JP2021530210A - 超長期作用性インスリン−ｆｃ融合タンパク質および使用方法 - Google Patents

超長期作用性インスリン−ｆｃ融合タンパク質および使用方法 Download PDF

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Abstract

本開示は、イヌ科動物およびネコ科動物糖尿病の治療において使用するための組換えにより生産される超長期作用性インスリン−Ｆｃ融合タンパク質を提供する。インスリン−Ｆｃ融合タンパク質は、ペプチドリンカーを介してイヌ科動物又はネコ科動物起源のＦｃ断片に連結されたインスリンポリペプチドを含む。得られた結果に基づけば、低コストの生産に適用可能であり、十分なインビボでの生物活性を呈し、生物活性の延長された継続期間を表し示し、抗薬物抗体を誘導せず、かつ複数の投与にわたり効力を実質的に保持する治療を作製することは、これらの成分の１つ又はより多くにおける選択的な突然変異に加えて、インスリンポリペプチド、ペプチドリンカー、及び種特異的Ｆｃ断片の自明でない組合せを要求する。例示的な超長期作用性インスリン−Ｆｃ融合タンパク質、これらのインスリン−Ｆｃ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び例示的なインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の薬学的製剤が、使用及び調製の方法に加えて、提供される。【選択図】図１

Description

優先権および関連出願
本出願は、２０１９年４月２２日に出願された米国仮特許出願第６２／８３７，１８８号、２０１９年４月１日に出願された米国仮特許出願第６２／８２７，８０９号、２０１９年３月２６日に出願された米国仮特許出願第６２／８２４，１７６号、２０１８年１２月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／７８１，３７８号、２０１８年１２月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／７８１，３６８号、２０１８年１２月３日に出願された米国仮特許出願第６２／７７４，６８２号、２０１８年１０月９日に出願された米国仮特許出願第６２／７４３，３５８号、２０１８年１０月３日に出願された米国仮特許出願第６２／７４０，７３５号、２０１８年８月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／７１９，３４７号、２０１８年７月２３日に出願された米国仮特許出願第６２／７０２，１６７号、２０１８年７月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／６９８，６４８号、２０１８年７月１１日に出願された米国仮特許出願第６２／６９６，６４５号、２０１８年７月３日に出願された米国仮特許出願第６２／６９３，８１４号、２０１８年６月２９日に出願された米国仮特許出願第６２／６９２，５０７号、および２０１８年６月２９日に出願された米国仮特許出願第６２／６９２，４９８号に関し、これらの優先権の利益を主張する。上述の各特許出願の内容は参照により全体が本明細書に組み込まれる。
本技術は、インスリン−Ｆｃ融合タンパク質の組成物および伴侶動物、例えば、イヌまたはネコにおいて糖尿病を治療するためのその使用に関する。
本技術の背景の以下の記載は、単純に本技術の理解の補助として提供され、本技術に対する先行技術を記載または構成することを認めるものではない。
糖尿病は、インスリン欠乏および／またはインスリンの有効でない使用により特徴付けられる慢性状態である。インスリンの絶対的な欠乏を有する糖尿病患者は、１型またはインスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）を有すると分類される。１型糖尿病患者は、膵臓のインスリン産生性β細胞の免疫学的破壊と組み合わさった遺伝的素因を有すると考えられる。これと比較して、依然としてある程度のインスリンを産生できるがインスリン抵抗性または他の機能障害に起因して相対的な欠乏を有する糖尿病患者は、２型または非インスリン依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）を有すると分類される。２型糖尿病は、遺伝的素因、肥満症、およびある特定の医薬に連鎖している。
イヌまたはネコがインスリンを産生せず、またはそれを通常通りに使用できない場合、血糖レベルが上昇して高血糖症が結果としてもたらされる。イヌは、一般に、ヒト１型糖尿病に強い類似性を有する非定型的な糖血症表現型を呈する。イヌはまた、ヒトにおける２型糖尿病に強い類似性を有する非定型的な糖血症を時折呈する。雌イヌはまた、熱中または妊娠中に一時的なインスリン抵抗性を発症することがある。全ての場合に、イヌは、慢性のインスリン注射療法を用いて治療される。ネコは、一般に、ヒト２型糖尿病（すなわち、インスリン抵抗性）に強い類似性を有する非定型的な糖血症表現型を呈するが、疾患が獣医により診断される時点までに、それは進行して１型糖尿病状態（ベータ細胞質量の顕著な損失を伴う膵臓における炎症性疾患）に似たものとなり、ネコは外因性インスリンに依存する。一部の糖尿病ネコは食餌変化および経口医薬を用いて管理することができるが、糖尿病ネコの大部分は、十分な調節を維持するために慢性のインスリン注射療法を与えられる。治療しないままの場合、イヌおよびネコにおける糖尿病は、体重損失、食欲不振、嘔吐、脱水、運動機能の問題、昏睡、そして死にさえ繋がることがある。
米国におけるイヌの約０．２４％およびネコの約０．６８％は糖尿病に罹患している。イヌおよびネコのための現行の糖尿病療法としては、１日１回または２回投与されるイヌ用のＶｅｔｓｕｌｉｎ（登録商標）（Ｉｎｔｅｒｖｅｔ Ｉｎｃ．， ｄ．ｂ．ａ． ＭＥＲＣＫ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ、Ｓｕｍｍｉｔ、ＮＪ）およびネコ用のＰｒｏＺｉｎｃ（登録商標）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ Ｖｅｔｍｅｄｉｃａ、Ｄｕｌｕｔｈ、Ｇｅｏｒｇｉａ）などのインスリンの使用が挙げられる。頻繁な注射の所有者に対する負担は、多くの場合に、治療レジメンの順守の欠如および過少量投薬を結果としてもたらして、不良な長期健康アウトカムに繋がる。実際に、インスリン療法のコストおよび週当たり１４時間まで愛玩動物に投薬を行う実際性は、顕著なパーセンテージの所有者が糖尿病の集中的な管理への代替として愛玩動物のために安楽死を選択することに繋がる。したがって、この疾患に対するコスト効果の高いかつより低い負担の治療オプションの必要性が存在する。
本技術の要約
一態様では、本開示は、インスリンポリペプチドおよびＦｃ断片を含む融合タンパク質であって、インスリンポリペプチドおよびＦｃ断片がペプチドリンカーなどのリンカーにより接続されており、Ｆｃ断片が非ヒト動物起源であり、かつ以下の配列：ＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＮＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号１６）を含む、融合タンパク質を提供する。一部の実施形態では、融合タンパク質のインスリンポリペプチドは、配列ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＸ１ＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＸ２ＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＸ３（配列番号６）（Ｘ１はＤではなく、Ｘ２はＨではなく、かつＸ３は存在しないまたはＮである）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質のインスリンポリペプチドは、配列ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＸ１ＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＸ２ＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＸ３（配列番号６）（Ｘ１はＨであり、Ｘ２はＴであり、かつＸ３は存在しないまたはＮである）を含む。実施形態では、融合タンパク質のインスリンポリペプチドおよびＦｃ断片は、配列ＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧ（配列番号１４）を含むペプチドリンカーなどのリンカーにより接続されている。
実施形態では、融合タンパク質は、配列ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＮＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号３２）を含む。実施形態では、融合タンパク質は、配列ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＮＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＮＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号３４）を含む。
一態様では、本開示は、インスリンポリペプチドおよびＦｃ断片を含む融合タンパク質であって、インスリンポリペプチドおよびＦｃ断片がペプチドリンカーなどのリンカーにより接続されており、Ｆｃ断片が、配列ＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＳＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号２２）を含む、融合タンパク質を提供する。一部の実施形態では、融合タンパク質のインスリンポリペプチドは配列ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＸ１ＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＸ２ＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣ（配列番号１０）（Ｘ１はＤではなく、かつＸ２はＨではない）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質のインスリンポリペプチドは、配列ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＸ１ＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＸ２ＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣ（配列番号１０）（Ｘ１はＨであり、かつＸ２はＴである）を含む。実施形態では、インスリンポリペプチドおよびＦｃ断片は、配列ＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧ（配列番号１４）を含むペプチドリンカーなどのリンカーにより接続されている。
実施形態では、融合タンパク質は、配列ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＳＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号３６）を含む。
一態様では、本開示は、インスリンポリペプチドおよびＦｃ断片を含む融合タンパク質であって、インスリンポリペプチドおよびＦｃ断片がペプチドリンカーなどのリンカーにより接続されており、Ｆｃ断片が非ヒト動物起源であり、かつ配列ＤＣＰＫＣＰＰＰＥＭＬＧＧＰＳＩＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＳＩＳＲＴＰＥＶＴＣＬＶＶＤＬＧＰＤＤＳＤＶＱＩＴＷＦＶＤＮＴＱＶＹＴＡＫＴＳＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＬＨＱＤＷＬＫＧＫＥＦＫＣＫＶＮＳＫＳＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＤＫＧＱＰＨＥＰＱＶＹＶＬＰＰＡＱＥＥＬＳＲＮＫＶＳＶＴＣＬＩＥＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＩＴＧＱＰＥＰＥＮＮＹＲＴＴＰＰＱＬＤＳＤＧＴＹＦＬＹＳＲＬＳＶＤＲＳＲＷＱＲＧＮＴＹＴＣＳＶＳＨＥＡＬＨＳＨＨＴＱＫＳＬＴＱＳＰＧ（配列番号２０）を含む、融合タンパク質を提供する。実施形態では、融合タンパク質のインスリンポリペプチドは、配列ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＸ１ＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＸ２ＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＸ３（配列番号６）（Ｘ１はＤではなく、Ｘ２はＨではなく、かつＸ３は存在しない）を含む。実施形態では、融合タンパク質のインスリンポリペプチドは、配列ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＸ１ＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＸ２ＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＸ３（配列番号６）（Ｘ１はＨであり、Ｘ２はＴであり、かつＸ３は存在しない）を含む。実施形態では、インスリンポリペプチドおよびＦｃ断片は、以下の配列ＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧ（配列番号１４）を含むペプチドリンカーなどのリンカーにより接続されている。
実施形態では、融合タンパク質は、配列ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＰＰＥＭＬＧＧＰＳＩＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＳＩＳＲＴＰＥＶＴＣＬＶＶＤＬＧＰＤＤＳＤＶＱＩＴＷＦＶＤＮＴＱＶＹＴＡＫＴＳＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＬＨＱＤＷＬＫＧＫＥＦＫＣＫＶＮＳＫＳＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＤＫＧＱＰＨＥＰＱＶＹＶＬＰＰＡＱＥＥＬＳＲＮＫＶＳＶＴＣＬＩＥＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＩＴＧＱＰＥＰＥＮＮＹＲＴＴＰＰＱＬＤＳＤＧＴＹＦＬＹＳＲＬＳＶＤＲＳＲＷＱＲＧＮＴＹＴＣＳＶＳＨＥＡＬＨＳＨＨＴＱＫＳＬＴＱＳＰＧ（配列番号３８）を含む。
一態様では、本開示は、インスリンポリペプチドおよびＦｃ断片を含む融合タンパク質であって、インスリンポリペプチドおよびＦｃ断片がペプチドリンカーなどのリンカーにより接続されており、Ｆｃ断片が、配列ＤＣＰＫＣＰＰＰＥＭＬＧＧＰＳＩＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＳＩＳＲＴＰＥＶＴＣＬＶＶＤＬＧＰＤＤＳＤＶＱＩＴＷＦＶＤＮＴＱＶＹＴＡＫＴＳＰＲＥＥＱＦＳＳＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＬＨＱＤＷＬＫＧＫＥＦＫＣＫＶＮＳＫＳＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＤＫＧＱＰＨＥＰＱＶＹＶＬＰＰＡＱＥＥＬＳＲＮＫＶＳＶＴＣＬＩＥＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＩＴＧＱＰＥＰＥＮＮＹＲＴＴＰＰＱＬＤＳＤＧＴＹＦＬＹＳＲＬＳＶＤＲＳＲＷＱＲＧＮＴＹＴＣＳＶＳＨＥＡＬＨＳＨＨＴＱＫＳＬＴＱＳＰＧ（配列番号２３）を含む、融合タンパク質を提供する。実施形態では、融合タンパク質のインスリンポリペプチドは、配列ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＸ１ＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＸ２ＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣ（配列番号１０）（Ｘ１はＤではなく、かつＸ２はＨではない）を含む。実施形態では、インスリンポリペプチドは、以下の配列ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＸ１ＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＸ２ＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣ（配列番号１０）（Ｘ１はＨであり、かつＸ２はＴである）を含む。実施形態では、インスリンポリペプチドおよびＦｃ断片は、配列ＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧ（配列番号１４）を含むペプチドリンカーなどのリンカーにより接続されている。
実施形態では、融合タンパク質は、配列ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＰＰＥＭＬＧＧＰＳＩＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＳＩＳＲＴＰＥＶＴＣＬＶＶＤＬＧＰＤＤＳＤＶＱＩＴＷＦＶＤＮＴＱＶＹＴＡＫＴＳＰＲＥＥＱＦＳＳＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＬＨＱＤＷＬＫＧＫＥＦＫＣＫＶＮＳＫＳＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＤＫＧＱＰＨＥＰＱＶＹＶＬＰＰＡＱＥＥＬＳＲＮＫＶＳＶＴＣＬＩＥＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＩＴＧＱＰＥＰＥＮＮＹＲＴＴＰＰＱＬＤＳＤＧＴＹＦＬＹＳＲＬＳＶＤＲＳＲＷＱＲＧＮＴＹＴＣＳＶＳＨＥＡＬＨＳＨＨＴＱＫＳＬＴＱＳＰＧ（配列番号４０）を含む。
態様では、本明細書に記載の融合タンパク質はホモ二量体を含む。実施形態では、融合タンパク質のホモ二量体のパーセンテージは９０％より高い。実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質はＨＥＫ２９３細胞を使用して作られ、かつプロテインＡビーズまたはプロテインＡカラムを使用する精製後の結果としてもたられるホモ二量体タイターは５０ｍｇ／Ｌより高い。実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質のインスリン受容体ＩＣ５０は５０００ｎＭより低いまたはそれに等しい。実施形態では、投与された場合の標的動物の血液または血清中での本明細書に記載の融合タンパク質の血清半減期は約３日より長い。実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質について、投薬前レベルと比べて対象において血中グルコースレベルの統計的に有意な減少がある時間は、２時間、６時間、９時間、１２時間、１８時間、１日、１．５日、２日、２．５日、３日、４日、５日、６日、７日、またはより長くのうちの１つより長い。
態様では、本明細書に記載の融合タンパク質について、標的動物における１回目の皮下注射後のＮＡＯＣは１５０ＦＢＧＬ％・日・ｋｇ／ｍｇより高い。実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質について、標的動物における融合タンパク質の１回目の皮下注射後のＮＡＯＣに対する標的動物における融合タンパク質の３回目の週毎の皮下注射後のＮＡＯＣの比は０．５０より高い。
態様では、本明細書に記載されるような融合タンパク質は医薬組成物として製剤化されている。実施形態では、医薬組成物中で融合タンパク質は約３ｍｇ／ｍＬまたはより高い濃度において存在する。実施形態では、組成物は皮下投与のために好適なものである。
一態様では、標的動物の血中グルコースレベルを低下させる方法であって、生理学的有効量の本明細書に記載されるような融合タンパク質またはその医薬組成物を患者に投与することを含む、方法が記載される。実施形態では、標的動物は、糖尿病を有すると診断されている。実施形態では、標的動物はイヌまたはネコである。一部の実施形態では、融合タンパク質は皮下に投与される。一部の実施形態では、融合タンパク質は、１日毎、週に２回、または週に１回標的動物に投与される。例では、融合タンパク質は、０．０２５〜０．５ｍｇ／ｋｇ／週の用量において週に１回標的動物に投与される。態様では、本明細書に記載されるような融合タンパク質を発現するように操作された細胞が記載される。例では、細胞は、融合タンパク質をコードする核酸をトランスフェクトされている。例では、細胞はＨＥＫ２９３細胞またはＣＨＯ細胞である。
一態様では、本明細書に記載されるような融合タンパク質をコードするｃＤＮＡが記載される。実施形態では、ｃＤＮＡは、核酸配列ａｔｇｇａａｔｇｇａｇｃｔｇｇｇｔｃｔｔｔｃｔｃｔｔｃｔｔｃｃｔｇｔｃａｇｔａａｃｇａｃｔｇｇｔｇｔｃｃａｃｔｃｃｔｔｃｇｔｇａａｃｃａｇｃａｃｃｔｇｔｇｃｇｇｃｔｃｃｃａｃｃｔｇｇｔｇｇａａｇｃｔｃｔｇｇａａｃｔｃｇｔｇｔｇｃｇｇｃｇａｇｃｇｇｇｇｃｔｔｃｃａｃｔａｃｇｇｇｇｇｔｇｇｃｇｇａｇｇａｇｇｔｔｃｔｇｇｔｇｇｃｇｇｃｇｇａｇｇｃａｔｃｇｔｇｇａａｃａｇｔｇｃｔｇｃａｃｃｔｃｃａｃｃｔｇｃｔｃｃｃｔｇｇａｃｃａｇｃｔｇｇａａａａｃｔａｃｔｇｃｇｇｔｇｇｃｇｇａｇｇｔｇｇｔｃａａｇｇａｇｇｃｇｇｔｇｇａｃａｇｇｇｔｇｇａｇｇｔｇｇｇｃａｇｇｇａｇｇａｇｇｃｇｇｇｇｇａｇａｃｔｇｃｃｃｃａａｇｔｇｃｃｃｃｇｃｔｃｃｃｇａｇａｔｇｃｔｇｇｇｃｇｇａｃｃｃａｇｃｇｔｇｔｔｃａｔｃｔｔｃｃｃｔｃｃｃａａｇｃｃｃａａｇｇａｃａｃａｃｔｇｃｔｇａｔｃｇｃｃａｇｇａｃｃｃｃｇｇａｇｇｔｇａｃｃｔｇｃｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇａｃｃｔｇｇａｔｃｃｃｇａａｇａｃｃｃｃｇａｇｇｔｇｃａｇａｔｃａｇｃｔｇｇｔｔｃｇｔｇｇａｔｇｇａａａｇｃａｇａｔｇｃａｇａｃｃｇｃｃａａｇａｃｃｃａａｃｃｃｃｇｇｇａａｇａｇｃａｇｔｔｃａａｃｇｇｃａｃｃｔａｃａｇｇｇｔｇｇｔｇａｇｔｇｔｇｔｔｇｃｃｃａｔｃｇｇｃｃａｃｃａｇｇａｃｔｇｇｃｔｇａａｇｇｇｇａａｇｃａａｔｔｃａｃａｔｇｃａａｇｇｔｔａａｔａａｃａａｇｇｃｃｃｔｇｃｃｃａｇｃｃｃｃａｔｃｇａｇａｇｇａｃｃａｔｃａｇｃａａｇｇｃｃａｇｇｇｇｃｃａｇｇｃｃｃａｃｃａｇｃｃａｔｃｔｇｔｇｔａｃｇｔｇｃｔｇｃｃｃｃｃａｔｃｔａｇｇｇａｇｇａａｃｔｇａｇｃａａｇａａｃａｃａｇｔｃａｇｃｃｔｔａｃｔｔｇｃｃｔｇａｔｃａａｇｇａｃｔｔｃｔｔｃｃｃａｃｃｇｇａｃａｔａｇａｃｇｔｇｇａｇｔｇｇｃａｇａｇｔａａｃｇｇｃｃａｇｃａｇｇａｇｃｃｃｇａｇａｇｃａａｇｔａｔａｇｇａｃｃａｃａｃｃｇｃｃｃｃａａｃｔｇｇａｃｇａｇｇａｃｇｇａａｇｃｔａｃｔｔｃｃｔｃｔａｃａｇｃａａａｔｔｇａｇｃｇｔｔｇａｃａａａａｇｃａｇｇｔｇｇｃａｇｃｇａｇｇｃｇａｃａｃｃｔｔｃａｔｃｔｇｃｇｃｃｇｔｇａｔｇｃａｃｇａｇｇｃｔｔｔｇｃａｔａａｃｃａｃｔａｃａｃｃｃａｇｇａｇａｇｃｃｔｇｔｃｃｃａｃａｇｃｃｃｃｇｇａｔａｇ（配列番号３１）を含む。
実施形態では、ｃＤＮＡは、核酸配列ａｔｇｇａａｔｇｇａｇｃｔｇｇｇｔｃｔｔｔｃｔｃｔｔｃｔｔｃｃｔｇｔｃａｇｔａａｃｇａｃｔｇｇｔｇｔｃｃａｃｔｃｃｔｔｃｇｔｇａａｃｃａｇｃａｃｃｔｇｔｇｃｇｇｃｔｃｃｃａｃｃｔｇｇｔｇｇａａｇｃｔｃｔｇｇａａｃｔｃｇｔｇｔｇｃｇｇｃｇａｇｃｇｇｇｇｃｔｔｃｃａｃｔａｃｇｇｇｇｇｔｇｇｃｇｇａｇｇａｇｇｔｔｃｔｇｇｔｇｇｃｇｇｃｇｇａｇｇｃａｔｃｇｔｇｇａａｃａｇｔｇｃｔｇｃａｃｃｔｃｃａｃｃｔｇｃｔｃｃｃｔｇｇａｃｃａｇｃｔｇｇａａａａｃｔａｃｔｇｃａａｃｇｇｔｇｇｃｇｇａｇｇｔｇｇｔｃａａｇｇａｇｇｃｇｇｔｇｇａｃａｇｇｇｔｇｇａｇｇｔｇｇｇｃａｇｇｇａｇｇａｇｇｃｇｇｇｇｇａｇａｃｔｇｃｃｃｃａａｇｔｇｃｃｃｃｇｃｔｃｃｃｇａｇａｔｇｃｔｇｇｇｃｇｇａｃｃｃａｇｃｇｔｇｔｔｃａｔｃｔｔｃｃｃｔｃｃｃａａｇｃｃｃａａｇｇａｃａｃａｃｔｇｃｔｇａｔｃｇｃｃａｇｇａｃｃｃｃｇｇａｇｇｔｇａｃｃｔｇｃｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇａｃｃｔｇｇａｔｃｃｃｇａａｇａｃｃｃｃｇａｇｇｔｇｃａｇａｔｃａｇｃｔｇｇｔｔｃｇｔｇｇａｔｇｇａａａｇｃａｇａｔｇｃａｇａｃｃｇｃｃａａｇａｃｃｃａａｃｃｃｃｇｇｇａａｇａｇｃａｇｔｔｃａａｃｇｇｃａｃｃｔａｃａｇｇｇｔｇｇｔｇａｇｔｇｔｇｔｔｇｃｃｃａｔｃｇｇｃｃａｃｃａｇｇａｃｔｇｇｃｔｇａａｇｇｇｇａａｇｃａａｔｔｃａｃａｔｇｃａａｇｇｔｔａａｔａａｃａａｇｇｃｃｃｔｇｃｃｃａｇｃｃｃｃａｔｃｇａｇａｇｇａｃｃａｔｃａｇｃａａｇｇｃｃａｇｇｇｇｃｃａｇｇｃｃｃａｃｃａｇｃｃａｔｃｔｇｔｇｔａｃｇｔｇｃｔｇｃｃｃｃｃａｔｃｔａｇｇｇａｇｇａａｃｔｇａｇｃａａｇａａｃａｃａｇｔｃａｇｃｃｔｔａｃｔｔｇｃｃｔｇａｔｃａａｇｇａｃｔｔｃｔｔｃｃｃａｃｃｇｇａｃａｔａｇａｃｇｔｇｇａｇｔｇｇｃａｇａｇｔａａｃｇｇｃｃａｇｃａｇｇａｇｃｃｃｇａｇａｇｃａａｇｔａｔａｇｇａｃｃａｃａｃｃｇｃｃｃｃａａｃｔｇｇａｃｇａｇｇａｃｇｇａａｇｃｔａｃｔｔｃｃｔｃｔａｃａｇｃａａａｔｔｇａｇｃｇｔｔｇａｃａａａａｇｃａｇｇｔｇｇｃａｇｃｇａｇｇｃｇａｃａｃｃｔｔｃａｔｃｔｇｃｇｃｃｇｔｇａｔｇｃａｃｇａｇｇｃｔｔｔｇｃａｔａａｃｃａｃｔａｃａｃｃｃａｇｇａｇａｇｃｃｔｇｔｃｃｃａｃａｇｃｃｃｃｇｇａｔａｇ（配列番号３３）を含む。
実施形態では、ｃＤＮＡは、核酸配列ａｔｇｇａａｔｇｇａｇｃｔｇｇｇｔｃｔｔｔｃｔｃｔｔｃｔｔｃｃｔｇｔｃａｇｔａａｃｇａｃｔｇｇｔｇｔｃｃａｃｔｃｃｔｔｃｇｔｇａａｃｃａｇｃａｃｃｔｇｔｇｃｇｇｃｔｃｃｃａｃｃｔｇｇｔｇｇａａｇｃｔｃｔｇｇｃａｃｔｃｇｔｇｔｇｃｇｇｃｇａｇｃｇｇｇｇｃｔｔｃｃａｃｔａｃｇｇｇｇｇｔｇｇｃｇｇａｇｇａｇｇｔｔｃｔｇｇｔｇｇｃｇｇｃｇｇａｇｇｃａｔｃｇｔｇｇａａｃａｇｔｇｃｔｇｃａｃｃｔｃｃａｃｃｔｇｃｔｃｃｃｔｇｇａｃｃａｇｃｔｇｇａａａａｃｔａｃｔｇｃｇｇｔｇｇｃｇｇａｇｇｔｇｇｔｃａａｇｇａｇｇｃｇｇｔｇｇａｃａｇｇｇｔｇｇａｇｇｔｇｇｇｃａｇｇｇａｇｇａｇｇｃｇｇｇｇｇａｇａｃｔｇｃｃｃｃａａｇｔｇｃｃｃｃｇｃｔｃｃｃｇａｇａｔｇｃｔｇｇｇｃｇｇａｃｃｃａｇｃｇｔｇｔｔｃａｔｃｔｔｃｃｃｔｃｃｃａａｇｃｃｃａａｇｇａｃａｃａｃｔｇｃｔｇａｔｃｇｃｃａｇｇａｃｃｃｃｇｇａｇｇｔｇａｃｃｔｇｃｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇａｃｃｔｇｇａｔｃｃｃｇａａｇａｃｃｃｃｇａｇｇｔｇｃａｇａｔｃａｇｃｔｇｇｔｔｃｇｔｇｇａｔｇｇａａａｇｃａｇａｔｇｃａｇａｃｃｇｃｃａａｇａｃｃｃａａｃｃｃｃｇｇｇａａｇａｇｃａｇｔｔｃｔｃａｇｇｃａｃｃｔａｃａｇｇｇｔｇｇｔｇａｇｔｇｔｇｔｔｇｃｃｃａｔｃｇｇｃｃａｃｃａｇｇａｃｔｇｇｃｔｇａａｇｇｇｇａａｇｃａａｔｔｃａｃａｔｇｃａａｇｇｔｔａａｔａａｃａａｇｇｃｃｃｔｇｃｃｃａｇｃｃｃｃａｔｃｇａｇａｇｇａｃｃａｔｃａｇｃａａｇｇｃｃａｇｇｇｇｃｃａｇｇｃｃｃａｃｃａｇｃｃａｔｃｔｇｔｇｔａｃｇｔｇｃｔｇｃｃｃｃｃａｔｃｔａｇｇｇａｇｇａａｃｔｇａｇｃａａｇａａｃａｃａｇｔｃａｇｃｃｔｔａｃｔｔｇｃｃｔｇａｔｃａａｇｇａｃｔｔｃｔｔｃｃｃａｃｃｇｇａｃａｔａｇａｃｇｔｇｇａｇｔｇｇｃａｇａｇｔａａｃｇｇｃｃａｇｃａｇｇａｇｃｃｃｇａｇａｇｃａａｇｔａｔａｇｇａｃｃａｃａｃｃｇｃｃｃｃａａｃｔｇｇａｃｇａｇｇａｃｇｇａａｇｃｔａｃｔｔｃｃｔｃｔａｃａｇｃａａａｔｔｇａｇｃｇｔｔｇａｃａａａａｇｃａｇｇｔｇｇｃａｇｃｇａｇｇｃｇａｃａｃｃｔｔｃａｔｃｔｇｃｇｃｃｇｔｇａｔｇｃａｃｇａｇｇｃｔｔｔｇｃａｔａａｃｃａｃｔａｃａｃｃｃａｇｇａｇａｇｃｃｔｇｔｃｃｃａｃａｇｃｃｃｃｇｇａｔａｇ（配列番号３５）を含む。
実施形態では、ｃＤＮＡは、核酸配列ａｔｇｇａａｔｇｇａｇｃｔｇｇｇｔｃｔｔｔｃｔｃｔｔｃｔｔｃｃｔｇｔｃａｇｔａａｃｇａｃｔｇｇｔｇｔｃｃａｃｔｃｃｔｔｃｇｔｇａａｃｃａｇｃａｃｃｔｇｔｇｃｇｇｃｔｃｃｃａｃｃｔｇｇｔｇｇａａｇｃｔｃｔｇｇａａｃｔｃｇｔｇｔｇｃｇｇｃｇａｇｃｇｇｇｇｃｔｔｃｃａｃｔａｃｇｇｇｇｇｔｇｇｃｇｇａｇｇａｇｇｔｔｃｔｇｇｔｇｇｃｇｇｃｇｇａｇｇｃａｔｃｇｔｇｇａａｃａｇｔｇｃｔｇｃａｃｃｔｃｃａｃｃｔｇｃｔｃｃｃｔｇｇａｃｃａｇｃｔｇｇａａａａｃｔａｃｔｇｃｇｇｔｇｇｃｇｇａｇｇｔｇｇｔｃａａｇｇａｇｇｃｇｇｔｇｇａｃａｇｇｇｔｇｇａｇｇｔｇｇｇｃａｇｇｇａｇｇａｇｇｃｇｇｇｇｇａｇａｃｔｇｃｃｃｃａａａｔｇｔｃｃｔｃｃｇｃｃｔｇａｇａｔｇｃｔｇｇｇｔｇｇｃｃｃｔａｇｃａｔｃｔｔｃａｔｃｔｔｃｃｃｇｃｃｃａａｇｃｃｃａａｇｇａｔａｃｔｃｔｇｔｃｃａｔｔａｇｃａｇｇａｃｃｃｃｃｇａｇｇｔｇａｃｃｔｇｃｃｔｇｇｔｇｇｔｇｇａｃｃｔｇｇｇｇｃｃａｇａｃｇａｃｔｃｔｇａｃｇｔｇｃａｇａｔｃａｃｃｔｇｇｔｔｃｇｔａｇａｃａａｃａｃｃｃａｇｇｔｔｔａｃａｃｔｇｃｃａａｇａｃｃａｇｔｃｃｃａｇｇｇａｇｇａｇｃａｇｔｔｃａａｃａｇｃａｃａｔａｃａｇｇｇｔｇｇｔｇａｇｃｇｔｔｃｔｇｃｃｃａｔｃｃｔｇｃａｃｃａｇｇａｃｔｇｇｃｔｇａａａｇｇｃａａａｇａｇｔｔｃａａｇｔｇｔａａｇｇｔｇａａｃａｇｃａａｇａｇｃｃｔｇｃｃｃａｇｃｃｃｃａｔｔｇａａａｇｇａｃｃａｔｃａｇｃａａｇｇａｃａａｇｇｇｃｃａｇｃｃｇｃａｃｇａｇｃｃｃｃａａｇｔｃｔａｃｇｔｇｃｔｇｃｃｃｃｃａｇｃａｃａｇｇａａｇａｇｃｔｇａｇｃａｇｇａａｃａａｇｇｔｔａｇｃｇｔｇａｃａｔｇｃｃｔｇａｔｃｇａｇｇｇｔｔｔｃｔａｃｃｃｃａｇｃｇａｃａｔｃｇｃｃｇｔｇｇａｇｔｇｇｇａａａｔｃａｃｃｇｇｃｃａａｃｃｃｇａｇｃｃｃｇａｇａａｃａａｃｔａｃａｇｇａｃｃａｃｔｃｃｇｃｃｇｃａａｃｔｇｇａｃａｇｃｇａｃｇｇｇａｃｃｔａｃｔｔｃｔｔｇｔａｔａｇｃａｇｇｃｔｇａｇｃｇｔｇｇａｃｃｇｇａｇｃａｇｇｔｇｇｃａｇａｇｇｇｇｃａａｃａｃｃｔａｃａｃｔｔｇｃａｇｃｇｔｇａｇｃｃａｃｇａｇｇｃｃｔｔｇｃａｃａｇｃｃａｃｃａｃａｃｔｃａｇａａｇａｇｔｃｔｇａｃｃｃａｇａｇｃｃｃｇｇｇａｔａｇ（配列番号３７）を含む。
実施形態では、ｃＤＮＡは、核酸配列ａｔｇｇａａｔｇｇａｇｃｔｇｇｇｔｃｔｔｔｃｔｃｔｔｃｔｔｃｃｔｇｔｃａｇｔａａｃｇａｃｔｇｇｔｇｔｃｃａｃｔｃｃｔｔｃｇｔｇａａｃｃａｇｃａｃｃｔｇｔｇｃｇｇｃｔｃｃｃａｃｃｔｇｇｔｇｇａａｇｃｔｃｔｇｇｃａｃｔｃｇｔｇｔｇｃｇｇｃｇａｇｃｇｇｇｇｃｔｔｃｃａｃｔａｃｇｇｇｇｇｔｇｇｃｇｇａｇｇａｇｇｔｔｃｔｇｇｔｇｇｃｇｇｃｇｇａｇｇｃａｔｃｇｔｇｇａａｃａｇｔｇｃｔｇｃａｃｃｔｃｃａｃｃｔｇｃｔｃｃｃｔｇｇａｃｃａｇｃｔｇｇａａａａｃｔａｃｔｇｃｇｇｔｇｇｃｇｇａｇｇｔｇｇｔｃａａｇｇａｇｇｃｇｇｔｇｇａｃａｇｇｇｔｇｇａｇｇｔｇｇｇｃａｇｇｇａｇｇａｇｇｃｇｇｇｇｇａｇａｃｔｇｃｃｃｃａａａｔｇｔｃｃｔｃｃｇｃｃｔｇａｇａｔｇｃｔｇｇｇｔｇｇｃｃｃｔａｇｃａｔｃｔｔｃａｔｃｔｔｃｃｃｇｃｃｃａａｇｃｃｃａａｇｇａｔａｃｔｃｔｇｔｃｃａｔｔａｇｃａｇｇａｃｃｃｃｃｇａｇｇｔｇａｃｃｔｇｃｃｔｇｇｔｇｇｔｇｇａｃｃｔｇｇｇｇｃｃａｇａｃｇａｃｔｃｔｇａｃｇｔｇｃａｇａｔｃａｃｃｔｇｇｔｔｃｇｔａｇａｃａａｃａｃｃｃａｇｇｔｔｔａｃａｃｔｇｃｃａａｇａｃｃａｇｔｃｃｃａｇｇｇａｇｇａｇｃａｇｔｔｃａｇｃａｇｃａｃａｔａｃａｇｇｇｔｇｇｔｇａｇｃｇｔｔｃｔｇｃｃｃａｔｃｃｔｇｃａｃｃａｇｇａｃｔｇｇｃｔｇａａａｇｇｃａａａｇａｇｔｔｃａａｇｔｇｔａａｇｇｔｇａａｃａｇｃａａｇａｇｃｃｔｇｃｃｃａｇｃｃｃｃａｔｔｇａａａｇｇａｃｃａｔｃａｇｃａａｇｇａｃａａｇｇｇｃｃａｇｃｃｇｃａｃｇａｇｃｃｃｃａａｇｔｃｔａｃｇｔｇｃｔｇｃｃｃｃｃａｇｃａｃａｇｇａａｇａｇｃｔｇａｇｃａｇｇａａｃａａｇｇｔｔａｇｃｇｔｇａｃａｔｇｃｃｔｇａｔｃｇａｇｇｇｔｔｔｃｔａｃｃｃｃａｇｃｇａｃａｔｃｇｃｃｇｔｇｇａｇｔｇｇｇａａａｔｃａｃｃｇｇｃｃａａｃｃｃｇａｇｃｃｃｇａｇａａｃａａｃｔａｃａｇｇａｃｃａｃｔｃｃｇｃｃｇｃａａｃｔｇｇａｃａｇｃｇａｃｇｇｇａｃｃｔａｃｔｔｃｔｔｇｔａｔａｇｃａｇｇｃｔｇａｇｃｇｔｇｇａｃｃｇｇａｇｃａｇｇｔｇｇｃａｇａｇｇｇｇｃａａｃａｃｃｔａｃａｃｔｔｇｃａｇｃｇｔｇａｇｃｃａｃｇａｇｇｃｃｔｔｇｃａｃａｇｃｃａｃｃａｃａｃｔｃａｇａａｇａｇｔｃｔｇａｃｃｃａｇａｇｃｃｃｇｇｇａｔａｇ（配列番号３９）を含む。
図１は例示的なインスリン−Ｆｃ融合タンパク質ホモ二量体の図式的表現を示す。 図２は、配列番号４２のホモ二量体を０日目に０．２ｍｇ／ｋｇで静脈内に投薬されたＮ＝３のイヌについての０日目から３日目までの空腹時血中グルコースレベルの平均％を示す。 図３は、配列番号４２、４４、４６、４８、および５０を並べた配列比較を示す。「＊」は所与の配列位置における全ての配列にわたる完全な相同性を表し、「：」、「．」またはスペースは、所与の配列位置における配列にわたる保存的、中等度、または非常に異なるアミノ酸突然変異をそれぞれ指す。 図４は、配列番号４２、５２、５４、および５６を並べた配列比較を示す。「＊」は所与の配列位置における全ての配列にわたる完全な相同性を表し、「：」、「．」またはスペースは、所与の配列位置における配列にわたる保存的、中等度、または非常に異なるアミノ酸突然変異をそれぞれ指す。 図５は、配列番号５２のホモ二量体を０日目に０．２ｍｇ／ｋｇで静脈内に投薬されたＮ＝３のイヌについての０日目から７日目までの空腹時血中グルコースレベルの平均％を示す。 図６は、配列番号５２のホモ二量体を０日目に０．３３ｍｇ／ｋｇで皮下に投薬されたＮ＝６のイヌについての０日目から７日目までの空腹時血中グルコースレベルの平均％を示す。 図７は、配列番号５２のホモ二量体を０日目（０．３０ｍｇ／ｋｇ）、２８日目（０．３３ｍｇ／ｋｇ）、３５日目（０．３３ｍｇ／ｋｇ）、４２日目（０．５０ｍｇ／ｋｇ）、４９日目（１．００ｍｇ／ｋｇ）および５６日目（１．００ｍｇ／ｋｇ）に皮下に投薬されたＮ＝３のイヌについての平均の抗薬物抗体タイター（μｇ／ｍＬ）を示す。 図８は、配列番号５８、６０、６２、および６４を並べた配列比較を示す。「＊」は所与の配列位置における全ての配列にわたる完全な相同性を表し、「：」、「．」またはスペースは、所与の配列位置における配列にわたる保存的、中等度、または非常に異なるアミノ酸突然変異をそれぞれ指す。 図９は、配列番号６４のホモ二量体を０日目（０．３３ｍｇ／ｋｇ）、７日目（０．５０ｍｇ／ｋｇ）、１４日目（０．５０ｍｇ／ｋｇ）、および２１日目（０．５０ｍｇ／ｋｇ）に皮下に投薬されたＮ＝１のイヌについての平均の抗薬物抗体タイター（μｇ／ｍＬ）を示す。 図１０は、配列番号６６のホモ二量体を０日目（０．３３ｍｇ／ｋｇ）および１４日目（０．１６ｍｇ／ｋｇ）に皮下に投薬されたＮ＝１のイヌについての平均の抗薬物抗体タイター（μｇ／ｍＬ）を示す。 図１１は、配列番号６６のホモ二量体を０日目に０．３３ｍｇ／ｋｇで皮下に投薬されたＮ＝２のイヌについての０日目から７日目までの空腹時血中グルコースレベルの平均％を示す。 図１２は、配列番号６６、６８、７０、７２、７４および７６を並べた配列比較を示す。「＊」は所与の配列位置における全ての配列にわたる完全な相同性を表し、「：」、「．」またはスペースは、所与の配列位置における配列にわたる保存的、中等度、または非常に異なるアミノ酸突然変異をそれぞれ指す。 図１３は、配列番号６６、７８、８０、８２、および８４を並べた配列比較を示す。「＊」は所与の配列位置における全ての配列にわたる完全な相同性を表し、「：」、「．」またはスペースは、所与の配列位置における配列にわたる保存的、中等度、または非常に異なるアミノ酸突然変異をそれぞれ指す。 図１４は、配列番号６６、７６および８６を並べた配列比較を示す。「＊」は所与の配列位置における全ての配列にわたる完全な相同性を表し、「：」、「．」またはスペースは、所与の配列位置における配列にわたる保存的、中等度、または非常に異なるアミノ酸突然変異をそれぞれ指す。 図１５は、配列番号６６、８２、８４および８８を並べた配列比較を示す。「＊」は所与の配列位置における全ての配列にわたる完全な相同性を表し、「：」、「．」またはスペースは、所与の配列位置における配列にわたる保存的、中等度、または非常に異なるアミノ酸突然変異をそれぞれ指す。 図１６は、配列番号３２、３４、６６、９０、９２および９４を並べた配列比較を示す。「＊」は所与の配列位置における全ての配列にわたる完全な相同性を表し、「：」、「．」またはスペースは、所与の配列位置における配列にわたる保存的、中等度、または非常に異なるアミノ酸突然変異をそれぞれ指す。 図１７は、配列番号３４のホモ二量体を０日目に０．１６ｍｇ／ｋｇで皮下に投薬されたＮ＝１のイヌについての０日目から７日目までの空腹時血中グルコースレベルの％を示す。 図１８は、配列番号３４のホモ二量体を０日目（０．１６ｍｇ／ｋｇ）、１４日目（０．１６ｍｇ／ｋｇ）、２８日目（０．１６ｍｇ／ｋｇ）、および４２日目（０．１６ｍｇ／ｋｇ）に皮下に投薬されたＮ＝１のイヌについての抗薬物抗体タイター（μｇ／ｍＬ）を示す。 図１９は、配列番号３２のホモ二量体を０日目に０．３３ｍｇ／ｋｇで皮下に投薬されたＮ＝１のイヌについての０日目から７日目までの空腹時血中グルコースレベルの％を示す。 図２０は、配列番号３２のホモ二量体を０日目（０．３３ｍｇ／ｋｇ）、１５日目（０．１６ｍｇ／ｋｇ）、３１日目（０．１６ｍｇ／ｋｇ）および４５日目（０．１５ｍｇ／ｋｇ）に皮下に投薬されたＮ＝１のイヌについての０日目から６０日目までの空腹時血中グルコースレベルの％を示す。 図２１は、配列番号３２のホモ二量体を０日目（０．３３ｍｇ／ｋｇ）、１５日目（０．１６ｍｇ／ｋｇ）、３１日目（０．１６ｍｇ／ｋｇ）および４５日目（０．１５ｍｇ／ｋｇ）に皮下に投薬されたＮ＝１のイヌについての抗薬物抗体タイター（μｇ／ｍＬ）を示す。 図２２は、配列番号９６のホモ二量体を０日目に０．１６ｍｇ／ｋｇで皮下に投薬されたＮ＝１のイヌについての０日目から７日目までの空腹時血中グルコースレベルの％を示す。 図２３は、配列番号９８のホモ二量体を０日目に０．１６ｍｇ／ｋｇで皮下に投薬されたＮ＝１のイヌについての０日目から７日目までの空腹時血中グルコースレベルの％を示す。 図２４は、配列番号１０２および１０４を並べた配列比較を示す。「＊」は所与の配列位置における全ての配列にわたる完全な相同性を表し、「：」、「．」またはスペースは、所与の配列位置における配列にわたる保存的、中等度、または非常に異なるアミノ酸突然変異をそれぞれ指す。 図２５は、配列番号１０２のホモ二量体を０日目に０．１６ｍｇ／ｋｇで皮下に投薬されたＮ＝１のイヌについての０日目から７日目までの空腹時血中グルコースレベルの％、および配列番号１０４のホモ二量体を０日目に０．１６ｍｇ／ｋｇで皮下に投薬されたＮ＝１のイヌについての０日目から７日目までの空腹時血中グルコースレベルの％を示す。 図２６は、イヌが食餌を与えられた時点に加えて、配列番号３６のホモ二量体を皮下に投薬されたＮ＝１のイヌについての０日目から７日目までの空腹時血中グルコースレベルの％を示す。 図２７は、配列番号１０６のホモ二量体を０日目に０．８ｍｇ／ｋｇで皮下に投薬されたＮ＝３のネコについての０日目から７日目までの空腹時血中グルコースレベルの平均％を示す。 図２８は、配列番号１０６、１０８、１１０および１１２を並べた配列比較を示す。「＊」は所与の配列位置における全ての配列にわたる完全な相同性を表し、「：」、「．」またはスペースは、所与の配列位置における配列にわたる保存的、中等度、または非常に異なるアミノ酸突然変異をそれぞれ指す。 図２９は、配列番号１０６のホモ二量体を０日目（０．８ｍｇ／ｋｇ）、２８日目（０．６ｍｇ／ｋｇ）、３５日目（０．６ｍｇ／ｋｇ）、４２日目（０．６ｍｇ／ｋｇ）および４８日目（０．８ｍｇ／ｋｇ）に皮下に投薬されたＮ＝３のネコについての平均の抗薬物抗体タイター（μｇ／ｍＬ）を示す。 図３０は、配列番号１０８、１１４、１１６および１１８を並べた配列比較を示す。「＊」は所与の配列位置における全ての配列にわたる完全な相同性を表し、「：」、「．」またはスペースは、所与の配列位置における配列にわたる保存的、中等度、または非常に異なるアミノ酸突然変異をそれぞれ指す。 図３１は、配列番号１０６、１１２、および１２２を並べた配列比較を示す。「＊」は所与の配列位置における全ての配列にわたる完全な相同性を表し、「：」、「．」またはスペースは、所与の配列位置における配列にわたる保存的、中等度、または非常に異なるアミノ酸突然変異をそれぞれ指す。 図３２は、配列番号１２２のホモ二量体を０日目（０．１６ｍｇ／ｋｇ）に皮下に投薬されたＮ＝１のネコについての０日目から７日目までの空腹時血中グルコースレベルの％を示す。 図３３は、ネコが食餌を与えられた時点に加えて、配列番号３８のホモ二量体を０日目（０．１６ｍｇ／ｋｇ）に皮下に投薬されたＮ＝１のネコについての０日目から７日目までの空腹時血中グルコースレベルの％を示す。 図３４は、配列番号３８のホモ二量体を０日目（０．１６ｍｇ／ｋｇ）、１４日目（０．１６ｍｇ／ｋｇ）、２８日目（０．１１ｍｇ／ｋｇ）、および４２日目（０．０９ｍｇ／ｋｇ）に皮下に投薬されたＮ＝１のネコについての抗薬物抗体タイター（μｇ／ｍＬ）を示す。 図３５は、配列番号１２４のホモ二量体を０日目（０．１６ｍｇ／ｋｇ）に皮下に投薬されたＮ＝１のネコについての０日目から７日目までの空腹時血中グルコースレベルの％を示す。 図３６は、配列番号４０のホモ二量体を０日目（０．１０ｍｇ／ｋｇ）に皮下に投薬されたＮ＝３のネコについての０日目から７日目までの空腹時血中グルコースレベルの平均％を示す。 図３７は、配列番号４０のホモ二量体を７日目（０．２０ｍｇ／ｋｇ）に皮下に投薬されたＮ＝３のネコについての７日目から１４日目までの空腹時血中グルコースレベルの平均％を示す。 図３８は、融合タンパク質の「全長ａａ配列」（配列番号３２）およびその対応する核酸配列（配列番号３１）を示す。 図３９は、融合タンパク質の「全長ａａ配列」（配列番号３４）およびその対応する核酸配列（配列番号３３）を示す。 図４０は、融合タンパク質の「全長ａａ配列」（配列番号３６）およびその対応する核酸配列（配列番号３５）を示す。 図４１は、融合タンパク質の「全長ａａ配列」（配列番号３８）およびその対応する核酸配列（配列番号３７）を示す。 図４２は、融合タンパク質の「全長ａａ配列」（配列番号４０）およびその対応する核酸配列（配列番号３９）を示す。
より低い頻度の投薬（例えば、週に１回の注射）を要求するインスリン治療は、所有者に対してより小さい負担となり、より良好な順守、安楽死のより少ない事例、および愛玩動物のより良好なアウトカムに繋がる。所与の種（例えば、イヌまたはネコ）について、糖尿病の超長期作用性の治療のために好適な分子は、所望のホモ二量体製造物の許容されるタイター（例えば、一過的にトランスフェクトされたＨＥＫ細胞からの５０ｍｇ／Ｌより高い、一過的にトランスフェクトされたＨＥＫ細胞からの７５ｍｇ／Ｌより高い、一過的にトランスフェクトされたＨＥＫ細胞からの１００ｍｇ／Ｌより高いホモ二量体タイターなど）と共に哺乳動物細胞、例えば、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ、例えば、ＨＥＫ２９３）細胞において生産可能であるべきである。５０ｍｇ／Ｌより高いホモ二量体タイターを有する候補のみが本発明において有用であると考えられ、その理由は、このレベルより低いホモ二量体タイターは、獣医学的製造物のための厳密に低い生産コスト要求を満たすチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞におけるホモ二量体タイターの商用の製造を結果としてもたらさないようであることを経験が実証しているからである。追加的に、分子は、４℃でのＩＭ−９インスリン受容体結合アッセイにおいて測定された場合に認識可能な親和性（例えば、５０００ｎＭ未満のＩＣ５０、４０００ｎＭ未満のＩＣ５０、３０００ｎＭ未満のＩＣ５０、２５００ｎＭ未満のＩＣ５０など）と共にインスリン受容体に結合しなければならない。経験に基づけば、５０００ｎＭ未満のインスリン受容体活性ＩＣ５０値を呈する分子のみが、標的種において要求される生物活性を呈するようであるとみなされる。分子はまた、より低い頻度の投薬を正当化するためにインビボで持続的な生物活性を実証（例えば、約２時間、６時間、９時間、１２時間、１８時間、１日、１．５日、２日、２．５日、３日、４日、５日、６日、７日、またはより長くより大きいグルコース低下活性を実証）しなければならない。分子はまた、標的動物において長期化された系滞留時間を実証しなければならない（例えば、血清半減期は３日またはより長くより大きくなければならない）。生物活性効力および生物活性の継続期間は、実施例１１に記載されるように、ＦＢＧＬ％・日・ｋｇ／ｍｇの単位を用いてｍｇ／ｋｇでの所与の用量に対して正規化された空腹時血中グルコースパーセント（ＦＢＧＬ％）曲線上の面積（ＮＡＯＣ）を算出することにより定量的に表すことができる。分子が生物活性の増加を実証する場合に該当するようにＦＢＧＬ％のより大きい低下と共に、およびインスリン−Ｆｃ融合タンパク質が作用の継続期間の増加を実証する場合に該当するようにＦＢＧＬ％が１００％に復帰するまでにより長くかかる場合に、ＮＡＯＣは増加する。本明細書に記載されるように有用であるために、分子は十分に高いＮＡＯＣ値（例えば、好ましくは１５０ＦＢＧＬ％・日・ｋｇ／ｍｇより高いＮＡＯＣ、より好ましくは２００ＦＢＧＬ％・日・ｋｇ／ｍｇより高いＮＡＯＣ、よりいっそう好ましくは２５０ＦＢＧＬ％・日・ｋｇ／ｍｇより高いＮＡＯＣ）を実証しなければならない。経験に基づけば、１５０ＦＢＧＬ％・日・ｋｇ／ｍｇより高いＮＡＯＣ値において、標的種における用量要求は、許容される治療コストに達するように十分に低いものとなる。最後に、糖尿病などの慢性疾患を治療するために有用であるために、分子は、抗薬物抗体、殊に、繰返しの投薬後に分子の生物活性を中和する抗体の産生を誘導してはならない。したがって、分子は、標的動物における複数の繰返しの投薬後に生物活性の類似した継続期間および程度（すなわち、ＮＡＯＣ）を実証しなければならない（例えば、分子の１回目の週毎の皮下注射後のＮＡＯＣに対する３回目の週毎の皮下注射後のＮＡＯＣの比（すなわち、３回目の投薬後のＮＡＯＣ比（ＮＡＯＣＲ））は、好ましい順に、０．５０より高い、０．６０より高い、０．７０より高い、０．８０より高い、または０．９０より高いまたはより高い）。
ヒト臨床使用用の提案される超長期作用性インスリン治療は、インビボでの作用を長期化させるためにヒトＦｃ断片を使用するインスリン−Ｆｃ融合タンパク質を含む。ヒトＦｃ断片は免疫原性であり、したがって伴侶動物（例えば、イヌまたはネコ）において抗薬物抗体の産生を誘導し得ることが予期されるので、ヒトＦｃ断片は種特異的（例えば、イヌ科動物またはネコ科動物）Ｆｃ断片で置き換えられなければならない。しかしながら、かなり予想外なことに、ヒトＦｃ断片と種特異的（例えば、イヌ科動物またはネコ科動物）Ｆｃ断片との単純な交換は、許容されるホモ二量体タイター（例えば、５０ｍｇ／Ｌより高いホモ二量体タイター）または十分に高いＮＡＯＣ値（例えば、１５０ＦＢＧＬ％・日・ｋｇ／ｍｇより高いＮＡＯＣ）を有する製造物をもたらさないことが見出された。例えば、一部の場合には、Ｆｃ断片について特定のアイソタイプ（例えば、イヌ科動物ＩｇＧＢまたはネコ科動物ＩｇＧ１ｂ）のみが、高い十分なホモ二量体タイター（例えば、５０ｍｇ／Ｌより高いホモ二量体タイター）および許容可能に高いＮＡＯＣ値（例えば、１５０ＦＢＧＬ％・日・ｋｇ／ｍｇより高いＮＡＯＣ）を有するインスリン−Ｆｃ融合タンパク質を結果としてもたらした。他の場合には、インスリンポリペプチドの特定のアミノ酸は標的種において免疫原性であることが見出され、それにより、許容可能に高いＮＡＯＣ値（例えば、１５０ＦＢＧＬ％・日・ｋｇ／ｍｇより高いＮＡＯＣ値）および０．５より高い３回目の週毎の皮下投薬後のＮＡＯＣＲ値と共に標的種において非免疫原性および生物活性の両方である比較的少数の実施形態を見出すために部位特異的な突然変異を要求した。さらなる場合には、グリコシル化を予防し、それによりインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の免疫原性をさらに低減するためにＦｃ断片を突然変異させた場合、予想外なことに、Ｆｃ断片中の特定のアミノ酸突然変異のみが所望のホモ二量体タイター（例えば、５０ｍｇ／Ｌより高いホモ二量体タイター）およびＮＡＯＣ値（例えば、１５０ＦＢＧＬ％・日・ｋｇ／ｍｇより高いＮＡＯＣ）に繋がることが発見された。さらには、０．５より高い３回目の週毎の皮下投薬後のＮＡＯＣＲ値も達成しながら所望のホモ二量体タイター（例えば、５０ｍｇ／Ｌより高いホモ二量体タイター）およびＮＡＯＣ値（例えば、１５０ＦＢＧＬ％・日・ｋｇ／ｍｇより高いＮＡＯＣ）を有するこれらのＦｃ突然変異型非グリコシル化インスリンＦｃ融合タンパク質を製造するためにインスリン成分における追加の突然変異が要求されることが発見された。したがって、許容可能に高いホモ二量体タイター（例えば、５０ｍｇ／Ｌより高いホモ二量体タイター）、ＮＡＯＣ値（例えば、１５０ＦＢＧＬ％・日・ｋｇ／ｍｇより高いＮＡＯＣ値）、および０．５より高い３回目の週毎の皮下投薬後のＮＡＯＣＲ値を有し、伴侶動物（例えば、イヌまたはネコ）における糖尿病の治療のために好適な、生産可能、高純度、長期作用性、生物活性、非免疫原性のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質であって、それぞれがインスリンポリペプチド、Ｆｃ断片、およびインスリンポリペプチドとＦｃ断片との間のリンカーを含む、融合タンパク質が本明細書において提供される。
定義
本明細書において使用される場合、冠詞「ａ」および「ａｎ」は、冠詞の文法的目的語の１つまたは１つより多く、例えば、少なくとも１つを指す。本明細書において「含む」という用語と組み合わせて使用される場合の「ａ」または「ａｎ」という語の使用は「１つ」を意味し得るが、それは、「１つまたはより多く」、「少なくとも１つ」、および「１つまたは１つより多く」の意味とも合致する。
本明細書において使用される場合、「約」および「おおよそ」は、一般に、測定の性質または精度を考慮して測定された量についての許容される誤差の程度を意味する。例示的な誤差の程度は、値の所与の範囲の２０パーセント（％）以内、典型的には１０％以内、より典型的には５％以内である。
本明細書において使用される場合、障害（例えば、本明細書に記載の障害）を治療するために有効な分子、化合物、コンジュゲート、もしくは物質の量、「治療有効量」、または「有効量」は、そのような治療の非存在下で予期されるものを超える、対象の治療、または障害（例えば、本明細書に記載の障害）を有する対象の治癒、和らげること、緩和もしくは改善において、対象への単回または複数回投薬の投与において有効な、分子、化合物、コンジュゲート、または物質の量を指す。
本明細書において使用される場合、「アナログ」という用語は、別の化合物またはコンジュゲートの化学構造に類似しているが少なくとも１つの態様においてそれとは異なる化学構造を有する化合物またはコンジュゲート（例えば、本明細書に記載されるような化合物またはコンジュゲート、例えば、インスリン）を指す。
本明細書において使用される場合、「抗体」または「抗体分子」という用語は、免疫グロブリン分子（Ｉｇ）、免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の免疫学的活性部分、すなわち、抗原に特異的に結合する、例えば、それと免疫反応を起こす抗原結合部位を含有する分子を指す。本明細書において使用される場合、「抗体ドメイン」という用語は、免疫グロブリンの可変または定常領域を指す。本明細書において使用される場合、「抗体ドメイン」という用語は、免疫グロブリンの可変または定常領域を指す。抗体はいくつかのクラス、例えば、哺乳動物（例えば、ヒトおよびネコ科動物）の場合、ＩｇＡ、ＩｇＭ、またはＩｇＧを含むことが当該技術分野において報告されている。免疫グロブリンのクラスは、異なるアイソタイプ、例えば、イヌ科動物についてＩｇＧＡ、ＩｇＧＢ、ＩｇＧＣ、およびＩｇＧＤ、またはネコ科動物についてＩｇＧ１ａ、ＩｇＧ１ｂ、およびＩｇＧ２にさらに分類することができる。所与の免疫グロブリンクラスの免疫グロブリンアイソタイプは、互いに異なるアミノ酸配列、構造、および機能的特性（例えば、Ｆｃ（ガンマ）受容体に対する異なる結合親和性）を含むことを当業者は認識する。「特異的に結合する」または「免疫反応を起こす」は、抗体が所望の抗原の１つまたはより多くの抗原決定基と反応し、かつ他のポリペプチドに対してより低い親和性を有する、例えば、他のポリペプチドと反応しないことを意味する。
本明細書において使用される場合、「曲線下面積」または「ＡＵＣ」という用語は、インスリン−Ｆｃ融合タンパク質の所与の用量が投与された後の対象についてのＦＢＧＬ％対時間曲線下の積分された面積を指す。本明細書において使用される場合、「曲線上面積」または「ＡＯＣ」という用語は、インスリン−Ｆｃ融合タンパク質の生物学的効力の度合として使用され、ＡＯＣは、ＦＢＧＬ％対時間曲線下の合計の可能な面積とＡＵＣ値との間の差異に等しい。本明細書において使用される場合、「正規化された曲線上面積」、「正規化されたＡＯＣ」、または「ＮＡＯＣ」は、投与されたインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の実際の用量により割られたＡＯＣ値である。本明細書において使用される場合、「正規化されたＡＯＣ比」または「ＮＡＯＣＲ」という用語は、一連の投与におけるインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の１回目の投与の結果としてもたらされるＮＡＯＣに対するインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の具体的な投与の結果としてもたらされるＮＡＯＣの比である。ＮＡＯＣＲは、そのため、繰返しの投与後のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の生物学的活性における変化の度合を提供する。
本明細書において使用される場合、「生物活性」、「活性」、「生物学的活性」、「効力」、「生物活性効力」、または「生物学的効力」という用語は、インスリン−Ｆｃ融合タンパク質が標的対象においてインスリン受容体を活性化させかつ／または血中グルコースレベルにおける低減を発揮する程度を指す。本明細書において使用される場合、「インビトロ活性」または「インスリン受容体活性」は、インスリン−Ｆｃ融合タンパク質がインスリン受容体に結合する親和性を指し、典型的には、インスリン−Ｆｃ融合タンパク質が競合結合アッセイにおいてインスリン受容体からインスリン参照標準の半分を置換する濃度（すなわち、ＩＣ５０）により測定される。本明細書において使用される場合、「インビボ活性」は、インスリン−Ｆｃ融合タンパク質の投与後の標的対象の空腹時血中グルコースレベルにおける低減の程度および継続期間を指す。
本明細書において使用される場合、「生合成」、「組換え合成」、または「組換えにより作られた」という用語は、細胞にインスリン−Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸分子（例えば、ベクター）をトランスフェクトすること（例えば、インスリン−Ｆｃ融合タンパク質全体が単一の核酸分子によりコードされる場合）によりインスリン−Ｆｃ融合タンパク質が宿主細胞内で発現されるプロセスを指す。例示的な宿主細胞としては、哺乳動物細胞、例えば、ＨＥＫ２９３細胞またはＣＨＯ細胞が挙げられる。細胞は、当該技術分野における標準的な方法を使用して培養することができ、発現されたインスリン−Ｆｃ融合タンパク質は、当該技術分野における標準的な方法を使用して細胞培養物から回収および精製されてもよい。
本明細書において使用される場合、「細胞表面受容体」という用語は、一般に細胞の膜の外表面上に見出され、かつ可溶性分子、例えば、血液供給中で循環する分子と相互作用する、タンパク質などの分子を指す。一部の実施形態では、細胞表面受容体は、ホルモン受容体（例えば、インスリンホルモン受容体またはインスリン受容体（ＩＲ））または抗体（例えば、Ｆｃ（ガンマ）受容体、例えば、Ｆｃ（ガンマ）受容体Ｉ、またはＦｃ新生児受容体、例えば、ＦｃＲｎ）のＦｃ断片もしくはＦｃ領域に結合するＦｃ受容体を含んでもよい。本明細書において使用される場合、「インビトロ活性」または「Ｆｃ（ガンマ）受容体活性」または「Ｆｃ（ガンマ）受容体結合」または「ＦｃＲｎ受容体活性」または「ＦｃＲｎ結合」は、インスリン−Ｆｃ融合タンパク質がＦｃ受容体（例えば、Ｆｃ（ガンマ）受容体またはＦｃＲｎ受容体）に結合する親和性を指し、典型的には、マイクロプレートリーダーにおいて測定されるようなＯＤ ４５０ｎｍ値を使用してアッセイ（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）アッセイ）において測定されるような、インスリン−Ｆｃ融合タンパク質がその最大結合の半分に達することを引き起こすインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の濃度（すなわち、ＥＣ５０値）により測定される。
本明細書において使用される場合、「空腹時血中グルコースレベル」または「ＦＢＧＬ」という用語は、食餌が投与されない期間の終了時かつインスリン−Ｆｃ融合タンパク質が投与される時点の直前における標的対象における平均血中グルコースレベルを指す。本明細書において使用される場合、「空腹時血中グルコースレベルのパーセント」、「空腹時血中グルコースレベルの％」、または「ＦＢＧＬ％」という用語は、空腹時血中グルコースレベルに対する所与の血中グルコースレベルの比に１００を掛けたものを指す。
本明細書において使用される場合、「免疫原性の」または「免疫原性」という用語は、所与の分子（例えば、本発明のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質）の繰返しの投与後に、対象が該分子に特異的に結合することができる抗体（すなわち、抗薬物抗体）を発生させるように標的対象の免疫系を惹起する該分子の能力を指す。本明細書において使用される場合、「中和する」、「中和抗体」、または「中和抗薬物抗体」という用語は、標的対象中の化合物の生物学的活性に干渉する抗体の能力を指す。本明細書において使用される場合、「免疫原性エピトープ」、「免疫原性ホットスポット」、または「ホットスポット」という用語は、抗薬物抗体の中等度のまたは強い結合の原因となる所与の分子（例えば、本発明のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質）の突然変異またはエピトープを指す。
本明細書において使用される場合、「インスリン参照標準」という用語は、（ｉ）哺乳動物（例えば、ヒト、イヌ、またはネコ）からの天然に存在するインスリン、（ｉｉ）Ｆｃ断片を含まないインスリンポリペプチド、または（ｉｉｉ）標準治療用インスリン（例えば、商業的に入手可能なインスリン）のうちのいずれか１つである。
本明細書において使用される場合、「単量体」という用語は、単一のポリペプチドを含むタンパク質または融合タンパク質を指す。実施形態では、「単量体」は、インスリンポリペプチドおよびＦｃ断片ポリペプチドを含むタンパク質または融合タンパク質、例えば、単一のポリペプチドであって、インスリンおよびＦｃ断片ポリペプチドがペプチド結合により接合されて単一のポリペプチドを形成したものである。実施形態では、単量体は単一の核酸分子によりコードされる。
本明細書において使用される場合、「Ｎ末端」は、アミノ酸のアルファ−アミノ基（例えば、第２の炭素原子に隣接して位置する１個の炭素原子に共有結合的に連結しており、第２の炭素原子がアミノ酸のカルボニル基の部分である、遊離アミノ）である遊離アミン基を含有するアミノ酸により開始されるタンパク質またはポリペプチドの開始を指す。本明細書において使用される場合、「Ｃ末端」は、カルボン酸基を含有するアミノ酸により終了し、カルボン酸基の炭素原子がアミノ酸のアルファ−アミノ基に隣接して位置する、タンパク質またはポリペプチドの末端を指す。
本明細書において使用される場合、「薬力学」または「ＰＤ」は、一般に、対象におけるインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の生物学的効果を指す。特に、本明細書においてＰＤは、インスリン−Ｆｃ融合タンパク質の投与後の対象における経時的な空腹時血中グルコースレベルにおける低減の度合を指す。
本明細書において使用される場合、「薬物動態」または「ＰＫ」は、一般に、その吸収、分布、代謝、および排出の点でのインスリン−Ｆｃ融合タンパク質と対象の身体との特徴的な相互作用を指す。特に、本明細書においてＰＫは、インスリン−Ｆｃ融合タンパク質の投与後の所与の時点における対象の血液または血清中のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の濃度を指す。本明細書において使用される場合、「半減期」は、薬物排除のための１次指数減衰モデルから算出されるような、対象の血液または血清中のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の濃度がその元々の値の半分に達するためにかかる時間を指す。より大きい「半減期」値を有するインスリン−Ｆｃ融合タンパク質は、標的対象において作用のより長い継続期間を実証する。
アミノ酸またはヌクレオチド配列における「配列同一性」、「配列相同性」、「相同性」または「同一の」という用語は、本明細書において使用される場合、変種のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の指定された連続するセグメントが参照配列のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列に対してアライメントおよび比較された場合に、同じヌクレオチドまたはアミノ酸残基が変種および参照配列内に見出されることを記載する。配列アライメントおよび配列間の同一性を決定する方法は当該技術分野において公知であり、これには、類似性のために配列をオーガナイズし、アライメントし、かつ比較するＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ（該ソフトウェアは、各配列位置をハイライトし、その位置において全ての配列にわたり比較して以下のスコアのうちの１つを割り当てる：「＊」（アステリスク）は単一の完全に保存された残基を有する配列位置のためであり、「：」（コロン）は、Ｇｏｎｎｅｔ ＰＡＭ ２５０マトリックスにおいて０．５より高いスコア付けを有する強く類似した特性の群間の保存を指し示し、「．」（ピリオド）はＧｏｎｎｅｔ ＰＡＭ ２５０マトリックスにおいて０．５より低いまたはそれに等しいスコア付けを有する弱く類似した特性の群間の保存を指し示し、「−」（ダッシュ）は、配列ギャップ、すなわち、局所的な相同性が配列のある特定の範囲内の比較の具体的なセット内に存在しないことを指し示し、空白スペース「 」は、比較された配列にわたりその具体的な位置について配列相同性がほとんどまたは全くないことを指し示す。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ． （１９９５） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｃｈａｐｔｅｒ １９ （Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ− Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照）、およびＡＬＩＧＮプログラム（Ｄａｙｈｏｆｆ （１９７８）， Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ５： Ｓｕｐｐｌ． ３ （Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ．））の使用が含まれる。２つのヌクレオチド配列の最適なアライメントに関して、変種ヌクレオチド配列の連続するセグメントは、参照ヌクレオチド配列に関して追加のヌクレオチドまたは欠失したヌクレオチドを有してもよい。同様に、２つのアミノ酸配列の最適なアライメントの目的のために、変種アミノ酸配列の連続するセグメントは、参照アミノ酸配列に関して追加のアミノ酸残基または欠失したアミノ酸残基を有してもよい。一部の実施形態では、参照ヌクレオチド配列または参照アミノ酸配列に対する比較のために使用される連続するセグメントは、少なくとも６、１０、１５、または２０個の連続するヌクレオチド、またはアミノ酸残基を含み、３０、４０、５０、１００、またはより多くのヌクレオチドまたはアミノ酸残基であってもよい。変種のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列中にギャップを含めることと関連付けられる増加した配列同一性の訂正は、ギャップペナルティを割り当てることにより行うことができる。配列アライメントの方法は当該技術分野において公知である。
実施形態では、２つの配列間の同一性パーセントまたは「相同性」の決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成される。例えば、アミノ酸配列の同一性パーセントは、１２のギャップオープンペナルティおよび２のギャップ伸長ペナルティ、ＢＬＯＳＵＭマトリックス６２を用いてａｆｆｉｎｅ ６ギャップ検索を使用してＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムを使用して決定される。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ （１９８１） Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ ２：４８２−４８９（参照により本明細書に組み込まれる）において記載されている。実施形態では、ヌクレオチド配列の同一性パーセントは、２５のギャップオープンペナルティおよび５のギャップ伸長ペナルティを使用してＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムを使用して決定される。配列同一性のそのような決定は、例えば、ＴｉｍｅＬｏｇｉｃのＤｅＣｙｐｈｅｒ Ｈａｒｄｗａｒｅ Ａｃｃｅｌｅｒａｔｏｒを使用して行うことができる。
本明細書において使用される場合、「相同性」という用語は、例えば、ベータ鎖、ヘリックス、およびフォールドの、共通の構造的特徴および共通の空間分布を位置付けることにより２つまたはより多くのタンパク質を比較するために使用される。よって、相同のタンパク質構造は空間解析により定義される。構造的相同性の測定は、空間の幾何学的−位相幾何学的特徴を計算することを伴う。三次元（３Ｄ）タンパク質構造を生成および解析するために使用される１つのアプローチは相同性モデリング（比較モデリングまたは知識ベースモデリングとも呼ばれる）であり、これは、３Ｄ類似性は２Ｄ類似性を反映するという事実に基づいて類似した配列を見出すことにより機能する。相同的構造は、配列類似性を必要条件として含意しない。
本明細書において使用される場合、「対象」および「患者」という用語は、イヌ科動物およびネコ科動物を含むことが意図される。例示的なイヌ科動物およびネコ科動物対象としては、疾患もしくは障害、例えば、糖尿病もしくは本明細書に記載の別の疾患もしくは障害を有するイヌおよびネコ、または正常な対象が挙げられる。
本明細書において使用される場合、「タイター」または「収率」という用語は、細胞培養物の体積当たりの生合成（例えば、哺乳動物細胞中、例えば、ＨＥＫ２９３細胞またはＣＨＯ細胞中）の結果としてもたらされる融合タンパク質製造物（例えば、本明細書に記載のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質）の量を指す。製造物の量は、製造プロセスの任意のステップ（例えば、精製の前または後）において決定されてもよいが、収率またはタイターは常に元々の細胞培養物の体積当たりで記載される。本明細書において使用される場合、「製造物収率」または「総タンパク質収率」という用語は、細胞により発現され、かつ少なくとも１つのアフィニティークロマトグラフィーステップ（例えば、プロテインＡまたはプロテインＧ）を介して精製されたインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の総量を指し、インスリン−Ｆｃ融合タンパク質の単量体、インスリン−Ｆｃ融合タンパク質のホモ二量体、およびインスリン−Ｆｃ融合タンパク質のホモ二量体のより高次の分子凝集物を含む。本明細書において使用される場合、「ホモ二量体パーセント」または「ホモ二量体％」という用語は、所望のホモ二量体である融合タンパク質製造物（例えば、本明細書に記載のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質）の割合を指す。本明細書において使用される場合、「ホモ二量体タイター」という用語は、細胞培養物の体積当たりで報告されるプロテインＡ精製ステップ後のホモ二量体％および総タンパク質収率の積を指す。
本明細書において使用される場合、疾患または障害を有する対象を「治療する」（ｔｒｅａｔ）または「治療する」（ｔｒｅａｔｉｎｇ）という用語は、疾患または障害の少なくとも１つの症状が、治癒され、治され、和らげられ、緩和され、変更され、矯められ（ｒｅｍｅｄｉｅｄ）、寛解され、または改善されるように、対象をレジメン、例えば、本明細書に記載の融合タンパク質などの融合タンパク質の投与に供することを指す。治療することは、疾患もしくは障害、または疾患もしくは障害の症状を和らげ、緩和し、変更し、矯め、寛解させ、改善しまたはそれに影響するために有効な量を投与することを含む。治療は、疾患または障害の症状の増悪または悪化を阻害してもよい。
インスリン−Ｆｃ融合タンパク質の成分および構造
本開示は、ペプチドリンカーを介して種特異的Ｆｃ断片に連結したインスリンポリペプチドを含む融合タンパク質（すなわち、インスリン−Ｆｃ融合タンパク質）の組成物、および伴侶動物（例えば、イヌまたはネコ）において糖尿病を治療するためのその使用に関する。本明細書において使用される場合、「融合タンパク質」および「インスリン−Ｆｃ融合タンパク質」という用語は、ペプチド結合を通じて共有結合的に連結した、例えば異なる供給源（異なるタンパク質、ポリペプチド、細胞など）からの、１つより多くの部分を含むタンパク質を指す。インスリン−Ｆｃ融合タンパク質は、（ｉ）各部分をコードする遺伝子を接続して単一の核酸分子とすることおよび（ｉｉ）宿主細胞（例えば、ＨＥＫまたはＣＨＯ）中で以下：（Ｎ末端）−−インスリンポリペプチド−−リンカー−−Ｆｃ断片−−（Ｃ末端）のように核酸分子がコードするタンパク質を発現させることにより共有結合的に連結している。完全に組換え合成のアプローチは、インスリンポリペプチドおよびＦｃ断片が別々に合成され、次に化学的に共役される方法よりも好ましい。化学的共役ステップおよびその後の精製プロセスは、生産の複雑性を増加させ、製造物収率を低減し、かつコストを増加させる。
本明細書において使用される場合、「二量体」という用語は、共有結合的に連結した２つのポリペプチドを含むタンパク質または融合タンパク質を指す。実施形態では、２つの同一のポリペプチドが共有結合的（例えば、ジスルフィド結合を介して）に連結されて「ホモ二量体」（図１において図式的に表される）が形成される。ジスルフィド結合は図１において点線として示され、現実のジスルフィド結合の総数は、図１に示される数より多いまたは少なくてもよい。実施形態では、ホモ二量体は単一の核酸分子によりコードされ、ホモ二量体は、最初にインスリン−Ｆｃ融合タンパク質単量体を形成すること、次に細胞の内部でのさらなるプロセシングにより２つの同一のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質単量体をホモ二量体に集合させることにより細胞の内部で組換えにより作られる。
本明細書において使用される場合、「多量体」、「多量体の」、または「多量体状態」という用語は、Ｆｃ融合タンパク質二量体と平衡状態であってもよい、またはＦｃ融合タンパク質二量体の永久的に凝集したバージョン（例えば、Ｆｃ融合タンパク質ホモ二量体の二量体、Ｆｃ融合タンパク質ホモ二量体の三量体、Ｆｃ融合タンパク質ホモ二量体の四量体、または５つもしくはより多くのＦｃ融合タンパク質ホモ二量体を含有するより高次の凝集物）として作用してもよい、Ｆｃ融合タンパク質二量体の非共有結合性の会合した形態を指す。Ｆｃ融合タンパク質の多量体形態は、インスリン−Ｆｃ融合タンパク質ホモ二量体とは異なる物理的、安定性、または薬理学的活性を有してもよいことが予期され得る。
インスリンポリペプチド
インスリンポリペプチドは、例えば、膵臓内のランゲルハンスの膵島中のβ細胞により産生されるインスリンまたはインスリンアナログであってもよい。インスリンは、血液からのグルコースの吸収を調節することにより機能する。タンパク質およびグルコースレベルの増加などで刺激されると、インスリンはβ細胞から放出されてインスリン受容体（ＩＲ）に結合し、哺乳動物（例えば、ヒト、イヌ科動物、またはネコ科動物）代謝の多くの態様に影響するシグナルカスケードを開始させる。このプロセスの妨害は、いくつかの疾患、特に、糖尿病、インスリノーマ、インスリン抵抗性、メタボリックシンドローム、および多嚢胞性卵巣症候群に直接的に関する。本開示のインスリンアナログは、インスリンの構造に関し得るが、１つまたはより多くの改変を含有してもよい。一部の実施形態では、インスリンアナログは、インスリン−Ｆｃ融合タンパク質の具体的な特色または特徴に影響し得る、インスリンと比べた少なくとも１つのアミノ酸置換、欠失、付加または化学修飾を含む。例えば、本明細書に記載の改変または変更は、参照標準と比べたインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の構造、安定性、ｐＨ感受性、生物活性、または細胞表面受容体（例えば、インスリンホルモン受容体）への結合親和性に影響してもよい。
インスリンのアミノ酸配列は、具体的には脊椎動物において、進化を通じて強く保存されている。例えば、天然のイヌ科動物インスリンはヒトインスリンから１アミノ酸のみ異なり、天然のネコ科動物インスリンはヒトインスリンから４アミノ酸のみ異なる。本明細書において使用される場合、「Ｂ鎖」、「Ｃペプチド」または「Ｃ鎖」、および「Ａ鎖」という用語は、図１に示されるようなインスリンポリペプチドのペプチドセグメントを指す。インスリンは、ジスルフィド結合（例えば、１つまたはより多くのＢ鎖システイン側鎖チオールおよび１つまたはより多くのＡ鎖システイン側鎖チオールにより形成されるジスルフィド結合）を介して接続された２つのペプチド鎖（すなわち、Ｂ鎖およびＡ鎖）を含有する５１アミノ酸のホルモンである。インスリンのＡ鎖は２１アミノ酸の長さであり、インスリンのＢ鎖は３０アミノ酸の長さである。インスリンの天然の形態において、Ａ鎖は、２つのＡ鎖システイン側鎖チオールにより形成される１つの鎖内ジスルフィド結合を含有する。参照の目的のために、配列番号１のヒトインスリンＡ鎖および配列番号２のヒトインスリンＢ鎖の配列を以下に示す：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴ（配列番号１）
ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ（配列番号２）
本明細書において使用される場合、「インスリン」または「インスリンポリペプチド」という用語は、成熟したインスリン、プレプロインスリン、プロインスリン、および天然に存在するインスリン、またはこれらのアナログを包含する。実施形態では、インスリンポリペプチドは全長インスリンポリペプチドまたはその断片であることができる。実施形態では、インスリンポリペプチドは、成熟したインスリン、プレプロインスリン、プロインスリン、または天然に存在するインスリンからの１つまたはより多くの断片を含むことができる。
インスリンは、通常、Ｎ末端−−Ｂ鎖：Ｃ鎖：Ａ鎖−−Ｃ末端ポリペプチドとして構築され、Ｃ鎖は、生物活性となるために切断される。参照目的のために、Ｃ鎖を含むヒトインスリン分子全体（すなわち、ヒトプロインスリン）の配列をＣ鎖に下線を引いて以下に示す：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴＲＲＥＡＥＤＬＱＶＧＱＶＥＬＧＧＧＰＧＡＧＳＬＱＰＬＡＬＥＧＳＬＱＫＲＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ（配列番号３）
一本鎖インスリンポリペプチドの生物活性の２鎖ポリペプチドへの変換は、通常、２つのエンドプロテアーゼ、Ｉ型エンドプロテアーゼ、Ｃペプチド−Ｂ鎖接続を妨害するＰＣ１およびＰＣ３、およびＰＣ２、ならびに正確に正しい部位においてＣペプチド−Ａ鎖結合を切断するＩＩ型エンドプロテアーゼによりグルコース刺激性のインスリン分泌の前にランゲルハンスの膵島のβ細胞内で達成される。しかしながら、インスリンなどの治療用分子の生合成のために使用される細胞システム（例えば、細菌、酵母、および哺乳動物（例えば、ＨＥＫおよびＣＨＯ）細胞システム）はこの経路を持たず、したがって、変換は、化学的または酵素的方法を使用して単鎖ポリペプチドの発現および回収後に行われなければならない。発現および回収後にＣ鎖を切断するための全ての公知の技術は、Ａ鎖のＮ末端の直前のリジンにおいて終了するようにＣ鎖を最初に改変することに依拠する。次に、リジン残基のＣ末端において特異的にペプチド結合をクリップするトリプシンまたはＬｙｓ−Ｃファミリーから選択される酵素を使用して、単鎖インスリンポリペプチドは、Ｃ鎖のＣ末端リジンおよびＢ鎖のＮ末端から２９番目の位置におけるＣ末端リジンにおいて切断される。一部の場合には、結果としてもたらされる生物活性の２鎖インスリンは、Ｂ鎖のＮ末端から３０番目の位置においてクリップされたアミノ酸を再取付けすることなく使用され、一部の場合には、Ｂ鎖のＮ末端から３０番目の位置においてクリップされたアミノ酸は、追加の酵素的方法を使用して分子に再び付加される。そのようなプロセスはインスリンでよく機能し、その理由は、それはその２鎖ポリペプチド形態全体に１つのリジンのみを含有するからである。しかしながら、このプロセスは、本明細書において含有されるインスリン−Ｆｃ融合タンパク質において使用することはできず、その理由は、全ての公知のＦｃ断片は複数のリジン残基を含有するからである。酵素切断プロセスは、したがって、Ｆｃ断片を非機能的部分に消化し、それにより、インビボでインスリンポリペプチドの作用を長期化させるＦｃ断片の能力を排除することになる。したがって、本発明のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質は、Ｃ鎖切断を要求せず、したがってその単鎖形態において生物活性であるインスリンポリペプチドを含まなければならない。
多数の生物活性の単鎖インスリンポリペプチドが当該技術分野において記載されてきた。全ての場合に、単鎖インスリンポリペプチドは、特定の長さおよび組成のＣ鎖の他に、静電バランスを達成し、凝集を予防し、かつインスリン受容体（ＩＲ）結合および／または下流のシグナル伝達を増進して天然の２鎖インスリンと同等のレベルにおいて生物活性を達成するために特定のアミノ酸部位において突然変異したＡ鎖およびＢ鎖を含有する。本明細書において、ペプチドセグメント上の突然変異の位置は、セグメントの名称（例えば、Ｂ鎖、Ｃ鎖、Ａ鎖）およびセグメントのＮ末端からカウントしたアミノ酸の数を使用して記される。例えば、「Ｂ１６」という表記は、Ｂ鎖のアミノ酸配列のＮ末端から１６番目のアミノ酸を指す。「Ａ８」という表記は、Ａ鎖のＮ末端から８番目のアミノ酸を指す。さらには、アミノ酸が具体的な位置においてその天然の形態から新たなアミノ酸へと突然変異している場合、その位置には新たなアミノ酸のための１文字アミノ酸コードが付記される。例えば、Ｂ１６Ａは、Ｂ鎖のアミノ酸配列のＮ末端から１６番目のアミノ酸におけるアラニン突然変異を指し、Ａ８Ｈは、Ａ鎖のアミノ酸配列のＮ末端から８番目のアミノ酸におけるヒスチジン突然変異を指す。
一例では、配列ＧＧＧＰＲＲのＣ鎖ならびにＡ鎖およびＢ鎖における追加の置換を有する単鎖インスリンアナログ（配列番号４）がＴｈｅ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｃａｓｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ ｔｈｅ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｈｉｃａｇｏにより開発された（Ｈｕａ， Ｑ．−ｘ， Ｎａｋａｇａｗａ， Ｓ． Ｈ．， Ｊｉａ， Ｗ．， Ｈｕａｎｇ， Ｋ．， Ｐｈｉｌｌｉｐｓ， Ｎ． Ｂ．， Ｈｕ， Ｓ．−ｑ．， Ｗｅｉｓｓ， Ｍ． Ａ．， （２００８） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ Ｖｏｌ． ２８３， Ｎｏ． ２１ ｐｐ １４７０３−１４７１６を参照）。この例では、Ａ鎖の位置８（すなわち、Ａ８）においてヒスチジンはスレオニンを置換しており、Ｂ鎖の位置１０（すなわち、Ｂ１０）においてアスパラギン酸はヒスチジンを置換しており、Ｂ鎖の位置２８（すなわち、Ｂ２８）においてアスパラギン酸はプロリンを置換しており、かつＢ鎖の位置２９（すなわち、Ｂ２９）においてプロリンはリジンを置換している。各非天然アミノ酸に下線を引いて配列番号４を以下に列記する：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＤＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＤＰＴＧＧＧＰＲＲＧＩＶＥＱＣＣＨＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ（配列番号４）
実施形態では、アラニンは、配列番号４におけるＢ鎖のＮ末端から位置１６（すなわち、Ｂ１６）においてチロシンを置換して配列番号５を生成してもよく、この位置におけるアラニン置換はインスリン特異的Ｔ細胞を活性化させる能力がより低いことが公知である（Ａｌｌｅｖａ， Ｄ．Ｇ．， Ｇａｕｒ， Ａ．， Ｊｉｎ， Ｌ．， Ｗｅｇｍａｎｎ， Ｄ．， Ｇｏｔｔｌｉｅｂ， Ｐ．Ａ．， Ｐａｈｕｊａ， Ａ．， Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｅ．Ｂ．， Ｍｏｔｈｅｒａｌ， Ｔ．， Ｐｕｔｎａｍ， Ａ．， Ｃｒｏｗｅ， Ｐ．Ｄ．， Ｌｉｎｇ， Ｎ．， Ｂｏｅｈｍｅ， Ｓ．Ａ．， Ｃｏｎｌｏｎ， Ｐ．Ｊ．， （２００２） Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｖｏｌ． ５１， Ｎｏ． ７ ｐｐ ２１２６−２１３４）。各非天然アミノ酸に下線を引いて配列番号５を以下に列記する：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＤＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＤＰＴＧＧＧＰＲＲＧＩＶＥＱＣＣＨＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ（配列番号５）
一部の実施形態では、予想外なことに、配列番号４および配列番号５における特定のアミノ酸は、標的動物（例えば、イヌまたはネコ）における繰返しの皮下注射後に中和抗薬物抗体の発生に繋がることが発見された。抗薬物抗体は、複数の注射後のＮＡＯＣにおける許容できない低減（例えば、０．５未満の３回目の注射後のＮＡＯＣＲ値）に繋がり、関連付けられるインスリン−Ｆｃ融合タンパク質を実行不可能なものとした。特に、ヒスチジンへのＡ８突然変異およびアスパラギン酸へのＢ１０突然変異は抗薬物抗体の特異性の大部分を説明し、そのためインスリン−ポリペプチド上の免疫原性「ホットスポット」（例えば、免疫原性エピトープ）を表すことが本開示の発明に繋がるステップにおいて発見された。したがって、好ましい実施形態では、インスリン−ポリペプチドは、インスリンポリペプチドの位置Ａ８におけるヒスチジンまたは位置Ｂ１０におけるアスパラギン酸を含有しない。
一実施形態では、Ａ８およびＢ１０アミノ酸をそれらの天然のそれぞれスレオニンおよびヒスチジンとして単純に保つことは抗薬物抗体応答を排除し、結果としてもたらされるインスリン−Ｆｃ融合タンパク質は標的種において生物活性ではない（例えば、ＮＡＯＣは１５０ＦＢＧＬ％・日・ｋｇ／ｍｇ未満である）ことが確認された。したがって、好適な解決策を見出すために様々なＡ鎖、Ｂ鎖、およびＣ鎖のバリエーションを用いて実験を行うことが必要であった。ほとんどの変種は５０ｍｇ／Ｌより高いホモ二量体タイターを達成せず、それらの目的を満たしたものの多くは標的種における許容されるレベルの生物活性（例えば、１５０ＦＢＧＬ％・日・ｋｇ／ｍｇより高い許容されるＮＡＯＣ値）に達しなかった。１２０を超える変種をスクリーニングし、配列番号６＿ＮＵＬＬの以下のインスリンポリペプチドを、５０ｍｇ／Ｌより高いホモ二量体タイター、１５０ＦＢＧＬ％・日・ｋｇ／ｍｇより高い標的種におけるＮＡＯＣ値、最小の免疫原性、および関連付けられるインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の０．５より高い標的種における３回目の注射後のＮＡＯＣＲ値の達成に関して好適であるとみなした（非天然アミノ酸に下線を引き、欠失した天然アミノ酸を下線を引いたＺを用いて表す）：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＸ １ ＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＺＺＺＺＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＸ ２ ＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＸ ３ （配列番号６＿ＮＵＬＬ）
（Ｘ１はＤではなく、Ｘ２はＨではなく、かつＸ３は存在しないまたはＮである）。
特定の実施形態では、配列番号６＿ＮＵＬＬにおいて、Ｘ１はＨであり、Ｘ２はＴであり、かつＸ３は存在しないまたはＮであり、これは以下の配列番号７＿ＮＵＬＬ（非天然アミノ酸に下線を引き、欠失した天然アミノ酸を下線を引いたＺを用いて表す）を結果としてもたらす：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＺＺＺＺＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＸ ３ （配列番号７＿ＮＵＬＬ）
（Ｘ３は存在しないまたはＮである）。
特定の実施形態では、配列番号７＿ＮＵＬＬにおいて、Ｘ３は存在せず、これは以下の配列番号８＿ＮＵＬＬ（非天然アミノ酸に下線を引き、欠失した天然アミノ酸を下線を引いたＺを用いて表す）を結果としてもたらす：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＺＺＺＺＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＺ（配列番号８＿ＮＵＬＬ）
特定の実施形態では、配列番号７＿ＮＵＬＬにおいて、Ｘ３はＮであり、これは以下の配列番号９＿ＮＵＬＬ（非天然アミノ酸に下線を引き、欠失した天然アミノ酸を下線を引いたＺを用いて表す）を結果としてもたらす：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＺＺＺＺＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＮ（配列番号９＿ＮＵＬＬ）
一部の実施形態では、合成の間のグリコシル化を予防しかつ標的動物（例えば、イヌまたはネコ）における結果としてもたらされるインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の免疫原性を潜在的に低減するためにＦｃ断片を突然変異させた。予想外なことに、１５０ＦＢＧＬ％・日・ｋｇ／ｍｇより高い標的種におけるＮＡＯＣ値および０．５より高い標的種における３回目の注射後のＮＡＯＣＲ値と共にインスリン−Ｆｃ融合タンパク質を十分に生産可能（例えば、５０ｍｇ／Ｌより高いホモ二量体タイターを有する）かつ非免疫原性とするためにさらに別のアミノ酸突然変異がインスリンポリペプチドに要求されるようなインスリンポリペプチドと突然変異したＦｃ断片との間の相互作用があることが発見された。特に、特定の、突然変異した、非グリコシル化Ｆｃ断片に連結された場合に、インスリンポリペプチド上のＢ１６アミノ酸をアラニンに突然変異させることが要求されることが発見され、これは以下のインスリンポリペプチド配列番号１０＿ＮＵＬＬ（非天然アミノ酸に下線を引き、欠失した天然アミノ酸を下線を引いたＺを用いて表す）を結果としてもたらした：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＸ １ ＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＺＺＺＺＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＸ ２ ＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＺ（配列番号１０＿ＮＵＬＬ）
（Ｘ１はＤではなく、かつＸ２はＨではない）。
特定の実施形態では、配列番号１０＿ＮＵＬＬにおいて、Ｘ１はＨであり、かつＸ２はＴであり、これは以下の配列番号１１＿ＮＵＬＬ（非天然アミノ酸に下線を引き、欠失した天然アミノ酸を下線を引いたＺを用いて表す）を結果としてもたらす：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＺＺＺＺＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＺ − 配列番号１１＿ＮＵＬＬ
以下は、上記に示される配列を再記載したものであるが、インスリンポリペプチド配列の表記から存在しない記号Ｚのアミノ酸が除去されている。ここでもまた、全ての場合において非天然アミノ酸に下線を引いている。混乱を回避するために、Ｚ記号を含有する各元々の配列を、Ｚ記号を除去した新たな配列の上に列記している。２つの別々の表記にもかかわらず、対となる配列は正確に同じインスリンポリペプチドを指す。
配列番号６＿ＮＵＬＬは以下の通りに再記載される：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＸ １ ＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＸ ２ ＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＸ ３
（配列番号６）
（Ｘ１はＤではなく、Ｘ２はＨではなく、かつＸ３は存在しないまたはＮである）。
配列番号７＿ＮＵＬＬは以下の通りに再記載される：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＸ ３
（配列番号７）
（Ｘ３は存在しないまたはＮである）。
配列番号８＿ＮＵＬＬは以下の通りに再記載される：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣ
（配列番号８）
配列番号９＿ＮＵＬＬは以下の通りに再記載される：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＮ
（配列番号９）
配列番号１０＿ＮＵＬＬは以下の通りに再記載される：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＸ １ ＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＸ ２ ＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣ
（配列番号１０）
（Ｘ１はＤではなく、かつＸ２はＨではない）。
配列番号１１＿ＮＵＬＬは以下の通りに再記載される：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣ
（配列番号１１）
リンカー
組換えにより作られるインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の構築の成功は、インスリンポリペプチドをＦｃ断片に接続するリンカーを要求する。実施形態では、本明細書に記載のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質は、アミノ酸（例えば、天然または非天然アミノ酸）を含むペプチドインスリンポリペプチドとＦｃ断片との間のリンカーを含む。実施形態では、ペプチドリンカーは核酸分子によりコードされることができ、例えば、単一の核酸分子は、インスリンポリペプチド内の様々なペプチドの他に、ペプチドリンカーおよびＦｃ断片をコードすることができる。ペプチドリンカーの選択（例えば、長さ、組成、疎水性、および二次構造）は、インスリン−Ｆｃ融合タンパク質の生産可能性（すなわち、ホモ二量体タイター）、化学的および酵素安定性、生物活性（すなわち、ＮＡＯＣ値）、ならびに免疫原性に影響し得る（Ｃｈｅｎ， Ｘ．， Ｚａｒｏ， Ｊ．， Ｓｈｅｎ， Ｗ．Ｃ．， Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ． ２０１３ Ｏｃｔｏｂｅｒ １５； ６５（１０）： １３５７−１３６９）。表１は、ホモ二量体タイターおよび生物活性を向上させることを目標としてインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の設計において使用されるいくつかのリンカーを列記する。
Figure 2021530210
実施形態では、ペプチドリンカーは配列：
ＧＧＧＧＡＧＧＧＧ（配列番号１２）
を含む。
他の実施形態では、ペプチドリンカーは配列：
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１３）
を含む。
好ましい実施形態では、ペプチドリンカーは配列：
ＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧ（配列番号１４）
を含む。
配列番号１４のもののようなペプチドリンカーを有する組換えにより作られるインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の構築において、インスリンＡ鎖のＣ末端とペプチドリンカーのＮ末端との間の望ましくない酵素切断の可能性に注意しなければならない。インスリンポリペプチドからのリンカーおよびＦｃ断片の切断は、インスリン−Ｆｃ融合タンパク質を、生物活性の延長された継続期間を提供することができないものとする。公知の酵素切断部位がアスパラギン−グリシン結合の間に存在する（Ｖｌａｓａｋ， Ｊ．， Ｉｏｎｅｓｃｕ， Ｒ．， （２０１１） ＭＡｂｓ Ｖｏｌ． ３， Ｎｏ． ３ ｐｐ ２５３−２６３）。配列番号１４の好ましいペプチドリンカーを含む、多くのペプチドリンカーの実施形態において、Ｎ末端アミノ酸はグリシンである。さらには、インスリンＡ鎖のＣ末端、すなわち、（Ａ鎖のＮ末端から２１番目のアミノ酸（すなわち、Ａ２１））はアスパラギンである。したがって、Ａ２１アスパラギンは、Ａ鎖とペプチドリンカーとの間に形成される潜在的に酵素切断可能なアスパラギン−グリシン結合を排除するために配列番号８、配列番号１０、および配列番号１１のインスリンポリペプチドにおいて省略される。予想外なことに、Ａ鎖のＣ末端におけるアスパラギンを保持する配列番号９のインスリンポリペプチドから構築されるインスリン−Ｆｃ融合タンパク質は、許容されるホモ二量体タイター（すなわち、５０ｍｇ／Ｌより高いホモ二量体タイター）、インビボでの許容される生物活性（すなわち、標的動物における１５０ＦＢＧＬ％・日・ｋｇ／ｍｇより高いＮＡＯＣ）、および複数回の投薬後の生物活性の持続的なレベル（すなわち、０．５より高い標的動物における３回目の注射後のＮＡＯＣＲ値）を伴う哺乳動物細胞中での生産可能性を実証する。先行する教示に基づいて予測されるものとは反対に、少なくとも本明細書に開示されるＦｃ断片配列を含むインスリン−Ｆｃ融合タンパク質について、インスリンポリペプチドとペプチドリンカーとの間にアスパラギン−グリシン連結を含有するインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の酵素切断または失活のリスクがないことをこの結果は指し示す。
Ｆｃ断片
「Ｆｃ断片」、「Ｆｃ領域」、「Ｆｃドメイン」、または「Ｆｃポリペプチド」という用語は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために本明細書において使用される。Ｆｃ断片、領域、ドメインまたはポリペプチドは、天然配列Ｆｃ領域または変種／突然変異体Ｆｃ領域であってもよい。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変動し得るが、それらは、一般に、重鎖のヒンジ領域、重鎖のＣＨ２領域、および重鎖のＣＨ３領域の一部または全体を含む。イヌ科動物またはネコ科動物Ｆｃ断片のヒンジ領域は、重鎖のＣＨ１ドメインを重鎖のＣＨ２領域に接続するアミノ酸配列を含み、かつＦｃ融合タンパク質の２つの同一であるが別々の単量体からＦｃ融合タンパク質のホモ二量体を形成するために１つまたはより多くの重鎖間ジスルフィドブリッジを形成する１つまたはより多くのシステインを含有する。ヒンジ領域は、天然に存在するアミノ酸配列または天然に存在しないアミノ酸配列の全体または部分を含んでもよい。
Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）は、Ｆｃ断片または抗体のＦｃ領域に結合する受容体を指す。実施形態では、ＦｃＲはイヌ科動物またはネコ科動物ＦｃＲの天然配列である。実施形態では、ＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマ受容体）のＦｃ断片またはＦｃ領域に結合するものであり、これには、以下の受容体のアレル変種および選択的にスプライシングされた形態を含めて、Ｆｃ（ガンマ）受容体Ｉ、Ｆｃ（ガンマ）受容体ＩＩａ、Ｆｃ（ガンマ）受容体ＩＩｂ、およびＦｃ（ガンマ）受容体ＩＩＩサブクラスの受容体が含まれるがそれに限定されない。「ＦｃＲ」としてはまた新生児受容体、ＦｃＲｎが挙げられ、これは母系ＩｇＧ分子の胎児への移動の原因となり（Ｇｕｙｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９７６ Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １１７：５８７； ａｎｄ Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ２４：２４９）、インビボでの抗体およびＦｃ融合タンパク質のインビボ排出半減期の長期化の原因にもなる。実施形態では、イヌ科動物またはネコ科動物起源のＦｃ断片を含むインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の結合を測定してそれらのＦｃＲ結合特性を査定するためにヒト起源のＦｃＲがｉｎ ｖｉｔｒｏで（例えば、アッセイにおいて）使用される。１つの種からの哺乳動物ＦｃＲ（例えば、ヒト起源のＦｃＲ）は第２の種からのＦｃ断片（例えば、イヌ科動物またはネコ科動物起源のＦｃＲ）にインビトロで結合できる場合があることを当業者は理解する。実施形態では、イヌ科動物またはネコ科動物の両方の起源のＦｃ断片を含むインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の結合を測定してそれらのＦｃＲ結合特性を査定するためにイヌ科動物起源のＦｃＲがｉｎ ｖｉｔｒｏで（例えば、アッセイにおいて）使用される。１つの種からの哺乳動物ＦｃＲ（例えば、イヌ科動物起源のＦｃＲ）は同じ種からのＦｃ断片（例えば、イヌ科動物起源）を含むインスリン−Ｆｃ融合タンパク質にインビトロで結合することができ、かつ別の哺乳動物種を起源とするＦｃ断片（例えば、ネコ科動物起源）を含むインスリン−Ｆｃ融合タンパク質にもインビトロで結合できる場合があることを当業者は理解する。
実施形態では、Ｆｃ断片は、哺乳動物ＩｇＧのＦｃ領域（例えば、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメイン）、例えば、イヌ科動物ＩｇＧＡ Ｆｃ断片（配列番号１５）、イヌ科動物ＩｇＧＢ Ｆｃ断片（配列番号１６）、イヌ科動物ＩｇＧＣ Ｆｃ断片（配列番号１７）、もしくはイヌ科動物ＩｇＧＤ Ｆｃ断片（配列番号１８）またはネコ科動物ＩｇＧ１ａ断片（配列番号１９）、ネコ科動物ＩｇＧ１ｂ Ｆｃ断片（配列番号２０）、もしくはネコ科動物ＩｇＧ２ Ｆｃ断片（配列番号２１）を含む。実施形態では、多くの場合に天然のイヌ科動物またはネコ科動物ＩｇＧアイソタイプＦｃ断片アミノ酸配列中に見出されるＣ末端リジン（すなわち、Ｆｃ断片配列の最後のアミノ酸を表すリジン）は、生産の間の望ましくないアミノ酸配列変種の偶発的な製造を予防するために省略される（例えば、Ｃ末端リジンを含有するＦｃ断片は、Ｃ末端リジンが省略されたＦｃ断片と混合され、これは細胞内での所望のタンパク質の製造の間に起こり得る（Ｄｉｃｋ， ＬＷ．， （２００８） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ． Ａｕｇ １５；１００（６） ｐｐ１１３２−４３）。したがって、実施形態では、Ｃ末端リジンを欠いたイヌ科動物およびネコ科動物Ｆｃ断片配列は、
ＲＣＴＤＴＰＰＣＰＶＰＥＰＬＧＧＰＳＶＬＩＦＰＰＫＰＫＤＩＬＲＩＴＲＴＰＥＶＴＣＶＶＬＤＬＧＲＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＥＶＨＴＡＫＴＱＳＲＥＱＱＦＮＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＥＨＱＤＷＬＴＧＫＥＦＫＣＲＶＮＨＩＤＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＲＡＨＫＰＳＶＹＶＬＰＰＳＰＫＥＬＳＳＳＤＴＶＳＩＴＣＬＩＫＤＦＹＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＲＫＨＲＭＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＱＧＤＰＦＴＣＡＶＭＨＥＴＬＱＮＨＹＴＤＬＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号１５）
ＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＮＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号１６）
ＣＮＮＣＰＣＰＧＣＧＬＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＩＬＶＴＡＲＴＰＴＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＮＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＳＫＱＶＱＴＡＮＴＱＰＲＥＥＱＳＮＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＳＧＫＱＦＫＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＥＩＩＳＫＴＰＧＱＡＨＱＰＮＶＹＶＬＰＰＳＲＤＥＭＳＫＮＴＶＴＬＴＣＬＶＫＤＦＦＰＰＥＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＭＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＩＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号１７）
ＣＩＳＰＣＰＶＰＥＳＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＩＬＲＩＴＲＴＰＥＩＴＣＶＶＬＤＬＧＲＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＥＶＨＴＡＫＴＱＰＲＥＱＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＥＨＱＤＷＬＴＧＫＥＦＫＣＲＶＮＨＩＧＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＰＫＥＬＳＳＳＤＴＶＴＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＥＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＰＥＰＥＳＫＹＨＴＴＡＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＱＧＤＴＦＴＣＡＶＭＨＥＡＬＱＮＨＹＴＤＬＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号１８）
ＤＣＰＫＣＰＰＰＥＭＬＧＧＰＳＩＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＳＩＳＲＴＰＥＶＴＣＬＶＶＤＬＧＰＤＤＳＤＶＱＩＴＷＦＶＤＮＴＱＶＹＴＡＫＴＳＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＬＨＱＤＷＬＫＧＫＥＦＫＣＫＶＮＳＫＳＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＫＧＱＰＨＥＰＱＶＹＶＬＰＰＡＱＥＥＬＳＲＮＫＶＳＶＴＣＬＩＫＳＦＨＰＰＤＩＡＶＥＷＥＩＴＧＱＰＥＰＥＮＮＹＲＴＴＰＰＱＬＤＳＤＧＴＹＦＶＹＳＫＬＳＶＤＲＳＨＷＱＲＧＮＴＹＴＣＳＶＳＨＥＡＬＨＳＨＨＴＱＫＳＬＴＱＳＰＧ（配列番号１９）
ＤＣＰＫＣＰＰＰＥＭＬＧＧＰＳＩＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＳＩＳＲＴＰＥＶＴＣＬＶＶＤＬＧＰＤＤＳＤＶＱＩＴＷＦＶＤＮＴＱＶＹＴＡＫＴＳＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＬＨＱＤＷＬＫＧＫＥＦＫＣＫＶＮＳＫＳＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＤＫＧＱＰＨＥＰＱＶＹＶＬＰＰＡＱＥＥＬＳＲＮＫＶＳＶＴＣＬＩＥＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＩＴＧＱＰＥＰＥＮＮＹＲＴＴＰＰＱＬＤＳＤＧＴＹＦＬＹＳＲＬＳＶＤＲＳＲＷＱＲＧＮＴＹＴＣＳＶＳＨＥＡＬＨＳＨＨＴＱＫＳＬＴＱＳＰＧ（配列番号２０）
ＧＥＧＰＫＣＰＶＰＥＩＰＧＡＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＳＩＳＲＴＰＥＶＴＣＬＶＶＤＬＧＰＤＤＳＮＶＱＩＴＷＦＶＤＮＴＥＭＨＴＡＫＴＲＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＬＨＱＤＷＬＫＧＫＥＦＫＣＫＶＮＳＫＳＬＰＳＡＭＥＲＴＩＳＫＡＫＧＱＰＨＥＰＱＶＹＶＬＰＰＴＱＥＥＬＳＥＮＫＶＳＶＴＣＬＩＫＧＦＨＰＰＤＩＡＶＥＷＥＩＴＧＱＰＥＰＥＮＮＹＱＴＴＰＰＱＬＤＳＤＧＴＹＦＬＹＳＲＬＳＶＤＲＳＨＷＱＲＧＮＴＹＴＣＳＶＳＨＥＡＬＨＳＨＨＴＱＫＳＬＴＱＳＰＧ（配列番号２１）
である。
ヒトＦｃをイヌ科動物ＩｇＧＡで置き換えることは、イヌにおけるＩｇＧＡアイソタイプのＦｃ（ガンマ）エフェクター機能の欠如（ヒトにおけるヒトＩｇＧ２アイソタイプとよく似ている）に起因するイヌにおける任意の望ましくない免疫原性を最小化するために好ましい。しかしながら、配列番号５のインスリンポリペプチドおよび配列番号１２のペプチドリンカーを含有する一実施形態では、予想外なことに、イヌ科動物ＩｇＧＡ断片（配列番号１５）を含むインスリン−Ｆｃ融合タンパク質は、所望のホモ二量体の低いタイター（すなわち、５０ｍｇ／Ｌ未満のホモ二量体タイター）と共に高度に凝集することが発見された。さらには、化合物は、恐らくはその高いレベルの凝集（例えば、低いホモ二量体％）に起因して、イヌにおいて生物活性ではなかった（すなわち、ＮＡＯＣ値は１５０ＦＢＧＬ％・日・ｋｇ／ｍｇ未満であった）。配列番号５のインスリンポリペプチド、イヌ科動物ＩｇＧＡ Ｆｃ断片（配列番号１５）、および／またはリンカーを突然変異させたにもかかわらず、低い十分な程度の凝集および所望のホモ二量体の高い十分なタイターを有するイヌ科動物ＩｇＧＡ Ｆｃ断片に基づく実施形態はなかった。他方、イヌ科動物ＩｇＧＡ Ｆｃ断片（配列番号１５）をイヌ科動物ＩｇＧＢ Ｆｃ断片（配列番号１６）で置き換えることは、所望のホモ二量体の比較的高いタイターを有するはるかに凝集の少ない化合物をもたらした。さらには、配列番号５のインスリンポリペプチドおよびイヌ科動物ＩｇＧＢ Ｆｃ断片（配列番号１６）を含有する化合物はイヌにおいて生物活性であり、複数日にわたりグルコース低下生物活性を呈した（すなわち、ＮＡＯＣ値は１５０ＦＢＧＬ％・日・ｋｇ／ｍｇより高かった）。
イヌ科動物ＩｇＧＡ Ｆｃ断片に対してイヌ科動物ＩｇＧＢ Ｆｃ断片が好ましいことは、配列番号５のインスリンポリペプチドおよび配列番号１２のペプチドリンカーからいずれもかなり異なる、配列番号８のインスリンポリペプチドおよび配列番号１４のペプチドリンカーを含有する実施形態において確認された。配列番号８のインスリンポリペプチドおよび配列番号１４のペプチドリンカーを含有するインスリン−Ｆｃ融合タンパク質は、イヌ科動物ＩｇＧＡ（配列番号１５）、イヌ科動物ＩｇＧＢ（配列番号１６）、イヌ科動物ＩｇＧＣ（配列番号１７）、またはイヌ科動物ＩｇＧＤ（配列番号１８）免疫グロブリンからのＦｃ断片を使用して合成された。従来の精製方法を使用して、イヌ科動物ＩｇＧＡおよびイヌ科動物ＩｇＧＢを含む化合物のみが任意の認識可能なタンパク質収率を示した。しかしながら、以前とまさに同様に、イヌ科動物ＩｇＧＡバージョンの化合物は低いレベルの生物活性と共に高度に凝集した一方、イヌ科動物ＩｇＧＢバージョンの化合物は、低い程度の凝集（すなわち、高いホモ二量体％）、所望のホモ二量体の高いタイター（すなわち、５０ｍｇ／Ｌより高いホモ二量体タイター）、およびイヌにおける長期継続期間のグルコース低下生物活性の認識可能なレベル（すなわち、ＮＡＯＣ値は１５０ＦＢＧＬ％・日・ｋｇ／ｍｇより高かった）を呈した。代替的な精製方法を使用して、イヌ科動物ＩｇＧＣバージョンの化合物が低い程度の凝集と共に回収されたが、それは、恐らくはＦｃＲｎ受容体に対するその低い親和性に起因して、イヌにおいて生物活性は最小限であった（すなわち、ＮＡＯＣ値は１５０ＦＢＧＬ％・日・ｋｇ／ｍｇ未満であった）。したがって、イヌ特異的製造物に関して、イヌ科動物ＩｇＧＢ（配列番号１６）は、インスリンポリペプチドの選択にかかわらず、イヌにおいて使用される全てのインスリン−Ｆｃ融合タンパク質のための好ましいＦｃ断片である。
ヒトＦｃをネコ科動物ＩｇＧ２で置き換えることは、ネコにおけるＩｇＧ２アイソタイプのＦｃ（ガンマ）エフェクター機能の欠如（ヒトにおけるヒトＩｇＧ２アイソタイプとよく似ている）に起因するネコにおける任意の望ましくない免疫原性を最小化するために好ましい。イヌの場合と異なり、配列番号４のインスリンポリペプチドを含有する実施形態において、ネコ科動物ＩｇＧ２断片（配列番号２１）およびネコ科動物ＩｇＧ１ｂ断片（配列番号２０）を含むインスリン−Ｆｃ融合タンパク質は、低い程度の凝集（すなわち、５０ｍｇ／Ｌより高いホモ二量体タイター）および認識可能なインスリン受容体親和性（すなわち、５０００ｎＭ未満のインスリン受容体ＩＣ５０値）と共に同様に高い収率であることが発見された。しかしながら、予想外なことに、インスリンポリペプチドを配列番号７に変更した場合、ネコ科動物ＩｇＧ２断片（配列番号２１）を含むインスリン−Ｆｃ融合タンパク質はネコにおいて生物活性でなかった（すなわち、ＮＡＯＣは１５０ＦＢＧＬ％・日・ｋｇ／ｍｇ未満であった）一方、ネコ科動物ＩｇＧ１ｂ断片（配列番号２０）を含むインスリン−Ｆｃ融合タンパク質は、低い程度の凝集（すなわち、高いホモ二量体％）、所望のホモ二量体の高いタイター（すなわち、５０ｍｇ／Ｌより高いホモ二量体タイター）、およびネコにおける長期継続期間のグルコース低下生物活性の認識可能なレベル（すなわち、ＮＡＯＣ値は１５０ＦＢＧＬ％・日・ｋｇ／ｍｇより高かった）を呈した。したがって、ネコ特異的製造物に関して、ネコ科動物ＩｇＧ１ｂ断片（配列番号２０）は、インスリンポリペプチド配列が配列番号７を含む場合に好ましいＦｃ断片である。
イヌ科動物ＩｇＧＢおよびネコ科動物ＩｇＧ１ｂアイソタイプは、イヌ科動物ＩｇＧＡおよびネコ科動物ＩｇＧ２アイソタイプ対応物より高い親和性でそれらの各々の種特異的Ｆｃ（ガンマ）受容体と相互作用することを考慮すると、繰返しの注射後に望ましくない免疫原性のリスクがあるかもしれないし、またはないかもしれない。Ｆｃ（ガンマ）相互作用を低減する１つの方法は、宿主細胞中での合成の間にＦｃ断片を脱グリコシル化することまたはそのグリコシル化を予防することを伴う。各ＩｇＧ断片は、Ｆｃ領域の各重鎖のＣＨ２ドメイン中に保存されたアスパラギン（Ｎ）−グリコシル化部位を含有する。本明細書において、保存されたＮ−グリコシル化部位を指すために使用される表記は「ｃＮｇ」である。合成されたインスリン−Ｆｃ融合タンパク質から取り付けられたグリカンを除去する１つのやり方は、ｃＮｇ部位を突然変異させて、宿主細胞中での製造の間のグリカンの取付けを完全に予防することである。本明細書において、ｃＮｇ突然変異を記載するために使用される表記はｃＮｇ−（置換されたアミノ酸）である。例えば、ｃＮｇ部位におけるアスパラギンがセリンに突然変異している場合、この突然変異は「ｃＮｇ−Ｓ」と記される。
インスリン−Ｆｃ融合タンパク質のＢ鎖のＮ末端からのｃＮｇ部位の絶対位置は、インスリンポリペプチドの長さ、リンカーの長さ、およびｃＮｇ部位の前のＦｃ断片中の任意の省略されたアミノ酸に依存して変動する。本明細書において、所与のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質配列中のｃＮｇ部位の絶対位置（インスリン−Ｆｃ融合タンパク質のＢ鎖のＮ末端からカウントして測定された場合）を指すために使用される表記は「ＮＢ（数）」である。例えば、ｃＮｇ部位がＢ鎖のＮ末端からカウントした場合に１５１番目のアミノ酸位置において見出される場合、この部位の絶対位置はｃＮｇ−ＮＢ１５１と称される。さらなる例として、ｃＮｇ部位がＢ鎖のＮ末端からカウントした場合に１５１番目のアミノ酸位置において見出され、かつこの部位におけるアスパラギンがセリンに突然変異している場合、この突然変異は「ｃＮｇ−ＮＢ１５１−Ｓ」と記述される。
配列番号５のインスリンポリペプチドならびにｃＮｇ−Ｑ、ｃＮｇ−Ｓ、ｃＮｇ−Ｄ、およびｃＮｇ−Ｋ突然変異を有するイヌ科動物ＩｇＧＢ Ｆｃ断片を含有する実施形態において、予想外なことに、ｃＮｇ−ＫおよびｃＮｇ−Ｓ突然変異を含有する化合物のみが、５０ｍｇ／Ｌより高い要求されるホモ二量体タイターおよび最低のＦｃ（ガンマ）ＲＩ結合親和性を呈することが発見された。他方、配列番号８のインスリンポリペプチドおよびｃＮｇ−Ｓ突然変異を有するイヌ科動物ＩｇＧＢ Ｆｃ断片を含有する一実施形態において、予想外なことに、結果としてもたらされる化合物は、天然のイヌ科動物ＩｇＧＢ Ｆｃ含有対応物と比較してイヌにおいて有意に低い生物活性であることが発見された（すなわち、ＮＡＯＣ値は、天然のグリコシル化部位アミノ酸、例えば、ｃＮｇ−Ｎを含有する対応物について有意により低かった）。インスリンポリペプチドの配列番号１１について上記したようにＢ１６アミノ酸をアラニンに突然変異させた場合に、生物活性は予想外なことにｃＮｇ−Ｓ突然変異体において回復した（すなわち、ＮＡＯＣ値は有意に増加した）。以上を合わせると、ｃＮｇ突然変異の選択とインスリンポリペプチドの組成との間に予想外かつ有意な相互作用があり、好ましい実施形態を同定するために実験が要求される。特定の実施形態では、ｃＮｇ−Ｓ突然変異を含有するイヌ科動物ＩｇＧＢ Ｆｃ突然変異体は好ましく、下線を引いたｃＮｇ−Ｓを有する配列は、
ＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＳＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号２２）
として示される。
特定の実施形態では、ｃＮｇ−Ｓ突然変異を含有するネコ科動物ＩｇＧ１ｂ Ｆｃ突然変異体は好ましい：
ＤＣＰＫＣＰＰＰＥＭＬＧＧＰＳＩＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＳＩＳＲＴＰＥＶＴＣＬＶＶＤＬＧＰＤＤＳＤＶＱＩＴＷＦＶＤＮＴＱＶＹＴＡＫＴＳＰＲＥＥＱＦＳＳＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＬＨＱＤＷＬＫＧＫＥＦＫＣＫＶＮＳＫＳＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＤＫＧＱＰＨＥＰＱＶＹＶＬＰＰＡＱＥＥＬＳＲＮＫＶＳＶＴＣＬＩＥＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＩＴＧＱＰＥＰＥＮＮＹＲＴＴＰＰＱＬＤＳＤＧＴＹＦＬＹＳＲＬＳＶＤＲＳＲＷＱＲＧＮＴＹＴＣＳＶＳＨＥＡＬＨＳＨＨＴＱＫＳＬＴＱＳＰＧ（配列番号２３）
インスリン−Ｆｃ融合タンパク質
インスリンポリペプチド、Ｆｃ断片、およびインスリンポリペプチドとＦｃ断片との間のリンカーを含むインスリン−Ｆｃ融合タンパク質が本明細書において提供される。実施形態では、インスリンポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端へ以下の配向性：（Ｎ末端）−−Ｂ鎖−−Ｃ鎖−−Ａ鎖−−（Ｃ末端）においてドメインを含む。実施形態では、インスリンポリペプチドはＦｃ断片のＮ末端側に位置する。実施形態では、融合タンパク質は、図１に示されるように、Ｎ末端からＣ末端へ以下の配向性：（Ｎ末端）−−インスリンポリペプチド−−リンカー−−Ｆｃ断片−−（Ｃ末端）（例えば、（Ｎ末端）−−Ｂ鎖−−Ｃ鎖−−Ａ鎖−−リンカー−−Ｆｃ断片−−（Ｃ末端））においてドメインを含む。
好ましい実施形態では、配列番号６の好ましい非免疫原性の、生物活性のインスリンポリペプチドは、配列番号１４の好ましいリンカーを使用して配列番号１６の好ましいイヌ科動物ＩｇＧＢ Ｆｃ断片と組み合わせられて、５０ｍｇ／Ｌより高いホモ二量体タイター、イヌにおける１５０ＦＢＧＬ％・日・ｋｇ／ｍｇより高いＮＡＯＣ値、およびイヌにおける一連の繰返しの注射における３回目の注射後に０．５より高いＮＡＯＣＲ値を呈する、配列番号２４の高いホモ二量体タイターをもたらす、非凝集性の、生物活性の、非免疫原性のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質のファミリーが製造される。以下は、非天然アミノ酸に下線を引いた配列番号２４を示す：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＸ １ ＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＸ ２ ＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＸ ３ ＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＮＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号２４）
（Ｘ１はＤではなく、Ｘ２はＨではなく、かつＸ３は存在しないまたはＮである）。
配列番号２４を含む好ましい実施形態では、Ｘ１はＨであり、Ｘ２はＴであり、かつＸ３は存在しないまたはＮである。選択により、５０ｍｇ／Ｌより高いホモ二量体タイター、イヌにおける１５０ＦＢＧＬ％・日・ｋｇ／ｍｇより高いＮＡＯＣ値、およびイヌにおける一連の繰返しの注射における３回目の注射後に０．５より高いＮＡＯＣＲ値を呈する、配列番号２５の高いホモ二量体タイターをもたらす、非凝集性の、生物活性の、非免疫原性のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質が製造される。以下は、非天然アミノ酸に下線を引いた配列番号２５を示す：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＸ ３ ＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＮＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号２５）
（Ｘ３は存在しないまたはＮである）。
好ましい実施形態では、配列番号２５においてＸ３は存在しないことにより、５０ｍｇ／Ｌより高いホモ二量体タイター、イヌにおける１５０ＦＢＧＬ％・日・ｋｇ／ｍｇより高いＮＡＯＣ値、およびイヌにおける一連の繰返しの注射における３回目の注射後に０．５より高いＮＡＯＣＲ値を呈する、配列番号３２の高いホモ二量体をもたらす、非凝集性の、生物活性の、非免疫原性のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質が製造される。以下は、非天然アミノ酸に下線を引いた配列番号３２を示す：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＮＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号３２）
好ましい実施形態では、配列番号２５においてＸ３はＮであることにより、５０ｍｇ／Ｌより高いホモ二量体タイター、イヌにおける１５０ＦＢＧＬ％・日・ｋｇ／ｍｇより高いＮＡＯＣ値、およびイヌにおける一連の繰返しの注射における３回目の注射後に０．５より高いＮＡＯＣＲ値を呈する、配列番号３４の高いホモ二量体タイターをもたらす、非凝集性の、生物活性の、非免疫原性のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質が製造される。以下は、非天然アミノ酸に下線を引いた配列番号３４を示す：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＮＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＮＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号３４）
好ましい実施形態では、配列番号２２の好ましい非グリコシル化の、ｃＮｇ−Ｓ突然変異型イヌ科動物ＩｇＧＢ Ｆｃ断片は、配列番号１４の好ましいリンカーを使用して配列番号１０の好ましいＢ１６Ａ突然変異型インスリンポリペプチド配列と組み合わせられて、５０ｍｇ／Ｌより高いホモ二量体タイター、イヌにおける１５０ＦＢＧＬ％・日・ｋｇ／ｍｇより高いＮＡＯＣ値、およびイヌにおける一連の繰返しの注射における３回目の注射後に０．５より高いＮＡＯＣＲ値を呈する、配列番号２６の高いホモ二量体タイターをもたらす、非凝集性の、生物活性の、非免疫原性のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質のファミリーが製造される。以下は、非天然アミノ酸に下線を引いた配列番号２６を示す：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＸ １ ＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＸ ２ ＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＳＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号２６）
（Ｘ１はＤではなく、かつＸ２はＨではない）。
好ましい実施形態では、配列番号２６においてＸ１はＨであり、かつＸ２はＴであることにより、５０ｍｇ／Ｌより高いホモ二量体タイター、イヌにおける１５０ＦＢＧＬ％・日・ｋｇ／ｍｇより高いＮＡＯＣ値、およびイヌにおける一連の繰返しの注射における３回目の注射後に０．５より高いＮＡＯＣＲ値を呈する、配列番号３６の高いホモ二量体タイターをもたらす、非凝集性の、生物活性の、非免疫原性のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質が製造される。以下は、非天然アミノ酸に下線を引いた配列番号３６を示す：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＳＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号３６）
好ましい実施形態では、Ｘ３が存在しない配列番号６の好ましい非免疫原性の、生物活性のインスリンポリペプチドは、配列番号１４の好ましいリンカーを使用して配列番号２０の好ましいネコ科動物ＩｇＧ１ｂ Ｆｃ断片と組み合わせられて、５０ｍｇ／Ｌより高いホモ二量体タイター、ネコにおける１５０ＦＢＧＬ％・日・ｋｇ／ｍｇより高いＮＡＯＣ値、およびネコにおける一連の繰返しの注射における３回目の注射後に０．５より高いＮＡＯＣＲ値を呈する、配列番号２７の高いホモ二量体タイターをもたらす、非凝集性の、生物活性の、非免疫原性のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質のファミリーが製造される。以下は、非天然アミノ酸に下線を引いた配列番号２７を示す：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＸ １ ＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＸ ２ ＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＰＰＥＭＬＧＧＰＳＩＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＳＩＳＲＴＰＥＶＴＣＬＶＶＤＬＧＰＤＤＳＤＶＱＩＴＷＦＶＤＮＴＱＶＹＴＡＫＴＳＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＬＨＱＤＷＬＫＧＫＥＦＫＣＫＶＮＳＫＳＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＤＫＧＱＰＨＥＰＱＶＹＶＬＰＰＡＱＥＥＬＳＲＮＫＶＳＶＴＣＬＩＥＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＩＴＧＱＰＥＰＥＮＮＹＲＴＴＰＰＱＬＤＳＤＧＴＹＦＬＹＳＲＬＳＶＤＲＳＲＷＱＲＧＮＴＹＴＣＳＶＳＨＥＡＬＨＳＨＨＴＱＫＳＬＴＱＳＰＧ（配列番号２７）
（Ｘ１はＤではなく、かつＸ２はＨではない）。
好ましい実施形態では、配列番号２７においてＸ１はＨであり、かつＸ２はＴであることにより、５０ｍｇ／Ｌより高いホモ二量体タイター、ネコにおける１５０ＦＢＧＬ％・日・ｋｇ／ｍｇより高いＮＡＯＣ値、およびネコにおける一連の繰返しの注射における３回目の注射後に０．５より高いＮＡＯＣＲ値を呈する、配列番号３８の高いホモ二量体タイターをもたらす、非凝集性の、生物活性の、非免疫原性のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質が製造される。以下は、非天然アミノ酸に下線を引いた配列番号３８を示す：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＰＰＥＭＬＧＧＰＳＩＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＳＩＳＲＴＰＥＶＴＣＬＶＶＤＬＧＰＤＤＳＤＶＱＩＴＷＦＶＤＮＴＱＶＹＴＡＫＴＳＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＬＨＱＤＷＬＫＧＫＥＦＫＣＫＶＮＳＫＳＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＤＫＧＱＰＨＥＰＱＶＹＶＬＰＰＡＱＥＥＬＳＲＮＫＶＳＶＴＣＬＩＥＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＩＴＧＱＰＥＰＥＮＮＹＲＴＴＰＰＱＬＤＳＤＧＴＹＦＬＹＳＲＬＳＶＤＲＳＲＷＱＲＧＮＴＹＴＣＳＶＳＨＥＡＬＨＳＨＨＴＱＫＳＬＴＱＳＰＧ（配列番号３８）
好ましい実施形態では、配列番号２３の好ましい非グリコシル化の、ｃＮｇ−Ｓ突然変異型ネコ科動物ＩｇＧ１ｂ Ｆｃ断片は、配列番号１４の好ましいリンカーを使用して配列番号１０の好ましいＢ１６Ａ突然変異型インスリンポリペプチド配列と組み合わせられて、５０ｍｇ／Ｌより高いホモ二量体タイター、ネコにおける１５０ＦＢＧＬ％・日・ｋｇ／ｍｇより高いＮＡＯＣ値、およびネコにおける一連の繰返しの注射における３回目の注射後に０．５より高いＮＡＯＣＲ値を呈する、配列番号２８の高いホモ二量体タイターをもたらす、非凝集性の、生物活性の、非免疫原性のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質のファミリーが製造される。以下は、非天然アミノ酸に下線を引いた配列番号２８を示す：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＸ １ ＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＸ ２ ＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＰＰＥＭＬＧＧＰＳＩＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＳＩＳＲＴＰＥＶＴＣＬＶＶＤＬＧＰＤＤＳＤＶＱＩＴＷＦＶＤＮＴＱＶＹＴＡＫＴＳＰＲＥＥＱＦＳＳＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＬＨＱＤＷＬＫＧＫＥＦＫＣＫＶＮＳＫＳＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＤＫＧＱＰＨＥＰＱＶＹＶＬＰＰＡＱＥＥＬＳＲＮＫＶＳＶＴＣＬＩＥＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＩＴＧＱＰＥＰＥＮＮＹＲＴＴＰＰＱＬＤＳＤＧＴＹＦＬＹＳＲＬＳＶＤＲＳＲＷＱＲＧＮＴＹＴＣＳＶＳＨＥＡＬＨＳＨＨＴＱＫＳＬＴＱＳＰＧ（配列番号２８）
（Ｘ１はＤではなく、かつＸ２はＨではない）。
好ましい実施形態では、配列番号２８においてＸ１はＨであり、かつＸ２はＴであることにより、５０ｍｇ／Ｌより高いホモ二量体タイター、ネコにおける１５０ＦＢＧＬ％・日・ｋｇ／ｍｇより高いＮＡＯＣ値、およびイヌにおける一連の繰返しの注射における３回目の注射後に０．５より高いＮＡＯＣＲ値を呈する、配列番号４０の高いホモ二量体タイターをもたらす、非凝集性の、生物活性の、非免疫原性のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質が製造される。以下は、非天然アミノ酸に下線を引いた配列番号４０を示す：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＰＰＥＭＬＧＧＰＳＩＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＳＩＳＲＴＰＥＶＴＣＬＶＶＤＬＧＰＤＤＳＤＶＱＩＴＷＦＶＤＮＴＱＶＹＴＡＫＴＳＰＲＥＥＱＦＳＳＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＬＨＱＤＷＬＫＧＫＥＦＫＣＫＶＮＳＫＳＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＤＫＧＱＰＨＥＰＱＶＹＶＬＰＰＡＱＥＥＬＳＲＮＫＶＳＶＴＣＬＩＥＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＩＴＧＱＰＥＰＥＮＮＹＲＴＴＰＰＱＬＤＳＤＧＴＹＦＬＹＳＲＬＳＶＤＲＳＲＷＱＲＧＮＴＹＴＣＳＶＳＨＥＡＬＨＳＨＨＴＱＫＳＬＴＱＳＰＧ（配列番号４０）
一部の実施形態では、本明細書に記載のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質は、Ｎ末端においてリーダーアミノ酸配列を含まない。他の実施形態では、本明細書に記載のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質は、例えばＮ末端において、リーダー配列を含む。例示的なリーダー配列としては、アミノ酸配列ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ（配列番号３０）が挙げられる。一部の実施形態では、本明細書に記載のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質は、例えば細胞（例えば、真核細胞、例えば、哺乳動物細胞）中での発現（例えば、組換え発現）のために、リーダー配列を含む核酸分子によりコードされる。ある特定の実施形態では、リーダー配列は、例えば細胞培養物中で、発現の間に切断除去される。リーダー配列をコードする例示的な核酸配列としては、核酸配列：
ａｔｇｇａａｔｇｇａｇｃｔｇｇｇｔｃｔｔｔｃｔｃｔｔｃｔｔｃｃｔｇｔｃａｇｔａａｃｇａｃｔｇｇｔｇｔｃｃａｃｔｃｃ（配列番号２９）
が挙げられる。
配列番号０３２、０３４、０３６、０３８、および０４０のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸配列（例えば、ｃＤＮＡ）もまた本明細書に開示される。
配列番号３２のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質を含む実施形態では、核酸配列（リーダー配列に下線を引いている）は、
ａｔｇｇａａｔｇｇａｇｃｔｇｇｇｔｃｔｔｔｃｔｃｔｔｃｔｔｃｃｔｇｔｃａｇｔａａｃｇａｃｔｇｇｔｇｔｃｃａｃｔｃｃｔｔｃｇｔｇａａｃｃａｇｃａｃｃｔｇｔｇｃｇｇｃｔｃｃｃａｃｃｔｇｇｔｇｇａａｇｃｔｃｔｇｇａａｃｔｃｇｔｇｔｇｃｇｇｃｇａｇｃｇｇｇｇｃｔｔｃｃａｃｔａｃｇｇｇｇｇｔｇｇｃｇｇａｇｇａｇｇｔｔｃｔｇｇｔｇｇｃｇｇｃｇｇａｇｇｃａｔｃｇｔｇｇａａｃａｇｔｇｃｔｇｃａｃｃｔｃｃａｃｃｔｇｃｔｃｃｃｔｇｇａｃｃａｇｃｔｇｇａａａａｃｔａｃｔｇｃｇｇｔｇｇｃｇｇａｇｇｔｇｇｔｃａａｇｇａｇｇｃｇｇｔｇｇａｃａｇｇｇｔｇｇａｇｇｔｇｇｇｃａｇｇｇａｇｇａｇｇｃｇｇｇｇｇａｇａｃｔｇｃｃｃｃａａｇｔｇｃｃｃｃｇｃｔｃｃｃｇａｇａｔｇｃｔｇｇｇｃｇｇａｃｃｃａｇｃｇｔｇｔｔｃａｔｃｔｔｃｃｃｔｃｃｃａａｇｃｃｃａａｇｇａｃａｃａｃｔｇｃｔｇａｔｃｇｃｃａｇｇａｃｃｃｃｇｇａｇｇｔｇａｃｃｔｇｃｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇａｃｃｔｇｇａｔｃｃｃｇａａｇａｃｃｃｃｇａｇｇｔｇｃａｇａｔｃａｇｃｔｇｇｔｔｃｇｔｇｇａｔｇｇａａａｇｃａｇａｔｇｃａｇａｃｃｇｃｃａａｇａｃｃｃａａｃｃｃｃｇｇｇａａｇａｇｃａｇｔｔｃａａｃｇｇｃａｃｃｔａｃａｇｇｇｔｇｇｔｇａｇｔｇｔｇｔｔｇｃｃｃａｔｃｇｇｃｃａｃｃａｇｇａｃｔｇｇｃｔｇａａｇｇｇｇａａｇｃａａｔｔｃａｃａｔｇｃａａｇｇｔｔａａｔａａｃａａｇｇｃｃｃｔｇｃｃｃａｇｃｃｃｃａｔｃｇａｇａｇｇａｃｃａｔｃａｇｃａａｇｇｃｃａｇｇｇｇｃｃａｇｇｃｃｃａｃｃａｇｃｃａｔｃｔｇｔｇｔａｃｇｔｇｃｔｇｃｃｃｃｃａｔｃｔａｇｇｇａｇｇａａｃｔｇａｇｃａａｇａａｃａｃａｇｔｃａｇｃｃｔｔａｃｔｔｇｃｃｔｇａｔｃａａｇｇａｃｔｔｃｔｔｃｃｃａｃｃｇｇａｃａｔａｇａｃｇｔｇｇａｇｔｇｇｃａｇａｇｔａａｃｇｇｃｃａｇｃａｇｇａｇｃｃｃｇａｇａｇｃａａｇｔａｔａｇｇａｃｃａｃａｃｃｇｃｃｃｃａａｃｔｇｇａｃｇａｇｇａｃｇｇａａｇｃｔａｃｔｔｃｃｔｃｔａｃａｇｃａａａｔｔｇａｇｃｇｔｔｇａｃａａａａｇｃａｇｇｔｇｇｃａｇｃｇａｇｇｃｇａｃａｃｃｔｔｃａｔｃｔｇｃｇｃｃｇｔｇａｔｇｃａｃｇａｇｇｃｔｔｔｇｃａｔａａｃｃａｃｔａｃａｃｃｃａｇｇａｇａｇｃｃｔｇｔｃｃｃａｃａｇｃｃｃｃｇｇａｔａｇ（配列番号３１）
である。
配列番号３４のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質を含む実施形態では、核酸配列（リーダー配列に下線を引いている）は、
ａｔｇｇａａｔｇｇａｇｃｔｇｇｇｔｃｔｔｔｃｔｃｔｔｃｔｔｃｃｔｇｔｃａｇｔａａｃｇａｃｔｇｇｔｇｔｃｃａｃｔｃｃｔｔｃｇｔｇａａｃｃａｇｃａｃｃｔｇｔｇｃｇｇｃｔｃｃｃａｃｃｔｇｇｔｇｇａａｇｃｔｃｔｇｇａａｃｔｃｇｔｇｔｇｃｇｇｃｇａｇｃｇｇｇｇｃｔｔｃｃａｃｔａｃｇｇｇｇｇｔｇｇｃｇｇａｇｇａｇｇｔｔｃｔｇｇｔｇｇｃｇｇｃｇｇａｇｇｃａｔｃｇｔｇｇａａｃａｇｔｇｃｔｇｃａｃｃｔｃｃａｃｃｔｇｃｔｃｃｃｔｇｇａｃｃａｇｃｔｇｇａａａａｃｔａｃｔｇｃａａｃｇｇｔｇｇｃｇｇａｇｇｔｇｇｔｃａａｇｇａｇｇｃｇｇｔｇｇａｃａｇｇｇｔｇｇａｇｇｔｇｇｇｃａｇｇｇａｇｇａｇｇｃｇｇｇｇｇａｇａｃｔｇｃｃｃｃａａｇｔｇｃｃｃｃｇｃｔｃｃｃｇａｇａｔｇｃｔｇｇｇｃｇｇａｃｃｃａｇｃｇｔｇｔｔｃａｔｃｔｔｃｃｃｔｃｃｃａａｇｃｃｃａａｇｇａｃａｃａｃｔｇｃｔｇａｔｃｇｃｃａｇｇａｃｃｃｃｇｇａｇｇｔｇａｃｃｔｇｃｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇａｃｃｔｇｇａｔｃｃｃｇａａｇａｃｃｃｃｇａｇｇｔｇｃａｇａｔｃａｇｃｔｇｇｔｔｃｇｔｇｇａｔｇｇａａａｇｃａｇａｔｇｃａｇａｃｃｇｃｃａａｇａｃｃｃａａｃｃｃｃｇｇｇａａｇａｇｃａｇｔｔｃａａｃｇｇｃａｃｃｔａｃａｇｇｇｔｇｇｔｇａｇｔｇｔｇｔｔｇｃｃｃａｔｃｇｇｃｃａｃｃａｇｇａｃｔｇｇｃｔｇａａｇｇｇｇａａｇｃａａｔｔｃａｃａｔｇｃａａｇｇｔｔａａｔａａｃａａｇｇｃｃｃｔｇｃｃｃａｇｃｃｃｃａｔｃｇａｇａｇｇａｃｃａｔｃａｇｃａａｇｇｃｃａｇｇｇｇｃｃａｇｇｃｃｃａｃｃａｇｃｃａｔｃｔｇｔｇｔａｃｇｔｇｃｔｇｃｃｃｃｃａｔｃｔａｇｇｇａｇｇａａｃｔｇａｇｃａａｇａａｃａｃａｇｔｃａｇｃｃｔｔａｃｔｔｇｃｃｔｇａｔｃａａｇｇａｃｔｔｃｔｔｃｃｃａｃｃｇｇａｃａｔａｇａｃｇｔｇｇａｇｔｇｇｃａｇａｇｔａａｃｇｇｃｃａｇｃａｇｇａｇｃｃｃｇａｇａｇｃａａｇｔａｔａｇｇａｃｃａｃａｃｃｇｃｃｃｃａａｃｔｇｇａｃｇａｇｇａｃｇｇａａｇｃｔａｃｔｔｃｃｔｃｔａｃａｇｃａａａｔｔｇａｇｃｇｔｔｇａｃａａａａｇｃａｇｇｔｇｇｃａｇｃｇａｇｇｃｇａｃａｃｃｔｔｃａｔｃｔｇｃｇｃｃｇｔｇａｔｇｃａｃｇａｇｇｃｔｔｔｇｃａｔａａｃｃａｃｔａｃａｃｃｃａｇｇａｇａｇｃｃｔｇｔｃｃｃａｃａｇｃｃｃｃｇｇａｔａｇ（配列番号３３）
である。
配列番号３６のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質を含む実施形態では、核酸配列（リーダー配列に下線を引いている）は、
ａｔｇｇａａｔｇｇａｇｃｔｇｇｇｔｃｔｔｔｃｔｃｔｔｃｔｔｃｃｔｇｔｃａｇｔａａｃｇａｃｔｇｇｔｇｔｃｃａｃｔｃｃｔｔｃｇｔｇａａｃｃａｇｃａｃｃｔｇｔｇｃｇｇｃｔｃｃｃａｃｃｔｇｇｔｇｇａａｇｃｔｃｔｇｇｃａｃｔｃｇｔｇｔｇｃｇｇｃｇａｇｃｇｇｇｇｃｔｔｃｃａｃｔａｃｇｇｇｇｇｔｇｇｃｇｇａｇｇａｇｇｔｔｃｔｇｇｔｇｇｃｇｇｃｇｇａｇｇｃａｔｃｇｔｇｇａａｃａｇｔｇｃｔｇｃａｃｃｔｃｃａｃｃｔｇｃｔｃｃｃｔｇｇａｃｃａｇｃｔｇｇａａａａｃｔａｃｔｇｃｇｇｔｇｇｃｇｇａｇｇｔｇｇｔｃａａｇｇａｇｇｃｇｇｔｇｇａｃａｇｇｇｔｇｇａｇｇｔｇｇｇｃａｇｇｇａｇｇａｇｇｃｇｇｇｇｇａｇａｃｔｇｃｃｃｃａａｇｔｇｃｃｃｃｇｃｔｃｃｃｇａｇａｔｇｃｔｇｇｇｃｇｇａｃｃｃａｇｃｇｔｇｔｔｃａｔｃｔｔｃｃｃｔｃｃｃａａｇｃｃｃａａｇｇａｃａｃａｃｔｇｃｔｇａｔｃｇｃｃａｇｇａｃｃｃｃｇｇａｇｇｔｇａｃｃｔｇｃｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇａｃｃｔｇｇａｔｃｃｃｇａａｇａｃｃｃｃｇａｇｇｔｇｃａｇａｔｃａｇｃｔｇｇｔｔｃｇｔｇｇａｔｇｇａａａｇｃａｇａｔｇｃａｇａｃｃｇｃｃａａｇａｃｃｃａａｃｃｃｃｇｇｇａａｇａｇｃａｇｔｔｃｔｃａｇｇｃａｃｃｔａｃａｇｇｇｔｇｇｔｇａｇｔｇｔｇｔｔｇｃｃｃａｔｃｇｇｃｃａｃｃａｇｇａｃｔｇｇｃｔｇａａｇｇｇｇａａｇｃａａｔｔｃａｃａｔｇｃａａｇｇｔｔａａｔａａｃａａｇｇｃｃｃｔｇｃｃｃａｇｃｃｃｃａｔｃｇａｇａｇｇａｃｃａｔｃａｇｃａａｇｇｃｃａｇｇｇｇｃｃａｇｇｃｃｃａｃｃａｇｃｃａｔｃｔｇｔｇｔａｃｇｔｇｃｔｇｃｃｃｃｃａｔｃｔａｇｇｇａｇｇａａｃｔｇａｇｃａａｇａａｃａｃａｇｔｃａｇｃｃｔｔａｃｔｔｇｃｃｔｇａｔｃａａｇｇａｃｔｔｃｔｔｃｃｃａｃｃｇｇａｃａｔａｇａｃｇｔｇｇａｇｔｇｇｃａｇａｇｔａａｃｇｇｃｃａｇｃａｇｇａｇｃｃｃｇａｇａｇｃａａｇｔａｔａｇｇａｃｃａｃａｃｃｇｃｃｃｃａａｃｔｇｇａｃｇａｇｇａｃｇｇａａｇｃｔａｃｔｔｃｃｔｃｔａｃａｇｃａａａｔｔｇａｇｃｇｔｔｇａｃａａａａｇｃａｇｇｔｇｇｃａｇｃｇａｇｇｃｇａｃａｃｃｔｔｃａｔｃｔｇｃｇｃｃｇｔｇａｔｇｃａｃｇａｇｇｃｔｔｔｇｃａｔａａｃｃａｃｔａｃａｃｃｃａｇｇａｇａｇｃｃｔｇｔｃｃｃａｃａｇｃｃｃｃｇｇａｔａｇ（配列番号３５）
である。
配列番号３８のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質を含む実施形態では、核酸配列（リーダー配列に下線を引いている）は、
ａｔｇｇａａｔｇｇａｇｃｔｇｇｇｔｃｔｔｔｃｔｃｔｔｃｔｔｃｃｔｇｔｃａｇｔａａｃｇａｃｔｇｇｔｇｔｃｃａｃｔｃｃｔｔｃｇｔｇａａｃｃａｇｃａｃｃｔｇｔｇｃｇｇｃｔｃｃｃａｃｃｔｇｇｔｇｇａａｇｃｔｃｔｇｇａａｃｔｃｇｔｇｔｇｃｇｇｃｇａｇｃｇｇｇｇｃｔｔｃｃａｃｔａｃｇｇｇｇｇｔｇｇｃｇｇａｇｇａｇｇｔｔｃｔｇｇｔｇｇｃｇｇｃｇｇａｇｇｃａｔｃｇｔｇｇａａｃａｇｔｇｃｔｇｃａｃｃｔｃｃａｃｃｔｇｃｔｃｃｃｔｇｇａｃｃａｇｃｔｇｇａａａａｃｔａｃｔｇｃｇｇｔｇｇｃｇｇａｇｇｔｇｇｔｃａａｇｇａｇｇｃｇｇｔｇｇａｃａｇｇｇｔｇｇａｇｇｔｇｇｇｃａｇｇｇａｇｇａｇｇｃｇｇｇｇｇａｇａｃｔｇｃｃｃｃａａａｔｇｔｃｃｔｃｃｇｃｃｔｇａｇａｔｇｃｔｇｇｇｔｇｇｃｃｃｔａｇｃａｔｃｔｔｃａｔｃｔｔｃｃｃｇｃｃｃａａｇｃｃｃａａｇｇａｔａｃｔｃｔｇｔｃｃａｔｔａｇｃａｇｇａｃｃｃｃｃｇａｇｇｔｇａｃｃｔｇｃｃｔｇｇｔｇｇｔｇｇａｃｃｔｇｇｇｇｃｃａｇａｃｇａｃｔｃｔｇａｃｇｔｇｃａｇａｔｃａｃｃｔｇｇｔｔｃｇｔａｇａｃａａｃａｃｃｃａｇｇｔｔｔａｃａｃｔｇｃｃａａｇａｃｃａｇｔｃｃｃａｇｇｇａｇｇａｇｃａｇｔｔｃａａｃａｇｃａｃａｔａｃａｇｇｇｔｇｇｔｇａｇｃｇｔｔｃｔｇｃｃｃａｔｃｃｔｇｃａｃｃａｇｇａｃｔｇｇｃｔｇａａａｇｇｃａａａｇａｇｔｔｃａａｇｔｇｔａａｇｇｔｇａａｃａｇｃａａｇａｇｃｃｔｇｃｃｃａｇｃｃｃｃａｔｔｇａａａｇｇａｃｃａｔｃａｇｃａａｇｇａｃａａｇｇｇｃｃａｇｃｃｇｃａｃｇａｇｃｃｃｃａａｇｔｃｔａｃｇｔｇｃｔｇｃｃｃｃｃａｇｃａｃａｇｇａａｇａｇｃｔｇａｇｃａｇｇａａｃａａｇｇｔｔａｇｃｇｔｇａｃａｔｇｃｃｔｇａｔｃｇａｇｇｇｔｔｔｃｔａｃｃｃｃａｇｃｇａｃａｔｃｇｃｃｇｔｇｇａｇｔｇｇｇａａａｔｃａｃｃｇｇｃｃａａｃｃｃｇａｇｃｃｃｇａｇａａｃａａｃｔａｃａｇｇａｃｃａｃｔｃｃｇｃｃｇｃａａｃｔｇｇａｃａｇｃｇａｃｇｇｇａｃｃｔａｃｔｔｃｔｔｇｔａｔａｇｃａｇｇｃｔｇａｇｃｇｔｇｇａｃｃｇｇａｇｃａｇｇｔｇｇｃａｇａｇｇｇｇｃａａｃａｃｃｔａｃａｃｔｔｇｃａｇｃｇｔｇａｇｃｃａｃｇａｇｇｃｃｔｔｇｃａｃａｇｃｃａｃｃａｃａｃｔｃａｇａａｇａｇｔｃｔｇａｃｃｃａｇａｇｃｃｃｇｇｇａｔａｇ（配列番号３７）
である。
配列番号４０のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質を含む実施形態では、核酸配列（リーダー配列に下線を引いている）は、
ａｔｇｇａａｔｇｇａｇｃｔｇｇｇｔｃｔｔｔｃｔｃｔｔｃｔｔｃｃｔｇｔｃａｇｔａａｃｇａｃｔｇｇｔｇｔｃｃａｃｔｃｃｔｔｃｇｔｇａａｃｃａｇｃａｃｃｔｇｔｇｃｇｇｃｔｃｃｃａｃｃｔｇｇｔｇｇａａｇｃｔｃｔｇｇｃａｃｔｃｇｔｇｔｇｃｇｇｃｇａｇｃｇｇｇｇｃｔｔｃｃａｃｔａｃｇｇｇｇｇｔｇｇｃｇｇａｇｇａｇｇｔｔｃｔｇｇｔｇｇｃｇｇｃｇｇａｇｇｃａｔｃｇｔｇｇａａｃａｇｔｇｃｔｇｃａｃｃｔｃｃａｃｃｔｇｃｔｃｃｃｔｇｇａｃｃａｇｃｔｇｇａａａａｃｔａｃｔｇｃｇｇｔｇｇｃｇｇａｇｇｔｇｇｔｃａａｇｇａｇｇｃｇｇｔｇｇａｃａｇｇｇｔｇｇａｇｇｔｇｇｇｃａｇｇｇａｇｇａｇｇｃｇｇｇｇｇａｇａｃｔｇｃｃｃｃａａａｔｇｔｃｃｔｃｃｇｃｃｔｇａｇａｔｇｃｔｇｇｇｔｇｇｃｃｃｔａｇｃａｔｃｔｔｃａｔｃｔｔｃｃｃｇｃｃｃａａｇｃｃｃａａｇｇａｔａｃｔｃｔｇｔｃｃａｔｔａｇｃａｇｇａｃｃｃｃｃｇａｇｇｔｇａｃｃｔｇｃｃｔｇｇｔｇｇｔｇｇａｃｃｔｇｇｇｇｃｃａｇａｃｇａｃｔｃｔｇａｃｇｔｇｃａｇａｔｃａｃｃｔｇｇｔｔｃｇｔａｇａｃａａｃａｃｃｃａｇｇｔｔｔａｃａｃｔｇｃｃａａｇａｃｃａｇｔｃｃｃａｇｇｇａｇｇａｇｃａｇｔｔｃａｇｃａｇｃａｃａｔａｃａｇｇｇｔｇｇｔｇａｇｃｇｔｔｃｔｇｃｃｃａｔｃｃｔｇｃａｃｃａｇｇａｃｔｇｇｃｔｇａａａｇｇｃａａａｇａｇｔｔｃａａｇｔｇｔａａｇｇｔｇａａｃａｇｃａａｇａｇｃｃｔｇｃｃｃａｇｃｃｃｃａｔｔｇａａａｇｇａｃｃａｔｃａｇｃａａｇｇａｃａａｇｇｇｃｃａｇｃｃｇｃａｃｇａｇｃｃｃｃａａｇｔｃｔａｃｇｔｇｃｔｇｃｃｃｃｃａｇｃａｃａｇｇａａｇａｇｃｔｇａｇｃａｇｇａａｃａａｇｇｔｔａｇｃｇｔｇａｃａｔｇｃｃｔｇａｔｃｇａｇｇｇｔｔｔｃｔａｃｃｃｃａｇｃｇａｃａｔｃｇｃｃｇｔｇｇａｇｔｇｇｇａａａｔｃａｃｃｇｇｃｃａａｃｃｃｇａｇｃｃｃｇａｇａａｃａａｃｔａｃａｇｇａｃｃａｃｔｃｃｇｃｃｇｃａａｃｔｇｇａｃａｇｃｇａｃｇｇｇａｃｃｔａｃｔｔｃｔｔｇｔａｔａｇｃａｇｇｃｔｇａｇｃｇｔｇｇａｃｃｇｇａｇｃａｇｇｔｇｇｃａｇａｇｇｇｇｃａａｃａｃｃｔａｃａｃｔｔｇｃａｇｃｇｔｇａｇｃｃａｃｇａｇｇｃｃｔｔｇｃａｃａｇｃｃａｃｃａｃａｃｔｃａｇａａｇａｇｔｃｔｇａｃｃｃａｇａｇｃｃｃｇｇｇａｔａｇ（配列番号３９）
である。
インスリン−Ｆｃ融合タンパク質の製造
実施形態では、融合タンパク質は、実施例セクションにおいてより詳細に記載されるように細胞により発現させることができる。
発現および精製
実施形態では、インスリン−Ｆｃ融合タンパク質は、例えば、真核細胞中、例えば、哺乳動物細胞または非哺乳動物細胞中で組換えにより発現させることができる。発現のために使用される例示的な哺乳動物細胞としては、ＨＥＫ細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）またはＣＨＯ細胞が挙げられる。ＣＨＯ細胞は様々な株またはサブクラス（例えば、ＣＨＯ ＤＧ４４、ＣＨＯ−Ｍ、およびＣＨＯ−Ｋ１）にさらに分割することができ、これらの細胞株の一部は、実施例セクションに記載されるような具体的な種類の核酸分子（例えば、ＤＮＡを含むベクター）または具体的な細胞増殖培地組成物との最適な使用のために遺伝子操作されてもよい。実施形態では、細胞は、インスリン−Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸分子（例えば、ベクター）（例えば、インスリン−Ｆｃ融合タンパク質全体が単一の核酸分子によりコードされる場合）をトランスフェクトされる。実施形態では、ＨＥＫ２９３細胞は、インスリン−Ｆｃ融合タンパク質をコードするベクターをトランスフェクトされるが、宿主細胞が認識可能なレベルのインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の発現を中止する前の期間（例えば、３日、４日、５日、７日、１０日、１２日、１４日、またはより長い）のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の一時的な発現のみを結果としてもたらす（すなわち、一過性トランスフェクション）。インスリン−Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸配列を一過的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞は、多くの場合に、複数のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質候補の作製およびスクリーニングを促す組換えタンパク質のより迅速な製造を可能とする。実施形態では、ＣＨＯ細胞は、宿主細胞ＤＮＡに永久的に組み込まれ、細胞が適切に培養される限りインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の一貫した永久的な発現に繋がるベクターをトランスフェクト（すなわち、安定なトランスフェクション）される。インスリン−Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸を安定的にトランスフェクトされるＣＨＯ細胞およびＣＨＯ細胞系は、多くの場合に、開発により長くかかるが、多くの場合に、より高いタンパク質収率を生じ、かつ低コスト製造物（例えば、獣医学的薬学市場において使用するための製造物）を生産するためにより適する。細胞および細胞系は、当該技術分野における標準的な方法を使用して培養することができる。好ましい実施形態では、配列番号３１、３３、３５、３７、および３９を有するｃＤＮＡ配列のいずれか１つを含むＨＥＫ細胞が、インスリン−Ｆｃ融合タンパク質を発現するために使用される。好ましい実施形態では、配列番号３１、３３、３５、３７、および３９を有するｃＤＮＡ配列のいずれか１つを含むＣＨＯ細胞が、インスリン−Ｆｃ融合タンパク質を発現するために使用される。
一部の実施形態では、インスリン−Ｆｃ融合タンパク質は、（例えば、細胞の溶解により）細胞から精製または単離される。他の実施形態では、インスリン−Ｆｃ融合タンパク質は細胞により分泌され、細胞が生育された細胞培養培地から精製または単離される。インスリン−Ｆｃ融合タンパク質の精製は、カラムクロマトグラフィー（例えば、アフィニティークロマトグラフィー）を使用することまたはサイズ、電荷、および／もしくはある特定の分子に対する親和性における差異に基づく他の分離方法を使用することを含むことができる。実施形態では、インスリン−Ｆｃ融合タンパク質の精製は、例えば、Ｆｃ断片を含有するタンパク質が、プロテインＡビーズに共有結合的に共役したプロテインＡに中性の溶液ｐＨにおいて高親和性で結合することを引き起こすプロテインＡビーズまたはプロテインＡカラムを使用することにより、Ｆｃ断片を含有するタンパク質を選択または濃縮することを伴う。結合したインスリン−Ｆｃ融合タンパク質は次に、溶液変数の変化（例えば、溶液ｐＨの減少）によりプロテインＡビーズから溶出されてもよい。イオン交換クロマトグラフィーおよび／またはゲル濾過クロマトグラフィーなどの他の分離方法もまた、代替的または追加的に用いることができる。実施形態では、インスリン−Ｆｃ融合タンパク質の精製は、タンパク質調製物を濾過または遠心分離することをさらに含む。実施形態では、インスリン−Ｆｃ融合タンパク質のさらなる精製は、ダイアフィルトレーション（ｄｉａｌｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、限外濾過、および様々なサイズの多孔性膜を通じた濾過の他に、賦形剤を用いる最終の製剤化を含む。
精製されたインスリン−Ｆｃ融合タンパク質は、様々な方法、例えば、２８０ｎｍにおける吸光度（例えば、タンパク質収率を決定するため）、サイズ排除もしくはキャピラリー電気泳動（例えば、分子量、凝集パーセント、および／または純度を決定するため）、質量分析（ＭＳ）および／もしくは液体クロマトグラフィー（ＬＣ−ＭＳ）（例えば、純度および／またはグリコシル化を決定するため）、ならびに／またはＥＬＩＳＡ（例えば、抗インスリン抗体に対する結合の程度、例えば、親和性を決定するため）を使用して、例えば、純度、タンパク質収率、構造、および／または活性について特徴付けることができる。特徴付けの例示的な方法はまた、実施例セクションに記載される。
実施形態では、一過的にトランスフェクトされたＨＥＫ細胞中での製造およびプロテインＡ精製後のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質のタンパク質収率は、５ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ、または２０ｍｇ／Ｌより高い。好ましい実施形態では、一過的にトランスフェクトされたＨＥＫ細胞中での製造およびプロテインＡ精製後のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質のタンパク質収率は５０ｍｇ／Ｌより高い（例えば、６０ｍｇ／Ｌより高い、７０ｍｇ／Ｌより高い、８０ｍｇ／Ｌより高い、９０ｍｇ／Ｌより高い、１００ｍｇ／Ｌより高い）。実施形態では、一過的にトランスフェクトされたＨＥＫ細胞中での製造およびプロテインＡ精製後のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質のホモ二量体％は７０％より高い（例えば、８０％より高い、８５％より高い、９０％より高い、９５％より高い、９６％より高い、９７％より高い、９８％より高い、９９％より高い）。実施形態では、インスリン−Ｆｃ融合タンパク質収率とホモ二量体％との積として算出される、一過的にトランスフェクトされたＨＥＫ細胞中での製造およびプロテインＡ精製後のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質のホモ二量体タイターは５０ｍｇ／Ｌより高い（例えば、６０ｍｇ／Ｌより高い、７０ｍｇ／Ｌより高い、８０ｍｇ／Ｌより高い、９０ｍｇ／Ｌより高い、１００ｍｇ／Ｌより高い）。５０ｍｇ／Ｌより高いホモ二量体タイターを有する候補のみを本発明において有用であると考え、その理由は、このレベルより低いホモ二量体タイターは、獣医学的製造物についての厳密に低い生産コスト要求を満たすＣＨＯ細胞における商用の製造タイターを結果としてもたらさないようであることを経験が実証したからである。
実施形態では、安定的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞（例えば、ＣＨＯ細胞系またはＣＨＯ細胞クローン）中での製造およびプロテインＡ精製後のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質のタンパク質収率は、１Ｌ当たり１００ｍｇのインスリン−Ｆｃ融合タンパク質（例えば、培養培地１Ｌ当たりのｍｇ）より高い。好ましい実施形態では、安定的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞（例えば、ＣＨＯ細胞系またはＣＨＯ細胞クローン）中での製造およびプロテインＡ精製後のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質のタンパク質収率は、培養培地１Ｌ当たり１５０ｍｇのインスリン−Ｆｃ融合タンパク質より高い（例えば、２００ｍｇ／Ｌより高い、３００ｍｇ／Ｌより高い、４００ｍｇ／Ｌより高い、５００ｍｇ／Ｌより高い、６００ｍｇ／Ｌより高いまたはより高い）。実施形態では、安定的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞（例えば、ＣＨＯ細胞系またはＣＨＯ細胞クローン）中での製造およびプロテインＡ精製後のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質のホモ二量体％は７０％より高い（例えば、８０％より高い、８５％より高い、９０％より高い、９５％より高い、９６％より高い、９７％より高い、９８％より高い、９９％より高い）。実施形態では、インスリン−Ｆｃ融合タンパク質収率とホモ二量体％との積として算出される、安定的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞（例えば、ＣＨＯ細胞系またはＣＨＯ細胞クローン）中での製造およびプロテインＡ精製後のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質のホモ二量体タイターは１５０ｍｇ／Ｌより高い（例えば、２００ｍｇ／Ｌより高い、３００ｍｇ／Ｌより高い、４００ｍｇ／Ｌより高い、５００ｍｇ／Ｌより高い、６００ｍｇ／Ｌより高いまたはより高い）。
インスリン−Ｆｃ融合タンパク質の機能的な特徴
伴侶動物（例えば、イヌまたはネコ）においてインスリン受容体と相互作用して血中グルコースを低下させる方法であって、対象にインスリン−Ｆｃ融合タンパク質、例えば、本明細書に記載の融合タンパク質を投与することを含む、方法が本明細書に記載される。一部の実施形態では、対象は、糖尿病（例えば、イヌ科動物糖尿病またはネコ科動物糖尿病）を有すると診断されている。
実施形態では、本明細書に記載のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質は、実施例７に記載の４℃でのＩＭ−９インスリン受容体結合アッセイにおいてＩＣ５０により測定された場合に認識可能な親和性でインスリン受容体に結合する（例えば、５０００ｎＭ未満のＩＣ５０、４０００ｎＭ未満のＩＣ５０、３０００ｎＭ未満のＩＣ５０、２５００ｎＭ未満のＩＣ５０）。経験に基づけば、５０００ｎＭ未満のインスリン受容体活性ＩＣ５０値を呈する化合物のみが、標的種において生物活性を呈するようであるとみなされた。一般に、より高い親和性のインスリン受容体結合（すなわち、より低いＩＣ５０値）が好ましい。しかしながら、インスリンおよびインスリンアナログ（例えば、本明細書に記載のインスリンポリペプチド）のクリアランスは、主にインスリン受容体への結合、続いてインスリン受容体の内部移行および細胞内での分解を通じて支配される。したがって、高すぎるインスリン受容体結合親和性（すなわち、低すぎるＩＣ５０）を有するインスリン−Ｆｃ融合タンパク質は、あまりに急速に循環からクリアランスされて、標的動物におけるグルコース低下生物活性の所望の継続期間より短い継続期間を結果としてもたらすことがある。
実施形態では、本明細書に記載のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質は、対象における投与後にグルコースレベル（例えば、血中グルコースレベル）を低下させることができる。実施形態では、インスリン−Ｆｃ融合タンパク質のグルコース低下活性は、インスリン参照標準のそれより高い。一部の実施形態では、インスリン−Ｆｃ融合タンパク質の活性の継続期間は、投薬前の空腹時血中グルコースレベルと比べた空腹時血中グルコースにおける減少、例えば、統計的に有意な減少により測定することができる。実施形態では、インスリン−Ｆｃ融合タンパク質の活性の継続期間（例えば、投薬前レベルと比べて対象において空腹時血中グルコースレベルにおける統計的に有意な減少がある時間）は約２時間より長い。実施形態では、インスリン−Ｆｃ融合タンパク質の活性の継続期間（例えば、投薬前レベルと比べて対象において血中グルコースレベルにおける統計的に有意な減少がある時間）は、約６時間、９時間、１２時間、１８時間、１日、１．５日、２日、２．５日、３日、４日、５日、６日、７日、またはより長くより長い。実施形態では、インスリン−Ｆｃ融合タンパク質は長期作用性である（例えば、例えば血清中で、長い半減期を有する）。
実施形態では、標的動物（例えば、イヌまたはネコ）中のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の血清半減期は、インスリン参照標準または対照製剤のそれより長い。実施形態では、標的動物（例えば、イヌまたはネコ）中の（例えば、投与での対象の血液中の）インスリン−Ｆｃ融合タンパク質の血清半減期は約２時間より長い。実施形態では、標的動物（例えば、イヌまたはネコ）中のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の血清半減期は、約０．５日、１日、２日、または２．５日である。好ましい実施形態では、標的動物（例えば、イヌまたはネコ）中のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の血清半減期は約３日またはより長い。
実施形態では、効力と生物活性の継続期間との組合せは、ＦＢＧＬ％・日・ｋｇ／ｍｇの単位を用いてｍｇ／ｋｇでの所与の用量に対して正規化された空腹時血中グルコースパーセント（ＦＢＧＬ％）曲線上の面積（ＮＡＯＣ）を算出することにより定量化されてもよい。実施形態では、インスリン−Ｆｃ融合タンパク質のＮＡＯＣは１５０ＦＢＧＬ％・日・ｋｇ／ｍｇより高い（例えば、２００ＦＢＧＬ％・日・ｋｇ／ｍｇより高い、２５０ＦＢＧＬ％・日・ｋｇ／ｍｇより高いまたはより高い）。ここでもまた、経験に基づけば、１５０ＦＢＧＬ％・日・ｋｇ／ｍｇより高いＮＡＯＣ値において、標的種における用量要求は、許容される治療コストを達成するために十分に低い。実施形態では、インスリン−Ｆｃ融合タンパク質のＮＡＯＣは、標的種における繰返しの投薬後に維持されなければならない（すなわち、インスリン−Ｆｃ融合タンパク質の１回目の投薬後のＮＡＯＣに対する３回目の投薬後のＮＡＯＣの比は０．５０より高い（例えば、０．６０より高い、０．７０より高い、０．８０より高い、０．９０より高い、またはより高い）。
一部の実施形態では、本明細書に記載のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質は、実施例８にしたがって測定された場合に、インスリン−Ｆｃ融合タンパク質参照標準の親和性より低い親和性でＦｃ（ガンマ）受容体に結合する。一部の実施形態では、インスリン−Ｆｃ融合タンパク質参照標準のＦｃ（ガンマ）受容体親和性に対するインスリン−Ｆｃ融合タンパク質のＦｃ（ガンマ）受容体親和性の比は０．５０未満（例えば、０．４０未満、０．３０未満、０．２０未満）である。
治療の方法および対象選択の特徴
糖尿病（例えば、イヌ科動物糖尿病またはネコ科動物糖尿病）を治療する方法であって、対象にインスリン−Ｆｃ融合タンパク質（例えば、本明細書に記載のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質）を投与することを含む、方法が本明細書に記載される。
実施形態では、本明細書に記載の任意の方法において使用される参照標準は参照治療または参照療法を含む。一部の実施形態では、参照は糖尿病治療用の標準治療剤（例えば、イヌ科動物糖尿病用の標準治療剤またはネコ科動物糖尿病用の標準治療剤）を含む。一部の実施形態では、参照標準は、商業的に入手可能なインスリンまたはインスリンアナログである。一部の実施形態では、参照標準は、長期持続性インスリン、中期持続性インスリン、短期持続性インスリン、即効性インスリン、短期作用性、中期作用性、長期作用性インスリンを含む。一部の実施形態では、参照標準は、Ｖｅｔｓｕｌｉｎ（登録商標）、Ｐｒｏｚｉｎｃ（登録商標）、インスリンＮＰＨ、インスリングラルギン（Ｌａｎｔｕｓ（登録商標））、または組換えヒトインスリンを含む。
実施形態では、本明細書に記載の任意の方法において使用される参照標準は、糖尿病療法（例えば、イヌ科動物糖尿病療法またはネコ科動物糖尿病療法）のアウトカム、例えば、明細書に記載のアウトカムを含む。
実施形態では、参照標準は、療法、例えば、本明細書に記載のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質療法の開始前の対象におけるマーカー（例えば、血中グルコースまたはフルクトサミン）のレベルであり、対象は糖尿病を有する。実施形態では、伴侶動物（例えば、イヌまたはネコ）における血中グルコースレベルは、療法の開始前に２００ｍｇ／ｄＬより高い（例えば、２５０ｍｇ／ｄＬ、３００ｍｇ／ｄＬ、３５０ｍｇ／ｄＬ、４００ｍｇ／ｄＬまたはより高くより高い）。実施形態では、伴侶動物（例えば、イヌまたはネコ）におけるフルクトサミンレベルは、療法の開始前に２５０マイクロモル／Ｌ、３５０マイクロモル／Ｌより高い（例えば、４００マイクロモル／Ｌ、４５０マイクロモル／Ｌ、５００マイクロモル／Ｌ、５５０マイクロモル／Ｌ、６００マイクロモル／Ｌ、６５０マイクロモル／Ｌ、７００マイクロモル／Ｌ、７５０マイクロモル／Ｌまたはより高くより高い）。実施形態では、参照標準は、疾患の存在またはその進行もしくは重症度の度合である。実施形態では、参照標準は、療法、例えば、本明細書に記載のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質療法の開始前の疾患症状の存在または重症度の度合であり、例えば、対象は糖尿病を有する。
医薬組成物および投与の経路
伴侶動物（例えば、イヌまたはネコ）において血中グルコースを低下させるために使用することができる本明細書に記載のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質を含有する医薬組成物が本明細書において提供される。医薬組成物中のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の量および濃度の他に、対象に投与される医薬組成物の量は、臨床的に関連する因子、例えば、対象の医学的に関連する特徴（例えば、年齢、体重、性別、および他の医学的条件など）、医薬組成物中の化合物の溶解度、化合物の効力および活性、ならびに医薬組成物の投与の方式に基づいて選択することができる。投与の経路および投薬レジームに関するさらなる情報について、読者は、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ＣｈｅｍｉｓｔｒｙのＶｏｌｕｍｅ ５（Ｃｏｒｗｉｎ Ｈａｎｓｃｈ； Ｃｈａｉｒｍａｎ ｏｆ Ｅｄｉｔｏｒｉａｌ Ｂｏａｒｄ）， Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ １９９０のＣｈａｐｔｅｒ ２５．３を参照されたい。
本開示の製剤としては、非経口投与のために好適なものが挙げられる。「非経口投与」および「非経口的に投与される」という語句は、本明細書において使用される場合、通常は静脈内または皮下注射による、経腸および外用投与以外の投与のモードを意味する。
本開示の医薬組成物において用いることができる好適な水性および非水性担体の例としては、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、およびポリエチレングリコールなど）、およびこれらの好適な混合物、オリーブ油などの植物油、ならびにオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルが挙げられる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用により、分散体の場合には要求される粒子サイズの維持により、および界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ様の界面活性剤の使用により維持することができる。一部の実施形態では、（例えば、本明細書に記載されるような）医薬組成物は、Ｔｗｅｅｎ様の界面活性剤、例えば、ポリソルベート−２０、Ｔｗｅｅｎ−２０またはＴｗｅｅｎ−８０を含む。一部の実施形態では、（例えば、本明細書に記載されるような）医薬組成物は、約０．００１％〜約２％、または約０．００５％〜約０．１％、または約０．０１％〜約０．５％の濃度において、Ｔｗｅｅｎ様の界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ−８０を含む。
一部の実施形態では、水性担体中のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の濃度は約３ｍｇ／ｍＬである。一部の実施形態では、水性担体中のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の濃度は約６ｍｇ／ｍＬである。一部の実施形態では、水性担体中のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の濃度は、約８ｍｇ／ｍＬ、９ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、１２ｍｇ／ｍＬ、１５ｍｇ／ｍＬまたはより高い。
一部の実施形態では、インスリン−Ｆｃ融合タンパク質は、ボーラス、注入、または静脈内プッシュとして投与される。一部の実施形態では、融合タンパク質は、シリンジ注射、ポンプ、ペン、針、または留置カテーテルを通じて投与される。一部の実施形態では、インスリン−Ｆｃ融合タンパク質は皮下ボーラス注射により投与される。導入の方法はまた、再チャージ可能または生分解性デバイスにより提供されてもよい。様々な遅延放出ポリマーデバイスが薬物の制御送達のために近年開発およびインビボで試験されており、これにはタンパク質性バイオ医薬品が含まれる。生分解性および非分解性の両方のポリマーを含む、様々な生体適合性ポリマー（ハイドロゲルを含む）を、具体的な標的部位における化合物の持続放出用のインプラントを形成するために使用することができる。
投薬量
インスリン−Ｆｃ融合タンパク質の実際の投薬量レベルは、具体的な対象（例えば、イヌまたはネコ）について所望の治療奏功を達成するために有効な活性の原料成分の量を得るように変動させることができる。選択される投薬量レベルは、用いられる具体的な融合タンパク質、またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与の経路、投与の時間、用いられる具体的な化合物の排出の速度、治療の継続期間、用いられる具体的な融合タンパク質と組み合わせて使用される他の薬物、化合物および／または材料、治療されている対象の年齢、性別、体重、状態、全般的健康および過去の病歴、ならびに医学分野において周知の同様の因子を含む、様々な因子に依存する。
一般に、インスリン−Ｆｃ融合タンパク質の好適な用量は、治療効果を生じさせるために有効な最低用量である量である。そのような有効な用量は、一般に、上記の因子に依存する。一般に、イヌまたはネコのためのインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の静脈内および皮下用量は、約０．００１〜約１ｍｇ／体重キログラム（例えば、ｍｇ／ｋｇ）／日、例えば、約０．００１〜１ｍｇ／ｋｇ／日、約０．０１〜０．１ｍｇ／ｋｇ／日、約０．１〜１ｍｇ／ｋｇ／日、または約０．０１〜１ｍｇ／ｋｇ／日の範囲内である。さらに他の実施形態では、融合タンパク質は、０．０２５〜４ｍｇ／体重キログラム／週、例えば、０．０２５〜０．５ｍｇ／ｋｇ／週の用量において投与される。
本開示は、上述の任意の医薬組成物および調製物中のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の製剤を想定する。さらには、本開示は、以上の任意の投与の経路を介する投与を想定する。当業者は、治療されている状態ならびに治療されている患者の全体的な健康、年齢、およびサイズに基づいて適切な製剤および投与の経路を選択することができる。
本技術を以下の実施例によりさらに説明するが、実施例は、いかなる意味でも限定的なものとして解釈されるべきではない。
一般の方法、アッセイ、および材料
実施例１：ＨＥＫ２９３細胞中でのインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の合成および作製方法
インスリン−Ｆｃ融合タンパク質を以下のように合成した。特許ソフトウェア（ＬａｋｅＰｈａｒｍａ、Ｂｅｌｍｏｎｔ、ＣＡ）を使用して目的の遺伝子配列を構築し、高発現哺乳動物ベクターにクローニングした。トランスフェクションの２４時間前にＨＥＫ２９３細胞をシェークフラスコに播種し、無血清化学限定培地を使用して生育させた。一過性トランスフェクションのための（ＬａｋｅＰｈａｒｍａ、Ｂｅｌｍｏｎｔ、ＣＡ）標準作業手順を使用して、目的のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質をコードするＤＮＡ発現構築物をＨＥＫ２９３細胞の懸濁液に一過的にトランスフェクトした。２０時間後、細胞を計数して生存能力および生存細胞数を決定し、ＦｏｒｔｅＢｉｏ（登録商標） Ｏｃｔｅｔ（登録商標）（Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ ＬＬＣ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）によりタイターを測定した。一過性トランスフェクションの製造ランの全体を通じて追加の読取りを行った。培養物を５日目またはその後に回収した。
実施例２：ＣＨＯ細胞中でのインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の合成および作製方法
ＣＨＯ細胞系は元々ＣＨＯ−Ｋ１（ＬａｋｅＰｈａｒｍａ、Ｂｅｌｍｏｎｔ、ＣＡ）に由来し、当該技術分野において公知の方法を使用して組換え技術により内因性のグルタミンシンセターゼ（ＧＳ）遺伝子をノックアウトした。安定発現ＤＮＡベクターを設計し、ＣＨＯ発現およびＧＳ選択のために最適化し、高発現哺乳動物ベクター（ＬａｋｅＰｈａｒｍａ、Ｂｅｌｍｏｎｔ、ＣＡ）に組み込んだ。スケールアップ実験の開始前に各完成した構築物の配列を確認した。加湿された５％のＣＯ２インキュベーター中３７℃で化学限定培地（ＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中で懸濁液適応ＣＨＯ細胞を培養した。ＣＨＯ細胞の培養において血清も他の動物由来の製造物も使用しなかった。
指数増殖期の間にＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ培地中で生育した約８０００万個の懸濁液適応ＣＨＯ細胞に、ＭａｘＣｙｔｅ（登録商標） ＳＴＸ（登録商標）システム（ＭａｘＣｙｔｅ， Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を使用してエレクトロポレーションにより８０μｇのＤＮＡをトランスフェクトして、各インスリン−Ｆｃ融合タンパク質のための安定なＣＨＯ細胞系を作製した（ＤＮＡ構築物はインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の全長配列を含有する）。２４時間後、トランスフェクトされた細胞を計数し、インスリン−Ｆｃ融合遺伝子の安定な組込みのための選択下に置いた。トランスフェクトされた細胞を、シェーカーフラスコ中で０．５×１０６細胞／ｍＬの細胞密度において０〜１００μＭのメチオニンスルホキシイミン（ＭＳＸ）を含有するＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ選択培地に播種し、５％のＣＯ２と共に３７℃でインキュベートした。選択プロセスの間に、細胞を遠心沈降させ、ＣＨＯ安定プールがその増殖速度および生存能力を回復するまで２〜３日毎に新鮮な選択培地に再懸濁した。細胞培養物を増殖およびタイターについてモニターした。
細胞を２．５×１０６細胞／ｍＬまで生育させた。細胞バンキング用の回収の時点において、生存能力は９５％より高かった。細胞を次に遠心分離し、細胞ペレットを１５×１０６細胞／ｍＬ／バイアルの細胞数まで７．５％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含むＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ培地に再懸濁した。液体窒素中での貯蔵のためにバイアルを凍結保存した。
以下のようにＣＨＯ細胞を使用して小スケールアップ製造を行った。１００μＭのＭＳＸを含有するＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ増殖培地中３７℃での製造のために細胞をスケールアップし、必要に応じて２〜４日毎にフィードし、ＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ増殖培地には必要に応じて約１４〜２１日間グルコースおよび追加のアミノ酸を添加した。安定プール製造ランから回収された条件培地上清を遠心分離機でのスピニングにより清澄化した。結合緩衝液を用いて予備平衡化したプロテインＡ（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）カラムにタンパク質を流した。ＯＤ２８０値（ＮａｎｏＤｒｏｐ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）がバックグラウンドレベルまたはそれに近いと測定されるまで洗浄緩衝液を次にカラムに通過させた。低ｐＨの緩衝液を使用してインスリン−Ｆｃ融合タンパク質を溶出させ、溶出画分を収集し、各画分のＯＤ２８０値を記録した。標的インスリン−Ｆｃ融合タンパク質を含有する画分をプールし、任意選択的に０．２μＭの膜フィルターを使用してさらに濾過した。
細胞系を任意選択的にモノクローン性までさらにサブクローニングし、任意選択的に当業者に公知の方法である限界希釈の方法を使用して高タイターインスリン−Ｆｃ融合タンパク質発現クローンについてさらに選択した。高タイターのモノクローナルインスリン−Ｆｃ融合タンパク質発現細胞系列を得た後、ＭＳＸを含まない増殖培地中で、または任意選択的にＭＳＸを含有する増殖培地中で上記のようにインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の製造を達成して、組換えの、ＣＨＯにより作られた、インスリン−Ｆｃ融合タンパク質を含有する細胞培養上清を得た。より高い製造物タイターをもたらすことができるクローンについての追加の選択性を発揮するために、ＭＳＸ濃度を任意選択的に経時的に増加させた。
実施例３：インスリン−Ｆｃ融合タンパク質の精製
インスリン−Ｆｃ融合タンパク質の精製を以下のように行った。一過的または安定的にトランスフェクトされたＨＥＫ製造ランから分泌されたインスリン−Ｆｃ融合タンパク質を含有する条件培地上清を回収し、遠心分離により清澄化した。所望のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質を含有する上清をプロテインＡまたはプロテインＧカラムに流し、低ｐＨ勾配を使用して溶出させた。任意選択的に、インスリン−Ｆｃ融合タンパク質の回収は、初期プロテインＡまたはプロテインＧカラム溶出液を第２のプロテインＡまたはプロテインＧカラムに再びリローディングすることにより増進させてもよい。その後、所望のタンパク質を含有する溶出された画分をプールし、２００ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＮａＯＡｃ、ｐＨ７．０の緩衝液への緩衝液交換を行った。０．２μｍの膜フィルターを使用して最終の濾過ステップを行った。最終のタンパク質濃度を２８０ｎｍにおける溶液の光学密度から算出した。イオン交換クロマトグラフィー（例えば、陰イオン交換ビーズ樹脂または陽イオン交換ビーズ樹脂を使用する）、ゲル濾過クロマトグラフィー、または他の方法によるさらなる任意選択的な精製を必要に応じて行った。
実施例４：非還元および還元ＣＥ−ＳＤＳによる構造の確認
２００ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＮａＯＡｃ、ｐＨ７．０の緩衝液に溶解させた精製されたインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の溶液に対してＬａｂＣｈｉｐ（登録商標） ＧＸＩＩ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）においてキャピラリー電気泳動ドデシル硫酸ナトリウム（ＣＥ−ＳＤＳ）分析を行い、電気泳動図をプロットした。非還元条件下で、試料を既知の分子量（ＭＷ）のタンパク質標準に対して流し、溶出ピークはインスリン−Ｆｃ融合タンパク質ホモ二量体の「見かけ」のＭＷを表した。
還元条件（例えば、インスリン−Ｆｃ融合物ホモ二量体のジスルフィド結合を破壊するためにベータ−メルカプトエタノールを使用する）下で、インスリン−Ｆｃ融合タンパク質の構造的純度は正確であるらしいことを決定するやり方として、結果としてもたらされたインスリン−Ｆｃ融合タンパク質単量体の見かけのＭＷをインスリン−Ｆｃ融合タンパク質ホモ二量体の分子量の半分に対して比較する。
実施例５：グリカン除去を用いるＬＣ−ＭＳによる配列同定
質量分析（ＭＳ）を介してインスリン−Ｆｃ質量の正確な推定値を得るために、ＭＳ分析に干渉する可能性がある天然に存在するグリカンを除去するために試料を最初に処理する。２００ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＮａＯＡｃ、ｐＨ７．０の緩衝溶液に溶解させた２．５ｍｇ／ｍＬのインスリン−Ｆｃ融合タンパク質１００μＬを最初に、Ｚｅｂａ脱塩カラム（Ｐｉｅｒｃｅ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用して５ｍＭのＥＤＴＡを含有する０．１ＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０の緩衝液に緩衝液交換する。融合タンパク質中に存在するＮ結合型グリカン（例えば、ｃＮｇ−Ｎ部位に位置するアスパラギンの側鎖に連結したグリカン）を除去するために１．６７μＬのＰＮＧａｓｅ Ｆ酵素（Ｐｒｏｚｙｍｅ Ｎ−グリカナーゼ）をこの溶液に加え、混合物をインキュベーター中３７□で終夜インキュベートする。試料を次にＬＣ−ＭＳ（ＮｏｖａＢｉｏａｓｓａｙｓ、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）を介して分析し、これは、グリカンを有しない所望のホモ二量体に対応する分子の分子量を結果としてもたらす。この質量を次にさらに補正するが、その理由は、ｃＮｇ−アスパラギンからグリカンを切断するために使用される酵素プロセスはまた、アスパラギン側鎖を脱アミノ化してアスパラギン酸を形成させ、そうする際に酵素処理されたホモ二量体は、ホモ二量体中に存在する各鎖について１Ｄａの質量に対応する全体として２Ｄａを獲得するからである。したがって、実際の分子量は、分析試料中のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質構造の酵素修飾について補正するために、測定された質量マイナス２Ｄａである。
実施例６：サイズ排除クロマトグラフィーによるホモ二量体％
２８０ｎｍの波長において２９９８フォトダイオードアレイに接続されたＷａｔｅｒｓ ２７９５ＨＴ ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）を使用してインスリン−Ｆｃ融合タンパク質のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）を実行した。０．２ｍＬ／分の流速において作動させ、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、３００ｍＭのＮａＣｌ、および０．０５％ｗ／ｖのナトリウムアジド（ｐＨ６．２）を含む移動相を用いて、目的のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質を含有する１００μＬまたはそれより少ない試料をＭＡｂＰａｃ ＳＥＣ−１、５μｍ、４×３００ｍｍカラム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）に注入した。ＭＡｂＰａｃ ＳＥＣ−１カラムは分子サイズ分離の原理において作動する。したがって、より大きい可溶性のインスリン−Ｆｃ凝集物（例えば、インスリン−Ｆｃ融合タンパク質ホモ二量体の多量体）はより早い保持時間において溶出し、非凝集性のホモ二量体はより後の保持時間において溶出した。分析的ＳＥＣ−ＨＰＬＣを介する凝集した多量体ホモ二量体からのホモ二量体の混合物の分離において、非凝集性ホモ二量体のパーセンテージの点でのインスリン−Ｆｃ融合タンパク質溶液の純度を確認した。
実施例７：４℃における例示的なインスリン−Ｆｃ融合タンパク質のインビトロＩＭ−９インスリン受容体結合
ヒトインスリン受容体を発現するヒトＩＭ−９細胞（ＡＴＴＣ＃ ＣＣＬ−１５９）を７０〜８０％の密集度において完全ＲＰＭＩ ５％ ＦＢＳ培地中で培養および維持した。ＩＭ−９細胞の培養物を２５０×ｇ（約１０００ｒｐｍ）において１０分間遠心分離して細胞をペレット化した。ＨＢＳＳまたはＰＢＳ緩衝液を用いて細胞を１回洗浄し、８×１０６細胞／ｍＬの濃度まで冷ＦＡＣＳ染色培地（ＨＢＳＳ／２ｍＭのＥＤＴＡ／０．１％のＮａ−アジド＋４％のウマ血清）に再懸濁し、試験溶液が作られるまで氷上または４℃に保った。１．２ｍＬのチューブ中２×濃度として１：３の段階希釈においてＦＡＣＳ緩衝液にインスリン−Ｆｃタンパク質を希釈（約６０μＬの体積の各希釈）し、ピペッティングの用意ができるまで溶液を氷冷下に保った。
１．２５μｇ／ｍＬの濃度までビオチン化ＲＨＩをＦＡＣＳ染色培地に希釈した。４０μＬの段階希釈された試験化合物および８μＬの１．２５μｇ／ｍＬのビオチン−ＲＨＩをＶ底マイクロタイタープレートの各ウェルに加え、遅いボルテックスにより混合し、氷上に置いた。４０μＬのＩＭ−９細胞懸濁液（８×１０６細胞／ｍＬ）を次にマルチチャンネルピペットにより各ウェルに加え、再び穏やかに混合し、氷上で３０分間インキュベートして、ＩＭ−９細胞上のインスリン受容体に競合的に結合させた。Ｖ底プレートを３０００ｒｐｍにおいて３分間遠心分離し、上清を吸引することにより、細胞を次に２７５μＬの氷冷したＦＡＣＳ洗浄緩衝液（ＨＢＳＳ／２ｍＭのＥＤＴＡ／０．１％のＮａ−アジド＋０．５％のウマ血清）を用いて２回洗浄した。細胞を次に、氷上で２０分間１：１００に希釈されたストレプトアビジン−ＰＥ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有する４０μＬのＦＡＣＳ染色培地に再懸濁した。細胞を次に、２７５μＬの氷冷したＦＡＣＳ緩衝液を用いて１回洗浄し、最後に３％のパラホルムアルデヒドを用いて室温で１０分間固定した。細胞を次に、２７５μＬの氷冷したＦＡＣＳ緩衝液を用いて１回洗浄し、分析のために２５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。
細胞を含有するＶ底プレートを次にＧｕａｖａ ８−ＨＴフローサイトメーター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）において分析した。各濃度の試験化合物についてＦＡＣＳ ＦＬ−２チャネルにおいて細胞のメジアン蛍光強度（ＭＦＩ）によりインスリン受容体へのビオチン化ＲＨＩの結合を定量化した。対照ウェルをビオチン化ＲＨＩのみを用いて標識し、各試験化合物濃度の結果としてもたらされる阻害パーセント（％）を算出するために使用した。ＩＭ−９細胞上のビオチン化ＲＨＩ結合の試験化合物による阻害％を試験化合物のｌｏｇ濃度に対してプロットし、試験化合物についてＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を使用して結果としてもたらされたＩＣ５０値を算出した。試験化合物のより低いＩＣ５０値は、したがって、より低い濃度におけるビオチン化ＲＨＩ阻害のより高いレベルを指し示し、インスリン受容体へのインスリン−Ｆｃ融合タンパク質のより強い結合を指し示す。非標識組換えヒトインスリン（ＲＨＩ）などの対照化合物もまた内部標準として使用して、それに対する所与の化合物のＩＣ５０の比（ＩＣ５０（化合物）／ＩＣ５０（ＲＨＩ））を取り得るＲＨＩ ＩＣ５０を生成した。より低いＩＣ５０比はＲＨＩにより類似した結合（インスリン受容体へのより強い結合）を有し、より高いＩＣ５０比はＲＨＩと比べてインスリン受容体へのより弱い結合を有する。
実施例８：インビトロＦｃ（ガンマ）受容体Ｉ結合親和性アッセイ
以下のようにＥＬＩＳＡアッセイを使用してｐＨ７．４におけるＦｃ（ガンマ）受容体Ｉへのインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の結合を実行した。イヌ科動物およびネコ科動物のいずれのＦｃ（ガンマ）受容体Ｉも商業的に入手可能でなかったので、ヒトＦｃ（ガンマ）受容体Ｉ（すなわち、ｒｈＦｃ（ガンマ）受容体Ｉ）をサロゲート哺乳動物受容体として使用した。インスリン−Ｆｃ化合物をｐＨ９．６において重炭酸ナトリウム緩衝液に１０μｇ／ｍＬまで希釈し、Ｍａｘｉｓｏｒｐ（Ｎｕｎｃ）マイクロタイタープレートに４℃で終夜コーティングした後、マイクロプレートストリップをＰＢＳＴ（ＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０）緩衝液を用いて５回洗浄し、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋブロッキング試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いてブロッキングした。ビオチン化ｒｈＦｃ（ガンマ）受容体Ｉ（組換えヒトＦｃ（ガンマ）Ｒ−Ｉ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の段階希釈液を６０００ｎｇ／ｍＬ〜８．２ｎｇ／ｍＬでＰＢＳＴ／１０％のＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋ緩衝液中で調製し、インスリン−Ｆｃ融合タンパク質をコーティングしたマイクロプレートストリップに１００μＬ／ウェルにおいてロードした。マイクロタイタープレートを室温で１時間インキュベートした後、ＰＢＳＴを用いてマイクロプレートストリップを５回洗浄し、次にＰＢＳＴ／１０％のＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋ緩衝液に１：１００００で希釈した１００μＬ／ウェルのストレプトアビジン−ＨＲＰをロードした。４５分間インキュベートした後、ＰＢＳＴを用いてマイクロプレートストリップを再び５回洗浄した。ＴＭＢを加えて結合したＦｃ（ガンマ）受容体Ｉタンパク質を明らかにさせ、ＥＬＩＳＡ中止試薬（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）を用いて中止させた。プレートを４５０ｎｍにおいてＥＬＩＳＡプレートリーダーで読み取り、ＯＤ値（インスリン−Ｆｃタンパク質へのｒｈＦｃ（ガンマ）受容体Ｉの結合に比例する）を各ウェルに加えたｒｈＦｃ（ガンマ）受容体Ｉのｌｏｇ濃度に対してプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して結合曲線を生成した。
実施例９：イヌ科動物ＦｃＲｎ受容体に対するインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の親和性のインビトロ測定
イヌ科動物ＦｃＲｎ受容体に対するイヌ科動物またはネコ科動物ＩｇＧ起源のＦｃ断片を含有するインスリン−Ｆｃ融合タンパク質のインビトロ結合親和性を、５．５の溶液ｐＨにおいて実行したＥＬＩＳＡ技術を介して測定した。わずかに酸性のｐＨは、Ｆｃ断片含有分子がＦｃＲｎ受容体に結合するための好ましい結合環境である。インビボで、細胞は表面上およびエンドソームの内部にＦｃＲｎを発現する。Ｆｃ断片を含有する分子は天然のプロセス（例えば、ピノサイトーシスまたはエンドサイトーシス）を通じて細胞に運ばれるので、ｐＨはエンドソーム中でより低いｐＨに変化し、そこでＦｃＲｎ受容体は、さもなければエンドソーム−リソソームコンパートメント中で分解されるであろうＦｃ断片含有分子に結合し、それにより、これらの分子がｐＨが中性により近い（例えば、ｐＨ７．０〜７．４）細胞表面に再循環することを可能とする。中性ｐＨはＦｃＲｎ受容体への結合に不利に働き、循環に戻るＦｃ断片含有分子の放出を可能とする。これは、Ｆｃ断片含有分子がインビボで長期化された循環薬物動態の半減期を呈する主要な機序である。
イヌ科動物またはネコ科動物起源のＦｃ断片を含むインスリン−Ｆｃ融合タンパク質をｐＨ９．６の重炭酸ナトリウム緩衝液に１０μｇ／ｍｌまで希釈し、ＲＴで１〜２時間Ｍａｘｉｓｏｒｂ ＥＬＩＳＡプレートストリップに２連でコーティングした。ストリップを次にＰＢＳＴ（ＰＢＳ／０．１％のＴｗｅｅｎ−２０）緩衝液を用いて４回洗浄し、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋブロッキング試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いてブロッキングした。ＦｃＲｎ結合用のストリップを次にｐＨ５．５のＭＥＳ／ＮａＣｌ／Ｔｗｅｅｎ（５０ｍＭのＭＥＳ／１５０ｍＭのＮａＣｌ／０．１％のＴｗｅｅｎ−２０）緩衝液を用いて再び２回洗浄した後、ＦｃＲｎ試薬（ビオチン化イヌ科動物ＦｃＲｎ；Ｉｍｍｕｎｉｔｒａｃｋ）を添加した。ネコ科動物ＦｃＲｎ試薬は商業的に入手可能なものが見出されなかったため、イヌ科動物Ｆｃ断片またはネコ科動物Ｆｃ断片のいずれかを含有するインスリン−Ｆｃ融合タンパク質をイヌ科動物ＦｃＲｎへの結合についてアッセイした。ビオチン化ＦｃＲｎ試薬の段階希釈液（１：３Ｘ希釈液）を１０００ｎｇ／ｍｌ〜０．４５ｎｇ／ｍｌの濃度においてｐＨ５．５のＭＥＳ／ＮａＣｌ／Ｔｗｅｅｎ／１０％Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ緩衝液中に調製し、マルチチャンネルピペッタを使用してインスリン−Ｆｃ融合タンパク質化合物でコーティングしたストリップに１００μＬ／ウェルにおいてロードした。アッセイプレートを次に室温で１時間インキュベートした。ＦｃＲｎ結合ストリップをｐＨ５．５のＭＥＳ／ＮａＣｌ／Ｔｗｅｅｎ緩衝液を用いて４回洗浄し、次にｐＨ５．５のＭＥＳ／ＮａＣｌ／１０％Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ緩衝液に１：１００００で希釈した１００μｌ／ウェルのストレプトアビジン−ＨＲＰをロードした。４５分間インキュベートした後、ｐＨ５．５のＭＥＳ／ＮａＣｌ／Ｔｗｅｅｎ緩衝液を用いてストリップを再び４回洗浄した。ＴＭＢを最後に加えて、結合したビオチン化イヌ科動物ＦｃＲｎ試薬を明らかにし、ＥＬＩＳＡ中止試薬を用いて顕色を中止させた。プレートを４５０ｎｍの波長においてＥＬＩＳＡプレートリーダーで読み取った。ＯＤ値（インスリン−Ｆｃ融合タンパク質試験化合物へのイヌ科動物ＦｃＲｎの結合に比例する）を各ウェルに加えたＦｃＲｎのｌｏｇ濃度に対してプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して結合曲線を生成した。各結合曲線のＥＣ５０値を算出して異なる化合物間の比較を行った。
実施例１０：イヌまたはネコにおけるインスリンＦｃ融合タンパク質の単回投与後のインビボ薬力学（ＰＤ）の決定のための一般化された手順
以下のように空腹時血中グルコースレベルに対する効果についてインスリン−Ｆｃ融合タンパク質を査定した。Ｎ＝１、２、３またはより多くの健常の、抗体ナイーブの、体重約１０〜１５ｋｇのイヌまたは体重約５ｋｇのネコを各インスリン−Ｆｃ融合タンパク質について１匹使用した。アナフィラキシー、嗜眠、苦痛、疼痛などの徴候についても動物を１日２回観察し、任意選択的に一部の化合物について、治療を追加の３回の週毎の皮下注射またはより多くにわたり続けて、中和抗薬物抗体の潜在的な誘導の鍵となる徴候として、化合物のグルコース低下能力が経時的に減じるかどうかを観察した。０日目に、７．０〜８．０の溶液ｐＨにおいて０．０８〜０．８０ｍｇのインスリン−Ｆｃ融合タンパク質／ｋｇ（またはモルベースで１．２〜１２．３ｎｍｏｌ／ｋｇとおおよそ同等もしくは０．４〜４．０Ｕ／ｋｇとおおよそ同等のインスリン同等物）の用量において１０〜５０ｍＭのリン酸水素ナトリウム、５０〜１５０ｍＭの塩化ナトリウム、０．００５〜０．０５％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ−８０、および任意選択的に０．０２〜１．００ｍｇ／ｍＬの濃度の静菌剤（例えば、フェノール、ｍ−クレゾール、またはメチルパラベン）の溶液中に１〜１０ｍｇ／ｍＬの濃度のインスリンＦｃ融合タンパク質ホモ二量体を含有する医薬組成物の静脈内投与または皮下投与のいずれかを介して単回注射を動物に与えた。０日目に、注射の直前および注射の１５、３０、４５、６０、１２０、２４０、３６０、および４８０分後、ならびに注射の１、２、３、４、５、６、および７日後に好適な静脈から血液を収集した。
各時点について最小１ｍＬの全血を収集した。約１滴の血液を要求するグルコース計（ＡＣＣＵ−ＣＨＥＫ（登録商標） Ａｖｉｖａ Ｐｌｕｓ）を使用してグルコースレベルの読取りを直ちに決定した。０日目から７日目までの空腹時血中グルコースレベルの平均％（ＦＢＧＬ％）をプロットして所与のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の生物活性を査定した。
実施例１１：イヌ科動物またはネコ科動物におけるインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の繰返しの投与後のインビボ薬力学（ＰＤ）の決定のための一般化された手順
以下のように繰返しの注射にわたる血中グルコースレベルに対する効果についてインスリン−Ｆｃ融合タンパク質を査定した。健常な、抗体ナイーブの、体重約５〜２０ｋｇのイヌまたはネコを使用し、各動物にインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の用量を投与した。アナフィラキシー、嗜眠、苦痛、疼痛、および他の負の副作用の徴候について動物を１日２回観察し、任意選択的に一部の化合物について、治療を追加の２〜５回までの皮下注射にわたり続けて、インビボでの中和抗薬物抗体の存在の可能性を指し示す、化合物のグルコース低下能力が経時的に減少するかどうかを観察した。０日目に、７．０〜８．０の溶液ｐＨにおいて０．０８〜０．８０ｍｇのインスリン−Ｆｃ融合タンパク質／ｋｇ（またはモルベースで１．２〜１２．３ｎｍｏｌ／ｋｇとおおよそ同等もしくは０．４〜４．０Ｕ／ｋｇとおおよそ同等のインスリン同等物）の用量において１０〜５０ｍＭのリン酸水素ナトリウム、５０〜１５０ｍＭの塩化ナトリウム、０．００５〜０．０５％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ−８０、および任意選択的に０．０２〜１．００ｍｇ／ｍＬの濃度の静菌剤（例えば、フェノール、ｍ−クレゾール、またはメチルパラベン）の溶液中にインスリンＦｃ融合タンパク質を含有する医薬組成物の単回の皮下注射を動物に与えた。０日目に、注射の直前および注射の１５、３０、４５、６０、１２０、２４０、３６０、および４８０分後、ならびに注射の１、２、３、４、５、６、および７日後に好適な静脈から血液を収集した。
その後の皮下注射は週に１回以下の頻度で与え、一部の場合には、所与のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質製剤の薬力学に基づいて異なる間隔において注射を与えた。各インスリン−Ｆｃ融合タンパク質についてのその後の注射は、インスリン−Ｆｃ融合タンパク質の実証された薬力学に依存して、より高いまたはより低い用量に調整した。例えば、０日目における１回目の注射の用量が血中グルコースの低下において有効でないと見出された場合、注射されるインスリン−Ｆｃ融合タンパク質のその後の用量レベルを上向きに調整した。類似した方式において、０日目における１回目の注射の用量が強すぎる方式においてグルコースを低下させることが見出された場合、注射されるインスリン−Ｆｃ融合タンパク質のその後の用量レベルを下向きに調整した。暫定用量または最終用量を必要に応じて類似した方式において調整し得ることも見出された。各投薬について、注射の直前ならびに注射の１５、３０、４５、６０、１２０、２４０、３６０、および４８０分、および１、２、３、４、５、６、７日（および任意選択的に１４日）後に好適な静脈から血液を収集した。各時点について最小１ｍＬの全血を収集した。約１滴の血液を要求するグルコース計（ＡＣＣＵ−ＣＨＥＫ（登録商標） Ａｖｉｖａ Ｐｌｕｓ）を使用してグルコースレベルの読取りを直ちに決定した。研究の全体からの空腹時血中グルコースレベルの平均％（ＦＢＧＬ％）を時間に対してプロットすることで融合タンパク質の生物活性を決定した。
各用量の生物活性を決定するために、以下のように曲線上面積（ＡＯＣ）分析を実行した。ＦＢＧＬ％対時間データを構築した後、データを次にデータ解析ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）に入力した。ソフトウェアを使用して最初に曲線下面積分析（ＡＵＣ）を実行し、各用量についてＦＢＧＬ％対時間曲線下の面積を積分した。ＡＵＣデータを所望のＡＯＣデータに変換するために、以下の等式：ＡＯＣ＝ＴＰＡ−ＡＵＣを使用し、ここでＴＰＡは、各用量寿命（例えば、７日、１４日など）に１００％（１００％はｙ＝ＦＢＧＬ％対時間曲線の１００％を表す）を掛けることにより得られる総可能面積である。例えば、７日の所与の用量寿命および５００ＦＢＧＬ％・日の算出されたＡＵＣは、ＡＯＣについて以下を与える：ＡＯＣ＝（１００ＦＢＧＬ％×７日）−（５００ＦＢＧＬ％・日）＝２００ＦＢＧＬ％・日。解析を一連の注射された用量における各注射された用量について行って、注射１、注射２、注射３などについてのＡＯＣ値を得ることができる。
インスリン−Ｆｃ融合タンパク質の用量は以前に議論したように変動し得るので、所与のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質についての全ての算出されたＡＯＣ値をそのインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の具体的な用量に対して正規化することが多くの場合により簡便である。そうすることにより、用量レベルが所与の研究の注射にわたり変化する場合であっても、複数の注射にわたるインスリン−Ｆｃ融合タンパク質のグルコース低下効力の簡便な比較が可能となる。所与の用量についての正規化されたＡＯＣ（ＮＡＯＣ）は、ＦＢＧＬ％・日・ｋｇ／ｍｇの単位を用いて以下：ＮＡＯＣ＝ＡＯＣ／Ｄとして算出され、Ｄは、ｍｇ／ｋｇでの動物に注射された実際の用量である。ＮＡＯＣ値は、所与の動物についての一連の注射における各注射について算出されてもよく、同じインスリン−Ｆｃ融合タンパク質製剤を与えられた動物の群にわたり平均化されてもよい。
各注射（例えば、注射１、２、３、・・・Ｎ）についてＮＡＯＣ値を得、以下：ＮＡＯＣＲ＝（ＮＡＯＣ（Ｎ回目の注射）／ＮＡＯＣ（注射１））のように所与の注射についての各ＮＡＯＣを注射１からのＮＡＯＣで割ることにより、所与の動物についての一連の注射における各注射についてＮＡＯＣ比（ＮＡＯＣＲ）を算出してもよい。一連の注射におけるＮ回目の注射についての所与のインスリン−Ｆｃホモ二量体融合タンパク質製剤のＮＡＯＣＲを評価することにより、所与のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質のインビボグルコース低下活性が一連のＮ回の投薬にわたりその生物活性を実質的に保持したかどうか（例えば、０．５より高いＮ回目の投薬についてのＮＡＯＣＲ）、または、インビボでの中和抗薬物抗体の形成の可能性を指し示す、所与のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質のインビボグルコース低下活性がＮ回の投薬の過程にわたりその効力の実質的な部分を失ったかどうか（例えば、Ｎ回目の投薬のＮＡＯＣＲが０．５未満である）を決定することができる。好ましい実施形態では、１回目の皮下注射後のＮＡＯＣに対する３回目の皮下注射後のＮＡＯＣの比は０．５より高い（すなわち、３回目の皮下注射のＮＡＯＣＲは０．５より高い）。
実施例１２：イヌ科動物およびネコ科動物血清におけるインビボ薬物動態（ＰＫ）の決定のための一般化された手順
以下のようにイヌ科動物血清中のイヌ科動物アイソタイプのＦｃ断片を含むインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の濃度を測定するためのアッセイを構築した。アッセイはサンドイッチＥＬＩＳＡフォーマットを含み、該フォーマットでは、血清試料中の治療用化合物がＥＬＩＳＡプレートにコーティングされた抗インスリン／プロインスリンモノクローナル抗体（ｍＡｂ）により捕捉され、次にＨＲＰ共役抗イヌ科動物ＩｇＧ Ｆｃ特異的抗体、続いて顕色用のＴＭＢ基質システムの使用により検出される。Ｍａｘｉｓｏｒｐ ＥＬＩＳＡ Ｐｌａｔｅ（Ｎｕｎｃ）を５μｇ／ｍｌのコーティング緩衝液（ｐＨ＝９．６の炭酸ナトリウム−重炭酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｂｉｏｃａｒｂｏｎａｔｅ）緩衝液）中の抗インスリンｍＡｂクローンＤ６Ｃ４（Ｂｉｏｒａｄ）を用いて４℃で終夜コーティングする。プレートを次にＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０）を用いて５回洗浄し、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋブロッキング溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて室温で最低１時間（または４Ｃで終夜）ブロッキングする。試験血清試料をＰＢＳＴ／ＳＢ／２０％ＨＳ試料希釈緩衝液（ＰＢＳ＋０．１％のＴｗｅｅｎ ２０＋１０％のＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ＋２０％のウマ血清）に１：２０まで希釈する。標準曲線を作るために、目的のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質を１：２．５の段階希釈において２００ｎｇ／ｍｌ〜０．８２ｎｇ／ｍｌの濃度範囲で試料希釈緩衝液（ＰＢＳＴ／ＳＢ／２０％ＨＳ）＋５％のプールされたビーグル血清（ＢｉｏＩＶＴ）に希釈する。標準物質および希釈された血清試料をブロッキングされたプレートに１００μｌ／ウェルにおいて２連で加え、室温で１時間インキュベートする。インキュベーション後、試料および標準物質をＰＢＳＴを用いて５回洗浄する。ＨＲＰ共役ヤギ抗イヌ科動物ＩｇＧ Ｆｃ（Ｓｉｇｍａ）検出抗体をＰＢＳＴ／ＳＢ／２０％ＨＳ緩衝液に約１：１５，０００まで希釈し、１００μｌを全てのウェルに加え、暗所下の室温で４５分間インキュベートする。プレートをＰＢＳＴを用いて５回および脱イオン水を用いて１回洗浄し、１００μｌ／ウェルのＴＭＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を室温で８〜１０分間加えることにより顕色させる。顕色を次に１００μｌ／ウェルのＥＬＩＳＡ Ｓｔｏｐ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）の添加により中止させ、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して３０分以内に吸光度を４５０ｎｍにおいて読み取る。試料中のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質化合物の濃度をＳｏｆｔＭａｘＰｒｏソフトウェアを使用して４−ＰＬ曲線上の補間により算出する。
同様に、以下のようにネコ科動物血清中のネコ科動物アイソタイプのＦｃ断片を含むインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の濃度を測定するためのアッセイを構築した。アッセイはサンドイッチＥＬＩＳＡフォーマットを含み、該フォーマットでは、血清試料中の治療用化合物がＥＬＩＳＡプレートにコーティングされた抗インスリン／プロインスリンｍＡｂにより捕捉され、次にＨＲＰ共役ヤギ抗ネコ科動物ＩｇＧ Ｆｃ特異的抗体、続いて顕色用のＴＭＢ基質システムの使用により検出される。Ｍａｘｉｓｏｒｐ ＥＬＩＳＡ Ｐｌａｔｅ（Ｎｕｎｃ）を５μｇ／ｍｌのコーティング緩衝液（ｐＨ＝９．６の炭酸ナトリウム−重炭酸ナトリウム緩衝液）中の抗インスリンｍＡｂクローンＤ６Ｃ４（Ｂｉｏｒａｄ）を用いて４℃で終夜コーティングする。プレートを次にＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０）を用いて５回洗浄し、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋブロッキング溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて室温で最低１時間（または４Ｃで終夜）ブロッキングする。試験血清試料をＰＢＳＴ／ＳＢ／２０％ＨＳ試料希釈緩衝液（ＰＢＳ＋０．１％のＴｗｅｅｎ ２０＋１０％のＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ＋２０％のウマ血清）に１：２０まで希釈する。標準曲線を作るために、目的のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質化合物を１：２．５の段階希釈において２００ｎｇ／ｍｌ〜０．８２ｎｇ／ｍｌの濃度範囲で試料希釈緩衝液（ＰＢＳＴ／ＳＢ／２０％ＨＳ）＋５％の正常ネコ血清（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）に希釈する。標準物質および希釈された血清試料をブロッキングされたプレートに１００μｌ／ウェルにおいて２連で加え、室温で１時間インキュベートする。インキュベーション後、試料および標準物質をＰＢＳＴを用いて５回洗浄する。ＨＲＰ共役ヤギ抗ネコ科動物ＩｇＧ Ｆｃ（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂ）検出抗体をＰＢＳＴ／ＳＢ／２０％ＨＳ緩衝液に約１：２０，０００まで希釈し、１００μｌを全てのウェルに加え、暗所下の室温で４５分間インキュベートする。プレートをＰＢＳＴを用いて５回および脱イオン水を用いて１回洗浄し、１００μｌ／ウェルのＴＭＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を室温で８〜１０分間加えることにより顕色させる。顕色を次に１００μｌ／ウェルのＥＬＩＳＡ Ｓｔｏｐ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）の添加により中止させ、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して３０分以内に吸光度を４５０ｎｍにおいて読み取る。試料中のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質化合物の濃度をＳｏｆｔＭａｘＰｒｏソフトウェアを使用して４−ＰＬ曲線上の補間により算出する。
実施例１３：イヌ科動物血清中の抗薬物抗体を測定するためのアッセイプロトコール
試験化合物に対するＡＤＡを測定するためにＭａｘｉｓｏｒｐ ＥＬＩＳＡ Ｐｌａｔｅ（Ｎｕｎｃ）を１０μｇ／ｍＬのコーティング緩衝液（ｐＨ＝９．６の炭酸塩−重炭酸塩（Ｂｉｏｃａｒｂｏｎａｔｅ）緩衝液）に希釈した目的のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質を用いて４℃で終夜コーティングする。イヌ科動物ＩｇＧ起源のＦｃ断片を含有するインスリン−Ｆｃ融合タンパク質のインスリン部分に対するＡＤＡを測定するために、コーティング緩衝液中の３０μｇ／ｍＬの精製されたインスリンを用いてプレートをコーティングする。プレートを次にＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０）を用いて５回洗浄し、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋブロッキング溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ ＭＡ）を用いて少なくとも１時間（または終夜）ブロッキングする。イヌ科動物ＩｇＧ単位におけるＡＤＡを算出するために、３００〜４．６９ｎｇ／ｍｌの濃度のｐＨ＝９．６のＣａｒｂ−Ｂｉｏｃａｒｂコーティング緩衝液中のイヌ科動物ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ ＰＡ）の１：２の段階希釈液を用いてストリップを４℃で終夜直接的にコーティングし、それを使用して７点の偽性標準曲線を作製する。標準物質ストリッププレートもまた洗浄し、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋブロッキング溶液を用いて少なくとも１時間（または終夜）ブロッキングする。
試験血清試料をＰＢＳＴ／ＳＢ／２０％ＨＳ試料希釈緩衝液（ＰＢＳ＋０．１％のＴｗｅｅｎ ２０＋１０％のＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ＋２０％のウマ血清）に１：１００より高いまたはそれに等しくなるまで（典型的には１：２００として試験する）希釈し、それを１００μＬ／ウェルにおいて２連でインスリン−Ｆｃ融合タンパク質コーティング（またはＲＨＩコーティング）ストリップに加える。イヌ科動物ＩｇＧコーティング標準物質ストリップの重複ストリップもまた各プレートに加え、１００μＬ／ウェルのＰＢＳＴ／ＳＢ（ＰＢＳ＋０．１％のＴｗｅｅｎ ２０＋１０％のＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ）緩衝液を充填する。プレートをＲＴで１時間インキュベートし、次にＰＢＳＴを用いて５回洗浄する。ＡＤＡの検出のために、ＨＲＰ共役ヤギ抗ネコ科動物ＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２（抗ネコ科動物ＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２試薬はイヌ科動物抗体に対して交差反応する；Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ ＰＡ）をＰＢＳＴ／ＳＢに１：１００００まで希釈し、試料ウェルおよび標準物質ウェルの両方に１００μＬ／ウェルにおいて加え、暗所下のＲＴで４５分間インキュベートする。プレートをＰＢＳＴを用いて５回、次に脱イオン水を用いて１回洗浄し、次に１００μＬ／ウェルのＴＭＢ基質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ ＭＡ）を暗所下の室温で１５〜２０分間加えることにより顕色させる。顕色を次に１００μＬ／ウェルのＥＬＩＳＡ Ｓｔｏｐ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）の添加により中止させ、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダーを使用して３０分以内に４５０ｎｍにおける吸光度を読み取る。ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ ＣＡ）を使用して４−ＰＬ偽性標準曲線においてＯＤ値を補間することにより抗薬物抗体濃度を決定する。
検出されるＡＤＡの特異性を実証するために、「阻害」アッセイを実行する。薬物阻害ＡＤＡアッセイにおいて、血清試料をＰＢＳＴ／ＳＢ／２０％ＨＳ緩衝液に１：１００で希釈し、等しい体積の３００μｇ／ｍＬの関連する治療用化合物（１：２００の最終の試料希釈および１５０μｇ／ｍＬの最終の阻害化合物）と混合し、室温で３０〜４０分間インキュベートして抗薬物抗体を遊離阻害剤（すなわち、治療用化合物）に結合させる。プレインキュベーション後に、試料をインスリン−Ｆｃ融合タンパク質コーティング（またはＲＨＩコーティング）ストリップに１００μＬ／ウェルにおいて２連で加える。阻害化合物を含まないＰＢＳＴ／ＳＢ／２０％ＨＳ緩衝液に１：２００で希釈した試料もまた、イヌ科動物ＩｇＧコーティング標準物質の重複ストリップと共に試料プレートにおいて試験する。アッセイ手順の残りのステップは上記のように実行する。薬物阻害ウェルにおいて測定されるＡＤＡは、ＡＤＡの特異性を査定するために非阻害のＡＤＡ濃度とマッチさせる。ＡＤＡシグナルの有意な阻害が薬物阻害ウェルにおいて観察される場合、これは、ＡＤＡは治療用化合物に特異的であることを意味する。
実施例１４：ネコ科動物血清中の抗薬物抗体を測定するためのアッセイプロトコール
ネコ科動物ＩｇＧ起源のＦｃ断片を含有するインスリン−Ｆｃ融合タンパク質に対するＡＤＡを測定するためにＭａｘｉｓｏｒｐ ＥＬＩＳＡ Ｐｌａｔｅ（Ｎｕｎｃ）を１０μｇ／ｍＬのコーティング緩衝液（ｐＨ＝９．６の炭酸塩−重炭酸塩緩衝液）に希釈した目的のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質を用いて４℃で終夜コーティングする。インスリン−Ｆｃ融合タンパク質のインスリン部分に対するＡＤＡを測定するために、コーティング緩衝液中の３０μｇ／ｍＬの精製されたインスリンを用いてプレートをコーティングする。プレートを次にＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０）を用いて５回洗浄し、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋブロッキング溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ ＭＡ）を用いて少なくとも１時間（または終夜）ブロッキングする。ネコ科動物ＩｇＧ単位におけるＡＤＡを算出するために、３００〜４．６９ｎｇ／ｍｌの濃度のｐＨ＝９．６の炭酸ナトリウム−重炭酸ナトリウムコーティング緩衝液中のネコ科動物ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ ＰＡ）の１：２の段階希釈液を用いてストリップを４℃で終夜直接的にコーティングし、それを使用して７点の偽性標準曲線を作製する。標準物質ストリッププレートもまた洗浄し、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋブロッキング溶液を用いて少なくとも１時間（または終夜）ブロッキングする。
試験血清試料をＰＢＳＴ／ＳＢ／２０％ＨＳ試料希釈緩衝液（ＰＢＳ＋０．１％のＴｗｅｅｎ ２０＋１０％のＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ＋２０％のウマ血清）に１：１００より高いまたはそれに等しくなるまで（典型的には１：２００として試験する）希釈し、それを１００μＬ／ウェルにおいて２連でインスリン−Ｆｃ融合タンパク質コーティング（またはＲＨＩコーティング）ストリップに加える。ネコ科動物ＩｇＧコーティング標準物質ストリップの重複ストリップもまた各プレートに加え、１００μＬ／ウェルのＰＢＳＴ／ＳＢ（ＰＢＳ＋０．１％のＴｗｅｅｎ ２０＋１０％のＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ）緩衝液を充填する。プレートを室温で１時間インキュベートし、次にＰＢＳＴを用いて５回洗浄する。ＡＤＡの検出のために、ＨＲＰ共役ヤギ抗ネコ科動物ＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ ＰＡ）を１：１００００の係数でＰＢＳＴ／ＳＢに希釈し、試料ウェルおよび標準物質ウェルの両方に１００μＬ／ウェルにおいて加え、暗所下の室温で４５分間インキュベートする。プレートをＰＢＳＴを用いて５回、脱イオン水を用いて１回洗浄し、１００μＬ／ウェルのＴＭＢ基質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を暗所下の室温で１５〜２０分間加えることにより顕色させる。顕色を次に１００μＬ／ウェルのＥＬＩＳＡ Ｓｔｏｐ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ａｓｈｌａｎｄ ＭＡ）の添加により中止させ、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダーを使用して３０分以内に４５０ｎｍにおける吸光度を読み取る。ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ ＣＡ）を使用して４−ＰＬ偽性標準曲線においてＯＤ値を補間することにより抗薬物抗体濃度を決定する。
実施例１５：免疫原性エピトープの同定のためのアッセイ手順
Ｍａｘｉｓｏｒｐ ＥＬＩＳＡマイクロプレート（Ｎｕｎｃ）を既知のアミノ酸配列を有するインスリン−Ｆｃ融合タンパク質ホモ二量体化合物のライブラリーを用いてコーティングし、ライブラリー中の各化合物をＥＬＩＳＡマイクロプレートウェルの別々の個々のストリップにコーティングする以外は抗薬物抗体ＥＬＩＳＡアッセイの実施例１３および１４に記載されるものと類似の方式において、コーティングされたプレートをブロッキングする。ライブラリー中の化合物は、異なるインスリンポリペプチドアミノ酸組成を有する広範なインスリン−Ｆｃ融合タンパク質を含み、これには、様々なＢ鎖、Ｃ鎖、およびＡ鎖アミノ酸突然変異、異なるリンカー組成、ならびにヒト起源のものを含む、異なるＦｃ断片組成が含まれる。別々に、実施例１３および１４に記載されるように、それぞれイヌ科動物またはネコ科動物ＩｇＧ単位における抗薬物抗体（ＡＤＡ）を算出するために、一部のプレートストリップウェルをイヌ科動物またはネコ科動物ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ ＰＡ）の１：２の段階希釈液を用いて直接的にコーティングする。
インスリン−Ｆｃ融合タンパク質の繰返しの投薬を与えられた個々のイヌまたはネコから得られる血清を抗薬物抗体ＥＬＩＳＡアッセイ（イヌについて実施例１３およびネコについて実施例１４）において最初にスクリーニングする。実施例１３または実施例１４のアッセイにおいて中等度または高い陽性（例えば、中等度または高いタイターの抗体）を実証した血清試料をＰＢＳＴ／ＳＢ／２０％ＨＳ試料希釈緩衝液（ＰＢＳ＋０．１％のＴｗｅｅｎ ２０＋１０％のＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ＋２０％のウマ血清）に段階希釈（１：２００〜１：８０００）し、インスリン−Ｆｃ融合タンパク質化合物のライブラリーを用いてコーティングされたプレートにＲＴで１時間加える。インキュベーション後に、プレートをＰＢＳＴを用いて５回洗浄する。コーティングされた化合物ライブラリーに交差反応することができるイヌ科動物またはネコ科動物抗体の検出のために、イヌ科動物およびネコ科動物の両方のＩｇＧに交差反応性であるＨＲＰ共役ヤギ抗ネコ科動物ＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ ＰＡ）をＰＢＳＴ／ＳＢに１：１００００まで希釈し、試料ウェルおよび標準物質ウェルの両方に１００μＬ／ウェルにおいて加え、暗所下のＲＴで４５分間インキュベートする。プレートをＰＢＳＴを用いて５回、脱イオン水を用いて１回洗浄し、１００μＬ／ウェルのＴＭＢ基質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ ＭＡ）を暗所下のＲＴで１５〜２０分間加えることにより顕色させる。顕色を次に１００μＬ／ウェルのＥＬＩＳＡ Ｓｔｏｐ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ａｓｈｌａｎｄ ＭＡ）の添加により中止させ、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダーを使用して３０分以内に４５０ｎｍにおける吸光度を読み取る。ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ ＣＡ）を使用して直接的にコーティングされたイヌ科動物またはネコ科動物ＩｇＧ抗体対照に対する４−ＰＬ偽性標準曲線においてＯＤ値を補間することにより血清試料中に存在する抗化合物交差反応性抗体濃度を決定する。
アッセイからの結果としてもたらされた抗体濃度をコーティングされたインスリン−Ｆｃ融合タンパク質ライブラリーの既知のアミノ酸組成と相関させることにより、具体的なアミノ酸突然変異またはエピトープが、アッセイにおける総抗体シグナルの０、一部、ほとんど、または全てを引き起こす原因となるかどうかを決定することができ、これは、様々なインスリン−Ｆｃ融合タンパク質ホモ二量体への結合なし、弱い結合、または強い結合を指し示す。中等度または強い結合の原因となる突然変異またはエピトープは、本明細書において免疫原性「ホットスポット」と称される。
実施例１６：高いホモ二量体タイターならびに標的種における許容されるレベルの急性および繰返しの投薬の生物活性を有するインスリン−Ｆｃ融合タンパク質を得るための設計プロセス
本発明の詳細な説明に記載の設計目標を満たすためのプロセスは以下のステップを含んだ。最初に、結果としてもたらされるインスリン−Ｆｃ融合タンパク質が最小の免疫原性を有する長期作用性の生物活性製造物をもたらす可能性が最も高くなるように配列番号４または配列番号５のインスリンポリペプチドを具体的なＩｇＧアイソタイプの種特異的Ｆｃ断片およびリンカーと組み合わせた（例えば、最小のＦｃ（ガンマ）受容体Ｉ結合を有する種特異的ＩｇＧアイソタイプを選んだ）。所望の融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を調製し、ベクター（ＬａｋｅＰｈａｒｍａ、Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ、ＣＡ）にクローニングし、次に実施例１に記載の手順にしたがってベクターを使用してＨＥＫ細胞に一過的にトランスフェクトした。インスリン−Ｆｃ融合タンパク質を次に実施例３にしたがって精製し、実施例６にしたがって全体的なタンパク質収率およびホモ二量体％を測定した。５０ｍｇ／Ｌより高いホモ二量体タイターを有する候補のみを許容されると考え、その理由は、このレベルより低いタイターは、獣医学的製造物についての厳密に低い生産コスト要求を満たす商用の製造タイターを結果としてもたらさないようであるからである。選択されたインスリン−Ｆｃ融合タンパク質を次に実施例７に記載されるようにインビトロインスリン受容体結合研究を通じて生物活性の指標についてスクリーニングした。経験に基づけば、５０００ｎＭ未満のＩＲ活性ＩＣ５０値を呈する化合物のみを標的種において生物活性を呈するようであるとみなした。インビトロＩＲ ＩＣ５０値は有用な定性的なスクリーニングツールであるが、それはヒトインスリン受容体を発現するヒトＩＭ−９細胞を利用し、したがって、イヌ科動物またはネコ科動物ＩＲとヒトＩＲとの間の親和性における一部の小さい差異を捕捉しない可能性がある。さらには、インスリン受容体結合以外の因子が、インビボで化合物の生物活性に影響を及ぼす（例えば、イヌ科動物またはネコ科動物ＦｃＲｎに対する親和性がインビボで延長された薬物動態排出半減期を可能とする）可能性がある。したがって、生産およびＩＲ活性ＩＣ５０値の見地から許容される選択されたインスリン−Ｆｃ融合タンパク質を目的の動物（例えば、イヌまたはネコ）における生物活性についてさらにスクリーニングして、所望されるものより低い効力および／または生物活性の継続期間（例えば、１５０ＦＢＧＬ％・日・ｋｇ／ｍｇ未満のＮＡＯＣ）を有する任意の材料をスクリーニングにより除外した。ここでもまた、経験に基づけば、１５０ＦＢＧＬ％・日・ｋｇ／ｍｇより高いＮＡＯＣ値において、標的種における用量要求は、許容される治療コストに達するように十分に低いものとなる。最後に、当該技術分野においてあったとしてもほとんど言及されない追加の評価基準を加えた。以下の実施例においてより詳細に議論するように、１回目の投薬後に標的種において許容されるＮＡＯＣレベルを呈する多くのインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の実施形態は、予想外なことに、繰返しの投薬後にそのレベルの生物活性を維持しない。さらには、ほとんどの場合に、標的種における繰返しの投薬での生物活性の低減は、中和抗薬物抗体の発生と相関している。抗薬物抗体を生成するこの傾向および活性を維持しないことは、そのようなインスリン−Ｆｃ融合タンパク質を、イヌ科動物糖尿病またはネコ科動物糖尿病などの慢性疾患の治療において使用するために実用的でないものとする。したがって、最小のレベルの抗薬物抗体と共に許容されるレベルの繰返しの投薬での生物活性（例えば、１回目の投薬に対する３回目の投薬についての０．５０より高いＮＡＯＣＲ値）を呈するインスリン−Ｆｃ融合タンパク質のみを、本発明において使用するために許容されるとみなした。
結果 − イヌ科動物Ｆｃ断片を含むインスリン−ＦＣ融合タンパク質
実施例１７：イヌ科動物Ｆｃ ＩｇＧＡアイソタイプを含むイヌ科動物インスリン−Ｆｃ融合タンパク質
配列番号１２のペプチドリンカーを使用して配列番号５のインスリンポリペプチド配列およびイヌ科動物ＩｇＧＡアイソタイプのＦｃ断片（配列番号１５）を含むインスリン−Ｆｃ融合タンパク質を製造することを試みた。結果としてもたらされるインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の全長アミノ酸配列は以下の通りである：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＤＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＤＰＴＧＧＧＰＲＲＧＩＶＥＱＣＣＨＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮＧＧＧＧＡＧＧＧＧＲＣＴＤＴＰＰＣＰＶＰＥＰＬＧＧＰＳＶＬＩＦＰＰＫＰＫＤＩＬＲＩＴＲＴＰＥＶＴＣＶＶＬＤＬＧＲＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＥＶＨＴＡＫＴＱＳＲＥＱＱＦＮＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＥＨＱＤＷＬＴＧＫＥＦＫＣＲＶＮＨＩＤＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＲＡＨＫＰＳＶＹＶＬＰＰＳＰＫＥＬＳＳＳＤＴＶＳＩＴＣＬＩＫＤＦＹＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＲＫＨＲＭＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＱＧＤＰＦＴＣＡＶＭＨＥＴＬＱＮＨＹＴＤＬＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号４２）
配列番号４２のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質を実施例１にしたがってＨＥＫ細胞中で合成し、実施例３にしたがって精製した。タンパク質収率はタンパク質精製ステップ後に２２ｍｇ／Ｌであった。インスリン−Ｆｃ融合タンパク質の構造を非還元および還元ＣＥ−ＳＤＳにより実施例４にしたがって確認し、配列を実施例５にしたがってグリカン除去を用いてＬＣ−ＭＳによりさらに同定した。ホモ二量体％を実施例６にしたがってサイズ排除クロマトグラフィーにより測定したところ２４％であると決定され、高い程度のホモ二量体凝集物を指し示した。結果としてもたらされたホモ二量体タイターはしたがって５ｍｇ／Ｌに過ぎなかった。要約すると、ＨＥＫ細胞中での配列番号４２のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の生産は、高いレベルの凝集物および低いホモ二量体タイター（５ｍｇ／Ｌ）を結果としてもたらし、これは５０ｍｇ／Ｌより高いホモ二量体タイターの設計目標を満たさなかった。
それにもかかわらず、配列番号４２のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質を生物活性について評価した（ａｓ ｅｖａｌｕａｔｅｄ）。最初に、配列番号４２のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質のインスリン受容体結合を実施例７にしたがって測定したところ２，７３３ｎＭのＩＣ５０値が結果としてもたらされ、化合物はインビボで生物活性であるらしいこと（すなわち、５０００ｎＭ未満のＩＣ５０）を指し示した。
次に、実施例１０にしたがって、Ｎ＝３のイヌ科動物への化合物の単回静脈内投与後に配列番号４２のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質のインビボ薬力学（ＰＤ）を測定した。図２は、配列番号４２の空腹時血中グルコースレベルのパーセントを時間の関数として示す。配列番号４２のＮＡＯＣは、実施例１１の手順にしたがって１０５ＦＢＧＬ％・日・ｋｇ／ｍｇであると算出された。配列番号４２のインビボ半減期は、実施例１２の方法を使用して１日未満であると算出された。比較的低いＮＡＯＣは、試料中の凝集物の多い量（すなわち、低いホモ二量体％）の結果であったようであり、可溶性のホモ二量体が循環中に残存したが、依然として１日未満の薬物動態排出半減期を有したに過ぎず、これは週に１回の投与のサポートとはならないようであるとみなされた。
実施例１８：イヌ科動物ＩｇＧＡアイソタイプを含むインスリン−Ｆｃ融合タンパク質のＦｃ断片領域の突然変異
配列番号４２のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質のホモ二量体％含有量を増加させ、生物活性を向上させ、かつ半減期を増加させることを試みて、突然変異をＦｃ断片ＣＨ３領域に挿入して、分子間会合（例えば、分子間のＦｃ断片−Ｆｃ断片相互作用）を予防し、かつＦｃＲｎ受容体へのより強い結合（例えば、ＦｃＲｎに対するより高い親和性）を促して、再利用および全身循環時間を増加させることを試みた。以下のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質を実施例１にしたがってＨＥＫ細胞中で合成し、実施例３にしたがって精製し、実施例４〜７にしたがって試験し、それを以下に示す。配列番号４２に対する配列番号４４、４６、４８、および５０の配列アライメントならびにアミノ酸配列における差異を図３に示す。
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＤＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＤＰＴＧＧＧＰＲＲＧＩＶＥＱＣＣＨＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮＧＧＧＧＡＧＧＧＧＲＣＴＤＴＰＰＣＰＶＰＥＰＬＧＧＰＳＶＬＩＦＰＰＫＰＫＤＩＬＲＩＴＲＴＰＥＶＴＣＶＶＬＤＬＧＲＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＥＶＨＴＡＫＴＱＳＲＥＱＱＦＮＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＥＨＱＤＷＬＴＧＫＥＦＫＣＲＶＮＨＩＤＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＲＡＨＫＰＳＶＹＶＬＰＰＳＰＫＥＬＳＳＳＤＴＶＳＩＴＣＬＩＫＤＦＹＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＲＫＨＲＭＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＱＧＤＰＦＴＣＡＶＬＨＥＡＬＨＳＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号４４）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＤＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＤＰＴＧＧＧＰＲＲＧＩＶＥＱＣＣＨＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮＧＧＧＧＡＧＧＧＧＲＣＴＤＴＰＰＣＰＶＰＥＰＬＧＧＰＳＶＬＩＦＰＰＫＰＫＤＩＬＲＩＴＲＴＰＥＶＴＣＶＶＬＤＬＧＲＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＥＶＨＴＡＫＴＱＳＲＥＱＱＦＮＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＥＨＱＤＷＬＴＧＫＥＦＫＣＲＶＮＨＩＤＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＲＡＨＫＰＳＶＹＶＬＰＰＳＰＫＥＬＳＳＳＤＴＶＳＩＴＣＬＩＫＤＦＹＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＲＫＨＲＭＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＱＧＤＰＦＴＣＡＶＬＨＥＴＬＱＳＨＹＴＤＬＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号４６）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＤＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＤＰＴＧＧＧＰＲＲＧＩＶＥＱＣＣＨＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮＧＧＧＧＡＧＧＧＧＲＣＴＤＴＰＰＣＰＶＰＥＰＬＧＧＰＳＶＬＩＦＰＰＫＰＫＤＩＬＲＩＴＲＴＰＥＶＴＣＶＶＬＤＬＧＲＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＥＶＨＴＡＫＴＱＳＲＥＱＱＦＮＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＥＨＱＤＷＬＴＧＫＥＦＫＣＲＶＮＨＩＤＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＲＡＨＫＰＳＶＹＶＬＰＰＳＰＫＥＬＳＳＳＤＴＶＳＩＴＣＬＩＫＤＦＹＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＲＫＨＲＭＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＱＧＤＰＦＴＣＡＶＭＨＥＴＬＱＳＨＹＴＤＬＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号４８）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＤＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＤＰＴＧＧＧＰＲＲＧＩＶＥＱＣＣＨＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮＧＧＧＧＡＧＧＧＧＲＣＴＤＴＰＰＣＰＶＰＥＰＬＧＧＰＳＶＬＩＦＰＰＫＰＫＤＩＬＲＩＴＲＴＰＥＶＴＣＶＶＬＤＬＧＲＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＥＶＨＴＡＫＴＱＳＲＥＱＱＦＮＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＥＨＱＤＷＬＴＧＫＥＦＫＣＲＶＮＨＩＤＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＲＡＨＫＰＳＶＹＶＬＰＰＳＰＫＥＬＳＳＳＤＴＶＳＩＴＣＬＩＫＤＦＹＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＲＫＨＲＭＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＱＧＤＰＦＴＣＡＶＬＨＥＴＬＱＮＨＹＴＤＬＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号５０）
イヌ科動物ＩｇＧＡ変種に基づくインスリン−Ｆｃ融合タンパク質を、対応するタンパク質収率、ホモ二量体％、およびホモ二量体タイターと共に表２に列記する。結果は、ＩｇＧＡ Ｆｃ断片への様々な突然変異は、ホモ二量体％およびホモ二量体タイターを向上させる代わりに、５ｍｇ／Ｌ未満の極めて低いホモ二量体タイターを有する高度に凝集したタンパク質を生じさせたことを示す。そのため、化合物のインビボでの生物活性および薬物動態を評価することはできなかった。
Figure 2021530210
実施例１９：他のイヌ科動物Ｆｃ断片アイソタイプを使用したイヌ科動物インスリン−Ｆｃ融合タンパク質
上記のように、イヌ科動物ＩｇＧＡは、イヌ科動物におけるＦｃ（ガンマ）Ｉエフェクター機能の欠如に起因してイヌのための非免疫原性のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質を製造するためのＦｃ断片の好ましいアイソタイプであると考えられる（ヒトにおけるヒトＩｇＧ２アイソタイプとよく似ている）。しかしながら、イヌ科動物ＩｇＧＡ Ｆｃ断片を用いて生産されたインスリン−Ｆｃ融合タンパク質は、許容できない低いホモ二量体タイターならびに許容できない低いレベルの生物活性および作用の継続期間と共に高度に凝集した。したがって、他のイヌ科動物ＩｇＧアイソタイプ（配列番号１６のイヌ科動物ＩｇＧＢ）、配列番号１７のイヌ科動物ＩｇＧＣ、および配列番号１８のイヌ科動物ＩｇＧＤ）からのＦｃ断片を配列番号４２のインスリン−Ｆｃ融合物のイヌ科動物ＩｇＧＡ Ｆｃ断片用の置換物として評価した。イヌ科動物ＩｇＧＢ、ＩｇＧＣ、およびＩｇＧＤアイソタイプに基づくＦｃ断片を含有する３つのインスリン−Ｆｃ融合タンパク質を、配列番号４２のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質を作るために使用したものと同じ配列番号５のインスリンポリペプチドおよび配列番号１２のペプチドリンカーを使用して合成した。タンパク質を実施例１にしたがってＨＥＫ２９３細胞中で生産した。インスリン−Ｆｃ融合タンパク質を次に実施例３にしたがってプロテインＡカラムを使用して精製した。インスリン−Ｆｃ融合タンパク質の構造を非還元および還元ＣＥ−ＳＤＳにより実施例４にしたがって確認し、配列を実施例５にしたがってグリカン除去を用いてＬＣ−ＭＳによりさらに同定した。ホモ二量体％を実施例６にしたがってサイズ排除クロマトグラフィーにより測定した。それらの配列を以下に示し、配列番号４２に対するそれらの配列アライメント比較を図４に示す：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＤＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＤＰＴＧＧＧＰＲＲＧＩＶＥＱＣＣＨＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮＧＧＧＧＡＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＮＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号５２）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＤＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＤＰＴＧＧＧＰＲＲＧＩＶＥＱＣＣＨＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮＧＧＧＧＡＧＧＧＧＣＮＮＣＰＣＰＧＣＧＬＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＩＬＶＴＡＲＴＰＴＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＮＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＳＫＱＶＱＴＡＮＴＱＰＲＥＥＱＳＮＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＳＧＫＱＦＫＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＥＩＩＳＫＴＰＧＱＡＨＱＰＮＶＹＶＬＰＰＳＲＤＥＭＳＫＮＴＶＴＬＴＣＬＶＫＤＦＦＰＰＥＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＭＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＩＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号５４）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＤＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＤＰＴＧＧＧＰＲＲＧＩＶＥＱＣＣＨＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮＧＧＧＧＡＧＧＧＧＣＩＳＰＣＰＶＰＥＳＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＩＬＲＩＴＲＴＰＥＩＴＣＶＶＬＤＬＧＲＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＥＶＨＴＡＫＴＱＰＲＥＱＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＥＨＱＤＷＬＴＧＫＥＦＫＣＲＶＮＨＩＧＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＰＫＥＬＳＳＳＤＴＶＴＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＥＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＰＥＰＥＳＫＹＨＴＴＡＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＱＧＤＴＦＴＣＡＶＭＨＥＡＬＱＮＨＹＴＤＬＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号５６）
結果としてもたらされたタンパク質収率、ホモ二量体％、およびホモ二量体タイターを表３に与える。予想外なことに、イヌ科動物ＩｇＧＢアイソタイプに基づくＦｃ断片を含む配列番号５２のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質のみが、５０ｍｇ／Ｌより高い設計基準を満たすホモ二量体タイターを実証した。イヌ科動物ＩｇＧＣアイソタイプに基づくＦｃ断片を含む配列番号５４のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質は、全くいかなる化合物ももたらさず、イヌ科動物ＩｇＧＤアイソタイプに基づくＦｃ断片を含む配列番号５６のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質は、認識可能なタンパク質収率を実証せず、高い程度の凝集、したがって許容できない低いホモ二量体タイターを有した。
配列番号５２および配列番号５６のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質のインビトロインスリン受容体結合を実施例７の手順にしたがって試験した。配列番号５６のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質は５０００ｎＭより高いＩＣ５０を実証し、化合物はインビボで生物活性を示さない可能性が非常に高いことを指し示した。しかしながら、配列番号５２のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質は２８ｎＭのＩＣ５０を実証し、この配列はインビボで生物活性であるらしいことを指し示した。
Figure 2021530210
実施例２０：イヌ科動物ＩｇＧＢアイソタイプＦｃ断片を有する配列番号５のインスリンポリペプチドを含むインスリン−Ｆｃ融合タンパク質のインビボでの有効性
実施例１９における有望なホモ二量体タイターおよびインスリン受容体活性の結果を考慮して、Ｎ＝３の健常な、抗体ナイーブの、体重約１０ｋｇのビーグル犬のそれぞれにおける静脈注射後に配列番号５２のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質を実施例１０にしたがってインビボでの生物活性について試験した。別々の実験において、化合物をＮ＝３のナイーブビーグル犬の皮下に投与した。図５は、配列番号５２のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の単回静脈内投与についてのＦＢＧＬ％対時間を示し、図６は、配列番号５２のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の単回皮下投与についてのＦＢＧＬ％対時間を示し、これらの両方は、配列番号５２のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質はイヌにおいて有意に生物活性であることを実証する。
ＮＡＯＣを実施例１１の手順にしたがって算出して、インスリン−Ｆｃ融合タンパク質の相対的な生物活性および作用の継続期間を決定した。静脈内に注射された配列番号５２のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質のＮＡＯＣは３９９ＦＢＧＬ％・日・ｋｇ／ｍｇであり、これは静脈内に注射された配列番号４２のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質のＮＡＯＣの３．８倍であり、イヌ科動物ＩｇＧＡ Ｆｃ断片を含むインスリン−Ｆｃ融合タンパク質に対するイヌ科動物ＩｇＧＢ Ｆｃ断片を含むインスリン−Ｆｃ融合タンパク質についての有意に増加した生物活性を示した。皮下に注射された配列番号５２のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質のＮＡＯＣは３６６ＦＢＧＬ％・日・ｋｇ／ｍｇであり、静脈内投与を介して得られたものに類似する皮下投与を介する生物活性のレベルを実証した。
実施例２１：イヌ科動物ＩｇＧＢアイソタイプＦｃ断片を有する配列番号５のインスリンポリペプチドを含むインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の繰返しの皮下投薬後のインビボ免疫原性スクリーニング
次に、配列番号５２のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の繰返し投薬皮下生物活性を実施例１１に記載の方法の通りにイヌにおいて試験した。Ｎ＝３の動物の皮下に０日目、ａｔ ３５日目、および４２日目に投薬を行い、ＦＢＧＬ％を実施例１１にしたがって各投薬後の７日ウィンドウにわたり測定した。ＮＡＯＣおよびＮＡＯＣＲを各繰返しの皮下注射について実施例１１の手順にしたがって算出した。表４に示されるように、イヌにおける繰返しの皮下投薬は、予想外なことに、ＮＡＯＣＲの有意な減少（すなわち、３回目の注射についてのＮＡＯＣは１回目の注射についてのＮＡＯＣの０．４０、または４０％に過ぎなかった）により測定されたように３回目の投薬による生物活性の有意な減衰を明らかにした。
Figure 2021530210
いかなる具体的な説明にも縛られないが、イヌにおける３回目の繰返しの皮下投薬後の配列番号５２のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の生物活性における有意な低減の原因は、その生物学的活性を中和する抗薬物抗体の発生に起因することが想定された。抗薬物抗体は、インスリン−Ｆｃ融合タンパク質のインスリンポリペプチド、リンカー、またはＦｃ断片部分を標的としている可能性がある。免疫原性応答は、抗原提示細胞、Ｔヘルパー細胞、Ｂ細胞、およびそれらの関連付けられるサイトカインの間の相互作用として現れ、薬物に対する内因性の抗体（例えば、抗薬物抗体）の産生に繋がり得る。結合抗体は、インスリン−Ｆｃ融合タンパク質に結合することができる全てのアイソタイプであり、これらは実施例１３に記載されるようなイムノアッセイにおいて検出され得る。インスリン−Ｆｃ融合タンパク質の機能的活性を阻害する中和抗体は、一般に、生物活性のために要求されるエピトープを標的とする。これが該当するかどうかを査定するために、各用量の投与前ならびに実施例１１および１２に記載の実験の終了時に収集した血清を試験して、実施例１３にしたがって抗薬物抗体のレベルを定量化した。図７に示すように、抗薬物抗体のレベルは化合物の複数回皮下投与と共に実際に増加し、中和抗薬物抗体の生成が、配列番号５２のインスリンＦｃ融合タンパク質の３回目の注射後のＮＡＯＣＲの低減の原因であるらしいことを指し示した。
実施例２２：免疫原性の潜在的なリスクを低減するためのイヌ科動物ＩｇＧＢアイソタイプＦｃ断片を有する配列番号５のインスリンポリペプチドを含む非グリコシル化インスリン−Ｆｃ融合タンパク質
実施例１９および２０に示したように、配列番号５２のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質は、イヌにおいて許容されるホモ二量体％含有量、ホモ二量体タイター、および生物活性を示したが、糖尿病などの慢性疾患のためのその使用は、繰返しの皮下投薬での生物活性の低減（実施例２１）および抗薬物抗体の生成（実施例２１）により損なわれる。いかなる具体的な理論にも縛られないが、抗薬物抗体の生成および生物活性の低減の１つのあり得る原因は、イヌ科動物免疫系の様々な受容体（例えば、Ｆｃ（ガンマ）受容体、例えば、Ｆｃ（ガンマ）ＲＩ）とのイヌ科動物ＩｇＧＢ Ｆｃ断片の相互作用の増加である。それにもかかわらず、イヌ科動物ＩｇＧＢアイソタイプは、Ｆｃ断片のために使用された場合に、生産可能性および単回投薬での生物活性の設計目標を満たすインスリン−Ｆｃ融合タンパク質を結果としてもたらす、４つのイヌ科動物ＩｇＧアイソタイプのうちのただ１つのものであった（実施例１６）。本発明の詳細な説明に記載されるように、Ｆｃ（ガンマ）相互作用を低減する１つの方法は、Ｆｃ断片ｃＮｇ部位を突然変異させて宿主細胞中での合成の間のグリコシル化を予防することを伴う。したがって、ｃＮｇ部位突然変異を配列番号５２のＦｃ断片領域に対して行って、実施例８に記載のインビトロヒトＦｃ（ガンマ）ＲＩアッセイにおける結合により測定された場合の、インビボでのＦｃ（ガンマ）受容体に対するＦｃ断片の結合親和性を低減させた。グリカンの欠如の検証は、実施例５のＬＣ−ＭＳ法を使用して行ったが、ＰＮＧａｓｅ Ｆ処理ステップを省略した。配列番号５２のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質中のｃＮｇ部位の位置はｃＮｇ−ＮＢ１３９である。配列番号５２に対する突然変異は、ｃＮｇ−ＮＢ１３９−Ｑの突然変異を含む配列番号５８、ｃＮｇ−ＮＢ１３９−Ｓの突然変異を含む配列番号６０、ｃＮｇ−ＮＢ１３９−Ｄの突然変異を含む配列番号６２、およびｃＮｇ−ＮＢ１３９−Ｋの突然変異を含む配列番号６４を含んだ。ｃＮｇ突然変異型インスリン−Ｆｃ融合タンパク質の全長アミノ酸配列を以下に列記し（ＮＢ１３９の位置に下線を引いている）、結果としてもたらされる配列アライメントを図８に示す（Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ）：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＤＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＤＰＴＧＧＧＰＲＲＧＩＶＥＱＣＣＨＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮＧＧＧＧＡＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＱＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号５８）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＤＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＤＰＴＧＧＧＰＲＲＧＩＶＥＱＣＣＨＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮＧＧＧＧＡＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＳＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号６０）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＤＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＤＰＴＧＧＧＰＲＲＧＩＶＥＱＣＣＨＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮＧＧＧＧＡＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＤＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号６２）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＤＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＤＰＴＧＧＧＰＲＲＧＩＶＥＱＣＣＨＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮＧＧＧＧＡＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＫＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号６４）
インスリン−Ｆｃ融合タンパク質を実施例１にしたがってＨＥＫ２９３細胞中で生産し、実施例３にしたがってプロテインＡカラムを使用して精製した。インスリン−Ｆｃ融合タンパク質の構造を非還元および還元ＣＥ−ＳＤＳにより実施例４にしたがって確認し、配列を実施例５にしたがってグリカン除去を用いてＬＣ−ＭＳによりさらに同定した。ホモ二量体％を実施例６にしたがってサイズ排除クロマトグラフィーにより測定した。表５に示すように、配列番号６０、配列番号６２、および配列番号６４のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質のホモ二量体タイターは設計目標を満たしたが、予想外なことに、ｃＮｇ−ＮＢ１３９−Ｑ突然変異を含有する配列番号５８のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質はホモ二量体タイターについての設計目標を満たさなかった。
Figure 2021530210
残り３つの化合物のうちのいずれが、免疫原性の低減を呈する可能性が最も高いのかを決定するために、Ｆｃ（ガンマ）受容体結合を実施例８の手順にしたがって測定した。低いＦｃ（ガンマ）受容体結合は、最小の免疫原性と相関する可能性が最も高い。表６は、これらのインスリン−Ｆｃ融合タンパク質のＦｃ（ガンマ）受容体Ｉ結合を配列番号５２のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質のＦｃ（ガンマ）受容体結合と比較したものであり、これは予想外なことに、ｃＮｇ−Ｄ突然変異を含有する配列番号６２のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質は、ｃＮｇ−Ｓ突然変異を含有する配列番号６０およびｃＮｇ−Ｋ突然変異を含有する配列番号６４のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の約２倍のＦｃ（ガンマ）受容体結合活性を呈することを実証する。したがって、ｃＮｇ−Ｓ突然変異およびｃＮｇ−Ｋ突然変異を含有する後者の２つの化合物を含むインスリン−Ｆｃ融合タンパク質のみを、イヌにおける繰返しの投薬での生物活性試験のために好適であるとみなした。
Figure 2021530210
実施例２３：非グリコシル化ｃＮｇ−ＫおよびｃＮｇ−Ｓイヌ科動物ＩｇＧＢアイソタイプＦｃ断片を有する配列番号５のインスリンポリペプチドのインビボでの生物活性および免疫原性の評価
ｃＮｇ−Ｓ突然変異を含有する配列番号６０のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質がイヌにおいて繰返しの投薬での生物活性の成績を向上させるかどうかを決定するために、実施例１１の手順にしたがって０日目、７日目、１４日目、および２８日目にＮ＝１のイヌの皮下に化合物を投与した。イヌのＦＢＧＬ％があまりに低く低下した場合、イヌに食餌を与えて安全なレベルまで血中グルコースを上昇させた。１回目の注射についてのＮＡＯＣは１９１ＦＢＧＬ％・日・ｋｇ／ｍｇであり、配列番号６０のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質はインビボで十分に生物活性であることを示した。ＮＡＯＣおよびＮＡＯＣＲもまた、実施例１１の一般手順にしたがって各その後の投薬について測定し、次の用量が投与される直前までに用量が投与された時間から算出した。表７に示されるＮＡＯＣおよびＮＡＯＣＲは、配列番号６０のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質は、４回の投薬レジメンの投薬３および４において有意に減少するＮＡＯＣＲを呈したことを示す。したがって、ｃＮｇ−Ｓ突然変異を含有する配列番号６０のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号５２のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質より４倍低いＦｃ（ガンマ）ＲＩ結合を有するにもかかわらず、イヌにおいて繰返しの投薬での生物活性を実証することができなかった。
Figure 2021530210
ｃＮｇ−Ｋ突然変異を含有する配列番号６４のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質がイヌにおいて繰返しの投薬での生物活性の成績を向上させるかどうかを決定するために、実施例１１の手順にしたがって０日目、７日目、１４日目、および２８日目にＮ＝１のイヌの皮下に化合物を投与した。イヌのＦＢＧＬ％があまりに低く低下した場合、イヌに食餌を与えて安全なレベルまで血中グルコースを上昇させた。１回目の注射についてのＮＡＯＣは４４９ＦＢＧＬ％・日・ｋｇ／ｍｇであり、配列番号６４のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質はインビボで十分に生物活性であることを示した。化合物の薬物動態プロファイルもまた、ＥＬＩＳＡを使用して実施例１２の方法により測定し、２コンパートメントモデルをデータにフィッティングして、その排出半減期を約０．９日と決定した。ＮＡＯＣおよびＮＡＯＣＲもまた、実施例１１の一般手順にしたがって各その後の投薬について測定し、次の用量が投与される直前までに用量が投与された時間から算出した。表８に示されるＮＡＯＣおよびＮＡＯＣＲは、配列番号６４のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質は４回の投薬の全体を通じて０．６より高いＮＡＯＣＲを維持することを示す。したがって、予想外なことに、ｃＮｇ−Ｋ突然変異を含有する配列番号６４のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質は、イヌにおいて繰返しの投薬での生物活性の有意な向上を結果としてもたらす配列番号５２のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の唯一の非グリコシル化突然変異体であった。
Figure 2021530210
抗薬物および抗インスリン抗体のレベルもまた、実施例１３にしたがって治療（２８日）の過程の全体を通じておよび追加の２週間測定した。図９は、配列番号６４のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質はイヌにおいて繰返しの皮下投薬で抗薬物抗体を依然として生成させたが、抗薬物抗体タイターは配列番号５２のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質により生成されるもの（実施例１９）よりはるかに低かったことを示す。
実施例２４：抗薬物抗体を含有するイヌ科動物血清のスクリーニングならびにインスリンポリペプチドのＢ１０ＤおよびＡ８Ｈの位置における潜在的な免疫原性エピトープの同定
イヌ科動物ＩｇＧＢ Ｆｃ断片のｃＮｇ部位をＬｙｓに突然変異させること（すなわち、ｃＮｇ−Ｋ）は、配列番号５のインスリンポリペプチドおよび配列番号１２のペプチドリンカーを含むインスリン融合タンパク質の繰返しの投薬での生物活性を向上させたが（実施例２３）、配列番号６４の結果としてもたらされるインスリン−Ｆｃ融合タンパク質は抗薬物抗体を依然として生じさせた（実施例２３）。したがって、配列番号５のインスリンポリペプチドは、予想外なことに、イヌの免疫系が標的とする特定のエピトープ（すなわち、免疫原性「ホットスポット」）を含有し得るという仮説を立てた。したがって、実施例１３に記載の血清試料中に存在する抗体の結合特異性を実施例１５の一般手順にしたがって評価した。コーティングされたインスリン−Ｆｃ融合タンパク質ライブラリーに対する配列番号５２のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質（実施例１９）の繰返しの投薬からの抗体含有血清試料の分析は、予想外なことに、Ｂ鎖のＮ末端から１０番目の位置（すなわち、Ｂ１０）におけるアスパラギン酸突然変異、および、別々に、Ａ鎖のＮ末端から８番目の位置（すなわち、Ａ８）におけるヒスチジン突然変異という２つの主要な「ホットスポット」が配列番号５のインスリンポリペプチド配列内に存在することを実証した。これらの２つの具体的なアミノ酸突然変異を含有するインスリンポリペプチドアミノ酸組成を含むインスリン−Ｆｃ融合タンパク質はイヌにおいて免疫原性であるらしく、したがって、繰返しの注射後に生物活性を中和する抗薬物抗体を生じさせるらしいことを結果は示唆する。したがって、Ｂ１０アスパラギン酸およびＡ８ヒスチジンを含有しないインスリンポリペプチドは、（例えば、イヌ科動物糖尿病を治療するために）長期間にわたりイヌにおいて繰り返し投薬される必要があるインスリン−Ｆｃ融合タンパク質のために好ましいことが決定された。
実施例２５：免疫原性の潜在的なリスクを低減するためにインスリンポリペプチドのＢ１０ＤおよびＡ８Ｈ突然変異が天然の組成に回復された配列番号５のインスリンポリペプチドおよび非グリコシル化イヌ科動物ＩｇＧＢアイソタイプＦｃ断片を含むインスリン−Ｆｃ融合タンパク質
「ホットスポット」突然変異を置き換えることが、配列番号５のインスリンポリペプチドおよびイヌ科動物ＩｇＧＢアイソタイプ断片を含むインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の免疫原性および繰返しの投薬での生物活性を向上させるのかどうかを評価するために、非天然アミノ酸に下線を引いて以下に列記されるインスリンポリペプチドのＢ１０およびＡ８アミノ酸がそれらの天然のそれぞれヒスチジンおよびスレオニン組成（配列番号１２５）に回復された例示的なインスリン−Ｆｃ融合タンパク質（配列番号６６）を合成した。
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＤＰＴＧＧＧＰＲＲＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ（配列番号１２５）
さらには、非グリコシル化ｃＮｇ突然変異体の追加の潜在的な利益を考慮して、配列番号６６のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質はｃＮｇ−Ｑ突然変異を含有する。配列番号６６のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸配列全体を以下に与える：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＤＰＴＧＧＧＰＲＲＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮＧＧＧＧＡＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＱＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号６６）
配列番号６６のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質を実施例１にしたがってＨＥＫ２９３細胞中で生産し、実施例３にしたがってプロテインＡカラムを使用して精製した。結果としてもたらされたタンパク質収率は２１ｍｇ／Ｌに過ぎなかった。構造を非還元および還元ＣＥ−ＳＤＳにより実施例４にしたがって確認し、配列を実施例５にしたがってグリカン除去を用いてＬＣ−ＭＳによりさらに同定した。実施例６にしたがってサイズ排除クロマトグラフィーにより測定された場合のホモ二量体％は９８．０％であり、タンパク質は凝集物を比較的含まないことを指し示した。
２１ｍｇ／Ｌの比較的低いホモ二量体タイターにもかかわらず、配列番号６６のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質を実施例１１〜１３の手順にしたがってそれぞれインビボでの生物活性および免疫原性についてイヌにおいて評価した。図１０は、配列番号６６のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質におけるＢ１０ＤおよびＡ８Ｈ突然変異のそれらの天然のアミノ酸（すなわち、Ｂ１０ＨおよびＡ８Ｔ）への回復は親化合物（配列番号５２）の免疫原性を有意に低減したことを実証する。
しかしながら、図１１に示すように、天然のＢ１０およびＡ８アミノ酸を含有する配列番号６６のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質は生物活性でなかった（すなわち、ＮＡＯＣは本質的に０であった）。
実施例２６：イヌ科動物ＩｇＧＢ Ｆｃ断片を含有する関連付けられるインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の生物活性を向上させるために追加のＢ鎖およびＡ鎖突然変異を配列番号１２５のインスリンポリペプチドに組み込む試み
配列番号６６のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質（実施例２５）は配列番号５２のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質（実施例２０）と比較して抗薬物抗体を生成しなかったという事実は、配列番号５のインスリンポリペプチドにおけるＢ１０ＤおよびＡ８Ｈ突然変異は抗薬物抗体の産生の原因となる免疫原性エピトープであるらしいという理論の強い証拠を提供する。しかしながら、配列番号５２のそれと比較した配列番号６６のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質のインビボ効力の欠如は、これらの２つのアミノ酸突然変異もまた生物活性の許容されるレベルを達成する原因となることを指し示す。配列番号６６のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質についてのインビボ効力の欠如は、実施例７の方法にしたがってインスリン受容体結合アッセイにより測定された場合のその高いＩＣ５０（以下の表９に示される）と相関する。したがって、インスリンポリペプチド中に天然のＢ１０およびＡ８アミノ酸を保つことにより低い程度の免疫原性を維持しながらインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の生物活性を増加させる（すなわち、５０００ｎＭ未満、またはより好ましくは４０００ｎＭ未満、またはよりいっそう好ましくは３０００ｎＭ未満までインスリン受容体結合アッセイのＩＣ５０値を減少させる）ためにさらなる努力が要求される。
インスリンＢ鎖およびＡ鎖の様々な部分がＩＲへの強い結合のために要求されることが公知である（Ｈｕｂｂａｒｄ Ｓ．Ｒ．， “Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ： Ｉｎｓｕｌｉｎ ｍｅｅｔｓ ｉｔｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒ”， Ｎａｔｕｒｅ． ２０１３； ４９３（７４３１）：１７１−１７２）。したがって、Ｂ１０およびＡ８を天然のインスリン中と同じに保ちかつＣ鎖およびペプチドリンカーを一定に保ったままＢ鎖またはＡ鎖の部分を修飾した。これらのインスリン−Ｆｃ融合タンパク質のいくつかを実施例１にしたがってＨＥＫ２９３細胞中で生産し、実施例３にしたがってプロテインＡカラムを使用して精製した。それらの構造を非還元および還元ＣＥ−ＳＤＳにより実施例４にしたがって確認し、配列を実施例５にしたがってグリカン除去を用いてＬＣ−ＭＳによりさらに同定した。それらのホモ二量体％含有量を実施例６にしたがってサイズ排除クロマトグラフィーにより測定し、それらのインスリン受容体結合親和性を実施例７にしたがって測定した。それらの配列を以下に示し、配列番号６６に対する結果としてもたらされる配列アライメントを図１２に示す（Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ）。
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＱＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＤＰＴＧＧＧＰＲＲＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＡＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＳＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号６８）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＥＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＤＰＴＧＧＧＰＲＲＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＡＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＳＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号７０）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＡＧＦＦＹＴＤＰＴＧＧＧＰＲＲＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＡＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＳＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号７２）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＹＹＴＤＰＴＧＧＧＰＲＲＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＡＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＳＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号７４）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＤＰＴＧＧＧＰＲＲＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＡＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＳＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号７６）
Figure 2021530210
３つの場合（配列番号６８、７０、および７４においてのみ、提案される突然変異は、配列番号６６と比較した場合にＩＲ結合を向上させた（すなわち、ＩＣ５０値を低下させた）。しかしながら、いずれの突然変異も、５０ｍｇ／Ｌより高いホモ二量体タイターの生産設計目標を満たす化合物を結果としてもたらさず、一部の場合には、突然変異は有意に低減された生産可能性（例えば、２０ｍｇ／Ｌ未満のホモ二量体タイター）に繋がった。
実施例２７：イヌ科動物ＩｇＧＢ Ｆｃ断片を含有する関連付けられるインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の生物活性を向上させるためのＣ鎖突然変異を配列番号１２５のインスリンポリペプチドに組み込む試み
実施例２６において得られた結果は、配列番号１２５のインスリンポリペプチドのＡ鎖およびＢ鎖を突然変異させる全ての試みは、関連付けられるインスリン−Ｆｃ融合物の許容できない低いＨＥＫホモ二量体タイター（すなわち、２５ｍｇ／Ｌより低いまたはそれに等しいホモ二量体タイター）を結果としてもたらすことを示した。したがって、さらなる実験の必要があった。本実施例では、配列番号１２５のインスリンポリペプチドのＣ鎖組成を、それをより長くすることによりまたはその柔軟性を増加させることにより突然変異させた。天然のインスリン（例えば、ヒトインスリン）は、（例えば、Ｍｅｎｔｉｎｇ， ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ， ２０１３； ４９３（７４３１）： ｐｐ２４１−２４５に記載されるように）インスリン受容体に結合する際にＢ鎖およびＡ鎖の両方のフォールディングの運動を伴う顕著なコンホメーション変化を起こすことが示されている。天然のインスリンは、本発明のインスリンポリペプチドとは異なり、インスリン受容体においてこのコンホメーション変化を自由に起こすことができ、その理由は、その天然の形態において２鎖ポリペプチドであり、Ａ鎖およびＢ鎖のモビリティを制約するＣ鎖を伴わない２つのジスルフィド結合のみを通じて接続されているからである。いかなる具体的な理論によっても縛られないが、配列番号１２５のインスリンポリペプチド内に含有されるＣ鎖は柔軟性が低すぎる（例えば、Ｂ鎖とＡ鎖との間で簡易な運動を許容しないアミノ酸組成および配列）かつ／または短すぎる（例えば、Ｂ鎖のＣ末端とＡ鎖のＮ末端との間に十分なアミノ酸がない）ため、インスリン受容体への強い結合のために要求される分子形状における必要な変化をインスリンポリペプチドが起こすことが予防されるという仮説を立てた。したがって、以下に示され、配列番号６６に対する結果としてもたらされる配列アライメントを図１３に示すように（Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ）、インスリンポリペプチドＣ鎖におけるバリエーションを有する配列番号６６のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質に基づいていくつかのインスリン−Ｆｃ融合タンパク質を合成した。
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＱＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＤＰＴＱＲＧＧＧＧＧＱＲＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＡＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＳＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号７８）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＤＰＴＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＡＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＳＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号８０）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＤＰＧＧＧＧＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＡＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＳＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号８２）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＧＧＧＧＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＡＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＳＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号８４）
Figure 2021530210
インスリン−Ｆｃ融合タンパク質を実施例１にしたがってＨＥＫ２９３細胞中で生産し、実施例３にしたがってプロテインＡカラムを使用して精製した。それらの構造を非還元および還元ＣＥ−ＳＤＳにより実施例４にしたがって確認し、配列を実施例５にしたがってグリカン除去を用いてＬＣ−ＭＳによりさらに同定した。それらのホモ二量体％含有量を実施例６にしたがってサイズ排除クロマトグラフィーにより測定し、それらのインスリン受容体結合親和性を実施例７にしたがって測定した。最も長いＣ鎖（ＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧ）を含む１つの場合（配列番号８０）においてのみ、Ｃ鎖突然変異は、配列番号６６のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質と比較してインスリン受容体結合親和性を有意に向上させた（３０００ｎＭ未満のＩＣ５０）。しかしながら、これらのＣ鎖突然変異型インスリン−Ｆｃ融合タンパク質のいずれも、５０ｍｇ／Ｌの生産設計目標より高いホモ二量体タイターを呈しなかった。実際に、１つの場合（配列番号７８）において、Ｃ鎖突然変異は、予想外なことに、有意により低いホモ二量体タイターに繋がった。
実施例２８：生物活性を向上させるために配列番号１２５のインスリンポリペプチドおよびイヌ科動物ＩｇＧＢ Ｆｃ断片を含有するインスリン−Ｆｃ融合タンパク質にペプチドリンカーの突然変異を組み込む試み
いかなる具体的な理論によっても縛られないが、配列番号６６のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の乏しいインスリン受容体結合の別のあり得る理由は、ペプチドリンカーを通じてインスリンポリペプチドに取り付けられたはるかにより大きいＦｃ断片分子の近接性の結果としてもたらされるインスリンポリペプチドとインスリン受容体との間の立体障害を伴うと考えられた。より短いペプチドリンカーまたはより緊密にフォールディングしたペプチドリンカーは、この問題を悪化させる可能性があると考えられたが、より長いペプチドリンカーまたは折畳みに対して抵抗性のペプチドリンカー（例えば、より高い分子剛性を有するリンカー）は、インスリンポリペプチドとＦｃ断片との間により多くの空間を作製することによりこの問題を和らげる可能性がある。インスリンポリペプチドとＦｃ断片との間の空間の増加はまた、インスリン受容体とＦｃ断片との間の距離を増加させて、インスリン受容体結合の間のより少ない干渉に繋がる。配列番号６６のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質を構築するために使用された配列番号１２（すなわち、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧ）のペプチドリンカーは、潜在的に短すぎるかつ／または柔軟すぎるという仮説が立てられ、その理由は、リンカーを構成するアミノ酸は側鎖を含有しないからである（すなわち、それはグリシンおよびアラニンアミノ酸のみを含有する）。したがって、この仮説を試験するために、配列番号６６のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の２つの他のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質変種を合成した。配列番号７６のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号６６のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質を構築するために使用されたものと同じペプチドリンカーを含有したが、Ａ鎖のＮ末端から２１番目の位置（すなわち、Ａ２１）におけるアスパラギンが存在しない（すなわち、ｄｅｓ−Ａ２１）インスリンポリペプチドを有していた。この具体的な突然変異は、Ａ鎖とペプチドリンカーとの間の接合部がタンパク質収率および／または分子の生物活性に影響するかどうかを調べるために組み込んだ。配列番号８６の他のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質は、このｄｅｓ−Ａ２１Ｎ Ａ鎖突然変異および配列番号６６のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質を構築するために使用されたものの２倍より大きい長さのペプチドリンカーを含有する。このより長いペプチドリンカーにおいて、アラニンは好まれず、代わりに極性アミド側鎖を含有するグルタミンで置き換えられる。グルタミン置換は、ペプチドリンカーの親水性の性質を増加させ、リンカーが折り畳まれることを潜在的に予防することが予期された。配列を以下に示し、配列番号６６に対する結果としてもたらされる配列アライメントを図１４に示す（Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ）。
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＤＰＴＧＧＧＰＲＲＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＳＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号８６）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＤＰＴＧＧＧＰＲＲＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＡＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＳＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号７６）
Figure 2021530210
２つのインスリン−Ｆｃ融合タンパク質を実施例１にしたがってＨＥＫ２９３細胞中で生産し、実施例３にしたがってプロテインＡカラムを使用して精製した。それらの構造を非還元および還元ＣＥ−ＳＤＳにより実施例４にしたがって確認し、配列を実施例５にしたがってグリカン除去を用いてＬＣ−ＭＳによりさらに同定した。それらのホモ二量体％含有量を実施例６にしたがってサイズ排除クロマトグラフィーにより測定し、それらのインスリン受容体結合親和性を実施例７にしたがって測定した。異なる組成（配列番号８６についてＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧ、これに対して配列番号６６についてＧＧＧＧＡＧＧＧＧのより長いペプチドリンカーの組込みは、ＩＣ５０値における有意な低減により測定されたようにインスリン受容体結合を向上させ、より長いリンカーは、他のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質についてインスリン受容体結合を増加させるための戦略であり得ることを指し示した。しかしながら、より長いリンカーの組込みは依然として、５０ｍｇ／Ｌより高い生産設計目標より高くまでホモ二量体タイターを向上させなかった。
実施例２９：イヌ科動物ＩｇＧＢ Ｆｃ断片を含有する関連付けられるインスリン−Ｆｃ融合タンパク質のホモ二量体タイターを向上させるために配列番号１２５のインスリンポリペプチドのＢ鎖の部分を欠失させる試み
実施例２８からの結果は、ペプチドリンカーを改変して、天然のＢ１０およびＡ８アミノ酸を含有する配列番号６６のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質のインスリン受容体結合親和性を増加させることができることを実証する。しかしながら、ペプチドリンカーの突然変異は、生産設計目標を満たすために十分にホモ二量体タイターを増加させなかった。ホモ二量体タイターは、細胞内合成および細胞内でのプロセシングを含むいくつかの特性の関数であるので、インスリン−Ｆｃ分子は、ホモ二量体の２つの単量体の間で分子内でまたは２つもしくはより多くの別々のホモ二量体の間で分子間で合成の間および後において自己会合性（すなわち、凝集性）であるかもしれないという仮説を立てた。この凝集は、実施例１、３、および６に記載の製造プロセスの間に細胞培養上清から得られる許容できない低いホモ二量体タイターに繋がるであろう。インスリン−Ｆｃ融合タンパク質分子の間のこの潜在的な相互作用は、部分的には、自己会合して凝集物を形成するインスリンの周知の傾向に起因する可能性がある。インスリンが自己会合する傾向を低減する当該技術分野において公知の１つの方法は、Ｂ鎖のＣ末端の近くのアミノ酸を突然変異させることを伴う。例えば、インスリンリスプロ（Ｂ２８Ｋ；Ｂ２９Ｐ突然変異）およびインスリンアスパルト（Ｂ２８Ｄ突然変異）は、会合および凝集を予防し、そのため溶液中にインスリンの主に単量体形態を生じさせる非天然のＢ鎖突然変異を有する周知の商用の２鎖インスリンである。凝集を予防する別のアプローチはアミノ酸構造の欠失を伴う。例えば、デスペンタペプチドインスリン（ＤＰＰＩ；Ｂｒａｎｇｅ Ｊ．， Ｄｏｄｓｏｎ Ｇ．Ｇ．， Ｅｄｗａｒｄｓ Ｊ．， Ｈｏｌｄｅｎ Ｐ．Ｈ．， Ｗｈｉｔｔｉｎｇｈａｍ Ｊ．Ｌ． １９９７ｂ． “Ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｉｎｓｕｌｉｎ ｆｉｂｒｉｌｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｘ−ｒａｙ ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａ ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ ｉｎｓｕｌｉｎ （ｄｅｓｐｅｎｔａｐｅｐｔｉｄｅ ｉｎｓｕｌｉｎ）” Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ２７ ５０７−５１６を参照）として公知の２鎖インスリンは、Ｂ鎖の５つのＣ末端アミノ酸（ＹＴＰＫＴ）が除去されている以外は天然の２鎖ヒトインスリンと同一である。ＤＰＰＩは、天然の２鎖ヒトインスリンと比較した場合にインスリン受容体に対するより低い結合親和性を有するが、溶液中で完全に単量体であり、すなわち、ＤＰＰＩ分子間に顕著な会合も凝集もない。したがって、分子内および分子間自己会合の可能性を減少させ、かつインスリン−Ｆｃ融合タンパク質ホモ二量体タイターを向上させることを試みて、ＤＰＰＩ、インスリンリスプロ、およびインスリンアスパルトについて上記したように部分的なＢ鎖アミノ酸切断およびＢ鎖アミノ酸突然変異を使用して配列番号６６のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質のいくつかの変種を構築した。配列を以下に示し、配列番号６６に対する結果としてもたらされる配列アライメントを図１５に示す（Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ）。
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＤＰＧＧＧＧＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＡＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＳＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号８２）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＧＧＧＧＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＡＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＳＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号８４）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＱＧＧＧＧＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＡＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＳＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号８８）
Figure 2021530210
インスリン−Ｆｃ融合タンパク質を実施例１にしたがってＨＥＫ２９３細胞中で生産し、実施例３にしたがってプロテインＡカラムを使用して精製した。それらの構造を非還元および還元ＣＥ−ＳＤＳにより実施例４にしたがって確認し、配列を実施例５にしたがってグリカン除去を用いてＬＣ−ＭＳによりさらに同定した。それらのホモ二量体％含有量を実施例６にしたがってサイズ排除クロマトグラフィーにより測定し、それらのインスリン受容体結合親和性を実施例７にしたがって測定した。結果としてもたらされた化合物のホモ二量体タイターは１つの場合（配列番号８２）においてのみ有意に増加したが、予想外なことに、インスリン受容体親和性は突然変異した化合物（配列番号８２、８８、および８４）の全てについて向上した。
実施例３０：ホモ二量体タイターおよび生物活性をさらに向上させるために配列番号６６のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質に対するＢ鎖、Ｃ鎖、およびＡ鎖突然変異、Ｂ鎖切断、ならびにリンカー突然変異を組み合わせる試み
実施例２６、２７、２８、および２９に示すように、単一の戦略は、イヌ科動物ＩｇＧＢ Ｆｃ断片を有する非免疫原性の天然のＢ１０およびＡ８アミノ酸を含むインスリンポリペプチドを組み込んで、許容されるインスリン受容体活性およびホモ二量体タイターを有するインスリン−Ｆｃ融合タンパク質を形成することに成功しなかった。したがって、より長いＣ鎖、より長いペプチドリンカー、およびＢ鎖のＣ末端アミノ酸の切断の概念を組み合わせた。追加的に、自己会合および凝集の傾向を潜在的にさらに減少させるために、生理的ｐＨにおいて負または正に荷電する側鎖基を有するものを含む、より低い疎水性のアミノ酸を使用して天然のインスリン疎水性アミノ酸残基部位に追加の点突然変異を導入した。例となる突然変異には、チロシンをアラニンに、チロシンをグルタミン酸に、イソロイシンをスレオニンに、およびフェニルアラニンをヒスチジンにするものが含まれた。さらには、解析を単純化するために、全ての場合において、イヌ科動物ＩｇＧＢ Ｆｃ断片のｃＮｇ部位をその天然のアスパラギンに回復させた。これらのインスリン−Ｆｃ融合タンパク質変種の配列を以下に示し、配列番号６６に対する結果としてもたらされる配列アライメントを図１６に示す（Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ）。
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＮＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号９０）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＮＨＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＮＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号９２）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＮＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＮＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号３４）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＮＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号３２）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＮＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号９４）
Figure 2021530210
インスリン−Ｆｃ融合タンパク質を実施例１にしたがってＨＥＫ２９３細胞中で生産し、実施例３にしたがってプロテインＡカラムを使用して精製した。それらの構造を非還元および還元ＣＥ−ＳＤＳにより実施例４にしたがって確認し、配列を実施例５にしたがってグリカン除去を用いてＬＣ−ＭＳによりさらに同定した。それらのホモ二量体％含有量を実施例６にしたがってサイズ排除クロマトグラフィーにより測定し、それらのインスリン受容体結合親和性を実施例７にしたがって測定した。ある特定のＢ鎖およびＡ鎖アミノ酸の疎水性を減少させること、より長いおよびより柔軟なＣペプチド配列を使用すること、いくつかのＣ末端Ｂ鎖アミノ酸を切断すること、ならびにより長いペプチドリンカーを使用することの組合せは、最小ホモ二量体タイターおよびインスリン受容体結合活性の設計基準を満たすいくつかの有用なインスリン−Ｆｃ融合タンパク質を結果としてもたらしたことを結果は示す。配列番号９２、３４、３２、および９４（３６８ｄ）、（３６６ｄ）、（２１８ｄ）、および（３７５ｄ）は、配列番号６６または配列番号９０のいずれかより好ましいインスリン受容体ＩＣ５０値（３０００ｎＭ未満）およびより好ましいＨＥＫホモ二量体タイター値（１００ｍｇ／Ｌより高い）を示した。驚くべきことに、少数のアミノ酸のみを変化させることで、インスリン受容体親和性における複数倍の向上、および配列番号３２のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の場合、元々の配列番号６６のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質に対するホモ二量体タイターの劇的な増加に繋がる。
実施例３１：配列番号７のインスリンポリペプチド、配列番号１４のペプチドリンカー、および配列番号１６のイヌ科動物ＩｇＧＢ Ｆｃ断片から構築されたインスリン−Ｆｃ融合タンパク質のインビボでの生物活性、繰返しの投薬での生物活性、および免疫原性
実施例３０からのポジティブなホモ二量体タイターおよびインスリン受容体結合活性の結果を考慮して、最も有望なインスリン−Ｆｃ融合タンパク質のうちの２つ（配列番号３２および３４）をイヌにおいて試験して、繰返しの投薬での生物活性および免疫原性を評価した。各化合物は、配列番号１４のより長い、より親水性のペプチドリンカーおよび配列番号１６のより生産可能な、より低い凝集性のイヌ科動物ＩｇＧＢ Ｆｃ断片を含む。最も重要なことに、両方のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質は、より低い免疫原性が推定される天然のＢ１０およびＡ８アミノ酸を有するインスリンポリペプチド（すなわち、一般の配列番号７）を含む。配列番号３４のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の場合、位置Ａ２１におけるアスパラギンが存在する（すなわち、インスリンポリペプチドは配列番号９を含む）。配列番号３２のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の場合、位置Ａ２１におけるアスパラギンは存在しない（すなわち、インスリンポリペプチドは配列番号８を含む）。
配列番号３４のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質のインビボでの生物活性を実施例１０の手順にしたがってＮ＝１のイヌにおいて試験した。単回皮下投薬について図１７に示される結果は、配列番号３４のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質は、実施例１１における手順にしたがって算出された１０７６ＦＢＧＬ％・日・ｋｇ／ｍｇのＮＡＯＣと共に実際にインビボで生物活性であることを実証する。配列番号３４のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の薬物動態プロファイルをＥＬＩＳＡを使用して実施例１２の方法により測定し、２コンパートメントモデルをデータにフィッティングして、その排出半減期を３．５日と決定した。
実施例８の手順にしたがって初期注射後１４日目、２８日目、および４２日目にＮ＝１のイヌの皮下に配列番号３４のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の投与を続けることにより繰返しの投薬での生物活性を次に評価した。イヌのＦＢＧＬ％があまりに低く低下した場合、イヌに食餌を与えて安全なレベルまで血中グルコースを上昇させた。ＮＡＯＣおよびＮＡＯＣＲを実施例１１の一般手順にしたがって各その後の用量について測定し、次の用量が投与される直前までに用量が投与された時間から算出した。表１４に示されるＮＡＯＣおよびＮＡＯＣＲは、配列番号３４のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質は４回の投薬の全体を通じて０．８より高いＮＡＯＣＲを維持し、そのため繰返しの投薬での生物活性の設計目標を満たすことを示す。
Figure 2021530210
配列番号３４のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の免疫原性を実施例１３の手順にしたがって試験した。図１８は、配列番号３４のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質は、繰返しの投薬の実験の全体を通じたインビボでの生物活性の維持と合致して、インビボで明らかな免疫原性を呈しないことを実証する。
インスリンポリペプチド鎖のＡ２１におけるアスパラギンが存在しない配列番号３２のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質もまた、イヌにおいて繰返しの投薬での生物活性の成績について評価した。実施例１１の手順にしたがって０日目、１４日目、２８日目、および４２日目にＮ＝１のイヌの皮下に化合物を投与した。イヌのＦＢＧＬ％があまりに低く低下した場合、イヌに食餌を与えて安全なレベルまで血中グルコースを上昇させた。１回目の注射についてのＮＡＯＣは印象的な２２７８ＦＢＧＬ％・日・ｋｇ／ｍｇであり、配列番号３２のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号３４のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質のほぼ２倍の効力においてインビボで十分に生物活性であることを示した。インスリン−Ｆｃ融合タンパク質の薬物動態プロファイルをＥＬＩＳＡを使用して実施例１２の方法により測定し、２コンパートメントモデルをデータにフィッティングして、その排出半減期を４．１±０．７日と決定した。図１９および図２０は、配列番号３２のホモ二量体を与えた動物についての単回投薬血中グルコース対照および複数回投薬、複数週血中グルコース対照を示す。ＮＡＯＣおよびＮＡＯＣＲもまた、実施例１１の一般手順にしたがって各その後の投薬について測定し、次の用量が投与される直前までに用量が投与された時間から算出した。表１５に示されるＮＡＯＣおよびＮＡＯＣＲは、配列番号３２のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質は４回の投薬の全体を通じて１．０より高いまたはそれに等しいＮＡＯＣＲを維持し、そのため実施例１６に記載の繰返しの投薬での生物活性の設計目標を満たすことを示す。
配列番号３２のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の免疫原性を実施例１３の手順にしたがって試験した。図２１は、配列番号３２のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質は、繰返しの投薬の実験の全体を通じたインビボでの生物活性の維持と合致して、インビボで明らかな免疫原性を呈しないことを実証する。
Figure 2021530210
本発明の詳細な説明において議論したように、公知の酵素切断部位がアスパラギン−グリシン結合の間に存在する（Ｖｌａｓａｋ， Ｊ．， Ｉｏｎｅｓｃｕ， Ｒ．， （２０１１） ＭＡｂｓ Ｖｏｌ． ３， Ｎｏ． ３ ｐｐ ２５３−２６３）。配列番号１４のペプチドリンカーを有する配列番号３２のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質中に含有される配列番号８のインスリンポリペプチド中のＡ鎖中の２１番目のアミノ酸（すなわち、Ａ２１）におけるアスパラギンを省略することは、Ａ鎖のＣ末端とペプチドリンカーのＮ末端との間のアスパラギン−グリシン結合の酵素切断の可能性を排除する。しかしながら、配列番号３４のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１４のペプチドリンカー、およびＡ２１においてアスパラギンを保つ配列番号８のインスリンポリペプチドを含む。したがって、配列番号３４のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質は、合成の間にまたは皮下投与後にインビボで酵素的に消化されることが予期された。しかしながら、かなり予想外なことに、配列番号３４のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質は、許容されるホモ二量体タイターと共にＨＥＫ細胞中で生産可能であり、その生物活性を損なう酵素消化の徴候なしにインビボで許容される生物活性を実証した。
実施例３２：配列番号８の好ましいインスリンポリペプチドおよび配列番号１４の好ましいペプチドリンカーを含むインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の最適な生産可能性およびインビボでの有効性についてのイヌ科動物ＩｇＧＢアイソタイプＦｃ断片の確認
実施例３０および３１に記載されるように、新たなインスリンポリペプチドおよびペプチドリンカーの組合せは、非免疫原性、高収率、高純度、および高度に生物活性のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質を結果としてもたらすことが発見されたが、イヌ科動物ＩｇＧＢ Ｆｃ断片は、実施例１９および２０におけるインスリン−Ｆｃ融合タンパク質について該当したように、ホモ二量体タイターおよび生物活性に関して依然として好ましいアイソタイプであるのかどうかという疑問が残った。したがって、追加のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質を設計し、該融合タンパク質では、配列番号３２のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質のインスリンポリペプチド（配列番号８）およびペプチドリンカー（配列番号１４）は一定に保ち、配列番号１６のイヌ科動物ＩｇＧＢ Ｆｃ断片を配列番号１５のイヌ科動物ＩｇＧＡ Ｆｃ断片、配列番号１７のイヌ科動物ＩｇＧＣ Ｆｃ断片、または配列番号１８のイヌ科動物ＩｇＧＤ Ｆｃ断片により置き換えた。これらの結果としてもたらされたインスリン−Ｆｃ融合タンパク質変種の配列を以下に示す：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＮＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号３２）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＲＣＴＤＴＰＰＣＰＶＰＥＰＬＧＧＰＳＶＬＩＦＰＰＫＰＫＤＩＬＲＩＴＲＴＰＥＶＴＣＶＶＬＤＬＧＲＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＥＶＨＴＡＫＴＱＳＲＥＱＱＦＮＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＥＨＱＤＷＬＴＧＫＥＦＫＣＲＶＮＨＩＤＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＲＡＨＫＰＳＶＹＶＬＰＰＳＰＫＥＬＳＳＳＤＴＶＳＩＴＣＬＩＫＤＦＹＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＲＫＨＲＭＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＱＧＤＰＦＴＣＡＶＭＨＥＴＬＱＮＨＹＴＤＬＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号９６）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＣＮＮＣＰＣＰＧＣＧＬＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＩＬＶＴＡＲＴＰＴＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＮＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＳＫＱＶＱＴＡＮＴＱＰＲＥＥＱＳＮＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＳＧＫＱＦＫＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＥＩＩＳＫＴＰＧＱＡＨＱＰＮＶＹＶＬＰＰＳＲＤＥＭＳＫＮＴＶＴＬＴＣＬＶＫＤＦＦＰＰＥＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＭＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＩＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号９８）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＣＩＳＰＣＰＶＰＥＳＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＩＬＲＩＴＲＴＰＥＩＴＣＶＶＬＤＬＧＲＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＥＶＨＴＡＫＴＱＰＲＥＱＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＥＨＱＤＷＬＴＧＫＥＦＫＣＲＶＮＨＩＧＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＰＫＥＬＳＳＳＤＴＶＴＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＥＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＰＥＰＥＳＫＹＨＴＴＡＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＱＧＤＴＦＴＣＡＶＭＨＥＡＬＱＮＨＹＴＤＬＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号１００）
インスリン−Ｆｃ融合タンパク質を実施例１にしたがってＨＥＫ２９３細胞中で生産し、実施例３にしたがってプロテインＡまたはプロテインＧカラムを使用して精製した。それらの構造を非還元および還元ＣＥ−ＳＤＳにより実施例４にしたがって確認し、配列を実施例５にしたがってグリカン除去を用いてＬＣ−ＭＳによりさらに同定した。それらのホモ二量体％含有量を実施例６にしたがってサイズ排除クロマトグラフィーにより測定し、それらのインスリン受容体結合親和性を実施例７にしたがって測定した。追加的に、イヌ科動物ＦｃＲｎ受容体に対するインスリン−Ｆｃ融合タンパク質親和性を実施例８にしたがって測定した。表１６に示されるように、イヌ科動物ＩｇＧＢ Ｆｃ断片を含む配列番号３２のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質は、これらの配列のうちで最も高いホモ二量体タイターを実証した。イヌ科動物ＩｇＧＡ Ｆｃ断片を含む配列番号９６のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質は、プロテインＡカラムを使用して精製された場合に不良なホモ二量体タイターを呈したが、プロテインＧカラムを使用して精製された場合、ホモ二量体タイターは有意に向上し、５０ｍｇ／Ｌより高い設計目標を上回った。同じことが、イヌ科動物ＩｇＧＣ Ｆｃ断片を含む配列番号９８のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質について当てはまった。イヌ科動物ＩｇＧＤ Ｆｃ断片を含む配列番号１００のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質は、プロテインＡカラムまたはプロテインＧカラムのいずれかを用いて生成された場合にいかなる化合物ももたらさなかった。したがって、異なるインスリンポリペプチド（配列番号５およびペプチドリンカー（配列番号１２）を含有する配列番号５２のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質を用いて実証されたように、イヌ科動物ＩｇＧＢはホモ二量体タイターに関して好ましいＦｃ断片であった（実施例１９を参照）。
Figure 2021530210
プロテインＧを介して精製されたイヌ科動物ＩｇＧＡ Ｆｃ断片を含む配列番号９６のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質のインビボでの生物活性を実施例１０の手順にしたがって試験した。図２２に示される結果は、配列番号９６のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質は、実施例１１にしたがって算出されたわずか１７４ＦＢＧＬ％・日・ｋｇ／ｍｇのＮＡＯＣと共にインビボでいくぶん生物活性であるに過ぎないことを示す。
プロテインＧを介して精製されたイヌ科動物ＩｇＧＣ Ｆｃ断片を含む配列番号９８のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質のインビボでの生物活性を実施例１０の手順にしたがって試験した。図２３に示される結果は、配列番号９８のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質は、実施例１１にしたがって算出されたわずか３９ＦＢＧＬ％・日・ｋｇ／ｍｇのＮＡＯＣと共にインビボでいくぶん生物活性であるに過ぎないことを示す。
したがって、異なるインスリンポリペプチド（配列番号５）およびペプチドリンカー（配列番号１２）を含有する配列番号５２のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質を用いて実証されたように、イヌ科動物ＩｇＧＢは生物活性に関して好ましいＦｃ断片であった（上記の実施例１９および２０ならびに表１６を参照）。
実施例３３：免疫原性の潜在的なリスクを低減するための配列番号８のインスリンポリペプチド、配列番号１４のペプチドリンカー、およびイヌ科動物ＩｇＧＢ Ｆｃ断片を含む非グリコシル化インスリン−Ｆｃ融合タンパク質
配列番号３２のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質は設計目標の全てを満たすが（実施例１６）、長期間の治療（例えば、６か月、１年、２年またはより長い）にわたる免疫原性のリスクがあるかもしれず、またはないかもしれず、これが起こる場合、糖尿病を治療するためのこのインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の使用が損なわれ得る。本発明の詳細な説明ならびに実施例２１および２２に記載されるように、繰返しの投薬後の生物活性の低減の１つのあり得る原因は、中和抗薬物抗体の産生を結果としてもたらすイヌ科動物ＩｇＧＢ Ｆｃ断片のイヌの免疫系との望ましくない相互作用である。しかしながら、実施例３２に示される結果は、予想外なことに、イヌ科動物ＩｇＧＢアイソタイプは、所望の生産可能性および生物活性をもたらす、４つのイヌ科動物ＩｇＧアイソタイプのうちの唯一のオプションであったことを実証する。したがって、長期の慢性の免疫原性リスクを低減するはずである低いＦｃ（ガンマ）ＲＩ受容体結合を有する非グリコシル化インスリン−Ｆｃ融合タンパク質を達成するためにさらなるＦｃ突然変異を探求した。
本発明の詳細な説明に記載されるように、Ｆｃ（ガンマ）ＲＩ相互作用を低減する１つの方法は、Ｆｃ断片ｃＮｇ部位を突然変異させて宿主細胞中での合成の間のグリコシル化を予防することを伴う。したがって、ｃＮｇ部位突然変異を配列番号３２のＦｃ断片領域に対して行って、実施例８に記載のインビトロヒトＦｃ（ガンマ）ＲＩアッセイにおける結合により測定された場合の、インビボでのＦｃ（ガンマ）受容体に対するＦｃ断片の結合親和性を低減させた。配列番号３２のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質中のｃＮｇ部位の位置はｃＮｇ−ＮＢ１５１である。配列番号３２に対する突然変異は、ｃＮｇ−ＮＢ１５１−Ｓ突然変異を含む配列番号１０４、および同じｃＮｇ−ＮＢ１５１−Ｓ突然変異の他にＮＢ１１９−Ａ突然変異を含む配列番号１０２を含んだ。ＮＢ１１９−Ａは、Ｌｏ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． “Ｅｆｆｅｃｔｏｒ ａｔｔｅｎｕａｔｉｎｇ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ ｔｈａｔ ｍａｉｎｔａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｅ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ ｍｉｃｅ”， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． （２０１７）， ｐｐ． １−２０によりマウス抗体における使用のためにのみ記載されたようにＦｃ（ガンマ）ＲＩとの相互作用を低減することをさらに試みて組み込んだ。結果としてもたらされるインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の全長アミノ酸配列を、図２４に示されるそれらの配列アライメント（Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ）と共に以下に列記する（明確性のためにＮＢ１１９およびＮＢ１５１部位に下線を引いている）：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＡＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＳＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号１０２）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＳＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号１０４）
インスリン−Ｆｃ融合タンパク質を実施例１にしたがってＨＥＫ２９３細胞中で生産し、実施例３にしたがってプロテインＡカラムを使用して精製した。それらの構造を非還元および還元ＣＥ−ＳＤＳにより実施例４にしたがって確認し、配列を実施例５にしたがってグリカン除去を用いてＬＣ−ＭＳによりさらに同定した。それらのホモ二量体％含有量を実施例６にしたがってサイズ排除クロマトグラフィーにより測定し、それらのインスリン受容体結合親和性を実施例７にしたがって測定した。表１７に示すように、ｃＮｇ−ＮＢ１５１−Ｓ突然変異をＦｃ断片に組み込むことはホモ二量体％を減少させ、許容できない高いレベルの凝集を指し示した（すなわち、ホモ二量体％は７０％のすぐ上まで低下した）。
Figure 2021530210
配列番号１０２および配列番号１０４のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質のインビボでの生物活性を実施例１０の手順にしたがってそれぞれＮ＝１のイヌにおいて試験した。単回皮下投薬についての図２５に示される結果は、両方の化合物は配列番号３２のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質よりインビボで有意に低い生物活性であったことを実証する（配列番号１０４についてのＮＡＯＣ＝５７４ＦＢＧＬ％・日・ｋｇ／ｍｇ；配列番号１０２についてのＮＡＯＣ＝９２１ＦＢＧＬ％・日・ｋｇ／ｍｇ）。ｃＮｇ−ＮＢ１５１−Ｓ突然変異をＦｃ断片に組み込んで非グリコシル化バージョンの配列番号３２のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質を製造することは、予想外なことに、結果としてもたらされる化合物のインビボでの生物活性を減少させたことを結果は指し示す。
ｃＮｇ−ＮＢ１５１−Ｓ部位突然変異を含有する配列番号１０４のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の凝集の程度を減少させかつ生物活性を向上させることを試みて、凝集の原因となると考えられる領域中の突然変異を用いて様々なインスリン−ポリペプチドＢ鎖変種を調べた。インスリン−Ｆｃ融合タンパク質を実施例１にしたがってＨＥＫ２９３細胞中で生産し、実施例３にしたがってプロテインＡカラムを使用して精製した。それらの構造を非還元および還元ＣＥ−ＳＤＳにより実施例４にしたがって確認し、配列を実施例５にしたがってグリカン除去を用いてＬＣ−ＭＳによりさらに同定した。それらのホモ二量体％含有量を実施例６にしたがってサイズ排除クロマトグラフィーにより測定した。試験したＢ鎖変種のうち、Ｂ鎖のＮ末端から１６番目のアミノ酸（すなわち、Ｂ１６）におけるチロシンからアラニンへの置換を含有する１つのインスリンＦｃ融合タンパク質（配列番号３６）は、予想外なことに、低い凝集（９９％のホモ二量体）と共に高いホモ二量体タイター（１０５ｍｇ／Ｌ）を有し、１０４ｍｇ／Ｌのホモ二量体タイターを結果としてもたらすことが見出された。実施例７にしたがって測定されたインスリン受容体結合は、２０４０ｎＭのＩＣ５０と共に許容されるものであった。実施例９にしたがって測定されたＦｃＲｎ受容体結合親和性ＥＣ５０値は１１９４ｎｇ／ｍＬであった。配列番号３６のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の薬物動態プロファイルをＥＬＩＳＡを使用して実施例１２の方法により測定し、２コンパートメントモデルをデータにフィッティングして、その排出半減期を４．１±０．７日と決定した。配列番号３６の配列を以下に示す（明確性のためにＢ１６ＡおよびｃＮｇ−ＮＢ１５１−Ｓ突然変異に下線を引いている）。
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＳＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号３６）
配列番号３６のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質を次にイヌにおける繰返しの投薬での生物活性の成績について評価した。実施例１１の手順にしたがって０日目、７日目、１４日目、および２８日目にＮ＝１のイヌの皮下に化合物を投与した。イヌのＦＢＧＬ％があまりに低く低下した場合、イヌに食餌を与えて安全なレベルまで血中グルコースを上昇させた。予想外なことに、配列番号１０４のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質と比較して、Ｂ１６Ａ突然変異を含有する配列番号３６のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の１回目の注射についてのＮＡＯＣは有意により高かった（１１８５ＦＢＧＬ％・日・ｋｇ／ｍｇ）。１回目の投薬のインビボでの生物活性のプロットを図２６に示す。化合物の薬物動態プロファイルもまた、ＥＬＩＳＡを使用して実施例１２の方法により測定し、２コンパートメントモデルをデータにフィッティングして、その排出半減期を３．５日と決定した。ＮＡＯＣおよびＮＡＯＣＲもまた、実施例１１の一般手順にしたがって各その後の投薬について測定し、次の用量が投与される直前までに用量が投与された時間から算出した。表１８に示されるＮＡＯＣおよびＮＡＯＣＲは、配列番号３６のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質は４回の投薬の全体を通じて０．６より高いまたはそれに等しいＮＡＯＣＲを維持し、そのため繰返しの投薬での生物活性の設計目標を満たすことを示す。以上を合わせると、配列番号３２の好適な非グリコシル化ｃＮｇ−Ｓ変種を得るためにインスリンＢ鎖配列を突然変異させることが必要であったことを結果は指し示す。したがって、配列番号１１のインスリンポリペプチドは、ｃＮｇ突然変異型イヌ科動物ＩｇＧＢ Ｆｃ断片を含む非グリコシル化インスリン−Ｆｃ融合タンパク質のために好ましいものであった。
Figure 2021530210
最後に、実施例８の手順にしたがってＦｃ（ガンマ）受容体結合活性を測定することにより選択化合物を免疫系と相互作用する可能性について試験した。表１９は、これらのインスリン−Ｆｃ融合タンパク質のＦｃ（ガンマ）受容体Ｉ結合を配列番号５２のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質のＦｃ（ガンマ）受容体結合と比較したものである。非グリコシル化インスリン−Ｆｃ融合タンパク質（ｃＮｇ−Ｓ突然変異を通じて達成される）は配列番号５２に対する最も低いＦｃ（ガンマ）受容体結合比を呈したことが分かる。
Figure 2021530210
実施例３４：安定的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞系を介して作られたイヌ科動物ＩｇＧＢ起源のＦｃ断片を含む好ましいインスリン−Ｆｃ融合タンパク質を使用した例示的なＣＨＯベースの製造ラン
配列番号３２、または配列番号３６をコードするベクターを用いて安定的にトランスフェクトされた別々のＣＨＯ細胞系を実施例２に記載されるように構築した。流加シェークフラスコ１４日製造ラン（０．５〜２．０Ｌの培地スケール）を３７℃および５％の二酸化炭素においてインキュベーター−シェーカーセットに５０万細胞／ｍＬにおいて播種し、増殖培地としてＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯをＤｙｎａｍｉｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に置換し、フィードとしてＥｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｆｅｅｄ Ｃ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用した以外は上記の実施例２に記載されるようにランを実行した。フィードを製造ランの３日目に開始して３％ｖ／ｖにおいて加え、４日目にシェークフラスコ温度を３２℃に調整し、インキュベーター−シェーカーの二酸化炭素濃度を５％から２％に低下させた。ランの間に、細胞は８００万〜１４００万細胞／ｍＬに増加し、１４日目に製造ランを回収して細胞を除去し、培養上清を実施例３、４、５、および６に記載されるように精製および試験してインスリン−Ｆｃ融合タンパク質を得た。表２０は、安定的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞系を用いる製造ランから得られた生産データを記載する。
Figure 2021530210
実施例３５：安定的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞系を介して作られるイヌ科動物ＩｇＧＢ起源のＦｃ断片を含む好ましいインスリン−Ｆｃ融合タンパク質を使用する例示的なＣＨＯベースの製造ラン
配列番号３４をコードするベクターを用いて安定的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞系を実施例２に記載されるように構築する。流加シェークフラスコ１４日製造ラン（０．５〜２．０Ｌの培地スケール）を３７℃および５％の二酸化炭素においてインキュベーター−シェーカーセットに５０万細胞／ｍＬにおいて播種し、増殖培地としてＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯをＤｙｎａｍｉｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に置換し、フィードとしてＥｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｆｅｅｄ Ｃ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用する以外は実施例２に記載されるようにランを実行する。フィードを製造ランの３日目に開始して３％ｖ／ｖにおいて加え、４日目にシェークフラスコ温度を３２℃に調整し、インキュベーター−シェーカーの二酸化炭素濃度を５％から２％に低下させる。１４日目に製造ランを回収して細胞を除去し、培養上清を実施例３、４、５、および６に記載されるように精製および試験してインスリン−Ｆｃ融合タンパク質を得る。結果としてもたらされる製造ランは、配列番号３４の２００ｍｇ／Ｌより高いタンパク質収率、９５％より高いホモ二量体、および１９０ｍｇ／Ｌより高いホモ二量体タイターを与える。
結果 − ネコ科動物Ｆｃ断片を含むインスリン−ＦＣ融合タンパク質
実施例３６：ネコ科動物ＩｇＧ２アイソタイプのＦｃ断片を含むインスリン−Ｆｃ融合タンパク質
ネコにおいて使用するために好適な製造物を開発するために、以下のアミノ酸配列を有する、配列番号１３のペプチドリンカーを使用して配列番号４のインスリンポリペプチド配列およびネコ科動物ＩｇＧ２アイソタイプのＦｃ断片（配列番号２１）を含むインスリン−Ｆｃ融合タンパク質を製造することを試みた：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＤＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＤＰＴＧＧＧＰＲＲＧＩＶＥＱＣＣＨＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＥＧＰＫＣＰＶＰＥＩＰＧＡＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＳＩＳＲＴＰＥＶＴＣＬＶＶＤＬＧＰＤＤＳＮＶＱＩＴＷＦＶＤＮＴＥＭＨＴＡＫＴＲＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＬＨＱＤＷＬＫＧＫＥＦＫＣＫＶＮＳＫＳＬＰＳＡＭＥＲＴＩＳＫＡＫＧＱＰＨＥＰＱＶＹＶＬＰＰＴＱＥＥＬＳＥＮＫＶＳＶＴＣＬＩＫＧＦＨＰＰＤＩＡＶＥＷＥＩＴＧＱＰＥＰＥＮＮＹＱＴＴＰＰＱＬＤＳＤＧＴＹＦＬＹＳＲＬＳＶＤＲＳＨＷＱＲＧＮＴＹＴＣＳＶＳＨＥＡＬＨＳＨＨＴＱＫＳＬＴＱＳＰＧ（配列番号１０６）
配列番号１０６のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質を実施例１にしたがってＨＥＫ細胞中で合成し、実施例３にしたがって精製した。インスリン−Ｆｃ融合タンパク質の構造を非還元および還元ＣＥ−ＳＤＳにより実施例４にしたがって確認し、配列を実施例５にしたがってグリカン除去を用いてＬＣ−ＭＳによりさらに同定した。実施例６にしたがってサイズ排除クロマトグラフィーにより測定された、結果としてもたらされた化合物のホモ二量体％は８８％であった。結果としてもたらされたホモ二量体タイターは２０ｍｇ／Ｌに過ぎず、これはＨＥＫ細胞は高い収率において製造物を作ることができないことの結果としてもたらされた（すなわち、タンパク質精製後のタンパク質収率は２３ｍｇ／Ｌに過ぎなかった）。要約すると、ＨＥＫ細胞中での配列番号１０６のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の生産は、中等度のレベルの凝集物および２０ｍｇ／Ｌの低いホモ二量体タイターを結果としてもたらし、これは５０ｍｇ／Ｌより高いホモ二量体タイターの設計目標を満たさなかった。
それにもかかわらず、配列番号１０６のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質を生物活性について評価した。最初に、配列番号１０６のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質のインスリン受容体結合を実施例７にしたがって測定したところ２２ｎＭのＩＣ５０値が結果としてもたらされ、化合物はインビボで生物活性であるらしいこと（すなわち、５０００ｎＭ未満のＩＣ５０）を指し示した。
次に、実施例１０にしたがって０．８ｍｇ／ｋｇの用量におけるＮ＝３のネコへの化合物の単回皮下投与後に配列番号１０６のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質のインビボ薬力学（ＰＤ）を測定した。図２７は、配列番号１０６のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質（１６１ｃ）についての空腹時血中グルコースレベルのパーセントを時間の関数として示す。インスリン−Ｆｃ融合タンパク質のＮＡＯＣは、実施例１１の手順にしたがって２１５ＦＢＧＬ％・日・ｋｇ／ｍｇであると算出された。驚くべきことに、配列番号５のインスリンポリペプチドおよび配列番号１２のペプチドリンカーを含む配列番号４２のイヌ用の類似したインスリン−Ｆｃ融合タンパク質とは異なり、配列番号１０６のネコ用のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質は、はるかに低い凝集であり、かつ標的動物において有意により生物活性であることが見出された。
ＮＡＯＣは許容され、かつ薬物動態データは週に１回の投与をサポートするものであったので、ネコに２８日目、３５日目、４２日目および４９日目に追加の皮下投薬を与え、ＦＢＧＬ％を実施例１１にしたがって各投薬後の７日ウィンドウにわたり測定した。ＮＡＯＣおよびＮＡＯＣＲを各繰返しの皮下注射について実施例１１の手順にしたがって算出した。表２１に示されるように、ネコにおける繰返しの皮下投薬は、ＮＡＯＣＲの有意な減少により測定されるように、３回目の投薬までに生物活性の有意な減衰を明らかにした（すなわち、３回目の注射についてのＮＡＯＣは１回目の注射についてのＮＡＯＣの０．４０、または４０％に過ぎず、４回目の注射についてのＮＡＯＣは１回目の注射についてのＮＡＯＣの０．１０、または１０％に過ぎなかった）。ネコにおける繰返しの投薬後の配列番号１０６のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質についての生物活性の有意な減衰は、実施例２０に示されるイヌにおいて配列番号５２のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質について観察されたものに類似していた。
Figure 2021530210
実施例３７：タンパク質収率、純度、およびインスリン受容体活性に対するインスリンポリペプチド突然変異およびネコ科動物ＩｇＧ１ｂまたはＩｇＧ２ Ｆｃ断片の選択の評価
配列番号１０６のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質のホモ二量体％含有量およびタンパク質収率を増加させることを試みて、突然変異をインスリンポリペプチドＢ鎖（例えば、Ｂ１６Ａ突然変異）およびペプチドリンカーの配列に挿入した。さらには、配列番号１０６のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質を構築するために使用したネコ科動物ＩｇＧ２ Ｆｃ断片（配列番号２１）に加えてネコ科動物ＩｇＧ１ｂ Ｆｃ断片（配列番号２０）を評価した。結果としてもたらされるインスリン−Ｆｃ融合タンパク質配列を以下に示し、配列番号１０６に対する結果としてもたらされる配列アライメントを図２８に示す（Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ）。
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＤＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＤＰＴＧＧＧＰＲＲＧＩＶＥＱＣＣＨＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮＧＧＧＧＳＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＰＰＥＭＬＧＧＰＳＩＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＳＩＳＲＴＰＥＶＴＣＬＶＶＤＬＧＰＤＤＳＤＶＱＩＴＷＦＶＤＮＴＱＶＹＴＡＫＴＳＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＬＨＱＤＷＬＫＧＫＥＦＫＣＫＶＮＳＫＳＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＤＫＧＱＰＨＥＰＱＶＹＶＬＰＰＡＱＥＥＬＳＲＮＫＶＳＶＴＣＬＩＥＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＩＴＧＱＰＥＰＥＮＮＹＲＴＴＰＰＱＬＤＳＤＧＴＹＦＬＹＳＲＬＳＶＤＲＳＲＷＱＲＧＮＴＹＴＣＳＶＳＨＥＡＬＨＳＨＨＴＱＫＳＬＴＱＳＰＧ（配列番号１０８）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＤＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＤＰＴＧＧＧＰＲＲＧＩＶＥＱＣＣＨＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮＧＧＧＧＡＧＧＧＧＧＥＧＰＫＣＰＶＰＥＩＰＧＡＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＳＩＳＲＴＰＥＶＴＣＬＶＶＤＬＧＰＤＤＳＮＶＱＩＴＷＦＶＤＮＴＥＭＨＴＡＫＴＲＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＬＨＱＤＷＬＫＧＫＥＦＫＣＫＶＮＳＫＳＬＰＳＡＭＥＲＴＩＳＫＡＫＧＱＰＨＥＰＱＶＹＶＬＰＰＴＱＥＥＬＳＥＮＫＶＳＶＴＣＬＩＫＧＦＨＰＰＤＩＡＶＥＷＥＩＴＧＱＰＥＰＥＮＮＹＱＴＴＰＰＱＬＤＳＤＧＴＹＦＬＹＳＲＬＳＶＤＲＳＨＷＱＲＧＮＴＹＴＣＳＶＳＨＥＡＬＨＳＨＨＴＱＫＳＬＴＱＳＰＧ（配列番号１１０）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＤＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＤＰＴＧＧＧＰＲＲＧＩＶＥＱＣＣＨＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＥＧＰＫＣＰＶＰＥＩＰＧＡＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＳＩＳＲＴＰＥＶＴＣＬＶＶＤＬＧＰＤＤＳＮＶＱＩＴＷＦＶＤＮＴＥＭＨＴＡＫＴＲＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＬＨＱＤＷＬＫＧＫＥＦＫＣＫＶＮＳＫＳＬＰＳＡＭＥＲＴＩＳＫＡＫＧＱＰＨＥＰＱＶＹＶＬＰＰＴＱＥＥＬＳＥＮＫＶＳＶＴＣＬＩＫＧＦＨＰＰＤＩＡＶＥＷＥＩＴＧＱＰＥＰＥＮＮＹＱＴＴＰＰＱＬＤＳＤＧＴＹＦＬＹＳＲＬＳＶＤＲＳＨＷＱＲＧＮＴＹＴＣＳＶＳＨＥＡＬＨＳＨＨＴＱＫＳＬＴＱＳＰＧ（配列番号１１２）
インスリン−Ｆｃ融合タンパク質を実施例１にしたがってＨＥＫ２９３細胞中で生産し、実施例３にしたがってプロテインＡカラムを使用して精製した。それらの構造を非還元および還元ＣＥ−ＳＤＳにより実施例４にしたがって確認し、配列を実施例５にしたがってグリカン除去を用いてＬＣ−ＭＳによりさらに同定した。それらのホモ二量体％含有量を実施例６にしたがってサイズ排除クロマトグラフィーにより測定し、それらのインスリン受容体結合親和性を実施例７にしたがって測定した。インスリン−Ｆｃ融合タンパク質変種を、対応するタンパク質収率、ホモ二量体％、およびホモ二量体タイターと共に表２２に列記する。様々な突然変異は、配列番号１０８のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質を製造するためにネコ科動物ＩｇＧ１ｂアイソタイプＦｃ断片と組み合わせられた場合に、はるかにより高いタンパク質収率を生じさせたが、結果としてもたらされたタンパク質はより凝集したことを結果は示す（例えば、配列番号１０６より低いホモ二量体％）。ネコ科動物ＩｇＧ１ｂは、イヌ科動物インスリン−Ｆｃ融合タンパク質の製造のための高度に好ましいＦｃアイソタイプであるイヌ科動物ＩｇＧＢ Ｆｃ断片アイソタイプ（実施例３２）に機能がより類似しているので、これは驚くべきことであった。ネコ科動物ＩｇＧ２アイソタイプを含有する突然変異したネコ科動物組成のうち、インスリンポリペプチドＢ鎖のＢ１６Ａ突然変異を含むもの（すなわち、配列番号１１０および配列番号１１２）は、タンパク質収率およびホモ二量体タイターの向上に繋がった。しかしながら、配列番号１１０（すなわち、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧ）中に存在する突然変異したリンカーは、配列番号１１２と比較した場合にタンパク質収率およびホモ二量体タイターにおけるさらなる倍加を提供したようである。
Figure 2021530210
実施例３８：ネコ科動物ＩｇＧ２アイソタイプＦｃ断片を有する配列番号４のインスリンポリペプチドを含むインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の繰返しの皮下投薬後のインビボ免疫原性スクリーニング
いかなる具体的な説明にも縛られないが、ネコにおける４回目の繰返しの皮下投薬後の配列番号１０６のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の生物活性における有意な低減（実施例３６）の原因は、その生物学的活性を中和する抗薬物抗体の発生に起因することが想定された。抗薬物抗体は、インスリン−Ｆｃ融合タンパク質のインスリンポリペプチド、リンカー、またはＦｃ断片部分を標的としている可能性がある。免疫原性応答は、抗原提示細胞、Ｔヘルパー細胞、Ｂ細胞、およびそれらの関連付けられるサイトカインの間の相互作用として現れ、薬物に対する内因性の抗体（例えば、抗薬物抗体）の産生に繋がり得る。結合抗体は、インスリン−Ｆｃ融合タンパク質に結合することができる全てのアイソタイプであり、これらは実施例１４に記載されるようなイムノアッセイにおいて検出され得る。インスリン−Ｆｃ融合タンパク質の機能的活性を阻害する中和抗体は、一般に、生物学的に活性の部位を標的とする。これが該当するかどうかを査定するために、各用量の投与前および実施例１１に記載の実験の終了時に収集した血清を試験して、実施例１４にしたがって抗薬物抗体のレベルを定量化した。図２９に示すように、抗薬物抗体のレベルは化合物の複数回皮下投与と共に実際に増加し、中和抗薬物抗体の生成が、配列番号１０６のインスリンＦｃ融合タンパク質の４回目の注射後のＮＡＯＣＲの低減の原因であるらしいことを指し示した。
実施例３９：抗薬物抗体を含有するネコ科動物血清のスクリーニングならびにインスリンポリペプチドのＢ１０ＤおよびＡ８Ｈの位置における潜在的な免疫原性エピトープの同定
イヌにおいて配列番号５２について観察されたように（実施例２０）、配列番号４のインスリンポリペプチドおよび配列番号１３のペプチドリンカーを含む配列番号１０６のインスリン融合タンパク質の繰返しの投薬での生物活性は、抗薬物抗体を依然として生じさせた（実施例３８）。したがって、配列番号４のインスリンポリペプチドは、予想外なことに、ネコの免疫系が標的とする特定のエピトープ（すなわち、免疫原性「ホットスポット」）を含有し得るという仮説を立てた。したがって、実施例３８に記載の血清試料中に存在する抗体の結合特異性を実施例１５の一般手順にしたがって評価した。コーティングされたインスリン−Ｆｃ融合タンパク質ライブラリーに対する配列番号１０６のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の繰返しの投薬（実施例３８）からの抗体含有ネコ科動物血清試料の分析は、予想外なことに、Ｂ１０Ｄ部位突然変異（すなわち、Ｂ鎖のＮ末端から１０番目の位置（すなわち、Ｂ１０）におけるアスパラギン酸突然変異）、および、別々に、Ａ８Ｈ部位突然変異（すなわち、Ａ鎖のＮ末端から８番目の位置（すなわち、Ａ８）におけるヒスチジン突然変異）におけるヒスチジン突然変異という２つの主要な「ホットスポット」が配列番号４のインスリンポリペプチド配列内に存在することを実証した。これらの２つの具体的なアミノ酸突然変異を含有するインスリンポリペプチドアミノ酸組成を含むインスリン−Ｆｃ融合タンパク質はネコにおいて免疫原性であるらしく、したがって、繰返しの注射後に生物活性を中和する抗薬物抗体を生じさせるらしいことを結果は示唆する。したがって、Ｂ１０ＤおよびＡ８Ｈを含有しないインスリンポリペプチドは、（例えば、ネコ科動物糖尿病を治療するために）長期間にわたりネコにおいて繰り返し投薬される必要があるインスリン−Ｆｃ融合タンパク質のために好ましいことが決定された。
実施例４０：免疫原性の潜在的なリスクを低減するためにインスリンポリペプチドのＢ１０、Ａ８、および他の部位がさらに突然変異した配列番号４のインスリンポリペプチドならびにグリコシル化および非グリコシル化ネコ科動物ＩｇＧ１ｂおよびＩｇＧ２アイソタイプＦｃ断片を含むインスリン−Ｆｃ融合タンパク質
「ホットスポット」突然変異を置き換えることが、配列番号４のインスリンポリペプチドおよびネコ科動物ＩｇＧ２アイソタイプ断片を含むインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の免疫原性および繰返しの投薬での生物活性を向上させるのかどうかを評価するために、インスリンポリペプチドのＢ１０およびＡ８アミノ酸が、イヌ科動物インスリン−Ｆｃ融合タンパク質の多くのために使用された配列番号５のインスリンポリペプチドについて該当するように、それらの天然のそれぞれヒスチジンおよびアラニン組成に回復され、かつＢ１６におけるヒスチジンがアラニンで置き換えられた（すなわち、Ｂ１６Ａ）配列番号１１４、１１６、および１１８の例示的なインスリン−Ｆｃ融合タンパク質を合成した。天然のインスリンのＡ２１Ｎ部位もまた欠失させた。この実施例のために、他のインスリンポリペプチドアミノ酸を突然変異させて、構造を天然のネコ科動物インスリンにより類似したものとした（例えば、Ｂ３０Ａ、Ａ８Ａ、Ａ１０Ｖ、およびＡ１８Ｈ）。結果としてもたらされたインスリンポリペプチドの配列（配列番号１２０）を、ネコ科動物インスリンに対する非天然アミノ酸に下線を引いて以下に列記する。
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＤＰＡＧＧＧＰＲＲＧＩＶＥＱＣＣＡＳＶＣＳＬＹＱＬＥＨＹＣ（配列番号１２０）
さらには、実施例２２および３３において議論した非グリコシル化ｃＮｇ突然変異体の追加の潜在的な利益を考慮して、評価したインスリン−Ｆｃ融合タンパク質のうちの２つ（配列番号１１６および１１８）はｃＮｇ−Ｓ突然変異を含有する。インスリン−Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸配列全体を以下に示し、配列番号１０８に対する結果としてもたらされる配列アライメントを図３０に示す（Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ）。
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＤＰＡＧＧＧＰＲＲＧＩＶＥＱＣＣＡＳＶＣＳＬＹＱＬＥＨＹＣＧＧＧＧＡＧＧＧＧＧＥＧＰＫＣＰＶＰＥＩＰＧＡＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＳＩＳＲＴＰＥＶＴＣＬＶＶＤＬＧＰＤＤＳＮＶＱＩＴＷＦＶＤＮＴＥＭＨＴＡＫＴＲＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＬＨＱＤＷＬＫＧＫＥＦＫＣＫＶＮＳＫＳＬＰＳＡＭＥＲＴＩＳＫＡＫＧＱＰＨＥＰＱＶＹＶＬＰＰＴＱＥＥＬＳＥＮＫＶＳＶＴＣＬＩＫＧＦＨＰＰＤＩＡＶＥＷＥＩＴＧＱＰＥＰＥＮＮＹＱＴＴＰＰＱＬＤＳＤＧＴＹＦＬＹＳＲＬＳＶＤＲＳＨＷＱＲＧＮＴＹＴＣＳＶＳＨＥＡＬＨＳＨＨＴＱＫＳＬＴＱＳＰ（配列番号１１４）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＤＰＡＧＧＧＰＲＲＧＩＶＥＱＣＣＡＳＶＣＳＬＹＱＬＥＨＹＣＧＧＧＧＡＧＧＧＧＧＥＧＰＫＣＰＶＰＥＩＰＧＡＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＳＩＳＲＴＰＥＶＴＣＬＶＶＤＬＧＰＤＤＳＮＶＱＩＴＷＦＶＤＮＴＥＭＨＴＡＫＴＲＰＲＥＥＱＦＳＳＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＬＨＱＤＷＬＫＧＫＥＦＫＣＫＶＮＳＫＳＬＰＳＡＭＥＲＴＩＳＫＡＫＧＱＰＨＥＰＱＶＹＶＬＰＰＴＱＥＥＬＳＥＮＫＶＳＶＴＣＬＩＫＧＦＨＰＰＤＩＡＶＥＷＥＩＴＧＱＰＥＰＥＮＮＹＱＴＴＰＰＱＬＤＳＤＧＴＹＦＬＹＳＲＬＳＶＤＲＳＨＷＱＲＧＮＴＹＴＣＳＶＳＨＥＡＬＨＳＨＨＴＱＫＳＬＴＱＳＰＧ（配列番号１１６）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＤＰＡＧＧＧＰＲＲＧＩＶＥＱＣＣＡＳＶＣＳＬＹＱＬＥＨＹＣＧＧＧＧＡＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＰＰＥＭＬＧＧＰＳＩＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＳＩＳＲＴＰＥＶＴＣＬＶＶＡＬＧＰＤＤＳＤＶＱＩＴＷＦＶＤＮＴＱＶＹＴＡＫＴＳＰＲＥＥＱＦＳＳＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＬＨＱＤＷＬＫＧＫＥＦＫＣＫＶＮＳＫＳＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＤＫＧＱＰＨＥＰＱＶＹＶＬＰＰＡＱＥＥＬＳＲＮＫＶＳＶＴＣＬＩＥＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＩＴＧＱＰＥＰＥＮＮＹＲＴＴＰＰＱＬＤＳＤＧＴＹＦＬＹＳＲＬＳＶＤＲＳＲＷＱＲＧＮＴＹＴＣＳＶＳＨＥＡＬＨＳＨＨＴＱＫＳＬＴＱＳＰＧ（配列番号１１８）
インスリン−Ｆｃ融合タンパク質を実施例１にしたがってＨＥＫ２９３細胞中で生産し、実施例３にしたがってプロテインＡカラムを使用して精製した。それらの構造を非還元および還元ＣＥ−ＳＤＳにより実施例４にしたがって確認し、配列を実施例５にしたがってグリカン除去を用いてＬＣ−ＭＳによりさらに同定した。それらのホモ二量体％含有量を実施例６にしたがってサイズ排除クロマトグラフィーにより測定し、それらのインスリン受容体結合親和性を実施例７にしたがって測定した。以下の表２３は、結果としてもたらされた化合物の生産可能性およびインビトロＩＲ結合パラメーターを示す。
Figure 2021530210
予想外なことに、３つ全てのインスリン−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１０８のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質と比較してはるかに低いタンパク質収率を与えた。実際に、配列番号１１６のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質は十分に高いインスリン受容体結合親和性（７０７ｎＭのＩＣ５０）を有していたが、タンパク質収率をほとんど与えなかった。配列番号１１８のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質は、許容できない低いタンパク質収率およびホモ二量体タイターを与え、５０００ｎＭより高いその高いＩＲ結合ＩＣ５０値に起因してインビボで生物活性でないようであるとみなされた。配列番号１１４のタンパク質もまた、許容できない低いタンパク質収率および配列番号１０８のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質と比較してはるかに低いインスリン受容体結合親和性（より高いＩＲ ＩＣ５０値）を与えた。
実施例４１：配列番号８のインスリンポリペプチド、配列番号１４のリンカーおよびネコ科動物ＩｇＧ２アイソタイプＦｃ断片を含むインスリン−Ｆｃ融合タンパク質
免疫原性「ホットスポット」突然変異（すなわち、Ｂ１０ＤおよびＡ８Ｈ）を有しないインスリンポリペプチド配列を含むインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の許容されるタンパク質収率を得ることを試みて、イヌ科動物ＩｇＧＢアイソタイプＦｃ断片における配列番号８のインスリンポリペプチドおよび配列番号１４のペプチドリンカーの使用が高いタンパク質およびホモ二量体タイターならびに許容されるＩＲ結合親和性を結果としてもたらすことを示したイヌ科動物インスリン−Ｆｃ融合タンパク質の同時および並行の開発から学習を得た。したがって、配列番号２１のネコ科動物ＩｇＧ２ Ｆｃ断片において配列番号８のインスリンポリペプチドおよび配列番号１４のペプチドリンカーを使用してネコ科動物インスリン−Ｆｃ融合タンパク質を構築して以下の配列を製造した：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＧＥＧＰＫＣＰＶＰＥＩＰＧＡＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＳＩＳＲＴＰＥＶＴＣＬＶＶＤＬＧＰＤＤＳＮＶＱＩＴＷＦＶＤＮＴＥＭＨＴＡＫＴＲＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＬＨＱＤＷＬＫＧＫＥＦＫＣＫＶＮＳＫＳＬＰＳＡＭＥＲＴＩＳＫＡＫＧＱＰＨＥＰＱＶＹＶＬＰＰＴＱＥＥＬＳＥＮＫＶＳＶＴＣＬＩＫＧＦＨＰＰＤＩＡＶＥＷＥＩＴＧＱＰＥＰＥＮＮＹＱＴＴＰＰＱＬＤＳＤＧＴＹＦＬＹＳＲＬＳＶＤＲＳＨＷＱＲＧＮＴＹＴＣＳＶＳＨＥＡＬＨＳＨＨＴＱＫＳＬＴＱＳＰＧ（配列番号１２２）
実施例３７の配列、配列番号１０６および１１２に対する配列番号１２２の配列アライメントを図３１に示す（Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ）。
Figure 2021530210
配列番号１２２のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質を実施例１にしたがってＨＥＫ２９３細胞中で生産し、実施例３にしたがってプロテインＡカラムを使用して精製した。それらの構造を非還元および還元ＣＥ−ＳＤＳにより実施例４にしたがって確認し、配列を実施例５にしたがってグリカン除去を用いてＬＣ−ＭＳによりさらに同定した。それらのホモ二量体％含有量を実施例６にしたがってサイズ排除クロマトグラフィーにより測定し、それらのインスリン受容体結合親和性を実施例７にしたがって測定した。ＦｃＲｎ受容体結合親和性を実施例９にしたがって測定した。タンパク質収率は１４６ｍｇ／Ｌであり、ホモ二量体％は９９％であると決定され、生産設計目標を満たす１４５ｍｇ／Ｌのホモ二量体タイターを結果としてもたらした。ＩＲ結合親和性ＩＣ５０値は２，５３６ｎＭであり、化合物はインビボで生物活性であるらしいことを指し示した。ＦｃＲｎ受容体結合親和性ＥＣ５０値は３１１４ｎｇ／ｍＬであった。したがって、配列番号１２２のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質はインビボでさらに試験するための潜在的な候補であった。
実施例４２：配列番号８のインスリンポリペプチド、配列番号１４のペプチドリンカー、および配列番号２１のネコ科動物ＩｇＧ２ Ｆｃ断片から構築されたインスリン−Ｆｃ融合タンパク質のインビボでの生物活性
配列番号１２２のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質を実施例１０にしたがってインビボでの生物活性について試験した。健常な、抗体ナイーブの、体重約５ｋｇのネコを使用した。０日目に、ネコに配列番号１２２のインスリンＦｃ融合タンパク質を含有する医薬組成物の単回注射を与えた。０日目に、注射の直前および注射の１５、３０、４５、６０、１２０、２４０、３６０、および４８０分後、ならびに注射の１、２、３、４、５、６、および７日後に好適な静脈から血液を収集した。対象の血中グルコースが危険なレベルまで低下した場合、食餌および／またはデキストロース注射を与えて症候性低血糖症を予防した。
図３２は単回投与のＦＢＧＬ％を示し、これは、予想外なことに、配列番号１２２のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質はインビボでわずかに生物活性であるに過ぎなかったことを示す（本質的に０ＦＢＧＬ％・日・ｋｇ／ｍｇのＮＡＯＣ）。殊に、インスリン−Ｆｃ融合タンパク質は凝集せず（すなわち、高いホモ二量体％含有量を有する）、かつイヌにおいて有意な生物活性を呈することが見出されたイヌ科動物インスリン−Ｆｃ融合タンパク質（実施例３１）と類似した範囲内のＩＲ親和性を分子は呈したので、これは驚くべきことであった。１回目の投与における生物活性の欠如に起因して、繰返しの投与は行わなかった。
実施例４３：配列番号８のインスリンポリペプチドおよび配列番号１４のペプチドリンカーを含むインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の収率、純度、生物活性、および免疫原性に対するネコ科動物ＩｇＧ２ Ｆｃ断片のネコ科動物ＩｇＧ１ｂでの置換の評価
イヌおよびネコ長期作用性インスリン研究プログラムは並行して実行されたので、イヌ科動物インスリン−Ｆｃ融合タンパク質研究プログラムの学習の一部をネコ科動物インスリン−Ｆｃタンパク質研究プログラムに応用した。イヌ科動物インスリン−Ｆｃ研究プログラムからの１つの鍵となる学習は、異なるＩｇＧアイソタイプＦｃ断片（例えば、イヌ科動物ＩｇＧＡ、イヌ科動物ＩｇＧＢ、イヌ科動物ＩｇＧＣ、およびイヌ科動物ＩｇＧＤアイソタイプ）の選択がどのように劇的に異なる生産およびインビボでの有効性性能に繋がるかであった。したがって、配列番号８のインスリンポリペプチドおよび配列番号１４のペプチドリンカーを保ちながら配列番号１２２のネコ科動物ＩｇＧ２ Ｆｃ断片を配列番号２０のネコ科動物ＩｇＧ１ｂ Ｆｃ断片で置き換え、以下のアミノ酸配列が結果としてもたらされた：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＰＰＥＭＬＧＧＰＳＩＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＳＩＳＲＴＰＥＶＴＣＬＶＶＤＬＧＰＤＤＳＤＶＱＩＴＷＦＶＤＮＴＱＶＹＴＡＫＴＳＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＬＨＱＤＷＬＫＧＫＥＦＫＣＫＶＮＳＫＳＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＤＫＧＱＰＨＥＰＱＶＹＶＬＰＰＡＱＥＥＬＳＲＮＫＶＳＶＴＣＬＩＥＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＩＴＧＱＰＥＰＥＮＮＹＲＴＴＰＰＱＬＤＳＤＧＴＹＦＬＹＳＲＬＳＶＤＲＳＲＷＱＲＧＮＴＹＴＣＳＶＳＨＥＡＬＨＳＨＨＴＱＫＳＬＴＱＳＰＧ（配列番号３８）
配列番号３８のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質を実施例１の手順にしたがってＨＥＫ２９３細胞中で合成し、実施例３にしたがってプロテインＡカラムを使用して精製した。構造を非還元および還元ＬＣ−ＭＳにより実施例４にしたがって確認し、配列を実施例５にしたがってグリカン除去を用いてＬＣ−ＭＳによりさらに同定した。タンパク質収率はこのステージにおいて１５８ｍｇ／Ｌであった。配列についてのホモ二量体％を実施例６にしたがってサイズ排除クロマトグラフィーにより測定したところ、９９．５％であると決定され、生産設計目標を満たす１５７ｍｇ／Ｌのホモ二量体タイターを結果としてもたらした。実施例７にしたがって測定されたインビトロでのＩＭ−９インスリン受容体結合ＩＣ５０値は２３９８ｎＭであり、これもまた設計目標を満たす。ＦｃＲｎ受容体結合親和性ＥＣ５０値を実施例９にしたがって測定したところ、１５５２ｎｇ／ｍＬであることが見出された。
配列番号３８のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質を次に実施例１０にしたがってインビボでの生物活性について試験した。健常な、抗体ナイーブの、体重約５ｋｇのネコに０．１６ｍｇのインスリン−Ｆｃ融合タンパク質／ｋｇの用量において配列番号３８のインスリンＦｃ融合タンパク質を含有する医薬組成物の単回皮下注射を与えた。０日目に、注射の直前および注射の１５、３０、４５、６０、１２０、２４０、３６０、および４８０分後、ならびに注射の１、２、３、４、５、６、および７日後に好適な静脈から血液を収集した。対象の血中グルコースが危険なレベルまで低下した場合、食餌および／またはデキストロース注射を与えて症候性低血糖症を予防した。
図３３は１回目の投与後のＦＢＧＬ％を示す。症候性低血糖症を予防するために食餌を動物に定期的に与え、配列番号３８のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質は１８３８ＦＢＧＬ％・日・ｋｇ／ｍｇのＮＡＯＣと共にインビボで有意に生物活性であることが示された。化合物の薬物動態プロファイルもまた、ＥＬＩＳＡを使用して実施例１２の方法により測定し、２コンパートメントモデルをデータにフィッティングして、その排出半減期を６．３±０．５と決定した。配列番号３８のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質と配列番号１２２のそれとの間の生物学的活性（インビトロおよびインビボ）における差異は、予想外なことに、インスリンポリペプチド配列が配列番号８におけるように改変された場合に、ネコ科動物ＩｇＧ１ｂアイソタイプはＦｃ断片のためにネコ科動物ＩｇＧ２アイソタイプより好ましいことを実証する。
ＮＡＯＣは許容され、かつ薬物動態データは週に１回の投与をサポートするものであったので、ネコに１４日目、２８日目、および４２日目に追加の皮下投薬を与え、ＦＢＧＬ％を実施例１１にしたがって各投薬後の７日ウィンドウにわたり測定した。ＮＡＯＣおよびＮＡＯＣＲを各繰返しの皮下注射について実施例１１の手順にしたがって算出した。表２５に示されるように、配列番号３８のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質は、複数の投薬後にインビボで許容される生物活性を実証した。
Figure 2021530210
追加的に、実施例１４にしたがって任意の抗薬物抗体の存在について試験し、かつそのレベルを定量化するために各用量の投与前および実験の終了後に週に１回で２週間、血清を収集した。図３４に示すように、化合物の複数回投与後にベースラインを上回る抗薬物抗体における測定可能な増加はなかった。したがって、許容されるホモ二量体タイター、インビボでの生物活性、およびネコにおける繰返しの週毎の注射後の持続的な生物活性の設計基準を満たすネコ科動物インスリン−Ｆｃ融合タンパク質候補（例えば、配列番号３８）を得るために、配列番号４のインスリンポリペプチドを配列番号８のインスリンポリペプチドで置き換え、かつ配列番号２１のネコ科動物ＩｇＧ２ Ｆｃ断片の代わりに配列番号２０のネコ科動物ＩｇＧ１ｂ Ｆｃ断片を使用することが必要であった。
実施例４４：免疫原性の潜在的なリスクを低減するための配列番号８のインスリンポリペプチド、配列番号１４のペプチドリンカー、およびネコ科動物ＩｇＧ１ｂ Ｆｃ断片を含む非グリコシル化インスリン−Ｆｃ融合タンパク質
配列番号３８のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質は設計目標の全てを満たすが（実施例４３）、長期間の治療（例えば、６か月、１年、２年またはより長い）にわたる免疫原性のリスクがあるかもしれず、またはないかもしれず、これが起こる場合、糖尿病を治療するためのこのインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の使用が損なわれ得る。本発明の詳細な説明に記載されるように、繰返しの投薬後の生物活性の低減の１つのあり得る原因は、中和抗薬物抗体の産生を結果としてもたらすネコ科動物ＩｇＧ１ｂ Ｆｃ断片のネコの免疫系との望ましくない相互作用である。しかしながら、実施例４３に示される結果は、予想外なことに、ネコ科動物ＩｇＧ１ｂアイソタイプは、インビボでの生物活性に関してより低い免疫原性のネコ科動物ＩｇＧ２アイソタイプより好ましかったことを実証する。したがって、長期の慢性の免疫原性リスクを低減するはずである低いＦｃ（ガンマ）ＲＩ受容体結合を有する非グリコシル化インスリン−Ｆｃ融合タンパク質を達成するためにさらなるＦｃ突然変異を探求した。
本発明の詳細な説明に記載されるように、Ｆｃ（ガンマ）ＲＩ相互作用を低減する１つの方法は、Ｆｃ断片ｃＮｇ部位を突然変異させて宿主細胞中での合成の間のグリコシル化を予防することを伴う。したがって、ｃＮｇ部位突然変異を配列番号３８のＦｃ断片領域に対して行って、実施例８に記載のインビトロヒトＦｃ（ガンマ）ＲＩアッセイにおける結合により測定された場合の、インビボでのＦｃ（ガンマ）受容体に対するＦｃ断片の結合親和性を低減させた。配列番号３８のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質中のｃＮｇ部位の位置はｃＮｇ−ＮＢ１５１である。ここでもまた、実施例３３に記載のイヌ科動物インスリン−Ｆｃ融合タンパク質からの学習を活用して、ｃＮｇ−ＮＢ１５１−Ｓ突然変異を配列番号３８のＦｃ断片に導入した。結果としてもたらされるインスリン−Ｆｃ融合タンパク質の全長アミノ酸配列を以下に列記する（明確性のためにｃＮｇ−ＮＢ１５１−Ｓに下線を引いている）：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＰＰＥＭＬＧＧＰＳＩＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＳＩＳＲＴＰＥＶＴＣＬＶＶＤＬＧＰＤＤＳＤＶＱＩＴＷＦＶＤＮＴＱＶＹＴＡＫＴＳＰＲＥＥＱＦＳＳＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＬＨＱＤＷＬＫＧＫＥＦＫＣＫＶＮＳＫＳＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＤＫＧＱＰＨＥＰＱＶＹＶＬＰＰＡＱＥＥＬＳＲＮＫＶＳＶＴＣＬＩＥＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＩＴＧＱＰＥＰＥＮＮＹＲＴＴＰＰＱＬＤＳＤＧＴＹＦＬＹＳＲＬＳＶＤＲＳＲＷＱＲＧＮＴＹＴＣＳＶＳＨＥＡＬＨＳＨＨＴＱＫＳＬＴＱＳＰＧ（配列番号１２４）
配列番号１２４のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質を実施例１の手順にしたがってＨＥＫ２９３細胞中で合成し、実施例３にしたがってプロテインＡカラムを使用して精製した。インスリン−Ｆｃ融合タンパク質の構造を非還元および還元ＬＣ−ＭＳにより実施例４にしたがって確認し、配列を実施例５にしたがってグリカン除去を用いてＬＣ−ＭＳによりさらに同定した。タンパク質収率はこのステージにおいて２０２ｍｇ／Ｌであった。配列についてのホモ二量体％を実施例６にしたがってサイズ排除クロマトグラフィーにより測定したところ、９９％であると決定され、生産設計目標を満たす２００ｍｇ／Ｌのホモ二量体タイターを結果としてもたらした。しかしながら、実施例７にしたがって測定されたインビトロでのＩＭ−９インスリン受容体結合ＩＣ５０値は５０００ｎＭより高く、これはインビトロでの生物活性についての設計目標の外側である。ＦｃＲｎ受容体結合親和性ＥＣ５０値を実施例９にしたがって測定したところ、６９２２ｎｇ／ｍＬであった。
配列番号１２４のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質はインスリン受容体結合の設計目標を満たさなかったが、それを実施例１０にしたがってインビボでの生物活性について試験した。健常な、抗体ナイーブの、体重約５ｋｇのネコを使用した。０日目に、ネコに０．１６ｍｇのインスリン−Ｆｃ融合タンパク質／ｋｇの用量において配列番号１２４のインスリンＦｃ融合タンパク質を含有する医薬組成物の単回注射を与えた。０日目に、注射の直前および注射の１５、３０、４５、６０、１２０、２４０、３６０、および４８０分後、ならびに注射の１、２、３、４、５、６、および７日後に好適な静脈から血液を収集した。対象の血中グルコースが危険なレベルまで低下した場合、食餌および／またはデキストロース注射を与えて症候性低血糖症を予防した。
図３５は単回投与についてのＦＢＧＬ％を示し、これは、配列番号１２４のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質は６５ＦＢＧＬ％・日・ｋｇ／ｍｇのＮＡＯＣと共にインビボでいくぶん生物活性であるに過ぎないことを示す。１回目の投与における生物活性の欠如に起因して、繰返しの投与は行わなかった。
予想外なことに、配列番号３６のイヌ科動物インスリンＦｃ融合タンパク質について実施例３３において該当したように、Ｂ鎖のＮ末端から１６番目のアミノ酸（Ｂ１６）がチロシンからアラニンに突然変異するように配列番号１２４のインスリンポリペプチド配列を突然変異させること（すなわち、Ｂ１６Ａ）は、配列番号４０の結果としてもたらされるインスリン−Ｆｃ融合タンパク質を生物活性とすることが見出された。結果としてもたらされるインスリン−Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸配列を以下に示す（明確性のためにＢ１６ＡおよびｃＮｇ−ＮＢ１５１−Ｓ突然変異に下線を引いている）：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＰＰＥＭＬＧＧＰＳＩＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＳＩＳＲＴＰＥＶＴＣＬＶＶＤＬＧＰＤＤＳＤＶＱＩＴＷＦＶＤＮＴＱＶＹＴＡＫＴＳＰＲＥＥＱＦＳＳＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＬＨＱＤＷＬＫＧＫＥＦＫＣＫＶＮＳＫＳＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＤＫＧＱＰＨＥＰＱＶＹＶＬＰＰＡＱＥＥＬＳＲＮＫＶＳＶＴＣＬＩＥＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＩＴＧＱＰＥＰＥＮＮＹＲＴＴＰＰＱＬＤＳＤＧＴＹＦＬＹＳＲＬＳＶＤＲＳＲＷＱＲＧＮＴＹＴＣＳＶＳＨＥＡＬＨＳＨＨＴＱＫＳＬＴＱＳＰＧ（配列番号４０）
配列番号４０のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質を実施例１の手順にしたがってＨＥＫ２９３細胞中で合成し、実施例３にしたがってプロテインＡカラムを使用して精製した。インスリン−Ｆｃ融合タンパク質の構造を非還元および還元ＣＥ−ＳＤＳにより実施例４にしたがって確認し、配列を実施例５にしたがってグリカン除去を用いてＬＣ−ＭＳによりさらに同定した。タンパク質収率はこのステージにおいて１７４ｍｇ／Ｌであった。配列についてのホモ二量体％を実施例６にしたがってサイズ排除クロマトグラフィーにより測定したところ、９８．９％であると決定され、生産設計基準を満たす１７２ｍｇ／Ｌのホモ二量体タイターを結果としてもたらした。実施例７にしたがって測定された４６３５ｎＭのインビトロＩＭ−９インスリン受容体結合ＩＣ５０値もまた設計目標を満たす。Ｆｃ（ガンマ）受容体活性を実施例８にしたがって測定したところ、同じ手順を使用して配列番号３８のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質について得られたものより約４倍低いことが見出され、インスリン−Ｆｃ融合タンパク質はネコの免疫系と有害に相互作用する可能性はより低いことを指し示した。ＦｃＲｎ受容体結合親和性ＥＣ５０値を実施例９にしたがって測定したところ８１５７ｎｇ／ｍＬであった。
配列番号４０のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質を次に実施例１１にしたがってインビボでの生物活性について試験した。健常な、抗体ナイーブの、体重約５ｋｇのネコを使用した。０日目、７日目、および２１日目にネコに０．１ｍｇのインスリン−Ｆｃ融合タンパク質／ｋｇの用量において配列番号４０のインスリンＦｃ融合タンパク質を含有する医薬組成物の単回皮下注射を与えた。０日目に、注射の直前および注射の１５、３０、４５、６０、１２０、２４０、３６０、および４８０分後、ならびに注射の１、２、３、４、５、６、および７日後に好適な静脈から血液を収集した。対象の血中グルコースが危険なレベルまで低下した場合、食餌および／またはデキストロース注射を与えて症候性低血糖症を予防した。
図３６は１回目の投与後のＦＢＧＬ％を示し、これは、配列番号４０のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質は０．１ｍｇのインスリン−Ｆｃ融合タンパク質／ｋｇの皮下用量について１５９ＦＢＧＬ％・日・ｋｇ／ｍｇのＮＡＯＣと共にインビボで生物活性であることを示す。０．２ｍｇのインスリン−Ｆｃ融合タンパク質／ｋｇの２回目のより高い皮下用量は、７０２ＦＢＧＬ％・日・ｋｇ／ｍｇのはるかにより高いＮＡＯＣを与え、これは図３７に示される。薬物動態プロファイルをＥＬＩＳＡを使用して実施例１２の方法により測定し、２コンパートメントモデルをデータにフィッティングしてその排出半減期を決定すると、これは３日より長い。これらの結果は、Ｂ１６においてアラニンの代わりにチロシンを含む同じ化合物はおおよそ同じ用量（０．１６ｍｇのインスリン−Ｆｃ融合タンパク質／ｋｇ）において非常に弱くのみ生物活性であることを示した配列番号１２４のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質を用いて得られた結果とは対照的である。したがって、配列番号１１のインスリンポリペプチドは、ｃＮｇ突然変異型ネコ科動物ＩｇＧ１ｂ Ｆｃ断片を含む非グリコシル化インスリン−Ｆｃ融合タンパク質のために好ましいものであった。
複数の投薬後の繰返し可能な生物活性を分析するために、ネコに７日目、２１日目、および３５日目に配列番号４０のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質のさらなる投薬を与えた。ネコのＦＢＧＬ％があまりに低く低下した場合、ネコに食餌を与えて安全なレベルまで血中グルコースを上昇させた。ＮＡＯＣおよびＮＡＯＣＲを実施例１１の一般手順にしたがって各その後の用量について測定し、次の用量が投与される直前までに用量が投与された時間から算出した。表２６に示されるＮＡＯＣおよびＮＡＯＣＲは、配列番号４０のインスリン−Ｆｃ融合タンパク質は複数の投薬後にインビボで生物活性であることを示す。
Figure 2021530210
追加的に、実施例１４にしたがって任意の抗薬物抗体の存在について試験し、かつそのレベルを定量化するために各用量の投与前および実験の終了時に血清を収集した。化合物の複数回投与後にベースラインを上回る抗薬物抗体における測定可能な増加はない。したがって、有意に低減されたＦｃ（ガンマ）受容体活性を有する生産および生物活性の設計基準を満たすネコ科動物インスリン−Ｆｃ融合タンパク質を得るために、ｃＮｇをセリンに突然変異させるだけではなく、インスリンポリペプチドのＢ１６アミノ酸をアラニンに突然変異させることが必要であった。
実施例４５：安定的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞系を介して作られたネコ科動物ＩｇＧ１ｂ起源のＦｃ断片を含む好ましいインスリン−Ｆｃ融合タンパク質を使用した例示的なＣＨＯベースの製造ラン
配列番号３８をコードするベクターを用いて安定的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞系を上記の実施例２に記載されるように構築した。流加シェークフラスコ１４日製造ラン（０．５〜２．０Ｌの培地スケール）を３７℃および５％の二酸化炭素においてインキュベーター−シェーカーセットに５０万細胞／ｍＬにおいて播種し、増殖培地としてＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯをＤｙｎａｍｉｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に置換し、フィードとしてＥｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｆｅｅｄ Ｃ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用した以外は上記の実施例２に記載されるようにランを実行した。フィードを製造ランの３日目に開始して３％ｖ／ｖにおいて加え、４日目にシェークフラスコ温度を３２℃に調整し、インキュベーター−シェーカーの二酸化炭素濃度を５％から２％に低下させた。ランの間に、細胞密度は８００万〜１４００万細胞／ｍＬまで増加し、１４日目に製造ランを回収して細胞を除去し、培養上清を実施例３、４、５、および６に記載されるように精製および特徴付けしてインスリン−Ｆｃ融合タンパク質を得た。表２７は、これらの安定的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞系の製造ランを介して得られたインスリン−Ｆｃ融合タンパク質についての生産データを記載する。
Figure 2021530210
実施例４６：安定的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞系を介して作られるネコ科動物ＩｇＧ１ｂ起源の好ましいインスリン−Ｆｃ融合タンパク質を使用する例示的なＣＨＯベースの製造ラン
配列番号４０をコードするベクターを用いて安定的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞系を上記の実施例２に記載されるように構築する。流加シェークフラスコ１４日製造ラン（０．５〜２．０Ｌの培地スケール）を３７℃および５％の二酸化炭素においてインキュベーター−シェーカーセットに５０万細胞／ｍＬにおいて播種し、増殖培地としてＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯをＤｙｎａｍｉｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に置換し、フィードとしてＥｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｆｅｅｄ Ｃ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用する以外は上記の実施例２に記載されるようにランを実行する。フィードを製造ランの３日目に開始して３％ｖ／ｖにおいて加え、４日目にシェークフラスコ温度を３２℃に調整し、インキュベーター−シェーカーの二酸化炭素濃度を５％から２％に低下させる。１４日目に製造ランを回収して細胞を除去し、培養上清を実施例３、４、５、および６に記載されるように精製および特徴付けしてインスリン−Ｆｃ融合タンパク質を得る。結果としてもたらされる製造ランは、配列番号４０の２００ｍｇ／Ｌより高いタンパク質収率、９５％より高いホモ二量体、および１９０ｍｇ／Ｌより高いホモ二量体タイターを与える。
実施例４７：例示的なインスリン−Ｆｃ融合タンパク質ドメインおよび配列
上記の実施例において使用した例示的なインスリン−Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸配列および対応するＤＮＡ配列を図３８、３９、４０、４１、および４２に示す。
均等
請求項において、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」などの冠詞は、そうでないことが指し示されなければまたは文脈から他に明らかでなければ、１つまたは１つより多くを意味することができる。群の１つまたはより多くのメンバーの間に「または」を含む請求項または記載は、そうでないことが指し示されなければまたは文脈から他に明らかでなければ、群メンバーの１つ、１つより多く、または全てが、所与の製造物または方法において存在する、それにおいて用いられる、またはそれに他に関連する場合に、満たされると考えられる。本開示は、群の正確に１つのメンバーが、所与の製造物または方法において存在する、それにおいて用いられる、またはそれに他に関連する実施形態を含む。本開示は、群メンバーの１つより多く、または全てが、所与の製造物または方法において存在する、それにおいて用いられる、またはそれに他に関連する実施形態を含む。
さらには、本開示は、列記される請求項の１つまたはより多くからの１つまたはより多くの限定、要素、節、および記述的用語が別の請求項に導入される全てのバリエーション、組合せ、およびパーミュテーションを包含する。例えば、別の請求項に従属する任意の請求項は、同じ基礎とする請求項に従属する任意の他の請求項中に見出される１つまたはより多くの限定を含むように修飾され得る。要素が、例えばマーカッシュ群形式の、リストとして提示される場合、要素の各亜群もまた開示され、任意の要素を群から除去することができる。一般に、本開示、または本開示の態様が具体的な要素および／または特徴を含むと言及される場合、本開示のある特定の実施形態または本開示の態様は、そのような要素および／または特徴からなる、またはから本質的になることが理解されるべきである。簡便性の目的のために、それらの実施形態は本明細書においてこれらの言葉で特に示されていない。「含む」（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））、「含む」（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）、「含有する」（ｃｏｎｔａｉｎ（ｓ））および「含有する」（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）という用語は開放的であることが意図され、その使用は追加の要素またはステップを含めることを許容することもまた留意される。範囲が与えられる場合、端点が含まれる。さらには、他に指し示されなければまたは文脈および当業者の理解から他に明らかでなければ、範囲として表される表は、文脈が他に明確に規定しなければ、本開示の異なる実施形態において、範囲の下限の単位の１０分の１まで、記載される範囲内の任意の特定の値または部分的範囲をとることができる。

Claims (47)

  1. インスリンポリペプチドおよびＦｃ断片を含む融合タンパク質であって、前記インスリンポリペプチドおよび前記Ｆｃ断片がペプチドリンカーなどのリンカーにより接続されており、前記Ｆｃ断片が非ヒト動物起源であり、かつ以下の配列：
    ＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＮＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号１６）
    を含む、融合タンパク質。
  2. 前記インスリンポリペプチドが、以下の配列：
    ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＸ１ＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＸ２ＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＸ３（配列番号６）
    （Ｘ１はＤではなく、Ｘ２はＨではなく、かつＸ３は存在しないまたはＮである）
    を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
  3. 前記インスリンポリペプチドが、以下の配列：
    ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＸ１ＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＸ２ＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＸ３（配列番号６）
    （Ｘ１はＨであり、Ｘ２はＴであり、かつＸ３は存在しないまたはＮである）
    を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
  4. 前記インスリンポリペプチドおよび前記Ｆｃ断片が、以下の配列：
    ＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧ（配列番号１４）
    を含むペプチドリンカーなどのリンカーにより接続されている、請求項１〜３に記載の融合タンパク質。
  5. 以下の配列：
    ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＮＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号３２）
    を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
  6. 以下の配列：
    ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＮＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＮＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号３４）
    を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
  7. インスリンポリペプチドおよびＦｃ断片を含む融合タンパク質であって、前記インスリンポリペプチドおよび前記Ｆｃ断片がペプチドリンカーなどのリンカーにより接続されており、前記Ｆｃ断片が、以下の配列：
    ＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＳＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号２２）
    を含む、融合タンパク質。
  8. 前記インスリンポリペプチドが、以下の配列：
    ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＸ１ＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＸ２ＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣ（配列番号１０）
    （Ｘ１はＤではなく、かつＸ２はＨではない）
    を含む、請求項７に記載の融合タンパク質。
  9. 前記インスリンポリペプチドが、以下の配列：
    ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＸ１ＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＸ２ＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣ（配列番号１０）
    （Ｘ１はＨであり、かつＸ２はＴである）
    を含む、請求項７に記載の融合タンパク質。
  10. 前記インスリンポリペプチドおよび前記Ｆｃ断片が、以下の配列：
    ＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧ（配列番号１４）
    を含むペプチドリンカーなどのリンカーにより接続されている、請求項７〜９に記載の融合タンパク質。
  11. 以下の配列：
    ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＳＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号３６）
    を含む、請求項７に記載の融合タンパク質。
  12. インスリンポリペプチドおよびＦｃ断片を含む融合タンパク質であって、前記インスリンポリペプチドおよび前記Ｆｃ断片がペプチドリンカーなどのリンカーにより接続されており、前記Ｆｃ断片が非ヒト動物起源であり、かつ以下の配列：
    ＤＣＰＫＣＰＰＰＥＭＬＧＧＰＳＩＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＳＩＳＲＴＰＥＶＴＣＬＶＶＤＬＧＰＤＤＳＤＶＱＩＴＷＦＶＤＮＴＱＶＹＴＡＫＴＳＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＬＨＱＤＷＬＫＧＫＥＦＫＣＫＶＮＳＫＳＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＤＫＧＱＰＨＥＰＱＶＹＶＬＰＰＡＱＥＥＬＳＲＮＫＶＳＶＴＣＬＩＥＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＩＴＧＱＰＥＰＥＮＮＹＲＴＴＰＰＱＬＤＳＤＧＴＹＦＬＹＳＲＬＳＶＤＲＳＲＷＱＲＧＮＴＹＴＣＳＶＳＨＥＡＬＨＳＨＨＴＱＫＳＬＴＱＳＰＧ（配列番号２０）
    を含む、融合タンパク質。
  13. 前記インスリンポリペプチドが、以下の配列：
    ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＸ１ＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＸ２ＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＸ３（配列番号６）
    （Ｘ１はＤではなく、Ｘ２はＨではなく、かつＸ３は存在しない）
    を含む、請求項１２に記載の融合タンパク質。
  14. 前記インスリンポリペプチドが、以下の配列：
    ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＸ１ＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＸ２ＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＸ３（配列番号６）
    （Ｘ１はＨであり、Ｘ２はＴであり、かつＸ３は存在しない）
    を含む、請求項１２に記載の融合タンパク質。
  15. 前記インスリンポリペプチドおよび前記Ｆｃ断片が、以下の配列：
    ＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧ（配列番号１４）
    を含むペプチドリンカーなどのリンカーにより接続されている、請求項１２〜１４に記載の融合タンパク質。
  16. 以下の配列：
    ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＰＰＥＭＬＧＧＰＳＩＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＳＩＳＲＴＰＥＶＴＣＬＶＶＤＬＧＰＤＤＳＤＶＱＩＴＷＦＶＤＮＴＱＶＹＴＡＫＴＳＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＬＨＱＤＷＬＫＧＫＥＦＫＣＫＶＮＳＫＳＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＤＫＧＱＰＨＥＰＱＶＹＶＬＰＰＡＱＥＥＬＳＲＮＫＶＳＶＴＣＬＩＥＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＩＴＧＱＰＥＰＥＮＮＹＲＴＴＰＰＱＬＤＳＤＧＴＹＦＬＹＳＲＬＳＶＤＲＳＲＷＱＲＧＮＴＹＴＣＳＶＳＨＥＡＬＨＳＨＨＴＱＫＳＬＴＱＳＰＧ（配列番号３８）
    を含む、請求項１２に記載の融合タンパク質。
  17. インスリンポリペプチドおよびＦｃ断片を含む融合タンパク質であって、前記インスリンポリペプチドおよび前記Ｆｃ断片がペプチドリンカーなどのリンカーにより接続されており、前記Ｆｃ断片が、以下の配列：
    ＤＣＰＫＣＰＰＰＥＭＬＧＧＰＳＩＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＳＩＳＲＴＰＥＶＴＣＬＶＶＤＬＧＰＤＤＳＤＶＱＩＴＷＦＶＤＮＴＱＶＹＴＡＫＴＳＰＲＥＥＱＦＳＳＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＬＨＱＤＷＬＫＧＫＥＦＫＣＫＶＮＳＫＳＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＤＫＧＱＰＨＥＰＱＶＹＶＬＰＰＡＱＥＥＬＳＲＮＫＶＳＶＴＣＬＩＥＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＩＴＧＱＰＥＰＥＮＮＹＲＴＴＰＰＱＬＤＳＤＧＴＹＦＬＹＳＲＬＳＶＤＲＳＲＷＱＲＧＮＴＹＴＣＳＶＳＨＥＡＬＨＳＨＨＴＱＫＳＬＴＱＳＰＧ（配列番号２３）
    を含む、融合タンパク質。
  18. 前記インスリンポリペプチドが、以下の配列：
    ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＸ１ＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＸ２ＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣ（配列番号１０）
    （Ｘ１はＤではなく、かつＸ２はＨではない）
    を含む、請求項１７に記載の融合タンパク質。
  19. 前記インスリンポリペプチドが、以下の配列：
    ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＸ１ＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＸ２ＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣ（配列番号１０）
    （Ｘ１はＨであり、かつＸ２はＴである）
    を含む、請求項１７に記載の融合タンパク質。
  20. 前記インスリンポリペプチドおよび前記Ｆｃ断片が、以下の配列：
    ＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧ（配列番号１４）
    を含むペプチドリンカーなどのリンカーにより接続されている、請求項１７〜１９に記載の融合タンパク質。
  21. 以下の配列：
    ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＰＰＥＭＬＧＧＰＳＩＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＳＩＳＲＴＰＥＶＴＣＬＶＶＤＬＧＰＤＤＳＤＶＱＩＴＷＦＶＤＮＴＱＶＹＴＡＫＴＳＰＲＥＥＱＦＳＳＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＬＨＱＤＷＬＫＧＫＥＦＫＣＫＶＮＳＫＳＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＤＫＧＱＰＨＥＰＱＶＹＶＬＰＰＡＱＥＥＬＳＲＮＫＶＳＶＴＣＬＩＥＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＩＴＧＱＰＥＰＥＮＮＹＲＴＴＰＰＱＬＤＳＤＧＴＹＦＬＹＳＲＬＳＶＤＲＳＲＷＱＲＧＮＴＹＴＣＳＶＳＨＥＡＬＨＳＨＨＴＱＫＳＬＴＱＳＰＧ（配列番号４０）
    を含む、請求項１７に記載の融合タンパク質。
  22. ホモ二量体である、請求項１〜２１のいずれかに記載の融合タンパク質。
  23. 前記融合タンパク質のホモ二量体のパーセンテージが９０％より高い、請求項２２に記載の融合タンパク質。
  24. 前記融合タンパク質がＨＥＫ２９３細胞を使用して作られ、かつプロテインＡビーズまたはプロテインＡカラムを使用する精製後の結果としてもたられるホモ二量体タイターが５０ｍｇ／Ｌより高い、請求項１〜２１のいずれかに記載の融合タンパク質。
  25. 前記融合タンパク質に対するインスリン受容体ＩＣ５０が５０００ｎＭより低いまたはそれに等しい、請求項１〜２１のいずれかに記載の融合タンパク質。
  26. 投与された場合の標的動物の血液または血清中での前記融合タンパク質の血清半減期が約３日より長い、請求項１〜２１のいずれかに記載の融合タンパク質。
  27. 投薬前レベルと比べて対象において血中グルコースレベルの統計的に有意な減少がある時間が、２時間、６時間、９時間、１２時間、１８時間、１日、１．５日、２日、２．５日、３日、４日、５日、６日、７日、またはより長くのうちの１つより長い、請求項１〜２１のいずれかに記載の融合タンパク質。
  28. 標的動物における１回目の皮下注射後のＮＡＯＣが１５０ＦＢＧＬ％・日・ｋｇ／ｍｇより高い、請求項１〜２１のいずれかの請求項のいずれかに記載の融合タンパク質。
  29. 前記標的動物における前記融合タンパク質の１回目の皮下注射後のＮＡＯＣに対する前記標的動物における前記融合タンパク質の３回目の週毎の皮下注射後のＮＡＯＣの比が０．５０より高い、請求項２８に記載の融合タンパク質。
  30. 医薬組成物として製剤化されている、請求項１〜２１のいずれかに記載の融合タンパク質。
  31. 前記融合タンパク質が、約３ｍｇ／ｍＬまたはより高い濃度において前記医薬組成物中に存在する、請求項３０に記載の医薬組成物。
  32. 皮下投与のために好適なものである、請求項３１に記載の医薬組成物。
  33. 標的動物の血中グルコースレベルを低下させる方法であって、生理学的有効量の請求項１〜２１のいずれか１項に記載の融合タンパク質またはその医薬組成物を患者に投与することを含む、方法。
  34. 前記標的動物が、糖尿病を有すると診断されている、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記標的動物がイヌまたはネコである、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記融合タンパク質が皮下に投与される、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記融合タンパク質が、１日毎、週に２回、または週に１回前記標的動物に投与される、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記融合タンパク質が、０．０２５〜０．５ｍｇ／ｋｇ／週の用量において週に１回前記標的動物に投与される、請求項３７に記載の方法。
  39. 請求項１〜２１のいずれか１項に記載の融合タンパク質を発現するように操作された細胞。
  40. 前記融合タンパク質をコードする核酸をトランスフェクトされている、請求項３９に記載の細胞。
  41. ＨＥＫ２９３細胞またはＣＨＯ細胞である、請求項４０に記載の細胞。
  42. 請求項１〜２１のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードするｃＤＮＡ。
  43. 以下の核酸配列：
    ａｔｇｇａａｔｇｇａｇｃｔｇｇｇｔｃｔｔｔｃｔｃｔｔｃｔｔｃｃｔｇｔｃａｇｔａａｃｇａｃｔｇｇｔｇｔｃｃａｃｔｃｃｔｔｃｇｔｇａａｃｃａｇｃａｃｃｔｇｔｇｃｇｇｃｔｃｃｃａｃｃｔｇｇｔｇｇａａｇｃｔｃｔｇｇａａｃｔｃｇｔｇｔｇｃｇｇｃｇａｇｃｇｇｇｇｃｔｔｃｃａｃｔａｃｇｇｇｇｇｔｇｇｃｇｇａｇｇａｇｇｔｔｃｔｇｇｔｇｇｃｇｇｃｇｇａｇｇｃａｔｃｇｔｇｇａａｃａｇｔｇｃｔｇｃａｃｃｔｃｃａｃｃｔｇｃｔｃｃｃｔｇｇａｃｃａｇｃｔｇｇａａａａｃｔａｃｔｇｃｇｇｔｇｇｃｇｇａｇｇｔｇｇｔｃａａｇｇａｇｇｃｇｇｔｇｇａｃａｇｇｇｔｇｇａｇｇｔｇｇｇｃａｇｇｇａｇｇａｇｇｃｇｇｇｇｇａｇａｃｔｇｃｃｃｃａａｇｔｇｃｃｃｃｇｃｔｃｃｃｇａｇａｔｇｃｔｇｇｇｃｇｇａｃｃｃａｇｃｇｔｇｔｔｃａｔｃｔｔｃｃｃｔｃｃｃａａｇｃｃｃａａｇｇａｃａｃａｃｔｇｃｔｇａｔｃｇｃｃａｇｇａｃｃｃｃｇｇａｇｇｔｇａｃｃｔｇｃｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇａｃｃｔｇｇａｔｃｃｃｇａａｇａｃｃｃｃｇａｇｇｔｇｃａｇａｔｃａｇｃｔｇｇｔｔｃｇｔｇｇａｔｇｇａａａｇｃａｇａｔｇｃａｇａｃｃｇｃｃａａｇａｃｃｃａａｃｃｃｃｇｇｇａａｇａｇｃａｇｔｔｃａａｃｇｇｃａｃｃｔａｃａｇｇｇｔｇｇｔｇａｇｔｇｔｇｔｔｇｃｃｃａｔｃｇｇｃｃａｃｃａｇｇａｃｔｇｇｃｔｇａａｇｇｇｇａａｇｃａａｔｔｃａｃａｔｇｃａａｇｇｔｔａａｔａａｃａａｇｇｃｃｃｔｇｃｃｃａｇｃｃｃｃａｔｃｇａｇａｇｇａｃｃａｔｃａｇｃａａｇｇｃｃａｇｇｇｇｃｃａｇｇｃｃｃａｃｃａｇｃｃａｔｃｔｇｔｇｔａｃｇｔｇｃｔｇｃｃｃｃｃａｔｃｔａｇｇｇａｇｇａａｃｔｇａｇｃａａｇａａｃａｃａｇｔｃａｇｃｃｔｔａｃｔｔｇｃｃｔｇａｔｃａａｇｇａｃｔｔｃｔｔｃｃｃａｃｃｇｇａｃａｔａｇａｃｇｔｇｇａｇｔｇｇｃａｇａｇｔａａｃｇｇｃｃａｇｃａｇｇａｇｃｃｃｇａｇａｇｃａａｇｔａｔａｇｇａｃｃａｃａｃｃｇｃｃｃｃａａｃｔｇｇａｃｇａｇｇａｃｇｇａａｇｃｔａｃｔｔｃｃｔｃｔａｃａｇｃａａａｔｔｇａｇｃｇｔｔｇａｃａａａａｇｃａｇｇｔｇｇｃａｇｃｇａｇｇｃｇａｃａｃｃｔｔｃａｔｃｔｇｃｇｃｃｇｔｇａｔｇｃａｃｇａｇｇｃｔｔｔｇｃａｔａａｃｃａｃｔａｃａｃｃｃａｇｇａｇａｇｃｃｔｇｔｃｃｃａｃａｇｃｃｃｃｇｇａｔａｇ（配列番号３１）
    を含む、請求項４２に記載のｃＤＮＡ。
  44. 以下の核酸配列：
    ａｔｇｇａａｔｇｇａｇｃｔｇｇｇｔｃｔｔｔｃｔｃｔｔｃｔｔｃｃｔｇｔｃａｇｔａａｃｇａｃｔｇｇｔｇｔｃｃａｃｔｃｃｔｔｃｇｔｇａａｃｃａｇｃａｃｃｔｇｔｇｃｇｇｃｔｃｃｃａｃｃｔｇｇｔｇｇａａｇｃｔｃｔｇｇａａｃｔｃｇｔｇｔｇｃｇｇｃｇａｇｃｇｇｇｇｃｔｔｃｃａｃｔａｃｇｇｇｇｇｔｇｇｃｇｇａｇｇａｇｇｔｔｃｔｇｇｔｇｇｃｇｇｃｇｇａｇｇｃａｔｃｇｔｇｇａａｃａｇｔｇｃｔｇｃａｃｃｔｃｃａｃｃｔｇｃｔｃｃｃｔｇｇａｃｃａｇｃｔｇｇａａａａｃｔａｃｔｇｃａａｃｇｇｔｇｇｃｇｇａｇｇｔｇｇｔｃａａｇｇａｇｇｃｇｇｔｇｇａｃａｇｇｇｔｇｇａｇｇｔｇｇｇｃａｇｇｇａｇｇａｇｇｃｇｇｇｇｇａｇａｃｔｇｃｃｃｃａａｇｔｇｃｃｃｃｇｃｔｃｃｃｇａｇａｔｇｃｔｇｇｇｃｇｇａｃｃｃａｇｃｇｔｇｔｔｃａｔｃｔｔｃｃｃｔｃｃｃａａｇｃｃｃａａｇｇａｃａｃａｃｔｇｃｔｇａｔｃｇｃｃａｇｇａｃｃｃｃｇｇａｇｇｔｇａｃｃｔｇｃｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇａｃｃｔｇｇａｔｃｃｃｇａａｇａｃｃｃｃｇａｇｇｔｇｃａｇａｔｃａｇｃｔｇｇｔｔｃｇｔｇｇａｔｇｇａａａｇｃａｇａｔｇｃａｇａｃｃｇｃｃａａｇａｃｃｃａａｃｃｃｃｇｇｇａａｇａｇｃａｇｔｔｃａａｃｇｇｃａｃｃｔａｃａｇｇｇｔｇｇｔｇａｇｔｇｔｇｔｔｇｃｃｃａｔｃｇｇｃｃａｃｃａｇｇａｃｔｇｇｃｔｇａａｇｇｇｇａａｇｃａａｔｔｃａｃａｔｇｃａａｇｇｔｔａａｔａａｃａａｇｇｃｃｃｔｇｃｃｃａｇｃｃｃｃａｔｃｇａｇａｇｇａｃｃａｔｃａｇｃａａｇｇｃｃａｇｇｇｇｃｃａｇｇｃｃｃａｃｃａｇｃｃａｔｃｔｇｔｇｔａｃｇｔｇｃｔｇｃｃｃｃｃａｔｃｔａｇｇｇａｇｇａａｃｔｇａｇｃａａｇａａｃａｃａｇｔｃａｇｃｃｔｔａｃｔｔｇｃｃｔｇａｔｃａａｇｇａｃｔｔｃｔｔｃｃｃａｃｃｇｇａｃａｔａｇａｃｇｔｇｇａｇｔｇｇｃａｇａｇｔａａｃｇｇｃｃａｇｃａｇｇａｇｃｃｃｇａｇａｇｃａａｇｔａｔａｇｇａｃｃａｃａｃｃｇｃｃｃｃａａｃｔｇｇａｃｇａｇｇａｃｇｇａａｇｃｔａｃｔｔｃｃｔｃｔａｃａｇｃａａａｔｔｇａｇｃｇｔｔｇａｃａａａａｇｃａｇｇｔｇｇｃａｇｃｇａｇｇｃｇａｃａｃｃｔｔｃａｔｃｔｇｃｇｃｃｇｔｇａｔｇｃａｃｇａｇｇｃｔｔｔｇｃａｔａａｃｃａｃｔａｃａｃｃｃａｇｇａｇａｇｃｃｔｇｔｃｃｃａｃａｇｃｃｃｃｇｇａｔａｇ（配列番号３３）
    を含む、請求項４２に記載のｃＤＮＡ。
  45. 以下の核酸配列：
    ａｔｇｇａａｔｇｇａｇｃｔｇｇｇｔｃｔｔｔｃｔｃｔｔｃｔｔｃｃｔｇｔｃａｇｔａａｃｇａｃｔｇｇｔｇｔｃｃａｃｔｃｃｔｔｃｇｔｇａａｃｃａｇｃａｃｃｔｇｔｇｃｇｇｃｔｃｃｃａｃｃｔｇｇｔｇｇａａｇｃｔｃｔｇｇｃａｃｔｃｇｔｇｔｇｃｇｇｃｇａｇｃｇｇｇｇｃｔｔｃｃａｃｔａｃｇｇｇｇｇｔｇｇｃｇｇａｇｇａｇｇｔｔｃｔｇｇｔｇｇｃｇｇｃｇｇａｇｇｃａｔｃｇｔｇｇａａｃａｇｔｇｃｔｇｃａｃｃｔｃｃａｃｃｔｇｃｔｃｃｃｔｇｇａｃｃａｇｃｔｇｇａａａａｃｔａｃｔｇｃｇｇｔｇｇｃｇｇａｇｇｔｇｇｔｃａａｇｇａｇｇｃｇｇｔｇｇａｃａｇｇｇｔｇｇａｇｇｔｇｇｇｃａｇｇｇａｇｇａｇｇｃｇｇｇｇｇａｇａｃｔｇｃｃｃｃａａｇｔｇｃｃｃｃｇｃｔｃｃｃｇａｇａｔｇｃｔｇｇｇｃｇｇａｃｃｃａｇｃｇｔｇｔｔｃａｔｃｔｔｃｃｃｔｃｃｃａａｇｃｃｃａａｇｇａｃａｃａｃｔｇｃｔｇａｔｃｇｃｃａｇｇａｃｃｃｃｇｇａｇｇｔｇａｃｃｔｇｃｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇａｃｃｔｇｇａｔｃｃｃｇａａｇａｃｃｃｃｇａｇｇｔｇｃａｇａｔｃａｇｃｔｇｇｔｔｃｇｔｇｇａｔｇｇａａａｇｃａｇａｔｇｃａｇａｃｃｇｃｃａａｇａｃｃｃａａｃｃｃｃｇｇｇａａｇａｇｃａｇｔｔｃｔｃａｇｇｃａｃｃｔａｃａｇｇｇｔｇｇｔｇａｇｔｇｔｇｔｔｇｃｃｃａｔｃｇｇｃｃａｃｃａｇｇａｃｔｇｇｃｔｇａａｇｇｇｇａａｇｃａａｔｔｃａｃａｔｇｃａａｇｇｔｔａａｔａａｃａａｇｇｃｃｃｔｇｃｃｃａｇｃｃｃｃａｔｃｇａｇａｇｇａｃｃａｔｃａｇｃａａｇｇｃｃａｇｇｇｇｃｃａｇｇｃｃｃａｃｃａｇｃｃａｔｃｔｇｔｇｔａｃｇｔｇｃｔｇｃｃｃｃｃａｔｃｔａｇｇｇａｇｇａａｃｔｇａｇｃａａｇａａｃａｃａｇｔｃａｇｃｃｔｔａｃｔｔｇｃｃｔｇａｔｃａａｇｇａｃｔｔｃｔｔｃｃｃａｃｃｇｇａｃａｔａｇａｃｇｔｇｇａｇｔｇｇｃａｇａｇｔａａｃｇｇｃｃａｇｃａｇｇａｇｃｃｃｇａｇａｇｃａａｇｔａｔａｇｇａｃｃａｃａｃｃｇｃｃｃｃａａｃｔｇｇａｃｇａｇｇａｃｇｇａａｇｃｔａｃｔｔｃｃｔｃｔａｃａｇｃａａａｔｔｇａｇｃｇｔｔｇａｃａａａａｇｃａｇｇｔｇｇｃａｇｃｇａｇｇｃｇａｃａｃｃｔｔｃａｔｃｔｇｃｇｃｃｇｔｇａｔｇｃａｃｇａｇｇｃｔｔｔｇｃａｔａａｃｃａｃｔａｃａｃｃｃａｇｇａｇａｇｃｃｔｇｔｃｃｃａｃａｇｃｃｃｃｇｇａｔａｇ（配列番号３５）
    を含む、請求項４２に記載のｃＤＮＡ。
  46. 以下の核酸配列：
    ａｔｇｇａａｔｇｇａｇｃｔｇｇｇｔｃｔｔｔｃｔｃｔｔｃｔｔｃｃｔｇｔｃａｇｔａａｃｇａｃｔｇｇｔｇｔｃｃａｃｔｃｃｔｔｃｇｔｇａａｃｃａｇｃａｃｃｔｇｔｇｃｇｇｃｔｃｃｃａｃｃｔｇｇｔｇｇａａｇｃｔｃｔｇｇａａｃｔｃｇｔｇｔｇｃｇｇｃｇａｇｃｇｇｇｇｃｔｔｃｃａｃｔａｃｇｇｇｇｇｔｇｇｃｇｇａｇｇａｇｇｔｔｃｔｇｇｔｇｇｃｇｇｃｇｇａｇｇｃａｔｃｇｔｇｇａａｃａｇｔｇｃｔｇｃａｃｃｔｃｃａｃｃｔｇｃｔｃｃｃｔｇｇａｃｃａｇｃｔｇｇａａａａｃｔａｃｔｇｃｇｇｔｇｇｃｇｇａｇｇｔｇｇｔｃａａｇｇａｇｇｃｇｇｔｇｇａｃａｇｇｇｔｇｇａｇｇｔｇｇｇｃａｇｇｇａｇｇａｇｇｃｇｇｇｇｇａｇａｃｔｇｃｃｃｃａａａｔｇｔｃｃｔｃｃｇｃｃｔｇａｇａｔｇｃｔｇｇｇｔｇｇｃｃｃｔａｇｃａｔｃｔｔｃａｔｃｔｔｃｃｃｇｃｃｃａａｇｃｃｃａａｇｇａｔａｃｔｃｔｇｔｃｃａｔｔａｇｃａｇｇａｃｃｃｃｃｇａｇｇｔｇａｃｃｔｇｃｃｔｇｇｔｇｇｔｇｇａｃｃｔｇｇｇｇｃｃａｇａｃｇａｃｔｃｔｇａｃｇｔｇｃａｇａｔｃａｃｃｔｇｇｔｔｃｇｔａｇａｃａａｃａｃｃｃａｇｇｔｔｔａｃａｃｔｇｃｃａａｇａｃｃａｇｔｃｃｃａｇｇｇａｇｇａｇｃａｇｔｔｃａａｃａｇｃａｃａｔａｃａｇｇｇｔｇｇｔｇａｇｃｇｔｔｃｔｇｃｃｃａｔｃｃｔｇｃａｃｃａｇｇａｃｔｇｇｃｔｇａａａｇｇｃａａａｇａｇｔｔｃａａｇｔｇｔａａｇｇｔｇａａｃａｇｃａａｇａｇｃｃｔｇｃｃｃａｇｃｃｃｃａｔｔｇａａａｇｇａｃｃａｔｃａｇｃａａｇｇａｃａａｇｇｇｃｃａｇｃｃｇｃａｃｇａｇｃｃｃｃａａｇｔｃｔａｃｇｔｇｃｔｇｃｃｃｃｃａｇｃａｃａｇｇａａｇａｇｃｔｇａｇｃａｇｇａａｃａａｇｇｔｔａｇｃｇｔｇａｃａｔｇｃｃｔｇａｔｃｇａｇｇｇｔｔｔｃｔａｃｃｃｃａｇｃｇａｃａｔｃｇｃｃｇｔｇｇａｇｔｇｇｇａａａｔｃａｃｃｇｇｃｃａａｃｃｃｇａｇｃｃｃｇａｇａａｃａａｃｔａｃａｇｇａｃｃａｃｔｃｃｇｃｃｇｃａａｃｔｇｇａｃａｇｃｇａｃｇｇｇａｃｃｔａｃｔｔｃｔｔｇｔａｔａｇｃａｇｇｃｔｇａｇｃｇｔｇｇａｃｃｇｇａｇｃａｇｇｔｇｇｃａｇａｇｇｇｇｃａａｃａｃｃｔａｃａｃｔｔｇｃａｇｃｇｔｇａｇｃｃａｃｇａｇｇｃｃｔｔｇｃａｃａｇｃｃａｃｃａｃａｃｔｃａｇａａｇａｇｔｃｔｇａｃｃｃａｇａｇｃｃｃｇｇｇａｔａｇ（配列番号３７）
    を含む、請求項４２に記載のｃＤＮＡ。
  47. 以下の核酸配列：
    ａｔｇｇａａｔｇｇａｇｃｔｇｇｇｔｃｔｔｔｃｔｃｔｔｃｔｔｃｃｔｇｔｃａｇｔａａｃｇａｃｔｇｇｔｇｔｃｃａｃｔｃｃｔｔｃｇｔｇａａｃｃａｇｃａｃｃｔｇｔｇｃｇｇｃｔｃｃｃａｃｃｔｇｇｔｇｇａａｇｃｔｃｔｇｇｃａｃｔｃｇｔｇｔｇｃｇｇｃｇａｇｃｇｇｇｇｃｔｔｃｃａｃｔａｃｇｇｇｇｇｔｇｇｃｇｇａｇｇａｇｇｔｔｃｔｇｇｔｇｇｃｇｇｃｇｇａｇｇｃａｔｃｇｔｇｇａａｃａｇｔｇｃｔｇｃａｃｃｔｃｃａｃｃｔｇｃｔｃｃｃｔｇｇａｃｃａｇｃｔｇｇａａａａｃｔａｃｔｇｃｇｇｔｇｇｃｇｇａｇｇｔｇｇｔｃａａｇｇａｇｇｃｇｇｔｇｇａｃａｇｇｇｔｇｇａｇｇｔｇｇｇｃａｇｇｇａｇｇａｇｇｃｇｇｇｇｇａｇａｃｔｇｃｃｃｃａａａｔｇｔｃｃｔｃｃｇｃｃｔｇａｇａｔｇｃｔｇｇｇｔｇｇｃｃｃｔａｇｃａｔｃｔｔｃａｔｃｔｔｃｃｃｇｃｃｃａａｇｃｃｃａａｇｇａｔａｃｔｃｔｇｔｃｃａｔｔａｇｃａｇｇａｃｃｃｃｃｇａｇｇｔｇａｃｃｔｇｃｃｔｇｇｔｇｇｔｇｇａｃｃｔｇｇｇｇｃｃａｇａｃｇａｃｔｃｔｇａｃｇｔｇｃａｇａｔｃａｃｃｔｇｇｔｔｃｇｔａｇａｃａａｃａｃｃｃａｇｇｔｔｔａｃａｃｔｇｃｃａａｇａｃｃａｇｔｃｃｃａｇｇｇａｇｇａｇｃａｇｔｔｃａｇｃａｇｃａｃａｔａｃａｇｇｇｔｇｇｔｇａｇｃｇｔｔｃｔｇｃｃｃａｔｃｃｔｇｃａｃｃａｇｇａｃｔｇｇｃｔｇａａａｇｇｃａａａｇａｇｔｔｃａａｇｔｇｔａａｇｇｔｇａａｃａｇｃａａｇａｇｃｃｔｇｃｃｃａｇｃｃｃｃａｔｔｇａａａｇｇａｃｃａｔｃａｇｃａａｇｇａｃａａｇｇｇｃｃａｇｃｃｇｃａｃｇａｇｃｃｃｃａａｇｔｃｔａｃｇｔｇｃｔｇｃｃｃｃｃａｇｃａｃａｇｇａａｇａｇｃｔｇａｇｃａｇｇａａｃａａｇｇｔｔａｇｃｇｔｇａｃａｔｇｃｃｔｇａｔｃｇａｇｇｇｔｔｔｃｔａｃｃｃｃａｇｃｇａｃａｔｃｇｃｃｇｔｇｇａｇｔｇｇｇａａａｔｃａｃｃｇｇｃｃａａｃｃｃｇａｇｃｃｃｇａｇａａｃａａｃｔａｃａｇｇａｃｃａｃｔｃｃｇｃｃｇｃａａｃｔｇｇａｃａｇｃｇａｃｇｇｇａｃｃｔａｃｔｔｃｔｔｇｔａｔａｇｃａｇｇｃｔｇａｇｃｇｔｇｇａｃｃｇｇａｇｃａｇｇｔｇｇｃａｇａｇｇｇｇｃａａｃａｃｃｔａｃａｃｔｔｇｃａｇｃｇｔｇａｇｃｃａｃｇａｇｇｃｃｔｔｇｃａｃａｇｃｃａｃｃａｃａｃｔｃａｇａａｇａｇｔｃｔｇａｃｃｃａｇａｇｃｃｃｇｇｇａｔａｇ（配列番号３９）
    を含む、請求項４２に記載のｃＤＮＡ。
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