp和PUC57Fc。用AvrII和Bstz17I双酶切PUC57nesp，用EcoRV和PacI双酶切PUC57Fc，同时用EcoRV和PacI双酶切Invitrogen公司pCHO1.0表达载体，胶回收基因片段，DNA纯化回收试剂盒回收酶切后的载体pCHO1.0、及两个基因片段nesp和Fc。
将酶切回收后的载体pCHO1.0与Fc连接，连接正确的质粒命名为pCHO-Fc，再将pCHO-Fc用AvrII和Bstz17I酶切，DNA纯化回收试剂盒直接回收，并与经过同样的双酶切回收的nesp基因连接，获得的质粒分别用AvrII和Bstz17I双酶切、EcoRI和Pacl双酶切电泳得到1380bp和770bp左右的条带(如图3所示)。表明连接正确，质粒命名为pCHO-NESP-Fc(如图2所示)。
实施例2.表达NESP-CTP-IgG1Fc：IgG1Fc’融合蛋白的细胞株的制备和细胞培养。
将重组表达载体pCHO-NESP-Fc转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化菌用含有卡那的LB液体筛选培养基复壮后扩大至100ml大量培养，37℃振荡培养过夜后抽提纯化质粒，纯化后的质粒DNA调整浓度至1μg/μL，用于电穿孔转化CHO-S细胞。
转染前1天，将宿主细胞按0.5×106的接种密度传代至20mL新鲜培养基。电穿孔当天平行收集处对数生长期的细胞，每组细胞个数为1×107个，离心去除培养基后用PBS洗净细胞，离心弃上清，再将细胞重悬混匀于0.8ml PBS并加入电穿孔杯中，加入100μg pCHO-NESP-Fc的质粒并混匀，冰浴10分钟后放入电击槽中，用220V、200μS电击1次，电穿孔杯再次冰浴10分钟，至此电转染过程结束。将转染好的CHO-S细胞分别加入10ml的非选择性CD-CHO培养基中37℃，5％CO2，75％湿度，100rpm/min摇床悬浮振荡培养。
24h后，将培养基换成含有20微克/毫升嘌呤霉素，200nM MTX的筛选培养基CDFortiCHO。再过48h后，ELISA双抗夹心法检测转染克隆库的培养上清中重组蛋白的含量为48mg/L。从转染的细胞中优选出表达最高的混合克隆群，继续用筛选培养基继续培养，当细胞活力恢复到90％左右时，将嘌呤霉素的浓度增加到50微克/毫升，MTX浓度增加到1000nM，细胞密度以50万/毫升接种，当细胞活力恢复到95％左右时，采取有限稀释法进行单克隆化。
选取表达最高的克隆建立原始细胞库。继续培养细胞培养放大，至5升发酵罐中培养，当细胞长到200万/毫升时，每隔3天加一次feed C补料，体积不超过10％，当细胞活力在50％左右时，停止培养，离心收获细胞培养上清用作后续的纯化。
实施例3.融合蛋白的纯化
采用常规离心技术进行固液分离，去除发酵体系中的细胞成分。发酵上清采用下述步骤纯化：
本实施例的一种纯化Fc融合蛋白的纯化方法，具体包括如下步骤：
1)首先用Mabselect SuRe LX捕获融合蛋白，包括：用亲和平衡液(25mM Tris，25mM NaCl，pH7.5)平衡层析柱5个柱体积；上样，上样保留时间为10min；完成上样后，用亲和平衡液再平衡4个柱体积，然后用淋洗液(25mM Tris，0.3M NaCl，pH7.5)冲洗4个柱体积；再用50mM醋酸盐，pH4.6冲洗层析柱3个柱体积，样品用50mM醋酸盐，pH＝3.5洗脱，收集紫外280nm处的主峰，收峰参数为：开始收集为UV＝80mAU，终止收集的UV＝80mAU。
2)用Capto Q ImpRes离子交换层析进一步去除降解片段：用阴离子平衡液(30mMTris-HCl，85mM NaCl，pH7.8)平衡层析柱3个柱体积；上样，上样载量≤30mg/ml，上样时保留时间为8min；上样结束后，用平衡液冲洗层析柱5个柱体积，样品用洗脱液(30mM Tris-HCl，190mM NaCl，pH7.8)洗脱，收集紫外280nm处的主峰，收集紫外280nm处的主峰，收峰参数为：开始收集的UV＝100mAU，终止收集的UV＝100mAU。
3)用CHT I型填料去除大量的聚集体：用30mM Tris，5mM PB，5％PEG1000，pH8.0，cond8.5ms/cm平衡层析柱5个柱体积；样品调节到与平衡液一致的条件上样，收集流穿的目的蛋白，样品上样结束后继续用平衡液平衡，直至样品收集完毕。获得的NESP-CTP-IgG1Fc：IgG1Fc’融合蛋白纯品电泳结果如图4所示。
实施例4.融合蛋白的活性测试
参照《中华人民共和国药典》2015年版中的网织红细胞法。本法系依据人促红素可刺激网织红细胞生成的作用，给小鼠皮下注射EPO后，其网织红细胞数量随EPO注射剂量的增加而升高。
试剂1)抗凝液：称取乙二胺四乙酸二钾100mg，加生理氯化钠溶液10ml溶解，混匀，使用时新鲜配制。2)稀释液：称取0.1g牛血清白蛋白，加生理氯化钠溶液溶解并稀释至100ml，即得。3)标准品溶液：按说明书，将EPO标准品复溶，用稀释液将EPO标准品稀释成高、中、低3个剂量EPO标准品溶液。4)供试品溶液：初始溶液浓度为0.84mg/ml，用稀释液将供试品稀释成高、中、低3个剂量与EPO标准品溶液单位相近的供试品溶液。
测定法：按低、中、高(如10IU/鼠、20IU/鼠、40IU/鼠)3个剂量组，分别给近交系6～8周龄雌性BALB/C小鼠皮下注射EPO标准品及供试品溶液，每组4只，每鼠注射量小于0.5ml。在注射后的第4天从小鼠眼眶采血4滴，置于预先加入乙二胺四乙酸二钾抗凝剂的采血管中。取抗凝血，用全自动网织红细胞分析仪计数每只小鼠血液中的网织红细胞数对红细胞总数的比值(Ret％)。按注射剂量(IU)对Ret％的量反应平行线测定法(通则1431)计算供试品体内生物学活性。
初步研究结果表明，重组NESP-CTP-IgG1Fc：IgG1Fc’融合蛋白溶液的比活性为72800iu/ml，相当于86666iu/mg。
实施例5.融合蛋白的半衰期测定
成年雄性SD大鼠3只，体重180-200g，以20μg/kg的剂量单次皮下注射给予NESP-CTP-IgG1Fc：IgG1Fc’融合蛋白，分别于给药后0、3、6、10、24、30、48、54、72、96、120、144、168h自眼眶静脉丛采血，分离血浆，用ELISA法检测血浆药物浓度，采用DAS Version软件进行数据处理并计算血清循环半衰期。初步结果表明，NESP-CTP-IgG1Fc：IgG1Fc’融合蛋白的血清循环半衰期可达到45h以上，较EPO延长4～6倍以上。延长的半衰期对于增强NESP的活性具有实质性的意义。
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Claims (2)

1.一种具有人促红细胞生成素活性的重组融合蛋白，其由第一链和第二链组成，特征是：
(1)所述第一链包含三个功能单元，从N端到C端依次是：具有人类促红细胞生成素活性的突变体NESP或其同源序列是其第一个功能单元，人绒毛膜促性腺激素β亚基羧基末端肽或其同源序列是第二个功能单元，人IgG1Fc段或其同源序列是第三个功能单元；
(2)所述第二链是人IgG1Fc段或其同源序列；
其第一链和第二链中的人IgG1Fc段或其同源序列含有完整的铰链区、CH2区和CH3区；
其第一链中的人IgG1Fc段含有‘T366Y’突变而形成knob，第二链的IgG1Fc段含有‘Y407T’突变而形成hole；
其第一链的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示，其第二链的氨基酸序列如SEQIDNO.8所示。
2.如权利要求1所述的重组融合蛋白在制备用于促进红细胞生成的药物中的应用。
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