CN113038964A - 超长效胰岛素-fc融合蛋白及使用方法 - Google Patents

超长效胰岛素-fc融合蛋白及使用方法 Download PDF

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Abstract

本公开提供了用于治疗犬科动物和猫科动物糖尿病的重组制造的超长效胰岛素‑Fc融合蛋白。所述胰岛素‑Fc融合蛋白包含通过肽接头与犬科动物或猫科动物来源的Fc片段连接的胰岛素多肽。基于所获得的结果，创建一种治疗，所述治疗适合于低成本制造，表现出足够的体内生物活性，显示出延长的生物活性持续时间，不诱导抗药物抗体，并且在多次施用期间基本上保持效力，除了在这些组分中的一种或多种上的选择性突变之外，还需要胰岛素多肽、肽接头和物种特异性Fc片段的非明显组合。除了使用和制备方法，还提供了示例性的超长效胰岛素‑Fc融合蛋白、编码这些胰岛素‑Fc融合蛋白的多核苷酸以及示例性的胰岛素‑Fc融合蛋白的药物制剂。

Description

超长效胰岛素-FC融合蛋白及使用方法
优先权和相关申请
本申请涉及并要求2019年4月22日提交的美国临时专利申请序列第62/837,188号、2019年4月1日提交的美国临时专利申请序列第62/827,809号、2019年3月26日提交的美国临时专利申请序列第62/824,176号、2018年12月18日提交的美国临时专利申请序列第62/781,378号、2018年12月18日提交的美国临时专利申请序列第62/781,368号、2018年12月3日提交的美国临时专利申请序列第62/774,682号、2018年10月9日提交的美国临时专利申请序列第62/743,358号、2018年10月3日提交的美国临时专利申请序列第62/740,735号、2018年8月17日提交的美国临时专利申请序列第62/719,347号、2018年7月23日提交的美国临时专利申请序列第62/702,167号、2018年7月16日提交的美国临时专利申请序列第62/698,648号、2018年7月11日提交的美国临时专利申请序列第62/696,645号、2018年7月3日提交的美国临时专利申请序列第62/693,814号、2018年6月29日提交的美国临时专利申请序列第62/692,507号以及2018年6月29日提交的美国专利申请序列第62/692,498号的优先权权益。每个前述专利申请的内容据此通过引用以其整体并入本文。
技术领域
本技术涉及胰岛素-Fc融合蛋白的组合物及其治疗伴侣动物例如狗或猫中的糖尿病的用途。
背景技术
以下对本技术背景的描述仅仅是为了帮助理解本技术而提供的，并且不被认为是描述或构成本技术的现有技术。
糖尿病是一种以胰岛素缺乏和/或胰岛素的无效使用为特征的慢性病症。患有胰岛素的绝对缺乏的糖尿病患者被归类为患有1型或胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)。1型糖尿病被认为具有遗传倾向，同时伴有胰腺的胰岛素生成β细胞的免疫破坏。相比之下，仍可以产生一些胰岛素但由于胰岛素抵抗或其他功能障碍而相对缺乏的糖尿病患者被归类为患有2型或非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)。2型糖尿病与遗传倾向、肥胖和某些药物有关。
当狗或猫不产生胰岛素或不能正常使用胰岛素时，血糖水平升高，导致高血糖症。狗通常表现出与人类1型糖尿病非常相似的非典型血糖表型。狗偶尔也表现出与人类2型糖尿病非常相似的非典型血糖。雌狗在发情或怀孕时也可以产生暂时的胰岛素抵抗。在所有情况下，狗都用慢性胰岛素注射疗法治疗。猫通常表现出与人类2型糖尿病(即胰岛素抵抗)非常相似的非典型血糖表型，但是到兽医诊断出该疾病时，该疾病已发展为类似于1型糖尿病病症(胰腺中的炎性疾病，β细胞量显著损失)，并且猫依赖于外源性胰岛素。一些糖尿病猫可以通过饮食改变和口服药物来控制，但是大多数糖尿病猫接受慢性胰岛素注射疗法以保持足够的调节。如果不治疗，狗和猫中的糖尿病可以导致体重减轻、食欲不振、呕吐、脱水、运动功能问题、昏迷，并且甚至死亡。
在美国，约0.24％的狗和约0.68％的猫患有糖尿病。目前对狗和猫的糖尿病疗法包括使用胰岛素，诸如对狗使用
Figure BDA0002955236580000021
(Intervet Inc.,d.b.a.MERCK Animal Health,Summit,NJ)，而对猫使用
Figure BDA0002955236580000022
(Boehringer Ingelheim Vetmedica,Duluth,Georgia)，每天施用一次或两次。频繁注射给主人带来的负担通常导致治疗方案依从性的缺乏和剂量不足，从而导致不良的长期健康结果。事实上，胰岛素疗法的成本和每周给宠物高达14次给药的实用性导致很大比例的主人选择为他们的宠物实施安乐死，作为强化管理糖尿病的替代方案。因此，需要针对这种疾病的成本有效且负担较少的治疗选项。
发明内容
在一个方面中，本公开提供了一种包含胰岛素多肽和Fc片段的融合蛋白，其中胰岛素多肽和Fc片段通过接头诸如肽接头连接，其中Fc片段为非人类动物来源，并且包含以下序列：
DCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFNGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG(SEQ ID NO:16)。在一些实施例中，融合蛋白的胰岛素多肽包含序列FVNQHLCGSX1LVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCX2STCSLDQLENYCX3(SEQ ID NO:6)，其中X1不是D，X2不是H，并且X3不存在或者是N。在一些实施例中，融合蛋白的胰岛素多肽包含序列FVNQHLCGSX1LVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCX2STCSLDQLENYCX3(SEQ ID NO:6)，其中X1是H，X2是T，并且X3不存在或者是N。在实施例中，融合蛋白的胰岛素多肽和Fc片段通过接头诸如肽接头连接，所述接头包含序列GGGGQGGGGQGGGGQGGGGG(SEQ ID NO:14)。
在实施例中，融合蛋白包含序列FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLDQLENYCGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFNGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG(SEQ ID NO:32)。在实施例中，融合蛋白包含序列FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLDQLENYCNGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFNGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG(SEQ ID NO:34)。
在一个方面中，本公开提供了一种包含胰岛素多肽和Fc片段的融合蛋白，其中胰岛素多肽和Fc片段通过接头诸如肽接头连接，其中Fc片段包含序列DCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFSGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG(SEQ ID NO:22)。在一些实施例中，融合蛋白的胰岛素多肽包含序列FVNQHLCGSX1LVEALALVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCX2STCSLDQLENYC(SEQ ID NO:10)，其中X1不是D，并且X2不是H。在一些实施例中，融合蛋白的胰岛素多肽包含序列FVNQHLCGSX1LVEALALVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCX2STCSLDQLENYC(SEQ ID NO:10)，其中X1是H，并且X2是T。在实施例中，胰岛素多肽和Fc片段通过接头诸如肽接头连接，所述接头包含序列GGGGGQGGGGQGGGGQGGGGG(SEQ ID NO:14)。
在实施例中，融合蛋白包含序列FVNQHLCGSHLVEALALVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLDQLENYCGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFSGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG(SEQ ID NO:36)。
在一个方面中，本公开提供了一种包含胰岛素多肽和Fc片段的融合蛋白，其中胰岛素多肽和Fc片段通过接头诸如肽接头连接，其中Fc片段为非人类动物来源，并且包含序列DCPKCPPPEMLGGPSIFIFPPKPKDTLSISRTPEVTCLVVDLGPDDSDVQITWFVDNTQVYTAKTSPREEQFNSTYRVVSVLPILHQDWLKGKEFKCKVNSKSLPSPIERTISKDKGQPHEPQVYVLPPAQEELSRNKVSVTCLIEGFYPSDIAVEWEITGQPEPENNYRTTPPQLDSDGTYFLYSRLSVDRSRWQRGNTYTCSVSHEALHSHHTQKSLTQSPG(SEQ ID NO:20)。在实施例中，融合蛋白的胰岛素多肽包含序列FVNQHLCGSX1LVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCX2STCSLDQLENYCX3(SEQ ID NO:6)，其中X1不是D，X2不是H，并且X3不存在。在实施例中，融合蛋白的胰岛素多肽包含序列FVNQHLCGSX1LVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCX2STCSLDQLENYCX3(SEQ ID NO:6)，其中X1是H，X2是T，并且X3不存在。在实施例中，胰岛素多肽和Fc片段通过接头诸如肽接头连接，所述接头包含以下序列GGGGGQGGGGQGGGGQGGGGG(SEQ ID NO:14)。
在实施例中，融合蛋白包含序列FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLDQLENYCGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGDCPKCPPPEMLGGPSIFIFPPKPKDTLSISRTPEVTCLVVDLGPDDSDVQITWFVDNTQVYTAKTSPREEQFNSTYRVVSVLPILHQDWLKGKEFKCKVNSKSLPSPIERTISKDKGQPHEPQVYVLPPAQEELSRNKVSVTCLIEGFYPSDIAVEWEITGQPEPENNYRTTPPQLDSDGTYFLYSRLSVDRSRWQRGNTYTCSVSHEALHSHHTQKSLTQSPG(SEQ ID NO:38)。
在一个方面中，本公开提供了一种包含胰岛素多肽和Fc片段的融合蛋白，其中胰岛素多肽和Fc片段通过接头诸如肽接头连接，其中Fc片段包含序列DCPKCPPPEMLGGPSIFIFPPKPKDTLSISRTPEVTCLVVDLGPDDSDVQITWFVDNTQVYTAKTSPREEQFSSTYRVVSVLPILHQDWLKGKEFKCKVNSKSLPSPIERTISKDKGQPHEPQVYVLPPAQEELSRNKVSVTCLIEGFYPSDIAVEWEITGQPEPENNYRTTPPQLDSDGTYFLYSRLSVDRSRWQRGNTYTCSVSHEALHSHHTQKSLTQSPG(SEQ ID NO:23)。在实施例中，融合蛋白的胰岛素多肽包含序列FVNQHLCGSX1LVEALALVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCX2STCSLDQLENYC(SEQ ID NO:10)，其中X1不是D，并且X2不是H。在实施例中，胰岛素多肽包含以下序列FVNQHLCGSX1LVEALALVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCX2STCSLDQLENYC(SEQ IDNO:10)，其中X1是H，并且X2是T。在实施例中，胰岛素多肽和Fc片段通过接头诸如肽接头连接，所述接头包含序列GGGGGQGGGGQGGGGQGGGGG(SEQ ID NO:14)。
在实施例中，所述融合蛋白包含序列FVNQHLCGSHLVEALALVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLDQLENYCGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGDCPKCPPPEMLGGPSIFIFPPKPKDTLSISRTPEVTCLVVDLGPDDSDVQITWFVDNTQVYTAKTSPREEQFSSTYRVVSVLPILHQDWLKGKEFKCKVNSKSLPSPIERTISKDKGQPHEPQVYVLPPAQEELSRNKVSVTCLIEGFYPSDIAVEWEITGQPEPENNYRTTPPQLDSDGTYFLYSRLSVDRSRWQRGNTYTCSVSHEALHSHHTQKSLTQSPG(SEQ ID NO:40)。
在一些方面中，本文所述的融合蛋白包含同型二聚体(homodimer)。在实施例中，融合蛋白的同型二聚体百分比大于90％。在实施例中，本文所述的融合蛋白使用HEK293细胞来制备，并且在使用蛋白A珠或蛋白A柱纯化后得到的同型二聚体滴度大于50mg/L。在实施例中，本文所述的融合蛋白的胰岛素受体IC50小于或等于5000nM。在实施例中，在施用时，本文所述的融合蛋白在目标动物的血液或血清中的血清半衰期长于约3天。在实施例中，对于本文所述的融合蛋白，其中在受试者中血糖水平相对于给药前水平具有统计学显著降低的时间长于2小时、6小时、9小时、12小时、18小时、1天、1.5天、2天、2.5天、3天、4天、5天、6天、7天或更长时间中的一个。
在一些方面，对于本文所述的融合蛋白，在目标动物中第一次皮下注射后的NAOC大于150％FBGL·天·kg/mg。在实施例中，对于本文所述的融合蛋白，在目标动物中第三周皮下注射融合蛋白后的NAOC与在目标动物中第一次皮下注射融合蛋白后的NAOC的比率大于0.50。
在一些方面，如本文所述的融合蛋白被配制成药物组合物。在实施例中，在药物组合物中，融合蛋白以约3mg/mL或更高的浓度存在。在实施例中，该组合物适合于皮下施用。
在一个方面中，描述了一种用于降低目标动物的血糖水平的方法，该方法包含向患者施用生理有效量的如本文所述的融合蛋白或其药物组合物。在实施例中，目标动物被诊断患有糖尿病。在实施例中，目标动物是狗或猫。在一些实施例中，融合蛋白被皮下施用。在一些实施例中，每天、每周两次或每周一次向目标动物施用融合蛋白。在实施例中，融合蛋白以0.025至0.5mg/kg/周的剂量每周一次施用于目标动物。在一些方面，描述了一种经工程改造以表达如本文所述的融合蛋白的细胞。在实施例中，用编码融合蛋白的核酸转染细胞。在实施例中，细胞是HEK293细胞或CHO细胞。
在一个方面中，描述了编码如本文所述的融合蛋白的cDNA。在实施例中，cDNA包含核酸序列
atggaatggagctgggtctttctcttcttcctgtcagtaacgactggtgtccactccttcgtgaaccagcacctgtgcggctcccacctggtggaagctctggaactcgtgtgcggcgagcggggcttccactacgggggtggcggaggaggttctggtggcggcggaggcatcgtggaacagtgctgcacctccacctgctccctggaccagctggaaaactactgcggtggcggaggtggtcaaggaggcggtggacagggtggaggtgggcagggaggaggcgggggagactgccccaagtgccccgctcccgagatgctgggcggacccagcgtgttcatcttccctcccaagcccaaggacacactgctgatcgccaggaccccggaggtgacctgcgtggtggtggacctggatcccgaagaccccgaggtgcagatcagctggttcgtggatggaaagcagatgcagaccgccaagacccaaccccgggaagagcagttcaacggcacctacagggtggtgagtgtgttgcccatcggccaccaggactggctgaaggggaagcaattcacatgcaaggttaataacaaggccctgcccagccccatcgagaggaccatcagcaaggccaggggccaggcccaccagccatctgtgtacgtgctgcccccatctagggaggaactgagcaagaacacagtcagccttacttgcctgatcaaggacttcttcccaccggacatagacgtggagtggcagagtaacggccagcaggagcccgagagcaagtataggaccacaccgccccaactggacgaggacggaagctacttcctctacagcaaattgagcgttgacaaaagcaggtggcagcgaggcgacaccttcatctgcgccgtgatgcacgaggctttgcataaccactacacccaggagagcctgtcccacagccccggatag(SEQ ID NO:31)。
在实施例中，cDNA包含核酸序列atggaatggagctgggtctttctcttcttcctgtcagtaacgactggtgtccactccttcgtgaaccagcacctgtgcggctcccacctggtggaagctctggaactcgtgtgcggcgagcggggcttccactacgggggtggcggaggaggttctggtggcggcggaggcatcgtggaacagtgctgcacctccacctgctccctggaccagctggaaaactactgcaacggtggcggaggtggtcaaggaggcggtggacagggtggaggtgggcagggaggaggcgggggagactgccccaagtgccccgctcccgagatgctgggcggacccagcgtgttcatcttccctcccaagcccaaggacacactgctgatcgccaggaccccggaggtgacctgcgtggtggtggacctggatcccgaagaccccgaggtgcagatcagctggttcgtggatggaaagcagatgcagaccgccaagacccaaccccgggaagagcagttcaacggcacctacagggtggtgagtgtgttgcccatcggccaccaggactggctgaaggggaagcaattcacatgcaaggttaataacaaggccctgcccagccccatcgagaggaccatcagcaaggccaggggccaggcccaccagccatctgtgtacgtgctgcccccatctagggaggaactgagcaagaacacagtcagccttacttgcctgatcaaggacttcttcccaccggacatagacgtggagtggcagagtaacggccagcaggagcccgagagcaagtataggaccacaccgccccaactggacgaggacggaagctacttcctctacagcaaattgagcgttgacaaaagcaggtggcagcgaggcgacaccttcatctgcgccgtgatgcacgaggctttgcataaccactacacccaggagagcctgtcccacagccccggatag(SEQ ID NO:33)。
在实施例中，cDNA包含核酸序列atggaatggagctgggtctttctcttcttcctgtcagtaacgactggtgtccactccttcgtgaaccagcacctgtgcggctcccacctggtggaagctctggcactcgtgtgcggcgagcggggcttccactacgggggtggcggaggaggttctggtggcggcggaggcatcgtggaacagtgctgcacctccacctgctccctggaccagctggaaaactactgcggtggcggaggtggtcaaggaggcggtggacagggtggaggtgggcagggaggaggcgggggagactgccccaagtgccccgctcccgagatgctgggcggacccagcgtgttcatcttccctcccaagcccaaggacacactgctgatcgccaggaccccggaggtgacctgcgtggtggtggacctggatcccgaagaccccgaggtgcagatcagctggttcgtggatggaaagcagatgcagaccgccaagacccaaccccgggaagagcagttctcaggcacctacagggtggtgagtgtgttgcccatcggccaccaggactggctgaaggggaagcaattcacatgcaaggttaataacaaggccctgcccagccccatcgagaggaccatcagcaaggccaggggccaggcccaccagccatctgtgtacgtgctgcccccatctagggaggaactgagcaagaacacagtcagccttacttgcctgatcaaggacttcttcccaccggacatagacgtggagtggcagagtaacggccagcaggagcccgagagcaagtataggaccacaccgccccaactggacgaggacggaagctacttcctctacagcaaattgagcgttgacaaaagcaggtggcagcgaggcgacaccttcatctgcgccgtgatgcacgaggctttgcataaccactacacccaggagagcctgtcccacagccccggatag(SEQ ID NO:35)。
在实施例中，cDNA包含核酸序列atggaatggagctgggtctttctcttcttcctgtcagtaacgactggtgtccactccttcgtgaaccagcacctgtgcggctcccacctggtggaagctctggaactcgtgtgcggcgagcggggcttccactacgggggtggcggaggaggttctggtggcggcggaggcatcgtggaacagtgctgcacctccacctgctccctggaccagctggaaaactactgcggtggcggaggtggtcaaggaggcggtggacagggtggaggtgggcagggaggaggcgggggagactgccccaaatgtcctccgcctgagatgctgggtggccctagcatcttcatcttcccgcccaagcccaaggatactctgtccattagcaggacccccgaggtgacctgcctggtggtggacctggggccagacgactctgacgtgcagatcacctggttcgtagacaacacccaggtttacactgccaagaccagtcccagggaggagcagttcaacagcacatacagggtggtgagcgttctgcccatcctgcaccaggactggctgaaaggcaaagagttcaagtgtaaggtgaacagcaagagcctgcccagccccattgaaaggaccatcagcaaggacaagggccagccgcacgagccccaagtctacgtgctgcccccagcacaggaagagctgagcaggaacaaggttagcgtgacatgcctgatcgagggtttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggaaatcaccggccaacccgagcccgagaacaactacaggaccactccgccgcaactggacagcgacgggacctacttcttgtatagcaggctgagcgtggaccggagcaggtggcagaggggcaacacctacacttgcagcgtgagccacgaggccttgcacagccaccacactcagaagagtctgacccagagcccgggatag(SEQ ID NO:37)。
在实施例中，cDNA包含核酸序列atggaatggagctgggtctttctcttcttcctgtcagtaacgactggtgtccactccttcgtgaaccagcacctgtgcggctcccacctggtggaagctctggcactcgtgtgcggcgagcggggcttccactacgggggtggcggaggaggttctggtggcggcggaggcatcgtggaacagtgctgcacctccacctgctccctggaccagctggaaaactactgcggtggcggaggtggtcaaggaggcggtggacagggtggaggtgggcagggaggaggcgggggagactgccccaaatgtcctccgcctgagatgctgggtggccctagcatcttcatcttcccgcccaagcccaaggatactctgtccattagcaggacccccgaggtgacctgcctggtggtggacctggggccagacgactctgacgtgcagatcacctggttcgtagacaacacccaggtttacactgccaagaccagtcccagggaggagcagttcagcagcacatacagggtggtgagcgttctgcccatcctgcaccaggactggctgaaaggcaaagagttcaagtgtaaggtgaacagcaagagcctgcccagccccattgaaaggaccatcagcaaggacaagggccagccgcacgagccccaagtctacgtgctgcccccagcacaggaagagctgagcaggaacaaggttagcgtgacatgcctgatcgagggtttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggaaatcaccggccaacccgagcccgagaacaactacaggaccactccgccgcaactggacagcgacgggacctacttcttgtatagcaggctgagcgtggaccggagcaggtggcagaggggcaacacctacacttgcagcgtgagccacgaggccttgcacagccaccacactcagaagagtctgacccagagcccgggatag(SEQ ID NO:39)。
附图说明
图1示出了示例性的胰岛素-Fc融合蛋白同型二聚体的示意图。
图2示出了对于N＝3只狗从第0天到第3天的平均空腹血糖水平％，这些狗在第0天以0.2mg/kg静脉给药SEQ ID NO:42的同型二聚体。
图3示出了SEQ ID NO:42、44、46、48和50的并排序列比较。“*”表示在给定序列位置的所有序列上的完全同源性，而“:”、“.”或空格分别指在给定序列位置的序列上的保守氨基酸突变、中度氨基酸突变或非常不同的氨基酸突变。
图4示出了SEQ ID NO:42、52、54和56的并排序列比较。“*”表示在给定序列位置的所有序列上的完全同源性，而“:”、“.”或空格分别指在给定序列位置的序列上的保守氨基酸突变、中度氨基酸突变或非常不同的氨基酸突变。
图5示出了对于N＝3只狗从第0天到第7天的平均空腹血糖水平％，这些狗在第0天以0.2mg/kg静脉给药SEQ ID NO:52的同型二聚体。
图6示出了对于N＝6只狗从第0天到第7天的平均空腹血糖水平％，这些狗在第0天以0.33mg/kg皮下给药SEQ ID NO:52的同型二聚体。
图7示出了对于N＝3只狗的平均抗药物抗体滴度(μg/mL)，所述狗在第0天(0.30mg/kg)、第28天(0.33mg/kg)、第35天(0.33mg/kg)、第42天(0.50mg/kg)、第49天(1.00mg/kg)和第56天(1.00mg/kg)皮下给药SEQ ID NO:52的同型二聚体。
图8示出了SEQ ID NO:58、60、62和64的并排序列比较。“*”表示在给定序列位置的所有序列上的完全同源性，而“:”、“.”或空格分别指在给定序列位置的序列上的保守氨基酸突变、中度氨基酸突变或非常不同的氨基酸突变。
图9示出了对于N＝1只狗的平均抗药物抗体滴度(μg/mL)，所述狗在第0天(0.33mg/kg)、第7天(0.50mg/kg)、第14天(0.50mg/kg)和第21天(0.50mg/kg)皮下给药SEQID NO:64的同型二聚体。
图10示出了对于N＝1只狗的平均抗药物抗体滴度(μg/mL)，所述狗在第0天(0.33mg/kg)和第14天(0.16mg/kg)皮下给药SEQ ID NO:66的同型二聚体。
图11示出了对于N＝2只狗从第0天到第7天的平均空腹血糖水平％，这些狗在第0天以0.33mg/kg皮下给药SEQ ID NO:66的同型二聚体。
图12示出了SEQ ID NO:66、68、70、72、74和76的并排序列比较。“*”表示在给定序列位置的所有序列上的完全同源性，而“:”、“.”或空格分别指在给定序列位置的序列上的保守氨基酸突变、中度氨基酸突变或非常不同的氨基酸突变。
图13示出了SEQ ID NO:66、78、80、82和84的并排序列比较。“*”表示在给定序列位置的所有序列上的完全同源性，而“:”、“.”或空格分别指在给定序列位置的序列上的保守氨基酸突变、中度氨基酸突变或非常不同的氨基酸突变。
图14示出了SEQ ID NO:66、76和86的并排序列比较。“*”表示在给定序列位置的所有序列上的完全同源性，而“:”、“.”或空格分别指在给定序列位置的序列上的保守氨基酸突变、中度氨基酸突变或非常不同的氨基酸突变。
图15示出了SEQ ID NO:66、82、84和88的并排序列比较。“*”表示在给定序列位置的所有序列上的完全同源性，而“:”、“.”或空格分别指在给定序列位置的序列上的保守氨基酸突变、中度氨基酸突变或非常不同的氨基酸突变。
图16示出了SEQ ID NO:32、34、66、90、92和94的并排序列比较。“*”表示在给定序列位置的所有序列上的完全同源性，而“:”、“.”或空格分别指在给定序列位置的序列上的保守氨基酸突变、中度氨基酸突变或非常不同的氨基酸突变。
图17示出了对于N＝1只狗从第0天到第7天的空腹血糖水平％，所述狗在第0天以0.16mg/kg皮下给药SEQ ID NO:34的同型二聚体。
图18示出了对于N＝1只狗的抗药物抗体滴度(μg/mL)，所述狗在第0天(0.16mg/kg)、第14天(0.16mg/kg)、第28天(0.16mg/kg)和第42天(0.16mg/kg)皮下给药SEQ ID NO:34的同型二聚体。
图19示出了对于N＝1只狗从第0天到第7天的空腹血糖水平％，所述狗在第0天以0.33mg/kg皮下给药SEQ ID NO:32的同型二聚体。
图20示出了对于N＝1只狗从第0天至第60天的空腹血糖水平％，所述狗在第0天(0.33mg/kg)、第15天(0.16mg/kg)、第31天(0.16mg/kg)和第45天(0.15mg/kg)皮下给药SEQID NO:32的同型二聚体。
图21示出了对于N＝1只狗的抗药物抗体滴度(μg/mL)，所述狗在第0天(0.33mg/kg)、第15天(0.16mg/kg)、第31天(0.16mg/kg)和第45天(0.15mg/kg)皮下给药SEQ ID NO:32的同型二聚体。
图22示出了对于N＝1只狗从第0天到第7天的空腹血糖水平％，所述狗在第0天以0.16mg/kg皮下给药SEQ ID NO:96的同型二聚体。
图23示出了对于N＝1只狗从第0天到第7天的空腹血糖水平％，所述狗在第0天以0.16mg/kg皮下给药SEQ ID NO:98的同型二聚体。
图24示出了SEQ ID NO:102和104的并排序列比较。“*”表示在给定序列位置的所有序列上的完全同源性，而“:”、“.”或空格分别指在给定序列位置的序列上的保守氨基酸突变、中度氨基酸突变或非常不同的氨基酸突变。
图25示出了对于N＝1只狗从第0天至第7天的空腹血糖水平％(所述狗在第0天以0.16mg/kg皮下施用SEQ ID NO:102的同型二聚体)以及对于N＝1只狗从第0天至第7天的空腹血糖水平％(所述狗在第0天以0.16mg/kg皮下施用SEQ ID NO:104的同型二聚体)。
图26示出对于N＝1只狗从第0天至第7天的空腹血糖水平％，所述狗除了给予狗食物的时间之外，皮下给药SEQ ID NO:36的同型二聚体。
图27示出了对于N＝3只猫从第0天到第7天的平均空腹血糖水平％，这些猫在第0天以0.8mg/kg皮下给药SEQ ID NO:106的同型二聚体。
图28示出了SEQ ID No:106、108、110和112的并排序列比较。“*”表示在给定序列位置的所有序列上的完全同源性，而“:”、“.”或空格分别指在给定序列位置的序列上的保守氨基酸突变、中度氨基酸突变或非常不同的氨基酸突变。
图29示出了对于N＝3只猫的平均抗药物抗体滴度(μg/mL)，这些猫在第0天(0.8mg/kg)、第28天(0.6mg/kg)、第35天(0.6mg/kg)、第42天(0.6mg/kg)和第48天(0.8mg/kg)皮下给药SEQ ID NO:106的同型二聚体。
图30示出了SEQ ID NO:108、114、116和118的并排序列比较。“*”表示在给定序列位置的所有序列上的完全同源性，而“:”、“.”或空格分别指在给定序列位置的序列上的保守氨基酸突变、中度氨基酸突变或非常不同的氨基酸突变。
图31示出了SEQ ID NO:106、112和122的并排序列比较。“*”表示在给定序列位置的所有序列上的完全同源性，而“:”、“.”或空格分别指在给定序列位置的序列上的保守氨基酸突变、中度氨基酸突变或非常不同的氨基酸突变。
图32示出了对于N＝1只猫从第0天到第7天的空腹血糖水平％，所述猫在第0天(0.16mg/kg)皮下给药SEQ ID NO:122的同型二聚体。
图33示出了对于N＝1只猫从第0天到第7天的空腹血糖水平％，所述猫除了给予猫食物的时间外，在第0天(0.16mg/kg)皮下给药SEQ ID NO:38的同型二聚体。
图34示出了对于N＝1只猫的抗药物抗体滴度(μg/mL)，所述猫在第0天(0.16mg/kg)、第14天(0.16mg/kg)、第28天(0.11mg/kg)和第42天(0.09mg/kg)皮下给药SEQ ID NO:38的同型二聚体。
图35示出了对于N＝1只猫从第0天到第7天的空腹血糖水平％，所述猫在第0天(0.16mg/kg)皮下给药SEQ ID NO:124的同型二聚体的。
图36示出了对于N＝3只猫从第0天到第7天的平均空腹血糖水平％，这些猫在第0天(0.10mg/kg)皮下给药SEQ ID NO:40的同型二聚体。
图37示出了对于N＝3只猫从第7天到第14天的平均空腹血糖水平％，这些猫在第7天(0.20mg/kg)皮下给药SEQ ID NO:40的同型二聚体。
图38示出了融合蛋白(SEQ IDNO:32)的“全aa序列”及其相应的核酸序列(SEQIDNO:31)。
图39示出了融合蛋白(SEQ IDNO:34)的“全aa序列”及其相应的核酸序列(SEQIDNO:33)。
图40示出了融合蛋白(SEQ IDNO:36)的“全aa序列”及其相应的核酸序列(SEQIDNO:35)。
图41示出了融合蛋白(SEQ IDNO:38)的“全aa序列”及其相应的核酸序列(SEQIDNO:37)。
图42示出了融合蛋白(SEQ ID NO:40)的“全aa序列”及其相应的核酸序列(SEQ IDNO:39)。
具体实施方式
需要较少频率给药(例如，每周注射一次)的胰岛素治疗对主人的负担会更轻，从而导致更好的依从性、更少的安乐死情况以及对宠物更好的结果。对于给定的物种(例如，狗或猫)，适合于糖尿病的超长效治疗的分子应该可在哺乳动物细胞(例如人胚胎肾(HEK，例如HEK293)细胞)中制造，具有可接受滴度的所需同型二聚体产物(例如，来自瞬时转染的HEK细胞的大于50mg/L同型二聚体滴度，来自瞬时转染的HEK细胞的大于75mg/L，来自瞬时转染的HEK细胞的大于100mg/L等)。仅具有大于50mg/L的同型二聚体滴度的候选物被认为可用于本发明，因为经验已经证明，低于该水平的同型二聚体滴度不太可能导致在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中商业生产符合兽医产品严格的低制造成本要求的同型二聚体滴度。此外，分子必须以可观的亲和力(例如，IC50小于5000nM、IC50小于4000nM、IC50小于3000nM、IC50小于2500nM等)结合胰岛素受体，如在4℃IM-9胰岛素受体结合测定中所测量的。根据经验，仅表现出小于5000nM的胰岛素受体活性IC50值的分子被视为可能在目标物种中表现出必要的生物活性。该分子还必须在体内表现出持续的生物活性(例如，表现出大于约2小时、6小时、9小时、12小时、18小时、1天、1.5天、2天、2.5天、3天、4天、5天、6天、7天或更长时间的降糖活性)，以证明较不频繁的给药是合理的。该分子还必须表现出在目标动物中的延长的系统停留时间(例如，血清半衰期必须大于3天，或更长)。如实例11所述，生物活性潜能和生物活性的持续时间可以通过计算被标准化为以mg/kg(NAOC)的给定剂量的空腹血糖百分比(％FBGL)曲线上的面积来定量表示，其中单位为％FBGL·天·kg/mg。NAOC随着％FBGL的较大下降而增加，这是其中分子表现出增加的生物活性的情况，并且当％FBGL需要更长时间恢复到100％时，这是其中胰岛素-Fc融合蛋白表现出增加的作用持续时间的情况。如本文所述，为了有用，分子必须表现出足够高的NAOC值(例如，优选地NAOC大于150％FBGL·天·kg/mg，更优选地NAOC大于200％FBGL·天·kg/mg，并且甚至更优选地NAOC大于250％FBGL·天·kg/mg)。根据经验，在NAOC值大于150％FBGL·天·kg/mg时，目标物种中的剂量要求将足够低，以便达到可接受的治疗成本。最后，为了用于治疗慢性疾病诸如糖尿病，该分子不得诱导抗药物抗体(特别是在重复给药后中和该分子的生物活性的抗体)的产生。因此，在目标动物中多次重复给药后，该分子必须表现出相似的生物活性的持续时间和程度(即NAOC)(例如，第三周皮下注射后的NAOC与第一周皮下注射该分子后的NAOC的比率(即，第三次给药后的NAOC比率(NAOCR))为优选地大于0.50、大于0.60、大于0.70、大于0.80或大于0.90或更大的量级)。
推荐的用于人类临床使用的超长效胰岛素治疗包含胰岛素-Fc融合蛋白，其利用人类Fc片段来延长其体内作用。由于预期人类Fc片段具有免疫原性并且因此能够诱导在伴侣动物(例如狗或猫)中产生抗药物抗体，因此必须用物种特异性(例如犬科或猫科)Fc片段替换人Fc片段。然而，出乎意料地发现，人Fc片段与物种特异性(例如，犬科或猫科)Fc片段之间的简单交换并未产生具有可接受的同型二聚体滴度(例如，同型二聚体滴度大于50mg/L)或足够高的NAOC值(例如，NAOC值大于150％FBGL·天·kg/mg)的产物。例如，在某些情况下，仅Fc片段的特定同种型(例如，犬科动物IgGB或猫科动物IgG1b)导致胰岛素-Fc融合蛋白具有足够高的同型二聚体滴度(例如，同型二聚体滴度大于50mg/L)和可接受的高NAOC值(例如，NAOC值大于150％FBGL·天·kg/mg)。在其他情况下，发现胰岛素多肽的特定氨基酸在目标物种中是免疫原性的，从而需要位点定向突变以发现相对少量的在目标物种中既无免疫原性又具有生物活性的实施例，所述实施例具有可接受的高NAOC值(例如，NAOC值大于150％FBGL·天·kg/mg)和在大于0.5的第三周皮下给药后的NAOCR值。在另外的情况下，当对Fc片段进行突变以防止糖基化并且从而进一步降低胰岛素-Fc融合蛋白的免疫原性时，出乎意料地发现仅Fc片段中的特定氨基酸突变导致所需的同型二聚体滴度(例如，同型二聚体滴度大于50mg/L)和NAOC值(例如，NAOC值大于150％FBGL·天·kg/mg)。此外，发现需要在胰岛素组分中进行另外的突变，以产生具有所需的同型二聚体滴度(例如，同型二聚体滴度大于50mg/L)和NAOC值(例如，NAOC值大于150％FBGL·天·kg/mg)的这些Fc突变的非糖基化的胰岛素Fc-融合蛋白，同时还获得在第三周皮下给药后大于0.5的NAOCR值。因此，本文提供了可制造的、高纯度的、长效的、生物活性的、非免疫原性的胰岛素-Fc融合蛋白，其具有可接受的高同型二聚体滴度(例如，同型二聚体滴度大于50mg/L)、NAOC值(例如，NAOC值大于150％FBGL·天·kg/mg)和在第三周皮下给药后的大于0.5的NAOCR值，适合于治疗伴侣动物(例如，狗或猫)中的糖尿病，其每一种均包含胰岛素多肽、Fc片段以及胰岛素多肽与Fc片段之间的接头。
定义
如本文所使用的，冠词“一(a)”和“一个(an)”是指该冠词的一个或多于一个(例如至少一个)语法对象。当与本文的术语“包含”结合使用时，词语“一”和“一个”的使用可以表示“一个”，但是它也与“一个或多个”、“至少一个”和“一个或多于一个”的含义一致。
如本文所使用的，“约(about)”和“大约(approximately)”通常是指给定测量的性质或精度，所测量的量的可接受的误差程度。示例性的误差程度在值的给定范围的20％(％)以内，通常在10％以内，并且更通常在5％以内。
如本文所使用的，有效治疗障碍(例如本文所述的障碍)的分子、化合物、缀合物或物质的量、“治疗有效量”或“有效量”是指对受试者进行单剂量或多剂量施用时，治疗受试者或治愈、减轻、缓解或改善患有障碍(例如本文所述的障碍)的受试者的分子、化合物、缀合物或物质的量超过在不进行此类治疗的情况下所预期的量。
如本文所使用的，术语“类似物”是指具有与另一化合物或缀合物的化学结构相似但在至少一个方面与其不同的化学结构的化合物或缀合物(例如，如本文所述的化合物或缀合物，例如胰岛素)。
如本文所使用的，术语“抗体”或“抗体分子”是指免疫球蛋白分子(Ig)，免疫球蛋白(Ig)分子的免疫活性部分，即含有与抗原特异性地结合(例如免疫反应)的抗原结合位点的分子。如本文所使用的，术语“抗体结构域”是指免疫球蛋白的可变区或恒定区。如本文所使用的，术语“抗体结构域”是指免疫球蛋白的可变区或恒定区。本领域已有文献记载，抗体包含若干种类别，例如在哺乳动物(例如，人和猫科动物)的情况下的IgA、IgM或IgG。免疫球蛋白的类别可以进一步被分为不同的同种型，例如对于犬科动物的IgGA、IgGB、IgGC和IgGD，或对于猫科动物的IgG1a、IgG1b和IgG2。本领域技术人员将认识到，给定免疫球蛋白类别的免疫球蛋白同种型将包含彼此不同的氨基酸序列、结构和功能性质(例如，对Fc(γ)受体的不同结合亲和力)。“特异性地结合”或“与……免疫反应”是指抗体与所需抗原的一种或多种抗原决定簇反应，并且对其他多肽具有较低的亲和力，例如不与其他多肽反应。
如本文所使用的，术语“曲线下面积”或“AUC”是指在施用给定剂量的胰岛素-Fc融合蛋白后，受试者的％FBGL相对于时间曲线下的积分面积。如本文所使用的，术语“曲线上面积”或“AOC”用作胰岛素-Fc融合蛋白的生物学效力的量度，使得AOC等于％FBGL相对于时间曲线下的总可能面积与AUC值之间的差。如本文所使用的，“归一化的曲线上面积”、“归一化的AOC”或“NAOC”是AOC值除以所施用的胰岛素-Fc融合蛋白的实际剂量。如本文所使用的，术语“标准化的AOC比”或“NAOCR”是由胰岛素-Fc融合蛋白的特定施用产生的NAOC与由胰岛素-Fc融合蛋白在一系列施用中的第一次施用产生的NAOC的比率。因此，NAOCR提供了在重复施用后胰岛素-Fc融合蛋白的生物活性变化的度量。
如本文所使用的，术语“生物活性”、“活性”、“生物学活性”、“效力”、“生物活性效力”或“生物学效力”是指胰岛素-Fc融合蛋白在目标受试者中激活胰岛素受体和/或实现血糖水平的降低的程度。如本文所使用的，“体外活性”或“胰岛素受体活性”是指胰岛素-Fc融合蛋白与胰岛素受体结合的亲和力，并且通常通过在竞争性结合测定(即IC50)中胰岛素-Fc融合蛋白从胰岛素受体置换一半胰岛素参考标准品的浓度来测量。如本文所使用的，“体内活性”是指在施用胰岛素-Fc融合蛋白后目标受试者的空腹血糖水平降低的程度和持续时间。
如本文所使用的，术语“生物合成”、“重组合成”或“重组制备”是指通过用编码胰岛素-Fc融合蛋白的核酸分子(例如载体)转染细胞(例如，其中整个胰岛素-Fc融合蛋白由单个核酸分子编码)，在宿主细胞内表达胰岛素-Fc融合蛋白的过程。示例性的宿主细胞包括哺乳动物细胞，例如HEK293细胞或CHO细胞。可以使用本领域中的标准方法培养细胞，并且可以使用本领域中的标准方法从细胞培养物中收获和纯化所表达的胰岛素-Fc融合蛋白。
如本文所使用的，术语“细胞表面受体”是指通常在细胞膜的外表面上发现的并且与可溶性分子(例如在血液供应中循环的分子)相互作用的分子，诸如蛋白质。在一些实施例中，细胞表面受体可以包括激素受体(例如，胰岛素激素受体或胰岛素受体(IR))或与抗体的Fc片段或Fc区域结合的Fc受体(例如，Fc(γ)受体，例如Fc(γ)受体I，或Fc新生儿受体，例如FcRn)。如本文所使用的，“体外活性”或“Fc(γ)受体活性”或“Fc(γ)受体结合”或“FcRn受体活性”或“FcRn结合”是指胰岛素-Fc融合蛋白与Fc受体(例如Fc(γ)受体或FcRn受体)结合的亲和力，并且通常通过使胰岛素-Fc融合蛋白达到其最大结合值的一半(即EC50值)的胰岛素-Fc融合蛋白的浓度来测量，如在使用在微孔板读取器上测量的OD 450nm值的测定(例如酶联免疫吸附测定(ELISA)测定)上所测量的。
如本文所使用的，术语“空腹血糖水平”或“FBGL”是指在不给予食物期间的时间段结束时且就在施用胰岛素-Fc融合蛋白的时间之前，目标受试者中的平均血糖水平。如本文所使用的，术语“空腹血糖水平百分比”、“空腹血糖水平％”或“％FBGL”是指给定的血糖水平与空腹血糖水平的比率乘以100。
如本文所使用的，术语“免疫原性的”或“免疫原性”是指给定分子(例如，本发明的胰岛素-Fc融合蛋白)激发目标受试者的免疫系统的能力，使得在重复施用该分子后，受试者产生能够特异性地结合该分子的抗体(即，抗药物抗体)。如本文所使用的，术语“中和”、“中和抗体”或“中和抗药物抗体”是指抗体干扰化合物在目标受试者中的生物学活性的能力。如本文所使用的，术语“免疫原性表位”、“免疫原性热点”或“热点”是指给定分子(例如，本发明的胰岛素-Fc融合蛋白)的突变或表位，其负责抗药物抗体的中度或强烈结合。
如本文所使用的，术语“胰岛素参考标准品”是下列中的任何一种：(i)来自哺乳动物(例如，人、狗或猫)的天然存在的胰岛素；(ii)不包含Fc片段的胰岛素多肽；或(iii)护理胰岛素的标准品(例如，市售胰岛素)。
如本文所使用的，术语“单体”是指包含单个多肽的蛋白质或融合蛋白。在实施例中，“单体”是包含胰岛素多肽和Fc片段多肽的蛋白质或融合蛋白，例如单一多肽，其中胰岛素和Fc片段多肽通过肽键连接以形成单一多肽。在实施例中，单体由单个核酸分子编码。
如本文所使用的，“N末端”是指由含有游离胺基团的氨基酸起始的蛋白质或多肽的起点，所述游离胺基团是氨基酸的α-氨基基团(例如共价地连接到被定位成与第二个碳原子相邻的一个碳原子上的游离氨基，其中第二个碳原子是氨基酸的羰基基团的一部分)。如本文所使用的，“C末端”是指被含有羧酸基团的由氨基酸终止的蛋白质或多肽的末端，其中羧酸基团的碳原子被定位成与氨基酸的α-氨基基团相邻。
本文所使用的，“药效动力学”或“PD”通常是指胰岛素-Fc融合蛋白在受试者中的生物学作用。具体而言，在本文中PD是指受试者在施用胰岛素-Fc融合蛋白后空腹血糖水平随时间降低的量度。
如本文所使用的，“药代动力学”或“PK”通常是指胰岛素-Fc融合蛋白和受试者的身体在其吸收、分布、代谢和排泄方面的特征性相互作用。具体而言，在本文中PK是指在施用胰岛素-Fc融合蛋白之后的给定时间，受试者的血液或血清中胰岛素-Fc融合蛋白的浓度。如本文所使用的，“半衰期”是指受试者的血液或血清中胰岛素-Fc融合蛋白的浓度达到其原始值的一半所用的时间，如从用于药物消除的一阶指数衰减模型所计算的。具有更大的“半衰期”值的胰岛素-Fc融合蛋白表现出在目标受试者中的更长的作用持续时间。
如本文所使用的，术语氨基酸或核苷酸序列中的“序列同一性”、“序列同源性”、“同源性”或“相同”描述了当变体的核苷酸序列或氨基酸序列的指定的连续区段与参考序列的核苷酸序列或氨基酸序列比对和比较时，在变体和参考序列中发现相同的核苷酸或氨基酸残基。用于序列比对和用于确定序列之间同一性的方法在本领域中是已知的，包括使用Clustal Omega，其组织、比对和比较序列以获得相似性，其中软件突出了每个序列位置并在该位置的所有序列之间进行比较，并分配以下得分之一：对于具有单个完全保守的残基的序列位置为“*”(星号)，“：”(冒号)表示在Gonnet PAM 250矩阵中得分大于0.5的强相似性质的组之间的保守性，以及“.”(句点)表示在Gonnet PAM 250矩阵中得分小于或等于0.5的弱相似性质的组之间的保守性，“-”(破折号)表示序列空位，意味着在序列的某一范围内的特定比较集中不存在局部同源性，而空格“”表示在所比较的序列中该特定位置的序列同源性很小或没有。参见，例如，Ausubel等人编辑(1995)Current Protocols inMolecular Biology,Chapter 19(Greene Publishing and Wiley-Interscience,NewYork)；和the ALIGN program(Dayhoff(1978)in Atlas of Polypeptide Sequence andStructure5:Suppl.3(National Biomedical Research Foundation,Washington,D.C.)。就两个核苷酸序列的最佳比对而言，变体核苷酸序列的连续区段相对于参考核苷酸序列可以具有额外的核苷酸或缺失的核苷酸。同样，为了两个氨基酸序列的最佳比对，变体氨基酸序列的连续区段相对于参考氨基酸序列可以具有额外氨基酸残基或缺失的氨基酸残基。在一些实施例中，用于与参考核苷酸序列或参考氨基酸序列比较的连续区段将包含至少6、10、15或20个连续核苷酸或氨基酸残基，并且可以是30个、40个、50个、100个或更多个核苷酸或氨基酸残基。与变体的核苷酸序列或氨基酸序列中包括空位相关的增加的序列同一性的校正可以通过指定空位罚分来进行。序列比对的方法在本领域中是已知的。
在实施例中，使用数学算法来完成两个序列之间同一性百分比或“同源性”的确定。例如，使用Smith-Waterman同源性搜索算法来确定氨基酸序列的同一性百分比，该算法使用仿射6空位搜索，其中空位开放罚分为12，并且空位延伸罚分为2，BLOSUM矩阵62。Smith-Waterman同源性搜索算法在Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math2:482-489(其通过引用并入本文)中描述。在实施例中，使用Smith-Waterman同源性搜索算法来确定核苷酸序列的同一性百分比，所述算法使用25的空位开放罚分和5的空位延伸罚分。可以使用例如来自TimeLogic的DeCypher硬件加速器进行序列同一性的此类确定。
如本文所使用的，术语“同源性”用于通过定位例如β链、螺旋和折叠的共同结构特征和共同空间分布来比较两种或更多种蛋白质。因此，同源蛋白质结构由空间分析定义。测量结构同源性涉及计算空间的几何拓扑特征。用于生成和分析三维(3D)蛋白质结构的一种方法是同源性建模(也被称为比较建模或基于知识的建模)，其通过在3D相似性反映2D相似性的事实的基础上发现相似序列来工作。同源结构并不暗示序列相似性是必要条件。
如本文所使用的，术语“受试者”和“患者”旨在包括犬科动物和猫科动物。示例性的犬科动物和猫科动物受试者包括患有疾病或障碍(例如，糖尿病或本文所述的另一种疾病或障碍)的狗和猫，或正常受试者。
如本文所使用的，术语“滴度”或“产量”是指每体积细胞培养物由生物合成(例如，在哺乳动物细胞中，例如在HEK293细胞或CHO细胞中)产生的融合蛋白产物(例如，本文所述的胰岛素-Fc融合蛋白)的量。产物的量可以在生产过程的任何步骤中确定(例如，在纯化之前或之后)，但产量或滴度总是以原始细胞培养物的每体积来表示。如本文所使用的，术语“产物产量”或“总蛋白产量”是指由细胞表达并通过至少一个亲和层析步骤纯化的胰岛素-Fc融合蛋白(例如蛋白A或蛋白G)的总量，并且包括胰岛素-Fc融合蛋白的单体、胰岛素-Fc融合蛋白的同型二聚体和胰岛素-Fc融合蛋白的同型二聚体的更高级分子聚集体。如本文所使用的，术语“同型二聚体百分比”或“同型二聚体％”是指作为所需的同型二聚体的融合蛋白产物(例如，本文所述的胰岛素-Fc融合蛋白)的比例。如本文所使用的，术语“同型二聚体滴度”是指每体积细胞培养物报告的在蛋白A纯化步骤后同型二聚体％与总蛋白产量的乘积。
如本文所使用的，术语“治疗(treat或treating)”患有疾病或障碍的受试者是指使受试者经历治疗方案，例如施用融合蛋白诸如本文所述的融合蛋白，使得疾病或障碍的至少一种症状被治愈、愈合、减轻、缓解、改变、补救、改善或改进。治疗包括施用有效减轻、缓解、改变、补救、改善、改进或影响所述疾病或障碍或所述疾病或障碍的症状的量。该治疗可以抑制疾病或障碍的症状的恶化或加剧。
胰岛素-Fc融合蛋白的组分和结构
本公开涉及一种融合蛋白(即胰岛素-Fc融合蛋白)的组合物，其包含通过肽接头与物种特异性Fc片段连接的胰岛素多肽，以及其治疗伴侣动物(例如，狗或猫)中的糖尿病的用途。如本文所使用的，术语“融合蛋白”和“胰岛素-Fc融合蛋白”是指包含多于一个部分的蛋白质，例如来自不同来源(不同的蛋白质、多肽、细胞等)，它们通过肽键共价连接。胰岛素-Fc融合蛋白通过以下共价连接：(i)将编码每个部分的基因连接到单个核酸分子中，和(ii)在宿主细胞(例如，HEK或CHO)中表达核酸分子编码的如下蛋白质：(N末端)--胰岛素多肽--接头--Fc片段--(C末端)。与其中分别合成胰岛素多肽和Fc片段然后进行化学缀合的方法相比，完全重组的合成方法是优选的。化学缀合步骤和随后的纯化过程增加了制造复杂性，降低了产品产量，并且增加了成本。
如本文所使用的，术语“二聚体”是指包含共价连接的两种多肽的蛋白质或融合蛋白。在实施例中，两种相同的多肽共价连接(例如，通过二硫键)，从而形成“同型二聚体”(在图1中示意性地表示)。二硫键如图1中的虚线所示；实际上二硫键的总数可以大于或小于图1所示的数目。在实施例中，所述同型二聚体由单个核酸分子编码，其中所述同型二聚体通过首先形成胰岛素-Fc融合蛋白单体，并且然后在细胞内进一步加工时将两种相同的胰岛素-Fc融合蛋白单体组装成同型二聚体而在细胞内重组制备。
如本文所使用的，术语“多聚体”、“多聚体的”或“多聚体状态”是指可以与Fc融合蛋白二聚体平衡或可以充当Fc融合蛋白二聚体的永久聚集形式(例如，Fc融合蛋白同型二聚体的二聚体、Fc融合蛋白同型二聚体的三聚体、Fc融合蛋白同型二聚体的四聚体或含有五种或更多种Fc融合蛋白同型二聚体的更高级聚集体)的非共价、缔合形式的Fc融合蛋白二聚体。可以预期，多聚体形式的Fc融合蛋白可能具有与胰岛素-Fc融合蛋白同型二聚体不同的物理、稳定性或药理活性。
胰岛素多肽
胰岛素多肽可以是例如由胰腺内的朗格汉斯岛中的β细胞产生的胰岛素或胰岛素类似物。胰岛素通过调节血液中葡萄糖的吸收来发挥作用。在刺激(诸如增加的蛋白质和葡萄糖水平)后，胰岛素从β细胞中释放并与胰岛素受体(IR)结合，启动信号级联，其影响哺乳动物(例如，人类、犬科动物或猫科动物)代谢的许多方面。这一过程的中断与多种疾病直接相关，特别是糖尿病、胰岛素瘤、胰岛素抵抗、代谢综合征和多囊卵巢综合征。本公开的胰岛素类似物可以与胰岛素的结构相关，但包含一种或多种修饰。在一些实施例中，胰岛素类似物包含相对于胰岛素的至少一个氨基酸取代、缺失、添加或化学修饰，其可以影响胰岛素-Fc融合蛋白的特定特征或特性。例如，相对于参考标准品，本文所述的修饰或改变可能影响胰岛素-Fc融合蛋白对细胞表面受体(例如胰岛素激素受体)的结构、稳定性、pH敏感性、生物活性或结合亲和力。
胰岛素的氨基酸序列在整个进化中高度保守，特别是在脊椎动物中。例如，天然犬科动物胰岛素与人类胰岛素仅相差一个氨基酸，并且天然猫科动物胰岛素与人类胰岛素仅相差四个氨基酸。如本文所使用的，术语“B链”、“C肽”或“C链”和“A链”是指如图1所示的胰岛素多肽的肽区段。胰岛素是一种51氨基酸激素，其含有两条通过二硫键(例如，由一个或多个B链半胱氨酸侧链硫醇和一个或多个A链半胱氨酸侧链硫醇形成的二硫键)连接的肽链(即B链和A链)。胰岛素的A链的长度为21个氨基酸，并且胰岛素的B链的长度为30个氨基酸。在胰岛素的天然形式中，A链包含一个由两个A链半胱氨酸侧链硫醇形成的链内二硫键。出于参考的目的，SEQ ID NO:1的人胰岛素A链以及SEQ ID NO:2的人胰岛素B链的序列如下所示：
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT(SEQ ID NO:1)
GIVEQCCTSICSLYQLENYCN(SEQ ID NO:2)
如本文所使用的，术语“胰岛素”或“胰岛素多肽”包括成熟胰岛素、前胰岛素、胰岛素原和天然存在的胰岛素或其类似物。在实施例中，胰岛素多肽可以是全长胰岛素多肽或其片段。在实施例中，胰岛素多肽可以包含来自成熟胰岛素、前胰岛素、胰岛素原或天然存在的胰岛素的一个或多个片段。
胰岛素通常被构建为N末端--B链：C链：A链--C末端多肽，其中C链被切割以便使其具有生物活性。出于参考的目的，包括C链的整个人胰岛素分子(即人胰岛素原)的序列如下所示，其中C链加下划线：
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN(SEQ ID NO:3)
在葡萄糖刺激的胰岛素分泌之前，单链胰岛素多肽向生物活性的双链多肽的转化通常在朗格汉斯岛的β细胞内通过两种内切蛋白酶完成，即破坏C肽-B链连接的I型内切蛋白酶PC1和PC3以及恰好在正确位点裂解C肽-A链键的II型内切蛋白酶PC2。然而，用于生物合成治疗性分子诸如胰岛素的细胞系统(例如细菌、酵母和哺乳动物(例如HEK和CHO)细胞系统)不具有该途径，并且因此转化必须在使用化学或酶促方法表达和收获单链多肽之后进行。所有已知的在表达和收获后用于切割C链的技术都依赖于首先修饰C链，使得其刚好在A链的N末端之前终止于赖氨酸。然后，使用选自胰蛋白酶或Lys-C家族的酶(其特异性地在赖氨酸残基的C末端剪切肽键)，单链胰岛素多肽在C链的C末端赖氨酸处和在B链的N末端第29位的C末端赖氨酸处被切割。在一些情况下，使用所得的生物活性双链胰岛素，而无需重新连接B链的N末端第30位处的剪切的氨基酸，并且在一些情况下，使用额外的酶促方法将B链的N末端第30位处的剪切的氨基酸添加回到分子中。此类过程对胰岛素很有效，因为它在其整个双链多肽形式中仅含有一个赖氨酸。然而，该方法不能用于本文包含的胰岛素-Fc融合蛋白，因为所有已知的Fc片段都含有多个赖氨酸残基。因此，酶切过程将Fc片段消化为非功能性部分，从而消除Fc片段延长胰岛素多肽体内作用的能力。因此，本发明的胰岛素-Fc融合蛋白必须包含不需要切割C链的胰岛素多肽，并且因此其单链形式具有生物活性。
在本领域中已经描述了多种生物活性单链胰岛素多肽。在所有情况下，单链胰岛素多肽含有特定长度和组成的C链以及在特定氨基酸位点突变的A链和B链，以便实现静电平衡、防止聚集、增强胰岛素受体(IR)结合和/或下游信号传导，以在与天然双链胰岛素相当的水平上实现生物活性。在本文中，使用区段的名称(例如B链、C链、A链)和从片段的N末端开始计数的氨基酸数量来标注肽区段上突变的位置。例如，符号“B16”是指距B链的氨基酸序列的N末端的第16个氨基酸。符号“A8”是指距A链的N末端的第8个氨基酸。此外，如果氨基酸在特定位置从其天然形式突变为新的氨基酸，则该位置附带有新氨基酸的一个字母氨基酸代码。例如，B16A是指在距B链的氨基酸序列的N末端的第16个氨基酸处的丙氨酸突变，并且A8H是指在距A链的氨基酸序列的N末端的第8个氨基酸处的组氨酸突变。
在一个实例中，单链胰岛素类似物(其具有序列GGGPRR的C链以及A链和B链中的附加取代(SEQ ID NO:4))由The Department of Biochemistry,Case Western ReserveUniversity School of Medicine and the Department of Medicine,University ofChicago开发(参见Hua,Q.-x,Nakagawa,S.H.,Jia,W.,Huang,K.,Phillips,N.B.,Hu,S.-q.,Weiss,M.A.,(2008)J.Biol.Chem Vol.283,No.21pp 14703-14716)。在该示例中，在A链的位置8(即A8)处，用组氨酸取代苏氨酸；在B链的位置10(即B10)处，用天冬氨酸取代组氨酸；在B链的位置28(即B28)处，用天冬氨酸取代脯氨酸；并且在B链的位置29(即B29)处，用脯氨酸取代赖氨酸。SEQ ID NO:4在下面列出，其中每个非天然氨基酸都加下划线：
FVNQHLCGSDLVEALYLVCGERGFFYTDPTGGGPRRGIVEQCCHSICSLYQLENYCN(SEQ ID NO:4)
在实施例中，可以用丙氨酸取代在来自SEQ ID NO:4中B链的N末端的位置16(即B16)处的酪氨酸，以产生SEQ ID NO:5，因为已知该位置中的丙氨酸取代不太能够活化胰岛素特异性T细胞(Alleva,D.G.,Gaur,A.,Jin,L.,Wegmann,D.,Gottlieb,P.A.,Pahuja,A.,Johnson,E.B.,Motheral,T.,Putnam,A.,Crowe,P.D.,Ling,N.,Boehme,S.A.,Conlon,P.J.,(2002)Diabetes Vol.51,No.7pp 2126-2134)。下面列出了SEQ ID NO:5，其中每个非天然氨基酸都加下划线：
FVNQHLCGSDLVEALALVCGERGFFYTDPTGGGPRRGIVEQCCHSICSLYQLENYCN(SEQ ID NO:5)
在一些实施例中，出乎意料地发现SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5中的特定氨基酸导致在目标动物(例如，狗或猫)中重复皮下注射后产生中和性抗药物抗体。在多次注射后，抗药物抗体导致NAOC的不可接受的降低(例如，第三次注射后的NAOCR值小于0.5)，从而使相关的胰岛素-Fc融合蛋白失去活性。具体而言，在导致本公开的发明的步骤中发现组氨酸的A8突变和天冬氨酸的B10突变占抗药物抗体特异性的绝大多数，并且因此代表胰岛素-多肽上的免疫原性“热点”(例如免疫原性表位)。因此，在优选的实施例中，胰岛素-多肽在A8位不包含组氨酸，或者在胰岛素多肽的B10位不包含天冬氨酸。
在一个实施例中，证实了简单地分别保持A8和B10氨基酸作为它们的天然苏氨酸和组氨酸确实消除了抗药物抗体应答，但是所得的胰岛素-Fc融合蛋白在目标物种中不具有生物活性(例如，NAOC小于150％FBGL·天·kg/mg)。因此，有必要试验各种A链、B链和C链变体，以找到合适的解决方案。大多数变体未能达到大于50mg/L的同型二聚体滴度，并且许多确实符合这些目标的变体在目标物种中未达到可接受的生物活性水平(例如，大于150％FBGL·天·kg/mg的可接受的NAOC值)。筛选了超过120种变体后，SEQ ID NO:6_NULL的下列胰岛素多肽被认为适合于实现大于50mg/L的同型二聚体滴度、大于150％FBGL·天·kg/mg的目标物种中的NAOC值、最小免疫原性以及在目标物种中第三次注射相关胰岛素-Fc融合蛋白后大于0.5的NAOCR值(非天然氨基酸被加下划线并且用加下划线的Z表示缺失的天然氨基酸)：
FVNQHLCGSX1 LVEALELVCGERGFHYZZZZGGGGGGSGGGGGIVEQCCX2 STCSLDQLENYCX 3 (SEQID NO:6_NULL)
其中X1不是D，X2不是H，并且X3不存在或者是N。
在特定实施例中，在SEQ ID NO:6_NULL中，X1是H，X2是T，并且X3不存在或者是N，导致以下SEQ ID NO:7_NULL(其中非天然氨基酸被加下划线并且用加下划线的Z表示缺失的天然氨基酸)：
FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYZZZZGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLDQLENYCX 3 (SEQID NO:7_NULL)
其中X3不存在或者是N。
在一个特定实施例中，在SEQ ID NO:7_NULL中，X3不存在，导致以下SEQ ID NO:8_NULL(其中非天然氨基酸被加下划线并且用加下划线的Z表示缺失的天然氨基酸)：FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYZZZZGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLDQLENYCZ(SEQ ID NO:8_NULL)
在一个具体的实施例中，在SEQ ID NO:7_NULL中，X3是N，导致以下SEQ ID NO:9_NULL(其中非天然氨基酸被加下划线并且用加下划线的Z表示缺失的天然氨基酸)：FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYZZZZGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLDQLENYCN(SEQ ID NO:9_NULL)
在一些实施例中，将Fc片段突变以防止在合成期间的糖基化，并潜在地降低目标动物(例如狗或猫)中所得的胰岛素-Fc融合蛋白的免疫原性。出乎意料的是，发现在胰岛素多肽与突变的Fc片段之间存在相互作用，使得需要在胰岛素多肽上进行另一个氨基酸突变，以便使胰岛素-Fc融合蛋白足以可制造(例如，具有大于50mg/L的同型二聚体滴度)且无免疫原性，其中目标物种中的NAOC值大于150％FBGL·天·kg/mg，并且在目标物种中第三次注射后的NAOCR值大于0.5。具体而言，发现当B16氨基酸与特定的突变的非糖基化Fc片段连接时，需要将B16氨基酸突变为胰岛素多肽上的丙氨酸，从而产生以下胰岛素多肽SEQ IDNO:10_NULL(其中非天然氨基酸被加下划线并且用加下划线的Z表示缺失的天然氨基酸)：
FVNQHLCGSX1 LVEALALVCGERGFHYZZZZGGGGGGSGGGGGIVEQCCX2 STCSLDQLENYCZ(SEQID NO:10_NULL)
其中X1不是D，并且X2不是H。
在一个具体的实施例中，在SEQ ID NO:10_NULL中，X1是H，并且X2是T，导致以下SEQID NO:11_NULL(其中非天然氨基酸被加下划线并且用加下划线的Z表示缺失的天然氨基酸)：
FVNQHLCGSHLVEALALVCGERGFHYZZZZGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLDQLENYCZ–SEQ IDNO:11_NULL
以下是上述序列的重述，但从胰岛素多肽序列的符号中移除了符号Z的缺失氨基酸。同样，在所有情况下，非天然氨基酸都加下划线。为了避免混淆，每个包含Z符号的原始序列都被列在新序列的上方，其中Z符号被移除。尽管有两个单独的符号，但配对的序列指代完全相同的胰岛素多肽。
SEQ ID NO:6_NULL被重述为：
FVNQHLCGSX1 LVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCX2 STCSLDQLENYCX3 (SEQ IDNO:6)
其中X1不是D，X2不是H，并且X3不存在或者是N。
SEQ ID NO:7_NULL被重述为：
FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLDQLENYCX3 (SEQ IDNO:7)
其中X3不存在或者是N。
SEQ ID NO:8_NULL被重述为：
FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLDQLENYC(SEQ ID NO:8)
SEQ ID NO:9_NULL被重述为：
FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLDQLENYCN(SEQ ID NO:9)
SEQ ID NO:10_NULL被重述为：
FVNQHLCGSX1 LVEALALVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCX2 STCSLDQLENYC(SEQ ID NO:10)
其中X1不是，并且X2不是H。
SEQ ID NO:11_NULL被重述为：
FVNQHLCGSHLVEALALVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLDQLENYC(SEQ ID NO:11)
接头
重组制备的胰岛素-Fc融合蛋白的成功构建需要将胰岛素多肽连接到Fc片段的接头。在实施例中，本文所述的胰岛素-Fc融合蛋白包含胰岛素多肽与包含氨基酸(例如，天然氨基酸或非天然氨基酸)的Fc片段之间的肽接头。在实施例中，肽接头可以由核酸分子编码，例如使得单个核酸分子可以编码胰岛素多肽内的各种肽以及肽接头和Fc片段。肽接头的选择(例如长度、组成、疏水性和二级结构)可能影响胰岛素-Fc融合蛋白的可生产性(即同型二聚体滴度)、化学和酶促稳定性、生物活性(即NAOC值)和免疫原性(Chen,X.,Zaro,J.,Shen,W.C.,Adv Drug Deliv Rev.2013October 15；65(10):1357-1369)。表1列出了用于设计胰岛素-Fc融合蛋白的若干种接头，目的是提高同型二聚体滴度和生物活性。
表1：胰岛素-Fc融合蛋白中A链与Fc片段之间的肽接头
GGGGAGGGG
GGGGSGGGG
GGGGGAGGGG
GGGGSGGGGSGGGGSGGGG
GGGGKGGGGKGGGGKGGGG
GGGGGQGGGGQGGGGQGGGGG
GGGGGAGGGGAGGGGAGGGGG
SGGGGQGGGGQGGGGQGGGGG
HGGGGQGGGGQGGGGQGGGGG
PGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGG
在实施例中，肽接头包含以下序列：
GGGGAGGGG(SEQ ID NO:12)。
在其他实施例中，肽接头包含以下序列：
GGGGSGGGG(SEQ ID NO:13)。
在优选的实施例中，肽接头包含以下序列：
GGGGGQGGGGQGGGGQGGGGG(SEQ ID NO:14)。
在构建具有肽接头(如SEQ ID NO:14中的接头)的重组制备的胰岛素-Fc融合蛋白时，必须注意在胰岛素A链的C末端与肽接头的N末端之间不希望的酶切的可能性。将接头和Fc片段从胰岛素多肽上切割会使胰岛素-Fc融合蛋白不能提供延长的生物活性持续时间。在天冬酰胺-甘氨酸键之间存在已知的酶切位点(Vlasak,J.,Ionescu,R.,(2011)MAbsVol.3,No.3pp 253-263)。在多个肽接头的实施例中，包括优选的SEQ ID NO:14的肽接头，N末端氨基酸是甘氨酸。此外，胰岛素A链的C末端(即，距A链的N末端的第21个氨基酸(即，A21))是天冬酰胺。因此，在SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11的胰岛素多肽中省略了A21天冬酰胺，以消除可能在A链与肽接头之间形成的可酶切的天冬酰胺-甘氨酸键。出乎意料的是，由SEQ ID NO:9的胰岛素多肽构建的胰岛素-Fc融合蛋白(其在A链的C末端保留天冬酰胺)在哺乳动物细胞中表现出可制造性，其具有可接受的同型二聚体滴度(即，同型二聚体滴度大于50mg/L)、可接受的体内生物活性(即，在目标动物中NAOC大于150％FBGL·天·kg/mg)以及在多剂量后持续的生物活性水平(即，在目标动物中第三次注射后的NAOCR值大于0.5)。结果表明，与基于先前教导的预期相反，不存在在胰岛素多肽和肽接头之间含有天冬酰胺-甘氨酸连接的胰岛素-Fc融合蛋白的酶切或失活的风险，至少对于包含本文公开的Fc片段序列的胰岛素-Fc融合蛋白而言是如此。
Fc片段
术语“Fc片段”、“Fc区域”、“Fc结构域”或“Fc多肽”在本文中用于定义免疫球蛋白重链的C末端区域。Fc片段、区域、结构域或多肽可以是天然序列Fc区域或变体/突变Fc区域。尽管免疫球蛋白重链的Fc区域的边界可能不同，但它们通常包含重链的铰链区、重链的CH2区和重链的CH3区中的一些或全部。犬科动物或猫科动物Fc片段的铰链区包含将重链的CH1结构域连接到重链的CH2区的氨基酸序列，并且包含一个或多个半胱氨酸，所述半胱氨酸形成一个或多个重链间二硫键，以由Fc融合蛋白的两个相同但分开的单体形成Fc融合蛋白的同型二聚体。铰链区可以包含全部或部分天然存在的氨基酸序列或非天然存在的氨基酸序列。
Fc受体(FcR)是指与Fc片段或抗体的Fc区域结合的受体。在实施例中，FcR是犬科动物或猫科动物FcR的天然序列。在实施例中，FcR是结合IgG抗体(γ受体)的Fc片段或Fc区域的FcR，并且包括但不限于Fc(γ)受体I、Fc(γ)受体IIa、Fc(γ)受体IIb和Fc(γ)受体III亚类的受体，包括这些受体的等位变体和选择性剪接的形式。“FcR”还包括新生儿受体FcRn，其负责将母体IgG分子转移至胎儿(Guyer等人,1976J.Immunol.,117:587；和Kim等人,1994,J.Immunol.,24:249)，并且还负责延长抗体和Fc-融合蛋白在体内的体内消除半衰期。在实施例中，体外(例如，在测定中)使用人类来源的FcR来测量包含犬科动物或猫科动物来源的Fc片段的胰岛素-Fc融合蛋白的结合，以便评估它们的FcR结合特性。本领域技术人员将理解，来自一个物种(例如，人类来源的FcR)的哺乳动物FcR有时能够体外结合来自第二物种(例如，犬科动物或猫科动物来源的FcR)的Fc片段。在实施例中，体外(例如，在测定中)使用犬科动物来源的FcR来测量包含犬科动物或猫科动物来源的Fc片段的胰岛素-Fc融合蛋白的结合，以便评估它们的FcR结合特性。本领域技术人员将理解，来自一个物种(例如，犬科动物来源的FcR)的哺乳动物FcR能够体外结合包含来自相同物种(例如，犬科动物来源的)的Fc片段的胰岛素-Fc融合蛋白，并且有时还结合包含来自另一个哺乳动物物种(例如，猫科动物来源的)的Fc片段的胰岛素-Fc融合蛋白。
在实施例中，Fc片段包含哺乳动物IgG的Fc区域(例如铰链区、CH2结构域和CH3结构域)，例如犬科动物的IgGA Fc片段(SEQ ID NO:15)、犬科动物的IgGB Fc片段(SEQ IDNO:16)、犬科动物的IgGC Fc片段(SEQ ID NO:17)、或犬科动物的IgGD Fc片段(SEQ ID NO:18)或猫科动物的IgG1a片段(SEQ ID NO:19)、猫科动物的IgG1b Fc片段(SEQ ID NO:20)或猫科动物的IgG2 Fc片段(SEQ ID NO:21)。在实施例中，省略了通常在天然犬科动物或猫科动物IgG同种型Fc片段氨基酸序列中发现的C末端赖氨酸(即，代表Fc片段序列的最后一个氨基酸的赖氨酸)，以防止在生产期间意外产生不需要的氨基酸序列变体(例如，含有C末端赖氨酸的Fc片段变得与其中省略了C末端赖氨酸的Fc片段混合，这可能在细胞内产生所需蛋白质期间发生(Dick,LW.,(2008)Biotechnol Bioeng.Aug 15；100(6)pp1132-43)。因此，在实施例中，缺乏C末端赖氨酸的犬科动物或猫科动物Fc片段序列是：
RCTDTPPCPVPEPLGGPSVLIFPPKPKDILRITRTPEVTCVVLDLGREDPEVQISWFVDGKEVHTAKTQSREQQFNGTYRVVSVLPIEHQDWLTGKEFKCRVNHIDLPSPIERTISKARGRAHKPSVYVLPPSPKELSSSDTVSITCLIKDFYPPDIDVEWQSNGQQEPERKHRMTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQQGDPFTCAVMHETLQNHYTDLSLSHSPG(SEQ ID NO:15)
DCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFNGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG(SEQ ID NO:16)
CNNCPCPGCGLLGGPSVFIFPPKPKDILVTARTPTVTCVVVDLDPENPEVQISWFVDSKQVQTANTQPREEQSNGTYRVVSVLPIGHQDWLSGKQFKCKVNNKALPSPIEEIISKTPGQAHQPNVYVLPPSRDEMSKNTVTLTCLVKDFFPPEIDVEWQSNGQQEPESKYRMTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQISLSHSPG(SEQ ID NO:17)
CISPCPVPESLGGPSVFIFPPKPKDILRITRTPEITCVVLDLGREDPEVQISWFVDGKEVHTAKTQPREQQFNSTYRVVSVLPIEHQDWLTGKEFKCRVNHIGLPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSPKELSSSDTVTLTCLIKDFFPPEIDVEWQSNGQPEPESKYHTTAPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQQGDTFTCAVMHEALQNHYTDLSLSHSPG(SEQ ID NO:18)
DCPKCPPPEMLGGPSIFIFPPKPKDTLSISRTPEVTCLVVDLGPDDSDVQITWFVDNTQVYTAKTSPREEQFNSTYRVVSVLPILHQDWLKGKEFKCKVNSKSLPSPIERTISKAKGQPHEPQVYVLPPAQEELSRNKVSVTCLIKSFHPPDIAVEWEITGQPEPENNYRTTPPQLDSDGTYFVYSKLSVDRSHWQRGNTYTCSVSHEALHSHHTQKSLTQSPG(SEQ ID NO:19)
DCPKCPPPEMLGGPSIFIFPPKPKDTLSISRTPEVTCLVVDLGPDDSDVQITWFVDNTQVYTAKTSPREEQFNSTYRVVSVLPILHQDWLKGKEFKCKVNSKSLPSPIERTISKDKGQPHEPQVYVLPPAQEELSRNKVSVTCLIEGFYPSDIAVEWEITGQPEPENNYRTTPPQLDSDGTYFLYSRLSVDRSRWQRGNTYTCSVSHEALHSHHTQKSLTQSPG(SEQ ID NO:20)
GEGPKCPVPEIPGAPSVFIFPPKPKDTLSISRTPEVTCLVVDLGPDDSNVQITWFVDNTEMHTAKTRPREEQFNSTYRVVSVLPILHQDWLKGKEFKCKVNSKSLPSAMERTISKAKGQPHEPQVYVLPPTQEELSENKVSVTCLIKGFHPPDIAVEWEITGQPEPENNYQTTPPQLDSDGTYFLYSRLSVDRSHWQRGNTYTCSVSHEALHSHHTQKSLTQSPG(SEQ ID NO:21)
由于IgGA同种型在狗中缺乏Fc(γ)效应子功能(与人类中的IgG2同种型非常相似)，因此用犬科动物IgGA替换人Fc是优选的，以最小化狗中任何不需要的免疫原性。然而，在含有SEQ ID NO:5的胰岛素多肽和SEQ ID NO:12的肽接头的实施例中，出乎意料地发现包含犬科动物IgGA片段(SEQ ID NO:15)的胰岛素-Fc融合蛋白与低滴度的所需同型二聚体高度聚集(即，同型二聚体滴度低于50mg/L)。此外，该化合物在狗中无生物活性(即NAOC值低于150％FBGL·天·kg/mg)，推测是由于其高聚集水平(例如低的同型二聚体％)。尽管突变了SEQ ID NO:5的胰岛素多肽、犬科动物IgGA Fc片段(SEQ ID NO:15)和/或接头，但不存在基于具有足够低的聚集度和足够高滴度的所需同型二聚体的犬科动物IgGA Fc片段的实施例。在另一个方面中，用犬科动物IgGB Fc片段(SEQ ID NO:16)替换犬科动物IgGA Fc片段(SEQ ID NO:15)得到聚集度低得多的化合物，其具有相对高的所需同型二聚体滴度。此外，含有SEQ ID NO:5的胰岛素多肽和犬科动物IgGB Fc片段(SEQ ID NO:16)的化合物在狗中具有生物活性，在多天内表现出降糖生物活性(即NAOC值大于150％FBGL·天·kg/mg)。
在含有SEQ ID NO:8的胰岛素多肽和SEQ ID NO:14的肽接头(这两者与SEQ IDNO:5的胰岛素多肽和SEQ ID NO:12的肽接头显著不同)的实施例中，证实了犬科动物IgGBFc片段优于犬科动物IgGA Fc片段。使用来自犬科动物IgGA(SEQ ID NO:15)、犬科动物IgGB(SEQ ID NO:16)、犬科动物IgGC(SEQ ID NO:17)或犬科动物IgGD(SEQ ID NO:18)免疫球蛋白的Fc片段合成含有SEQ ID NO:8的胰岛素多肽和SEQ ID NO:14的肽接头的胰岛素-Fc融合蛋白。使用常规的纯化方法，仅包含犬科动物IgGA和犬科动物IgGB的化合物示出了出任何可观的蛋白质产量。然而，就像以前一样，该化合物的犬科动物IgGA版本高度聚集，具有低水平的生物活性，而该化合物的犬科动物IgGB版本表现出低聚集度(即高的同型二聚体％)、高滴度的所需同型二聚体(即同型二聚体滴度大于50mg/L)，以及在狗中可观水平的长期降糖生物活性(即NAOC值大于150％FBGL·天·kg/mg)。使用替代的纯化方法，以低聚集度回收了该化合物的犬科动物IgGC版本，但其在狗中生物活性最低(即NAOC值低于150％FBGL·天·kg/mg)，推测是因为其对FcRn受体的低亲和力。因此，就狗特异性产物而言，犬科动物IgGB(SEQ ID NO:16)是狗中使用的所有胰岛素-Fc融合蛋白的优选的Fc片段，无论选择何种胰岛素多肽。
由于IgG2同种型在猫中缺乏Fc(γ)效应子功能(与人类中的IgG2同种型非常相似)，因此优选用猫科动物IgG2替换人类Fc以最小化猫中任何不需要的免疫原性。与狗的情况不同，在含有SEQ ID NO:4的胰岛素多肽的实施例中，发现包含猫科动物IgG2片段(SEQID NO:21)和猫科动物IgG1b片段(SEQ ID NO:20)的胰岛素-Fc融合蛋白类似地高产，具有低的聚集度(即，同型二聚体滴度大于50mg/L)和可感知的胰岛素受体亲和力(即，胰岛素受体IC50值小于5000nM)。然而，出乎意料的是，当胰岛素多肽被改变为SEQ ID NO:7时，包含猫科动物IgG2片段(SEQ ID NO:21)的胰岛素-Fc融合蛋白在猫中不具有生物活性(即，NAOC小于150％FBGL·天·kg/mg)，而包含猫科动物IgG1b片段(SEQ ID NO:20)的胰岛素-Fc融合蛋白表现出低聚集度(即，高的同型二聚体％)，高滴度的所需同型二聚体(即，同型二聚体滴度大于50mg/L)，以及在猫中可感知水平的长期降糖生物活性(即NAOC值大于150％FBGL·天·kg/mg)。因此，就猫特异性产物而言，当胰岛素多肽序列包含SEQ ID NO:7时，猫科动物IgG1b片段(SEQ ID NO:20)是优选的Fc片段。
鉴于犬科动物IgGB和猫科动物IgG1b同种型与其各自的物种特异性Fc(γ)受体以高于其犬科动物IgGA和猫科动物IgG2同种型对应物的亲和力相互作用，因此在重复注射后可能存在或者可能不存在不需要的免疫原性风险。用于减少Fc(γ)相互作用的一种方法涉及在宿主细胞中合成期间Fc片段的去糖基化或防止其糖基化。每个IgG片段在Fc区域的每个重链的CH2结构域中包含保守的天冬酰胺(N)-糖基化位点。在本文中，用于指代保守的N-糖基化位点的符号是“cNg”。从合成的胰岛素-Fc融合蛋白中去除附着的聚糖的一种方法是突变cNg位点，以防止在宿主细胞中生产期间聚糖附着在一起。在本文中，用于描述cNg突变的符号是cNg-(取代的氨基酸)。例如，如果cNg位点处的天冬酰胺被突变为丝氨酸，则该突变被命名为“cNg-S”。
cNg位点距胰岛素-Fc融合蛋白的B链的N末端的绝对位置根据胰岛素多肽的长度、接头的长度以及cNg位点前Fc片段中任何省略的氨基酸而变化。在本文中，用于表示给定胰岛素-Fc融合蛋白序列中cNg位点的绝对位置(如从胰岛素-Fc融合蛋白的B链的N末端开始计数所测量的)的符号是“NB(数字)”。例如，如果从B链的N末端开始计算，在第151个氨基酸位置处发现cNg位点，则该位点的绝对位置被称为cNg-NB151。作为进一步的示例，如果从B链的N末端开始计算，在第151个氨基酸位置处发现cNg位点，并且该位点处的天冬酰胺被突变为丝氨酸，则该突变被称为“cNg-NB151-S”。
在含有SEQ ID NO:5的胰岛素多肽和具有cNg-Q、cNg-S、cNg-D和cNg-K突变的犬科动物IgGB Fc片段的实施例中，出乎意料地发现仅含有cNg-K和cNg-S突变的化合物表现出大于50mg/L的必需的同型二聚体滴度和最低的Fc(γ)RI结合亲和力。在另一个方面中，在含有SEQ ID NO:8的胰岛素多肽和具有cNg-S突变的犬科动物IgGB Fc片段的实施例中，出乎意料地发现，与含有天然犬科动物IgGB Fc的对应物相比，所得的化合物在狗中的生物活性显著更低(即，对于含有天然糖基化位点氨基酸的对应物(例如cNg-N)，NAOC值显著更低)。当B16氨基酸被突变为丙氨酸时，在cNg-S突变体中生物活性出乎意料地恢复(即NAOC值显著增加)，如上文针对胰岛素多肽SEQ ID NO:11所描述的。总之，在cNg突变的选择和胰岛素多肽的组成之间存在出乎意料的和显著的相互作用，使得需要实验来鉴定优选的实施例。在具体实施例中，含有cNg-S突变的犬科动物IgGB Fc突变体是优选的，并且具有加下划线的cNg-S的序列如下所示：
DCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFSGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG(SEQ ID NO:22)
在具体的实施例中，含有cNg-S突变的猫科动物IgG1b Fc突变体是优选的：
DCPKCPPPEMLGGPSIFIFPPKPKDTLSISRTPEVTCLVVDLGPDDSDVQITWFVDNTQVYTAKTSPREEQFSSTYRVVSVLPILHQDWLKGKEFKCKVNSKSLPSPIERTISKDKGQPHEPQVYVLPPAQEELSRNKVSVTCLIEGFYPSDIAVEWEITGQPEPENNYRTTPPQLDSDGTYFLYSRLSVDRSRWQRGNTYTCSVSHEALHSHHTQKSLTQSPG(SEQ ID NO:23)
胰岛素-Fc融合蛋白
本文提供了胰岛素-Fc融合蛋白，其包含胰岛素多肽、Fc片段以及胰岛素多肽与Fc片段之间的接头。在实施例中，胰岛素多肽包含从N末端到C末端的以下取向的结构域：(N末端)--B链--C链--A链--(C末端)。在实施例中，胰岛素多肽位于Fc片段的N末端侧。在实施例中，如图1所示，融合蛋白包含从N末端到C末端的以下取向的结构域：(N末端)--胰岛素多肽--接头-Fc片段--(C末端)(例如，(N末端)--B链--C链--A链--接头--Fc片段--(C末端))。
在优选的实施例中，使用SEQ ID NO:14的优选接头，将SEQ ID NO:6的优选的非免疫原性、生物活性的胰岛素多肽与SEQ ID NO:16的优选的犬科动物IgGB Fc片段组合，以产生SEQ ID NO:24的高同型二聚体滴度产生的、非聚集的、生物活性的、非免疫原性的胰岛素-Fc融合蛋白的家族，其表现出大于50mg/L的同型二聚体滴度、在狗中大于150％FBGL·天·kg/mg的NAOC值、以及在狗中一系列重复注射中的第三次注射后大于0.5的NAOCR值。下面示出了SEQ ID NO:24，其中非天然氨基酸被加下划线：
FVNQHLCGSX1 LVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCX2 STCSLDQLENYCX3 GGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFNGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG(SEQ ID NO:24)
其中X1不是D，X2不是H，并且X3不存在或者是N。
在包含SEQ ID NO:24的优选实施例中，X1是H，X2是T，并且X3不存在或者是N。所述选择产生SEQ ID NO:25的高同型二聚体滴度产生的、非聚集的、生物活性的、非免疫原性的胰岛素-Fc融合蛋白，其表现出大于50mg/L的同型二聚体滴度、在狗中大于150％FBGL·天·kg/mg的NAOC值，以及在狗中一系列重复注射的第三次注射之后大于0.5的NAOCR值。以下示出了SEQ ID NO:25，其中非天然氨基酸被加下划线：
FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLDQLENYCX3 GGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFNGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG(SEQ ID NO:25)
X3不存在或者是N。
在优选的实施例中，在SEQ ID NO:25中X3不存在，以产生SEQ ID NO:32的高同型二聚体产生的、非聚集的、生物活性的、非免疫原性的胰岛素-Fc融合蛋白，其表现出大于50mg/L的同型二聚体滴度、在狗中大于150％FBGL·天·kg/mg的NAOC值、以及在狗中一系列重复注射的第三次注射后大于0.5的NAOCR值。以下示出了SEQ ID NO:32，其中非天然氨基酸被加下划线：
FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLDQLENYCGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFNGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG(SEQ ID NO:32)
在优选的实施例中，在SEQ ID NO:25中X3为N，以产生SEQ ID NO:34的高同型二聚体滴度产生的、非聚集的、生物活性的、非免疫原性的胰岛素-Fc融合蛋白，其表现出大于50mg/L的同型二聚体滴度、在狗中大于150％FBGL·天·kg/mg的NAOC值、以及在狗中一系列重复注射的第三次注射后大于0.5的NAOCR值。以下示出了SEQ ID NO:34，其中非天然氨基酸被加下划线：
FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLDQLENYCNGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFNGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG(SEQ ID NO:34)
在优选的实施例中，使用SEQ ID NO:14的优选接头，将SEQ ID NO:22的优选的非糖基化cNg-S突变的犬科动物IgGB Fc片段与SEQ ID NO:10的优选的B16A突变的胰岛素多肽序列组合，以产生SEQ ID NO:26的高同型二聚体滴度产生的、非聚集的、生物活性的、非免疫原性的胰岛素-Fc融合蛋白的家族，其表现出大于50mg/L的同型二聚体滴度、在狗中大于150％FBGL·天·kg/mg的NAOC值、以及在狗中一系列重复注射的第三次注射后大于0.5的NAOCR值。以下示出了SEQ ID NO:26，其中非天然氨基酸被加下划线：
FVNQHLCGSX1 LVEALALVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCX2 STCSLDQLENYCGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFSGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG(SEQ ID NO:26)
其中X1不是D，并且X2不是H。
在一个优选的实施例中，在SEQ ID NO:26中X1是H，并且X2是T，以产生SEQ ID NO:36的高同型二聚体滴度产生的、非聚集的、生物活性的、非免疫原性的胰岛素-Fc融合蛋白，其表现出大于50mg/L的同型二聚体滴度、在狗中大于150％FBGL·天·kg/mg的NAOC值、以及在狗中一系列重复注射中第三次注射后大于0.5的NAOCR值。以下示出了SEQ ID NO:36，其中非天然氨基酸被加下划线：
FVNQHLCGSHLVEALALVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLDQLENYCGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFSGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG(SEQ ID NO:36)
在优选的实施例中，使用SEQ ID NO:14的优选接头，将SEQ ID NO:6的优选的非免疫原性的、生物活性的胰岛素多肽(其中X3不存在)与SEQ ID NO:20的优选的猫科动物IgG1b Fc片段组合，以产生SEQ ID NO:27的高同型二聚体滴度产生的、非聚集的、生物活性、非免疫原性的胰岛素-Fc融合蛋白家族，其表现出大于50mg/L的同型二聚体滴度、在猫中大于150％FBGL·天·kg/mg的NAOC值、以及在猫中一系列重复注射中第三次注射后大于0.5的NAOCR值。以下示出了SEQ ID NO:27，其中非天然氨基酸被加下划线：
FVNQHLCGSX1 LVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCX2 STCSLDQLENYCGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGDCPKCPPPEMLGGPSIFIFPPKPKDTLSISRTPEVTCLVVDLGPDDSDVQITWFVDNTQVYTAKTSPREEQFNSTYRVVSVLPILHQDWLKGKEFKCKVNSKSLPSPIERTISKDKGQPHEPQVYVLPPAQEELSRNKVSVTCLIEGFYPSDIAVEWEITGQPEPENNYRTTPPQLDSDGTYFLYSRLSVDRSRWQRGNTYTCSVSHEALHSHHTQKSLTQSPG(SEQ ID NO:27)
其中X1不是D，并且X2不是H。
在一个优选实施例中，在SEQ ID NO:27中X1是H，并且X2是T，以产生SEQ ID NO:38的高同型二聚体滴度产生的、非聚集的、生物活性的、非免疫原性的胰岛素-Fc融合蛋白，其表现出大于50mg/L的同型二聚体滴度、在猫中大于150％FBGL·天·kg/mg的NAOC值、以及在猫中一系列重复注射中第三次注射后大于0.5的NAOCR值。以下示出了SEQ ID NO:38，其中非天然氨基酸被加下划线：
FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLDQLENYCGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGDCPKCPPPEMLGGPSIFIFPPKPKDTLSISRTPEVTCLVVDLGPDDSDVQITWFVDNTQVYTAKTSPREEQFNSTYRVVSVLPILHQDWLKGKEFKCKVNSKSLPSPIERTISKDKGQPHEPQVYVLPPAQEELSRNKVSVTCLIEGFYPSDIAVEWEITGQPEPENNYRTTPPQLDSDGTYFLYSRLSVDRSRWQRGNTYTCSVSHEALHSHHTQKSLTQSPG(SEQ ID NO:38)
在优选的实施例中，使用SEQ ID NO:14的优选接头，将SEQ ID NO:23的优选的非糖基化的cNg-S突变的猫科动物IgG1b Fc片段与SEQ ID NO:10的优选的B16A突变的胰岛素多肽序列组合，以产生SEQ ID NO:28的高同型二聚体滴度产生的、非聚集的、生物活性的、非免疫原性的胰岛素-Fc融合蛋白的家族，其表现出大于50mg/L的同型二聚体滴度、在猫中大于150％FBGL·天·kg/mg的NAOC值、以及在猫中一系列重复注射中第三次注射后大于0.5的NAOCR值。以下示出了SEQ ID NO:28，其中非天然氨基酸被加下划线：
FVNQHLCGSX1 LVEALALVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCX2 STCSLDQLENYCGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGDCPKCPPPEMLGGPSIFIFPPKPKDTLSISRTPEVTCLVVDLGPDDSDVQITWFVDNTQVYTAKTSPREEQFSSTYRVVSVLPILHQDWLKGKEFKCKVNSKSLPSPIERTISKDKGQPHEPQVYVLPPAQEELSRNKVSVTCLIEGFYPSDIAVEWEITGQPEPENNYRTTPPQLDSDGTYFLYSRLSVDRSRWQRGNTYTCSVSHEALHSHHTQKSLTQSPG(SEQ ID NO:28)
其中X1不是D，并且X2不是H。
在一个优选的实施例中，在SEQ ID NO:28中X1是H，并且X2是T，以产生SEQ ID NO:40的高同型二聚体滴度产生的、非聚集的、生物活性的、非免疫原性的胰岛素-Fc融合蛋白，其表现出大于50mg/L的同型二聚体滴度、在猫中大于150％FBGL·天·kg/mg的NAOC值、以及在猫中一系列重复注射中第三次注射后大于0.5的NAOCR值。以下示出了SEQ ID NO:40，其中非天然氨基酸被加下划线：
FVNQHLCGSHLVEALALVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLDQLENYCGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGDCPKCPPPEMLGGPSIFIFPPKPKDTLSISRTPEVTCLVVDLGPDDSDVQITWFVDNTQVYTAKTSPREEQFSSTYRVVSVLPILHQDWLKGKEFKCKVNSKSLPSPIERTISKDKGQPHEPQVYVLPPAQEELSRNKVSVTCLIEGFYPSDIAVEWEITGQPEPENNYRTTPPQLDSDGTYFLYSRLSVDRSRWQRGNTYTCSVSHEALHSHHTQKSLTQSPG(SEQ ID NO:40)
在一些实施例中，本文所述的胰岛素-Fc融合蛋白在N末端不包括前导氨基酸序列。
在其他实施例中，本文所述的胰岛素-Fc融合蛋白包括前导序列，例如在N末端。示例性的前导序列包括氨基酸序列MEWSWVFLFFLSVTTGVHS(SEQ ID NO:30)。在一些实施例中，本文所述的胰岛素-Fc融合蛋白由包含前导序列的核酸分子编码，例如，用于在细胞(例如，真核细胞，例如，哺乳动物细胞)中表达(例如，重组表达)。在某些实施例中，例如在细胞培养物中，在表达期间切割掉前导序列。编码前导序列的示例性核酸序列包括以下核酸序列：
atggaatggagctgggtctttctcttcttcctgtcagtaacgactggtgtccactcc(SEQ ID NO:29)。
本文还公开了编码SEQ ID NO:032、034、036、038和040的胰岛素-Fc融合蛋白的核酸序列(例如cDNA)。
在包含SEQ ID NO:32的胰岛素-Fc融合蛋白的实施例中，核酸序列(前导序列被加下划线)为：
atggaatggagctgggtctttctcttcttcctgtcagtaacgactggtgtccactccttcgtgaaccagcacctgtgcggctcccacctggtggaagctctggaactcgtgtgcggcgagcggggcttccactacgggggtggcggaggaggttctggtggcggcggaggcatcgtggaacagtgctgcacctccacctgctccctggaccagctggaaaactactgcggtggcggaggtggtcaaggaggcggtggacagggtggaggtgggcagggaggaggcgggggagactgccccaagtgccccgctcccgagatgctgggcggacccagcgtgttcatcttccctcccaagcccaaggacacactgctgatcgccaggaccccggaggtgacctgcgtggtggtggacctggatcccgaagaccccgaggtgcagatcagctggttcgtggatggaaagcagatgcagaccgccaagacccaaccccgggaagagcagttcaacggcacctacagggtggtgagtgtgttgcccatcggccaccaggactggctgaaggggaagcaattcacatgcaaggttaataacaaggccctgcccagccccatcgagaggaccatcagcaaggccaggggccaggcccaccagccatctgtgtacgtgctgcccccatctagggaggaactgagcaagaacacagtcagccttacttgcctgatcaaggacttcttcccaccggacatagacgtggagtggcagagtaacggccagcaggagcccgagagcaagtataggaccacaccgccccaactggacgaggacggaagctacttcctctacagcaaattgagcgttgacaaaagcaggtggcagcgaggcgacaccttcatctgcgccgtgatgcacgaggctttgcataaccactacacccaggagagcctgtcccacagccccggatag(SEQ ID NO:31)。
在包含SEQ ID NO:34的胰岛素-Fc融合蛋白的实施例中，核酸序列(前导序列被加下划线)为：
atggaatggagctgggtctttctcttcttcctgtcagtaacgactggtgtccactccttcgtgaaccagcacctgtgcggctcccacctggtggaagctctggaactcgtgtgcggcgagcggggcttccactacgggggtggcggaggaggttctggtggcggcggaggcatcgtggaacagtgctgcacctccacctgctccctggaccagctggaaaactactgcaacggtggcggaggtggtcaaggaggcggtggacagggtggaggtgggcagggaggaggcgggggagactgccccaagtgccccgctcccgagatgctgggcggacccagcgtgttcatcttccctcccaagcccaaggacacactgctgatcgccaggaccccggaggtgacctgcgtggtggtggacctggatcccgaagaccccgaggtgcagatcagctggttcgtggatggaaagcagatgcagaccgccaagacccaaccccgggaagagcagttcaacggcacctacagggtggtgagtgtgttgcccatcggccaccaggactggctgaaggggaagcaattcacatgcaaggttaataacaaggccctgcccagccccatcgagaggaccatcagcaaggccaggggccaggcccaccagccatctgtgtacgtgctgcccccatctagggaggaactgagcaagaacacagtcagccttacttgcctgatcaaggacttcttcccaccggacatagacgtggagtggcagagtaacggccagcaggagcccgagagcaagtataggaccacaccgccccaactggacgaggacggaagctacttcctctacagcaaattgagcgttgacaaaagcaggtggcagcgaggcgacaccttcatctgcgccgtgatgcacgaggctttgcataaccactacacccaggagagcctgtcccacagccccggatag(SEQ ID NO:33)。
在包含SEQ ID NO:36的胰岛素-Fc融合蛋白的实施例中，核酸序列(前导序列被加下划线)为：
atggaatggagctgggtctttctcttcttcctgtcagtaacgactggtgtccactccttcgtgaaccagcacctgtgcggctcccacctggtggaagctctggcactcgtgtgcggcgagcggggcttccactacgggggtggcggaggaggttctggtggcggcggaggcatcgtggaacagtgctgcacctccacctgctccctggaccagctggaaaactactgcggtggcggaggtggtcaaggaggcggtggacagggtggaggtgggcagggaggaggcgggggagactgccccaagtgccccgctcccgagatgctgggcggacccagcgtgttcatcttccctcccaagcccaaggacacactgctgatcgccaggaccccggaggtgacctgcgtggtggtggacctggatcccgaagaccccgaggtgcagatcagctggttcgtggatggaaagcagatgcagaccgccaagacccaaccccgggaagagcagttctcaggcacctacagggtggtgagtgtgttgcccatcggccaccaggactggctgaaggggaagcaattcacatgcaaggttaataacaaggccctgcccagccccatcgagaggaccatcagcaaggccaggggccaggcccaccagccatctgtgtacgtgctgcccccatctagggaggaactgagcaagaacacagtcagccttacttgcctgatcaaggacttcttcccaccggacatagacgtggagtggcagagtaacggccagcaggagcccgagagcaagtataggaccacaccgccccaactggacgaggacggaagctacttcctctacagcaaattgagcgttgacaaaagcaggtggcagcgaggcgacaccttcatctgcgccgtgatgcacgaggctttgcataaccactacacccaggagagcctgtcccacagccccggatag(SEQ ID NO:35)。
在包含SEQ ID NO:38的胰岛素-Fc融合蛋白的实施例中，核酸序列(前导序列被加下划线)为：
atggaatggagctgggtctttctcttcttcctgtcagtaacgactggtgtccactccttcgtgaaccagcacctgtgcggctcccacctggtggaagctctggaactcgtgtgcggcgagcggggcttccactacgggggtggcggaggaggttctggtggcggcggaggcatcgtggaacagtgctgcacctccacctgctccctggaccagctggaaaactactgcggtggcggaggtggtcaaggaggcggtggacagggtggaggtgggcagggaggaggcgggggagactgccccaaatgtcctccgcctgagatgctgggtggccctagcatcttcatcttcccgcccaagcccaaggatactctgtccattagcaggacccccgaggtgacctgcctggtggtggacctggggccagacgactctgacgtgcagatcacctggttcgtagacaacacccaggtttacactgccaagaccagtcccagggaggagcagttcaacagcacatacagggtggtgagcgttctgcccatcctgcaccaggactggctgaaaggcaaagagttcaagtgtaaggtgaacagcaagagcctgcccagccccattgaaaggaccatcagcaaggacaagggccagccgcacgagccccaagtctacgtgctgcccccagcacaggaagagctgagcaggaacaaggttagcgtgacatgcctgatcgagggtttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggaaatcaccggccaacccgagcccgagaacaactacaggaccactccgccgcaactggacagcgacgggacctacttcttgtatagcaggctgagcgtggaccggagcaggtggcagaggggcaacacctacacttgcagcgtgagccacgaggccttgcacagccaccacactcagaagagtctgacccagagcccgggatag(SEQ ID NO:37)。
在包含SEQ ID NO:40的胰岛素-Fc融合蛋白的实施例中，核酸序列(前导序列被加下划线)为：
atggaatggagctgggtctttctcttcttcctgtcagtaacgactggtgtccactccttcgtgaaccagcacctgtgcggctcccacctggtggaagctctggcactcgtgtgcggcgagcggggcttccactacgggggtggcggaggaggttctggtggcggcggaggcatcgtggaacagtgctgcacctccacctgctccctggaccagctggaaaactactgcggtggcggaggtggtcaaggaggcggtggacagggtggaggtgggcagggaggaggcgggggagactgccccaaatgtcctccgcctgagatgctgggtggccctagcatcttcatcttcccgcccaagcccaaggatactctgtccattagcaggacccccgaggtgacctgcctggtggtggacctggggccagacgactctgacgtgcagatcacctggttcgtagacaacacccaggtttacactgccaagaccagtcccagggaggagcagttcagcagcacatacagggtggtgagcgttctgcccatcctgcaccaggactggctgaaaggcaaagagttcaagtgtaaggtgaacagcaagagcctgcccagccccattgaaaggaccatcagcaaggacaagggccagccgcacgagccccaagtctacgtgctgcccccagcacaggaagagctgagcaggaacaaggttagcgtgacatgcctgatcgagggtttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggaaatcaccggccaacccgagcccgagaacaactacaggaccactccgccgcaactggacagcgacgggacctacttcttgtatagcaggctgagcgtggaccggagcaggtggcagaggggcaacacctacacttgcagcgtgagccacgaggccttgcacagccaccacactcagaagagtctgacccagagcccgggatag(SEQ ID NO:39)。
胰岛素-Fc融合蛋白的生产
在实施例中，融合蛋白可以由细胞表达，如在实例部分中更详细描述。
表达与纯化
在实施例中，胰岛素-Fc融合蛋白可以例如在真核细胞(例如哺乳动物细胞或非哺乳动物细胞)中重组表达。用于表达的示例性的哺乳动物细胞包括HEK细胞(例如，HEK293细胞)或CHO细胞。可以将CHO细胞细分为各种菌株或亚类(例如CHO DG44、CHO-M和CHO-K1)，并且可以对这些细胞菌株中的一些进行遗传工程改造以最佳地用于特定类型的核酸分子(例如，包含DNA的载体)或特定的细胞生长培养基组合物，如实例部分中所描述的。在实施例中，用编码胰岛素-Fc融合蛋白的核酸分子(例如载体)转染细胞(例如，其中整个胰岛素-Fc融合蛋白由单个核酸分子编码)。在实施例中，HEK293细胞用编码胰岛素-Fc融合蛋白的载体转染，但仅导致胰岛素-Fc融合蛋白在宿主细胞停止表达可观水平的胰岛素-Fc融合蛋白(即瞬时转染)之前的一段时间(例如，3天、4天、5天、7天、10天、12天、14天或更长时间)内的暂时表达。用编码胰岛素-Fc融合蛋白的核酸序列瞬时转染的HEK293细胞通常允许更快速地产生重组蛋白，这有助于制备和筛选多种胰岛素-Fc融合蛋白候选物。在实施例中，用永久掺入到宿主细胞DNA中并导致胰岛素-Fc融合蛋白的一致和永久表达(即稳定转染)的载体转染CHO细胞，只要细胞被适当培养。用编码胰岛素-Fc融合蛋白的核酸稳定地转染的CHO细胞和CHO细胞系通常需要更长的时间来发育，但是它们通常产生更高的蛋白质产量，并且更适合于制造低成本产品(例如用于兽医药物市场的产品)。可以使用本领域的标准方法培养细胞和细胞系。在优选的实施例中，包含具有SEQ ID NO:31、33、35、37和39的cDNA序列中的任何一种的HEK细胞用于表达胰岛素-Fc融合蛋白。在优选的实施例中，包含具有SEQ IDNO:31、33、35、37和39的cDNA序列中的任何一种的CHO细胞用于表达胰岛素-Fc融合蛋白。
在一些实施例中，从细胞中纯化或分离胰岛素-Fc融合蛋白(例如，通过裂解细胞)。在其他实施例中，胰岛素-Fc融合蛋白由细胞分泌，并从细胞在其中生长的细胞培养基中纯化或分离。胰岛素-Fc融合蛋白的纯化可以包括使用柱色谱法(例如亲和色谱法)或基于大小、电荷和/或对某些分子的亲和力的差异使用其他分离方法。在实施例中，胰岛素-Fc融合蛋白的纯化涉及选择或富集含有Fc片段的蛋白质，例如，通过使用蛋白A珠或蛋白A柱，其使含有Fc片段的蛋白质变得在中性溶液pH下以高亲和力结合到共价缀合到蛋白A珠的蛋白A上。然后，结合的胰岛素-Fc融合蛋白可以通过溶液变量的变化(例如，溶液pH的降低)从蛋白A珠中洗脱。可以可替代地或另外地使用其他分离方法，诸如离子交换色谱法和/或凝胶过滤色谱法。在实施例中，胰岛素-Fc融合蛋白的纯化进一步包含过滤或离心蛋白质制剂。在实施例中，胰岛素-Fc融合蛋白的进一步纯化包含透析过滤、超滤和通过各种尺寸的多孔膜的过滤，以及具有赋形剂的最终制剂。
纯化的胰岛素-Fc融合蛋白可以使用多种方法表征，例如纯度、蛋白质产量、结构和/或活性，例如280nm吸光度(例如，以确定蛋白质产量)、尺寸排阻或毛细管电泳(例如，以确定分子量、聚集百分比和/或纯度)、质谱(MS)和/或液相色谱法(LC-MS)(例如，以确定纯度和/或糖基化)和/或ELISA(例如，以确定与抗胰岛素抗体的结合程度，例如亲和力)。示例性的表征方法也在实例部分中描述。
在实施例中，胰岛素-Fc融合蛋白在瞬时转染的HEK细胞中生产和蛋白A纯化后的蛋白质产量大于5mg/L、10mg/L或20mg/L。在优选的实施例中，胰岛素-Fc融合蛋白在瞬时转染的HEK细胞中生产和蛋白A纯化后的蛋白质产量大于50mg/L(例如，大于60mg/L、大于70mg/L、大于80mg/L、大于90mg/L、大于100mg/L)。在实施例中，胰岛素-Fc融合蛋白在瞬时转染的HEK细胞中生产和蛋白A纯化后的同型二聚体％大于70％(例如，大于80％、大于85％、大于90％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％、大于99％)。在实施例中，胰岛素-Fc融合蛋白在瞬时转染的HEK细胞中生产和蛋白A纯化后的同型二聚体滴度(其被计算为胰岛素-Fc融合蛋白产量与同型二聚体％之间的乘积)大于50mg/L(例如，大于60mg/L、大于70mg/L、大于80mg/L、大于90mg/L、大于100mg/L)。仅具有大于50mg/L的同型二聚体滴度的候选物被认为可用于本发明，因为经验已经证明，低于该水平的同型二聚体滴度将不太可能在CHO细胞中产生符合兽医产品严格的低制造成本要求的商业生产滴度。
在实施例中，胰岛素-Fc融合蛋白在稳定转染的CHO细胞(例如，CHO细胞系或CHO细胞克隆)中生产和蛋白A纯化后的蛋白质产量大于100mg胰岛素-Fc融合蛋白/L(例如，mg/L培养基)。在优选的实施例中，胰岛素-Fc融合蛋白在稳定转染的CHO细胞(例如CHO细胞系或CHO细胞克隆)中生产和蛋白A纯化后的蛋白质产量大于150mg胰岛素-Fc融合蛋白/L培养基(例如，大于200mg/L、大于300mg/L、大于400mg/L、大于500mg/L、大于600mg/L或更大)。在实施例中，胰岛素-Fc融合蛋白在稳定转染的CHO细胞(例如，CHO细胞系或CHO细胞克隆)中生产和蛋白A纯化后的同型二聚体％大于70％(例如，大于80％、大于85％、大于90％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％、大于99％)。在实施例中，胰岛素-Fc融合蛋白在稳定转染的CHO细胞(例如CHO细胞系或CHO细胞克隆)中生产和蛋白A纯化后的同型二聚体滴度(被计算为胰岛素-Fc融合蛋白产量与同型二聚体％之间的乘积)大于150mg/L(例如，大于200mg/L、大于300mg/L、大于400mg/L、大于500mg/L、大于600mg/L或更大)。
胰岛素-Fc融合蛋白的功能特征
本文描述了用于与胰岛素受体相互作用以降低伴侣动物(例如，狗或猫)中的血糖的方法，其中所述方法包含向受试者施用胰岛素-Fc融合蛋白，例如本文所述的融合蛋白。在一些实施例中，受试者已被诊断患有糖尿病(例如，犬科动物糖尿病或猫科动物糖尿病)。
在实施例中，本文所述的胰岛素-Fc融合蛋白以可观的亲和力结合至胰岛素受体，所述亲和力如在实例7所述的4℃IM-9胰岛素受体结合测定中由IC50所测量的(例如IC50小于5000nM，IC50小于4000nM，IC50小于3000nM，IC50小于2500nM)。根据经验，仅表现出小于5000nM的胰岛素受体活性IC50值的化合物被认为可能在目标物种中表现出生物活性。通常，较高亲和力的胰岛素受体结合(即较低的IC50值)是优选的。然而，众所周知，胰岛素和胰岛素类似物(例如，本文所述的胰岛素多肽)的清除主要通过与胰岛素受体结合，随后在细胞内胰岛素受体内化和降解来控制。因此，胰岛素受体结合亲和力过高(即IC50过低)的胰岛素-Fc融合蛋白可能从循环中过快清除，导致低于目标动物中降糖生物活性的期望的持续时间。
在实施例中，本文所述的胰岛素-Fc融合蛋白在受试者中施用后能够降低葡萄糖水平(例如，血糖水平)。在实施例中，胰岛素-Fc融合蛋白的降糖活性大于胰岛素参考标准品的降糖活性。在一些实施例中，胰岛素-Fc融合蛋白的活性持续时间可以通过空腹血糖相对于给药前空腹血糖水平的降低(例如，统计学显著的降低)来测量。在实施例中，胰岛素-Fc融合蛋白的活性持续时间(例如，受试者中空腹血糖水平相对于给药前水平存在统计学上显著降低的时间)长于约2小时。在实施例中，胰岛素-Fc融合蛋白的活性持续时间(例如，受试者中血糖水平相对于给药前水平存在统计学上显著降低的时间)长于约6小时、9小时、12小时、18小时、1天、1.5天、2天、2.5天、3天、4天、5天、6天、7天或更长。在实施例中，胰岛素-Fc融合蛋白是长效的(例如，在血清中具有长的半衰期)。
在实施例中，胰岛素-Fc融合蛋白在目标动物(例如，狗或猫)中的血清半衰期长于胰岛素参考标准品或对照制剂的血清半衰期。在实施例中，胰岛素-Fc融合蛋白(例如，在施用时在受试者的血液中)在目标动物(例如，狗或猫)中的血清半衰期长于约2小时。在实施例中，胰岛素-Fc融合蛋白在目标动物(例如，狗或猫)中的血清半衰期为约0.5天、1天、2天或2.5天。在优选的实施例中，胰岛素-Fc融合蛋白在目标动物(例如，狗或猫)中的血清半衰期为约3天或更长。
在实施例中，生物活性的效力和持续时间的组合可以通过计算归一化为给定剂量的空腹血糖百分比(％FBGL)曲线上的面积来量化，单位为mg/kg(NAOC)，其中单位为％FBGL·天·kg/mg。在实施例中，胰岛素-Fc融合蛋白的NAOC大于150％FBGL·天·kg/mg(例如，大于200％FBGL·天·kg/mg、大于250％FBGL·天·kg/mg或更大)。同样，根据经验，在NAOC值大于150％FBGL·天·kg/mg时，目标物种中的剂量要求将足够低，以便达到可接受的治疗成本。在实施例中，胰岛素-Fc融合蛋白的NAOC必须在目标物种中重复给药后保持(即，胰岛素-Fc融合蛋白的第三次施用后的NAOC与第一次施用后的NAOC的比率大于0.50(例如，大于0.60、大于0.70、大于0.80、大于0.90或更大))。
在一些实施例中，本文所述的胰岛素-Fc融合蛋白以低于胰岛素-Fc融合蛋白参考标准品的亲和力结合至Fc(γ)受体，如根据实例8所测量的。在一些实施例中，胰岛素-Fc融合蛋白的Fc(γ)受体亲和力与胰岛素-Fc融合蛋白参考标准品的Fc(γ)受体亲和力的比率小于0.50(例如，小于0.40、小于0.30、小于0.20)。
治疗的方法和受试者选择的特点
本文描述了用于治疗糖尿病(例如，犬科动物糖尿病或猫科动物糖尿病)的方法，所述方法包含向受试者施用胰岛素-Fc融合蛋白(例如，本文描述的胰岛素-Fc融合蛋白)。
在实施例中，在本文所述的任何方法中使用的参考标准品包含参考治疗或参考疗法。在一些实施例中，所述参考包含用于糖尿病治疗的护理剂的标准品(例如，用于犬科动物糖尿病的护理剂的标准品或用于猫科动物糖尿病的护理剂的标准品)。在一些实施例中，参考标准品是市售的胰岛素或胰岛素类似物。在一些实施例中，参考标准品包含长效胰岛素、中效胰岛素、短效胰岛素、速效胰岛素、短效胰岛素、中效胰岛素、长效胰岛素。在一些实施例中，参考标准品包含
Figure BDA0002955236580000421
NPH胰岛素、甘精胰岛素
Figure BDA0002955236580000422
或重组人胰岛素。
在实施例中，在本文所述的任何方法中使用的参考标准品包括糖尿病疗法(例如犬科动物糖尿病疗法或猫科动物糖尿病疗法)的结果，例如本文所述的结果。
在实施例中，参考标准品是在开始疗法(例如本文所述的胰岛素-Fc融合蛋白疗法)之前受试者中标记物(例如血糖或果糖胺)的水平；其中受试者患有糖尿病。在实施例中，在疗法开始前，伴侣动物(例如狗或猫)中的血糖水平大于200mg/dL(例如大于250mg/dL、300mg/dL、350mg/dL、400mg/dL或更大)。在实施例中，在疗法开始之前，伴侣动物(例如狗或猫)中的果糖胺水平大于250微摩尔/升、350微摩尔/升(例如大于400微摩尔/升、450微摩尔/升、500微摩尔/升、550微摩尔/升、600微摩尔/升、650微摩尔/升、700微摩尔/升、750微摩尔/升或更高)。在实施例中，参考标准品是疾病的存在或进展或严重性的量度。在实施例中，参考标准品是在开始疗法(例如本文所述的胰岛素-Fc融合蛋白疗法，例如其中受试者患有糖尿病)之前疾病症状的存在或严重性的量度。
药物组合物和施用途径
本文提供了包含本文所述的胰岛素-Fc融合蛋白的药物组合物，其可以用于降低伴侣动物(例如狗或猫)中的血糖。药物组合物中胰岛素-Fc融合蛋白的量和浓度以及向受试者施用的药物组合物的量可以基于临床相关因素来选择，所述临床相关因素为诸如受试者的医学相关特征(例如，年龄、体重、性别、其他医学状况等)、化合物在药物组合物中的溶解度、化合物的效力和活性以及药物组合物的施用方式。关于施用途径和剂量方案的进一步的信息，读者可参考Comprehensive Medicinal Chemistry的第5卷中的第25.3章(Corwin Hansch；Chairman of Editorial Board),Pergamon Press 1990。
本公开的制剂包括适合于肠胃外施用的那些制剂。如本文所使用的，短语“肠胃外施用(parenteral administration和administered parenterally)”是指除了肠内和局部施用之外的施用模式，通常通过静脉内或皮下注射。
可以用于本公开的药物组合物中的合适的水性载体和非水性载体的示例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油(诸如橄榄油)和可注射的有机酯(诸如油酸乙酯)。例如，通过使用包衣材料诸如卵磷脂，通过在分散体的情况下保持所需的颗粒尺寸，以及通过使用表面活性剂例如吐温样表面活性剂，可以保持适当的流动性。在一些实施例中，药物组合物(例如，如本文所述)包含吐温样表面活性剂，例如聚山梨酯-20、吐温-20或吐温-80。在一些实施例中，药物组合物(例如，如本文所述)包含吐温样表面活性剂，例如吐温-80，其浓度在约0.001％与约2％之间，或在约0.005％与约0.1％之间，或在约0.01％与约0.5％之间。
在一些实施例中，水性载体中胰岛素-Fc融合蛋白的浓度为约3mg/mL。在一些实施例中，水性载体中胰岛素-Fc融合蛋白的浓度为约6mg/mL。在一些实施例中，水性载体中胰岛素-Fc融合蛋白的浓度为约8mg/mL、9mg/mL、10mg/mL、12mg/mL、15mg/mL或更大。
在一些实施例中，胰岛素-Fc融合蛋白以丸剂、输注或静脉推注的形式施用。在一些实施例中，通过注射器注射、泵、笔、针或留置导管来施用融合蛋白。在一些实施例中，胰岛素-Fc融合蛋白通过皮下丸剂注射施用。引入的方法也可以通过可再充电的或可生物降解的装置提供。近年来，已经开发并在体内测试了多种缓释聚合物装置，用于药物(包括蛋白质类生物药物)的受控递送。多种生物相容性聚合物(包括水凝胶)，包括可生物降解的和不可降解的聚合物，可以用于形成植入物，以用于在特定靶位点处持续释放化合物。
剂量
可以改变胰岛素-Fc融合蛋白的实际剂量水平，以便获得有效实现特定受试者(例如狗或猫)所需的治疗应答的活性成分的量。所选择的剂量水平将取决于多种因素，包括所使用的特定融合蛋白或其酯、盐或酰胺的活性、施用途径、施用时间、所使用的特定化合物的排泄速率、治疗的持续时间、与所使用的特定融合蛋白组合使用的其他药物、化合物和/或材料、所治疗的受试者的年龄、性别、体重、病症、一般健康状况和既往病史以及医学领域熟知的类似因素。
通常，胰岛素-Fc融合蛋白的合适剂量将是有效产生治疗效果的最低剂量。这种有效剂量通常将取决于上述因素。通常，用于狗或猫的胰岛素-Fc融合蛋白的静脉内和皮下剂量将在约0.001至约1mg每千克(例如，mg/kg)体重/天，例如约0.001至1mg/kg/天、约0.01至0.1mg/kg/天、约0.1至1mg/kg/天或约0.01至1mg/kg/天的范围内。在其他实施例中，融合蛋白以0.025至4mg/kg体重/周，例如0.025至0.5mg/kg/周的剂量施用。
本公开预期在任何前述药物组合物和制剂中配制胰岛素-Fc融合蛋白。此外，本公开预期通过任何前述施用途径施用。本领域技术人员可以根据所治疗的病症和所治疗的患者的总体健康状况、年龄和体型来选择合适的制剂和施用途径。
实例
通以下实例来进一步说明本技术，这些实例不应被理解为以任何方式进行限制。
一般方法、测定和材料
实例1：胰岛素-Fc融合蛋白在HEK293细胞中的合成和制备方法
胰岛素-Fc融合蛋白如下合成。使用专有软件(LakePharma,Belmont,CA)构建了目标基因序列，并将其克隆到高表达哺乳动物载体中。转染前24小时将HEK293细胞接种在摇瓶中，并使用无血清的化学定义的培养基生长。使用用于瞬时转染的(LakePharma,Belmont,CA)标准操作程序，将编码目标胰岛素-Fc融合蛋白的DNA表达构建体瞬时转染到HEK293细胞的悬浮液中。20小时后，计数细胞以确定存活率和活细胞计数，并通过
Figure BDA0002955236580000441
(Pall FortéBio LLC,Fremont,CA)来测量滴度。在整个瞬时转染生产运行中获取了额外的读数。培养物在第5天或第5天之后收获。
实例2：胰岛素-Fc融合蛋白在CHO细胞中的合成和制备方法
CHO细胞系最初来源于CHO-K1(LakePharma,Belmont,CA)，并且使用本领域中已知的方法通过重组技术来敲除内源性谷氨酰胺合成酶(GS)基因。针对CHO表达和GS选择设计并优化了稳定的表达DNA载体，并将其整合到高表达哺乳动物载体(LakePharma,Belmont,CA)中。在开始放大实验之前，确认了每种完整构建体的序列。在37℃下在加湿的5％CO2培养箱中，在化学定义的培养基(CD OptiCHO；Invitrogen,Carlsbad,CA)中培养悬浮适应的CHO细胞。在培养CHO细胞时未使用血清或其他动物来源的产物。
在指数生长期生长在CD OptiCHO培养基中的约8000万个悬浮适应的CHO细胞通过电穿孔使用
Figure BDA0002955236580000451
system(MaxCyte,Inc.,Gaithersburg,MD)用80μg的DNA转染，从而为每种胰岛素-Fc融合蛋白建立稳定的CHO细胞系(DNA构建体包含胰岛素-Fc融合蛋白的全长序列)。24小时后，计数转染的细胞，并置于筛选条件下，以用于胰岛素-Fc融合基因的稳定整合。将转染的细胞在摇瓶中以0.5×106个细胞/mL的细胞密度接种到CD OptiCHO选择培养基(该培养基含有0-100μM的甲硫氨酸亚砜胺(MSX))中，并在37℃下在5％CO2的情况下孵育。在选择过程期间，每2-3天将细胞向下旋转并重新悬浮在新鲜的选择培养基中，直到CHO稳定池恢复其生长速率和存活率。监测细胞培养物的生长和滴度。
细胞生长至2.5×106个细胞/mL。在细胞库收获时，存活率高于95％。然后对细胞进行离心，并且将细胞沉淀重新悬浮在含7.5％二甲基亚砜(DMSO)的CD OptiCHO培养基中，使细胞计数达到15×106个细胞/mL/小瓶。将小瓶冷冻保存，用于储存在液氮中。
如下使用CHO细胞进行小规模放大生产。在包含100μM MSX的CD OptiCHO生长培养基中在37℃下按比例放大细胞以用于生产，并根据需要每2-4天喂养一次，其中CD OptiCHO生长培养基根据需要补充有葡萄糖和另外的氨基酸约14-21天。通过离心旋转来澄清从稳定池生产运行中收获的条件培养基上清液。将蛋白在用结合缓冲液预平衡的蛋白A(MabSelect,GE Healthcare,Little Chalfont,United Kingdom)柱上运行。然后使洗涤缓冲液通过色谱柱，直到测得OD280值(NanoDrop,Thermo Scientific)等于或接近背景水平。使用低pH缓冲液洗脱胰岛素-Fc融合蛋白，收集洗脱馏分，并记录每种馏分的OD280值。合并含有目标胰岛素-Fc融合蛋白的馏分，并且任选地使用0.2μM滤膜进一步过滤。
使用限制稀释的方法(一种本领域技术人员已知的方法)，任选地将所述细胞系进一步亚克隆成单克隆，并任选地进一步选择用于高滴度胰岛素-Fc-融合蛋白表达克隆。在获得高滴度的单克隆胰岛素-Fc融合蛋白表达细胞系后，如上所述在不含MSX的生长培养基中或任选地在含有MSX的生长培养基中完成胰岛素-Fc融合蛋白的生产，以获得含有重组的CHO制成的胰岛素-Fc融合蛋白的细胞培养上清液。随着时间的推移，任选地增加MSX浓度，以对能够产生较高产物滴度的克隆施加额外的选择性。
实例3：胰岛素-Fc融合蛋白的纯化
胰岛素-Fc融合蛋白的纯化如下进行。从瞬时或稳定转染的HEK生产运行中收获含有分泌型胰岛素-Fc融合蛋白的条件培养基上清液，并通过离心进行澄清。将含有所需的胰岛素-Fc融合蛋白的上清液在蛋白A或蛋白G柱上运行，并且使用低pH梯度洗脱。任选地，可以通过将初始蛋白A或蛋白G柱洗脱液再次重新加载到第二个蛋白A或蛋白G柱上来提高胰岛素-Fc融合蛋白的回收率。然后，将含有所需蛋白的洗脱的馏分合并，并将缓冲液交换成200mM HEPES、100mM NaCl、50mM NaOAc、pH 7.0缓冲液。使用0.2μm滤膜进行最终过滤步骤。根据280nm处的溶液光密度来计算最终蛋白质浓度。根据需要，通过离子交换色谱法(例如使用阴离子交换珠树脂或阳离子交换珠树脂)、凝胶过滤色谱法或其他方法进行进一步的任选纯化。
实例4：通过非还原和还原CE-SDS进行结构确认。
在
Figure BDA0002955236580000461
GXII(Perkin Elmer,Waltham,MA)中对溶解在200mM HEPES、100mMNaCl、50mM NaOAc、pH 7.0缓冲液中的纯化的胰岛素-Fc融合蛋白的溶液进行毛细管电泳十二烷基硫酸钠(CE-SDS)分析，并绘制了电泳图谱。在非还原条件下，针对已知的分子量(MW)蛋白标准品运行样品，并且洗脱峰代表胰岛素-Fc融合蛋白同型二聚体的“表观”MW。
在还原条件下(例如使用β-巯基乙醇来破坏胰岛素-Fc融合同型二聚体的二硫键)，将所得的胰岛素-Fc融合蛋白单体的表观MW与胰岛素-Fc融合蛋白同型二聚体的分子量的一半进行比较，作为确定胰岛素-Fc融合蛋白的结构纯度可能正确的方式。
实例5：通过去除聚糖的LC-MS进行序列鉴定
为了通过质谱(MS)获得胰岛素-Fc质量的准确估计，首先处理样品以去除可能干扰MS分析的天然存在的聚糖。首先使用Zeba脱盐柱(Pierce,ThermoFisher Scientific,Waltham,MA)将100μL的2.5mg/mL的胰岛素-Fc融合蛋白溶解在200mM HEPES、100mM NaCl、50mM NaOAc、pH 7.0缓冲液中，缓冲液被交换为包含5mM EDTA的0.1M Tris、pH 8.0缓冲液。向该溶液中加入1.67μL的PNGase F酶(Prozyme N-聚糖酶)，以便去除融合蛋白中存在的N-连接的聚糖(例如，与位于cNg-N位点的天冬酰胺的侧链连接的聚糖)，并将混合物在培养箱中在37℃下孵育过夜。然后通过LC-MS(NovaBioassays,Woburn,MA)分析样品，产生对应于不含聚糖的所需同型二聚体的分子的分子质量。该质量然后被进一步校正，因为用于从cNg-天冬酰胺切割聚糖的酶促过程也使天冬酰胺侧链脱氨基以形成天冬氨酸，并且在这样做时，酶促处理的同型二聚体总体上获得2Da，对应于同型二聚体中存在的每个链的1Da的质量。因此，实际分子质量为测量的质量减去2Da，以校正分析样品中胰岛素-Fc融合蛋白结构的酶促修饰。
实例6：通过尺寸排阻色谱法测定的同型二聚体％
使用连接至2998光电二极管阵列的Waters 2795HT HPLC(Waters Corporation,Milford,MA)在280nm的波长下进行胰岛素-Fc融合蛋白的尺寸排阻色谱法(SEC-HPLC)。将100μL或更少的含有目标胰岛素-Fc融合蛋白的样品注射到MAbPac SEC-1，5μm，4×300mm柱(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA)中，其以0.2mL/min的流量操作，并且其中流动相包含50mM的磷酸钠、300mM的NaCl和0.05％w/v的叠氮化钠(pH 6.2)。MAbPac SEC-1柱根据分子大小分离的原理工作。因此，较大的可溶性胰岛素-Fc聚集体(例如，胰岛素-Fc融合蛋白同型二聚体的多聚体)在较早的保留时间洗脱，并且非聚集的同型二聚体在较晚的保留时间洗脱。通过分析型SEC-HPLC从聚集的多聚同型二聚体中分离同型二聚体的混合物时，确定了胰岛素-Fc融合蛋白溶液的纯度(以非聚集的同型二聚体的百分比表示)。
实例7：4℃下示例性的胰岛素-Fc融合蛋白的体外IM-9胰岛素受体结合
表达人胰岛素受体的人IM-9细胞(ATTC#CCL-159)在完全的RPMI 5％FBS培养基中以70-80％的汇合率培养和维持。IM-9细胞的培养物以250×g(约1000rpm)离心10min，以使细胞沉淀。用HBSS或PBS缓冲液洗涤细胞一次，重新悬浮在冷的FACS染色培养基(HBSS/2mMEDTA/0.1％叠氮化钠+4％马血清)中，使浓度达到8×106个细胞/mL，并在冰上或4℃下保存，直到制备出测试溶液。胰岛素-Fc蛋白在1:3连续稀释的FACS缓冲液中以2×浓度在1.2mL管(每次稀释约60μL体积)中稀释，并将溶液在冰上冷藏，直到准备好移液。
生物素化的RHI在FACS染色培养基中稀释至1.25μg/mL的浓度。将40μL连续稀释的测试化合物和8μL的1.25μg/mL生物素-RHI加入到V底微量滴定板的每个孔中，通过缓慢涡流混合，并置于冰上。然后通过多通道移液管向每个孔中加入40μL的IM-9细胞悬浮液(8×106个细胞/mL)，再次轻轻混合，并在冰上孵育30min，以允许与IM-9细胞上的胰岛素受体竞争性结合。然后通过以3000rpm离心V形底板3min，并吸取上清液，用275μL的冰冷的FACS洗涤缓冲液(HBSS/2mM的EDTA/0.1％叠氮化钠+0.5％马血清)洗涤细胞两次。然后将细胞重新悬浮在40μL的含有1:100稀释的链霉亲和素-PE(Life Technologies)的FACS染色培养基中，在冰上放置20min。然后用275μL的冰冷的FACS缓冲液洗涤细胞一次，并且最后用3％多聚甲醛在室温下固定10min。然后用275μL的冰冷的FACS缓冲液洗涤细胞一次，并重新悬浮在250μL的FACS缓冲液中用于分析。
然后在Guava 8-HT流式细胞仪(Millipore)上分析含有细胞的V形底板。对于每种浓度的测试化合物，通过FACS FL-2通道上细胞的中位荧光强度(MFI)对与胰岛素受体的生物素化的RHI结合进行定量。对照孔仅用生物素化的RHI标记，并用于计算由每种测试化合物浓度产生的抑制百分比(％)。针对测试化合物的对数浓度绘制了测试化合物对IM-9细胞上的生物素化的RHI结合的抑制％，并使用GraphPad Prism(GraphPad Software,LaJolla,CA)计算了测试化合物的所得的IC50值。因此，测试化合物的较低IC50值表明在较低浓度下生物素化的RHI抑制水平较高，这表明胰岛素-Fc融合蛋白与胰岛素受体的更强的结合。对照化合物(诸如未标记的重组人胰岛素(RHI))也被用作内标物，以生成RHI IC50，据此可以推断给定化合物的IC50(IC50(化合物)/IC50(RHI))。相对于RHI，较低的IC50比具有与RHI更相似的结合(与胰岛素受体的更强的结合)，而较高的IC50比与胰岛素受体具有更弱的结合。
实例8：体外Fc(γ)受体I结合亲和力测定
在pH 7.4下，胰岛素-Fc融合蛋白与Fc(γ)受体I的结合使用ELISA测定如下进行。由于犬科动物和猫科动物Fc(γ)受体I均无市售，因此使用人Fc(γ)受体I(即rhFc(γ)受体I)作为替代哺乳动物受体。将胰岛素-Fc化合物在pH 9.6的碳酸氢钠缓冲液中稀释至10μg/mL，并在4℃下包被在Maxisorp(Nunc)微量滴定板上过夜，之后用PBST(PBS/0.05％吐温-20)缓冲液洗涤微孔板条带5次，并用Superblock封闭剂(ThermoFisher)封闭。生物素化的rhFc(γ)受体I(重组人Fc(γ)R-I；R&D系统)的系列稀释液在6000ng/mL至8.2ng/mL的PBST/10％Superblock缓冲液中制备，并以100μL/孔加载到包被有胰岛素-Fc融合蛋白的微孔板条带上。将微量滴定板在室温下孵育1小时，之后用PBST洗涤5次微孔板条带，并且然后在PBST/10％Superblock缓冲液中装载100μL/孔的1:10000稀释的链霉亲和素-HRP。在孵育45min后，再次用PBST洗涤5次微孔板条带。加入TMB以揭示结合的Fc(γ)受体I蛋白，并用ELISA终止试剂(Boston Bioproducts)终止。在450nm下在ELISA板读取器中读取板，并且使用GraphPad Prism软件绘制OD值(与rhFc(γ)受体I与胰岛素-Fc蛋白的结合成比例)相对于加入到每个孔中的rhFc(γ)受体I的对数浓度图，以生成结合曲线。
实例9：对犬科动物FcRn受体的胰岛素-Fc融合蛋白亲和力的体外测量
通过在溶液pH为5.5时进行的ELISA技术，测量了包含犬科动物或猫科动物IgG来源的Fc片段的胰岛素-Fc融合蛋白与犬科动物FcRn受体的体外结合亲和力。微酸性pH值是含Fc片段的分子与FcRn受体结合的优选的结合环境。在体内，细胞在其表面和内泌体内部表达FcRn。当含有Fc片段的分子通过自然过程(例如胞饮或内吞)进入细胞时，在内泌体中pH变为较低的pH，其中FcRn受体与含有Fc片段的分子结合，否则这些分子将在内泌体-溶酶体区室中降解，从而使这些分子再循环回到其中pH更接近中性(例如，pH 7.0-7.4)的细胞表面。中性pH不利于与FcRn受体结合，并允许含Fc片段的分子释放回循环中。这是含Fc片段的分子呈现出在体内延长的循环药代动力学半衰期的主要机制。
将包含犬科动物或猫科动物来源的Fc片段的胰岛素-Fc融合蛋白在pH 9.6的碳酸氢钠缓冲液中稀释至10μg/ml，并在室温下以一式两份包被在Maxisorb ELISA板条带上1-2小时。然后用PBST(PBS/0.1％吐温-20)缓冲液洗涤条带4次，并用Superblock封闭试剂(ThermoFisher)封闭。然后在加入FcRn试剂(生物素化的犬科动物FcRn；Immunitrack)之前再次用pH 5.5MES/NaCl/吐温(50mM MES/150mM NaCl/0.1％吐温-20)洗涤两次。由于未发现市售猫科动物FcRn试剂，因此测定了含有犬科动物Fc片段或猫科动物Fc片段的胰岛素-Fc融合蛋白与犬科动物FcRn的结合。在pH 5.5MES/NaCl/吐温/10％Superblock缓冲液中，以1000ng/ml至0.45ng/ml的浓度制备生物素化的FcRn试剂的系列稀释液(1:3X稀释液)，并使用多通道移液器以100μL/孔将稀释液装载到包被有胰岛素-Fc融合蛋白化合物的条带上。然后将测定板在室温下孵育1小时。将FcRn结合条带用pH 5.5的MES/NaCl/吐温缓冲液洗涤4次，并且然后装载在pH 5.5的MES/NaCl/10％Superblock缓冲液中以1:10000稀释的100μl/孔链霉亲和素-HRP。在孵育45分钟后，再次用pH 5.5的MES/NaCl/吐温缓冲液洗涤条带4次。最后加入TMB以揭示结合的生物素化的犬科动物FcRn试剂，并用ELISA终止试剂终止显色。在450nm的波长下在ELISA板读取器中读取板。使用GraphPad Prism软件绘制了OD值(与犬科动物-FcRn与胰岛素-Fc融合蛋白测试化合物的结合成比例)相对于加入到每个孔中的FcRn的对数浓度图，以生成结合曲线。计算每条结合曲线的EC50值，以比较不同化合物之间的差异。
实例10：在狗或猫中单次施用胰岛素Fc-融合蛋白后用于确定体内药效动力学 (PD)的通用程序。
胰岛素-Fc融合蛋白对空腹血糖水平的影响评估如下。使用了N＝1、2、3或更多健康的、抗体幼稚的、体重约10-15kg的狗或体重约5kg的猫，每种胰岛素-Fc融合蛋白一只。还每天两次观察了动物的过敏反应、昏睡、悲痛、疼痛等体征，并且任选地对于一些化合物，继续治疗另外三次每周皮下注射或更多次，以观察化合物的降糖能力是否随时间降低，这是潜在诱导中和抗药物抗体的关键标志。在第0天，动物通过静脉内或皮下在7.0-8.0的溶液pH下以0.08-0.80mg胰岛素-Fc融合蛋白/kg(或约等于1.2-12.3nmol/kg或基于摩尔约等于0.4-4.0U/kg胰岛素当量)的剂量施用药物组合物接受单次注射，所述药物组合物包含在10-50mM磷酸氢钠、50-150mM氯化钠、0.005-0.05％v/v吐温-80和任选地浓度为0.02-1.00mg/mL的抑菌剂(例如苯酚、间甲酚或对羟基苯甲酸甲酯)的溶液中的浓度在1至10mg/mL之间的胰岛素Fc-融合蛋白同型二聚体。在第0天，在注射前立即并在注射后第15、30、45、60、120、240、360和480分钟以及第1、2、3、4、5、6和7天从合适的静脉收集血液。
对于每个时间点，至少收集1mL的全血。立即使用血糖仪(
Figure BDA0002955236580000501
AvivaPlus)确定葡萄糖水平读数，该血糖仪需要大约一滴血。绘制了第0天至第7天的平均空腹血糖水平％(％FBGL)，以评估给定胰岛素-Fc融合蛋白的生物活性。
实例11：在犬科动物或猫科动物中重复施用胰岛素-Fc融合蛋白后用于确定体内 药效动力学(PD)的通用程序。
胰岛素-Fc融合蛋白在重复注射期间对血糖水平的影响评估如下。使用了体重约在5至20kg之间的健康的、抗体幼稚的狗或猫，并向每只动物施用多剂量的胰岛素-Fc融合蛋白。每日两次观察动物的过敏反应、昏睡、悲痛、疼痛和其他负面副作用的体征，并且任选地对于一些化合物，继续治疗，最多进行另外的2至5次皮下注射，以观察化合物的降糖能力是否随时间降低，表明体内可能存在中和性抗药物抗体。在第0天，动物在7.0-8.0的溶液pH下以0.08-0.80mg胰岛素-Fc融合蛋白/kg(或约等于1.2-12.3nmol/kg或基于摩尔约等于0.4-4.0U/kg胰岛素当量)的剂量接受药物组合物的单次皮下注射，所述药物组合物包含在10-50mM磷酸氢钠、50-150mM氯化钠、0.005-0.05％v/v吐温-80和任选地浓度为0.02-1.00mg/mL的抑菌剂(例如苯酚、间甲酚或对羟基苯甲酸甲酯)的溶液中的胰岛素Fc-融合蛋白。在第0天，在注射前立即并在注射后第15、30、45、60、120、240、360和480分钟以及第1、2、3、4、5、6和7天从合适的静脉收集血液。
随后的皮下注射频率不超过每周一次，并且在一些情况下，根据给定胰岛素-Fc融合蛋白制剂的药效动力学，以不同的间隔给与注射。根据所证明的胰岛素-Fc融合蛋白的药效动力学，将每种胰岛素-Fc融合蛋白的后续注射调整为较高的剂量或较低的剂量。例如，如果发现第0天第一次注射的剂量在降低血糖方面无效，则将随后注射的胰岛素-Fc融合蛋白的剂量水平向上调整。以类似的方式，如果发现第0天第一次注射的剂量以太强的方式降低葡萄糖，则将随后注射的胰岛素-Fc融合蛋白的剂量水平向下调整。还发现可以根据需要以类似的方式调整中期剂量或最终剂量。对于每种剂量，在注射前立即和在注射后15、30、45、60、120、240、360和480分钟以及1、2、3、4、5、6、7天(和任选地14天)从合适的静脉采集血液。对于每个时间点，至少采集了1mL的全血。立即使用血糖仪(
Figure BDA0002955236580000511
AvivaPlus)测量葡萄糖水平读数，该血糖仪需要大约一滴血。绘制了整个研究期间的平均空腹血糖水平％(％FBGL)相对于时间的图，该时间允许确定融合蛋白的生物活性。
为了确定每种剂量的生物活性，如下进行了曲线上面积(AOC)分析。在构建％FBGL相对于时间的数据后，然后将数据输入到数据分析软件(GraphPad Prism,GraphPadSoftware,San Diego CA)中。首先使用该软件进行曲线下面积分析(AUC)，以积分每种剂量的％FBGL与时间曲线下的面积。为了将AUC数据转换为所需的AOC数据，使用以下公式：AOC＝TPA–AUC；其中TPA是通过将每个剂量生存期(例如7天、14天等)乘以100％获得的总可能面积(其中100％表示％FBGL与时间曲线的y＝100％)。例如，给定7天的剂量生存期和500％FBGL·天的计算的AUC，给出AOC的以下结果：AOC＝(100％FBGL x 7天)–(500％FBGL·天)＝200％FBGL·天。可以对一系列注射剂量中的每个注射剂量进行分析，以获得注射1、注射2、注射3等的AOC值。
由于胰岛素-Fc融合蛋白的剂量可能如前所述发生变化，因此将给定胰岛素-Fc融合蛋白的所有计算的AOC值归一化为该胰岛素-Fc融合蛋白的特定剂量通常更为方便。这样允许方便地比较多次注射的胰岛素-Fc融合蛋白的降糖效力，即使剂量水平在给定研究的多次注射之间发生变化。给定剂量的归一化的AOC(NAOC)计算如下：NAOC＝AOC/D，其中单位为％FBGL·天·kg/mg；其中D是注射到动物体内的实际剂量，单位为mg/kg。可以为给定动物的一系列注射中的每次注射计算NAOC值，并且可以对接受相同胰岛素-Fc融合蛋白制剂的一组动物取平均值。
对于给定动物的一系列注射中的每次注射，也可以通过取每一次注射(例如注射1、2、3、…N)的NAOC值并将给定注射的每一个NAOC除以来自注射1的NAOC值来计算NAOC比率(NAOCR)，如下所示：NAOCR＝(NAOC(第N次注射)/NAOC(注射1))。通过评估用于一系列注射中第N次注射的给定胰岛素-Fc同型二聚体融合蛋白制剂的NAOCR，可以确定给定胰岛素-Fc融合蛋白的体内降糖活性在一系列N个剂量是否基本上保持了其生物活性(例如，第N次剂量的NAOCR大于0.5)或者给定胰岛素-Fc融合蛋白的体内降糖活性在N次剂量的过程中是否丧失了其大部分效力(例如，第N次剂量的NAOCR小于0.5)，表明体内可能形成中和性抗药物抗体。在优选的实施例中，第三次皮下注射之后的NAOC与第一次皮下注射之后的NAOC的比率大于0.5(即，第三次皮下注射的NAOCR大于0.5)。
实例12：用于确定犬科动物和猫科动物血清中体内药代动力学(PK)的通用程序
如下构建了一种测定，用于测量包含犬科动物同种型的Fc片段的胰岛素-Fc融合蛋白在犬科动物血清中的浓度。该测定包含夹心ELISA形式，其中血清样品中的治疗性化合物通过包被在ELISA板上的抗胰岛素/胰岛素原单克隆抗体(mAb)捕获，并且然后通过HRP缀合的抗犬科动物IgG Fc特异性抗体检测，然后使用TMB底物系统用于显色。在5μg/ml的包被缓冲液(pH＝9.6碳酸钠-生物碳酸钠缓冲液)中用抗胰岛素mAb克隆D6C4(Biorad)包被Maxisorp ELISA板(Nunc)，在4℃下过夜。然后用PBST(PBS+0.05％吐温20)将板洗涤5次，并用SuperBlock封闭溶液(ThermoFisher)在室温下封闭至少1小时(或在4℃下过夜)。测试血清样品在PBST/SB/20％HS样品稀释缓冲液(PBS+0.1％吐温20+10％SuperBlock+20％马血清)中稀释至1:20。为了制作标准曲线，在浓度范围为200ng/ml至0.82ng/ml的样品稀释缓冲液(PBST/SB/20％HS)+5％的混合比格犬血清(BioIVT)中以1:2.5系列稀释液来稀释目标胰岛素-Fc融合蛋白。以100μl/孔将标准品和稀释的血清样品以一式两份添加到封闭板中，并在室温下孵育1小时。在孵育后，样品和标准品用PBST洗涤5次。将HRP缀合的山羊抗犬科动物IgG Fc(Sigma)检测抗体在PBST/SB/20％HS缓冲液中稀释至约1:15,000，并且向所有孔中加入100μl，并在室温下在黑暗处孵育45分钟。将板用PBST洗涤5次，并用去离子水洗涤1次，并在室温下通过加入100μl/孔TMB(Invitrogen)显影8-10分钟。然后通过加入100μl/孔ELISA终止溶液(Boston Bioproducts)终止显色，并在30分钟内使用SpectraMax板读取器(Molecular Devices)在450nm处读取吸光度。使用SoftMaxPro软件通过在4-PL曲线上插值来计算样品中胰岛素-Fc融合蛋白化合物的浓度。
类似地，如下构建了一种测定，用于测量包含猫科动物同种型的Fc片段的胰岛素-Fc融合蛋白在猫科动物血清中的浓度。该测定包含夹心ELISA形式，其中血清样品中的治疗性化合物由包被在ELISA板上的抗胰岛素/胰岛素原mAb捕获，并且然后由HRP缀合的山羊抗猫科动物IgG Fc特异性抗体检测，然后使用TMB底物系统用于显色。在5μg/ml的包被缓冲液(pH＝9.6碳酸钠-生物碳酸钠缓冲液)中用抗胰岛素mAb克隆D6C4(Biorad)包被MaxisorpELISA板(Nunc)，在4℃下过夜。然后用PBST(PBS+0.05％吐温20)将板洗涤5次，并用SuperBlock封闭溶液(ThermoFisher)在室温下封闭至少1小时(或在4℃下过夜)。测试血清样品在PBST/SB/20％HS样品稀释缓冲液(PBS+0.1％吐温20+10％SuperBlock+20％马血清)中稀释至1:20。为了制作标准曲线，在浓度范围为200ng/ml至0.82ng/ml的样品稀释缓冲液(PBST/SB/20％HS)+5％的正常猫血清(Jackson Immunoresearch)中以1:2.5系列稀释来稀释目标胰岛素-Fc融合蛋白化合物。以100μl/孔将标准品和稀释的血清样品以一式两份添加到封闭板中，并在室温下孵育1小时。在孵育后，样品和标准品用PBST洗涤5次。将HRP缀合的山羊抗猫科动物IgG Fc(Bethyl Lab)检测抗体在PBST/SB/20％HS缓冲液中稀释至约1:20,000，并且向所有孔中加入100μl，并在室温下在黑暗处孵育45分钟。将板用PBST洗涤5次，并用去离子水洗涤1次，并在室温下通过加入100μl/孔TMB(Invitrogen)显影8-10分钟。然后通过加入100μl/孔ELISA终止溶液(Boston Bioproducts)终止显色，并在30分钟内使用SpectraMax板读取器(Molecular Devices)在450nm处读取吸光度。使用SoftMaxPro软件通过在4-PL曲线上插值来计算样品中胰岛素-Fc融合蛋白化合物的浓度。
实例13：用于测量犬科动物血清中抗药物抗体的测定方案
使用在包被缓冲液(pH＝9.6碳酸盐-生物碳酸盐缓冲液)中以10μg/mL稀释的目标胰岛素-Fc融合蛋白对Maxisorp ELISA板(Nunc)进行包被，在4℃下过夜，用于测量针对测试化合物的ADA。为了针对含有犬科动物IgG来源的Fc片段的胰岛素-Fc融合蛋白的胰岛素部分测量ADA，在包被缓冲液中用30μg/mL的纯化的胰岛素包被板。然后用PBST(PBS+0.05％吐温20)将板洗涤5次，并用SuperBlock封闭溶液(ThermoFisher，Waltham MA)封闭至少1小时(或过夜)。为了计算以犬科动物IgG单位表示的ADA，条带在4℃下以300-4.69ng/ml的浓度在pH＝9.6的Carb-Biocarb包被缓冲液中用1:2系列稀释的犬科动物IgG直接包被过夜，并且用于创建7点伪标准曲线。也洗涤标准品条带板，并用SuperBlock封闭溶液封闭至少1小时(或过夜)。
将测试血清样品在PBST/SB/20％HS样品稀释缓冲液(PBS+0.1％吐温20+10％SuperBlock+20％马血清)中稀释至大于或等于1:100(通常按1:200进行测试)，并以100μL/孔一式两份添加到胰岛素-Fc融合蛋白包被的(或RHI包被的)条带中。还将犬科动物IgG包被的标准条带的重复条带添加到每个板中，并以100μL/孔填充PBST/SB(PBS+0.1％吐温20+10％SuperBlock)缓冲液。将板在室温下孵育1小时，并且然后用PBST洗涤5次。对于ADA的检测，HRP缀合的山羊抗猫科动物IgG F(ab’)2(抗猫科动物IgG F(ab’)2试剂与犬科动物抗体发生交叉反应；Jackson Immunoresearch Laboratories,West Grove PA)，其在PBST/SB中稀释至1:10000，并且以100μL/孔加入到样品孔和标准品孔中，并在室温下在黑暗处孵育45分钟。用PBST洗涤板5次，并且然后用去离子水洗涤一次，并且然后在室温下在黑暗处通过加入100μL/孔的TMB底物(Invitrogen,ThermoFisher Scientific,Waltham MA)显影15-20分钟。然后通过加入100μL/孔的ELISA终止溶液(Boston Bioproducts)终止显色，并在30分钟内使用SpectraMax板读取器在450nm处读取吸光度。使用SoftMax Pro软件(MolecularDevices,San Jose CA)通过4-PL假标准曲线中的OD值进行插值来确定抗药物抗体浓度。
为了确定检测到的ADA的特异性，进行了“抑制”测定。在药物抑制ADA测定中，血清样品在PBST/SB/20％HS缓冲液中以1:100稀释，并与等体积的300μg/mL相关治疗性化合物(最终样品稀释为1:200，并且最终抑制化合物稀释为150μg/mL)混合，并且然后在室温下孵育30-40分钟，以允许抗药物抗体与游离的抑制剂(即治疗性化合物)结合。在预孵育之后，以100μL/孔将样品一式两份添加到胰岛素-Fc融合蛋白包被的(或RHI包被的)条带中。在不含抑制性化合物的PBST/SB/20％HS缓冲液中以1:200稀释的样品也与犬科动物IgG包被的标准品的重复条带一起在样品板中进行测试。测定程序的其余步骤如上所述进行。将在药物抑制的孔中测得的ADA与非抑制的ADA浓度进行匹配，以评估ADA的特异性。如果在药物抑制的孔中观察到对ADA信号的显著抑制，这意味着ADA对治疗性化合物具有特异性。
实例14：用于测量猫科动物血清中的抗药物抗体的测定方案
使用在包被缓冲液(pH＝9.6碳酸盐-生物碳酸盐缓冲液)中以10μg/mL稀释的目标胰岛素-Fc融合蛋白对Maxisorp ELISA板(Nunc)进行包被，在4℃下过夜，用于测量针对包含猫科动物IgG来源的Fc片段的胰岛素-Fc融合蛋白的ADA。为了测量针对胰岛素-Fc融合蛋白的胰岛素部分的ADA，在包被缓冲液中用30μg/mL的纯化的胰岛素包被板。然后用PBST(PBS+0.05％吐温20)将板洗涤5次，并用SuperBlock封闭溶液(ThermoFisher，Waltham MA)封闭至少1小时(或过夜)。为了计算以猫科动物IgG单位表示的ADA，条带在4℃下以300-4.69ng/ml的浓度在pH＝9.6的碳酸钠-碳酸氢钠包衣缓冲液中用1:2系列稀释的犬科动物IgG(Jackson Immunoresearch Laboratories,West Grove PA)直接包被过夜，并且用于创建7点伪标准曲线。也洗涤标准品条带板，并用SuperBlock封闭溶液封闭至少1小时(或过夜)。
将测试血清样品在PBST/SB/20％HS样品稀释缓冲液(PBS+0.1％吐温20+10％SuperBlock+20％马血清)中稀释至大于或等于1:100(通常按1:200进行测试)，并以100μL/孔一式两份添加到胰岛素-Fc融合蛋白包被的(或RHI包被的)条带中。还将猫科动物IgG包被的标准条带的重复条带添加到每个板中，并以100μL/孔填充PBST/SB(PBS+0.1％吐温20+10％SuperBlock)缓冲液。将板在室温下孵育1小时，并且然后用PBST洗涤5次。对于ADA的检测，HRP缀合的山羊抗猫科动物IgG F(ab’)2(Jackson Immunoresearch Laboratories,West Grove PA)以1:10000的因数稀释在PBST/SB中，并且以100μL/孔加入到样品孔和标准品孔中，并在室温下在黑暗处孵育45分钟。用PBST洗涤板5次，并且用去离子水洗涤一次，并且在室温下在黑暗处通过加入100μL/孔的TMB底物(Invitrogen)显影15-20分钟。然后通过加入100μL/孔的ELISA终止溶液(Boston Bioproducts,Ashland MA)终止显色，并在30分钟内使用SpectraMax板读取器在450nm处读取吸光度。使用SoftMax Pro软件(MolecularDevices,San Jose CA)通过对4-PL假标准曲线中的OD值进行插值来确定抗药物抗体浓度。
实例15：用于免疫原性表位鉴定的测定程序
用具有已知氨基酸序列的胰岛素-Fc融合蛋白同型二聚体化合物的文库包被Maxisorp ELISA微孔板(Nunc)，并以与抗药物抗体ELISA测定实例13和14中所述类似的方式封闭包被的板，不同之处在于，将文库中的每种化合物包被在ELISA微孔板孔的单独的条带上。文库中的化合物包含一系列胰岛素-Fc融合蛋白，它们具有不同的胰岛素多肽氨基酸组成，包括各种B链、C链和A链氨基酸突变、不同的接头组成和不同的Fc片段组成，包括一些人类来源的组成。另外，如实例13和14中所述，一些板条带孔直接包被有1:2系列稀释的犬科动物或猫科动物IgG(Jackson Immunoresearch Laboratories,West Grove PA)，用于分别以犬科动物或猫科动物IgG单位计算抗药物抗体(ADA)。
从接受胰岛素-Fc融合蛋白的重复给药的个体狗或猫获得的血清首先在抗药物抗体ELISA测定中进行筛选(实例13用于狗，并且实例14用于猫)。在PBST/SB/20％HS样品稀释缓冲液(PBS+0.1％吐温20+10％SuperBlock+20％马血清)中连续稀释(1：200至1：8000)在实例13或实例14的测定中表现出中度或高度阳性的血清样品(例如，抗体的中度滴度或高滴度)，并将其添加到包被有胰岛素-Fc融合蛋白化合物的文库的板上，在室温下放置1小时。在孵育后，用PBST洗涤板5次。为了检测能够与包被的化合物文库发生交叉反应的犬科动物或猫科动物抗体，在PBST/SB中将对犬科动物和猫科动物IgG均具有交叉反应的HRP缀合的山羊抗猫科动物IgG F(ab′)2(Jackson Immunoresearch Laboratories,West GrovePA)稀释至1:10000，并以100μL/孔添加到样品孔和标准品孔中，并且在室温下在黑暗处孵育45min。用PBST洗涤板5次，用去离子水洗涤1次，并通过加入100μL/孔的TMB底物(Invitrogen，ThermoFisher Scientific，Waltham MA)在室温下在黑暗处显影15-20min。然后通过加入100μL/孔的ELISA终止溶液(Boston Bioproducts，Ashland MA)终止显色，并在30min内使用SpectraMax平板读取器在450nm处读取吸光度。血清样品中存在的抗化合物交叉反应抗体浓度通过使用SoftMax Pro Software(Molecular Devices,San Jose CA)对照直接包被的犬科动物或猫科动物IgG抗体对照品对4-PL假标准曲线中的OD值进行插值来确定。
通过将来自测定的所得到的抗体浓度与包被的胰岛素-Fc融合蛋白文库的已知氨基酸组成相关联，可以确定特定的氨基酸突变或表位是否导致测定上没有、一些、大多数或所有总抗体信号，表明与各种胰岛素-Fc融合蛋白同型二聚体没有结合、弱结合或强结合。本文将负责中度或强烈结合的突变或表位称为免疫原性“热点”。
实例16：用于获得目标物种中具有高同型二聚体滴度和可接受水平的急性和重复 给药生物活性的胰岛素-Fc融合蛋白的设计过程
用于符合本发明的具体实施方式中所述的设计目标的过程包含以下步骤。首先，将SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的胰岛素多肽与特定IgG同种型的物种特异性Fc片段和接头结合，使得所得的胰岛素-Fc融合蛋白最有可能产生具有最小免疫原性的长效生物活性产物(例如，选择具有最小Fc(γ)受体I结合的物种特异性IgG同种型)。制备编码所需融合蛋白的DNA序列，克隆到载体(LakePharma，San Carlos，CA)中，并且然后根据实例1中所述的程序使用该载体来瞬时转染HEK细胞。然后根据实例3纯化胰岛素-Fc融合蛋白，并根据实例6测量总蛋白产量和同型二聚体％。仅同型二聚体滴度大于50mg/L的候选物被认为是可接受的，因为低于该水平的滴度不太可能产生符合兽医产品严格的低生产成本要求的商业生产滴度。然后如实例7所述，通过体外胰岛素受体结合研究来筛选选定的胰岛素-Fc融合蛋白的生物活性指标。根据经验，仅呈现出IR活性IC50值小于5000nM的化合物被视为可能在目标物种中呈现出生物活性。尽管体外IR IC50值是一种有用的定性筛选工具，但它利用了表达人胰岛素受体的人IM-9细胞，并且因此可能无法捕捉到犬科动物或猫科动物IR与人IR之间亲和力的一些小的差异。此外，除胰岛素受体结合以外的因素可能影响化合物的体内生物活性(例如，对犬科动物或猫科动物FcRn的亲和力，以允许延长的体内药代动力学消除半衰期)。因此，从生产和IR活性IC50值的角度来看可接受的选定胰岛素-Fc融合蛋白在目标动物(例如，狗或猫)中的生物活性被进一步筛选，以筛选出生物活性低于所需效力和/或持续时间(例如，NAOC低于150％FBGL·天·kg/mg)的任何材料。同样，根据经验，在NAOC值大于150％FBGL·天·kg/mg时，目标物种中的剂量要求将足够低，以便达到可接受的治疗成本。最后，添加了一个额外的评估标准，该标准在本领域中很少提及。如在以下实例中更详细讨论的，在第一次给药后在目标物种中表现出可接受的NAOC水平的多个胰岛素-Fc融合蛋白实施例在重复给药后出乎意料地不能保持该水平的生物活性。此外，在大多数情况下，目标物种中重复给药生物活性的降低与中和性抗药物抗体的产生相关。这种产生抗药物抗体的倾向和维持活性的失败使得此类胰岛素-Fc融合蛋白不适合用于治疗慢性疾病，例如犬科动物糖尿病或猫科动物糖尿病。因此，仅表现出可接受水平的重复给药生物活性(例如，相对于第一剂量，第三剂量的NAOCR值大于0.50)且具有最低水平的抗药物抗体的胰岛素-Fc融合蛋白被认为可用于本发明。
结果-包含犬科动物Fc片段的胰岛素-FC融合蛋白
实例17：包含犬科动物Fc IgGA同种型的犬科动物胰岛素-Fc融合蛋白
尝试使用SEQ ID NO:12的肽接头来生产包含SEQ ID NO:5的胰岛素多肽序列和犬科动物IgGA同种型(SEQ ID NO:15)的Fc片段的胰岛素-Fc融合蛋白。得到的胰岛素-Fc融合蛋白的完整氨基酸序列如下：
FVNQHLCGSDLVEALALVCGERGFFYTDPTGGGPRRGIVEQCCHSICSLYQLENYCNGGGGAGGGGRCTDTPPCPVPEPLGGPSVLIFPPKPKDILRITRTPEVTCVVLDLGREDPEVQISWFVDGKEVHTAKTQSREQQFNGTYRVVSVLPIEHQDWLTGKEFKCRVNHIDLPSPIERTISKARGRAHKPSVYVLPPSPKELSSSDTVSITCLIKDFYPPDIDVEWQSNGQQEPERKHRMTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQQGDPFTCAVMHETLQNHYTDLSLSHSPG(SEQ ID NO:42)。
根据实例1在HEK细胞中合成SEQ ID NO:42的胰岛素-Fc融合蛋白，并根据实例3纯化。在蛋白A纯化步骤后，蛋白质产量为22mg/L。根据实例4通过非还原和还原CE-SDS确认胰岛素-Fc融合蛋白的结构，并根据实例5通过去除聚糖的LC-MS进一步鉴定序列。根据实例6，通过尺寸排阻色谱法测量同型二聚体％，并且确定为24％，表明高度的同型二聚体聚集体。因此，所得到的同型二聚体滴度仅为5mg/L。总之，在HEK细胞中生产SEQ ID NO:42的胰岛素-Fc融合蛋白产生了高水平的聚集体和低水平的同型二聚体滴度(5mg/L)，这不符合同型二聚体滴度大于50mg/L的设计目标。
然而，对SEQ ID NO:42的胰岛素-Fc融合蛋白的生物活性进行了评估。首先，根据实例7来测量SEQ ID NO:42的胰岛素-Fc融合蛋白的胰岛素受体结合，得到2,733nM的IC50值，表明该化合物可能在体内具有生物活性(即IC50小于5000nM)。
接下来，根据实例10，在向N＝3只犬科动物单次静脉内施用化合物之后，测量SEQID NO:42的胰岛素-Fc融合蛋白的体内药效动力学(PD)。图2示出了SEQ NO:42的空腹血糖水平百分比作为时间的函数。根据实例11的程序，计算出SEQ ID NO:42的NAOC为105％FBGL·天·kg/mg。使用实例12的方法计算出SEQ ID NO:42的体内半衰期小于1天。相对低的NAOC值可能是样品中大量聚集体(即低同型二聚体％)的结果，但仍保留在循环中的可溶性同型二聚体仅具有小于1天的药效动力学消除半衰期，这被认为不太可能支持每周施用一次。
实例18：包含犬科动物IgGA同种型的胰岛素-Fc融合蛋白的Fc片段区域的突变
为了试图增加SEQ ID NO:42的胰岛素-Fc融合蛋白的同型二聚体含量％、改善其生物活性和延长其半衰期，将突变插入到Fc片段CH3区域中，以试图阻止分子间的缔合(例如，分子之间的Fc片段-Fc片段相互作用)，并促使其与FcRn受体更强的结合(例如，对FcRn的更高的亲和力)，从而增加再循环和体循环时间。根据实例1在HEK细胞中合成下列胰岛素-Fc融合蛋白，根据实例3纯化，并根据实例4-7测试，如下所示。在图3中示出了SEQ IDNO:44、46、48和50相对于SEQ ID NO:42的序列比对以及氨基酸序列的差异。
FVNQHLCGSDLVEALALVCGERGFFYTDPTGGGPRRGIVEQCCHSICSLYQLENYCNGGGGAGGGGRCTDTPPCPVPEPLGGPSVLIFPPKPKDILRITRTPEVTCVVLDLGREDPEVQISWFVDGKEVHTAKTQSREQQFNGTYRVVSVLPIEHQDWLTGKEFKCRVNHIDLPSPIERTISKARGRAHKPSVYVLPPSPKELSSSDTVSITCLIKDFYPPDIDVEWQSNGQQEPERKHRMTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQQGDPFTCAVLHEALHSHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO:44)
FVNQHLCGSDLVEALALVCGERGFFYTDPTGGGPRRGIVEQCCHSICSLYQLENYCNGGGGAGGGGRCTDTPPCPVPEPLGGPSVLIFPPKPKDILRITRTPEVTCVVLDLGREDPEVQISWFVDGKEVHTAKTQSREQQFNGTYRVVSVLPIEHQDWLTGKEFKCRVNHIDLPSPIERTISKARGRAHKPSVYVLPPSPKELSSSDTVSITCLIKDFYPPDIDVEWQSNGQQEPERKHRMTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQQGDPFTCAVLHETLQSHYTDLSLSHSPG(SEQ ID NO:46)
FVNQHLCGSDLVEALALVCGERGFFYTDPTGGGPRRGIVEQCCHSICSLYQLENYCNGGGGAGGGGRCTDTPPCPVPEPLGGPSVLIFPPKPKDILRITRTPEVTCVVLDLGREDPEVQISWFVDGKEVHTAKTQSREQQFNGTYRVVSVLPIEHQDWLTGKEFKCRVNHIDLPSPIERTISKARGRAHKPSVYVLPPSPKELSSSDTVSITCLIKDFYPPDIDVEWQSNGQQEPERKHRMTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQQGDPFTCAVMHETLQSHYTDLSLSHSPG(SEQ ID NO:48)
FVNQHLCGSDLVEALALVCGERGFFYTDPTGGGPRRGIVEQCCHSICSLYQLENYCNGGGGAGGGGRCTDTPPCPVPEPLGGPSVLIFPPKPKDILRITRTPEVTCVVLDLGREDPEVQISWFVDGKEVHTAKTQSREQQFNGTYRVVSVLPIEHQDWLTGKEFKCRVNHIDLPSPIERTISKARGRAHKPSVYVLPPSPKELSSSDTVSITCLIKDFYPPDIDVEWQSNGQQEPERKHRMTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQQGDPFTCAVLHETLQNHYTDLSLSHSPG(SEQ ID NO:50)
在表2中列出了基于犬科动物IgGA变体的胰岛素-Fc融合蛋白以及相应的蛋白质产量、同型二聚体％和同型二聚体滴度。结果表明，IgGA Fc片段的各种突变没有提高同型二聚体％和同型二聚体滴度，而是产生高度聚集的蛋白质，具有低于5mg/L的极低同型二聚体滴度。因此，无法评估这些化合物的体内生物活性和药代动力学。
Figure BDA0002955236580000591
实例19：使用其他犬科动物Fc片段同种型的犬科动物胰岛素-Fc融合蛋白
如上所述，犬科动物IgGA被认为是Fc片段产生用于狗的非免疫原性胰岛素-Fc融合蛋白的优选的同种型，因为其在犬科动物中缺乏Fc(γ)I效应子功能(非常类似于人类中的人IgG2同种型)。然而，用犬科动物IgGA Fc片段制备的胰岛素-Fc融合蛋白高度聚集，具有不可接受的低同型二聚体滴度和不可接受的低水平生物活性和作用持续时间。因此，评估了来自其他犬科动物IgG同种型(SEQ ID NO:16的犬科动物IgGB、SEQ ID NO:17的犬科动物IgGC和SEQ ID NO:18的犬科动物IgGD)的Fc片段，作为SEQ ID NO:42的胰岛素-Fc融合的犬科动物IgGA Fc片段的替代品。使用与用于制备SEQ ID NO:42的胰岛素-Fc融合蛋白相同的SEQ ID NO:5的胰岛素多肽和SEQ ID NO:12的肽接头，合成了三种基于犬科动物IgGB、IgGC和IgGD同种型的包含Fc片段的胰岛素-Fc融合蛋白。根据实例1在HEK293细胞中制备蛋白质。然后根据实例3使用蛋白A柱来纯化胰岛素-Fc融合蛋白。根据实例4通过非还原和还原CE-SDS来确认胰岛素-Fc融合蛋白的结构，并根据实例5通过去除聚糖的LC-MS进一步鉴定序列。根据实例6，通过尺寸排阻色谱法来确定同型二聚体％。它们的序列如下所示，并且它们相对于SEQ ID NO:42的序列比对比较在图4中示出：
FVNQHLCGSDLVEALALVCGERGFFYTDPTGGGPRRGIVEQCCHSICSLYQLENYCNGGGGAGGGGDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFNGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG(SEQ IDNO:52)
FVNQHLCGSDLVEALALVCGERGFFYTDPTGGGPRRGIVEQCCHSICSLYQLENYCNGGGGAGGGGCNNCPCPGCGLLGGPSVFIFPPKPKDILVTARTPTVTCVVVDLDPENPEVQISWFVDSKQVQTANTQPREEQSNGTYRVVSVLPIGHQDWLSGKQFKCKVNNKALPSPIEEIISKTPGQAHQPNVYVLPPSRDEMSKNTVTLTCLVKDFFPPEIDVEWQSNGQQEPESKYRMTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQISLSHSPG(SEQID NO:54)
FVNQHLCGSDLVEALALVCGERGFFYTDPTGGGPRRGIVEQCCHSICSLYQLENYCNGGGGAGGGGCISPCPVPESLGGPSVFIFPPKPKDILRITRTPEITCVVLDLGREDPEVQISWFVDGKEVHTAKTQPREQQFNSTYRVVSVLPIEHQDWLTGKEFKCRVNHIGLPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSPKELSSSDTVTLTCLIKDFFPPEIDVEWQSNGQPEPESKYHTTAPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQQGDTFTCAVMHEALQNHYTDLSLSHSPG(SEQID NO:56)
在表3中给出了所得到的蛋白质产量、同型二聚体％和同型二聚体滴度。出乎意料的是，仅SEQ ID NO:52的胰岛素-Fc融合蛋白(包含基于犬科动物IgGB同种型的Fc片段)示出了符合大于50mg/L的设计标准的同型二聚体滴度。SEQ ID NO:54的胰岛素-Fc融合蛋白(包含基于犬科动物IgGC同种型的Fc片段)根本没有产生任何化合物，并且SEQ ID NO:56的胰岛素-Fc融合蛋白(包含基于犬科动物IgGD同种型的Fc片段)示出了可观的蛋白质产量，但具有高聚集度，并且因此具有不可接受的低同型二聚体滴度。
根据实例7的程序来测试SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:56的胰岛素-Fc融合蛋白的体外胰岛素受体结合。SEQ ID NO:56的胰岛素-Fc融合蛋白显示出大于5000nM的IC50，表明该化合物极不可能显示出体内生物活性。然而，SEQ ID NO:52的胰岛素-Fc融合蛋白显示出28nM的IC50，表明该序列可能具有体内生物活性。
Figure BDA0002955236580000611
*DNM＝未测量
实例20：包含SEQ ID NO:5的胰岛素多肽和犬科动物IgGB同种型Fc片段的胰岛素- Fc融合蛋白的体内效力
鉴于实例19中有希望的同型二聚体滴度和胰岛素受体活性结果，在向体重为大约10kg的N＝3只健康的、抗体幼稚的比格犬中的每只静脉注射之后，根据实例10测试了SEQID NO:52的胰岛素-Fc融合蛋白的体内生物活性。在单独的实验中，将该化合物皮下注射给N＝3只幼稚的比格犬。图5示出了SEQ ID NO:52的胰岛素-Fc融合蛋白的单次静脉内施用的％FBGL相对于时间，以及图6示出了SEQ ID NO:52的胰岛素-Fc融合蛋白的单次皮下施用的％FBGL相对于时间，这两者都证明了SEQ ID NO:52的胰岛素-Fc融合蛋白在狗中具有显著的生物活性。
根据实例11的程序计算NAOC，以确定胰岛素-Fc融合蛋白的相对生物活性和作用持续时间。静脉注射的SEQ ID NO:52的胰岛素-Fc融合蛋白的NAOC为399％FBGL·天·kg/mg，其是静脉注射的SEQ ID NO:42的胰岛素-Fc融合蛋白的NAOC的3.8倍，这说明与包含犬科动物IgGA Fc片段的胰岛素-Fc融合蛋白相比，包含犬科动物IgGB Fc片段的胰岛素-Fc融合蛋白的生物活性显著增加。皮下注射的SEQ ID NO:52的胰岛素-Fc融合蛋白的NAOC为366％FBGL·天·kg/mg，表明通过皮下施用获得的生物活性水平与通过静脉施用获得的生物活性水平相似。
实例21：在重复皮下给药包含SEQ ID NO:5的胰岛素多肽和犬科动物IgGB同种型 Fc片段的胰岛素-Fc融合蛋白后的体内免疫原性筛选
接着，按照实例11所述的方法，在狗中测试SEQ ID NO:52的胰岛素-Fc融合蛋白的重复给药皮下生物活性。N＝3只动物在第0天、第35天和第42天皮下给药，并且根据实例11测量每次给药后7天窗口期的％FBGL。对于每次重复皮下注射，根据实例11的程序计算NAOC和NAOCR。如表4所示，对狗中的重复皮下给药出人意料地显示了第三次给药后生物活性的显著衰减，如通过NAOCR的显著降低所测量的(即，第三次注射的NAOC仅为第一次注射的NAOC的0.40或40％)。
Figure BDA0002955236580000621
不受任何特定解释的束缚，假设在狗中第三次重复皮下给药后，SEQ ID NO:52的胰岛素-Fc融合蛋白的生物活性显著降低的原因是由于产生了中和其生物活性的抗药物抗体。抗药物抗体可以针对胰岛素-Fc融合蛋白的胰岛素多肽、接头或Fc片段部分。免疫原性反应表现为抗原呈递细胞、T辅助细胞、B细胞及其相关细胞因子之间的相互作用，这可能导致产生针对该药物的内源性抗体(例如抗药物抗体)。结合抗体是能够结合胰岛素-Fc融合蛋白的所有同种型，并且可以在如实例13所述的免疫测定中检测这些抗体。抑制胰岛素-Fc融合蛋白的功能活性的中和抗体通常针对生物活性所需的表位。为了评估是否是这种情况，根据实例13，测试在施用每种剂量之前和在实例11和12所述的实验结束时收集的血清，以定量抗药物抗体的水平。如图7所示，抗药物抗体的水平确实随着化合物的多次皮下施用而增加，这表明在第三次注射SEQ ID NO:52的胰岛素Fc-融合蛋白之后，中和抗药物抗体的产生是NAOCR下降的可能原因。
实例22：包含SEQ ID NO:5的胰岛素多肽和犬科动物IgGB同种型Fc片段的非糖基 化的胰岛素-Fc融合蛋白，以降低免疫原性的潜在风险
如实例19和20所示，SEQ ID NO:52的胰岛素-Fc融合蛋白在狗中示出了可接受的同型二聚体含量％、同型二聚体滴度和生物活性；然而，其用于慢性疾病诸如糖尿病的用途由于在重复皮下给药的情况下生物活性的降低(实例21)和抗药物抗体的产生(实例21)而受到损害。不受任何特定理论的束缚，产生抗药物抗体和生物活性降低的一个可能原因是犬科动物IgGB Fc片段与犬科动物免疫系统的各种受体(例如Fc(γ)受体，例如Fc(γ)RI)的增加的相互作用。然而，犬科动物IgGB同种型是四种犬科动物IgG同种型中的唯一一种，当用于Fc片段时，其产生符合可制造性和单剂量生物活性设计目标的胰岛素-Fc融合蛋白(实例16)。如本发明的具体实施中所述，一种用于减少Fc(γ)相互作用的方法涉及突变Fc片段cNg位点以防止在宿主细胞中合成期间的糖基化。因此，对SEQ ID NO:52的Fc片段区域进行cNg位点突变，以降低体内Fc片段对Fc(γ)受体的结合亲和力，如在实例8所述的体外人Fc(γ)RI结合测定中所测量的。使用实例5的LC-MS方法进行了聚糖缺乏的验证，但省略了PNGase F治疗步骤。SEQ ID NO:52的胰岛素-Fc融合蛋白中cNg位点的位置是cNg-NB139。SEQ ID NO:52的突变包括SEQ ID NO:58(包含cNg-NB139-Q的突变)；SEQ ID NO:60(包含cNg-NB139-S的突变)；SEQ ID NO:62(包含cNg-NB139-D的突变)；以及SEQ ID NO:64(包含cNg-NB139-K的突变)。下面列出了cNg-突变的胰岛素-Fc融合蛋白的完整氨基酸序列(其中NB139位置加下划线)，并在图8中示出了所得的序列比对(Clustal Omega)：
FVNQHLCGSDLVEALALVCGERGFFYTDPTGGGPRRGIVEQCCHSICSLYQLENYCNGGGGAGGGGDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFQGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG(SEQ IDNO:58)
FVNQHLCGSDLVEALALVCGERGFFYTDPTGGGPRRGIVEQCCHSICSLYQLENYCNGGGGAGGGGDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFSGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG(SEQ IDNO:60)
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FVNQHLCGSDLVEALALVCGERGFFYTDPTGGGPRRGIVEQCCHSICSLYQLENYCNGGGGAGGGGDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFKGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG(SEQ IDNO:64)
根据实例1在HEK293细胞中制备胰岛素-Fc融合蛋白，并根据实例3使用蛋白A柱纯化。根据实例4通过非还原和还原CE-SDS来确认胰岛素-Fc融合蛋白的结构，并根据实例5通过去除聚糖的LC-MS进一步鉴定序列。根据实例6，通过尺寸排阻色谱法来测量同型二聚体％。如表5所示，SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:64的胰岛素-Fc融合蛋白的同型二聚体滴度符合设计目标，而含有cNg-NB139-Q突变的SEQ ID NO:58的胰岛素-Fc融合蛋白出乎意料地并不符合同型二聚体滴度的设计目标。
Figure BDA0002955236580000641
为了确定剩余的三种化合物中哪一种最可能表现出降低的免疫原性，根据实例8的程序来测量Fc(γ)受体结合。低Fc(γ)受体结合最可能与最低的免疫原性相关。表6比较了这些胰岛素-Fc融合蛋白的Fc(γ)受体I结合与SEQ ID NO:52的胰岛素-Fc融合蛋白的Fc(γ)受体结合，出乎意料地证明了含有cNg-D突变的SEQ ID NO:62的胰岛素-Fc融合蛋白表现出的Fc(γ)受体结合活性是含有cNg-S突变的SEQ ID NO:60和含有cNg-K突变的SEQ IDNO:64的胰岛素-Fc融合蛋白的大约两倍。因此，仅包含后两种含有cNg-S突变和cNg-K突变的化合物的胰岛素-Fc融合蛋白被认为适合于狗中的重复给药生物活性测试。
Figure BDA0002955236580000642
实例23：带有非糖基化的cNg-K和cNg-S犬科动物IgGB同种型Fc片段的SEQ ID NO: 5的胰岛素多肽的体内生物活性和免疫原性的评估
为了确定含有cNg-S突变的SEQ ID NO:60的胰岛素-Fc融合蛋白是否改善了狗中的重复给药生物活性性能，根据实例11的程序，在第0天、第7天、第14天和第28天将该化合物皮下施用给N＝1只狗。当狗的％FBGL下降太低时，向狗提供食物以将血糖升高到安全水平。第一次注射的NAOC为191％FBGL·天·kg/mg，表明SEQ ID NO:60的胰岛素-Fc融合蛋白在体内具有令人满意的生物活性。还根据实例11的一般程序测量了每次后续给药的NAOC和NAOCR，从施用剂量的时间开始计算，直到刚好在施用下一剂量前。表7所示的NAOC和NAOCR表明，SEQ ID NO:60的胰岛素-Fc融合蛋白表现出在四剂量方案的剂量3和4下显著降低的NAOCR。因此，尽管含有cNg-S突变的SEQ ID NO:60的胰岛素-Fc融合蛋白的Fc(γ)RI结合率比SEQ ID NO:52的胰岛素-Fc融合蛋白的Fc(γ)RI结合率低4倍，但含有cNg-S突变的SEQID NO:60的胰岛素-Fc融合蛋白在狗中无法证明重复给药生物活性。
Figure BDA0002955236580000651
为了确定含有cNg-K突变的SEQ ID NO:64的胰岛素-Fc融合蛋白是否改善了狗中的重复给药生物活性性能，根据实例11的程序在第0天、第7天、第14天和第28天将化合物皮下施用给N＝1只狗。当狗的％FBGL下降太低时，向狗提供食物以将血糖升高到安全水平。第一次注射的NAOC为449％FBGL·天·kg/mg，表明SEQ ID NO:64的胰岛素-Fc融合蛋白在体内具有令人满意的生物活性。还通过实例12的方法使用ELISA来测量该化合物的药代动力学概况，并将双室模型拟合于数据以确定其消除半衰期(为约0.9天)。还根据实例11的一般程序测量了每次后续给药的NAOC和NAOCR，从施用剂量的时间开始计算，直到刚好在施用下一剂量前。表8所示的NAOC和NAOCR表明，在整个四个剂量中，SEQ ID NO:64的胰岛素-Fc融合蛋白保持大于0.6的NAOCR。因此，出乎意料的是，含有cNg-K突变的SEQ ID NO:64的胰岛素-Fc融合蛋白是SEQ ID NO:52的胰岛素-Fc融合蛋白的唯一非糖基化的突变体，从而显著改善了狗中的重复给药生物活性。
Figure BDA0002955236580000661
根据实例13，还在整个治疗过程(28天)和另外两周内测量了抗药物和抗胰岛素抗体的水平。图9说明了在狗中重复皮下给药的情况下，SEQ ID NO:64的胰岛素-Fc融合蛋白仍然产生抗药物抗体，但是抗药物抗体滴度远低于由SEQ ID NO:52的胰岛素-Fc融合蛋白产生的那些(实例19)。
实例24：筛选含有抗药物抗体的犬科动物血清并鉴定胰岛素多肽的B10D和A8H位 置的潜在免疫原性表位
将犬科动物IgGB Fc片段的cNg位点突变为Lys(即cNg-K)确实改善了包含SEQ IDNO:5的胰岛素多肽和SEQ ID NO:12的肽接头的胰岛素-融合蛋白的重复给药生物活性(实例23)，但所得的SEQ ID NO:64的胰岛素-Fc融合蛋白仍产生抗药物抗体(实例23)。因此，假设SEQ ID NO:5的胰岛素多肽可能出乎意料地含有狗的免疫系统针对的特定表位(即免疫原性“热点”)。因此，按照实例15的一般步骤评价实例13中所述的血清样品中存在的抗体的结合特异性。对来自针对包被的胰岛素-Fc融合蛋白文库重复给药SEQ ID NO:52的胰岛素-Fc融合蛋白(实例19)的含抗体血清样品的分析表明，在SEQ ID NO:5的胰岛素多肽序列中出乎意料地存在两个主要“热点”：来自B链的N末端第10位的天冬氨酸突变(即B10)，以及来自A链的N末端第8位的组氨酸突变(即A8)。结果表明，包含含有这两种特定氨基酸突变的胰岛素多肽氨基酸组合物的胰岛素-Fc融合蛋白在狗中可能具有免疫原性，并且因此可能产生在重复注射后中和生物活性的抗药物抗体。因此，可以确定，不包含B10天冬氨酸和A8组氨酸的胰岛素多肽优选地用于需要在狗中长期重复给药的胰岛素-Fc融合蛋白(例如，用于治疗犬科动物糖尿病)。
实例25：包含SEQ ID NO:5的胰岛素多肽和非糖基化的犬科动物IgGB同种型Fc片 段的胰岛素-Fc融合蛋白，其中胰岛素多肽的B10D和A8H突变被恢复至天然组成以降低免疫 原性的潜在风险
为了评估替换“热点”突变是否将改善包含SEQ ID NO:5的胰岛素多肽和犬科动物IgGB同种型片段的胰岛素-Fc融合蛋白的免疫原性和重复给药生物活性，合成了示例性的胰岛素-Fc融合蛋白(SEQ ID NO:66)，其中胰岛素多肽的B10和A8氨基酸分别恢复到它们的天然组氨酸和苏氨酸组成(下面列出的SEQ ID NO:125，其中非天然氨基酸被加下划线)。
FVNQHLCGSHLVEALALVCGERGFFYTDPTGGGPRRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN(SEQ ID NO:125)
此外，考虑到非糖基化的cNg突变体的额外潜在益处，SEQ ID NO:66的胰岛素-Fc融合蛋白含有cNg-Q突变。SEQ ID NO:66的胰岛素-Fc融合蛋白的完整氨基酸序列在下面给出：
FVNQHLCGSHLVEALALVCGERGFFYTDPTGGGPRRGIVEQCCTSICSLYQLENYCNGGGGAGGGGDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFQGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG(SEQ IDNO:66)
根据实例1在HEK293细胞中制备SEQ ID NO:66的胰岛素-Fc融合蛋白，并根据实例3使用蛋白A柱纯化。所得到的蛋白质产量仅为21mg/L。根据实例4通过非还原和还原CE-SDS来确认结构，并根据实例5通过去除聚糖的LC-MS进一步鉴定序列。根据实例6通过尺寸排阻色谱法所测量的同型二聚体％为98.0％，表明蛋白质相对不含聚集体。
尽管21mg/L的相对低的同型二聚体滴度，分别根据实例11-13的程序在狗中评估了SEQ ID NO:66的胰岛素-Fc融合蛋白的体内生物活性和免疫原性。图10表明，在SEQ IDNO:66的胰岛素-Fc融合蛋白中B10D和A8H突变恢复为其天然氨基酸(即B10H和A8T)确实显著降低了母体化合物(SEQ ID NO:52)的免疫原性。
然而，如图11所示，含有天然B10和A8氨基酸的SEQ ID NO:66的胰岛素-Fc融合蛋白不具有生物活性(即NAOC基本上为零)。
实例26：试图将额外的B链和A链突变掺入到SEQ ID NO: 125的胰岛素多肽中，以 改善含有犬科动物IgGBFc片段的相关胰岛素-Fc融合蛋白的生物活性
与SEQ ID NO:52的胰岛素-Fc融合蛋白(实例20)相比，SEQ ID NO:66的胰岛素-Fc融合蛋白未产生抗药物抗体(实例25)的事实为SEQ ID NO:5的胰岛素多肽中的B10D和A8H突变可能是负责产生抗药物抗体的免疫原性表位的理论提供了强有力的证据。然而，与SEQID NO:52相比，SEQ ID NO:66的胰岛素-Fc融合蛋白的体内效力的缺乏表明这两个氨基酸突变也有助于达到可接受水平的生物活性。如根据实例7的方法通过胰岛素受体结合测定所测量的，SEQ ID NO:66的胰岛素-Fc融合蛋白的体内效力的缺乏与其高IC50(如下表9所示)相关。因此，需要进一步努力来增加胰岛素-Fc融合蛋白的生物活性(即，将胰岛素受体结合测定IC50值降低至小于5000nM，或更优选地小于4000nM，或甚至更优选地小于3000nM)，同时通过在胰岛素多肽中保持天然的B10和A8氨基酸来维持低程度的免疫原性。
众所周知，胰岛素B链和A链的各个部分都是与IR强结合所必需的(Hubbard S.R.,“Structural biology:Insulin meets its receptor”,Nature.2013；493(7431):171-172)。因此，B链或A链的部分被修饰，同时保持B10和A8与天然胰岛素相同并且C链和肽接头恒定。根据实例1在HEK293细胞中制备这些胰岛素-Fc融合蛋白中的几种，并且根据实例3使用蛋白A柱纯化。根据实例4，通过非还原和还原CE-SDS确认它们的结构，并且根据实例5，通过去除聚糖的LC-MS进一步鉴定序列。根据实例6，通过尺寸排阻色谱法测量它们的同型二聚体含量％，并且根据实例7来测量它们的胰岛素受体结合亲和力。它们的序列如下所示，并且所得的序列针对SEQ ID NO:66的比对在图12中示出(Clustal Omega)。
FVNQHLCGSHLVQALYLVCGERGFFYTDPTGGGPRRGIVEQCCTSICSLYQLENYCGGGGAGGGGDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFSGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG(SEQ IDNO:68)
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Figure BDA0002955236580000691
与SEQ ID NO:66相比，仅在三种情况下(SEQ ID NO：68、70和74)，提出的突变确实改善IR结合(即降低IC50值)。然而，这些突变均未产生符合大于50mg/L的同型二聚体滴度的生产设计目标的化合物，并且在一些情况下，这些突变导致显著降低的可生产性(例如，同型二聚体滴度小于20mg/L)。
实例27：试图将C链突变并入到SEQ ID NO:125的胰岛素多肽中，以改善含有犬科 动物IgGB Fc片段的相关胰岛素-Fc融合蛋白的生物活性
实例26中获得的结果示出了，所有突变SEQ ID NO:125的胰岛素多肽A链和B链的尝试导致相关胰岛素-Fc融合的不可接受的低HEK同型二聚体滴度(即，同型二聚体滴度小于或等于25mg/L)。因此，有必要进行进一步的实验。在本实例中，SEQ ID NO:125的胰岛素多肽的C链组成通过使其更长或通过增加其柔性被突变。已经示出天然胰岛素(例如人胰岛素)在与胰岛素受体结合时经历显著的构象变化，其包括B链和A链折叠的移动(例如，如Menting等人,Nature,2013；493(7431):pp241–245所描述的)。与本发明的胰岛素多肽不同，天然胰岛素能够在胰岛素受体处自由地经历这种构象变化，因为它是其天然形式的双链多肽，仅通过两个二硫键连接，没有C链限制A链和B链的移动性。不受任何特定理论的束缚，假设SEQ ID NO:125的胰岛素多肽中包含的C链太过刚性(例如，氨基酸组成和序列不允许在B链和A链之间轻松移动)和/或太短(例如，在B链的C末端与A链的N末端之间没有足够的氨基酸)，从而阻止胰岛素多肽经历与胰岛素受体强结合所需的分子形状的必要变化。因此，基于SEQ ID NO:66的胰岛素-Fc融合蛋白合成了若干种胰岛素-Fc融合蛋白，其中胰岛素多肽C链中的变化如下所示，其中所得的序列针对SEQ ID NO:66的比对在图13中示出(Clustal Omega)。
FVNQHLCGSHLVQALYLVCGERGFFYTDPTQRGGGGGQRGIVEQCCTSICSLYQLENYCGGGGAGGGGDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFSGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG(SEQID NO:78)
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Figure BDA0002955236580000711
根据实例1在HEK293细胞中制备胰岛素-Fc融合蛋白，并根据实例3使用蛋白A柱纯化。根据实例4，通过非还原和还原CE-SDS来确认它们的结构，并且根据实例5，通过去除聚糖的LC-MS进一步鉴定序列。根据实例6，通过尺寸排阻色谱法来测量它们的同型二聚体含量％，并且根据实例7，测量它们的胰岛素受体结合亲和力。仅在一个病例(包含最长C链(GGGGGGSGGGG)的(SEQ ID NO:80))中，与SEQ ID NO:66的胰岛素-Fc融合蛋白相比，C链突变确实显著提高了胰岛素受体结合亲和力(IC50小于3000nM)。然而，这些经C链突变的胰岛素-Fc融合蛋白均未表现出高于50mg/L的生产设计目标的同型二聚体滴度。事实上，在一个病例(SEQ ID NO:78)中，C链突变出乎意料地导致显著较低的同型二聚体滴度。
实例28：试图将肽接头突变掺入到含有SEQ ID NO:125的胰岛素多肽和犬科动物 IgGB Fc片段的胰岛素-Fc融合蛋白中以提高生物活性
不受任何特定理论的束缚，SEQ ID NO:66的胰岛素-Fc融合蛋白的不良的胰岛素受体结合的另一种可能原因被认为涉及胰岛素多肽与胰岛素受体之间的空间位阻，该空间位阻是由通过肽接头连接到胰岛素多肽的大得多的Fc片段分子的紧密接近所产生的。较短的肽接头或更紧密折叠的肽接头被认为可能会加剧这一问题，而较长的肽接头或自身抗折叠的肽接头(例如具有更大的分子刚性的接头)可能通过在胰岛素多肽与Fc片段之间创建更多的空间来缓解这一问题。胰岛素多肽与Fc片段之间的增加的空间也会增加胰岛素受体与Fc片段之间的距离，从而导致在胰岛素受体结合期间更少的干扰。用于构建SEQ ID NO:66的胰岛素-Fc融合蛋白的SEQ ID NO:12的肽接头(即GGGGAGGGG)被假设为可能太短和/或太柔性，因为包含接头的氨基酸不包含侧链(即它仅包含甘氨酸和丙氨酸氨基酸)。因此，为了检验这一假设，合成了SEQ ID NO:66的胰岛素-Fc融合蛋白的另外两种胰岛素-Fc融合蛋白变体。SEQ ID NO:76的胰岛素-Fc融合蛋白包含与用于构建SEQ ID NO:66的胰岛素-Fc融合蛋白相同的肽接头，但带有一种胰岛素多肽，其中不存在来自A链的N末端第21位的天冬酰胺(即A21)(即des-A21)。掺入这种特定突变是为了观察A链与肽接头之间的连接是否影响蛋白质产量和/或分子的生物活性。SEQ ID NO:86的其他胰岛素-Fc融合蛋白包含这种des-A21N A链突变和长度比用于构建SEQ ID NO:66的胰岛素-Fc融合蛋白的长度大超过两倍的肽接头。在该较长的肽接头中，丙氨酸不受欢迎，而是用谷氨酰胺代替，它含有极性酰胺侧链。谷氨酰胺取代预期增加肽接头的亲水性，并且潜在地防止接头向自身折叠。序列如下所示，其中相对于SEQ ID NO:66的所得的序列比对在图14中示出(Clustal Omega)。
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FVNQHLCGSHLVEALALVCGERGFFYTDPTGGGPRRGIVEQCCTSICSLYQLENYCGGGGAGGGGDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFSGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG(SEQ IDNO:76)
Figure BDA0002955236580000721
Figure BDA0002955236580000731
根据实例1在HEK293细胞中制备两种胰岛素-Fc融合蛋白，并根据实例3使用蛋白A柱纯化。根据实例4，通过非还原和还原CE-SDS来确认它们的结构，并且根据实例5，通过去除聚糖的LC-MS进一步鉴定序列。根据实例6，通过尺寸排阻色谱法来测量它们的同型二聚体含量％，并且根据实例7，测量它们的胰岛素受体结合亲和力。掺入不同组成的较长肽接头(SEQ ID NO:86的GGGGGQGGGGQGGGGQGGGGG相对于SEQ ID NO:66的GGGGAGGGG)确实改善了胰岛素受体结合，如通过IC50值的显著降低所测量的，这表明较长的接头可能是用于增加其他胰岛素-Fc融合蛋白的胰岛素受体结合的策略。然而，掺入较长的接头仍未将同型二聚体滴度提高到高于大于50mg/L的生产设计目标。
实例29：试图删除SEQ ID NO:125的胰岛素多肽的B链的部分， 以提高含有犬科动 物IgGBFc片段的相关胰岛素-Fc融合蛋白的同型二聚体滴度
来自实例28的结果表明，肽接头可以被修饰以增加SEQ ID NO:66的胰岛素-Fc融合蛋白的胰岛素受体结合亲和力，该胰岛素-Fc融合蛋白包含天然的B10和A8氨基酸。然而，肽接头突变未能将同型二聚体滴度提高到足以符合生产设计目标。由于同型二聚体滴度是若干种性质(包括细胞内合成和在细胞内的加工)的函数，因此假设胰岛素-Fc分子在合成期间和在合成后可能在同型二聚体的两种单体之间进行分子内自缔合(即聚集)，或者在两种或更多种单独的同型二聚体之间进行分子间自缔合。这种聚集将导致在实例1、3和6所述的生产过程期间从细胞培养上清液中获得不可接受的低同型二聚体滴度。胰岛素-Fc融合蛋白分子之间的这种潜在的相互作用可能部分地是由于胰岛素众所周知的自缔合和形成聚集体的倾向。本领域中已知的一种降低胰岛素自缔合倾向的方法包括使B链的C末端附近的氨基酸突变。例如，赖脯胰岛素(B28K；B29P突变)和门冬胰岛素(B28D突变)是众所周知的具有非天然B链突变的商业双链胰岛素，其防止缔合和聚集，从而产生溶液中胰岛素的主要单体形式。防止聚集的另一种方法涉及氨基酸结构缺失。例如，被称为去五肽胰岛素的双链胰岛素(DPPI；参见Brange J.,Dodson G.G.,Edwards J.,Holden P.H.,WhittinghamJ.L.1997b.“A model of insulin fibrils derived from the x-ray crystalstructure of a monomeric insulin(despentapeptide insulin)”Proteins 27 507–516)与天然双链人胰岛素相同，不同之处在于B链(YTPKT)的五个C末端氨基酸被去除。与天然的双链人胰岛素相比，DPPI具有对胰岛素受体的较低的结合亲和力，但在溶液中完全为单体，这意味着在DPPI分子之间没有显著的缔合或聚集。因此，为了试图降低分子内和分子间自缔合的可能性并提高胰岛素-Fc融合蛋白同型二聚体滴度，使用部分B链氨基酸截短和B链氨基酸突变构建了SEQ ID NO:66的胰岛素-Fc融合蛋白的若干种变体，如上文针对DPPI、赖脯胰岛素和门冬胰岛素所描述的。序列如下所示，其中相对于SEQ ID NO:66的所得的序列比对在图15中示出(Clustal Omega)。
FVNQHLCGSHLVEALALVCGERGFFYTDPGGGGGGGGGIVEQCCTSICSLYQLENYCGGGGAGGGGDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFSGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG(SEQ IDNO:82)
FVNQHLCGSHLVEALALVCGERGFFYTPGGGGGGGGGIVEQCCTSICSLYQLENYCGGGGAGGGGDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFSGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG(SEQ IDNO:84)
FVNQHLCGSHLVEALALVCGERGFFYTQGGGGGGGGGIVEQCCTSICSLYQLENYCGGGGAGGGGDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFSGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG(SEQ IDNO:88)
Figure BDA0002955236580000741
根据实例1在HEK293细胞中制备胰岛素-Fc融合蛋白，并根据实例3使用蛋白A柱纯化。根据实例4，通过非还原和还原CE-SDS来确认它们的结构，并且根据实例5通过去除聚糖的LC-MS进一步鉴定序列。根据实例6，通过尺寸排阻色谱法来测量它们的同型二聚体含量％，并且根据实例7测量它们的胰岛素受体结合亲和力。仅在一个病例(SEQ ID NO:82)中，所得化合物的同型二聚体滴度显著升高，但出乎意料的是，对于所有突变的化合物，胰岛素受体亲和力均被提高(SEQ ID NO:82、88和84)。
实例30：试图将B链、C链和A链突变、B链截短和接头突变与SEQ ID NO:66的胰岛 素-Fc融合蛋白结合，以进一步提高同型二聚体滴度和生物活性
如实例26、27、28和29所示，没有单一策略成功地将包含非免疫原性天然B10和A8氨基酸的胰岛素多肽与犬科动物IgGB Fc片段掺入以形成具有可接受的胰岛素受体活性和同型二聚体滴度的胰岛素-Fc融合蛋白。因此，将更长的C链、更长的肽接头和B链的C末端氨基酸截短的概念结合。此外，为了潜在地进一步降低自缔合和聚集的倾向，使用较低的疏水性氨基酸(包括具有在生理pH下带负电荷或带正电荷的侧基的氨基酸)，将额外的点突变引入到天然胰岛素疏水性氨基酸残基位点中。示例性的突变包括酪氨酸至丙氨酸、酪氨酸至谷氨酸、异亮氨酸至苏氨酸和苯丙氨酸至组氨酸。此外，为了简化分析，在所有情况下，犬科动物IgGB Fc片段的cNg位点均恢复为其天然天冬酰胺。这些胰岛素-Fc融合蛋白变体的序列如下所示，其中相对于SEQ ID NO:66的所得的序列比对在图16中示出(Clustal Omega)。
FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFFYTPKTGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLDQLENYCGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFNGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG(SEQ ID NO:90)
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FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLDQLENYCNGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFNGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG(SEQ ID NO:34)
FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLDQLENYCGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFNGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG(SEQ ID NO:32)
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Figure BDA0002955236580000761
根据实例1在HEK293细胞中制备胰岛素-Fc融合蛋白，并根据实例3使用蛋白A柱纯化。根据实例4，通过非还原和还原CE-SDS来确认它们的结构，并且根据实例5，通过去除聚糖的LC-MS进一步鉴定序列。根据实例6，通过尺寸排阻色谱法来测量它们的同型二聚体含量％，并且根据实例7，测量它们的胰岛素受体结合亲和力。结果表明，降低某些B链和A链氨基酸的疏水性、使用更长的且更柔性的C肽序列、截短若干个C末端B链氨基酸以及使用更长的肽接头的组合导致若干种有用的胰岛素-Fc融合蛋白，这些胰岛素-Fc融合蛋白符合最低同型二聚体滴度和胰岛素受体结合活性设计标准。SEQ ID NO:92、34、32和94(368d)、(366d)、(218d)和(375d)示出了，与SEQ ID NO:66或SEQ ID NO:90相比更优选的胰岛素受体IC50值(小于3000nM)和更优选的HEK同型二聚体滴度值(大于100mg/L)。令人惊讶的是，仅改变几个氨基酸就导致胰岛素受体亲和力的多倍改善，并且在SEQ ID NO:32的胰岛素-Fc融合蛋白的情况下，同型二聚体滴度相对于SEQ ID NO:66的原始胰岛素-Fc融合蛋白显著增加。
实例31：由SEQ ID NO:7的胰岛素多肽、SEQ ID NO:14的肽接头和SEQ ID NO:16的 犬科动物IgGBFc片段构建的胰岛素-Fc融合蛋白的体内生物活性、重复给药生物活性和免 疫原性
鉴于来自实例30的阳性同型二聚体滴度和胰岛素受体结合活性，在狗中测试了两种最有希望的胰岛素-Fc融合蛋白(SEQ ID No:32和34)，以评估重复给药的生物活性和免疫原性。每种化合物都包含较长的、更亲水的SEQ ID NO:14的肽接头和更易制造的、较少聚集的SEQ ID NO:16的犬科动物IgGB Fc片段。最重要的是，两种胰岛素-Fc融合蛋白都包含具有假定较低免疫原性的天然B10和A8氨基酸的胰岛素多肽(即，通用SEQ ID NO:7)。在SEQID NO:34的胰岛素-Fc融合蛋白的情况下，存在位于位置A21处的天冬酰胺(即胰岛素多肽包含SEQ ID NO:9)。在SEQ ID NO:32的胰岛素-Fc融合蛋白的情况下，位置A21处的天冬酰胺不存在(即胰岛素多肽包含SEQ ID NO:8)。
根据实例10的程序，在N＝1只狗中测试了SEQ ID NO:34的胰岛素-Fc融合蛋白的体内生物活性。图17中所示的单次皮下给药的结果证明，SEQ ID NO:34的胰岛素-Fc融合蛋白在体内确实具有生物活性，其中根据实例11中的程序计算的NAOC为1076％FBGL·天·kg/mg。使用ELISA法，通过实例12的方法来测量SEQ ID NO:34的胰岛素-Fc融合蛋白的药代动力学概况，并且将双室模型拟合于数据，以确定其消除半衰期(其为3.5天)。
然后根据实例8的程序，通过在初始注射后第14天、第28天和第42天继续对N＝1只狗皮下施用SEQ ID NO:34的胰岛素-Fc融合蛋白来评估重复给药生物活性。当狗的％FBGL下降太低时，向狗提供食物以将血糖升高到安全水平。根据实例11的一般程序，测量每次后续给药的NAOC和NAOCR，从施用剂量的时间开始计算，直到刚好在下一次施用剂量前。表14所示的NAOC和NAOCR表明，SEQ ID NO:34的胰岛素-Fc融合蛋白在整个四次给药中均保持大于0.8的NAOCR，因此符合重复给药生物活性设计目标。
Figure BDA0002955236580000781
根据实例13的程序来测试SEQ ID NO:34的胰岛素-Fc融合蛋白的免疫原性。图18表明，SEQ ID NO:34的胰岛素-Fc融合蛋白在体内没有表现出明显的免疫原性，这与在整个重复给药实验中维持体内生物活性一致。
还评估了SEQ ID NO:32的胰岛素-Fc融合蛋白(其中胰岛素多肽链的A21处的天冬酰胺缺失)在狗中的重复给药生物活性表现。根据实例11的程序，在第0天、第14天、第28天和第42天将化合物皮下施用给N＝1只狗。当狗的％FBGL下降太低时，向狗提供食物以将血糖升高到安全水平。第一次注射的NAOC为令人印象深刻的2278％FBGL·天·kg/mg，表明SEQ ID NO:32的胰岛素-Fc融合蛋白令人满意的体内生物活性，其几乎是SEQ ID NO:34的胰岛素-Fc融合蛋白的效力的两倍。使用ELISA，通过实例12的方法来测量胰岛素-Fc融合蛋白的药代动力学概况，并将双室模型拟合于数据，以确定其消除半衰期(其为4.1±0.7天)。图19和20示出了接受SEQ ID NO:32的同型二聚体的动物的单剂量血糖控制和多剂量、多周血糖控制。还根据实例11的一般程序测量了每次后续给药的NAOC和NAOCR，从施用剂量的时间开始计算，直到刚好在下一次剂量施用前。表15所示的NAOC和NAOCR表明，SEQ ID NO:32的胰岛素-Fc融合蛋白在四次给药期间保持大于或等于1.0的NAOCR，因此符合实例16所述的重复给药生物活性设计目标。
根据实例13的程序来测试SEQ ID NO:32的胰岛素-Fc融合蛋白的免疫原性。图21表明，SEQ ID NO:32的胰岛素-Fc融合蛋白在体内没有表现出明显的免疫原性，这与在整个重复给药实验中维持体内生物活性一致。
Figure BDA0002955236580000782
如在本发明的具体实施方式中所讨论的，已知的酶切位点存在于天冬酰胺-甘氨酸键之间(Vlasak,J.,Ionescu,R.,(2011)MAbs Vol.3,No.3pp 253-263)。省略SEQ ID NO:32的胰岛素-Fc融合蛋白中包含的SEQ ID NO:8的胰岛素多肽中A链第21个氨基酸(即A21)处的天冬酰胺与SEQ ID NO:14的肽接头，消除了酶切A链的C末端与肽接头的N末端之间的天冬酰胺-甘氨酸键的可能性。然而，SEQ ID NO:34的胰岛素-Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:14的肽接头和SEQ ID NO:8的胰岛素多肽，其将天冬酰胺保留在A21。因此，将预期SEQ IDNO:34的胰岛素-Fc融合蛋白将在合成期间或在体内皮下施用后被酶促消化。然而，出乎意料的是，SEQ ID NO:34的胰岛素-Fc融合蛋白可在HEK细胞中生产，具有可接受的同型二聚体滴度，并在体内表现出可接受的生物活性，其中无酶促消化损害其生物活性的迹象。
实例32：针对包含SEQ ID NO:8的优选的胰岛素多肽和SEQ ID NO:14的优选的肽 接头的胰岛素-Fc融合蛋白的最佳可制造性和体内功效的犬科动物IgGB同种型Fc片段的确 认
如实例30和31所述，在发现新的胰岛素多肽和肽接头组合产生非免疫原性的、高产量、高纯度和高生物活性的胰岛素-Fc融合蛋白后，仍存在一个问题，即就同型二聚体滴度和生物活性而言，犬科动物IgGB Fc片段是否仍是优选的同种型，如实例19和20中胰岛素-Fc融合蛋白的情况。因此，设计了额外的胰岛素-Fc融合蛋白，其中SEQ ID NO:32的胰岛素-Fc融合蛋白的胰岛素多肽(SEQ ID NO:8)和肽接头(SEQ ID NO:14)保持恒定，并且SEQID NO:16的犬科动物IgGB Fc片段被SEQ ID NO:15的犬科动物IgGA Fc片段、SEQ ID NO:17的犬科动物IgGC Fc片段或SEQ ID NO:18的犬科动物IgGD Fc片段替换。这些产生的胰岛素-Fc融合蛋白变体的序列如下所示：
FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLDQLENYCGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFNGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG(SEQ ID NO:32)
FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLDQLENYCGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGRCTDTPPCPVPEPLGGPSVLIFPPKPKDILRITRTPEVTCVVLDLGREDPEVQISWFVDGKEVHTAKTQSREQQFNGTYRVVSVLPIEHQDWLTGKEFKCRVNHIDLPSPIERTISKARGRAHKPSVYVLPPSPKELSSSDTVSITCLIKDFYPPDIDVEWQSNGQQEPERKHRMTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQQGDPFTCAVMHETLQNHYTDLSLSHSPG(SEQ ID NO:96)
FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLDQLENYCGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGCNNCPCPGCGLLGGPSVFIFPPKPKDILVTARTPTVTCVVVDLDPENPEVQISWFVDSKQVQTANTQPREEQSNGTYRVVSVLPIGHQDWLSGKQFKCKVNNKALPSPIEEIISKTPGQAHQPNVYVLPPSRDEMSKNTVTLTCLVKDFFPPEIDVEWQSNGQQEPESKYRMTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQISLSHSPG(SEQ ID NO:98)
FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLDQLENYCGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGCISPCPVPESLGGPSVFIFPPKPKDILRITRTPEITCVVLDLGREDPEVQISWFVDGKEVHTAKTQPREQQFNSTYRVVSVLPIEHQDWLTGKEFKCRVNHIGLPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSPKELSSSDTVTLTCLIKDFFPPEIDVEWQSNGQPEPESKYHTTAPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQQGDTFTCAVMHEALQNHYTDLSLSHSPG(SEQ ID NO:100)
根据实例1在HEK293细胞中制备胰岛素-Fc融合蛋白，并根据实例3使用蛋白A或蛋白G柱纯化。根据实例4，通过非还原和还原CE-SDS来确认它们的结构，并且根据实例5，通过去除聚糖的LC-MS进一步鉴定序列。根据实例6，通过尺寸排阻色谱法测定它们的同型二聚体含量％，根据实例7，测量它们的胰岛素受体结合亲和力。此外，根据实例8测量胰岛素-Fc融合蛋白对犬科动物FcRn受体的亲和力。如表16所示，包含犬科动物IgGB Fc片段的SEQ IDNO:32的胰岛素-Fc融合蛋白示出了这些序列的最高的同型二聚体滴度。当使用蛋白A柱纯化时，包含犬科动物IgGA Fc片段的SEQ ID NO:96的胰岛素-Fc融合蛋白表现出较差的同型二聚体滴度；然而，当使用蛋白G柱纯化时，同型二聚体滴度显著提高，超过了大于50mg/L的设计目标。对于包含犬科动物IgGC Fc片段的SEQ ID NO:98的胰岛素-Fc融合蛋白也是如此。当用蛋白A或蛋白G柱纯化时，包含犬科动物IgGD Fc片段的SEQ ID:100的胰岛素-Fc融合蛋白未产生任何化合物。因此，如用含有不同的胰岛素多肽(SEQ ID NO:5)和肽接头(SEQID NO:12)的SEQ ID NO:52的胰岛素-Fc融合蛋白所证明的，就同型二聚体滴度而言，犬科动物IgGB是优选的Fc片段(参见实例19)。
Figure BDA0002955236580000811
DNM＝未测量；#＝通过蛋白A纯化；
Figure BDA0002955236580000812
＝通过蛋白G纯化。
根据实例10的程序测试了包含经由蛋白G纯化的犬科动物IgGA Fc片段的SEQ IDNO:96的胰岛素-Fc融合蛋白的体内生物活性。图22所示的结果表明，SEQ ID NO:96的胰岛素-Fc融合蛋白在体内仅具有一定的生物活性，其中根据实例11计算的NAOC仅为174％FBGL·天·kg/mg。
根据实例10的程序，通过测试的蛋白G来纯化包含犬科动物IgGC Fc片段的SEQ IDNO:98的胰岛素-Fc融合蛋白的体内生物活性。图23所示的结果示出了，SEQ ID NO:98的胰岛素-Fc融合蛋白在体内仅具有一定的生物活性，其中根据实例11计算的NAOC仅为39％FBGL·天·kg/mg。
因此，如用含有不同胰岛素多肽(SEQ ID NO:5)和肽接头(SEQ ID NO:12)的SEQID NO:52的胰岛素-Fc融合蛋白所证明的，就生物活性而言，犬科动物IgGB是优选的Fc片段(参见上面的实例19和20以及表16)。
实例33：包含SEQ ID NO:8的胰岛素多肽、SEQ ID NO:14的肽接头和犬科动物IgGB Fc片段的非糖基化的胰岛素-Fc融合蛋白以降低免疫原性的潜在风险
虽然SEQ ID NO:32的胰岛素-Fc融合蛋白符合所有设计目标(实例16)，但在延长的治疗时间段(例如6个月、1年、2年或更长时间)内可能存在或可能不存在免疫原性的风险，这可能损害该胰岛素-Fc融合蛋白用于治疗糖尿病的用途(如果发生这种情况)。如在本发明的具体实施方式中以及在实例21和22中所描述的，在重复给药后生物活性降低的一个可能原因是犬科动物IgGB Fc片段与狗免疫系统的不希望的相互作用，导致产生中和性抗药物抗体。然而，实例32中所示的结果出乎意料地证明，犬科动物IgGB同种型是四种犬科动物IgG同种型中产生期望的可制造性和生物活性的唯一选项。因此，探索了进一步的Fc突变，以获得具有低Fc(γ)RI受体结合的非糖基化的胰岛素-Fc融合蛋白，这可降低长期、慢性免疫原性风险。
如在本发明的具体实施中所描述的，一种用于减少Fc(γ)RI相互作用的方法包括突变Fc片段cNg位点以防止在宿主细胞中合成期间的糖基化。因此，对SEQ ID NO:32的Fc片段区域进行cNg位点突变，以降低体内Fc片段对Fc(γ)受体的结合亲和力，如通过在实例8所述的体外人Fc(γ)RI结合中的测定所测量的。SEQ ID NO:32的胰岛素-Fc融合蛋白中cNg位点的位置是cNg-NB151。SEQ ID NO:32的突变包括SEQ ID NO:104(包含cNg-NB151-S突变)和SEQ ID NO:102(包含相同的cNg-NB151-S突变以及NB119-A突变)。为了进一步试图减少与Fc(γ)RI的相互作用，掺入NB119-A，如Lo,M.等人“Effector attenuatingsubstitutions that maintain antibody stability and reduce toxicity in mice”,J.Biol.Chem.(2017),pp.1-20所描述的仅在小鼠抗体中使用。所得到的胰岛素-Fc融合蛋白的完整氨基酸序列以及其序列比对(Clustal Omega)在下面列出(为了清楚起见，NB119和NB151位点加下划线)，如图24所示：
FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLDQLENYCGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVALDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFSGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG(SEQ ID NO:102)
FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLDQLENYCGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFSGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG(SEQ ID NO:104)
根据实例1在HEK293细胞中制备胰岛素-Fc融合蛋白，并根据实例3使用蛋白A柱纯化。根据实例4，通过非还原和还原CE-SDS来确认它们的结构，并且根据实例5，通过去除聚糖的LC-MS进一步鉴定序列。根据实例6，通过尺寸排阻色谱法来测量它们的同型二聚体含量％，并且根据实例7，测量它们的胰岛素受体结合亲和力。如表17所示，在Fc片段上掺入cNg-NB151-S突变降低了同型二聚体％，表明聚集水平高得不可接受(即同型二聚体％降低至略高于70％)。
Figure BDA0002955236580000831
根据实例10的程序，在N＝1只狗中分别测试了SEQ ID NO:102和SEQ ID NO:104的胰岛素-Fc融合蛋白的体内生物活性。图25中所示的单次皮下给药的结果证明，两种化合物在体内的生物活性显著低于SEQ ID NO:32的胰岛素-Fc融合蛋白(SEQ ID NO:104的NAOC＝574％FBGL·天·kg/mg；SEQ ID NO:102的NAOC＝921％FBGL·天·kg/mg)。结果表明，在Fc片段上掺入cNg-NB151-S突变以产生非糖基化版本的SEQ ID NO:32的胰岛素-Fc融合蛋白出乎意料地降低了所得化合物的体内生物活性。
为了试图降低含有cNg-NB151-S位点突变的SEQ ID NO:104的胰岛素-Fc融合蛋白的聚集度并提高其生物活性，研究了各种胰岛素-多肽B链变体，其中在认为负责聚集的区域中具有突变。根据实例1在HEK293细胞中制备胰岛素-Fc融合蛋白，并根据实例3使用蛋白A柱纯化。根据实例4，通过非还原和还原CE-SDS来确认它们的结构，并且根据实例5，通过去除聚糖的LC-MS进一步鉴定序列。根据实例6，通过尺寸排阻色谱法来测量它们的同型二聚体含量％。在所测试的B链变体中，出乎意料地发现一种胰岛素Fc-融合蛋白(SEQ ID NO:36)，其来自在B链的N末端的第16个氨基酸处(即B16)含有酪氨酸至丙氨酸取代，该胰岛素Fc-融合蛋白具有高同型二聚体滴度(105mg/L)和低聚集性(99％同型二聚体)，导致104mg/L的同型二聚体滴度。根据实例7测量的胰岛素受体结合是可接受的，其中IC50为2040nM。根据实例9测量的FcRn受体结合亲和力EC50值为1194ng/mL。使用ELISA，通过实例12的方法来测量SEQ ID NO:36的胰岛素-Fc融合蛋白的药代动力学概况，并将双室模型拟合于数据以确定其消除半衰期(其为4.1±0.7天)。SEQ ID NO:36的序列如下所示(为了清楚起见，B16A和cNg-NB151-S突变被加下划线)。
FVNQHLCGSHLVEALALVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLDQLENYCGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFSGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG(SEQ ID NO:36)
然后评估了SEQ ID NO:36的胰岛素-Fc融合蛋白在狗中的重复给药生物活性性能。根据实例11的程序，在第0天、第7天、第14天和第28天将化合物皮下施用给N＝1只狗。当狗的％FBGL下降太低时，向狗提供食物以将血糖升高到安全水平。出乎意料的是，与SEQ IDNO:104的胰岛素-Fc融合蛋白相比，第一次注射含有B16A突变的SEQ ID NO:36的胰岛素-Fc融合蛋白的NAOC显著更高(1185％FBGL·天·kg/mg)。第一给药体内生物活性图在图26中示出。还通过实例12的方法使用ELISA来测量该化合物的药代动力学概况，并且将双室模型拟合于数据以确定其消除半衰期(其为3.5天)。还根据实例11的一般程序测量了每次后续给药的NAOC和NAOCR，从施用剂量的时间开始计算，直到刚好在下一次剂量施用前。表18所示的NAOC和NAOCR表明，SEQ ID NO:36的胰岛素-Fc融合蛋白在整个四次给药中保持大于或等于0.6的NAOCR，因此符合重复给药生物活性设计目标。总之，结果表明有必要对胰岛素B链序列进行突变，以获得SEQ ID NO:32的合适的非糖基化的cNg-S变体。因此，对于包含cNg突变的犬科动物IgGB Fc片段的非糖基化的胰岛素-Fc融合蛋白，SEQ ID NO:11的胰岛素多肽是优选的。
Figure BDA0002955236580000841
最后，根据实例8的程序，通过测量它们的Fc(γ)受体结合活性，测试所选化合物与免疫系统相互作用的可能性。表19比较了这些胰岛素-Fc融合蛋白的Fc(γ)受体I结合与SEQ ID NO:52的胰岛素-Fc融合蛋白的Fc(γ)受体结合。可以看出，非糖基化的胰岛素-Fc融合蛋白(通过cNg-S突变实现)表现出最低的与SEQ ID NO:52的Fc(γ)受体结合比率。
Figure BDA0002955236580000851
实例34：使用通过稳定转染的CHO细胞系制备的包含犬科动物IgGB来源的Fc片段 的优选的胰岛素-Fc融合蛋白的示例性的基于CHO的生产运行
如实例2所述，构建用编码SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:36的载体稳定转染的分离的CHO细胞系。将14天生产运行(0.5-2.0L培养基规模)的补料分批摇瓶以50万个细胞/mL接种在设定为37℃和5％二氧化碳的培养箱-摇动器中，并且如上述实例2所述进行运行，不同之处在于用CD OptiCHO代替Dynamis作为生长培养基(ThermoFisher)并且使用高效饲料C(ThermoFisher)作为饲料。从生产运行第3天开始以3％v/v添加饲料，并且在第4天，将摇瓶温度调节至32℃，并将培养箱-摇瓶二氧化碳浓度从5％降低至2％。在运行期间，细胞增加至800万-1400万个细胞/mL，并且在第14天收获生产运行以除去细胞，并纯化和测试培养物上清液以获得如实例3、4、5和6所述的胰岛素-Fc融合蛋白。表20描述了从用稳定转染的CHO细胞系的生产运行中获得的生产数据。
Figure BDA0002955236580000852
Figure BDA0002955236580000861
实例35：使用通过稳定转染的CHO细胞系制备的包含犬科动物IgGB来源的Fc片段 的优选的胰岛素-Fc融合蛋白的示例性的基于CHO的生产运行
如实例2所述，构建用编码SEQ ID NO:34的载体稳定转染的CHO细胞系。将14天生产运行(0.5-2.0L培养基规模)的补料分批摇瓶以50万个细胞/mL接种在设定为37℃和5％二氧化碳的培养箱-摇瓶中，并且如实例2所述进行运行，不同之处在于用CD OptiCHO代替Dynamis作为生长培养基(ThermoFisher)并且使用高效饲料C(ThermoFisher)作为饲料。从生产运行第3天开始以3％v/v添加饲料，并且在第4天，将摇瓶温度调节至32℃，并将培养箱-摇瓶二氧化碳浓度从5％降低至2％。在第14天，收获生产运行以除去细胞，并且纯化和测试培养物上清液以获得如实例3、4、5和6所述的胰岛素-Fc融合蛋白。所得的生产运行给出了大于200mg/L的蛋白质产量、大于95％的同型二聚体和大于190mg/L的SEQ ID NO:34的同型二聚体滴度。
结果-包含猫科动物FC片段的胰岛素-FC融合蛋白
实例36：包含猫科动物IgG2同种型的Fc片段的胰岛素-Fc融合蛋白
为了开发适用于猫的产品，尝试使用具有以下氨基酸序列的SEQ ID NO:13的肽接头来生产胰岛素-Fc融合蛋白，所述胰岛素-Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:4的胰岛素多肽序列和猫科动物IgG2同种型的Fc片段(SEQ ID NO:21)：
FVNQHLCGSDLVEALYLVCGERGFFYTDPTGGGPRRGIVEQCCHSICSLYQLENYCNGGGGSGGGGGEGPKCPVPEIPGAPSVFIFPPKPKDTLSISRTPEVTCLVVDLGPDDSNVQITWFVDNTEMHTAKTRPREEQFNSTYRVVSVLPILHQDWLKGKEFKCKVNSKSLPSAMERTISKAKGQPHEPQVYVLPPTQEELSENKVSVTCLIKGFHPPDIAVEWEITGQPEPENNYQTTPPQLDSDGTYFLYSRLSVDRSHWQRGNTYTCSVSHEALHSHHTQKSLTQSPG(SEQID NO:106)
根据实例1在HEK细胞中合成SEQ ID NO:106的胰岛素-Fc融合蛋白，并根据实例3纯化。根据实例4通过非还原和还原CE-SDS确认胰岛素-Fc融合蛋白的结构，并根据实例5通过去除聚糖的LC-MS进一步鉴定序列。根据实例6通过尺寸排阻色谱法测量所得化合物的同型二聚体％为88％。所得的同型二聚体滴度仅为20mg/L，这是由于HEK细胞无法以高产量制备产物(即蛋白纯化后的蛋白质产量仅为23mg/L)。总之，在HEK细胞中生产SEQ ID NO:106的胰岛素-Fc融合蛋白导致中等水平的聚集体和20mg/L的低同型二聚体滴度，这不符合大于50mg/L的同型二聚体滴度的设计目标。
尽管如此，对SEQ ID NO:106的胰岛素-Fc融合蛋白的生物活性进行了评价。首先，根据实例7来测量SEQ ID NO:106的胰岛素-Fc融合蛋白的胰岛素受体结合，得到22nM的IC50值，表明该化合物可能在体内具有生物活性(即，IC50小于5000nM)。
接下来，根据实例10，在以0.8mg/kg的剂量向N＝3只猫单次皮下施用化合物之后，测量SEQ ID NO:106的胰岛素-Fc融合蛋白的体内药效动力学(PD)。图27示出了SEQ NO:106(161c)的胰岛素-Fc融合蛋白的空腹血糖水平百分比作为时间的函数。根据实例11的程序，胰岛素-Fc融合蛋白的NAOC被计算为215％FBGL·天·kg/mg。令人惊讶的是，与包含SEQ IDNO:5的胰岛素多肽和SEQ ID NO:12的肽接头的用于狗的SEQ ID NO:42的类似胰岛素-Fc融合蛋白不同，发现用于猫的SEQ ID NO:106的胰岛素-Fc融合蛋白在目标动物中的聚集少得多且生物活性显著更高。
由于NAOC是可接受的并且药代动力学数据支持每周施用一次，因此根据实例11，在第28天、第35天、第42天和第49天给予猫额外的皮下剂量，并且在每次给药后的7天窗口期测量％FBGL。对于每次重复皮下注射，根据实例11的程序计算NAOC和NAOCR。如表21所示，在猫中重复皮下给药示出了到第三次给药时生物活性的显著衰减，如通过NAOCR的显著降低所测量的(即第三次注射的NAOC仅为第一次注射的NAOC的0.40或40％，并且第四次注射的NAOC仅为第一次注射的NAOC的0.10或10％)。在猫中重复给药后，SEQ ID NO:106的胰岛素-Fc融合蛋白的生物活性的显著下降与实例20中所示的在狗中观察到的SEQ ID NO:52的胰岛素-Fc融合蛋白的生物活性下降相似。
Figure BDA0002955236580000871
实例37：胰岛素多肽突变的评估以及猫科动物IgG1b或IgG2Fc片段对蛋白质产量、 纯度和胰岛素受体活性的影响的选择
为了试图提高SEQ ID NO:106的胰岛素-Fc融合蛋白的同型二聚体含量％和蛋白质产量，在胰岛素多肽B链的序列(例如B16A突变)和肽接头中插入突变。此外，除了用于构建SEQ ID NO:106的胰岛素-Fc融合蛋白的猫科动物IgG2 Fc片段(SEQ ID NO:21)之外，还评估了猫科动物IgG1b Fc片段(SEQ ID NO:20)。所得到的胰岛素-Fc融合蛋白序列如下所示，其中相对于SEQ ID NO:106的所得到序列比对在图28中示出(Clustal Omega)。
FVNQHLCGSDLVEALALVCGERGFFYTDPTGGGPRRGIVEQCCHSICSLYQLENYCNGGGGSGGGGDCPKCPPPEMLGGPSIFIFPPKPKDTLSISRTPEVTCLVVDLGPDDSDVQITWFVDNTQVYTAKTSPREEQFNSTYRVVSVLPILHQDWLKGKEFKCKVNSKSLPSPIERTISKDKGQPHEPQVYVLPPAQEELSRNKVSVTCLIEGFYPSDIAVEWEITGQPEPENNYRTTPPQLDSDGTYFLYSRLSVDRSRWQRGNTYTCSVSHEALHSHHTQKSLTQSPG(SEQ IDNO:108)
FVNQHLCGSDLVEALALVCGERGFFYTDPTGGGPRRGIVEQCCHSICSLYQLENYCNGGGGAGGGGGEGPKCPVPEIPGAPSVFIFPPKPKDTLSISRTPEVTCLVVDLGPDDSNVQITWFVDNTEMHTAKTRPREEQFNSTYRVVSVLPILHQDWLKGKEFKCKVNSKSLPSAMERTISKAKGQPHEPQVYVLPPTQEELSENKVSVTCLIKGFHPPDIAVEWEITGQPEPENNYQTTPPQLDSDGTYFLYSRLSVDRSHWQRGNTYTCSVSHEALHSHHTQKSLTQSPG(SEQID NO:110)
FVNQHLCGSDLVEALALVCGERGFFYTDPTGGGPRRGIVEQCCHSICSLYQLENYCNGGGGSGGGGGEGPKCPVPEIPGAPSVFIFPPKPKDTLSISRTPEVTCLVVDLGPDDSNVQITWFVDNTEMHTAKTRPREEQFNSTYRVVSVLPILHQDWLKGKEFKCKVNSKSLPSAMERTISKAKGQPHEPQVYVLPPTQEELSENKVSVTCLIKGFHPPDIAVEWEITGQPEPENNYQTTPPQLDSDGTYFLYSRLSVDRSHWQRGNTYTCSVSHEALHSHHTQKSLTQSPG(SEQID NO:112)
根据实例1在HEK293细胞中制备胰岛素-Fc融合蛋白，并根据实例3使用蛋白A柱纯化。根据实例4，通过非还原和还原CE-SDS来确认它们的结构，并且根据实例5，通过去除聚糖的LC-MS进一步鉴定序列。根据实例6，通过尺寸排阻色谱法来测量它们的同型二聚体含量％，并且根据实例7，测量它们的胰岛素受体结合亲和力。在表22中列出了胰岛素-Fc融合蛋白变体以及相应的蛋白质产量、同型二聚体％和同型二聚体滴度。结果表明，当与猫科动物IgG1b同种型Fc片段结合以产生SEQ ID NO:108的胰岛素-Fc融合蛋白时，各种突变产生高得多的蛋白质产量，但所得到的蛋白更聚集(例如，比SEQ ID NO:106低的同型二聚体％)。这是令人惊讶的，因为猫科动物IgG1b在功能上更类似于犬科动物IgGB Fc片段同种型，其是用于生产犬科动物胰岛素-Fc融合蛋白的高度优选的Fc同种型(实例32)。在含有猫科动物IgG2同种型的突变的猫科动物组合物中，包含胰岛素多肽B链的B16A突变的组合物(即SEQ ID NO:110和SEQ ID NO:112)导致提高的蛋白质产量和同型二聚体滴度。然而，与SEQ ID NO:112相比，SEQ ID NO:110(即GGGGAGGGG)中存在的突变的接头似乎提供了蛋白质产量和同型二聚体滴度的进一步倍增。
Figure BDA0002955236580000891
实例38：在重复皮下给药包含SEQ ID NO:4的胰岛素多肽和猫科动物IgG2同种型 Fc片段的胰岛素-Fc融合蛋白后的体内免疫原性筛选
不受任何特定解释的束缚，假设在猫中第四次重复皮下给药(实例36)后，SEQ IDNO:106的胰岛素-Fc融合蛋白的生物活性显著降低的原因是由于中和其生物活性的抗药物抗体的产生。抗药物抗体可以针对胰岛素-Fc融合蛋白的胰岛素多肽、接头或Fc片段部分。免疫原性反应表现为抗原呈递细胞、T辅助细胞、B细胞及其相关细胞因子之间的相互作用，这可能导致产生针对该药物的内源性抗体(例如抗药物抗体)。结合抗体是能够结合胰岛素-Fc融合蛋白的所有同种型，并且可以在如实例14所述的免疫测定中检测这些抗体。抑制胰岛素-Fc融合蛋白的功能活性的中和抗体通常针对生物活性位点。为了评估是否是这种情况，根据实例14，测试在施用每种剂量之前和在实例11所述的实验结束时收集的血清，以定量抗药物抗体的水平。如图29所示，抗药物抗体的水平确实随着化合物的多次皮下施用而增加，这表明在第四次注射SEQ ID NO:106的胰岛素Fc-融合蛋白之后，中和抗药物抗体的产生是NAOCR减少的可能原因。
实例39：筛选含有抗药物抗体的猫科动物血清并鉴定胰岛素多肽的B10D和A8H位 置处的潜在免疫原性表位
如在狗中针对SEQ ID NO:52(实例20)所观察到的，包含SEQ ID NO:4的胰岛素多肽和SEQ ID NO:13的肽接头的SEQ ID NO:106的胰岛素-融合蛋白的重复给药生物活性仍然产生抗药物抗体(实例38)。因此，假设SEQ ID NO:4的胰岛素多肽可能出乎意料地含有猫免疫系统针对的特定表位(即免疫原性“热点”)。因此，根据实例15的一般程序来评价实例38中所述的血清样品中存在的抗体的结合特异性。对来自针对包被的胰岛素-Fc融合蛋白文库重复给药SEQ ID NO:106的胰岛素-Fc融合蛋白(实例38)的含抗体的猫科动物血清样品的分析表明，在SEQ ID NO:4的胰岛素多肽序列中出乎意料存在两个主要“热点”：B10D位点突变(即，在距B链的N末端第10位(即，B10)的天冬氨酸突变)，以及分别地，A8H位点突变(即，在距B链的N末端第8位(即，A8)的组氨酸突变)。结果表明，包含含有这两种特定氨基酸突变的胰岛素多肽氨基酸组合物的胰岛素-Fc融合蛋白在猫中可能具有免疫原性，并且因此可能产生在重复注射后中和生物活性的抗药物抗体。因此，可以确定，不包含B10D和A8H的胰岛素多肽优选地用于需要在猫中长期重复给药的胰岛素-Fc融合蛋白(例如，用于治疗猫科动物糖尿病)。
实例40：包含SEQ ID NO:4的胰岛素多肽和糖基化和非糖基化的猫科动物IgG1b和 IgG2同种型Fc片段的胰岛素-Fc融合蛋白，其中胰岛素多肽的B10、A8和其他位点被进一步 突变以降低免疫原性的潜在风险
为了评估替换“热点”突变是否将改善胰岛素-Fc融合蛋白的免疫原性和重复给药生物活性，所述胰岛素-Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:4的胰岛素多肽和猫科动物IgG2同种型片段，合成了SEQ ID NO:114、116和118的示例性胰岛素-Fc融合蛋白，其中胰岛素多肽的B10和A8氨基酸分别恢复到其天然的组氨酸和丙氨酸组成，并且B16处的组氨酸被丙氨酸替换(即，B16A)，正如用于多种犬科动物胰岛素-Fc融合蛋白的SEQ ID NO:5的胰岛素多肽的情况一样。天然胰岛素的A21N位点也缺失。对于本实例，对其他胰岛素多肽氨基酸进行突变，以使其结构与天然猫科动物胰岛素更相似(例如，B30A、A8A、A10V和A18H)。所得的胰岛素多肽(SEQ ID NO:120)的序列在下面列出，其中猫科动物胰岛素的非天然氨基酸被加下划线。
FVNQHLCGSHLVEALALVCGERGFFYTDPAGGGPRRGIVEQCCASVCSLYQLEHYC(SEQ ID NO:120)
此外，鉴于实例22和33中讨论的非糖基化的cNg突变体的额外潜在益处，两种评估的胰岛素-Fc融合蛋白(SEQ ID NO:116和118)含有cNg-S突变。胰岛素-Fc融合蛋白的完整氨基酸序列如下所示，其中相对于SEQ ID NO:108的所得的序列比对在图30中示出(Clustal Omega)。
FVNQHLCGSHLVEALALVCGERGFFYTDPAGGGPRRGIVEQCCASVCSLYQLEHYCGGGGAGGGGGEGPKCPVPEIPGAPSVFIFPPKPKDTLSISRTPEVTCLVVDLGPDDSNVQITWFVDNTEMHTAKTRPREEQFNSTYRVVSVLPILHQDWLKGKEFKCKVNSKSLPSAMERTISKAKGQPHEPQVYVLPPTQEELSENKVSVTCLIKGFHPPDIAVEWEITGQPEPENNYQTTPPQLDSDGTYFLYSRLSVDRSHWQRGNTYTCSVSHEALHSHHTQKSLTQSP(SEQ IDNO:114)
FVNQHLCGSHLVEALALVCGERGFFYTDPAGGGPRRGIVEQCCASVCSLYQLEHYCGGGGAGGGGGEGPKCPVPEIPGAPSVFIFPPKPKDTLSISRTPEVTCLVVDLGPDDSNVQITWFVDNTEMHTAKTRPREEQFSSTYRVVSVLPILHQDWLKGKEFKCKVNSKSLPSAMERTISKAKGQPHEPQVYVLPPTQEELSENKVSVTCLIKGFHPPDIAVEWEITGQPEPENNYQTTPPQLDSDGTYFLYSRLSVDRSHWQRGNTYTCSVSHEALHSHHTQKSLTQSPG(SEQ IDNO:116)
FVNQHLCGSHLVEALALVCGERGFFYTDPAGGGPRRGIVEQCCASVCSLYQLEHYCGGGGAGGGGDCPKCPPPEMLGGPSIFIFPPKPKDTLSISRTPEVTCLVVALGPDDSDVQITWFVDNTQVYTAKTSPREEQFSSTYRVVSVLPILHQDWLKGKEFKCKVNSKSLPSPIERTISKDKGQPHEPQVYVLPPAQEELSRNKVSVTCLIEGFYPSDIAVEWEITGQPEPENNYRTTPPQLDSDGTYFLYSRLSVDRSRWQRGNTYTCSVSHEALHSHHTQKSLTQSPG(SEQ IDNO:118)
根据实例1在HEK293细胞中制备胰岛素-Fc融合蛋白，并根据实例3使用蛋白A柱纯化。根据实例4，通过非还原和还原CE-SDS来确认它们的结构，并且根据实例5，通过去除聚糖的LC-MS进一步鉴定序列。根据实例6，通过尺寸排阻色谱法来测量它们的同型二聚体含量％，并且根据实例7，测量它们的胰岛素受体结合亲和力。下表23示出了所得化合物的可制造性和体外IR结合参数。
Figure BDA0002955236580000911
出乎意料的是，与SEQ ID NO:108的胰岛素-Fc融合蛋白相比，所有三种胰岛素-Fc融合蛋白给出低得多的蛋白质产量。事实上，尽管其具有足够高的胰岛素受体结合亲和力(IC50为707nM)，但SEQ ID NO:116的胰岛素-Fc融合蛋白几乎没有产生蛋白质产量。SEQ IDNO:118的胰岛素-Fc融合蛋白给出不可接受的低蛋白质产量和同型二聚体滴度，并且由于其高于5000nM的高IR结合IC50值被认为不太可能具有体内生物活性。与SEQ ID NO:108的胰岛素-Fc融合蛋白相比，SEQ ID NO:114的蛋白也产生了不可接受的低蛋白质产量和低得多的胰岛素受体结合亲和力(较高的IR IC50值)。
实例41：包含SEQ ID NO:8的胰岛素多肽、SEQ ID NO:14的接头和猫科动物IgG2同 种型Fc片段的胰岛素-Fc融合蛋白
为了试图获得包含没有免疫原性“热点”突变(即B10D和A8H)的胰岛素多肽序列的胰岛素-Fc融合蛋白的可接受的蛋白质产量，从犬科动物胰岛素-Fc融合蛋白的同时和平行开发中获得了学习，所述学习已经表明在犬科动物IgGB同种型Fc片段上使用SEQ ID NO:8的胰岛素多肽和SEQ ID NO:14的肽接头导致高的蛋白和同型二聚体滴度以及可接受的IR结合亲和力。因此，在SEQ ID NO:21的猫科动物IgG2 Fc片段上使用SEQ ID NO:8的胰岛素多肽和SEQ ID NO:14的肽接头构建了猫科动物胰岛素-Fc融合蛋白，以产生以下序列：
FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLDQLENYCGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGGEGPKCPVPEIPGAPSVFIFPPKPKDTLSISRTPEVTCLVVDLGPDDSNVQITWFVDNTEMHTAKTRPREEQFNSTYRVVSVLPILHQDWLKGKEFKCKVNSKSLPSAMERTISKAKGQPHEPQVYVLPPTQEELSENKVSVTCLIKGFHPPDIAVEWEITGQPEPENNYQTTPPQLDSDGTYFLYSRLSVDRSHWQRGNTYTCSVSHEALHSHHTQKSLTQSPG(SEQ ID NO:122)
在图31中示出了SEQ ID NO:122相对于实例37序列SEQ ID NO:106和112的序列比对(Clustal Omega)。
Figure BDA0002955236580000921
根据实例1在HEK293细胞中制备SEQ ID NO:122的胰岛素-Fc融合蛋白，并根据实例3使用蛋白A柱纯化。根据实例4，通过非还原和还原CE-SDS来确认它们的结构，并且根据实例5，通过去除聚糖的LC-MS进一步鉴定序列。根据实例6，通过尺寸排阻色谱法来测量它们的同型二聚体含量％，并且根据实例7，测量它们的胰岛素受体结合亲和力。根据实例9测量FcRn受体结合亲和力。蛋白质产量为146mg/L，并且确定同型二聚体％为99％，得到符合生产设计目标的145mg/L的同型二聚体滴度。IR结合亲和力IC50值为2,536nM，表明该化合物可能具有体内生物活性。FcRn受体结合亲和力EC50值为3114ng/mL。因此，SEQ ID NO:122的胰岛素-Fc融合蛋白是进一步体内测试的潜在候选物。
实例42：由SEQ ID NO:8的胰岛素多肽、SEQ ID NO:14的肽接头和SEQ ID NO:21的 猫科动物IgG2 Fc片段构建的胰岛素-Fc融合蛋白的体内生物活性
根据实例10，对SEQ ID NO:122的胰岛素-Fc融合蛋白的体内生物活性进行了测试。使用了体重约5kg的健康的、抗体幼稚的猫。在第0天，猫接受了含有SEQ ID NO:122的胰岛素Fc-融合蛋白的药物组合物的单次注射。第0天，在注射前并且在注射后15、30、45、60、120、240、360和480分钟以及1、2、3、4、5、6和7天从合适的静脉采集血液。如果受试者的血糖降至危险水平，则给予食物和/或葡萄糖注射，以防止症状性低血糖。
图32示出了单次施用的％FBGL，说明出乎意料的是，SEQ ID NO:122的胰岛素-Fc融合蛋白在体内仅具有微弱的生物活性(NAOC基本上为0％FBGL·天·kg/mg)。这一结果是令人惊讶的，特别是因为胰岛素-Fc融合蛋白没有聚集(即具有高的同型二聚体含量％)，并且该分子表现出与在狗中发现表现出显著生物活性的犬科动物胰岛素-Fc融合蛋白相似范围内的IR亲和力(实例31)。由于第一次施用时缺乏生物活性，因此未进行重复施用。
实例43：评估猫科动物IgG1b取代猫科动物IgG2 Fc片段对包含SEQ ID NO:8的胰 岛素多肽和SEQ ID NO:14的肽接头的胰岛素-Fc融合蛋白的产量、纯度、生物活性和免疫原 性的影响
由于狗和猫的长效胰岛素研究项目是并行进行的，因此将犬科动物胰岛素-Fc融合蛋白研究项目的一些知识应用于猫科动物胰岛素-Fc蛋白研究项目。从犬科动物胰岛素-Fc研究项目中获得的一个重要知识是，不同IgG同种型Fc片段(例如，犬科动物IgGA、犬科动物IgGB、犬科动物IgGC和犬科动物IgGD同种型)的选择如何导致显著不同的生产和体内疗效表现。因此，SEQ ID NO:122的猫科动物IgG2 Fc片段被SEQ ID NO:20的猫科动物IgG1bFc片段代替，同时保留SEQ ID NO:8的胰岛素多肽和SEQ ID NO:14的肽接头，得到以下氨基酸序列：
FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLDQLENYCGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGDCPKCPPPEMLGGPSIFIFPPKPKDTLSISRTPEVTCLVVDLGPDDSDVQITWFVDNTQVYTAKTSPREEQFNSTYRVVSVLPILHQDWLKGKEFKCKVNSKSLPSPIERTISKDKGQPHEPQVYVLPPAQEELSRNKVSVTCLIEGFYPSDIAVEWEITGQPEPENNYRTTPPQLDSDGTYFLYSRLSVDRSRWQRGNTYTCSVSHEALHSHHTQKSLTQSPG(SEQ ID NO:38)
根据实例1的程序在HEK293细胞中合成SEQ ID NO:38的胰岛素-Fc融合蛋白，并根据实例3使用蛋白A柱纯化。根据实例4，通过非还原和还原LC-MS来确认结构，并且根据实例5，通过去除聚糖的LC-MS进一步鉴定序列。在此阶段蛋白质产量为158mg/L。根据实例6，通过尺寸排阻色谱法来测量序列的同型二聚体％，并且被确定为99.5％，得到符合生产设计目标的157mg/L的同型二聚体滴度。根据实例7测量的体外IM-9胰岛素受体结合IC50值为2398nM，其也符合设计目标。根据实例9来测量FcRn受体结合亲和力EC50值，并且发现为1552ng/mL。
然后根据实例10测试SEQ ID NO:38的胰岛素-Fc融合蛋白的体内生物活性。体重约5kg的健康的、抗体幼稚的猫接受了含有SEQ ID NO:38的胰岛素Fc-融合蛋白的药物组合物的单次皮下注射，剂量为0.16mg胰岛素Fc-融合蛋白/kg。在第0天，在注射前并且注射后15、30、45、60、120、240、360和480分钟以及1、2、3、4、5、6和7天从合适的静脉采集血液。如果受试者的血糖降至危险水平，则给予食物和/或葡萄糖注射，以防止症状性低血糖。
图33示出了第一次施用后的％FBGL。定期给予动物食物以防止症状性低血糖，这说明SEQ ID NO:38的胰岛素-Fc融合蛋白在体内具有显著的生物活性，其中NAOC为1838％FBGL·天·kg/mg。还通过实例12的方法，使用ELISA来测量该化合物的药代动力学概况，并将双室模型拟合于数据，以确定其消除半衰期(其为6.3±0.5)。SEQ ID NO:38的胰岛素-Fc融合蛋白与SEQ ID NO:122的胰岛素-Fc融合蛋白之间的生物活性差异(体外和体内)出乎意料地表明，当胰岛素多肽序列如SEQ ID NO:8中所述进行修饰时，对于Fc片段，猫科动物IgG1b同种型比猫科动物IgG2同种型更优选。
由于NAOC是可接受的并且药代动力学数据支持每周施用一次，因此根据实例11，在第14天、第28天和第42天给予猫额外的皮下给药，并在每次给药后的7天窗口期测量％FBGL。对于每次重复皮下注射，根据实例11的程序来计算NAOC和NAOCR。如表25所示，在多次给药后，SEQ ID NO:38的胰岛素-Fc融合蛋白在体内表现出可接受的生物活性。
Figure BDA0002955236580000951
此外，根据实例14，在施用每次剂量前和在实验结束后两周内每周一次收集血清，以便测试任何抗药物抗体的存在并定量其水平。如图34所示，在多次施用化合物后，在抗药物抗体中没有可测量的高于基线的增加。因此，为了获得符合可接受的同型二聚体滴度、体内生物活性和在猫中重复每周注射后持续的生物活性的设计标准的猫科动物胰岛素-Fc融合蛋白候选物(例如，SEQ ID NO:38)，有必要用SEQ ID NO:8的胰岛素多肽代替SEQ ID NO:4的胰岛素多肽，并使用SEQ ID NO:20的猫科动物IgG1b Fc片段代替SEQ ID NO:21的猫科动物IgG2 Fc片段。
实例44：包含SEQ ID NO:8的胰岛素多肽、SEQ ID NO:14的肽接头和猫科动物 IgG1b Fc片段的非糖基化的胰岛素-Fc融合蛋白以降低免疫原性的潜在风险
虽然SEQ ID NO:38的胰岛素-Fc融合蛋白符合所有设计目标(实例43)，但在延长的治疗时间段(例如，6个月、1年、2年或更长时间)内可能存在或可能不存在免疫原性的风险，其可能会损害该胰岛素-Fc融合蛋白用于治疗糖尿病治疗的用途(如果发生这种情况)。如在本发明的具体实施方式中所描述的，重复给药后生物活性降低的一个可能原因是猫科动物IgG1b Fc片段与猫的免疫系统的不希望的相互作用，导致中和性抗药物抗体的产生。然而，实例43中示出的结果出乎意料地证明，就体内生物活性而言，猫科动物IgG1b同种型优于较少免疫原性的猫科动物IgG2同种型。因此，探索了进一步的Fc突变，以获得具有低Fc(γ)RI受体结合的非糖基化的胰岛素-Fc融合蛋白，这可降低长期、慢性免疫原性的风险。
如在本发明的具体实施方式中所描述的，一种用于减少Fc(γ)RI相互作用的方法包括突变Fc片段cNg位点以防止在宿主细胞中合成期间的糖基化。因此，对SEQ ID NO:38的Fc片段区域进行cNg位点突变，以降低体内Fc片段对Fc(γ)受体的结合亲和力，如通过实例8所述的体外人Fc(γ)RI测定中的结合所测量的。SEQ ID NO:38的胰岛素-Fc融合蛋白中cNg位点的位置是cNg-NB151。再次，利用从实例33中描述的犬科动物胰岛素-Fc融合蛋白中获得的知识，将cNg-NB151-S突变引入到SEQ ID NO:38的Fc片段中。所得到的胰岛素-Fc融合蛋白的完整氨基酸序列如下所示(为了清楚起见，cNg-NB151-S被加下划线)：
FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLDQLENYCGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGDCPKCPPPEMLGGPSIFIFPPKPKDTLSISRTPEVTCLVVDLGPDDSDVQITWFVDNTQVYTAKTSPREEQFSSTYRVVSVLPILHQDWLKGKEFKCKVNSKSLPSPIERTISKDKGQPHEPQVYVLPPAQEELSRNKVSVTCLIEGFYPSDIAVEWEITGQPEPENNYRTTPPQLDSDGTYFLYSRLSVDRSRWQRGNTYTCSVSHEALHSHHTQKSLTQSPG(SEQ ID NO:124)
根据实例1的程序在HEK293细胞中合成SEQ ID NO:124的胰岛素-Fc融合蛋白，并根据实例3使用蛋白A柱纯化。根据实例4，通过非还原和还原LC-MS确认胰岛素-Fc融合蛋白的结构，并且根据实例5，通过去除聚糖的LC-MS进一步鉴定序列。在此阶段蛋白质产量为202mg/L。根据实例6，通过尺寸排阻色谱法来测量序列的同型二聚体％，并且被确定为99％，得到200mg/L的同型二聚体滴度，其符合生产设计目标。然而，根据实例7测量的体外IM-9胰岛素受体结合IC50值大于5000nM，其超出了体外生物活性的设计目标。根据实例9来测量FcRn受体结合亲和力EC50值并且为6922ng/mL。
尽管SEQ ID NO:124的胰岛素-Fc融合蛋白不符合胰岛素受体结合设计目标，但根据实例10测试了其体内生物活性。使用了体重约5kg的健康的、抗体幼稚的猫。在第0天，以0.16mg胰岛素-Fc融合蛋白/kg的剂量，使猫接受含有SEQ ID NO:124的胰岛素Fc融合蛋白的药物组合物的单次注射。第0天，在注射前并且在注射后15、30、45、60、120、240、360和480分钟以及1、2、3、4、5、6和7天从合适的静脉采集血液。如果受试者的血糖降至危险水平，则给予食物和/或葡萄糖注射，以防止症状性低血糖。
图35示出了单次施用的％FBGL，说明SEQ ID NO:124的胰岛素-Fc融合蛋白在体内仅具有一定的生物活性，其中NAOC为65％FBGL·天·kg/mg。由于第一次施用时缺乏生物活性，因此未进行重复施用。
出乎意料的是，与实例33中SEQ ID NO:36的犬科动物胰岛素Fc-融合蛋白的情况一样，发现突变SEQ ID NO:124的胰岛素多肽序列使得距B链的N末端第16个氨基酸(B16)从酪氨酸突变为丙氨酸(即B16A)，使得所得的SEQ ID NO:40的胰岛素Fc-融合蛋白具有生物活性。所得到的胰岛素-Fc融合蛋白的氨基酸序列如下所示(为了清楚起见，B16A和cNg-NB151-S突变被加下划线)：
FVNQHLCGSHLVEALALVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLDQLENYCGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGDCPKCPPPEMLGGPSIFIFPPKPKDTLSISRTPEVTCLVVDLGPDDSDVQITWFVDNTQVYTAKTSPREEQFSSTYRVVSVLPILHQDWLKGKEFKCKVNSKSLPSPIERTISKDKGQPHEPQVYVLPPAQEELSRNKVSVTCLIEGFYPSDIAVEWEITGQPEPENNYRTTPPQLDSDGTYFLYSRLSVDRSRWQRGNTYTCSVSHEALHSHHTQKSLTQSPG(SEQ ID NO:40)
根据实例1的程序在HEK293细胞中合成SEQ ID NO:40的胰岛素-Fc融合蛋白，并根据实例3使用蛋白A柱纯化。根据实例4通过非还原和还原CE-SDS确认胰岛素-Fc融合蛋白的结构，并根据实例5通过去除聚糖的LC-MS进一步鉴定序列。在此阶段蛋白质产量为174mg/L。根据实例6，通过尺寸排阻色谱法来测量序列的同型二聚体％，并且被确定为98.9％，得到172mg/L的同型二聚体滴度，其符合生产设计标准。根据实例7测量的体外IM-9胰岛素受体结合IC50值为4635nM，也符合设计目标。根据实例8测量Fc(γ)受体活性，并且发现其比使用相同程序针对SEQ ID NO:38的胰岛素-Fc融合蛋白获得的活性低约4倍，表明胰岛素-Fc融合蛋白可能较小地与猫免疫系统不利地相互作用。根据实例9来测量FcRn受体结合亲和力EC50值并且为8157ng/mL。
然后根据实例11测试SEQ ID NO:40的胰岛素-Fc融合蛋白的体内生物活性。使用体重约5kg的健康、抗体幼稚的猫。在第0天、第7天和第21天，以0.1mg胰岛素-Fc融合蛋白/kg的剂量，使猫接受含有SEQ ID NO:40的胰岛素Fc融合蛋白的药物组合物的单次皮下注射。第0天，在注射前和在注射后15、30、45、60、120、240、360和480分钟以及1、2、3、4、5、6和7天从合适的静脉采集血液。如果受试者的血糖降至危险水平，则给予食物和/或葡萄糖注射，以防止症状性低血糖。
图36示出了第一次施用后的％FBGL，说明SEQ ID NO:40的胰岛素-Fc融合蛋白在体内具有生物活性，其中对于0.1mg胰岛素-Fc融合蛋白/kg的皮下剂量，NAOC为159％FBGL·天·kg/mg。0.2mg胰岛素-Fc融合蛋白/kg的第二次较高皮下剂量产生702％FBGL·天·kg/mg的高得多的NAOC并且在图37中示出。使用ELISA通过实例12的方法来测量药代动力学概况，并且双室模型拟合于数据以确定其消除半衰期(其大于3天)。这些结果与使用SEQ ID NO:124的胰岛素-Fc融合蛋白获得的结果形成对比，该结果示出，在大约相同的剂量(0.16mg胰岛素-Fc融合蛋白/kg)下，包含B16处的酪氨酸而不是丙氨酸的相同化合物仅具有非常弱的生物活性。因此，对于包含cNg突变的猫科动物IgG1b Fc片段的非糖基化的胰岛素-Fc融合蛋白，SEQ ID NO:11的胰岛素多肽是优选的。
为了分析多次给药后的可重复生物活性，在第7天、第21天和第35天，给予猫另外剂量的SEQ ID NO:40的胰岛素-Fc融合蛋白。当猫的％FBGL下降太低时，向猫提供食物以将血糖升高到安全水平。根据实例11的一般程序，测量每次后续给药的NAOC和NAOCR，从施用剂量的时间开始计算，直到刚好在下一次剂量施用前。表26所示的NAOC和NAOCR表明，SEQID NO:40的胰岛素-Fc融合蛋白在多次给药后在体内具有生物活性。
Figure BDA0002955236580000981
此外，根据实例14，在每次剂量施用前和在实验结束时收集血清，以便测试任何抗药物抗体的存在并定量其水平。在多次施用该化合物后，不存在高于基线的抗药物抗体的可测量的增加。因此，为了获得符合生产和生物活性设计标准且具有显著降低的Fc(γ)受体活性的猫科动物胰岛素-Fc融合蛋白，不仅需要将cNg突变为丝氨酸，而且还需要将胰岛素多肽B16氨基酸突变为丙氨酸。
实例45：使用通过稳定转染的CHO细胞系制备的包含猫科动物IgG1b来源的Fc片段 的优选胰岛素-Fc融合蛋白的示例性基于CHO的生产运行
如上述实例2所述，构建了用编码SEQ ID NO:38的载体稳定转染的CHO细胞系。将14天生产运行(0.5-2.0L培养基规模)的补料分批摇瓶以50万个细胞/mL接种在设定为37℃和5％二氧化碳的培养箱-摇瓶中，并且如上述实例2中所述进行运行，不同之处在于，用CDOptiCHO代替Dynamis作为生长培养基(ThermoFisher)并且使用高效饲料C(ThermoFisher)作为饲料。从生产运行第3天开始以3％v/v添加饲料，并且在第4天，将摇瓶温度调节至32℃，并将培养箱-摇瓶二氧化碳浓度从5％降低至2％。在运行期间，细胞密度增加至800万-1400万个细胞/mL，并且在第14天收获生产运行以除去细胞，并纯化培养物上清液并表征以获得如实例3、4、5和6所述的胰岛素-Fc融合蛋白。表27描述了通过这些稳定转染的CHO细胞系生产运行获得的胰岛素-Fc融合蛋白的生产数据。
Figure BDA0002955236580000991
实例46：使用通过稳定转染的CHO细胞系制备的猫科动物IgG1b来源的优选的胰岛 素-Fc融合蛋白的示例性的基于CHO的生产运行
如上述实例2所述，构建了用编码SEQ ID NO:40的载体稳定转染的CHO细胞系。将14天生产运行(0.5-2.0L培养基规模)的补料分批摇瓶以50万个细胞/mL接种在设定为37℃和5％二氧化碳的培养箱-摇瓶中，并且如上述实例2所述进行运行，不同之处在于，用CDOptiCHO代替Dynamis作为生长培养基(ThermoFisher)并使用高效饲料C(ThermoFisher)作为饲料。从生产运行第3天开始以3％v/v添加饲料，并且在第4天，将摇瓶温度调节至32℃，并将培养箱-摇瓶二氧化碳浓度从5％降低至2％。在第14天，收获生产运行以除去细胞，并且纯化培养物上清液并表征以获得如实例3、4、5和6所述的胰岛素-Fc融合蛋白。所得到的生产运行给出了大于200mg/L的蛋白质产量、大于95％同型二聚体和SEQ ID NO:40的大于190mg/L的同型二聚体滴度。
实例47：示例性的胰岛素-Fc融合蛋白结构域和序列
在上述实例中使用的示例性的胰岛素-Fc融合蛋白氨基酸序列和相应的DNA序列在图38、39、40、41和42中示出。
等价物
在权利要求中，冠词诸如“一(a)”、“一个(an)”和“所述(the)”可以表示一个或多于一个，除非有相反的说明或从上下文中可以明显看出。如果一个、多于一个或所有组成员存在于给定产品或工艺中、用于给定产品或工艺或者以其他方式与给定产品或工艺相关，则包括组的一个或多个成员之间的“或”的权利要求书或描述被视为符合，除非有相反的指示或从上下文中明显看出。本公开包括其中仅一个组成员存在于给定产品或工艺中、用于在给定产品或工艺或者以其他方式与给定产品或工艺相关的实施例。本公开包括其中多于一个或所有组成员存在于给定产品或工艺中、用于在给定产品或工艺或者以其他方式与给定产品或工艺相关的实施例。
此外，本公开包括所有变型、组合和置换，其中来自一个或多个所列权利要求的一个或多个限制、要素、条款和描述性术语被引入到另一个权利要求中。例如，任何从属于另一个权利要求的权利要求都可以修改，以包括从属于同一基本权利要求的任何其他权利要求中的一个或多个限制。在要素以列表的形式(例如，以马库什组的形式)存在的情况下，还公开了要素的每个子组，并且可以从组中去除任何要素。应当理解，一般而言，在本公开或本公开的方面被称为包含特定的要素和/或特征的情况下，本公开的某些实施例或本公开的方面由这些要素和/或特征组成或基本上由这些要素和/或特征组成。出于简单的目的，这些实施例没有在本文中具体地阐述。还应注意，术语“包含(comprise(s)、comprising)”和“含有(contain(s)、containing)”旨在是开放式的，并且其使用允许包括额外的要素或步骤。在给出了范围的情况下，包括终点。此外，除非另有说明或从上下文和本领域普通技术人员的理解中显而易见，否则在本公开的不同实施例中，表示为范围的值可以采用所述范围内的任何特定值或子范围，直到范围下限的十分之一单位，除非上下文另有明确说明。
序列表
<110> 阿卡斯通生物科学公司
<120> 超长效胰岛素-FC融合蛋白（Fusion Protein）及使用方法
<130> ABC-3PC
<160> 125
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> hIns-B链（hIns-B-chain）
<400> 1
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
20 25 30
<210> 2
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> hIns-A链（hIns-A-chain）
<400> 2
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 3
<211> 86
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 人胰岛素原 （Human Proinsulin）
<400> 3
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
20 25 30
Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro
35 40 45
Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
50 55 60
Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
65 70 75 80
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
85
<210> 4
<211> 57
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> Ins 多肽（Ins Polypeptide）
<400> 4
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser Asp Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Asp Pro Thr Gly Gly
20 25 30
Gly Pro Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys His Ser Ile Cys Ser
35 40 45
Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
50 55
<210> 5
<211> 57
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> Ins 多肽（Ins Polypeptide）
<400> 5
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser Asp Leu Val Glu Ala Leu Ala
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Asp Pro Thr Gly Gly
20 25 30
Gly Pro Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys His Ser Ile Cys Ser
35 40 45
Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
50 55
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> Ins 多肽（Ins Polypeptide）
<220>
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<220>
<221> UNSURE
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<223> Xaa不存在或者是 N
<400> 6
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser Xaa Leu Val Glu Ala Leu Glu
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Xaa Ser Thr Cys
35 40 45
Ser Leu Asp Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Xaa
50 55
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
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<223> Ins 多肽（Ins Polypeptide）
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<221> UNSURE
<222> (58)..(58)
<223> Xaa不存在或者是 N
<400> 7
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Glu
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Thr Cys
35 40 45
Ser Leu Asp Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Xaa
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> Ins 多肽（Ins Polypeptide）
<400> 8
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Glu
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Thr Cys
35 40 45
Ser Leu Asp Gln Leu Glu Asn Tyr Cys
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> Ins 多肽（Ins Polypeptide）
<400> 9
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Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
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<221>
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<223> Ins 多肽（Ins Polypeptide）
<220>
<221> UNSURE
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<223> Xaa不是D
<220>
<221> UNSURE
<222> (45)..(45)
<223> Xaa不是H
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Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser Xaa Leu Val Glu Ala Leu Ala
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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35 40 45
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> Ins 多肽（Ins Polypeptide）
<400> 11
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Ala
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Thr Cys
35 40 45
Ser Leu Asp Gln Leu Glu Asn Tyr Cys
50 55
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 接头（Linker）
<400> 12
Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 13
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 接头（Linker）
<400> 13
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5
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<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 接头（Linker）
<400> 14
Gly Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Gly
20
<210> 15
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 犬科动物的IgGA Fc片段（Canine IgGA Fc Fragment）
<400> 15
Arg Cys Thr Asp Thr Pro Pro Cys Pro Val Pro Glu Pro Leu Gly Gly
1 5 10 15
Pro Ser Val Leu Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Ile Leu Arg Ile
20 25 30
Thr Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Leu Asp Leu Gly Arg Glu
35 40 45
Asp Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Glu Val His
50 55 60
Thr Ala Lys Thr Gln Ser Arg Glu Gln Gln Phe Asn Gly Thr Tyr Arg
65 70 75 80
Val Val Ser Val Leu Pro Ile Glu His Gln Asp Trp Leu Thr Gly Lys
85 90 95
Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn His Ile Asp Leu Pro Ser Pro Ile Glu
100 105 110
Arg Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Arg Ala His Lys Pro Ser Val Tyr
115 120 125
Val Leu Pro Pro Ser Pro Lys Glu Leu Ser Ser Ser Asp Thr Val Ser
130 135 140
Ile Thr Cys Leu Ile Lys Asp Phe Tyr Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu
145 150 155 160
Trp Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu Pro Glu Arg Lys His Arg Met Thr
165 170 175
Pro Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
180 185 190
Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asp Pro Phe Thr Cys Ala
195 200 205
Val Met His Glu Thr Leu Gln Asn His Tyr Thr Asp Leu Ser Leu Ser
210 215 220
His Ser Pro Gly
225
<210> 16
<211> 224
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 犬科动物IgGB Fc片段（Canine IgGB Fc Fragment）
<400> 16
Asp Cys Pro Lys Cys Pro Ala Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Val
1 5 10 15
Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg Thr
20 25 30
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asp Pro Glu
35 40 45
Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Gln Met Gln Thr Ala Lys
50 55 60
Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser
65 70 75 80
Val Leu Pro Ile Gly His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Gln Phe Thr
85 90 95
Cys Lys Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile
100 105 110
Ser Lys Ala Arg Gly Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro
115 120 125
Pro Ser Arg Glu Glu Leu Ser Lys Asn Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu
130 135 140
Ile Lys Asp Phe Phe Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn
145 150 155 160
Gly Gln Gln Glu Pro Glu Ser Lys Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu
165 170 175
Asp Glu Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys
180 185 190
Ser Arg Trp Gln Arg Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu
195 200 205
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly
210 215 220
<210> 17
<211> 225
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 犬科动物IgGC Fc片段（Canine IgGC Fc Fragment）
<400> 17
Cys Asn Asn Cys Pro Cys Pro Gly Cys Gly Leu Leu Gly Gly Pro Ser
1 5 10 15
Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Ile Leu Val Thr Ala Arg
20 25 30
Thr Pro Thr Val Thr Cys Val Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asn Pro
35 40 45
Glu Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asp Ser Lys Gln Val Gln Thr Ala
50 55 60
Asn Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Ser Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val
65 70 75 80
Ser Val Leu Pro Ile Gly His Gln Asp Trp Leu Ser Gly Lys Gln Phe
85 90 95
Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Glu Ile
100 105 110
Ile Ser Lys Thr Pro Gly Gln Ala His Gln Pro Asn Val Tyr Val Leu
115 120 125
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Met Ser Lys Asn Thr Val Thr Leu Thr Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Phe Phe Pro Pro Glu Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser
145 150 155 160
Asn Gly Gln Gln Glu Pro Glu Ser Lys Tyr Arg Met Thr Pro Pro Gln
165 170 175
Leu Asp Glu Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp
180 185 190
Lys Ser Arg Trp Gln Arg Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His
195 200 205
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Ile Ser Leu Ser His Ser Pro
210 215 220
Gly
225
<210> 18
<211> 225
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 犬科动物IgGD Fc片段（Canine IgGD Fc Fragment）
<400> 18
Cys Ile Ser Pro Cys Pro Val Pro Glu Ser Leu Gly Gly Pro Ser Val
1 5 10 15
Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Ile Leu Arg Ile Thr Arg Thr
20 25 30
Pro Glu Ile Thr Cys Val Val Leu Asp Leu Gly Arg Glu Asp Pro Glu
35 40 45
Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Glu Val His Thr Ala Lys
50 55 60
Thr Gln Pro Arg Glu Gln Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
65 70 75 80
Val Leu Pro Ile Glu His Gln Asp Trp Leu Thr Gly Lys Glu Phe Lys
85 90 95
Cys Arg Val Asn His Ile Gly Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile
100 105 110
Ser Lys Ala Arg Gly Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro
115 120 125
Pro Ser Pro Lys Glu Leu Ser Ser Ser Asp Thr Val Thr Leu Thr Cys
130 135 140
Leu Ile Lys Asp Phe Phe Pro Pro Glu Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser
145 150 155 160
Asn Gly Gln Pro Glu Pro Glu Ser Lys Tyr His Thr Thr Ala Pro Gln
165 170 175
Leu Asp Glu Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp
180 185 190
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asp Thr Phe Thr Cys Ala Val Met His
195 200 205
Glu Ala Leu Gln Asn His Tyr Thr Asp Leu Ser Leu Ser His Ser Pro
210 215 220
Gly
225
<210> 19
<211> 224
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 猫科动物IgG1a Fc片段（Feline IgG1a Fc Fragment）
<400> 19
Asp Cys Pro Lys Cys Pro Pro Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Ile
1 5 10 15
Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Ser Ile Ser Arg Thr
20 25 30
Pro Glu Val Thr Cys Leu Val Val Asp Leu Gly Pro Asp Asp Ser Asp
35 40 45
Val Gln Ile Thr Trp Phe Val Asp Asn Thr Gln Val Tyr Thr Ala Lys
50 55 60
Thr Ser Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
65 70 75 80
Val Leu Pro Ile Leu His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Glu Phe Lys
85 90 95
Cys Lys Val Asn Ser Lys Ser Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile
100 105 110
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro His Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro
115 120 125
Pro Ala Gln Glu Glu Leu Ser Arg Asn Lys Val Ser Val Thr Cys Leu
130 135 140
Ile Lys Ser Phe His Pro Pro Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ile Thr
145 150 155 160
Gly Gln Pro Glu Pro Glu Asn Asn Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu
165 170 175
Asp Ser Asp Gly Thr Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Arg
180 185 190
Ser His Trp Gln Arg Gly Asn Thr Tyr Thr Cys Ser Val Ser His Glu
195 200 205
Ala Leu His Ser His His Thr Gln Lys Ser Leu Thr Gln Ser Pro Gly
210 215 220
<210> 20
<211> 224
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 猫科动物IgG1b Fc片段（Feline IgG1b Fc Fragment）
<400> 20
Asp Cys Pro Lys Cys Pro Pro Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Ile
1 5 10 15
Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Ser Ile Ser Arg Thr
20 25 30
Pro Glu Val Thr Cys Leu Val Val Asp Leu Gly Pro Asp Asp Ser Asp
35 40 45
Val Gln Ile Thr Trp Phe Val Asp Asn Thr Gln Val Tyr Thr Ala Lys
50 55 60
Thr Ser Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
65 70 75 80
Val Leu Pro Ile Leu His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Glu Phe Lys
85 90 95
Cys Lys Val Asn Ser Lys Ser Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile
100 105 110
Ser Lys Asp Lys Gly Gln Pro His Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro
115 120 125
Pro Ala Gln Glu Glu Leu Ser Arg Asn Lys Val Ser Val Thr Cys Leu
130 135 140
Ile Glu Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ile Thr
145 150 155 160
Gly Gln Pro Glu Pro Glu Asn Asn Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu
165 170 175
Asp Ser Asp Gly Thr Tyr Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Ser Val Asp Arg
180 185 190
Ser Arg Trp Gln Arg Gly Asn Thr Tyr Thr Cys Ser Val Ser His Glu
195 200 205
Ala Leu His Ser His His Thr Gln Lys Ser Leu Thr Gln Ser Pro Gly
210 215 220
<210> 21
<211> 225
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 猫科动物IgG2 Fc片段（Feline IgG2 Fc Fragment）
<400> 21
Gly Glu Gly Pro Lys Cys Pro Val Pro Glu Ile Pro Gly Ala Pro Ser
1 5 10 15
Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Ser Ile Ser Arg
20 25 30
Thr Pro Glu Val Thr Cys Leu Val Val Asp Leu Gly Pro Asp Asp Ser
35 40 45
Asn Val Gln Ile Thr Trp Phe Val Asp Asn Thr Glu Met His Thr Ala
50 55 60
Lys Thr Arg Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
65 70 75 80
Ser Val Leu Pro Ile Leu His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Glu Phe
85 90 95
Lys Cys Lys Val Asn Ser Lys Ser Leu Pro Ser Ala Met Glu Arg Thr
100 105 110
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro His Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu
115 120 125
Pro Pro Thr Gln Glu Glu Leu Ser Glu Asn Lys Val Ser Val Thr Cys
130 135 140
Leu Ile Lys Gly Phe His Pro Pro Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ile
145 150 155 160
Thr Gly Gln Pro Glu Pro Glu Asn Asn Tyr Gln Thr Thr Pro Pro Gln
165 170 175
Leu Asp Ser Asp Gly Thr Tyr Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Ser Val Asp
180 185 190
Arg Ser His Trp Gln Arg Gly Asn Thr Tyr Thr Cys Ser Val Ser His
195 200 205
Glu Ala Leu His Ser His His Thr Gln Lys Ser Leu Thr Gln Ser Pro
210 215 220
Gly
225
<210> 22
<211> 224
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 具有cNg-S突变的犬科动物IgGB Fc片段 （Canine IgGB Fc Fragment withcNg-S Mutation）
<400> 22
Asp Cys Pro Lys Cys Pro Ala Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Val
1 5 10 15
Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg Thr
20 25 30
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asp Pro Glu
35 40 45
Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Gln Met Gln Thr Ala Lys
50 55 60
Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Ser Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser
65 70 75 80
Val Leu Pro Ile Gly His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Gln Phe Thr
85 90 95
Cys Lys Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile
100 105 110
Ser Lys Ala Arg Gly Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro
115 120 125
Pro Ser Arg Glu Glu Leu Ser Lys Asn Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu
130 135 140
Ile Lys Asp Phe Phe Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn
145 150 155 160
Gly Gln Gln Glu Pro Glu Ser Lys Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu
165 170 175
Asp Glu Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys
180 185 190
Ser Arg Trp Gln Arg Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu
195 200 205
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly
210 215 220
<210> 23
<211> 224
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 具有cNg-S突变的猫科动物IgG1b Fc片段（Feline IgG1b Fc Fragment withcNg-S Mutation）
<400> 23
Asp Cys Pro Lys Cys Pro Pro Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Ile
1 5 10 15
Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Ser Ile Ser Arg Thr
20 25 30
Pro Glu Val Thr Cys Leu Val Val Asp Leu Gly Pro Asp Asp Ser Asp
35 40 45
Val Gln Ile Thr Trp Phe Val Asp Asn Thr Gln Val Tyr Thr Ala Lys
50 55 60
Thr Ser Pro Arg Glu Glu Gln Phe Ser Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
65 70 75 80
Val Leu Pro Ile Leu His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Glu Phe Lys
85 90 95
Cys Lys Val Asn Ser Lys Ser Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile
100 105 110
Ser Lys Asp Lys Gly Gln Pro His Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro
115 120 125
Pro Ala Gln Glu Glu Leu Ser Arg Asn Lys Val Ser Val Thr Cys Leu
130 135 140
Ile Glu Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ile Thr
145 150 155 160
Gly Gln Pro Glu Pro Glu Asn Asn Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu
165 170 175
Asp Ser Asp Gly Thr Tyr Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Ser Val Asp Arg
180 185 190
Ser Arg Trp Gln Arg Gly Asn Thr Tyr Thr Cys Ser Val Ser His Glu
195 200 205
Ala Leu His Ser His His Thr Gln Lys Ser Leu Thr Gln Ser Pro Gly
210 215 220
<210> 24
<211> 303
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白（Fusion Protein）
<220>
<221> UNSURE
<222> (10)..(10)
<223> Xaa不是D
<220>
<221> UNSURE
<222> (45)..(45)
<223> Xaa不是H
<220>
<221> UNSURE
<222> (58)..(58)
<223> Xaa不存在或者是 N
<400> 24
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser Xaa Leu Val Glu Ala Leu Glu
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Xaa Ser Thr Cys
35 40 45
Ser Leu Asp Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Gln
50 55 60
Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gly Asp
65 70 75 80
Cys Pro Lys Cys Pro Ala Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
85 90 95
Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg Thr Pro
100 105 110
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asp Pro Glu Val
115 120 125
Gln Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Gln Met Gln Thr Ala Lys Thr
130 135 140
Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
145 150 155 160
Leu Pro Ile Gly His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Gln Phe Thr Cys
165 170 175
Lys Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser
180 185 190
Lys Ala Arg Gly Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro
195 200 205
Ser Arg Glu Glu Leu Ser Lys Asn Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu Ile
210 215 220
Lys Asp Phe Phe Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly
225 230 235 240
Gln Gln Glu Pro Glu Ser Lys Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp
245 250 255
Glu Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser
260 265 270
Arg Trp Gln Arg Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala
275 280 285
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly
290 295 300
<210> 25
<211> 303
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白（Fusion Protein）
<220>
<221> UNSURE
<222> (58)..(58)
<223> Xaa不存在或者是 N
<400> 25
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Glu
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Thr Cys
35 40 45
Ser Leu Asp Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Gln
50 55 60
Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gly Asp
65 70 75 80
Cys Pro Lys Cys Pro Ala Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
85 90 95
Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg Thr Pro
100 105 110
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asp Pro Glu Val
115 120 125
Gln Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Gln Met Gln Thr Ala Lys Thr
130 135 140
Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
145 150 155 160
Leu Pro Ile Gly His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Gln Phe Thr Cys
165 170 175
Lys Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser
180 185 190
Lys Ala Arg Gly Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro
195 200 205
Ser Arg Glu Glu Leu Ser Lys Asn Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu Ile
210 215 220
Lys Asp Phe Phe Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly
225 230 235 240
Gln Gln Glu Pro Glu Ser Lys Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp
245 250 255
Glu Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser
260 265 270
Arg Trp Gln Arg Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala
275 280 285
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly
290 295 300
<210> 26
<211> 302
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白（Fusion Protein）
<220>
<221> UNSURE
<222> (10)..(10)
<223> Xaa不是D
<220>
<221> UNSURE
<222> (45)..(45)
<223> Xaa不是H
<400> 26
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser Xaa Leu Val Glu Ala Leu Ala
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Xaa Ser Thr Cys
35 40 45
Ser Leu Asp Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gln Gly
50 55 60
Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gly Asp Cys
65 70 75 80
Pro Lys Cys Pro Ala Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile
85 90 95
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg Thr Pro Glu
100 105 110
Val Thr Cys Val Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asp Pro Glu Val Gln
115 120 125
Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Gln Met Gln Thr Ala Lys Thr Gln
130 135 140
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Ser Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
145 150 155 160
Pro Ile Gly His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Gln Phe Thr Cys Lys
165 170 175
Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys
180 185 190
Ala Arg Gly Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser
195 200 205
Arg Glu Glu Leu Ser Lys Asn Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu Ile Lys
210 215 220
Asp Phe Phe Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln
225 230 235 240
Gln Glu Pro Glu Ser Lys Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu
245 250 255
Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg
260 265 270
Trp Gln Arg Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu
275 280 285
His Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly
290 295 300
<210> 27
<211> 302
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白（Fusion Protein）
<220>
<221> UNSURE
<222> (10)..(10)
<223> Xaa不是D
<220>
<221> UNSURE
<222> (45)..(45)
<223> Xaa不是H
<400> 27
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser Xaa Leu Val Glu Ala Leu Glu
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Xaa Ser Thr Cys
35 40 45
Ser Leu Asp Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gln Gly
50 55 60
Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gly Asp Cys
65 70 75 80
Pro Lys Cys Pro Pro Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Ile Phe Ile
85 90 95
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Ser Ile Ser Arg Thr Pro Glu
100 105 110
Val Thr Cys Leu Val Val Asp Leu Gly Pro Asp Asp Ser Asp Val Gln
115 120 125
Ile Thr Trp Phe Val Asp Asn Thr Gln Val Tyr Thr Ala Lys Thr Ser
130 135 140
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
145 150 155 160
Pro Ile Leu His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys
165 170 175
Val Asn Ser Lys Ser Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys
180 185 190
Asp Lys Gly Gln Pro His Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Ala
195 200 205
Gln Glu Glu Leu Ser Arg Asn Lys Val Ser Val Thr Cys Leu Ile Glu
210 215 220
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ile Thr Gly Gln
225 230 235 240
Pro Glu Pro Glu Asn Asn Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Ser
245 250 255
Asp Gly Thr Tyr Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Ser Val Asp Arg Ser Arg
260 265 270
Trp Gln Arg Gly Asn Thr Tyr Thr Cys Ser Val Ser His Glu Ala Leu
275 280 285
His Ser His His Thr Gln Lys Ser Leu Thr Gln Ser Pro Gly
290 295 300
<210> 28
<211> 302
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白（Fusion Protein）
<220>
<221> UNSURE
<222> (10)..(10)
<223> Xaa不是D
<220>
<221> UNSURE
<222> (45)..(45)
<223> Xaa不是H
<400> 28
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser Xaa Leu Val Glu Ala Leu Ala
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Xaa Ser Thr Cys
35 40 45
Ser Leu Asp Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gln Gly
50 55 60
Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gly Asp Cys
65 70 75 80
Pro Lys Cys Pro Pro Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Ile Phe Ile
85 90 95
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Ser Ile Ser Arg Thr Pro Glu
100 105 110
Val Thr Cys Leu Val Val Asp Leu Gly Pro Asp Asp Ser Asp Val Gln
115 120 125
Ile Thr Trp Phe Val Asp Asn Thr Gln Val Tyr Thr Ala Lys Thr Ser
130 135 140
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Ser Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
145 150 155 160
Pro Ile Leu His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys
165 170 175
Val Asn Ser Lys Ser Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys
180 185 190
Asp Lys Gly Gln Pro His Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Ala
195 200 205
Gln Glu Glu Leu Ser Arg Asn Lys Val Ser Val Thr Cys Leu Ile Glu
210 215 220
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ile Thr Gly Gln
225 230 235 240
Pro Glu Pro Glu Asn Asn Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Ser
245 250 255
Asp Gly Thr Tyr Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Ser Val Asp Arg Ser Arg
260 265 270
Trp Gln Arg Gly Asn Thr Tyr Thr Cys Ser Val Ser His Glu Ala Leu
275 280 285
His Ser His His Thr Gln Lys Ser Leu Thr Gln Ser Pro Gly
290 295 300
<210> 29
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 前导（Leader）（Leader）DNA（Leader DNA）
<400> 29
atggaatgga gctgggtctt tctcttcttc ctgtcagtaa cgactggtgt ccactcc 57
<210> 30
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 前导（Leader）
<400> 30
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser
<210> 31
<211> 966
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白 DNA（Fusion Protein DNA）
<400> 31
atggaatgga gctgggtctt tctcttcttc ctgtcagtaa cgactggtgt ccactccttc 60
gtgaaccagc acctgtgcgg ctcccacctg gtggaagctc tggaactcgt gtgcggcgag 120
cggggcttcc actacggggg tggcggagga ggttctggtg gcggcggagg catcgtggaa 180
cagtgctgca cctccacctg ctccctggac cagctggaaa actactgcgg tggcggaggt 240
ggtcaaggag gcggtggaca gggtggaggt gggcagggag gaggcggggg agactgcccc 300
aagtgccccg ctcccgagat gctgggcgga cccagcgtgt tcatcttccc tcccaagccc 360
aaggacacac tgctgatcgc caggaccccg gaggtgacct gcgtggtggt ggacctggat 420
cccgaagacc ccgaggtgca gatcagctgg ttcgtggatg gaaagcagat gcagaccgcc 480
aagacccaac cccgggaaga gcagttcaac ggcacctaca gggtggtgag tgtgttgccc 540
atcggccacc aggactggct gaaggggaag caattcacat gcaaggttaa taacaaggcc 600
ctgcccagcc ccatcgagag gaccatcagc aaggccaggg gccaggccca ccagccatct 660
gtgtacgtgc tgcccccatc tagggaggaa ctgagcaaga acacagtcag ccttacttgc 720
ctgatcaagg acttcttccc accggacata gacgtggagt ggcagagtaa cggccagcag 780
gagcccgaga gcaagtatag gaccacaccg ccccaactgg acgaggacgg aagctacttc 840
ctctacagca aattgagcgt tgacaaaagc aggtggcagc gaggcgacac cttcatctgc 900
gccgtgatgc acgaggcttt gcataaccac tacacccagg agagcctgtc ccacagcccc 960
ggatag 966
<210> 32
<211> 302
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白（Fusion Protein）
<400> 32
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Glu
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Thr Cys
35 40 45
Ser Leu Asp Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gln Gly
50 55 60
Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gly Asp Cys
65 70 75 80
Pro Lys Cys Pro Ala Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile
85 90 95
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg Thr Pro Glu
100 105 110
Val Thr Cys Val Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asp Pro Glu Val Gln
115 120 125
Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Gln Met Gln Thr Ala Lys Thr Gln
130 135 140
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
145 150 155 160
Pro Ile Gly His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Gln Phe Thr Cys Lys
165 170 175
Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys
180 185 190
Ala Arg Gly Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser
195 200 205
Arg Glu Glu Leu Ser Lys Asn Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu Ile Lys
210 215 220
Asp Phe Phe Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln
225 230 235 240
Gln Glu Pro Glu Ser Lys Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu
245 250 255
Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg
260 265 270
Trp Gln Arg Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu
275 280 285
His Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly
290 295 300
<210> 33
<211> 969
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白DNA（Fusion Protein DNA）
<400> 33
atggaatgga gctgggtctt tctcttcttc ctgtcagtaa cgactggtgt ccactccttc 60
gtgaaccagc acctgtgcgg ctcccacctg gtggaagctc tggaactcgt gtgcggcgag 120
cggggcttcc actacggggg tggcggagga ggttctggtg gcggcggagg catcgtggaa 180
cagtgctgca cctccacctg ctccctggac cagctggaaa actactgcaa cggtggcgga 240
ggtggtcaag gaggcggtgg acagggtgga ggtgggcagg gaggaggcgg gggagactgc 300
cccaagtgcc ccgctcccga gatgctgggc ggacccagcg tgttcatctt ccctcccaag 360
cccaaggaca cactgctgat cgccaggacc ccggaggtga cctgcgtggt ggtggacctg 420
gatcccgaag accccgaggt gcagatcagc tggttcgtgg atggaaagca gatgcagacc 480
gccaagaccc aaccccggga agagcagttc aacggcacct acagggtggt gagtgtgttg 540
cccatcggcc accaggactg gctgaagggg aagcaattca catgcaaggt taataacaag 600
gccctgccca gccccatcga gaggaccatc agcaaggcca ggggccaggc ccaccagcca 660
tctgtgtacg tgctgccccc atctagggag gaactgagca agaacacagt cagccttact 720
tgcctgatca aggacttctt cccaccggac atagacgtgg agtggcagag taacggccag 780
caggagcccg agagcaagta taggaccaca ccgccccaac tggacgagga cggaagctac 840
ttcctctaca gcaaattgag cgttgacaaa agcaggtggc agcgaggcga caccttcatc 900
tgcgccgtga tgcacgaggc tttgcataac cactacaccc aggagagcct gtcccacagc 960
cccggatag 969
<210> 34
<211> 303
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白（Fusion Protein）
<400> 34
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Glu
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Thr Cys
35 40 45
Ser Leu Asp Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn Gly Gly Gly Gly Gly Gln
50 55 60
Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gly Asp
65 70 75 80
Cys Pro Lys Cys Pro Ala Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
85 90 95
Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg Thr Pro
100 105 110
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asp Pro Glu Val
115 120 125
Gln Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Gln Met Gln Thr Ala Lys Thr
130 135 140
Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
145 150 155 160
Leu Pro Ile Gly His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Gln Phe Thr Cys
165 170 175
Lys Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser
180 185 190
Lys Ala Arg Gly Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro
195 200 205
Ser Arg Glu Glu Leu Ser Lys Asn Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu Ile
210 215 220
Lys Asp Phe Phe Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly
225 230 235 240
Gln Gln Glu Pro Glu Ser Lys Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp
245 250 255
Glu Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser
260 265 270
Arg Trp Gln Arg Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala
275 280 285
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly
290 295 300
<210> 35
<211> 966
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白DNA（Fusion Protein DNA）
<400> 35
atggaatgga gctgggtctt tctcttcttc ctgtcagtaa cgactggtgt ccactccttc 60
gtgaaccagc acctgtgcgg ctcccacctg gtggaagctc tggcactcgt gtgcggcgag 120
cggggcttcc actacggggg tggcggagga ggttctggtg gcggcggagg catcgtggaa 180
cagtgctgca cctccacctg ctccctggac cagctggaaa actactgcgg tggcggaggt 240
ggtcaaggag gcggtggaca gggtggaggt gggcagggag gaggcggggg agactgcccc 300
aagtgccccg ctcccgagat gctgggcgga cccagcgtgt tcatcttccc tcccaagccc 360
aaggacacac tgctgatcgc caggaccccg gaggtgacct gcgtggtggt ggacctggat 420
cccgaagacc ccgaggtgca gatcagctgg ttcgtggatg gaaagcagat gcagaccgcc 480
aagacccaac cccgggaaga gcagttctca ggcacctaca gggtggtgag tgtgttgccc 540
atcggccacc aggactggct gaaggggaag caattcacat gcaaggttaa taacaaggcc 600
ctgcccagcc ccatcgagag gaccatcagc aaggccaggg gccaggccca ccagccatct 660
gtgtacgtgc tgcccccatc tagggaggaa ctgagcaaga acacagtcag ccttacttgc 720
ctgatcaagg acttcttccc accggacata gacgtggagt ggcagagtaa cggccagcag 780
gagcccgaga gcaagtatag gaccacaccg ccccaactgg acgaggacgg aagctacttc 840
ctctacagca aattgagcgt tgacaaaagc aggtggcagc gaggcgacac cttcatctgc 900
gccgtgatgc acgaggcttt gcataaccac tacacccagg agagcctgtc ccacagcccc 960
ggatag 966
<210> 36
<211> 302
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白（Fusion Protein）
<400> 36
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Ala
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Thr Cys
35 40 45
Ser Leu Asp Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gln Gly
50 55 60
Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gly Asp Cys
65 70 75 80
Pro Lys Cys Pro Ala Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile
85 90 95
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg Thr Pro Glu
100 105 110
Val Thr Cys Val Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asp Pro Glu Val Gln
115 120 125
Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Gln Met Gln Thr Ala Lys Thr Gln
130 135 140
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Ser Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
145 150 155 160
Pro Ile Gly His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Gln Phe Thr Cys Lys
165 170 175
Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys
180 185 190
Ala Arg Gly Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser
195 200 205
Arg Glu Glu Leu Ser Lys Asn Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu Ile Lys
210 215 220
Asp Phe Phe Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln
225 230 235 240
Gln Glu Pro Glu Ser Lys Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu
245 250 255
Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg
260 265 270
Trp Gln Arg Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu
275 280 285
His Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly
290 295 300
<210> 37
<211> 966
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白DNA（Fusion Protein DNA）
<400> 37
atggaatgga gctgggtctt tctcttcttc ctgtcagtaa cgactggtgt ccactccttc 60
gtgaaccagc acctgtgcgg ctcccacctg gtggaagctc tggaactcgt gtgcggcgag 120
cggggcttcc actacggggg tggcggagga ggttctggtg gcggcggagg catcgtggaa 180
cagtgctgca cctccacctg ctccctggac cagctggaaa actactgcgg tggcggaggt 240
ggtcaaggag gcggtggaca gggtggaggt gggcagggag gaggcggggg agactgcccc 300
aaatgtcctc cgcctgagat gctgggtggc cctagcatct tcatcttccc gcccaagccc 360
aaggatactc tgtccattag caggaccccc gaggtgacct gcctggtggt ggacctgggg 420
ccagacgact ctgacgtgca gatcacctgg ttcgtagaca acacccaggt ttacactgcc 480
aagaccagtc ccagggagga gcagttcaac agcacataca gggtggtgag cgttctgccc 540
atcctgcacc aggactggct gaaaggcaaa gagttcaagt gtaaggtgaa cagcaagagc 600
ctgcccagcc ccattgaaag gaccatcagc aaggacaagg gccagccgca cgagccccaa 660
gtctacgtgc tgcccccagc acaggaagag ctgagcagga acaaggttag cgtgacatgc 720
ctgatcgagg gtttctaccc cagcgacatc gccgtggagt gggaaatcac cggccaaccc 780
gagcccgaga acaactacag gaccactccg ccgcaactgg acagcgacgg gacctacttc 840
ttgtatagca ggctgagcgt ggaccggagc aggtggcaga ggggcaacac ctacacttgc 900
agcgtgagcc acgaggcctt gcacagccac cacactcaga agagtctgac ccagagcccg 960
ggatag 966
<210> 38
<211> 302
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白（Fusion Protein）
<400> 38
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Glu
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Thr Cys
35 40 45
Ser Leu Asp Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gln Gly
50 55 60
Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gly Asp Cys
65 70 75 80
Pro Lys Cys Pro Pro Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Ile Phe Ile
85 90 95
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Ser Ile Ser Arg Thr Pro Glu
100 105 110
Val Thr Cys Leu Val Val Asp Leu Gly Pro Asp Asp Ser Asp Val Gln
115 120 125
Ile Thr Trp Phe Val Asp Asn Thr Gln Val Tyr Thr Ala Lys Thr Ser
130 135 140
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
145 150 155 160
Pro Ile Leu His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys
165 170 175
Val Asn Ser Lys Ser Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys
180 185 190
Asp Lys Gly Gln Pro His Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Ala
195 200 205
Gln Glu Glu Leu Ser Arg Asn Lys Val Ser Val Thr Cys Leu Ile Glu
210 215 220
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ile Thr Gly Gln
225 230 235 240
Pro Glu Pro Glu Asn Asn Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Ser
245 250 255
Asp Gly Thr Tyr Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Ser Val Asp Arg Ser Arg
260 265 270
Trp Gln Arg Gly Asn Thr Tyr Thr Cys Ser Val Ser His Glu Ala Leu
275 280 285
His Ser His His Thr Gln Lys Ser Leu Thr Gln Ser Pro Gly
290 295 300
<210> 39
<211> 966
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白DNA（Fusion Protein DNA）
<400> 39
atggaatgga gctgggtctt tctcttcttc ctgtcagtaa cgactggtgt ccactccttc 60
gtgaaccagc acctgtgcgg ctcccacctg gtggaagctc tggcactcgt gtgcggcgag 120
cggggcttcc actacggggg tggcggagga ggttctggtg gcggcggagg catcgtggaa 180
cagtgctgca cctccacctg ctccctggac cagctggaaa actactgcgg tggcggaggt 240
ggtcaaggag gcggtggaca gggtggaggt gggcagggag gaggcggggg agactgcccc 300
aaatgtcctc cgcctgagat gctgggtggc cctagcatct tcatcttccc gcccaagccc 360
aaggatactc tgtccattag caggaccccc gaggtgacct gcctggtggt ggacctgggg 420
ccagacgact ctgacgtgca gatcacctgg ttcgtagaca acacccaggt ttacactgcc 480
aagaccagtc ccagggagga gcagttcagc agcacataca gggtggtgag cgttctgccc 540
atcctgcacc aggactggct gaaaggcaaa gagttcaagt gtaaggtgaa cagcaagagc 600
ctgcccagcc ccattgaaag gaccatcagc aaggacaagg gccagccgca cgagccccaa 660
gtctacgtgc tgcccccagc acaggaagag ctgagcagga acaaggttag cgtgacatgc 720
ctgatcgagg gtttctaccc cagcgacatc gccgtggagt gggaaatcac cggccaaccc 780
gagcccgaga acaactacag gaccactccg ccgcaactgg acagcgacgg gacctacttc 840
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ggatag 966
<210> 40
<211> 302
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白（Fusion Protein）
<400> 40
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Ala
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Thr Cys
35 40 45
Ser Leu Asp Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gln Gly
50 55 60
Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gly Asp Cys
65 70 75 80
Pro Lys Cys Pro Pro Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Ile Phe Ile
85 90 95
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Ser Ile Ser Arg Thr Pro Glu
100 105 110
Val Thr Cys Leu Val Val Asp Leu Gly Pro Asp Asp Ser Asp Val Gln
115 120 125
Ile Thr Trp Phe Val Asp Asn Thr Gln Val Tyr Thr Ala Lys Thr Ser
130 135 140
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Ser Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
145 150 155 160
Pro Ile Leu His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys
165 170 175
Val Asn Ser Lys Ser Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys
180 185 190
Asp Lys Gly Gln Pro His Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Ala
195 200 205
Gln Glu Glu Leu Ser Arg Asn Lys Val Ser Val Thr Cys Leu Ile Glu
210 215 220
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ile Thr Gly Gln
225 230 235 240
Pro Glu Pro Glu Asn Asn Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Ser
245 250 255
Asp Gly Thr Tyr Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Ser Val Asp Arg Ser Arg
260 265 270
Trp Gln Arg Gly Asn Thr Tyr Thr Cys Ser Val Ser His Glu Ala Leu
275 280 285
His Ser His His Thr Gln Lys Ser Leu Thr Gln Ser Pro Gly
290 295 300
<210> 41
<211> 942
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白DNA（Fusion Protein DNA）
<400> 41
atggaatgga gctgggtctt tctcttcttc ctgtcagtaa cgactggtgt ccactccttc 60
gtgaaccagc acctgtgcgg ctccgacctg gtggaagctc tggctctcgt gtgcggcgag 120
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aaggagttca agtgccgcgt gaaccacatt gatctcccca gccccatcga gaggactatc 600
tccaaggccc gagggagggc ccacaagccc agtgtatacg tgctgccgcc ctctccgaag 660
gaactgagct ctagcgacac cgtgagcatc acctgcctga tcaaggactt ctaccctccc 720
gacatagacg tagagtggca gagcaacggc cagcaggagc ccgaaaggaa gcacaggatg 780
accccacccc aactggacga ggacggctca tactttcttt atagcaagct gagtgtggac 840
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<210> 42
<211> 294
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白（Fusion Protein）
<400> 42
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser Asp Leu Val Glu Ala Leu Ala
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Asp Pro Thr Gly Gly
20 25 30
Gly Pro Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys His Ser Ile Cys Ser
35 40 45
Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly
50 55 60
Gly Gly Arg Cys Thr Asp Thr Pro Pro Cys Pro Val Pro Glu Pro Leu
65 70 75 80
Gly Gly Pro Ser Val Leu Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Ile Leu
85 90 95
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100 105 110
Arg Glu Asp Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Glu
115 120 125
Val His Thr Ala Lys Thr Gln Ser Arg Glu Gln Gln Phe Asn Gly Thr
130 135 140
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Glu His Gln Asp Trp Leu Thr
145 150 155 160
Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn His Ile Asp Leu Pro Ser Pro
165 170 175
Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Arg Ala His Lys Pro Ser
180 185 190
Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Pro Lys Glu Leu Ser Ser Ser Asp Thr
195 200 205
Val Ser Ile Thr Cys Leu Ile Lys Asp Phe Tyr Pro Pro Asp Ile Asp
210 215 220
Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu Pro Glu Arg Lys His Arg
225 230 235 240
Met Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser
245 250 255
Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asp Pro Phe Thr
260 265 270
Cys Ala Val Met His Glu Thr Leu Gln Asn His Tyr Thr Asp Leu Ser
275 280 285
Leu Ser His Ser Pro Gly
290
<210> 43
<211> 942
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白DNA（Fusion Protein DNA）
<400> 43
atggaatgga gctgggtctt tctcttcttc ctgtcagtaa cgactggtgt ccactccttc 60
gtgaaccagc acctgtgcgg ctccgacctg gtggaagctc tggctctcgt gtgcggcgag 120
cggggcttct tctacaccga tcccactgga ggcggtccac gcagaggcat cgtggaacag 180
tgctgccact ccatctgctc cctgtaccag ctggaaaact actgcaatgg cggaggtggt 240
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<210> 44
<211> 294
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白（Fusion Protein）
<400> 44
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser Asp Leu Val Glu Ala Leu Ala
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Asp Pro Thr Gly Gly
20 25 30
Gly Pro Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys His Ser Ile Cys Ser
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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130 135 140
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145 150 155 160
Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn His Ile Asp Leu Pro Ser Pro
165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Met Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser
245 250 255
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260 265 270
Cys Ala Val Leu His Glu Ala Leu His Ser His Tyr Thr Gln Lys Ser
275 280 285
Leu Ser Leu Ser Pro Gly
290
<210> 45
<211> 942
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白DNA（Fusion Protein DNA）
<400> 45
atggaatgga gctgggtctt tctcttcttc ctgtcagtaa cgactggtgt ccactccttc 60
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aaggagttca agtgccgcgt gaaccacatt gatctcccca gccccatcga gaggactatc 600
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<210> 46
<211> 294
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白（Fusion Protein）
<400> 46
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser Asp Leu Val Glu Ala Leu Ala
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Asp Pro Thr Gly Gly
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Gly Pro Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys His Ser Ile Cys Ser
35 40 45
Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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Met Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser
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290
<210> 47
<211> 942
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白DNA（Fusion Protein DNA）
<400> 47
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<210> 48
<211> 294
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白（Fusion Protein）
<400> 48
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser Asp Leu Val Glu Ala Leu Ala
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Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Asp Pro Thr Gly Gly
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Gly Pro Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys His Ser Ile Cys Ser
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Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly
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165 170 175
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180 185 190
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290
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<211> 942
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白DNA（Fusion Protein DNA）
<400> 49
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<211> 294
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白（Fusion Protein）
<400> 50
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser Asp Leu Val Glu Ala Leu Ala
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290
<210> 51
<211> 930
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白DNA（Fusion Protein DNA）
<400> 51
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白（Fusion Protein）
<400> 52
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser Asp Leu Val Glu Ala Leu Ala
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白DNA（Fusion Protein DNA）
<400> 53
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<211> 291
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<220>
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<222>
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<211> 933
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白DNA（Fusion Protein DNA）
<400> 55
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白（Fusion Protein）
<400> 56
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser Asp Leu Val Glu Ala Leu Ala
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Asp Pro Thr Gly Gly
20 25 30
Gly Pro Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys His Ser Ile Cys Ser
35 40 45
Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly
50 55 60
Gly Gly Cys Ile Ser Pro Cys Pro Val Pro Glu Ser Leu Gly Gly Pro
65 70 75 80
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Ile Leu Arg Ile Thr
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Arg Thr Pro Glu Ile Thr Cys Val Val Leu Asp Leu Gly Arg Glu Asp
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130 135 140
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser
245 250 255
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asp Thr Phe Thr Cys Ala Val
260 265 270
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275 280 285
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290
<210> 57
<211> 930
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白DNA（Fusion Protein DNA）
<400> 57
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<210> 58
<211> 290
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白（Fusion Protein）
<400> 58
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<210> 59
<211> 930
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白DNA（Fusion Protein DNA）
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白（Fusion Protein）
<400> 60
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<211> 930
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白（Fusion Protein）
<400> 62
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
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<223> 融合蛋白DNA（Fusion Protein DNA）
<400> 63
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
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<222>
<223> 融合蛋白（Fusion Protein）
<400> 64
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
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<223> 融合蛋白 DNA（Fusion Protein DNA）
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白（Fusion Protein）
<400> 66
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Ala
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<210> 67
<211> 927
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白DNA（Fusion Protein DNA）
<400> 67
atggaatgga gctgggtctt tctcttcttc ctgtcagtaa cgactggtgt ccactccttc 60
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<211> 289
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白（Fusion Protein）
<400> 68
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Gln Ala Leu Tyr
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225 230 235 240
Leu Asp Glu Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp
245 250 255
Lys Ser Arg Trp Gln Arg Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His
260 265 270
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser His Ser Pro
275 280 285
Gly
<210> 69
<211> 927
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白 DNA（Fusion Protein DNA）
<400> 69
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<210> 70
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白（Fusion Protein）
<400> 70
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
Gly
<210> 71
<211> 927
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
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<400> 71
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白（Fusion Protein）
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245 250 255
Lys Ser Arg Trp Gln Arg Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His
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Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser His Ser Pro
275 280 285
Gly
<210> 73
<211> 927
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白 DNA（Fusion Protein DNA）
<400> 73
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<210> 74
<211> 289
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白 DNA（Fusion Protein DNA）
<400> 74
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Ala
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Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Tyr Tyr Thr Asp Pro Thr Gly Gly
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Gly
<210> 75
<211> 927
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白 DNA（Fusion Protein DNA）
<400> 75
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<210> 76
<211> 289
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白（Fusion Protein）
<400> 76
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Ala
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Gly
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白 DNA（Fusion Protein DNA）
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白（Fusion Protein）
<400> 78
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Gln Ala Leu Tyr
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白 DNA（Fusion Protein DNA）
<400> 79
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<211> 294
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白（Fusion Protein）
<400> 80
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Ala
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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<210> 81
<211> 930
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白 DNA（Fusion Protein DNA）
<400> 81
atggaatgga gctgggtctt tctcttcttc ctgtcagtaa cgactggtgt ccactccttc 60
gtgaaccagc acctctgcgg cagccacctg gtggaggcct tggccctggt gtgcggcgag 120
aggggcttct tctacaccga tccaggtggc ggtgggggag gtggcggagg gatcgtggag 180
cagtgctgca ccagcatctg cagcctgtac caactggaaa actactgcgg cggaggtggt 240
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gatggaaagc agatgcagac cgccaagacc caaccccggg aagagcagtt cagcggcacc 480
tacagggtgg tgagtgtgtt gcccatcggc caccaggact ggctgaaggg gaagcaattc 540
acatgcaagg ttaataacaa ggccctgccc agccccatcg agaggaccat cagcaaggcc 600
aggggccagg cccaccagcc atctgtgtac gtgctgcccc catctaggga ggaactgagc 660
aagaacacag tcagccttac ttgcctgatc aaggacttct tcccaccgga catagacgtg 720
gagtggcaga gtaacggcca gcaggagccc gagagcaagt ataggaccac accgccccaa 780
ctggacgagg acggaagcta cttcctctac agcaaattga gcgttgacaa aagcaggtgg 840
cagcgaggcg acaccttcat ctgcgccgtg atgcacgagg ctttgcataa ccactacacc 900
caggagagcc tgtcccacag ccccggatag 930
<210> 82
<211> 290
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白（Fusion Protein）
<400> 82
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Ala
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Asp Pro Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys
35 40 45
Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly
50 55 60
Gly Gly Asp Cys Pro Lys Cys Pro Ala Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro
65 70 75 80
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala
85 90 95
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asp
100 105 110
Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Gln Met Gln Thr
115 120 125
Ala Lys Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Ser Gly Thr Tyr Arg Val
130 135 140
Val Ser Val Leu Pro Ile Gly His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Gln
145 150 155 160
Phe Thr Cys Lys Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg
165 170 175
Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val
180 185 190
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Leu Ser Lys Asn Thr Val Ser Leu Thr
195 200 205
Cys Leu Ile Lys Asp Phe Phe Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln
210 215 220
Ser Asn Gly Gln Gln Glu Pro Glu Ser Lys Tyr Arg Thr Thr Pro Pro
225 230 235 240
Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val
245 250 255
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Arg Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met
260 265 270
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser His Ser
275 280 285
Pro Gly
290
<210> 83
<211> 927
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白 DNA（Fusion Protein DNA）
<400> 83
atggaatgga gctgggtctt tctcttcttc ctgtcagtaa cgactggtgt ccactccttc 60
gtgaaccagc acctctgcgg cagccacctg gtggaggcct tggccctggt gtgcggcgag 120
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ttcatcttcc ctcccaagcc caaggacaca ctgctgatcg ccaggacccc ggaggtgacc 360
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agggtggtga gtgtgttgcc catcggccac caggactggc tgaaggggaa gcaattcaca 540
tgcaaggtta ataacaaggc cctgcccagc cccatcgaga ggaccatcag caaggccagg 600
ggccaggccc accagccatc tgtgtacgtg ctgcccccat ctagggagga actgagcaag 660
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tggcagagta acggccagca ggagcccgag agcaagtata ggaccacacc gccccaactg 780
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cgaggcgaca ccttcatctg cgccgtgatg cacgaggctt tgcataacca ctacacccag 900
gagagcctgt cccacagccc cggatag 927
<210> 84
<211> 289
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白（Fusion Protein）
<400> 84
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Ala
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Gly Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser
35 40 45
Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly
50 55 60
Gly Asp Cys Pro Lys Cys Pro Ala Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser
65 70 75 80
Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg
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100 105 110
Glu Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Gln Met Gln Thr Ala
115 120 125
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130 135 140
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Thr Cys Lys Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr
165 170 175
Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu
180 185 190
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195 200 205
Leu Ile Lys Asp Phe Phe Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser
210 215 220
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225 230 235 240
Leu Asp Glu Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp
245 250 255
Lys Ser Arg Trp Gln Arg Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His
260 265 270
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser His Ser Pro
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Gly
<210> 85
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白 DNA（Fusion Protein DNA）
<400> 85
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atcaaggact tcttcccacc ggacatagac gtggagtggc agagtaacgg ccagcaggag 780
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tag 963
<210> 86
<211> 301
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白（Fusion Protein）
<400> 86
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Ala
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Asp Pro Thr Gly Gly
20 25 30
Gly Pro Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser
35 40 45
Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly
50 55 60
Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gly Asp Cys Pro
65 70 75 80
Lys Cys Pro Ala Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe
85 90 95
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val
100 105 110
Thr Cys Val Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asp Pro Glu Val Gln Ile
115 120 125
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Arg Glu Glu Gln Phe Ser Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro
145 150 155 160
Ile Gly His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Gln Phe Thr Cys Lys Val
165 170 175
Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala
180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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Glu Pro Glu Ser Lys Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu Asp
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Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp
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Gln Arg Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His
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Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly
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<210> 87
<211> 927
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白 DNA（Fusion Protein DNA）
<400> 87
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<210> 88
<211> 289
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白（Fusion Protein）
<400> 88
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Ala
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Gln Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser
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Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly
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Gly Asp Cys Pro Lys Cys Pro Ala Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser
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Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg
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Glu Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Gln Met Gln Thr Ala
115 120 125
Lys Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Ser Gly Thr Tyr Arg Val Val
130 135 140
Ser Val Leu Pro Ile Gly His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Gln Phe
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Thr Cys Lys Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr
165 170 175
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Leu Ile Lys Asp Phe Phe Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser
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Leu Asp Glu Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp
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Lys Ser Arg Trp Gln Arg Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His
260 265 270
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Gly
<210> 89
<211> 966
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白 DNA（Fusion Protein DNA）
<400> 89
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<210> 90
<211> 302
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白（Fusion Protein）
<400> 90
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Glu
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Gly Gly
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Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gly Asp Cys
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<210> 91
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白 DNA（Fusion Protein DNA）
<400> 91
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gatcccgaag accccgaggt gcagatcagc tggttcgtgg atggaaagca gatgcagacc 480
gccaagaccc aaccccggga agagcagttc aacggcacct acagggtggt gagtgtgttg 540
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<211> 303
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白（Fusion Protein）
<400> 92
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Glu
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Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
145 150 155 160
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275 280 285
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly
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<211> 966
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白 DNA（Fusion Protein DNA）
<400> 93
atggaatgga gctgggtctt tctcttcttc ctgtcagtaa cgactggtgt ccactccttc 60
gtgaaccagc acctgtgcgg ctcccacctg gtggaagctc tggaactcgt gtgcggcgag 120
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ggatag 966
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<211> 302
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
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<223> 融合蛋白（Fusion Protein）
<400> 94
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Glu
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Thr Cys
35 40 45
Ser Leu Asp Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gln Gly
50 55 60
Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gly Asp Cys
65 70 75 80
Pro Lys Cys Pro Ala Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile
85 90 95
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg Thr Pro Glu
100 105 110
Val Thr Cys Val Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asp Pro Glu Val Gln
115 120 125
Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Gln Met Gln Thr Ala Lys Thr Gln
130 135 140
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
145 150 155 160
Pro Ile Gly His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Gln Phe Thr Cys Lys
165 170 175
Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys
180 185 190
Ala Arg Gly Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser
195 200 205
Arg Glu Glu Leu Ser Lys Asn Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu Ile Lys
210 215 220
Asp Phe Phe Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln
225 230 235 240
Gln Glu Pro Glu Ser Lys Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu
245 250 255
Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg
260 265 270
Trp Gln Arg Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu
275 280 285
His Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly
290 295 300
<210> 95
<211> 978
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白 DNA（Fusion Protein DNA）
<400> 95
atggaatgga gctgggtctt tctcttcttc ctgtcagtaa cgactggtgt ccactccttc 60
gtgaaccagc acctgtgcgg ctcccacctg gtggaagctc tggaactcgt gtgcggcgag 120
cggggcttcc actacggggg tggcggagga ggttctggtg gcggcggagg catcgtggaa 180
cagtgctgca cctccacctg ctccctggac cagctggaaa actactgcgg tggcggaggt 240
ggtcaaggag gcggtggaca gggtggaggt gggcagggag gaggcggggg acgctgcact 300
gacacccctc catgccctgt gcccgagccc ctgggtggcc ccagcgtact gatcttccca 360
ccgaaaccca aggacatcct gaggatcacc cgcaccccgg aggtgacctg cgtggtgctg 420
gacctgggca gggaggaccc cgaagtgcaa atcagctggt tcgtggacgg aaaggaggtg 480
cacaccgcca agacccaatc aagggagcag cagttcaacg gcacctacag ggtggtgagc 540
gtgttgccca tagagcacca ggactggctg accggcaagg agttcaagtg ccgcgtgaac 600
cacattgatc tccccagccc catcgagagg actatctcca aggcccgagg gagggcccac 660
aagcccagtg tatacgtgct gccgccctct ccgaaggaac tgagctctag cgacaccgtg 720
agcatcacct gcctgatcaa ggacttctac cctcccgaca tagacgtaga gtggcagagc 780
aacggccagc aggagcccga aaggaagcac aggatgaccc caccccaact ggacgaggac 840
ggctcatact ttctttatag caagctgagt gtggacaaga gcaggtggca gcagggcgac 900
cctttcactt gcgccgtaat gcacgagacc ctgcagaatc actacaccga cctgtcactg 960
agccatagcc ccggatag 978
<210> 96
<211> 306
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白（Fusion Protein）
<400> 96
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Glu
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Thr Cys
35 40 45
Ser Leu Asp Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gln Gly
50 55 60
Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gly Arg Cys
65 70 75 80
Thr Asp Thr Pro Pro Cys Pro Val Pro Glu Pro Leu Gly Gly Pro Ser
85 90 95
Val Leu Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Ile Leu Arg Ile Thr Arg
100 105 110
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Leu Asp Leu Gly Arg Glu Asp Pro
115 120 125
Glu Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Glu Val His Thr Ala
130 135 140
Lys Thr Gln Ser Arg Glu Gln Gln Phe Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val
145 150 155 160
Ser Val Leu Pro Ile Glu His Gln Asp Trp Leu Thr Gly Lys Glu Phe
165 170 175
Lys Cys Arg Val Asn His Ile Asp Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr
180 185 190
Ile Ser Lys Ala Arg Gly Arg Ala His Lys Pro Ser Val Tyr Val Leu
195 200 205
Pro Pro Ser Pro Lys Glu Leu Ser Ser Ser Asp Thr Val Ser Ile Thr
210 215 220
Cys Leu Ile Lys Asp Phe Tyr Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln
225 230 235 240
Ser Asn Gly Gln Gln Glu Pro Glu Arg Lys His Arg Met Thr Pro Pro
245 250 255
Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val
260 265 270
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asp Pro Phe Thr Cys Ala Val Met
275 280 285
His Glu Thr Leu Gln Asn His Tyr Thr Asp Leu Ser Leu Ser His Ser
290 295 300
Pro Gly
305
<210> 97
<211> 969
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白 DNA（Fusion Protein DNA）
<400> 97
atggaatgga gctgggtctt tctcttcttc ctgtcagtaa cgactggtgt ccactccttc 60
gtgaaccagc acctgtgcgg ctcccacctg gtggaagctc tggaactcgt gtgcggcgag 120
cggggcttcc actacggggg tggcggagga ggttctggtg gcggcggagg catcgtggaa 180
cagtgctgca cctccacctg ctccctggac cagctggaaa actactgcgg tggcggaggt 240
ggtcaaggag gcggtggaca gggtggaggt gggcagggag gaggcggggg atgcaacaac 300
tgcccgtgtc cgggatgcgg cctcctgggc ggaccgagcg tgttcatttt ccctcctaag 360
cccaaggaca ttctggtgac cgccaggacc cccacggtga cctgcgtggt agtagatctc 420
gatcccgaaa acccagaggt gcaaatcagc tggttcgtgg actctaagca agtgcaaacc 480
gccaacacgc aaccccgcga ggaacagagc aacggcacct acagggtggt gagcgtgctg 540
cccatcgggc atcaggactg gctgagcggc aagcagttta aatgcaaggt taacaacaag 600
gcactgccca gccccatcga ggagatcatc agcaagaccc cgggacaggc ccaccagccc 660
aacgtgtacg tccttcctcc gagccgcgac gagatgagca agaacaccgt gacgctgacc 720
tgtttggtga aggacttctt cccacccgag atcgacgtgg agtggcaaag caatggccag 780
caggagcccg agagcaaata caggatgacc ccaccccaac tggatgagga tggcagctat 840
ttcctctaca gcaaattgtc cgtggacaaa agcaggtggc agaggggcga caccttcatc 900
tgcgccgtca tgcacgaggc ccttcacaat cactacaccc agatcagcct gagccactct 960
cccggatag 969
<210> 98
<211> 303
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白（Fusion Protein）
<400> 98
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Glu
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Thr Cys
35 40 45
Ser Leu Asp Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gln Gly
50 55 60
Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gly Cys Asn
65 70 75 80
Asn Cys Pro Cys Pro Gly Cys Gly Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
85 90 95
Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Ile Leu Val Thr Ala Arg Thr Pro
100 105 110
Thr Val Thr Cys Val Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asn Pro Glu Val
115 120 125
Gln Ile Ser Trp Phe Val Asp Ser Lys Gln Val Gln Thr Ala Asn Thr
130 135 140
Gln Pro Arg Glu Glu Gln Ser Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
145 150 155 160
Leu Pro Ile Gly His Gln Asp Trp Leu Ser Gly Lys Gln Phe Lys Cys
165 170 175
Lys Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Glu Ile Ile Ser
180 185 190
Lys Thr Pro Gly Gln Ala His Gln Pro Asn Val Tyr Val Leu Pro Pro
195 200 205
Ser Arg Asp Glu Met Ser Lys Asn Thr Val Thr Leu Thr Cys Leu Val
210 215 220
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225 230 235 240
Gln Gln Glu Pro Glu Ser Lys Tyr Arg Met Thr Pro Pro Gln Leu Asp
245 250 255
Glu Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser
260 265 270
Arg Trp Gln Arg Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala
275 280 285
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Ile Ser Leu Ser His Ser Pro Gly
290 295 300
<210> 99
<211> 969
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白 DNA（Fusion Protein DNA）
<400> 99
atggaatgga gctgggtctt tctcttcttc ctgtcagtaa cgactggtgt ccactccttc 60
gtgaaccagc acctgtgcgg ctcccacctg gtggaagctc tggaactcgt gtgcggcgag 120
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ccctgccccg tgccggagag cctgggtggc cctagcgtgt tcatattccc tcccaagccc 360
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tgcgccgtga tgcacgaagc tctgcaaaac cactacaccg acctgtcact gagccatagc 960
cccggatag 969
<210> 100
<211> 303
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白（Fusion Protein）
<400> 100
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Glu
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Thr Cys
35 40 45
Ser Leu Asp Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gln Gly
50 55 60
Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ile
65 70 75 80
Ser Pro Cys Pro Val Pro Glu Ser Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile
85 90 95
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Ile Leu Arg Ile Thr Arg Thr Pro Glu
100 105 110
Ile Thr Cys Val Val Leu Asp Leu Gly Arg Glu Asp Pro Glu Val Gln
115 120 125
Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Glu Val His Thr Ala Lys Thr Gln
130 135 140
Pro Arg Glu Gln Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
145 150 155 160
Pro Ile Glu His Gln Asp Trp Leu Thr Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg
165 170 175
Val Asn His Ile Gly Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys
180 185 190
Ala Arg Gly Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser
195 200 205
Pro Lys Glu Leu Ser Ser Ser Asp Thr Val Thr Leu Thr Cys Leu Ile
210 215 220
Lys Asp Phe Phe Pro Pro Glu Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly
225 230 235 240
Gln Pro Glu Pro Glu Ser Lys Tyr His Thr Thr Ala Pro Gln Leu Asp
245 250 255
Glu Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser
260 265 270
Arg Trp Gln Gln Gly Asp Thr Phe Thr Cys Ala Val Met His Glu Ala
275 280 285
Leu Gln Asn His Tyr Thr Asp Leu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly
290 295 300
<210> 101
<211> 966
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白 DNA（Fusion Protein DNA）
<400> 101
atggaatgga gctgggtctt tctcttcttc ctgtcagtaa cgactggtgt ccactccttc 60
gtgaaccagc acctgtgcgg ctcccacctg gtggaagctc tggaactcgt gtgcggcgag 120
cggggcttcc actacggggg tggcggagga ggttctggtg gcggcggagg catcgtggaa 180
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ggatag 966
<210> 102
<211> 302
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白（Fusion Protein）
<400> 102
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Glu
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Thr Cys
35 40 45
Ser Leu Asp Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gln Gly
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65 70 75 80
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Pro Ile Gly His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Gln Phe Thr Cys Lys
165 170 175
Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys
180 185 190
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Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg
260 265 270
Trp Gln Arg Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu
275 280 285
His Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly
290 295 300
<210> 103
<211> 966
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白 DNA（Fusion Protein DNA）
<400> 103
atggaatgga gctgggtctt tctcttcttc ctgtcagtaa cgactggtgt ccactccttc 60
gtgaaccagc acctgtgcgg ctcccacctg gtggaagctc tggaactcgt gtgcggcgag 120
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ctgatcaagg acttcttccc accggacata gacgtggagt ggcagagtaa cggccagcag 780
gagcccgaga gcaagtatag gaccacaccg ccccaactgg acgaggacgg aagctacttc 840
ctctacagca aattgagcgt tgacaaaagc aggtggcagc gaggcgacac cttcatctgc 900
gccgtgatgc acgaggcttt gcataaccac tacacccagg agagcctgtc ccacagcccc 960
ggatag 966
<210> 104
<211> 302
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白（Fusion Protein）
<400> 104
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Glu
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Thr Cys
35 40 45
Ser Leu Asp Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gln Gly
50 55 60
Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gly Asp Cys
65 70 75 80
Pro Lys Cys Pro Ala Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile
85 90 95
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg Thr Pro Glu
100 105 110
Val Thr Cys Val Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asp Pro Glu Val Gln
115 120 125
Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Gln Met Gln Thr Ala Lys Thr Gln
130 135 140
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Ser Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
145 150 155 160
Pro Ile Gly His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Gln Phe Thr Cys Lys
165 170 175
Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys
180 185 190
Ala Arg Gly Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser
195 200 205
Arg Glu Glu Leu Ser Lys Asn Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu Ile Lys
210 215 220
Asp Phe Phe Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln
225 230 235 240
Gln Glu Pro Glu Ser Lys Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu
245 250 255
Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg
260 265 270
Trp Gln Arg Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu
275 280 285
His Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly
290 295 300
<210> 105
<211> 933
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白 DNA（Fusion Protein DNA）
<400> 105
atggaatgga gctgggtctt tctcttcttc ctgtcagtaa cgactggtgt ccactccttc 60
gtgaaccagc acctgtgcgg ctccgacctg gtggaagctc tgtatctcgt gtgcggcgag 120
cggggcttct tctacaccga tcccactgga ggcggtccac gcagaggcat cgtggaacag 180
tgctgccact ccatctgctc cctgtaccag ctggaaaact actgcaatgg cggaggtggt 240
tcaggaggcg gtggaggtga gggccccaag tgccccgtgc ccgagattcc cggtgccccc 300
agcgtgttca tctttccccc aaaacccaag gacaccctga gcatcagcag gacccccgag 360
gtgacctgcc tggtggtgga cctgggaccc gacgacagca acgtgcagat cacctggttc 420
gtggacaaca ccgagatgca caccgccaag accaggcctc gggaggagca gttcaacagc 480
acctacaggg tggtgagcgt gctgcccatc ctgcaccagg actggctgaa gggcaaggag 540
ttcaagtgca aggtgaacag caagagcctg cccagcgcca tggagaggac catcagcaag 600
gccaagggtc agccccacga gccccaagtg tacgtgcttc ccccgaccca ggaggagttg 660
agcgagaaca aagtgagcgt gacctgcctg atcaagggct tccaccctcc cgacatcgcc 720
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<210> 106
<211> 291
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白（Fusion Protein）
<400> 106
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser Asp Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Asp Pro Thr Gly Gly
20 25 30
Gly Pro Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys His Ser Ile Cys Ser
35 40 45
Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
50 55 60
Gly Gly Gly Glu Gly Pro Lys Cys Pro Val Pro Glu Ile Pro Gly Ala
65 70 75 80
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Ser Ile
85 90 95
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Leu Val Val Asp Leu Gly Pro Asp
100 105 110
Asp Ser Asn Val Gln Ile Thr Trp Phe Val Asp Asn Thr Glu Met His
115 120 125
Thr Ala Lys Thr Arg Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg
130 135 140
Val Val Ser Val Leu Pro Ile Leu His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys
145 150 155 160
Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Ser Lys Ser Leu Pro Ser Ala Met Glu
165 170 175
Arg Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro His Glu Pro Gln Val Tyr
180 185 190
Val Leu Pro Pro Thr Gln Glu Glu Leu Ser Glu Asn Lys Val Ser Val
195 200 205
Thr Cys Leu Ile Lys Gly Phe His Pro Pro Asp Ile Ala Val Glu Trp
210 215 220
Glu Ile Thr Gly Gln Pro Glu Pro Glu Asn Asn Tyr Gln Thr Thr Pro
225 230 235 240
Pro Gln Leu Asp Ser Asp Gly Thr Tyr Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Ser
245 250 255
Val Asp Arg Ser His Trp Gln Arg Gly Asn Thr Tyr Thr Cys Ser Val
260 265 270
Ser His Glu Ala Leu His Ser His His Thr Gln Lys Ser Leu Thr Gln
275 280 285
Ser Pro Gly
290
<210> 107
<211> 930
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白 DNA（Fusion Protein DNA）
<400> 107
atggaatgga gctgggtctt tctcttcttc ctgtcagtaa cgactggtgt ccactccttc 60
gtgaaccagc acctgtgcgg ctccgacctg gtggaagctc tggctctcgt gtgcggcgag 120
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tgctgccact ccatctgctc cctgtaccag ctggaaaact actgcaatgg tggcggagga 240
tctggcggag gcggtgactg ccccaaatgt cctccgcctg agatgctggg tggccctagc 300
atcttcatct tcccgcccaa gcccaaggat actctgtcca ttagcaggac ccccgaggtg 360
acctgcctgg tggtggacct ggggccagac gactctgacg tgcagatcac ctggttcgta 420
gacaacaccc aggtttacac tgccaagacc agtcccaggg aggagcagtt caacagcaca 480
tacagggtgg tgagcgttct gcccatcctg caccaggact ggctgaaagg caaagagttc 540
aagtgtaagg tgaacagcaa gagcctgccc agccccattg aaaggaccat cagcaaggac 600
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gagtgggaaa tcaccggcca acccgagccc gagaacaact acaggaccac tccgccgcaa 780
ctggacagcg acgggaccta cttcttgtat agcaggctga gcgtggaccg gagcaggtgg 840
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cagaagagtc tgacccagag cccgggatag 930
<210> 108
<211> 290
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白（Fusion Protein）
<400> 108
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser Asp Leu Val Glu Ala Leu Ala
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Asp Pro Thr Gly Gly
20 25 30
Gly Pro Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys His Ser Ile Cys Ser
35 40 45
Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
50 55 60
Gly Gly Asp Cys Pro Lys Cys Pro Pro Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro
65 70 75 80
Ser Ile Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Ser Ile Ser
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Ser Asp Val Gln Ile Thr Trp Phe Val Asp Asn Thr Gln Val Tyr Thr
115 120 125
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130 135 140
Val Ser Val Leu Pro Ile Leu His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Glu
145 150 155 160
Phe Lys Cys Lys Val Asn Ser Lys Ser Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg
165 170 175
Thr Ile Ser Lys Asp Lys Gly Gln Pro His Glu Pro Gln Val Tyr Val
180 185 190
Leu Pro Pro Ala Gln Glu Glu Leu Ser Arg Asn Lys Val Ser Val Thr
195 200 205
Cys Leu Ile Glu Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
210 215 220
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225 230 235 240
Gln Leu Asp Ser Asp Gly Thr Tyr Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Ser Val
245 250 255
Asp Arg Ser Arg Trp Gln Arg Gly Asn Thr Tyr Thr Cys Ser Val Ser
260 265 270
His Glu Ala Leu His Ser His His Thr Gln Lys Ser Leu Thr Gln Ser
275 280 285
Pro Gly
290
<210> 109
<211> 933
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白 DNA（Fusion Protein DNA）
<400> 109
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gtggacaaca ccgagatgca caccgccaag accaggcctc gggaggagca gttcaacagc 480
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tggcaaaggg gcaacaccta cacctgcagc gtgagccacg aggctctgca cagccaccac 900
acccagaagt ctctgaccca gagccccgga tag 933
<210> 110
<211> 291
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白（Fusion Protein）
<400> 110
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser Asp Leu Val Glu Ala Leu Ala
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Asp Pro Thr Gly Gly
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Gly Pro Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys His Ser Ile Cys Ser
35 40 45
Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly
50 55 60
Gly Gly Gly Glu Gly Pro Lys Cys Pro Val Pro Glu Ile Pro Gly Ala
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130 135 140
Val Val Ser Val Leu Pro Ile Leu His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys
145 150 155 160
Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Ser Lys Ser Leu Pro Ser Ala Met Glu
165 170 175
Arg Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro His Glu Pro Gln Val Tyr
180 185 190
Val Leu Pro Pro Thr Gln Glu Glu Leu Ser Glu Asn Lys Val Ser Val
195 200 205
Thr Cys Leu Ile Lys Gly Phe His Pro Pro Asp Ile Ala Val Glu Trp
210 215 220
Glu Ile Thr Gly Gln Pro Glu Pro Glu Asn Asn Tyr Gln Thr Thr Pro
225 230 235 240
Pro Gln Leu Asp Ser Asp Gly Thr Tyr Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Ser
245 250 255
Val Asp Arg Ser His Trp Gln Arg Gly Asn Thr Tyr Thr Cys Ser Val
260 265 270
Ser His Glu Ala Leu His Ser His His Thr Gln Lys Ser Leu Thr Gln
275 280 285
Ser Pro Gly
290
<210> 111
<211> 933
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白 DNA（Fusion Protein DNA）
<400> 111
atggaatgga gctgggtctt tctcttcttc ctgtcagtaa cgactggtgt ccactccttc 60
gtgaaccagc acctgtgcgg ctccgacctg gtggaagctc tggctctcgt gtgcggcgag 120
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tgctgccact ccatctgctc cctgtaccag ctggaaaact actgcaatgg cggaggtggt 240
tcaggaggcg gtggaggtga gggccccaag tgccccgtgc ccgagattcc cggtgccccc 300
agcgtgttca tctttccccc aaaacccaag gacaccctga gcatcagcag gacccccgag 360
gtgacctgcc tggtggtgga cctgggaccc gacgacagca acgtgcagat cacctggttc 420
gtggacaaca ccgagatgca caccgccaag accaggcctc gggaggagca gttcaacagc 480
acctacaggg tggtgagcgt gctgcccatc ctgcaccagg actggctgaa gggcaaggag 540
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acccagaagt ctctgaccca gagccccgga tag 933
<210> 112
<211> 291
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白（Fusion Protein）
<400> 112
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser Asp Leu Val Glu Ala Leu Ala
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Asp Pro Thr Gly Gly
20 25 30
Gly Pro Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys His Ser Ile Cys Ser
35 40 45
Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
50 55 60
Gly Gly Gly Glu Gly Pro Lys Cys Pro Val Pro Glu Ile Pro Gly Ala
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Thr Ala Lys Thr Arg Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg
130 135 140
Val Val Ser Val Leu Pro Ile Leu His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys
145 150 155 160
Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Ser Lys Ser Leu Pro Ser Ala Met Glu
165 170 175
Arg Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro His Glu Pro Gln Val Tyr
180 185 190
Val Leu Pro Pro Thr Gln Glu Glu Leu Ser Glu Asn Lys Val Ser Val
195 200 205
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Pro Gln Leu Asp Ser Asp Gly Thr Tyr Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Ser
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Ser Pro Gly
290
<210> 113
<211> 930
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白 DNA（Fusion Protein DNA）
<400> 113
atggaatgga gctgggtctt tctcttcttc ctgtcagtaa cgactggtgt ccactccttc 60
gtgaaccagc acctgtgcgg ctcccacctg gtggaagctc tggctctcgt gtgcggcgag 120
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<211> 289
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白（Fusion Protein）
<400> 114
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Ala
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Gly Pro Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Ala Ser Val Cys Ser
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115 120 125
Ala Lys Thr Arg Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val
130 135 140
Val Ser Val Leu Pro Ile Leu His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Glu
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Phe Lys Cys Lys Val Asn Ser Lys Ser Leu Pro Ser Ala Met Glu Arg
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Leu Pro Pro Thr Gln Glu Glu Leu Ser Glu Asn Lys Val Ser Val Thr
195 200 205
Cys Leu Ile Lys Gly Phe His Pro Pro Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
210 215 220
Ile Thr Gly Gln Pro Glu Pro Glu Asn Asn Tyr Gln Thr Thr Pro Pro
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Gln Leu Asp Ser Asp Gly Thr Tyr Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Ser Val
245 250 255
Asp Arg Ser His Trp Gln Arg Gly Asn Thr Tyr Thr Cys Ser Val Ser
260 265 270
His Glu Ala Leu His Ser His His Thr Gln Lys Ser Leu Thr Gln Ser
275 280 285
Pro
<210> 115
<211> 930
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白 DNA（Fusion Protein DNA）
<400> 115
atggaatgga gctgggtctt tctcttcttc ctgtcagtaa cgactggtgt ccactccttc 60
gtgaaccagc acctgtgcgg ctcccacctg gtggaagctc tggctctcgt gtgcggcgag 120
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tacagggtgg tgagcgtgct gcccatcctg caccaggact ggctgaaggg caaggagttc 540
aagtgcaagg tgaacagcaa gagcctgccc agcgccatgg agaggaccat cagcaaggcc 600
aagggtcagc cccacgagcc ccaagtgtac gtgcttcccc cgacccagga ggagttgagc 660
gagaacaaag tgagcgtgac ctgcctgatc aagggcttcc accctcccga catcgccgtg 720
gagtgggaga tcaccggcca gcctgagccg gaaaataact accagaccac ccctccacag 780
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caaaggggca acacctacac ctgcagcgtg agccacgagg ctctgcacag ccaccacacc 900
cagaagtctc tgacccagag ccccggatag 930
<210> 116
<211> 290
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白（Fusion Protein）
<400> 116
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Ala
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Asp Pro Ala Gly Gly
20 25 30
Gly Pro Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Ala Ser Val Cys Ser
35 40 45
Leu Tyr Gln Leu Glu His Tyr Cys Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly
50 55 60
Gly Gly Glu Gly Pro Lys Cys Pro Val Pro Glu Ile Pro Gly Ala Pro
65 70 75 80
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Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Leu Val Val Asp Leu Gly Pro Asp Asp
100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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275 280 285
Pro Gly
290
<210> 117
<211> 927
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白 DNA（Fusion Protein DNA）
<400> 117
atggaatgga gctgggtctt tctcttcttc ctgtcagtaa cgactggtgt ccactccttc 60
gtgaaccagc acctgtgcgg aagccacctg gtggaggcct tggccctggt gtgcggcgag 120
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gacagcgacg ggacctactt cttgtatagc aggctgagcg tggaccggag caggtggcag 840
aggggcaaca cctacacttg cagcgtgagc cacgaggcct tgcacagcca ccacactcag 900
aagagtctga cccagagccc gggatag 927
<210> 118
<211> 289
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白（Fusion Protein）
<400> 118
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Ala
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Asp Pro Ala Gly Gly
20 25 30
Gly Pro Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Ala Ser Val Cys Ser
35 40 45
Leu Tyr Gln Leu Glu His Tyr Cys Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly
50 55 60
Gly Asp Cys Pro Lys Cys Pro Pro Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Asp Val Gln Ile Thr Trp Phe Val Asp Asn Thr Gln Val Tyr Thr Ala
115 120 125
Lys Thr Ser Pro Arg Glu Glu Gln Phe Ser Ser Thr Tyr Arg Val Val
130 135 140
Ser Val Leu Pro Ile Leu His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Glu Phe
145 150 155 160
Lys Cys Lys Val Asn Ser Lys Ser Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr
165 170 175
Ile Ser Lys Asp Lys Gly Gln Pro His Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu
180 185 190
Pro Pro Ala Gln Glu Glu Leu Ser Arg Asn Lys Val Ser Val Thr Cys
195 200 205
Leu Ile Glu Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ile
210 215 220
Thr Gly Gln Pro Glu Pro Glu Asn Asn Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln
225 230 235 240
Leu Asp Ser Asp Gly Thr Tyr Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Ser Val Asp
245 250 255
Arg Ser Arg Trp Gln Arg Gly Asn Thr Tyr Thr Cys Ser Val Ser His
260 265 270
Glu Ala Leu His Ser His His Thr Gln Lys Ser Leu Thr Gln Ser Pro
275 280 285
Gly
<210> 119
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> Ins 多肽 DNA（Ins Polypeptide DNA）
<400> 119
ttcgtgaacc agcacctgtg cggaagccac ctggtggagg ccttggccct ggtgtgcggc 60
gagaggggct tcttctacac cgaccccgct ggtggcggac ctaggagggg catcgtggag 120
cagtgctgcg ccagcgtgtg cagcctgtac cagttggaac actactgc 168
<210> 120
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> Ins 多肽（Ins Polypeptide）
<400> 120
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Ala
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Asp Pro Ala Gly Gly
20 25 30
Gly Pro Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Ala Ser Val Cys Ser
35 40 45
Leu Tyr Gln Leu Glu His Tyr Cys
50 55
<210> 121
<211> 969
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白 DNA（Fusion Protein DNA）
<400> 121
atggaatgga gctgggtctt tctcttcttc ctgtcagtaa cgactggtgt ccactccttc 60
gtgaaccagc acctgtgcgg ctcccacctg gtggaagctc tggaactcgt gtgcggcgag 120
cggggcttcc actacggggg tggcggagga ggttctggtg gcggcggagg catcgtggaa 180
cagtgctgca cctccacctg ctccctggac cagctggaaa actactgcgg tggcggaggt 240
ggtcaaggag gcggtggaca gggtggaggt gggcagggag gaggcggggg aggtgagggc 300
cccaagtgcc ccgtgcccga gattcccggt gcccccagcg tgttcatctt tcccccaaaa 360
cccaaggaca ccctgagcat cagcaggacc cccgaggtga cctgcctggt ggtggacctg 420
ggacccgacg acagcaacgt gcagatcacc tggttcgtgg acaacaccga gatgcacacc 480
gccaagacca ggcctcggga ggagcagttc aacagcacct acagggtggt gagcgtgctg 540
cccatcctgc accaggactg gctgaagggc aaggagttca agtgcaaggt gaacagcaag 600
agcctgccca gcgccatgga gaggaccatc agcaaggcca agggtcagcc ccacgagccc 660
caagtgtacg tgcttccccc gacccaggag gagttgagcg agaacaaagt gagcgtgacc 720
tgcctgatca agggcttcca ccctcccgac atcgccgtgg agtgggagat caccggccag 780
cctgagccgg aaaataacta ccagaccacc cctccacagc tggacagcga cggcacctac 840
ttcctttaca gcaggctgtc tgtggaccga agccattggc aaaggggcaa cacctacacc 900
tgcagcgtga gccacgaggc tctgcacagc caccacaccc agaagtctct gacccagagc 960
cccggatag 969
<210> 122
<211> 303
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白（Fusion Protein）
<400> 122
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Glu
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Thr Cys
35 40 45
Ser Leu Asp Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gln Gly
50 55 60
Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gly Gly Glu
65 70 75 80
Gly Pro Lys Cys Pro Val Pro Glu Ile Pro Gly Ala Pro Ser Val Phe
85 90 95
Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Ser Ile Ser Arg Thr Pro
100 105 110
Glu Val Thr Cys Leu Val Val Asp Leu Gly Pro Asp Asp Ser Asn Val
115 120 125
Gln Ile Thr Trp Phe Val Asp Asn Thr Glu Met His Thr Ala Lys Thr
130 135 140
Arg Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
145 150 155 160
Leu Pro Ile Leu His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Glu Phe Lys Cys
165 170 175
Lys Val Asn Ser Lys Ser Leu Pro Ser Ala Met Glu Arg Thr Ile Ser
180 185 190
Lys Ala Lys Gly Gln Pro His Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro
195 200 205
Thr Gln Glu Glu Leu Ser Glu Asn Lys Val Ser Val Thr Cys Leu Ile
210 215 220
Lys Gly Phe His Pro Pro Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ile Thr Gly
225 230 235 240
Gln Pro Glu Pro Glu Asn Asn Tyr Gln Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp
245 250 255
Ser Asp Gly Thr Tyr Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Ser Val Asp Arg Ser
260 265 270
His Trp Gln Arg Gly Asn Thr Tyr Thr Cys Ser Val Ser His Glu Ala
275 280 285
Leu His Ser His His Thr Gln Lys Ser Leu Thr Gln Ser Pro Gly
290 295 300
<210> 123
<211> 966
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白 DNA（Fusion Protein DNA）
<400> 123
atggaatgga gctgggtctt tctcttcttc ctgtcagtaa cgactggtgt ccactccttc 60
gtgaaccagc acctgtgcgg ctcccacctg gtggaagctc tggaactcgt gtgcggcgag 120
cggggcttcc actacggggg tggcggagga ggttctggtg gcggcggagg catcgtggaa 180
cagtgctgca cctccacctg ctccctggac cagctggaaa actactgcgg tggcggaggt 240
ggtcaaggag gcggtggaca gggtggaggt gggcagggag gaggcggggg agactgcccc 300
aaatgtcctc cgcctgagat gctgggtggc cctagcatct tcatcttccc gcccaagccc 360
aaggatactc tgtccattag caggaccccc gaggtgacct gcctggtggt ggacctgggg 420
ccagacgact ctgacgtgca gatcacctgg ttcgtagaca acacccaggt ttacactgcc 480
aagaccagtc ccagggagga gcagttcagc agcacataca gggtggtgag cgttctgccc 540
atcctgcacc aggactggct gaaaggcaaa gagttcaagt gtaaggtgaa cagcaagagc 600
ctgcccagcc ccattgaaag gaccatcagc aaggacaagg gccagccgca cgagccccaa 660
gtctacgtgc tgcccccagc acaggaagag ctgagcagga acaaggttag cgtgacatgc 720
ctgatcgagg gtttctaccc cagcgacatc gccgtggagt gggaaatcac cggccaaccc 780
gagcccgaga acaactacag gaccactccg ccgcaactgg acagcgacgg gacctacttc 840
ttgtatagca ggctgagcgt ggaccggagc aggtggcaga ggggcaacac ctacacttgc 900
agcgtgagcc acgaggcctt gcacagccac cacactcaga agagtctgac ccagagcccg 960
ggatag 966
<210> 124
<211> 302
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 融合蛋白（Fusion Protein）
<400> 124
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Glu
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Thr Cys
35 40 45
Ser Leu Asp Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gln Gly
50 55 60
Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gly Asp Cys
65 70 75 80
Pro Lys Cys Pro Pro Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Ile Phe Ile
85 90 95
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Ser Ile Ser Arg Thr Pro Glu
100 105 110
Val Thr Cys Leu Val Val Asp Leu Gly Pro Asp Asp Ser Asp Val Gln
115 120 125
Ile Thr Trp Phe Val Asp Asn Thr Gln Val Tyr Thr Ala Lys Thr Ser
130 135 140
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Ser Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
145 150 155 160
Pro Ile Leu His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys
165 170 175
Val Asn Ser Lys Ser Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys
180 185 190
Asp Lys Gly Gln Pro His Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Ala
195 200 205
Gln Glu Glu Leu Ser Arg Asn Lys Val Ser Val Thr Cys Leu Ile Glu
210 215 220
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ile Thr Gly Gln
225 230 235 240
Pro Glu Pro Glu Asn Asn Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Ser
245 250 255
Asp Gly Thr Tyr Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Ser Val Asp Arg Ser Arg
260 265 270
Trp Gln Arg Gly Asn Thr Tyr Thr Cys Ser Val Ser His Glu Ala Leu
275 280 285
His Ser His His Thr Gln Lys Ser Leu Thr Gln Ser Pro Gly
290 295 300
<210> 125
<211> 57
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> Ins 多肽（Ins Polypeptide）
<400> 125
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Ala
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Asp Pro Thr Gly Gly
20 25 30
Gly Pro Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser
35 40 45
Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
50 55

Claims (47)

1.一种包含胰岛素多肽和Fc片段的融合蛋白，其中所述胰岛素多肽和所述Fc片段通过接头诸如肽接头连接，其中所述Fc片段为非人动物来源，并且包含以下序列：
DCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFNGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG(SEQ ID NO:16)。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述胰岛素多肽包含以下序列：
FVNQHLCGSX1LVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCX2STCSLDQLENYCX3(SEQ ID NO:6)，
其中X1不是D，X2不是H，并且X3不存在或者是N。
3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述胰岛素多肽包含以下序列：
FVNQHLCGSX1LVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCX2STCSLDQLENYCX3(SEQ ID NO:6)，
其中X1是H，X2是T，并且X3不存在或者是N。
4.根据权利要求1至3所述的融合蛋白，其中所述胰岛素多肽和所述Fc片段通过接头诸如肽接头连接，所述接头包含以下序列：
GGGGGQGGGGQGGGGQGGGGG(SEQ ID NO:14)。
5.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含以下序列：
FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLDQLENYCGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFNGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG(SEQ ID NO:32)。
6.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含以下序列：
FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLDQLENYCNGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFNGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG(SEQ ID NO:34)。
7.一种融合蛋白，包含胰岛素多肽和Fc片段，其中所述胰岛素多肽和所述Fc片段通过接头诸如肽接头连接，其中所述Fc片段包含以下序列：
DCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFSGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG(SEQ ID NO:22)。
8.根据权利要求7所述的融合蛋白，其中所述胰岛素多肽包含以下序列：
FVNQHLCGSX1LVEALALVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCX2STCSLDQLENYC(SEQ ID NO:10)，
其中X1不是D，并且X2不是H。
9.根据权利要求7所述的融合蛋白，其中所述胰岛素多肽包含以下序列：
FVNQHLCGSX1LVEALALVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCX2STCSLDQLENYC(SEQ ID NO:10)，
其中X1是H，并且X2是T。
10.根据权利要求7至9所述的融合蛋白，其中所述胰岛素多肽和所述Fc片段通过接头诸如肽接头连接，所述接头包含以下序列：
GGGGGQGGGGQGGGGQGGGGG(SEQ ID NO:14)。
11.根据权利要求7所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含以下序列：
FVNQHLCGSHLVEALALVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLDQLENYCGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFSGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG(SEQ ID NO:36)。
12.一种包含胰岛素多肽和Fc片段的融合蛋白，其中所述胰岛素多肽和所述Fc片段通过接头诸如肽接头连接，其中所述Fc片段为非人动物来源，并且包含以下序列：
DCPKCPPPEMLGGPSIFIFPPKPKDTLSISRTPEVTCLVVDLGPDDSDVQITWFVDNTQVYTAKTSPREEQFNSTYRVVSVLPILHQDWLKGKEFKCKVNSKSLPSPIERTISKDKGQPHEPQVYVLPPAQEELSRNKVSVTCLIEGFYPSDIAVEWEITGQPEPENNYRTTPPQLDSDGTYFLYSRLSVDRSRWQRGNTYTCSVSHEALHSHHTQKSLTQSPG(SEQ ID NO:20)。
13.根据权利要求12所述的融合蛋白，其中所述胰岛素多肽包含以下序列：
FVNQHLCGSX1LVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCX2STCSLDQLENYCX3(SEQ ID NO:6)，
其中X1不是D，X2不是H，并且X3不存在。
14.根据权利要求12所述的融合蛋白，其中所述胰岛素多肽包含以下序列：
FVNQHLCGSX1LVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCX2STCSLDQLENYCX3(SEQ ID NO:6)，
其中X1是H，X2是T，并且X3不存在。
15.根据权利要求12至14所述的融合蛋白，其中所述胰岛素多肽和所述Fc片段通过接头诸如肽接头连接，所述接头包含以下序列：
GGGGGQGGGGQGGGGQGGGGG(SEQ ID NO:14)。
16.根据权利要求12所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含以下序列：
FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLDQLENYCGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGDCPKCPPPEMLGGPSIFIFPPKPKDTLSISRTPEVTCLVVDLGPDDSDVQITWFVDNTQVYTAKTSPREEQFNSTYRVVSVLPILHQDWLKGKEFKCKVNSKSLPSPIERTISKDKGQPHEPQVYVLPPAQEELSRNKVSVTCLIEGFYPSDIAVEWEITGQPEPENNYRTTPPQLDSDGTYFLYSRLSVDRSRWQRGNTYTCSVSHEALHSHHTQKSLTQSPG(SEQ ID NO:38)。
17.一种包含胰岛素多肽和Fc片段的融合蛋白，所述胰岛素多肽和所述Fc片段通过接头诸如肽接头连接，其中所述Fc片段包含以下序列：
DCPKCPPPEMLGGPSIFIFPPKPKDTLSISRTPEVTCLVVDLGPDDSDVQITWFVDNTQVYTAKTSPREEQFSSTYRVVSVLPILHQDWLKGKEFKCKVNSKSLPSPIERTISKDKGQPHEPQVYVLPPAQEELSRNKVSVTCLIEGFYPSDIAVEWEITGQPEPENNYRTTPPQLDSDGTYFLYSRLSVDRSRWQRGNTYTCSVSHEALHSHHTQKSLTQSPG(SEQ ID NO:23)。
18.根据权利要求17所述的融合蛋白，其中所述胰岛素多肽包含以下序列：
FVNQHLCGSX1LVEALALVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCX2STCSLDQLENYC(SEQ ID NO:10)，
其中X1不是D，并且X2不是H。
19.根据权利要求17所述的融合蛋白，其中所述胰岛素多肽包含以下序列：
FVNQHLCGSX1LVEALALVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCX2STCSLDQLENYC(SEQ ID NO:10)，
其中X1是H，并且X2是T。
20.根据权利要求17至19所述的融合蛋白，其中所述胰岛素多肽和所述Fc片段通过接头诸如肽接头连接，所述接头包含以下序列：
GGGGGQGGGGQGGGGQGGGGG(SEQ ID NO:14)。
21.根据权利要求17所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含以下序列：
FVNQHLCGSHLVEALALVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLDQLENYCGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGDCPKCPPPEMLGGPSIFIFPPKPKDTLSISRTPEVTCLVVDLGPDDSDVQITWFVDNTQVYTAKTSPREEQFSSTYRVVSVLPILHQDWLKGKEFKCKVNSKSLPSPIERTISKDKGQPHEPQVYVLPPAQEELSRNKVSVTCLIEGFYPSDIAVEWEITGQPEPENNYRTTPPQLDSDGTYFLYSRLSVDRSRWQRGNTYTCSVSHEALHSHHTQKSLTQSPG(SEQ ID NO:40)。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白是同型二聚体。
23.根据权利要求22所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白的同型二聚体百分比大于90％。
24.根据权利要求1至21中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白使用HEK293细胞制备，并且在使用蛋白A珠或蛋白A柱纯化后所得到的同型二聚体滴度大于50mg/L。
25.根据权利要求1至21中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白的胰岛素受体IC50小于或等于5000nM。
26.根据权利要求1至21中任一项所述的融合蛋白，其中在施用时，所述融合蛋白在目标动物的血液或血清中的血清半衰期长于约3天。
27.根据权利要求1至21中任一项所述的融合蛋白，其中在受试者中血糖水平相对于给药前水平具有统计学显著降低的时间长于2小时、6小时、9小时、12小时、18小时、1天、1.5天、2天、2.5天、3天、4天、5天、6天、7天或更长时间中的一个。
28.根据权利要求1至21中任一项所述的融合蛋白，其中在目标动物中第一次皮下注射后的NAOC大于150％FBGL·天·kg/mg。
29.根据权利要求28所述的融合蛋白，其中在所述目标动物中第三次每周皮下注射所述融合蛋白后的NAOC与在所述目标动物中第一次皮下注射所述融合蛋白后的NAOC的比率大于0.50。
30.根据权利要求1至21中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白被配制成药物组合物。
31.根据权利要求30所述的药物组合物，其中所述融合蛋白以约3mg/mL或更高的浓度存在于所述药物组合物中。
32.根据权利要求31所述的药物组合物，其中所述组合物适合于皮下施用。
33.一种用于降低目标动物的血糖水平的方法，所述方法包含向所述患者施用生理有效量的权利要求1至21中任一项所述的融合蛋白或其药物组合物。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述目标动物被诊断患有糖尿病。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述目标动物是狗或猫。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述融合蛋白被皮下施用。
37.根据权利要求36所述的方法，其中每天、每周两次或每周一次向所述目标动物施用所述融合蛋白。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述融合蛋白以0.025至0.5mg/kg/周的剂量每周一次施用于所述目标动物。
39.一种经工程改造以表达权利要求1至21中任一项所述的融合蛋白的细胞。
40.根据权利要求39所述的细胞，其中所述细胞用编码所述融合蛋白的核酸转染。
41.根据权利要求40所述的细胞，其中所述细胞是HEK293细胞或CHO细胞。
42.一种编码权利要求1至21中任一项所述的融合蛋白的cDNA。
43.根据权利要求42所述的cDNA，其中所述cDNA包含以下核酸序列：
atggaatggagctgggtctttctcttcttcctgtcagtaacgactggtgtccactccttcgtgaaccagcacctgtgcggctcccacctggtggaagctctggaactcgtgtgcggcgagcggggcttccactacgggggtggcggaggaggttctggtggcggcggaggcatcgtggaacagtgctgcacctccacctgctccctggaccagctggaaaactactgcggtggcggaggtggtcaaggaggcggtggacagggtggaggtgggcagggaggaggcgggggagactgccccaagtgccccgctcccgagatgctgggcggacccagcgtgttcatcttccctcccaagcccaaggacacactgctgatcgccaggaccccggaggtgacctgcgtggtggtggacctggatcccgaagaccccgaggtgcagatcagctggttcgtggatggaaagcagatgcagaccgccaagacccaaccccgggaagagcagttcaacggcacctacagggtggtgagtgtgttgcccatcggccaccaggactggctgaaggggaagcaattcacatgcaaggttaataacaaggccctgcccagccccatcgagaggaccatcagcaaggccaggggccaggcccaccagccatctgtgtacgtgctgcccccatctagggaggaactgagcaagaacacagtcagccttacttgcctgatcaaggacttcttcccaccggacatagacgtggagtggcagagtaacggccagcaggagcccgagagcaagtataggaccacaccgccccaactggacgaggacggaagctacttcctctacagcaaattgagcgttgacaaaagcaggtggcagcgaggcgacaccttcatctgcgccgtgatgcacgaggctttgcataaccactacacccaggagagcctgtcccacagccccggatag(SEQ ID NO:31)。
44.根据权利要求42所述的cDNA，其中所述cDNA包含以下核酸序列：
atggaatggagctgggtctttctcttcttcctgtcagtaacgactggtgtccactccttcgtgaaccagcacctgtgcggctcccacctggtggaagctctggaactcgtgtgcggcgagcggggcttccactacgggggtggcggaggaggttctggtggcggcggaggcatcgtggaacagtgctgcacctccacctgctccctggaccagctggaaaactactgcaacggtggcggaggtggtcaaggaggcggtggacagggtggaggtgggcagggaggaggcgggggagactgccccaagtgccccgctcccgagatgctgggcggacccagcgtgttcatcttccctcccaagcccaaggacacactgctgatcgccaggaccccggaggtgacctgcgtggtggtggacctggatcccgaagaccccgaggtgcagatcagctggttcgtggatggaaagcagatgcagaccgccaagacccaaccccgggaagagcagttcaacggcacctacagggtggtgagtgtgttgcccatcggccaccaggactggctgaaggggaagcaattcacatgcaaggttaataacaaggccctgcccagccccatcgagaggaccatcagcaaggccaggggccaggcccaccagccatctgtgtacgtgctgcccccatctagggaggaactgagcaagaacacagtcagccttacttgcctgatcaaggacttcttcccaccggacatagacgtggagtggcagagtaacggccagcaggagcccgagagcaagtataggaccacaccgccccaactggacgaggacggaagctacttcctctacagcaaattgagcgttgacaaaagcaggtggcagcgaggcgacaccttcatctgcgccgtgatgcacgaggctttgcataaccactacacccaggagagcctgtcccacagccccggatag(SEQ ID NO:33)。
45.根据权利要求42所述的cDNA，其中所述cDNA包含以下核酸序列：
atggaatggagctgggtctttctcttcttcctgtcagtaacgactggtgtccactccttcgtgaaccagcacctgtgcggctcccacctggtggaagctctggcactcgtgtgcggcgagcggggcttccactacgggggtggcggaggaggttctggtggcggcggaggcatcgtggaacagtgctgcacctccacctgctccctggaccagctggaaaactactgcggtggcggaggtggtcaaggaggcggtggacagggtggaggtgggcagggaggaggcgggggagactgccccaagtgccccgctcccgagatgctgggcggacccagcgtgttcatcttccctcccaagcccaaggacacactgctgatcgccaggaccccggaggtgacctgcgtggtggtggacctggatcccgaagaccccgaggtgcagatcagctggttcgtggatggaaagcagatgcagaccgccaagacccaaccccgggaagagcagttctcaggcacctacagggtggtgagtgtgttgcccatcggccaccaggactggctgaaggggaagcaattcacatgcaaggttaataacaaggccctgcccagccccatcgagaggaccatcagcaaggccaggggccaggcccaccagccatctgtgtacgtgctgcccccatctagggaggaactgagcaagaacacagtcagccttacttgcctgatcaaggacttcttcccaccggacatagacgtggagtggcagagtaacggccagcaggagcccgagagcaagtataggaccacaccgccccaactggacgaggacggaagctacttcctctacagcaaattgagcgttgacaaaagcaggtggcagcgaggcgacaccttcatctgcgccgtgatgcacgaggctttgcataaccactacacccaggagagcctgtcccacagccccggatag(SEQ ID NO:35)。
46.根据权利要求42所述的cDNA，其中所述cDNA包含以下核酸序列：
atggaatggagctgggtctttctcttcttcctgtcagtaacgactggtgtccactccttcgtgaaccagcacctgtgcggctcccacctggtggaagctctggaactcgtgtgcggcgagcggggcttccactacgggggtggcggaggaggttctggtggcggcggaggcatcgtggaacagtgctgcacctccacctgctccctggaccagctggaaaactactgcggtggcggaggtggtcaaggaggcggtggacagggtggaggtgggcagggaggaggcgggggagactgccccaaatgtcctccgcctgagatgctgggtggccctagcatcttcatcttcccgcccaagcccaaggatactctgtccattagcaggacccccgaggtgacctgcctggtggtggacctggggccagacgactctgacgtgcagatcacctggttcgtagacaacacccaggtttacactgccaagaccagtcccagggaggagcagttcaacagcacatacagggtggtgagcgttctgcccatcctgcaccaggactggctgaaaggcaaagagttcaagtgtaaggtgaacagcaagagcctgcccagccccattgaaaggaccatcagcaaggacaagggccagccgcacgagccccaagtctacgtgctgcccccagcacaggaagagctgagcaggaacaaggttagcgtgacatgcctgatcgagggtttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggaaatcaccggccaacccgagcccgagaacaactacaggaccactccgccgcaactggacagcgacgggacctacttcttgtatagcaggctgagcgtggaccggagcaggtggcagaggggcaacacctacacttgcagcgtgagccacgaggccttgcacagccaccacactcagaagagtctgacccagagcccgggatag(SEQ ID NO:37)。
47.根据权利要求42所述的cDNA，其中所述cDNA包含以下核酸序列：
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