JP7405486B2 - 超長時間作用型インスリン－ｆｃ融合タンパク質および使用法 - Google Patents

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Description

優先権および関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１２月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／９５０，８０３号、および、２０２０年３月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／９８８，４４１号に関連し、これらの優先権の利益を主張するものである。上記の各特許出願の内容は、その全体が参照によって本明細書に援用される。
本発明の技術は、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の組成物、およびヒトにおける糖尿病を治療するためのその使用に関する。
本発明の技術の背景技術に関する以下の記述は、単に、本発明の技術の理解の一助として提供されるものであり、本発明の技術に対する先行技術の記述や構成を認めるものではない。
糖尿病は、インスリンの欠乏および／またはインスリン使用が効かないことを特徴とする、慢性的な状態である。インスリンが絶対的に欠乏した糖尿病患者は、１型糖尿病またはインスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）患者と分類される。１型糖尿病患者は、膵臓のインスリン産生β細胞の免疫による破壊と結び付いた遺伝的素因を有すると考えられている。それに対して、いくらかのインスリンをまだ生産できるが、インスリン抵抗性または他の機能障害による相対的な欠乏を有する糖尿病患者は、２型糖尿病またはインスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）患者に分類される。２型糖尿病は、遺伝的素因、肥満症、およびある特定の薬物療法に関連している。女性は、いわゆる妊娠糖尿病において、妊娠中も、一次的なインスリン抵抗性を発症する可能性がある。成人の中には、緩やかに進行する型の自己免疫性糖尿病である、成人潜在性自己免疫性糖尿病（ＬＡＤＡ）と診断されるものもいる。１型糖尿病と同様に、ＬＡＤＡでは、膵臓のインスリン産生β細胞が破壊されるが、速度はゆっくりである。若年発症成人型糖尿病（ＭＯＤＹ）と診断される人の割合は小さいが、これは、インスリン産生を阻害する常染色体優性遺伝子の変異によって引き起こされるいくつかの遺伝性真性糖尿病型のいずれかを指す。
１型糖尿病患者、ＬＡＤＡ患者、またはＭＯＤＹ患者の膵臓が十分なインスリンを産生していない場合、その患者は通常、高血糖症を特徴とする非定型の糖血症表現型を示す。これらの場合、患者は慢性的なインスリン注射療法で治療される。２型糖尿病および妊娠糖尿病でも、患者は、膵臓によって産生されているインスリンを適切に利用できないために、高血糖症を示す場合が多い。これらの場合、患者は経口薬で治療することができ、食事と運動は変更する場合と変更しない場合があるが、多くの被験者は最終的には、１型糖尿病に似た状態（β細胞量の著しい減少を伴う膵臓の炎症性疾患）へと進行し、外因性インスリンに依存するようになる。未治療のままであると、糖尿病は、体重減少、食欲不振、嘔吐、脱水、運動機能に関連する問題、昏睡、さらには死亡に繋がる可能性がある。
およそ３０００万人、すなわち合衆国の人口の９．４％が、糖尿病を有している。１型糖尿病は、糖尿病と診断された全ての症例の約５％を占め、およそ１５０万人に発症している。現行の糖尿病治療薬としては、種々の短時間作用型のインスリン製品（例えば、Ｈｕｍａｌｏｇ（登録商標）（イーライリリー社（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、インディアナポリス、インディアナ州）およびＮｏｖｏＬｏｇ（登録商標）（ノボノルディスク社（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）、バウスベア、デンマーク））、並びに、長時間作用型のインスリン製品（例えば、Ｌａｎｔｕｓ（登録商標）（サノフィ社（Ｓａｎｏｆｉ）、パリ、フランス）およびＬｅｖｅｍｉｒ（登録商標）（ノボノルディスク社、バウスベア、デンマーク））が挙げられ、これらは、１日に複数回皮下注射で投与されるか、または装着型皮下注入ポンプによって投与される。頻繁な注射による負担は、治療レジメンのコンプライアンスの不足や投与量の不足に繋がり、長期的な健康アウトカムを悪化する結果となる。実際、米国成人のうち、心血管イベント、切断、ケトアシドーシスにより、毎年７００万人以上の糖尿病に関連した退院が報告されている。さらに、米国成人のうち、低血糖症や高血糖症の危機などにより、毎年１，４００万人以上の糖尿病に関連した救急外来が報告されている。糖尿病と診断されている２０歳以上の米国成人のうち、腎疾患の有病率は３６％以上と推定されている。糖尿病は、米国における主要死因の第７位であり、年間の総費用は２４５０億ドル以上と推定されている。そのため、この疾患に対する費用対効果が高く、負担の少ない治療法の選択肢が求められている。
１つの態様において、本開示は、インスリンポリペプチドと、Ｆｃフラグメントと、を含む融合タンパク質であって、上記インスリンポリペプチドおよび前記Ｆｃフラグメントはリンカーによって接続されており、上記融合タンパク質は以下の配列：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＧＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＳＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号８７）、
を含む、融合タンパク質を提供する。
いくつかの実施形態において、本開示は、インスリンポリペプチドと、Ｆｃフラグメントと、を含む融合タンパク質であって、上記インスリンポリペプチドおよび上記Ｆｃフラグメントはリンカーによって接続されており、上記Ｆｃフラグメントはヒト由来であり、且つ以下の配列：
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＸ１ＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号７７）、
を含み、Ｘ１はＳ、Ｄ、Ａ、またはＲであり、上記インスリンポリペプチドはＣ鎖を介してインスリンＡ鎖アナログに連結されたインスリンＢ鎖アナログからなり、上記インスリンポリペプチドのインスリンＢ鎖アナログのＮ末端から１６番目のアミノ酸（すなわち、Ｂ１６）はアラニンである（すなわち、Ｂ１６Ａ）、融合タンパク質を提供する。
いくつかの実施形態において、上記インスリンポリペプチドは、配列：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＸ１ＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＸ２ＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣ（配列番号９）、
を含み、Ｘ１はＤではなく、Ｘ２はＨではない。いくつかの実施形態において、上記インスリンポリペプチドは、以下の配列：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣ（配列番号１０）、
を含む。
いくつかの構成において、上記リンカーは、配列：
ＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧ（配列番号１３）、
を含む。構成において、上記リンカーは、配列：
ＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＧ（配列番号６７）、
を含む。構成において、上記リンカーは、配列：
ＧＧＧＧＡＧＧＧＧ（配列番号１１）、
を含む。
いくつかの実施形態において、上記融合タンパク質は、以下の配列：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＡＧＧＧＧＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＳＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号８９）、
を含む。
いくつかの実施形態において、上記融合タンパク質は、以下の配列：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＳＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号７８）、
を含む。
いくつかの実施形態において、上記融合タンパク質は、以下の配列：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＤＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号８０）、
を含む。
いくつかの実施形態において、上記融合タンパク質は、以下の配列：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＡＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号８２）、
を含む。
いくつかの実施形態において、上記融合タンパク質は、以下の配列：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＲＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号８４）、
を含む。
いくつかの実施形態において、上記融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ以下の配向で各ドメインを含む：
（Ｎ末端）－インスリンポリペプチド－リンカー－Ｆｃフラグメント－（Ｃ末端）。
いくつかの実施形態において、上記融合タンパク質は、ホモ二量体である。例において、上記融合タンパク質のホモ二量体率は９０％超である。いくつかの例において、上記融合タンパク質は、ＨＥＫ２９３細胞またはＣＨＯ細胞の一方を用いて作製され、プロテインＡビーズまたはプロテインＡカラムを用いた精製後に得られるホモ二量体の力価は１５０ｍｇ／Ｌを超える。実施形態において、上記融合タンパク質のインスリン受容体ＩＣ５０は５０００ｎＭ以下である。いくつかの実施形態において、上記融合タンパク質のインスリン受容体ＩＣ５０は２４００ｎＭ以下である。
いくつかの実施形態において、上記融合タンパク質のヒトＦｃＲｎ受容体ＥＣ５０は１０００ｎｇ／ｍＬ以下である。例において、上記融合タンパク質の、ビオチン化ＦｃγＲＩ濃度が３０００ｎｇ／ｍＬである場合のヒトＦｃγＲＩ受容体アッセイにおけるＯＤ４５０比は０．５０以下である。実施形態において、ビオチン化Ｃ１ｑ濃度が１０００ｎｇ／ｍＬである場合のヒトＣ１ｑアッセイにおけるＯＤ４５０比は０．３５以下である。実施形態において、上記融合タンパク質は医薬組成物として製剤化される。いくつかの例において、上記医薬組成物中の上記融合タンパク質の濃度は約３ｍｇ／ｍＬ以上である。いくつかの実施形態において、上記医薬組成物は、皮下投与に好適である。
実施形態において、患者の血糖値を低下させる方法として、上記融合タンパク質またはその医薬組成物の生理学的有効量が患者に投与され得る。例において、上記患者は糖尿病と診断された患者である。いくつかの実施形態において、上記融合タンパク質は皮下投与される。上記融合タンパク質は、患者に毎日、週２回、または週１回投与されてもよい。いくつかの例において、上記融合タンパク質は、０．０２５～０．５００ｍｇ／ｋｇ／週の投与量で患者に週１回投与される。
実施形態において、上記融合タンパク質を発現するように細胞が改変されてもよい。上記細胞は、上記融合タンパク質をコードする核酸でトランスフェクトされてもよい。いくつかの例において、上記細胞は、ＨＥＫ２９３細胞またはＣＨＯ細胞である。
実施形態において、配列番号８７の上記融合タンパク質をコードする核酸（ｃＤＮＡ）は、以下の核酸配列：
ａｔｇｇａａｔｇｇａｇｃｔｇｇｇｔｃｔｔｔｃｔｃｔｔｃｔｔｃｃｔｇｔｃａｇｔａａｃｇａｃｔｇｇｔｇｔｃｃａｃｔｃｃｔｔｃｇｔｇａａｃｃａｇｃａｃｃｔｇｔｇｃｇｇｃｔｃｃｃａｃｃｔｇｇｔｇｇａａｇｃｔｃｔｇｇｃａｃｔｃｇｔｇｔｇｃｇｇｃｇａｇｃｇｇｇｇｃｔｔｃｃａｃｔａｃｇｇｇｇｇｔｇｇｃｇｇａｇｇａｇｇｔｔｃｔｇｇｔｇｇｃｇｇｃｇｇａｇｇｃａｔｃｇｔｇｇａａｃａｇｔｇｃｔｇｃａｃｃｔｃｃａｃｃｔｇｃｔｃｃｃｔｇｇａｃｃａｇｃｔｇｇａａａａｃｔａｃｔｇｃｇｇｔｇｇｃｇｇａｇｇｔｇｇｔｇｃａｇｇａｇｇｃｇｇｔｇｇａｇｃｃｇｇｔｇｇａｇｇｔｇｇｇｇｃｔｇｇａｇｇａｇｇｃｇｇｇｇｇａｇａｃａａａａｃｔｃａｃａｃａｔｇｃｃｃａｃｃｇｔｇｃｃｃａｇｃａｃｃｔｇａａｃｔｃｃｔｇｇｇｇｇｇａｃｃｇｔｃａｇｔｃｔｔｃｃｔｃｔｔｃｃｃｃｃｃａａａａｃｃｃａａｇｇａｃａｃｃｃｔｃａｔｇａｔｃｔｃｃｃｇｇａｃｃｃｃｔｇａｇｇｔｃａｃａｔｇｃｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇａｃｇｔｇａｇｃｃａｃｇａａｇａｃｃｃｔｇａｇｇｔｃａａｇｔｔｃａａｃｔｇｇｔａｃｇｔｇｇａｃｇｇｃｇｔｇｇａｇｇｔｇｃａｔａａｔｇｃｃａａｇａｃａａａｇｃｃｇｃｇｇｇａｇｇａｇｃａｇｔａｃａｇｃａｇｃａｃｇｔａｃｃｇｔｇｔｇｇｔｃａｇｃｇｔｃｃｔｃａｃｃｇｔｃｃｔｇｃａｃｃａｇｇａｃｔｇｇｃｔｇａａｔｇｇｃａａｇｇａｇｔａｃａａｇｔｇｃａａｇｇｔｃｔｃｃａａｃａａａｇｃｃｃｔｃｃｃａｇｃｃｃｃｃａｔｃｇａｇａａａａｃｃａｔｃｔｃｃａａａｇｃｃａａａｇｇｇｃａｇｃｃｃｃｇａｇａａｃｃａｃａｇｇｔｇｔａｃａｃｃｃｔｇｃｃｃｃｃａｔｃｃｃｇｇｇａｔｇａｇｃｔｇａｃｃａａｇａａｃｃａｇｇｔｃａｇｃｃｔｇａｃｃｔｇｃｃｔｇｇｔｃａａａｇｇｃｔｔｃｔａｔｃｃｃａｇｃｇａｃａｔｃｇｃｃｇｔｇｇａｇｔｇｇｇａｇａｇｃａａｔｇｇｇｃａｇｃｃｇｇａｇａａｃａａｃｔａｃａａｇａｃｃａｃｇｃｃｔｃｃｃｇｔｇｃｔｇｇａｃｔｃｃｇａｃｇｇｃｔｃｃｔｔｃｔｔｃｃｔｃｔａｃａｇｃａａｇｃｔｃａｃｃｇｔｇｇａｃａａｇａｇｃａｇｇｔｇｇｃａｇｃａｇｇｇｇａａｃｇｔｃｔｔｃｔｃａｔｇｃｔｃｃｇｔｇａｔｇｃａｔｇａｇｇｃｔｃｔｇｃａｃａａｃｃａｃｔａｃａｃｇｃａｇａａｇａｇｃｃｔｃｔｃｃｃｔｇｔｃｔｃｃｇｇｇｔｔａｇ（配列番号８８）、
を含む。
実施形態において、配列番号８９の上記融合タンパク質をコードする核酸（ｃＤＮＡ）は、以下の核酸配列：
ａｔｇｇａａｔｇｇａｇｃｔｇｇｇｔｃｔｔｔｃｔｃｔｔｃｔｔｃｃｔｇｔｃａｇｔａａｃｇａｃｔｇｇｔｇｔｃｃａｃｔｃｃｔｔｃｇｔｇａａｃｃａｇｃａｃｃｔｇｔｇｃｇｇｃｔｃｃｃａｃｃｔｇｇｔｇｇａａｇｃｔｃｔｇｇｃａｃｔｃｇｔｇｔｇｃｇｇｃｇａｇｃｇｇｇｇｃｔｔｃｃａｃｔａｃｇｇｇｇｇｔｇｇｃｇｇａｇｇａｇｇｔｔｃｔｇｇｔｇｇｃｇｇｃｇｇａｇｇｃａｔｃｇｔｇｇａａｃａｇｔｇｃｔｇｃａｃｃｔｃｃａｃｃｔｇｃｔｃｃｃｔｇｇａｃｃａｇｃｔｇｇａａａａｃｔａｃｔｇｃｇｇｔｇｇｃｇｇａｇｇｔｇｃｃｇｇａｇｇｃｇｇｇｇｇａｇａｃａａａａｃｔｃａｃａｃａｔｇｃｃｃａｃｃｇｔｇｃｃｃａｇｃａｃｃｔｇａａｃｔｃｃｔｇｇｇｇｇｇａｃｃｇｔｃａｇｔｃｔｔｃｃｔｃｔｔｃｃｃｃｃｃａａａａｃｃｃａａｇｇａｃａｃｃｃｔｃａｔｇａｔｃｔｃｃｃｇｇａｃｃｃｃｔｇａｇｇｔｃａｃａｔｇｃｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇａｃｇｔｇａｇｃｃａｃｇａａｇａｃｃｃｔｇａｇｇｔｃａａｇｔｔｃａａｃｔｇｇｔａｃｇｔｇｇａｃｇｇｃｇｔｇｇａｇｇｔｇｃａｔａａｔｇｃｃａａｇａｃａａａｇｃｃｇｃｇｇｇａｇｇａｇｃａｇｔａｃａｇｃａｇｃａｃｇｔａｃｃｇｔｇｔｇｇｔｃａｇｃｇｔｃｃｔｃａｃｃｇｔｃｃｔｇｃａｃｃａｇｇａｃｔｇｇｃｔｇａａｔｇｇｃａａｇｇａｇｔａｃａａｇｔｇｃａａｇｇｔｃｔｃｃａａｃａａａｇｃｃｃｔｃｃｃａｇｃｃｃｃｃａｔｃｇａｇａａａａｃｃａｔｃｔｃｃａａａｇｃｃａａａｇｇｇｃａｇｃｃｃｃｇａｇａａｃｃａｃａｇｇｔｇｔａｃａｃｃｃｔｇｃｃｃｃｃａｔｃｃｃｇｇｇａｔｇａｇｃｔｇａｃｃａａｇａａｃｃａｇｇｔｃａｇｃｃｔｇａｃｃｔｇｃｃｔｇｇｔｃａａａｇｇｃｔｔｃｔａｔｃｃｃａｇｃｇａｃａｔｃｇｃｃｇｔｇｇａｇｔｇｇｇａｇａｇｃａａｔｇｇｇｃａｇｃｃｇｇａｇａａｃａａｃｔａｃａａｇａｃｃａｃｇｃｃｔｃｃｃｇｔｇｃｔｇｇａｃｔｃｃｇａｃｇｇｃｔｃｃｔｔｃｔｔｃｃｔｃｔａｃａｇｃａａｇｃｔｃａｃｃｇｔｇｇａｃａａｇａｇｃａｇｇｔｇｇｃａｇｃａｇｇｇｇａａｃｇｔｃｔｔｃｔｃａｔｇｃｔｃｃｇｔｇａｔｇｃａｔｇａｇｇｃｔｃｔｇｃａｃａａｃｃａｃｔａｃａｃｇｃａｇａａｇａｇｃｃｔｃｔｃｃｃｔｇｔｃｔｃｃｇｇｇｔｔａｇ（配列番号９０）、
を含む。
実施形態において、配列番号７８の上記融合タンパク質をコードする核酸（ｃＤＮＡ）は、以下の核酸配列：
ａｔｇｇａａｔｇｇａｇｃｔｇｇｇｔｃｔｔｔｃｔｃｔｔｃｔｔｃｃｔｇｔｃａｇｔａａｃｇａｃｔｇｇｔｇｔｃｃａｃｔｃｃｔｔｃｇｔｇａａｃｃａｇｃａｃｃｔｇｔｇｃｇｇｃｔｃｃｃａｃｃｔｇｇｔｇｇａａｇｃｔｃｔｇｇｃａｃｔｃｇｔｇｔｇｃｇｇｃｇａｇｃｇｇｇｇｃｔｔｃｃａｃｔａｃｇｇｇｇｇｔｇｇｃｇｇａｇｇａｇｇｔｔｃｔｇｇｔｇｇｃｇｇｃｇｇａｇｇｃａｔｃｇｔｇｇａａｃａｇｔｇｃｔｇｃａｃｃｔｃｃａｃｃｔｇｃｔｃｃｃｔｇｇａｃｃａｇｃｔｇｇａａａａｃｔａｃｔｇｃｇｇｔｇｇｃｇｇａｇｇｔｇｇｔｃａａｇｇａｇｇｃｇｇｔｇｇａｃａｇｇｇｔｇｇａｇｇｔｇｇｇｃａｇｇｇａｇｇａｇｇｃｇｇｇｇｇａｇａｃａａａａｃｔｃａｃａｃａｔｇｃｃｃａｃｃｇｔｇｃｃｃａｇｃａｃｃｔｇａａｃｔｃｃｔｇｇｇｇｇｇａｃｃｇｔｃａｇｔｃｔｔｃｃｔｃｔｔｃｃｃｃｃｃａａａａｃｃｃａａｇｇａｃａｃｃｃｔｃａｔｇａｔｃｔｃｃｃｇｇａｃｃｃｃｔｇａｇｇｔｃａｃａｔｇｃｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇａｃｇｔｇａｇｃｃａｃｇａａｇａｃｃｃｔｇａｇｇｔｃａａｇｔｔｃａａｃｔｇｇｔａｃｇｔｇｇａｃｇｇｃｇｔｇｇａｇｇｔｇｃａｔａａｔｇｃｃａａｇａｃａａａｇｃｃｇｃｇｇｇａｇｇａｇｃａｇｔａｃａｇｃａｇｃａｃｇｔａｃｃｇｔｇｔｇｇｔｃａｇｃｇｔｃｃｔｃａｃｃｇｔｃｃｔｇｃａｃｃａｇｇａｃｔｇｇｃｔｇａａｔｇｇｃａａｇｇａｇｔａｃａａｇｔｇｃａａｇｇｔｃｔｃｃａａｃａａａｇｃｃｃｔｃｃｃａｇｃｃｃｃｃａｔｃｇａｇａａａａｃｃａｔｃｔｃｃａａａｇｃｃａａａｇｇｇｃａｇｃｃｃｃｇａｇａａｃｃａｃａｇｇｔｇｔａｃａｃｃｃｔｇｃｃｃｃｃａｔｃｃｃｇｇｇａｔｇａｇｃｔｇａｃｃａａｇａａｃｃａｇｇｔｃａｇｃｃｔｇａｃｃｔｇｃｃｔｇｇｔｃａａａｇｇｃｔｔｃｔａｔｃｃｃａｇｃｇａｃａｔｃｇｃｃｇｔｇｇａｇｔｇｇｇａｇａｇｃａａｔｇｇｇｃａｇｃｃｇｇａｇａａｃａａｃｔａｃａａｇａｃｃａｃｇｃｃｔｃｃｃｇｔｇｃｔｇｇａｃｔｃｃｇａｃｇｇｃｔｃｃｔｔｃｔｔｃｃｔｃｔａｃａｇｃａａｇｃｔｃａｃｃｇｔｇｇａｃａａｇａｇｃａｇｇｔｇｇｃａｇｃａｇｇｇｇａａｃｇｔｃｔｔｃｔｃａｔｇｃｔｃｃｇｔｇａｔｇｃａｔｇａｇｇｃｔｃｔｇｃａｃａａｃｃａｃｔａｃａｃｇｃａｇａａｇａｇｃｃｔｃｔｃｃｃｔｇｔｃｔｃｃｇｇｇｔｔａｇ（配列番号７９）、
を含む。
実施形態において、配列番号８０の上記融合タンパク質をコードする核酸（ｃＤＮＡ）は、以下の核酸配列：
ａｔｇｇａａｔｇｇａｇｃｔｇｇｇｔｃｔｔｔｃｔｃｔｔｃｔｔｃｃｔｇｔｃａｇｔａａｃｇａｃｔｇｇｔｇｔｃｃａｃｔｃｃｔｔｃｇｔｇａａｃｃａｇｃａｃｃｔｇｔｇｃｇｇｃｔｃｃｃａｃｃｔｇｇｔｇｇａａｇｃｔｃｔｇｇｃａｃｔｃｇｔｇｔｇｃｇｇｃｇａｇｃｇｇｇｇｃｔｔｃｃａｃｔａｃｇｇｇｇｇｔｇｇｃｇｇａｇｇａｇｇｔｔｃｔｇｇｔｇｇｃｇｇｃｇｇａｇｇｃａｔｃｇｔｇｇａａｃａｇｔｇｃｔｇｃａｃｃｔｃｃａｃｃｔｇｃｔｃｃｃｔｇｇａｃｃａｇｃｔｇｇａａａａｃｔａｃｔｇｃｇｇｔｇｇｃｇｇａｇｇｔｇｇｔｃａａｇｇａｇｇｃｇｇｔｇｇａｃａｇｇｇｔｇｇａｇｇｔｇｇｇｃａｇｇｇａｇｇａｇｇｃｇｇｇｇｇａｇａｃａａａａｃｔｃａｃａｃａｔｇｃｃｃａｃｃｇｔｇｃｃｃａｇｃａｃｃｔｇａａｃｔｃｃｔｇｇｇｇｇｇａｃｃｇｔｃａｇｔｃｔｔｃｃｔｃｔｔｃｃｃｃｃｃａａａａｃｃｃａａｇｇａｃａｃｃｃｔｃａｔｇａｔｃｔｃｃｃｇｇａｃｃｃｃｔｇａｇｇｔｃａｃａｔｇｃｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇａｃｇｔｇａｇｃｃａｃｇａａｇａｃｃｃｔｇａｇｇｔｃａａｇｔｔｃａａｃｔｇｇｔａｃｇｔｇｇａｃｇｇｃｇｔｇｇａｇｇｔｇｃａｔａａｔｇｃｃａａｇａｃａａａｇｃｃｇｃｇｇｇａｇｇａｇｃａｇｔａｃｇａｃａｇｃａｃｇｔａｃｃｇｔｇｔｇｇｔｃａｇｃｇｔｃｃｔｃａｃｃｇｔｃｃｔｇｃａｃｃａｇｇａｃｔｇｇｃｔｇａａｔｇｇｃａａｇｇａｇｔａｃａａｇｔｇｃａａｇｇｔｃｔｃｃａａｃａａａｇｃｃｃｔｃｃｃａｇｃｃｃｃｃａｔｃｇａｇａａａａｃｃａｔｃｔｃｃａａａｇｃｃａａａｇｇｇｃａｇｃｃｃｃｇａｇａａｃｃａｃａｇｇｔｇｔａｃａｃｃｃｔｇｃｃｃｃｃａｔｃｃｃｇｇｇａｔｇａｇｃｔｇａｃｃａａｇａａｃｃａｇｇｔｃａｇｃｃｔｇａｃｃｔｇｃｃｔｇｇｔｃａａａｇｇｃｔｔｃｔａｔｃｃｃａｇｃｇａｃａｔｃｇｃｃｇｔｇｇａｇｔｇｇｇａｇａｇｃａａｔｇｇｇｃａｇｃｃｇｇａｇａａｃａａｃｔａｃａａｇａｃｃａｃｇｃｃｔｃｃｃｇｔｇｃｔｇｇａｃｔｃｃｇａｃｇｇｃｔｃｃｔｔｃｔｔｃｃｔｃｔａｃａｇｃａａｇｃｔｃａｃｃｇｔｇｇａｃａａｇａｇｃａｇｇｔｇｇｃａｇｃａｇｇｇｇａａｃｇｔｃｔｔｃｔｃａｔｇｃｔｃｃｇｔｇａｔｇｃａｔｇａｇｇｃｔｃｔｇｃａｃａａｃｃａｃｔａｃａｃｇｃａｇａａｇａｇｃｃｔｃｔｃｃｃｔｇｔｃｔｃｃｇｇｇｔｔａｇ（配列番号８１）、
を含む。
実施形態において、配列番号８２の上記融合タンパク質をコードする核酸（ｃＤＮＡ）は、以下の核酸配列：
ａｔｇｇａａｔｇｇａｇｃｔｇｇｇｔｃｔｔｔｃｔｃｔｔｃｔｔｃｃｔｇｔｃａｇｔａａｃｇａｃｔｇｇｔｇｔｃｃａｃｔｃｃｔｔｃｇｔｇａａｃｃａｇｃａｃｃｔｇｔｇｃｇｇｃｔｃｃｃａｃｃｔｇｇｔｇｇａａｇｃｔｃｔｇｇｃａｃｔｃｇｔｇｔｇｃｇｇｃｇａｇｃｇｇｇｇｃｔｔｃｃａｃｔａｃｇｇｇｇｇｔｇｇｃｇｇａｇｇａｇｇｔｔｃｔｇｇｔｇｇｃｇｇｃｇｇａｇｇｃａｔｃｇｔｇｇａａｃａｇｔｇｃｔｇｃａｃｃｔｃｃａｃｃｔｇｃｔｃｃｃｔｇｇａｃｃａｇｃｔｇｇａａａａｃｔａｃｔｇｃｇｇｔｇｇｃｇｇａｇｇｔｇｇｔｃａａｇｇａｇｇｃｇｇｔｇｇａｃａｇｇｇｔｇｇａｇｇｔｇｇｇｃａｇｇｇａｇｇａｇｇｃｇｇｇｇｇａｇａｃａａａａｃｔｃａｃａｃａｔｇｃｃｃａｃｃｇｔｇｃｃｃａｇｃａｃｃｔｇａａｃｔｃｃｔｇｇｇｇｇｇａｃｃｇｔｃａｇｔｃｔｔｃｃｔｃｔｔｃｃｃｃｃｃａａａａｃｃｃａａｇｇａｃａｃｃｃｔｃａｔｇａｔｃｔｃｃｃｇｇａｃｃｃｃｔｇａｇｇｔｃａｃａｔｇｃｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇａｃｇｔｇａｇｃｃａｃｇａａｇａｃｃｃｔｇａｇｇｔｃａａｇｔｔｃａａｃｔｇｇｔａｃｇｔｇｇａｃｇｇｃｇｔｇｇａｇｇｔｇｃａｔａａｔｇｃｃａａｇａｃａａａｇｃｃｇｃｇｇｇａｇｇａｇｃａｇｔａｃｇｃｃａｇｃａｃｇｔａｃｃｇｔｇｔｇｇｔｃａｇｃｇｔｃｃｔｃａｃｃｇｔｃｃｔｇｃａｃｃａｇｇａｃｔｇｇｃｔｇａａｔｇｇｃａａｇｇａｇｔａｃａａｇｔｇｃａａｇｇｔｃｔｃｃａａｃａａａｇｃｃｃｔｃｃｃａｇｃｃｃｃｃａｔｃｇａｇａａａａｃｃａｔｃｔｃｃａａａｇｃｃａａａｇｇｇｃａｇｃｃｃｃｇａｇａａｃｃａｃａｇｇｔｇｔａｃａｃｃｃｔｇｃｃｃｃｃａｔｃｃｃｇｇｇａｔｇａｇｃｔｇａｃｃａａｇａａｃｃａｇｇｔｃａｇｃｃｔｇａｃｃｔｇｃｃｔｇｇｔｃａａａｇｇｃｔｔｃｔａｔｃｃｃａｇｃｇａｃａｔｃｇｃｃｇｔｇｇａｇｔｇｇｇａｇａｇｃａａｔｇｇｇｃａｇｃｃｇｇａｇａａｃａａｃｔａｃａａｇａｃｃａｃｇｃｃｔｃｃｃｇｔｇｃｔｇｇａｃｔｃｃｇａｃｇｇｃｔｃｃｔｔｃｔｔｃｃｔｃｔａｃａｇｃａａｇｃｔｃａｃｃｇｔｇｇａｃａａｇａｇｃａｇｇｔｇｇｃａｇｃａｇｇｇｇａａｃｇｔｃｔｔｃｔｃａｔｇｃｔｃｃｇｔｇａｔｇｃａｔｇａｇｇｃｔｃｔｇｃａｃａａｃｃａｃｔａｃａｃｇｃａｇａａｇａｇｃｃｔｃｔｃｃｃｔｇｔｃｔｃｃｇｇｇｔｔａｇ（配列番号８３）、
を含む。
実施形態において、配列番号８４の上記融合タンパク質をコードする核酸（ｃＤＮＡ）は、以下の核酸配列：
ａｔｇｇａａｔｇｇａｇｃｔｇｇｇｔｃｔｔｔｃｔｃｔｔｃｔｔｃｃｔｇｔｃａｇｔａａｃｇａｃｔｇｇｔｇｔｃｃａｃｔｃｃｔｔｃｇｔｇａａｃｃａｇｃａｃｃｔｇｔｇｃｇｇｃｔｃｃｃａｃｃｔｇｇｔｇｇａａｇｃｔｃｔｇｇｃａｃｔｃｇｔｇｔｇｃｇｇｃｇａｇｃｇｇｇｇｃｔｔｃｃａｃｔａｃｇｇｇｇｇｔｇｇｃｇｇａｇｇａｇｇｔｔｃｔｇｇｔｇｇｃｇｇｃｇｇａｇｇｃａｔｃｇｔｇｇａａｃａｇｔｇｃｔｇｃａｃｃｔｃｃａｃｃｔｇｃｔｃｃｃｔｇｇａｃｃａｇｃｔｇｇａａａａｃｔａｃｔｇｃｇｇｔｇｇｃｇｇａｇｇｔｇｇｔｃａａｇｇａｇｇｃｇｇｔｇｇａｃａｇｇｇｔｇｇａｇｇｔｇｇｇｃａｇｇｇａｇｇａｇｇｃｇｇｇｇｇａｇａｃａａａａｃｔｃａｃａｃａｔｇｃｃｃａｃｃｇｔｇｃｃｃａｇｃａｃｃｔｇａａｃｔｃｃｔｇｇｇｇｇｇａｃｃｇｔｃａｇｔｃｔｔｃｃｔｃｔｔｃｃｃｃｃｃａａａａｃｃｃａａｇｇａｃａｃｃｃｔｃａｔｇａｔｃｔｃｃｃｇｇａｃｃｃｃｔｇａｇｇｔｃａｃａｔｇｃｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇａｃｇｔｇａｇｃｃａｃｇａａｇａｃｃｃｔｇａｇｇｔｃａａｇｔｔｃａａｃｔｇｇｔａｃｇｔｇｇａｃｇｇｃｇｔｇｇａｇｇｔｇｃａｔａａｔｇｃｃａａｇａｃａａａｇｃｃｇｃｇｇｇａｇｇａｇｃａｇｔａｃａｇａａｇｃａｃｇｔａｃｃｇｔｇｔｇｇｔｃａｇｃｇｔｃｃｔｃａｃｃｇｔｃｃｔｇｃａｃｃａｇｇａｃｔｇｇｃｔｇａａｔｇｇｃａａｇｇａｇｔａｃａａｇｔｇｃａａｇｇｔｃｔｃｃａａｃａａａｇｃｃｃｔｃｃｃａｇｃｃｃｃｃａｔｃｇａｇａａａａｃｃａｔｃｔｃｃａａａｇｃｃａａａｇｇｇｃａｇｃｃｃｃｇａｇａａｃｃａｃａｇｇｔｇｔａｃａｃｃｃｔｇｃｃｃｃｃａｔｃｃｃｇｇｇａｔｇａｇｃｔｇａｃｃａａｇａａｃｃａｇｇｔｃａｇｃｃｔｇａｃｃｔｇｃｃｔｇｇｔｃａａａｇｇｃｔｔｃｔａｔｃｃｃａｇｃｇａｃａｔｃｇｃｃｇｔｇｇａｇｔｇｇｇａｇａｇｃａａｔｇｇｇｃａｇｃｃｇｇａｇａａｃａａｃｔａｃａａｇａｃｃａｃｇｃｃｔｃｃｃｇｔｇｃｔｇｇａｃｔｃｃｇａｃｇｇｃｔｃｃｔｔｃｔｔｃｃｔｃｔａｃａｇｃａａｇｃｔｃａｃｃｇｔｇｇａｃａａｇａｇｃａｇｇｔｇｇｃａｇｃａｇｇｇｇａａｃｇｔｃｔｔｃｔｃａｔｇｃｔｃｃｇｔｇａｔｇｃａｔｇａｇｇｃｔｃｔｇｃａｃａａｃｃａｃｔａｃａｃｇｃａｇａａｇａｇｃｃｔｃｔｃｃｃｔｇｔｃｔｃｃｇｇｇｔｔａｇ（配列番号８５）、
を含む。
図１は、例示的なインスリン－Ｆｃ融合タンパク質ホモ二量体の模式図を示している。 図２は、Ｎ＝３のイヌに、０．２ｍｇ／ｋｇの配列番号３１（SEQ ID NO:31）のホモ二量体を０日目に静脈内投与した場合の、０日目から３日目までの、平均空腹時血糖値％を示している。 図３は、配列番号３１（SEQ ID NO:31）、配列番号３２（SEQ ID NO:32）、配列番号３３（SEQ ID NO:33）、配列番号３４（SEQ ID NO:34）、および配列番号３５（SEQ ID NO:35）の、並列配列比較を示している。「＊」は、所与の配列位置において全ての配列間で完全に相同であることを示しており、一方、「：」、「．」、空白は、それぞれ、所与の配列位置における配列間のアミノ酸変異が保存的であること、中程度であること、または全く異なるものであること、を示している。 図４は、配列番号３１（SEQ ID NO:31）、配列番号３６（SEQ ID NO:36）、配列番号３７（SEQ ID NO:37）、および配列番号３８（SEQ ID NO:38）の、並列配列比較を示している。「＊」は、所与の配列位置において全ての配列間で完全に相同であることを示しており、一方、「：」、「．」、空白は、それぞれ、所与の配列位置における配列間のアミノ酸変異が保存的であること、中程度であること、または全く異なるものであること、を示している。 図５は、Ｎ＝３のイヌに、０．２ｍｇ／ｋｇの配列番号３６（SEQ ID NO:36）のホモ二量体を０日目に静脈内投与した場合の、０日目から７日目までの、平均空腹時血糖値％を示している。 図６は、Ｎ＝６のイヌに、０．３３ｍｇ／ｋｇの配列番号３６（SEQ ID NO:36）のホモ二量体を０日目に皮下投与した場合の、０日目から７日目までの、平均空腹時血糖値％を示している。 図７は、Ｎ＝３のイヌに、配列番号３６（SEQ ID NO:36）のホモ二量体を０日目（０．３０ｍｇ／ｋｇ）、２８日目（０．３３ｍｇ／ｋｇ）、３５日目（０．３３ｍｇ／ｋｇ）、４２日目（０．５０ｍｇ／ｋｇ）、４９日目（１．００ｍｇ／ｋｇ）、および５６日目（１．００ｍｇ／ｋｇ）に皮下投与した場合の、平均抗薬物抗体価（μｇ／ｍＬ）を示している。 図８は、配列番号３９（SEQ ID NO:39）、配列番号４０（SEQ ID NO:40）、配列番号４１（SEQ ID NO:41）、および配列番号４２（SEQ ID NO:42）の、並列配列比較を示している。「＊」は、所与の配列位置において全ての配列間で完全に相同であることを示しており、一方、「：」、「．」、空白は、それぞれ、所与の配列位置における配列間のアミノ酸変異が保存的であること、中程度であること、または全く異なるものであること、を示している。 図９は、Ｎ＝１のイヌに、配列番号４２（SEQ ID NO:42）のホモ二量体を０日目（０．３３ｍｇ／ｋｇ）、７日目（０．５０ｍｇ／ｋｇ）、１４日目（０．５０ｍｇ／ｋｇ）、および２１日目（０．５０ｍｇ／ｋｇ）に皮下投与した場合の、平均抗薬物抗体価（μｇ／ｍＬ）を示している。 図１０は、Ｎ＝１のイヌに、配列番号４３（SEQ ID NO:43）のホモ二量体を０日目（０．３３ｍｇ／ｋｇ）および１４日目（０．１６ｍｇ／ｋｇ）に皮下投与した場合の、平均抗薬物抗体価（μｇ／ｍＬ）を示している。 図１１は、Ｎ＝２のイヌに、０．３３ｍｇ／ｋｇの配列番号４３（SEQ ID NO:43）のホモ二量体を０日目に皮下投与した場合の、０日目から７日目までの、平均空腹時血糖値％を示している。 図１２は、配列番号４３（SEQ ID NO:43）、配列番号４４（SEQ ID NO:44）、配列番号４５（SEQ ID NO:45）、配列番号４６（SEQ ID NO:46）、配列番号４７（SEQ ID NO:47）、および配列番号４８（SEQ ID NO:48）の、並列配列比較を示している。「＊」は、所与の配列位置において全ての配列間で完全に相同であることを示しており、一方、「：」、「．」、空白は、それぞれ、所与の配列位置における配列間のアミノ酸変異が保存的であること、中程度であること、または全く異なるものであること、を示している。 図１３は、配列番号４３（SEQ ID NO:43）、配列番号４９（SEQ ID NO:49）、配列番号５０（SEQ ID NO:50）、配列番号５１（SEQ ID NO:51）、および配列番号５２（SEQ ID NO:52）の、並列配列比較を示している。「＊」は、所与の配列位置において全ての配列間で完全に相同であることを示しており、一方、「：」、「．」、空白は、それぞれ、所与の配列位置における配列間のアミノ酸変異が保存的であること、中程度であること、または全く異なるものであること、を示している。 図１４は、配列番号４３（SEQ ID NO:43）、配列番号４８（SEQ ID NO:48）、および配列番号５３（SEQ ID NO:53）の、並列配列比較を示している。「＊」は、所与の配列位置において全ての配列間で完全に相同であることを示しており、一方、「：」、「．」、空白は、それぞれ、所与の配列位置における配列間のアミノ酸変異が保存的であること、中程度であること、または全く異なるものであること、を示している。 図１５は、配列番号４３（SEQ ID NO:43）、配列番号５１（SEQ ID NO:51）、配列番号５２（SEQ ID NO:52）、および配列番号５４（SEQ ID NO:54）の、並列配列比較を示している。「＊」は、所与の配列位置において全ての配列間で完全に相同であることを示しており、一方、「：」、「．」、空白は、それぞれ、所与の配列位置における配列間のアミノ酸変異が保存的であること、中程度であること、または全く異なるものであること、を示している。 図１６は、配列番号２６（SEQ ID NO:26）、配列番号２８（SEQ ID NO:28）、配列番号４３（SEQ ID NO:43）、配列番号５５（SEQ ID NO:55）、配列番号５６（SEQ ID NO:56）、および配列番号５７（SEQ ID NO:57）の、並列配列比較を示している。「＊」は、所与の配列位置において全ての配列間で完全に相同であることを示しており、一方、「：」、「．」、空白は、それぞれ、所与の配列位置における配列間のアミノ酸変異が保存的であること、中程度であること、または全く異なるものであること、を示している。 図１７は、Ｎ＝１のイヌに、０．１６ｍｇ／ｋｇの配列番号２８（SEQ ID NO:28）のホモ二量体を０日目に皮下投与した場合の、０日目から７日目までの、空腹時血糖値％を示している。 図１８は、Ｎ＝１のイヌに、配列番号２８（SEQ ID NO:28）のホモ二量体を０日目（０．１６ｍｇ／ｋｇ）、１４日目（０．１６ｍｇ／ｋｇ）、２８日目（０．１６ｍｇ／ｋｇ）、および４２日目（０．１６ｍｇ／ｋｇ）に皮下投与した場合の、抗薬物抗体価（μｇ／ｍＬ）を示している。 図１９は、Ｎ＝１のイヌに、０．３３ｍｇ／ｋｇの配列番号２６（SEQ ID NO:26）のホモ二量体を０日目に皮下投与した場合の、０日目から７日目までの、空腹時血糖値％を示している。 図２０は、Ｎ＝１のイヌに、配列番号２６（SEQ ID NO:26）のホモ二量体を０日目（０．３３ｍｇ／ｋｇ）、１５日目（０．１６ｍｇ／ｋｇ）、３１日目（０．１６ｍｇ／ｋｇ）、および４５日目（０．１５ｍｇ／ｋｇ）に皮下投与した場合の、０日目から６０日目までの、空腹時血糖値％を示している。 図２１は、Ｎ＝１のイヌに、配列番号２６（SEQ ID NO:26）のホモ二量体を０日目（０．３３ｍｇ／ｋｇ）、１５日目（０．１６ｍｇ／ｋｇ）、３１日目（０．１６ｍｇ／ｋｇ）、および４５日目（０．１５ｍｇ／ｋｇ）に皮下投与した場合の、抗薬物抗体価（μｇ／ｍＬ）を示している。 図２２は、Ｎ＝１のイヌに、０．１６ｍｇ／ｋｇの配列番号５８（SEQ ID NO:58）のホモ二量体を０日目に皮下投与した場合の、０日目から７日目までの、空腹時血糖値％を示している。 図２３は、Ｎ＝１のイヌに、０．１６ｍｇ／ｋｇの配列番号５９（SEQ ID NO:59）のホモ二量体を０日目に皮下投与した場合の、０日目から７日目までの、空腹時血糖値％を示している。 図２４は、配列番号６１（SEQ ID NO:61）および配列番号６２（SEQ ID NO:62）の、並列配列比較を示している。「＊」は、所与の配列位置において全ての配列間で完全に相同であることを示しており、一方、「：」、「．」、空白は、それぞれ、所与の配列位置における配列間のアミノ酸変異が保存的であること、中程度であること、または全く異なるものであること、を示している。 図２５は、Ｎ＝１のイヌに、０．１６ｍｇ／ｋｇの配列番号６１（SEQ ID NO:61）のホモ二量体を０日目に皮下投与した場合の、０日目から７日目までの、空腹時血糖値％、および、Ｎ＝１のイヌに、０．１６ｍｇ／ｋｇの配列番号６２（SEQ ID NO:62）のホモ二量体を０日目に皮下投与した場合の、０日目から７日目までの、空腹時血糖値％を示している。 図２６は、Ｎ＝１のイヌに配列番号３０（SEQ ID NO:30）のホモ二量体を皮下投与した場合の０日目から７日目までの空腹時血糖値％を、当該イヌが餌を与えられた時間と共に、示している。 図２７は、配列番号７６（SEQ ID NO:76）、配列番号９１（SEQ ID NO:91）、および配列番号７８（SEQ ID NO:78）の、並列配列比較を示している。「＊」は、所与の配列位置において全ての配列間で完全に相同であることを示しており、一方、「：」、「．」、空白は、それぞれ、所与の配列位置における配列間のアミノ酸変異が保存的であること、中程度であること、または全く異なるものであること、を示している。 図２８は、配列番号７５（SEQ ID NO:75）、配列番号７６（SEQ ID NO:76）、配列番号９１（SEQ ID NO:91）、配列番号９２（SEQ ID NO:92）、配列番号９３（SEQ ID NO:93）、配列番号９４（SEQ ID NO:94）、および配列番号９５（SEQ ID NO:95）の、並列配列比較を示している。「＊」は、所与の配列位置において全ての配列間で完全に相同であることを示しており、一方、「：」、「．」、空白は、それぞれ、所与の配列位置における配列間のアミノ酸変異が保存的であること、中程度であること、または全く異なるものであること、を示している。 図２９は、配列番号７６（SEQ ID NO:76）、配列番号７８（SEQ ID NO:78）、配列番号８０（SEQ ID NO:80）、配列番号８２（SEQ ID NO:82）、配列番号８４（SEQ ID NO:84）、および配列番号８６（SEQ ID NO:86）の、並列配列比較を示している。「＊」は、所与の配列位置において全ての配列間で完全に相同であることを示しており、一方、「：」、「．」、空白は、それぞれ、所与の配列位置における配列間のアミノ酸変異が保存的であること、中程度であること、または全く異なるものであること、を示している。 図３０は、配列番号８７（SEQ ID NO:87）、配列番号９６（SEQ ID NO:96）、配列番号７８（SEQ ID NO:78）、配列番号９７（SEQ ID NO:97）、配列番号８９（SEQ ID NO:89）、および配列番号９８（SEQ ID NO:98）の、並列配列比較を示している。「＊」は、所与の配列位置において全ての配列間で完全に相同であることを示しており、一方、「：」、「．」、空白は、それぞれ、所与の配列位置における配列間のアミノ酸変異が保存的であること、中程度であること、または全く異なるものであること、を示している。 図３１は、融合タンパク質のリーダー配列を含む完全なアミノ酸配列（配列番号７８（SEQ ID NO:78））と、その対応する核酸配列（配列番号７９（SEQ ID NO:79））を示している。 図３２は、融合タンパク質のリーダー配列を含む完全なアミノ酸配列（配列番号８０（SEQ ID NO:80））と、その対応する核酸配列（配列番号８１（SEQ ID NO:81））を示している。 図３３は、融合タンパク質のリーダー配列を含む完全なアミノ酸配列（配列番号８２（SEQ ID NO:82））と、その対応する核酸配列（配列番号８３（SEQ ID NO:83））を示している。 図３４は、融合タンパク質のリーダー配列を含む完全なアミノ酸配列（配列番号８４（SEQ ID NO:84））と、その対応する核酸配列（配列番号８５（SEQ ID NO:85））を示している。 図３５は、融合タンパク質のリーダー配列を含む完全なアミノ酸配列（配列番号８７（SEQ ID NO:87））と、その対応する核酸配列（配列番号８８（SEQ ID NO:88））を示している。 図３６は、融合タンパク質のリーダー配列を含む完全なアミノ酸配列（配列番号８９（SEQ ID NO:89））と、その対応する核酸配列（配列番号９０（SEQ ID NO:90））を示している。 図３７は、融合タンパク質のリーダー配列を含む完全なアミノ酸配列（配列番号８６（SEQ ID NO:86））と、その対応する核酸配列（配列番号１００（SEQ ID NO:100））を示している。 図３８は、Ｎ＝１２のＢａｌｂ／ｃマウスを、１時間絶食させた後、配列番号８７（SEQ ID NO:87）のホモ二量体または配列番号８９（SEQ ID NO:89）のホモ二量体を、３００μｇ／ｋｇの投与量で皮下注射した場合の、０時間目から１０時間目までの平均空腹時血糖値％を示している。
インスリン治療は、必要な投与回数が少ないほど（例えば、週１回の注射）、患者にとっての負担が少なくなり、コンプライアンスの改善、グルコースコントロールの改善、そして最終的には長期健康アウトカムの改善に繋がる。本明細書に開示されるように、ヒト臨床用に提唱された超長時間作用型インスリン治療は、インビボでの作用を延長するためにヒトＦｃフラグメントを利用するインスリン－Ｆｃ融合タンパク質を含んでいる。糖尿病の超長時間作用型治療に適したインスリン－Ｆｃ融合タンパク質は、様々な設計目標を満たす必要がある。糖尿病の超長期作用型治療に適したインスリン－Ｆｃ融合タンパク質は、哺乳類細胞、例えばヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ、例えばＨＥＫ２９３）細胞で、所望のホモ二量体生成物が許容できる力価（例えば、一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ細胞から５０ｍｇ／Ｌを超えるホモ二量体力価、ＨＥＫ細胞から一過性にトランスフェクトされた７５ｍｇ／Ｌを超えるホモ二量体力価、一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ細胞から１００ｍｇ／Ｌを超えるホモ二量体力価、一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ細胞から１５０ｍｇ／Ｌを超えるホモ二量体力価など）を有して、製造可能であることが望ましい。ホモ二量体力価が１５０ｍｇ／Ｌを超えるヒトインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成のみを、本発明では有用と見なしているが、これは、一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ細胞におけるこのレベル未満のホモ二量体力価では、比較的コモディティ化したヒトインスリン市場の低製造コスト要件を満たす安定にトランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞における商業生産ホモ二量体力価が得られにくいことが、経験的に分かっているからである。
さらに、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質は、４℃でのＩＭ－９ ＩＲ結合アッセイで測定した場合に、かなりの親和性（例えば、５０００ｎＭ未満のＩＣ５０、４０００ｎＭ未満のＩＣ５０、３０００ｎＭ未満のＩＣ５０、２４００ｎＭ未満のＩＣ５０、より好ましくは２０００ｎＭ未満ＩＣ５０など）でＩＲと結合する必要がある。経験に基づいて、ＩＲ活性ＩＣ５０値が５０００ｎＭ未満の分子のみを、必要な生物活性を示す可能性があるものと見なしている。好ましい実施形態において、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質は、２４００ｎＭ未満のＩＲ活性ＩＣ５０値、より好ましくは２０００ｎＭ未満のＩＲ活性ＩＣ５０値を示す。インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成はまた、投与頻度を少なくすることを妥当なものとするために、インビボで持続的な生物活性（例えば、約２時間超、約６時間超、約９時間超、約１２時間超、約１８時間超、約１日超、約１．５日超、約２日超、約２．５日超、約３日超、約４日超、約５日超、約６日超、約７日超、またはそれ以上のグルコース低減活性を示す）を示す必要もある。インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成はまた、インビボにおける系滞留時間の延長（例えば、血清半減期は３日超、またはそれ以上でなければならない）も示す必要がある。所与のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の持続的な生物活性および滞留時間の延長は、抗体およびＦｃ融合タンパク質のインビボ排出半減期の延長に関与する、ＦｃＲｎ受容体との結合能によって予測することができる。ＦｃＲｎ受容体活性は、典型的には、マイクロプレートリーダーで測定されるＯＤ４５０ｎｍの値を用いたアッセイ（例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）アッセイ）で測定される、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質にその最大結合の半分に到達させるインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の濃度（すなわち、ＥＣ５０値）によって評価される。経験に基づいて、１５００ｎｇ／ｍＬ以下（より好ましくは１０００ｎｇ／ｍＬ未満）のヒトＦｃＲｎ受容体ＥＣ５０値を示すインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成は、週１回の投与を妥当なものとするのに十分に長い半減期を示す可能性が最も高い。
最後に、糖尿病などの慢性疾患の治療に有用であるためには、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成は、抗薬物抗体、特に反復投与後の上記分子の生物活性を中和する抗体の産生を誘導するものであってはならない。所与のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成が有害な免疫原性反応を誘発する傾向は、まず、オプソニン化された分子のファゴサイトーシス、炎症メディエーターの放出、抗体依存性細胞傷害を含む多くの免疫系エフェクター機能で重要な役割を担っている、ＦｃγＲＩ受容体と結合する能力によって予測することができる。ＦｃγＲＩ受容体活性は、通常、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質を所与の濃度とした酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）アッセイにおいて、マイクロプレートリーダーで得られる４５０ｎｍの波長における吸光度（ＯＤ４５０）の値によって評価される。経験に基づいて、ビオチン化ＦｃγＲＩ濃度を３０００ｎｇ／ｍＬとしたヒトＦｃγＲＩ受容体アッセイにおけるＯＤ４５０比（ここで、比のための参照インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成は配列番号７６）が０．５０以下を示すインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成は、週１回の反復投与を妥当なものとするのに十分に低い免疫原性を示す可能性がある。有害な免疫原性反応を誘導する所与のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成の傾向は、結合した分子を貪食細胞に除去させる補体カスケードを活性化し、炎症によりさらなる食細胞を引き付け、細胞殺害膜攻撃複合体を活性化する、補体成分１ｑ（Ｃ１ｑ）との結合能によっても予測することができる。Ｃ１ｑ活性は、通常、マイクロプレート上にコートされるインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成を所与の濃度とした酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）アッセイにおいて、マイクロプレートリーダーで得られるＯＤ４５０値によって評価される。経験に基づいて、ビオチン化Ｃ１ｑ濃度を１０００ｎｇ／ｍＬとしたヒトＣ１ｑ受容体アッセイにおけるＯＤ４５０比（ここで、比のための参照インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成は配列番号７６）が０．３５以下を示すインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成は、週１回の反復投与を妥当なものとするのに十分に低い免疫原性を示す可能性がある。
ヒト臨床用に提唱された超長時間作用型インスリン治療は、インビボでの作用を延長するためにヒトＦｃフラグメントを利用するインスリン－Ｆｃ融合タンパク質を含んでいる。様々な設計のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成の挙動を理解するために、まず、イヌ用の超長時間作用型インスリンとして有用なインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成を検討した。ヒトＦｃフラグメントは、イヌにおいては免疫原性であることで、抗薬物抗体の産生を誘導できると予想されるため、ヒトＦｃフラグメントをイヌＦｃフラグメントに置き換えた。
しかし、予想外にも、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成でヒトＦｃフラグメントと任意のイヌＦｃフラグメントとを単純に交換しても、許容できるホモ二量体力価（例えば、５０ｍｇ／Ｌを超えるホモ二量体力価）や、十分に高いＮＡＯＣ値（例えば、１５０％ＦＢＧＬ・日・ｋｇ／ｍｇを超えるＮＡＯＣ）を有する生成物を、必ずしも得られないことが分かった。例えば、場合によっては、Ｆｃフラグメントが特定のアイソタイプ（例えば、イヌＩｇＧＢ）である場合のみ、設計目標を満たすのに十分に高いホモ二量体力価（例えば、５０ｍｇ／Ｌを超えるイヌインスリン－Ｆｃ融合タンパク質のホモ二量体力価）および許容できる高いＮＡＯＣ値（例えば、１５０％ＦＢＧＬ・日・ｋｇ／ｍｇを超えるＮＡＯＣ）を有するインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成が得られた。他の場合では、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成のインスリンポリペプチドの特定のアミノ酸が、標的種において免疫原性であることにより部位特異的変異を必要とすることが分かり、許容できるほど高いＮＡＯＣ値（例えば、１５０％ＦＢＧＬ・日・ｋｇ／ｍｇを超えるＮＡＯＣ値）および０．５０を超える３回目の週１回皮下投与後のＮＡＯＣＲ値を有し、標的種において非免疫原性であり且つ生物活性を示す、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成は比較的少数であることが分かった。
さらなる場合で、Ｆｃフラグメントを、グリコシル化を防止するために変異させ、それによってインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成の免疫原性をさらに低減させた場合、予想外にも、Ｆｃフラグメントの特定のアミノ酸変異のみが、所望のホモ二量体力価（例えば、５０ｍｇ／Ｌを超えるイヌインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成のホモ二量体力価）およびＮＡＯＣ値（例えば、１５０％ＦＢＧＬ・日・ｋｇ／ｍｇを超えるＮＡＯＣ値）をもたらすことが見出された。さらに、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成のインスリン成分を追加で変異させることが、所望のホモ二量体力価（例えば、５０ｍｇ／Ｌを超えるイヌインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成のホモ二量体力価）およびＮＡＯＣ値（例えば、１５０％ＦＢＧＬ・日・ｋｇ／ｍｇを超えるＮＡＯＣ値）を有しながら、０．５０を超える３回目の週１回皮下投与後のＮＡＯＣＲ値も達成する、Ｆｃ変異型非グリコシル化インスリンＦｃ融合タンパク質の構成を製造するために必要であることが見出された。
ヒト超長時間作用型インスリンにおいては、ホモ二量体力価を最大化し製造コストを削減するため、ヒトＩｇＧ分子の異なるアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１とＩｇＧ２）をベースとするＦｃフラグメントを含むインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成が製造された。かなり予想外なことであるが、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成において、ＩｇＧ２分子ベースのＦｃフラグメントからＩｇＧ１分子ベースのＦｃフラグメントに切り替えると、ＩＲ結合活性またはＦｃＲｎ結合活性を著しく損なうことなく、平均ホモ二量体力価が５０％以上増加することが、見出された。しかし、得られたＩｇＧ１由来インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成は、ビオチン化ＦｃγＲＩ濃度を３０００ｎｇ／ｍＬとしたヒトＦｃγＲＩ受容体アッセイにおけるＯＤ４５０比（ここで、比のための参照インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成は配列番号７６）が０．５０よりもかなり大きく、ビオチン化Ｃ１ｑ濃度を１０００ｎｇ／ｍＬとしたヒトＣ１ｑ受容体アッセイにおけるＯＤ４５０比（ここで、比のための参照インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成は配列番号７６）が０．３５よりもかなり大きかったことから、免疫系と不利益に相互作用し中和抗体を発生する可能性がかなり高いと判断された。
望ましくない免疫原性を低減する試みとして、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成に、宿主細胞内での合成時にＦｃフラグメントのグリコシル化を妨げるための変異を導入した。具体的には、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質ホモ二量体の収量改善を維持しながら、ＦｃγＲＩ相互作用とＣ１ｑ相互作用を低減するために、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域の重鎖のＣＨ２ドメインに保存されているアスパラギン（Ｎ）－グリコシル化部位を異なるアミノ酸（例えば、Ｓ、Ｄ、Ａ、Ｒ、およびＱ）に変異させた。興味深いことに、Ｓ、Ｄ、Ａ、およびＲ変異型の非グリコシル化インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成は、グリコシル化された親構成と比較してホモ二量体力価が改善された。しかし、保存アスパラギン（Ｎ）－グリコシル化部位にＱ変異を有するインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成のホモ二量体力価は、低過ぎて（すなわち、ヒトインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成の設計目標である１５０ｍｇ／Ｌ未満）、低製造コスト要件を支持することができなかった。さらに、ＦｃγＲＩ結合およびＣ１ｑ結合は、Ｓ、Ｄ、Ａ、およびＲ変異型の非グリコシル化インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成おいて顕著に低減した。しかし、これらのインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成では、収量および免疫原性の改善が、グリコシル化した親構成と比較して、予想外に低いＦｃＲｎ結合親和性と著しく低いＩＲ結合によって相殺され、インビボでの生物活性と滞留時間において許容できない低減が示された。
イヌ由来Ｆｃフラグメントを含むインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成で予想外に発見されたことのように、ヒトインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成におけるインスリン配列の１つのアミノ酸を変更することで、Ｓ、Ｄ、Ａ、およびＲ変異型の非グリコシル化インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成の収量および免疫原性の改善を維持または改善しつつ、ＩＲ結合親和性およびＦｃＲｎ結合親和性を、元のグリコシル化した親構成と比較して減少させるのではなく、増加させる（例えば、ＩＲアッセイにおけるＩＣ５０値が低くなった）ことが見出された。このことから、得られたグリコシル化されていない変異型インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成は、許容できるインビボグルコース低減能と滞留時間の延長を示すと予想される。予想外なことに、非グリコシル化インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成の同じアミノ酸を、保存されたアスパラギン（Ｎ）－グリコシル化部位のＱ変異で変更したところ、既に不十分であったホモ二量体力価が著しく減少する結果となった。
Ｓ、Ｄ、Ａ、およびＲ変異型の非グリコシル化インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の特性をさらに操作できる方法を理解するため、インスリンポリペプチドとＦｃフラグメントを繋ぐ、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成のリンカー領域に改変を加えた。試験の結果、リンカーがない場合、得られたイヌインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成のホモ二量体力価は許容できないほどに低い（すなわち、５０ｍｇ／Ｌ未満）ことが示された。同じ長さのリンカーを含むインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成の場合、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成のホモ二量体力価、ＩＲ受容体結合およびＦｃＲｎ受容体結合、並びにＦｃγＲＩ結合およびＣ１ｑ結合の観点から、特定のアミノ酸配列が他のものより好ましいことが見出された。
そこで、本明細書では、変異型インスリンポリペプチドと、非グリコシル化Ｆｃフラグメントと、変異型インスリンポリペプチドと非グリコシル化Ｆｃフラグメントとの間のリンカーと、を含み、許容できる高いホモ二量体力価（例えば、１５０ｍｇ／Ｌを超えるホモ二量体力価）、ＩＲアッセイにおけるＩＣ５０値（例えば、５０００ｎＭ未満、２４００ｎＭ未満、より好ましくは２０００ｎＭ未満のＩＣ５０）、ヒトＦｃＲｎ受容体のＥＣ５０値（例えば、１５００ｎｇ／Ｌ以下、より好ましくは１０００ｎｇ／ｍＬ未満のＥＣ５０）、ヒトＦｃγＲＩ受容体のＯＤ４５０比（例えば、ビオチン化ＦｃγＲＩ受容体濃度３０００ｎｇ／ｍＬにおけるＯＤ４５０比が０．５０以下。ここで、比のための参照インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成は配列番号７６）、および、ヒトＣ１ｑ受容体のＯＤ４５０比（例えば、ビオチン化Ｃ１ｑ濃度１０００ｎｇ／ｍＬにおけるＯＤ４５０比が０．３５以下。ここで、比のための参照インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成は配列番号７６）の各設計目標を達成する、特定の、製造性の高い、高純度の、長時間作用性の、生物活性を示す、非免疫原性のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成が、提供される。これらの例示的なインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成は、週１回反復投与を妥当なものとし、糖尿病の治療に好適なものとする、十分に低い免疫原性 十分に長い半減期を示すことが期待される。
定義
本明細書で使用される場合、冠詞「ａ」および「ａｎ」は、その冠詞の文法上の目的語が１つであること、または２つ以上であることを指し、例えば、少なくとも１つであることを指す。本明細書において「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語と共に使用された場合での、「ａ」または「ａｎ」という語の使用は、「１つ」を意味する場合もあるが、「１つまたは複数」、「少なくとも１つ」、および「１つまたは２つ以上」という意味とも合致する。
本明細書で使用される場合、「約」および「およそ」は、通常、測定の性質または精度を考慮に入れた、測定量に対する許容可能な誤差の程度を意味する。例示的な誤差の程度としては、所与の値の範囲の、２０パーセント（％）以内、典型的には１０％以内、さらに典型的には５％以内である。
本明細書で使用される場合、障害（例えば、本明細書に記載の障害）を治療するのに有効な分子、化合物、複合体、または物質の量、「治療有効量」または「有効量」とは、対象に単回または複数回投与を行う際、対象の治療において、または障害（例えば、本明細書に記載の障害）を有する対象の治癒、緩和、軽減、もしくは改善において、そのような治療を行わない場合に予想されるよりも有効である、当該分子、化合物、複合体、または物質の量を指す。
本明細書で使用される場合、用語「アナログ」とは、別の化合物または複合体の化学構造と類似しているが、少なくとも１つの側面においてそれとは異なっている、化学構造を有する化合物または複合体（例えば、本明細書に記載の化合物または複合体、例えば、インスリン）を指す。
本明細書で使用される場合、用語「抗体」または「抗体分子」とは、免疫グロブリン分子（Ｉｇ）、免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の免疫学的活性を有する部分、すなわち、抗原と特異的に結合する、例えば免疫反応する、抗原結合部位を含む分子、を指す。本明細書で使用される場合、用語「抗体ドメイン」とは、免疫グロブリンの可変領域または定常領域を指す。本明細書で使用される場合、用語「抗体ドメイン」とは、免疫グロブリンの可変領域または定常領域を指す。当該技術分野では、抗体は、哺乳類（例えば、ヒト）の場合はＩｇＡ、ＩｇＭ、またはＩｇＧなどのいくつかのクラスを含むと記述されている。免疫グロブリンの各クラスは、さらに、イヌの場合はＩｇＧＡ、ＩｇＧＢ、ＩｇＧＣ、およびＩｇＧＤ、ヒトの場合はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４のように、種々のアイソタイプに分類できる。与の免疫グロブリンクラスの各免疫グロブリンアイソタイプが、互いに異なるアミノ酸配列、構造、および機能特性を含む（例えば、Ｆｃγ受容体に対する異なる結合親和性）ことは、当業者が認めるところである。「特異的に結合する」または「免疫反応する」は、抗体が、所望の抗原の１または複数の抗原決定基と反応し、他のポリペプチドに対してはより低い親和性を示す、例えば、他のポリペプチドとは反応しない、ことを意味する。
本明細書で使用される場合、用語「曲線下面積」または「ＡＵＣ」とは、所与の投与量のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質を投与した後の対象における、時間に対する％ＦＢＧＬ（空腹時血糖値）の曲線の下側の積分面積を指す。本明細書で使用される場合、用語「曲線上面積」または「ＡＯＣ」は、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の生物学的効力の尺度として用いられ、ＡＯＣは、時間に対する％ＦＢＧＬの曲線の下側の可能な総面積とＡＵＣ値との間の差に等しい。本明細書で使用される場合、「正規化曲線上面積」、「正規化ＡＯＣ」、または「ＮＡＯＣ」は、ＡＯＣ値を、投与されたインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の実際の投与量で割ったものである。本明細書で使用される場合、用語「正規化ＡＯＣ比」または「ＮＡＯＣＲ」は、一連の投与における、最初のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質投与から得られたＮＡＯＣに対する、特定のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質投与から得られたＮＡＯＣの比である。そのため、ＮＡＯＣＲは、反復投与後のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の生物活性における変化の尺度となる。
本明細書で使用される場合、用語「生物活性」、「活性」、「生物活性」、「効力」、「生物活性効力」、または「生物学的効力」とは、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質が、ＩＲを活性化し、且つ／または、標的対象において血糖値の低減を及ぼす、程度を指す。本明細書で使用される場合、「インビトロ活性」または「ＩＲ活性」とは、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質がＩＲに結合する際の親和性を指し、典型的には、競合的結合アッセイにおいてインスリン－Ｆｃ融合タンパク質がインスリン参照標準の半分をＩＲから押しのける濃度（すなわち、ＩＣ５０）によって評価される。本明細書で使用される場合、「インビボ活性」とは、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質投与後の標的対象の空腹時血糖値における低減の程度および持続時間を指す。
本明細書で使用される場合、用語「生合成」、「組換え合成」、または「組換え製造」は、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸分子（例えば、ベクター）（例えば、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質全体が単一の核酸分子によってコードされる場合）で細胞をトランスフェクトすることによって、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質を宿主細胞内で発現させるプロセスを指す。例示的な宿主細胞としては、哺乳類細胞、例えば、ＨＥＫ２９３細胞またはＣＨＯ細胞が挙げられる。細胞は、当技術分野において標準的な方法を用いて培養することができ、発現されたインスリン－Ｆｃ融合タンパク質は、当技術分野において標準的な方法を用いて細胞培養物から採取および精製してもよい。
本明細書で使用される場合、「細胞表面受容体」という用語は、一般に細胞の膜の外表面に存在し、可溶性分子、例えば血液供給中を循環する分子と相互作用する、タンパク質などの分子を指す。いくつかの実施形態において、細胞表面受容体は、ホルモン受容体（例えば、インスリンホルモン受容体またはインスリン受容体（ＩＲ））、または抗体のＦｃフラグメントもしくはＦｃ領域に結合するＦｃ受容体（例えば、Ｆｃγ受容体、例えばＦｃγＲＩ、または胎児性Ｆｃ受容体、例えばＦｃＲｎ）を含む場合がある。本明細書で使用される場合、「インビトロ活性」または「Ｆｃγ受容体活性」または「Ｆｃγ受容体結合」または「ＦｃＲｎ受容体活性」または「ＦｃＲｎ結合」は、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質がＦｃ受容体（例えば、Ｆｃγ受容体またはＦｃＲｎ受容体）に結合する親和性を指し、典型的には、マイクロプレートリーダーで測定されるＯＤ４５０ｎｍ値を用いたアッセイ（例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）アッセイ）で測定される、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質にその最大結合の半分に到達させる濃度（すなわち、ＥＣ５０値）によって評価される。あるいは、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質がＦｃ受容体（例えば、Ｆｃγ受容体またはＦｃＲｎ受容体）に結合する親和性は、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質を所与の濃度とした、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）アッセイにおいて、マイクロプレートリーダーで得られたＯＤ４５０ｎｍ値によって評価される。
本明細書で使用される場合、「Ｃ１ｑ」または「補体成分１ｑ」という用語は、自然免疫系の一部である、補体系に関与するタンパク質複合体を意味する。Ｃ１ｑは、Ｃ１ｒおよびＣ１ｓと一緒に、Ｃ１複合体を形成する。Ｃ１ｑは、Ｔ細胞やＢ細胞に対する樹状細胞による特異的な抗原提示に関与する役割を担っている。
本明細書で使用される場合、用語「空腹時血糖値」または「ＦＢＧＬ」は、食物を与えない期間の終わり、且つ、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質を投与する直前の、標的対象の平均血糖値を指す。本明細書で使用される場合、用語「空腹時血糖値パーセント」、「空腹時血糖値％」、または「％ＦＢＧＬ」は、空腹時血糖値に対する所与の血糖値の比率に１００を乗じたものを指す。
本明細書で使用される場合、用語「免疫原性の」または「免疫原性」は、分子の反復投与後、対象が当該分子と特異的に結合することができる抗体（すなわち、抗薬物抗体）を発現するように、所与の分子（例えば、本発明のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質）が標的対象の免疫系を誘起する能力を指す。本明細書で使用される場合、用語「中和すること」、「中和抗体」、または「中和抗薬物抗体」は、抗体が標的対象における化合物の生物活性を妨害する能力を指す。本明細書で使用される場合、用語「免疫原性エピトープ」、「免疫原性ホットスポット」、または「ホットスポット」は、抗薬物抗体の中程度または強い結合の原因となる、所与の分子（例えば、本発明のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質）の変異またはエピトープを指す。
本明細書で使用される場合、用語「インスリン参照標準」は、（ｉ）哺乳動物（例えば、イヌ、またはヒト）由来の天然由来のインスリン；（ｉｉ）Ｆｃフラグメントを含まないインスリンポリペプチド；または、（ｉｉｉ）標準治療用インスリン（例えば、市販のインスリン）のいずれか１つである。
本明細書で使用される場合、用語「モノマー」は、単一のポリペプチドから構成されるタンパク質または融合タンパク質を指す。実施形態において、「モノマー」は、タンパク質または融合タンパク質であり、例えば、インスリンポリペプチドとＦｃフラグメントポリペプチドとを含む単一ポリペプチドであって、当該インスリンおよび当該Ｆｃフラグメントポリペプチドがペプチド結合により結合されることで形成される、単一ポリペプチドである。実施形態において、モノマーは、単一の核酸分子にコードされる。
本明細書で使用される場合、「Ｎ末端」は、アミノ酸のα－アミノ基である遊離アミン基（例えば、第２の炭素原子に隣接して位置する１つの炭素原子に共有結合している遊離アミノであって、この第２の炭素原子がこのアミノ酸のカルボニル基の一部となっている）を含むアミノ酸によって開始されるタンパク質またはポリペプチドの始まりを指す。本明細書で使用される場合、「Ｃ末端」は、カルボン酸基を含むアミノ酸で終わっているタンパク質またはポリペプチドの末端を指し、ここでこのカルボン酸基の炭素原子は、このアミノ酸のα－アミノ基に隣接して位置している。
本明細書で使用される場合、「ＯＤ４５０」、「４５０ｎｍの光学密度」、および「４５０ｎｍの吸光度」は、同義的に使用され、アッセイ、例えばマイクロプレートベースアッセイ、例えば酵素結合免疫吸着測定法、例えばＥＬＩＳＡアッセイ、において試料を通過した４５０ｎｍの光の吸光度を、マイクロプレートリーダーを用いて読み取ることを指す場合がある。
本明細書で使用される場合、特定のアッセイにおいての「ＯＤ４５０比」は、特定の時点に実行された第１の被験インスリン－Ｆｃ融合タンパク質について得られたＯＤ４５０値を、別の時点に実行された第２の被験インスリン－Ｆｃ融合タンパク質について得られたＯＤ４５０値と、比較する方法を指す。ＯＤ４５０比は、第１の被験物質のＯＤ４５０値を、参照インスリン－Ｆｃ融合タンパク質のＯＤ４５０値で割ることによって得られる。同様に、第二の被験物質のＯＤ４５０値を、第一の被験物質のＯＤ４５０比の算出に用いたものと同じ参照インスリン－Ｆｃ融合タンパク質のＯＤ４５０値で割ることによって、第二の被験物質の第二のＯＤ４５０比を得ることができる。結果として、第１の被験インスリン－Ｆｃ融合タンパク質と第２の被験インスリン－Ｆｃ融合タンパク質のアッセイ特性を比較することができる。ＯＤ４５０比の算出に用いる参照インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成は、配列番号７６である。
本明細書で使用される場合、「薬力学」または「ＰＤ」は、通常、対象におけるインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の生物学的効果を指す。具体的には、本明細書において、ＰＤは、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の投与後、対象における経時的な空腹時血糖値の低下の指標を指す。
本明細書で使用される場合、「薬物動態」または「ＰＫ」は、通常、吸収、分布、代謝、および排泄の観点での、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質と対象の体との特徴的な相互作用を指す。具体的には、本明細書において、ＰＫは、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質を投与した後の所与の時点における、対象の血液または血清中のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の濃度を指す。本明細書で使用される場合、「半減期」とは、薬物排泄の一次指数関数的減衰モデルから算出される、対象の血液または血清中のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の濃度が元の値の半分に達するまでの時間を指す。「半減期」の値が大きいインスリン－Ｆｃ融合タンパク質ほど、標的対象においてより長い作用持続時間を示す。
本明細書で使用される場合、アミノ酸またはヌクレオチド配列における「配列同一性」、「配列相同性」、「相同性」、または「同一の」という用語は、バリアントのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の特定の連続するセグメントを、参照配列のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列に対してアラインメントして比較したとき、バリアントおよび参照配列内に同じヌクレオチドまたはアミノ酸残基が存在することを述べている。配列アライメント法および配列間の同一性を求めるための方法は、当該技術分野において公知であり、類似性のために配列を整理、整列、および比較するクラスタルオメガの使用が挙げられ、このソフトウェアは、各配列位置を強調し、その位置において全配列間で比較し、以下のスコアのうちの１つを割り当てる。「＊」（アステリスク）は、単一の完全に保存された残基を有する配列位置に割り当てられ、「：」（コロン）は、Ｇｏｎｎｅｔ ＰＡＭ ２５０マトリックスで０．５を超えるスコアを有する、強く類似した特性のグループ間の保存を示し、「．」（ピリオド）は、Ｇｏｎｎｅｔ ＰＡＭ ２５０マトリックスで０．５以下のスコアを有する弱く類似した特性のグループ間の保存を示し、「－」（ダッシュ）は配列ギャップを示し、ある配列範囲内の特定の比較集合の中に局所的な相同性が存在しないことを意味し、空白「 」は比較配列全体でその特定の位置に配列相同性がほとんど存在しないことを示す。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）（１９９５年）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９章（グリーン・パブリッシング（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）およびワイリー・インターサイエンス（Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、ニューヨーク）；および、ＡＬＩＧＮプログラム、Ｄａｙｈｏｆｆ、Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ５：Ｓｕｐｐｌ．３（国立生物医学研究財団（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）、ワシントンＤ．Ｃ．）を参照されたい。２つのヌクレオチド配列の最適なアラインメントに関して、バリアントヌクレオチド配列の連続するセグメントは、参照ヌクレオチド配列に対して追加のヌクレオチドまたは削除されたヌクレオチドを有していてもよい。同様に、２つのアミノ酸配列の最適なアラインメントの目的のために、バリアントアミノ酸配列の連続するセグメントは、参照アミノ酸配列に対して追加のアミノ酸残基または削除されたアミノ酸残基を有していてもよい。いくつかの実施形態において、参照ヌクレオチド配列または参照アミノ酸配列との比較に用いられる連続セグメントは、少なくとも６個、１０個、１５個、または２０個の連続ヌクレオチド、またはアミノ酸残基から構成され、３０個、４０個、５０個、１００個、またはそれ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸残基であってよい。バリアントのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列にギャップが含まれることに付随する配列同一性の増加の補正は、ギャップペナルティを割り当てることによって行うことができる。配列アライメントの方法は、当技術分野において公知である。
実施形態において、２つの配列間のパーセント同一性または「相同性」の決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成される。例えば、アミノ酸配列のパーセント同一性は、ギャップ開始ペナルティ１２、ギャップ伸長ペナルティ２、ＢＬＯＳＵＭ行列６２を用いるアフィン６ギャップ検索を使用するスミス－ウォーターマン相同性検索アルゴリズムを用いて決定される。スミス－ウォーターマン相同性検索アルゴリズムは、参照によって本明細書に援用される、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ、２巻：ｐｐ４８２～４８９で説明されている。実施形態において、ヌクレオチド配列のパーセント同一性は、ギャップ開始ペナルティ２５、ギャップ伸長ペナルティ５を用いる、スミス－ウォーターマン相同性検索アルゴリズムを使用して決定される。このような配列同一性の決定は、例えば、タイムロジック社（ＴｉｍｅＬｏｇｉｃ）のＤｅＣｙｐｈｅｒハードウェアアクセラレータを用いて、実施することができる。
本明細書で使用される場合、用語「相同性」は、例えばβストランド、ヘリックス、フォールドなどの共通の構造特性および共通の空間分布の位置を見つけることによって、２つ以上のタンパク質を比較するために使用される。従って、相同なタンパク質構造は、空間的な分析によって定義される。構造相同性の測定には、空間の幾何学的トポロジー的特徴を計算することが必要である。タンパク質の３次元構造を生成・解析するのに用いられる１つの手法として、３次元の類似性が２次元の類似性を反映しているという事実に基づいて類似配列を見つけ出す、ホモロジーモデリング（比較モデリング、知識ベースモデリングとも呼ばれる）がある。相同構造は、配列の類似性を必須条件とはしていない。
本明細書で使用される場合、用語「対象」および「患者」は、疾患または障害、例えば、糖尿病または本明細書に記載の別の疾患または障害、を有する犬科動物およびヒト、または正常な対象を含むことを意図している。
本明細書で使用される場合、用語「力価」または「収量」は、細胞培養物の体積当たりの生合成（例えば、哺乳動物細胞、例えば、ＨＥＫ２９３細胞またはＣＨＯ細胞における生合成）から生じる融合タンパク質生成物（例えば、本明細書に記載のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質）の量を指す。生成物の量は、生産プロセスの任意の工程（例えば、精製の前または後）で求めることができるが、収量または力価は、常に、元の細胞培養物の体積当たりで記載される。本明細書で使用される場合、用語「生成物収量」または「総タンパク質収量」は、細胞によって発現され、少なくとも１つのアフィニティークロマトグラフィー工程（例えば、プロテインＡまたはプロテインＧ）を介して精製されたインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の総量を指し、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の単量体、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質のホモ二量体、およびインスリン－Ｆｃ融合タンパク質のホモ二量体の高次分子凝集体を含む。本明細書で使用される場合、用語「パーセントホモ二量体」または「ホモ二量体率」は、所望のホモ二量体である融合タンパク質生成物（例えば、本明細書に記載のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質）の割合を指す。本明細書で使用される場合、用語「ホモ二量体力価」は、細胞培養物の体積当たりで報告される、プロテインＡ精製工程後のホモ二量体率と総タンパク質収量との積を指す。
本明細書で使用される場合、疾患または障害を有する対象を「治療する」または「治療すること」という用語は、疾患または障害の少なくとも１つの症状が解消、治癒、緩和、軽減、変化、軽快、緩解、または改善するように、対象をレジメン、例えば本明細書に記載の融合タンパク質などの融合タンパク質の投与に供することを意味する。治療は、疾患もしくは障害、または疾患もしくは障害の症状を緩和、軽減、変化、軽快、緩解、改善する、または影響を与えるのに有効な量を投与することを含む。治療は、疾患または障害の症状の増悪または悪化を抑制するものであってもよい。
インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の組成および構造
本開示は、ペプチドリンカーを介して種特異的なＦｃフラグメントに連結されたインスリンポリペプチドを含む融合タンパク質（すなわち、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質）の組成、並びに、糖尿病（例えば、ヒトおよび／またはイヌにおける糖尿病）を治療するためのその使用に関する。本明細書で使用される場合、「融合タンパク質」および「インスリン－Ｆｃ融合タンパク質」という用語は、ペプチド結合を介して共有結合した、例えば異なる供給源（異なるタンパク質、ポリペプチド、細胞など）からの、２以上の部分からなるタンパク質を指す。インスリン－Ｆｃ融合タンパク質は、（ｉ）各部分をコードする遺伝子を連結して１つの核酸分子にし、（ｉｉ）核酸分子が以下のようにコードしているタンパク質を宿主細胞（例えば、ＨＥＫまたはＣＨＯ）中で発現することで、共有結合される：（Ｎ末端）－－インスリンポリペプチド－－リンカー－－Ｆｃフラグメント－－（Ｃ末端）。完全に組換え合成するアプローチの方が、インスリンポリペプチドとＦｃフラグメントを別々に合成してから化学的に結合させる方法よりも好ましい。化学的結合工程とその後の精製プロセスは、製造の複雑さを増加させ、製品の収量を減少させ、コストを増加させる。
本明細書で使用される場合、「二量体」という用語は、共有結合した２つのポリペプチドを含むタンパク質または融合タンパク質を指す。実施形態において、２つの同一のポリペプチドが共有結合（例えば、ジスルフィド結合を介して）し、「ホモ二量体」を形成している（図１に図示）。ジスルフィド結合を図１に示しているが、実際のジスルフィド結合の総数は、図１に示される数よりも多くても少なくてもよい。実施形態において、ホモ二量体は、単一の核酸分子によってコードされており、ホモ二量体は、まずインスリン－Ｆｃ融合タンパク質単量体を形成し、次に細胞内でのさらなるプロセシング後に２つの同一のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質単量体をホモ二量体へと構築することによって、細胞内で組換え製造される。
本明細書で使用される場合、「多量体、」「多量体の」、または「多量体状態」という用語は、Ｆｃ融合タンパク質二量体と平衡状態にあり得る、または、Ｆｃ融合タンパク質二量体の永久凝集型として作用し得る、Ｆｃ融合タンパク質二量体の非共有結合性の会合形態（例えば、Ｆｃ融合タンパク質ホモ二量体の二量体、Ｆｃ融合タンパク質ホモ二量体の三量体、Ｆｃ融合タンパク質ホモ二量体の四量体、または５以上のＦｃ融合タンパク質ホモ二量体を含む高次凝集体）を指す。Ｆｃ融合タンパク質の多量体型は、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質ホモ二量体とは異なる物理的、安定性、または薬理活性を有し得ると予想できる。
インスリンポリペプチド
インスリンポリペプチドは、例えば、膵臓内のランゲルハンス島のβ細胞によって産生されるインスリンまたはインスリン類似体であってもよい。インスリンは、血液からのグルコースの吸収を調節することで機能する。タンパク質レベルの上昇およびグルコースレベルの上昇などの刺激により、インスリンはβ細胞から放出され、ＩＲに結合し、哺乳類（例えば、ヒト）の代謝の多くの側面に影響を与えるシグナルカスケードを開始する。このプロセスの崩壊は、いくつかの疾患、特に糖尿病、インスリノーマ、インスリン抵抗性、メタボリックシンドローム、および多嚢胞性卵巣症候群に直接関係する。本開示のインスリン類似体は、インスリンの構造に関連しているが、１またはそれ以上の改変を含んでいるものであってもよい。いくつかの実施形態において、インスリン類似体は、インスリンに対する少なくとも１つのアミノ酸の置換、欠失、付加、または化学修飾を含み、これらは、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成の特定の特徴または特性に影響を与える可能性がある。例えば、本明細書に記載の修飾または変更は、参照標準と比較して、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成の構造、安定性、ｐＨ感受性、生物活性、または細胞表面受容体（例えば、インスリンホルモン受容体）に対する結合親和性に影響を与える可能性がある。
インスリンのアミノ酸配列は、進化を通じて、特に脊椎動物において強く保存されている。例えば、天然型イヌインスリンと天然型ブタインスリンは、ヒトインスリンと１つのアミノ酸しか異なっておらず、天然型ウシインスリンは、ヒトインスリンと３つのアミノ酸しか異なっておらず、天然型ネコインスリンは、ヒトインスリンとたった４つのアミノ酸しか異なっていない。本明細書で使用される場合、用語「Ｂ鎖またはＢ鎖アナログ」、「Ｃペプチド」または「Ｃ鎖」、および「Ａ鎖またはＡ鎖アナログ」は、図１に例示されるようなインスリンポリペプチドのペプチドセグメントを指す。インスリンは、ジスルフィド結合（例えば、１または複数のＢ鎖システイン側鎖チオールおよび１または複数のＡ鎖システイン側鎖チオールによって形成されるジスルフィド結合）を介して接続された、２つのペプチド鎖（すなわち、Ｂ鎖およびＡ鎖）を含む、５１アミノ酸のホルモンである。インスリンのＡ鎖は２１アミノ酸長であり、インスリンのＢ鎖は３０アミノ酸長である。天然型のインスリンでは、Ａ鎖は、２つのＡ鎖システイン側鎖チオールによって形成された１つの鎖内ジスルフィド結合を含む。参考のため、配列番号１のヒトインスリンＢ鎖および配列番号２のヒトインスリンＡ鎖の配列を以下に示す：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴ（配列番号１）
ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ（配列番号２）。
本明細書で使用される場合、「インスリン」または「インスリンポリペプチド」という用語は、成熟インスリン、プレプロインスリン、プロインスリン、および天然に存在するインスリン、またはその類似体を包含する。実施形態において、インスリンポリペプチドは、完全長インスリンポリペプチドまたはその断片とすることができる。実施形態において、インスリンポリペプチドは、成熟インスリン、プレプロインスリン、プロインスリン、または天然に存在するインスリンからの１または複数の断片を含むことができる。
インスリンは通常、Ｎ末端－－Ｂ鎖：Ｃ鎖：Ａ鎖－－Ｃ末端ポリペプチドとして構築され、生物活性を示すようにするためにＣ鎖が切断される。参考のため、Ｃ鎖を含むヒトインスリン分子全体（すなわち、ヒトプロインスリン）の配列を、Ｃ鎖に下線を引いて以下に示す：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴＲＲＥＡＥＤＬＱＶＧＱＶＥＬＧＧＧＰＧＡＧＳＬＱＰＬＡＬＥＧＳＬＱＫＲＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ（配列番号３）。
単鎖インスリンポリペプチドの、生理活性を有する２鎖ポリペプチドへの変換は、通常、グルコース刺激によるインスリン分泌より前に、ランゲルハンス島のβ細胞内で、Ｉ型エンドプロテアーゼ（Ｃペプチド－Ｂ鎖接続を破壊するＰＣ１およびＰＣ３、並びにＰＣ２）、およびＣペプチド－Ａ鎖結合を正しい部位で正確に切断するＩＩ型エンドプロテアーゼの２つのエンドプロテアーゼによって達成されている。しかし、インスリンなどの治療用分子の生合成に用いられる細胞系（例えば、細菌、酵母、および哺乳類（ＨＥＫおよびＣＨＯ）細胞系）はこの経路を有していないため、化学的または酵素的な方法を用いて単鎖ポリペプチドを発現および回収した後に変換を行わなければならない。発現および回収後にＣ鎖を切断するための公知の技術は全て、Ｃ鎖がＡ鎖のＮ末端直前のリジンで終端するように、まずＣ鎖を改変することに依存している。次に、リジン残基のＣ末端で特異的にペプチド結合を切断する、トリプシンまたはＬｙｓ－Ｃファミリーから選択される酵素を用いて、単鎖インスリンポリペプチドをＣ鎖のＣ末端リジンおよびＢ鎖のＮ末端から２９番目の位置のＣ末端リジンで切断する。場合によっては、得られた生物活性を示す２鎖インスリンは、Ｂ鎖のＮ末端から３０番目の位置の切断されたアミノ酸を再付加せずに使用され、場合によっては、Ｂ鎖のＮ末端から３０番目の位置の切断されたアミノ酸が追加の酵素的方法を用いて当該分子に再付加される。このような処理がインスリンではうまくいくのは、インスリンが２鎖ポリペプチド形態の全体の中にリジンを１つしか含まないためである。しかし、既知のＦｃフラグメントは全て複数のリジン残基を含むため、この処理は本明細書に含まれるインスリン－Ｆｃ融合タンパク質に対しては使用することができない。従って、酵素切断プロセスは、Ｆｃフラグメントを非機能的な部分にまで消化することによって、インビボでインスリンポリペプチドの作用を延長するＦｃフラグメントの能力を取り除くことになる。従って、本発明のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質は、Ｃ鎖切断を必要としないことから単鎖形態で生物活性を示す、インスリンポリペプチドを含まなければならない。
生物活性を示すいくつかの単鎖インスリンポリペプチドが、当該技術分野において報告されている。いずれの場合も、単鎖インスリンポリペプチドは、静電バランスをとり、凝集を防ぎ、ＩＲ結合および／または下流シグナル伝達を増強して天然型の２鎖インスリンと同等レベルの生物活性を達成するために、特定の長さと組成のＣ鎖、並びに、特定のアミノ酸部位で変異したＡ鎖およびＢ鎖を含んでいる。ここで、ペプチドセグメント上の変異の位置は、セグメントの名称（例えば、Ｂ鎖、Ｃ鎖、Ａ鎖）と、セグメントのＮ末端から数えたアミノ酸の数を用いて表記される。例えば、「Ｂ１６」という表記は、Ｂ鎖のアミノ酸配列のＮ末端から１６番目のアミノ酸のことをいう。また、「Ａ８」という表記は、Ａ鎖のＮ末端から８番目のアミノ酸のことをいう。さらに、あるアミノ酸が特定の位置で天然型から新しいアミノ酸に変異している場合、その位置にはその新しいアミノ酸のための１文字アミノ酸コードが付加される。例えば、Ｂ１６ＡはＢ鎖のアミノ酸配列のＮ末端から１６番目のアミノ酸におけるアラニン変異のことをいい、Ａ８ＨはＡ鎖のアミノ酸配列のＮ末端から８番目のアミノ酸におけるヒスチジン変異をいう。
米国特許第９８５５３１８Ｂ２号では、配列ＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号７２）のＣ鎖（「第１のリンカー」）、Ａ鎖における置換、並びにＢ鎖における置換および欠失（非天然型アミノ酸には下線を引き、欠失させた天然型アミノ酸は下線を引いたＺで表している）を有する単鎖インスリン類似体が報告されている：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＺ（配列番号７＿ＮＵＬＬ）。
以下に、上に示した配列を、インスリンポリペプチド配列の表記から記号Ｚの不在アミノ酸を取り除いて、再掲したものである。ここでも、前と同様に、非天然型のアミノ酸に下線を引いている。２つの別々の表記をしたが、この１対の配列は全く同じインスリンポリペプチドを指している。
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣ（配列番号７）
いくつかの実施形態において、予想外にも、配列番号７のＢ鎖のＮ末端から１６番目の位置（すなわち、Ｂ１６）でアラニンをグルタミン酸に置換して配列番号１０を得る、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成は、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質のホモ二量体力価、ＩＲ結合親和性、およびＦｃＲｎ結合を向上させながら、ＦｃγＲＩ結合親和性およびＣ１ｑ結合親和性が低いことによって判断される免疫原性の低減を維持することが見出された。Ｂ１６におけるこの特定のアミノ酸置換は、もともと、この位置のアラニンはインスリン特異的Ｔ細胞を活性化する能力が低いことが知られていることで動機付けられていた（Ａｌｌｅｖａ，Ｄ．Ｇ．、Ｇａｕｒ，Ａ．、Ｊｉｎ，Ｌ．、Ｗｅｇｍａｎｎ，Ｄ．、Ｇｏｔｔｌｉｅｂ，Ｐ．Ａ．、Ｐａｈｕｊａ，Ａ．、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅ．Ｂ．、Ｍｏｔｈｅｒａｌ，Ｔ．、Ｐｕｔｎａｍ，Ａ．、Ｃｒｏｗｅ，Ｐ．Ｄ．、Ｌｉｎｇ，Ｎ．、Ｂｏｅｈｍｅ，Ｓ．Ａ．、Ｃｏｎｌｏｎ，Ｐ．Ｊ．、（２００２年）、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、５１巻、７号、ｐｐ２１２６～２１３４）。配列番号１０を、非天然型のアミノ酸のそれぞれに下線を引いて以下に挙げる：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣ（配列番号１０）。
リンカー
いくつかの例では、インスリンポリペプチドのＣ末端は、ＦｃフラグメントのＮ末端に直接接続される（例えば、無リンカーまたはリンカーなし）。他の例では、組換え製造されたインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構築を成功させるために、インスリンポリペプチドをＦｃフラグメントに接続するリンカーが必要となる。実施形態において、本明細書に記載のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成は、アミノ酸（例えば、天然アミノ酸または非天然アミノ酸）から構成される、インスリンポリペプチドとＦｃフラグメントとの間のペプチドリンカーを含む。実施形態において、例えば、単一の核酸分子が、インスリンポリペプチド内の様々なペプチドと、ペプチドリンカーおよびＦｃフラグメントとをコードできるように、ペプチドリンカーは核酸分子にコードさせることができる。ペプチドリンカーの選択肢（例えば、長さ、組成、疎水性、および二次構造）は、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成の製造性（すなわち、ホモ二量体力価）、化学的および酵素的な安定性、生物活性（すなわち、ＮＡＯＣ値）、生物活性と相関するパラメータ（すなわち、ＦｃＲｎアッセイにおけるＥＣ５０値）、並びにインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の免疫原性に影響し得る（Ｃｈｅｎ，Ｘ．、Ｚａｒｏ，Ｊ．、Ｓｈｅｎ，Ｗ．Ｃ．、Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．、２０１３年１０月１５日；６５巻（１０号）：ｐｐ１３５７～１３６９）。表１は、ホモ二量体力価と生物活性を向上させる目的で、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成の設計に使用されるいくつかのリンカーを挙げている。
Figure 0007405486000001
実施形態において、ペプチドリンカーは、配列：
ＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧ（配列番号１３）
を有する。他の実施形態において、ペプチドリンカーは、配列：
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１２）
を有する。好ましい実施形態において、ペプチドリンカーは、配列：
ＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＧ（配列番号６７）
または、配列：
ＧＧＧＧＡＧＧＧＧ（配列番号１１）
を含む。
配列番号１３のペプチドリンカーのようなペプチドリンカーを有する組換え製造されたインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成を構築する際には、インスリンＡ鎖のＣ末端とペプチドリンカーのＮ末端の間の、望ましくない酵素切断の可能性に注意を払わなければならない。インスリンポリペプチドからリンカーおよびＦｃフラグメントを切断した場合、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成は、長時間の生物活性を提供することができないものとなるであろう。アスパラギン－グリシン結合の間には、既知の酵素切断部位が存在する（Ｖｌａｓａｋ，Ｊ．、Ｉｏｎｅｓｃｕ，Ｒ．、（２０１１年）、ＭＡｂｓ、３巻、３号、ｐｐ２５３～２６３）。配列番号１３の好ましいペプチドリンカーを包含する多くのペプチドリンカーの実施形態では、Ｎ末端アミノ酸はグリシンである。さらに、インスリンＡ鎖のＣ末端（すなわち、Ａ鎖のＮ末端から２１番目のアミノ酸（すなわち、Ａ２１））は、アスパラギンである。そこで、配列番号７、配列番号９、および配列番号１０のインスリンポリペプチドでは、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成においてＡ鎖とペプチドリンカーとの間に形成されるであろう、酵素切断可能であり得るアスパラギン－グリシン結合を除去するために、Ａ２１アスパラギンを省いている。予想外にも、Ａ鎖のＣ末端にアスパラギンを保持している、配列番号８のインスリンポリペプチドから構築されたインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成が、許容できるホモ二量体力価（すなわち、５０ｍｇ／Ｌを超えるイヌインスリン－Ｆｃ融合タンパク質のホモ二量体力価）での哺乳類細胞における製造性、イヌにおける許容できるインビボ生物活性（すなわち、１５０％ＦＢＧＬ・日・ｋｇ／ｍｇを超えるＮＡＯＣ）、および、複数回投与後の生物活性レベルの維持（すなわち、０．５を超える、イヌにおける３回目注射後のＮＡＯＣＲ値）を示している。結果は、以前の教示に基づく予想に反して、少なくとも本明細書に開示されるＦｃフラグメント配列を含むインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成については、インスリンポリペプチドとペプチドリンカーとの間のアスパラギン－グリシン結合を含むインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成の酵素切断または非活性化のリスクは存在しないことを示している。
別の実施形態において、インスリンポリペプチド組成およびＦｃフラグメント組成が同じ場合、配列番号１３のグルタミン（Ｑ）をアラニン（Ａ）に変異させ、ＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＧ（配列番号６７）のペプチドリンカーを作製したところ、ホモ二量体力価が高く、ＩＲに対する結合親和性が増加し、ＦｃＲｎ受容体に対する結合親和性が増加した、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成が得られることが見出された。
別の実施形態において、インスリンポリペプチド組成およびＦｃフラグメント組成が同じ場合、配列番号６７のペプチドリンカーは、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質のホモ二量体力価にもＦｃＲｎ受容体に対する結合親和性にも顕著な影響を与えずに、ＩＲアッセイにおけるＩＣ５０値を６０％増加させて、短くできることが見出された。この短縮型ペプチドリンカーは、配列：
ＧＧＧＧＡＧＧＧＧ（配列番号１１）
を含む。
Ｆｃフラグメント
「Ｆｃフラグメント」、「Ｆｃ領域」、「Ｆｃドメイン」、または「Ｆｃポリペプチド」という用語は、本明細書では、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を規定するために使用される。Ｆｃフラグメント、Ｆｃ領域、Ｆｃドメイン、またはＦｃポリペプチドは、天然型配列のＦｃ領域であってもよいし、バリアント／変異型Ｆｃ領域であってもよい。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は様々であり得るが、一般に、重鎖のヒンジ領域、重鎖のＣＨ２領域、および重鎖のＣＨ３領域の一部または全部から構成される。イヌＦｃフラグメントまたはヒトＦｃフラグメントのヒンジ領域は、重鎖のＣＨ１ドメインと重鎖のＣＨ２領域とを接続し、また、２つの同一だが別々のＦｃ融合タンパク質単量体からＦｃ融合タンパク質のホモ二量体を形成するための１または複数の重鎖間ジスルフィド架橋を形成する１または複数のシステインを含む、アミノ酸配列を含む。ヒンジ領域は、天然に存在するアミノ酸配列または天然に存在しないアミノ酸配列の全部または一部を含んでもよい。
Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）とは、Ｆｃフラグメントまたは抗体のＦｃ領域に結合する受容体を指す。実施形態において、ＦｃＲは、イヌＦｃＲまたはヒトＦｃＲの天然型配列である。実施形態において、ＦｃＲは、ＩｇＧ抗体のＦｃフラグメントまたはＦｃ領域と結合するもの（γ受容体）であり、ＦｃγＲＩサブクラス、ＦｃγＲＩＩａサブクラス、ＦｃγＲＩＩｂサブクラス、およびＦｃγＲＩＩＩサブクラスという受容体を含むが、これらに限定はされず、これらの受容体の対立遺伝子バリアントおよび選択的スプライシングを受けた型を含む。「ＦｃＲ」は、新生児型受容体であるＦｃＲｎも含み、これは、母親のＩｇＧ分子の胎児への移行に関与しており（Ｇｕｙｅｒら、１９７６年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１７巻：ｐ５８７；およびＫｉｍら、１９９４年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２４巻：ｐ２４９）、また、インビボにおける抗体およびＦｃ融合タンパク質のインビボ排出半減期の延長にも関与している。ある種由来の哺乳類ＦｃＲ（例えば、ヒト由来のＦｃＲ）は、同じ種（例えば、ヒト由来）のＦｃフラグメントを含むインスリン－Ｆｃ融合タンパク質のインビトロ結合が可能であり、また、別の哺乳類種由来（例えば、イヌ由来）のＦｃフラグメントのインビトロ結合が可能な場合もあることは、当業者には理解される。実施形態において、ヒト由来のＦｃＲは、ヒトまたはイヌ由来のＦｃフラグメントを含むインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成のＦｃＲ結合特性を評価するための、結合特性測定に、インビトロで（例えば、アッセイで）使用される。実施形態において、イヌ由来のＦｃＲは、イヌ由来Ｆｃフラグメントを含むインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成の結合を測定するために、インビトロで（例えば、アッセイで）使用される。
実施形態において、天然型のイヌおよびヒトのＩｇＧアイソタイプＦｃフラグメントのアミノ酸配列に存在する場合が多いＣ末端リジン（すなわち、Ｆｃフラグメント配列の最後のアミノ酸を表すリジン）が、製造時に望ましくないアミノ酸配列バリアントが偶然生成されることを防ぐために取り除かれる（例えば、Ｃ末端リジンを含むＦｃフラグメントと、Ｃ末端リジンが取り除かれたＦｃフラグメントとの混在が、細胞内で所望のタンパク質が生産される際に起こる可能性がある）（Ｄｉｃｋ，ＬＷ．、（２００８年）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．、８月１５日；１００巻（６号）ｐｐ１１３２～４３）。
イヌインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の実施形態において、Ｆｃフラグメントは、イヌＩｇＧＡのＦｃフラグメント（配列番号１４）、イヌＩｇＧＢのＦｃフラグメント（配列番号１５）、イヌＩｇＧＣのＦｃフラグメント（配列番号１６）、またはイヌＩｇＧＤのＦｃフラグメント（配列番号１７）のＦｃ領域（例えば、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメイン）を含む。すなわち、イヌインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成において、Ｃ末端リジンを欠いたイヌＦｃフラグメント配列としては、以下のものがある：
ＲＣＴＤＴＰＰＣＰＶＰＥＰＬＧＧＰＳＶＬＩＦＰＰＫＰＫＤＩＬＲＩＴＲＴＰＥＶＴＣＶＶＬＤＬＧＲＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＥＶＨＴＡＫＴＱＳＲＥＱＱＦＮＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＥＨＱＤＷＬＴＧＫＥＦＫＣＲＶＮＨＩＤＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＲＡＨＫＰＳＶＹＶＬＰＰＳＰＫＥＬＳＳＳＤＴＶＳＩＴＣＬＩＫＤＦＹＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＲＫＨＲＭＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＱＧＤＰＦＴＣＡＶＭＨＥＴＬＱＮＨＹＴＤＬＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号１４）
ＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＮＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号１５）
ＣＮＮＣＰＣＰＧＣＧＬＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＩＬＶＴＡＲＴＰＴＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＮＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＳＫＱＶＱＴＡＮＴＱＰＲＥＥＱＳＮＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＳＧＫＱＦＫＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＥＩＩＳＫＴＰＧＱＡＨＱＰＮＶＹＶＬＰＰＳＲＤＥＭＳＫＮＴＶＴＬＴＣＬＶＫＤＦＦＰＰＥＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＭＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＩＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号１６）
ＣＩＳＰＣＰＶＰＥＳＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＩＬＲＩＴＲＴＰＥＩＴＣＶＶＬＤＬＧＲＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＥＶＨＴＡＫＴＱＰＲＥＱＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＥＨＱＤＷＬＴＧＫＥＦＫＣＲＶＮＨＩＧＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＰＫＥＬＳＳＳＤＴＶＴＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＥＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＰＥＰＥＳＫＹＨＴＴＡＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＱＧＤＴＦＴＣＡＶＭＨＥＡＬＱＮＨＹＴＤＬＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号１７）。
ヒトインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成において、Ｃ末端リジンを欠いたヒトＦｃフラグメント配列としては、以下のものがある：
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号７３）
ＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号７４）。
イヌの場合、イヌにおけるＩｇＧＡアイソタイプがＦｃγエフェクター機能を有していないことから（ヒトにおけるヒトＩｇＧ２アイソタイプとよく似ている）、任意の望ましくない免疫原性を最低限にするのに、イヌＩｇＧＡが好ましい。しかし、配列番号４のインスリンポリペプチドと配列番号１１のペプチドリンカーとを含むインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の実施形態において、予想外にも、イヌＩｇＧＡフラグメント（配列番号１４）を含むインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成が、高度に凝集し、所望のホモ二量体の力価が低い（すなわち、イヌインスリン－Ｆｃ融合タンパク質のホモ二量体力価が５０ｍｇ／Ｌ未満）ことが発見された。さらに、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成は、イヌにおいて生物活性を示さなかった（すなわち、ＮＡＯＣ値が１５０％ＦＢＧＬ・日・ｋｇ／ｍｇ未満）が、これは、その高い凝集度（例えば、低いホモ二量体率）によると推測される。配列番号４のインスリンポリペプチド、イヌＩｇＧＡ Ｆｃフラグメント（配列番号１４）、および／またはリンカーを変異させたが、凝集度が十分に低く、所望のホモ二量体の力価が十分に高いイヌＩｇＧＡ Ｆｃフラグメントを含むインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の実施形態はなかった。しかし、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成でイヌＩｇＧＡ Ｆｃフラグメント（配列番号１４）をイヌＩｇＧＢ Ｆｃフラグメント（配列番号１５）で置き換えた場合、著しく凝集度の低い化合物が得られ、所望のホモ二量体の比較的高い力価が得られた。さらに、配列番号４のインスリンポリペプチドとイヌＩｇＧＢ Ｆｃフラグメント（配列番号１５）を含むインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成は、イヌにおいて生物活性を示し、複数日に亘ってグルコースを低減させる生物活性を示した（すなわち、ＮＡＯＣ値が１５０％ＦＢＧＬ・日・ｋｇ／ｍｇより大きい）。
イヌＩｇＧＢ ＦｃフラグメントがイヌＩｇＧＡ Ｆｃフラグメントよりも好ましいことが、配列番号７のインスリンポリペプチドと配列番号１３のペプチドリンカーとを含むインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成において確認されたが、どちらの構成も、配列番号４のインスリンポリペプチドおよび配列番号１１のペプチドリンカーとかなり異なるものであった。配列番号７のインスリンポリペプチドと配列番号１３のペプチドリンカーを含むインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成は、イヌＩｇＧＡ（配列番号１４）、イヌＩｇＧＢ（配列番号１５）、イヌＩｇＧＣ（配列番号１６）、またはイヌＩｇＧＤ（配列番号１７）の免疫グロブリン由来のＦｃフラグメントを用いて合成された。従来の精製法を用いて、イヌＩｇＧＡを含むインスリン－Ｆｃ融合タンパク質構成とイヌＩｇＧＢを含むインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成のみが、かなりのタンパク質収量を示した。しかし、前述の通り、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質のイヌＩｇＧＡ構成は、高度に凝集しており、生物活性レベルが低かったが、一方、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質のイヌＩｇＧＢ構成は、凝集度が低く（すなわち、ホモ二量体率が高い）、望ましいホモ二量体の力価が高く（すなわち、イヌインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成のホモ二量体力価が５０ｍｇ／Ｌを超える）、イヌにおける長時間グルコース低減生物活性がかなりのレベルであった（すなわち、ＮＡＯＣ値が１５０％ＦＢＧＬ・日・ｋｇ／ｍｇ以上）。別の精製法を用いて、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質のイヌＩｇＧＣ構成は、低い凝集度で回収されたが、おそらくはＦｃＲｎ受容体に対する親和性の低さから、イヌにおいて最小限の生物活性しか示さなかった（すなわち、ＮＡＯＣ値が１５０％ＦＢＧＬ・日・ｋｇ／ｍｇ）。以上から、イヌ特異的製品に関しては、イヌＩｇＧＢ（配列番号１５）が、インスリンポリペプチドの選択にかかわらず、イヌに使用される全てのインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成において、好ましいＦｃフラグメントである。
イヌＩｇＧＢアイソタイプがイヌＩｇＧＡアイソタイプよりも高い親和性でイヌＦｃγ受容体と相互作用すると考えると、イヌＩｇＧＢを含むインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成を反復注射した後に、望ましくない免疫原性のリスクが存在する可能性がある。そこで、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質のより大きなホモ二量体力価を維持しつつ、イヌＦｃγＲＩ受容体に対する親和性を低減させるために、イヌＩｇＧＢ Ｆｃフラグメントに対する様々な変異の検討を行った。
ＦｃγＲＩ相互作用を低減する１つの方法では、宿主細胞内でインスリン－Ｆｃ融合タンパク質を合成する際に、Ｆｃフラグメントの脱グリコシル化またはグリコシル化防止が行われる。各ＩｇＧフラグメントは、Ｆｃ領域の各重鎖のＣＨ２ドメインに保存されたアスパラギン（Ｎ）－グリコシル化部位を含んでいる。ここでは、保存されたＮ－グリコシル化部位を指す表記として、「ｃＮｇ」を用いる。合成されたインスリン－Ｆｃ融合タンパク質から結合したグリカンを除去する１つの方法として、宿主細胞での生産中にグリカンの結合を完全に防止するためにｃＮｇ部位を変異させることが挙げられる。本明細書では、ｃＮｇ変異を記述するために用いられる表記は、ｃＮｇ－（置換アミノ酸）である。例えば、ｃＮｇ部位のアスパラギンがセリンに変異している場合、この変異は「ｃＮｇ－Ｓ」と表記される。
インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成のＢ鎖のＮ末端からのｃＮｇ部位の絶対位置は、インスリンポリペプチドの長さ、リンカーの長さ、ｃＮｇ部位より前のＦｃフラグメント中で取り除かれたアミノ酸によって変化する。本明細書において、所与のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質配列におけるｃＮｇ部位の絶対位置（インスリン－Ｆｃ融合タンパク質のＢ鎖のＮ末端から数えて測定）を指して用いられる表記は「ＮＢ（番号）」である。例えば、ｃＮｇ部位がＢ鎖のＮ末端から数えて１５５番目のアミノ酸位置に存在する場合、この部位の絶対位置は「ｃＮｇ－ＮＢ１５５」と称される。さらなる例として、ｃＮｇ部位がＢ鎖のＮ末端から数えて１５５番目のアミノ酸位置に存在し、この部位のアスパラギンがセリンに変異している場合、この変異は「ｃＮｇ－ＮＢ１５５－Ｓ」と表記される。
配列番号４のインスリンポリペプチドと、ｃＮｇ－Ｑ変異、ｃＮｇ－Ｓ変異、ｃＮｇ－Ｄ変異、ｃＮｇ－Ｋ変異を有するイヌＩｇＧＢ Ｆｃフラグメントとを含むインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の実施形態において、予想外にも、ｃＮｇ－Ｋを含む化合物とｃＮｇ－Ｓ変異を含む化合物のみが、必要な、５０ｍｇ／Ｌを超えるイヌインスリン－Ｆｃ融合タンパク質のホモ二量体力価と最低のＦｃγＲＩ結合親和性を示すことが見出された。一方、配列番号７のインスリンポリペプチドとｃＮｇ－Ｓ変異を有するイヌＩｇＧＢ Ｆｃフラグメントを含むインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の実施形態では、予想外にも、得られたインスリン－Ｆｃ融合タンパク質は、対応するインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成であるが天然型のイヌＩｇＧＢ Ｆｃを含むものと比較して、イヌにおいて著しく低い生物活性を示すことが見出された（すなわち、ＮＡＯＣ値は、天然型のグリコシル化部位アミノ酸、例えばｃＮｇ－Ｎを含む対応するインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の方が著しく低かった）。予想外にも、このインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の生物活性は、配列番号１０のインスリンポリペプチドについて上述したようにＢ１６アミノ酸をアラニンに変異させたとき、ｃＮｇ－Ｓ変異体において回復した（すなわち、ＮＡＯＣ値が著しく増加した）。まとめると、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成のＦｃフラグメント上のｃＮｇ変異の選択とインスリンポリペプチドの組成との間には、好ましいインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の実施形態を特定するのに実験が必要となるような、予想外の顕著な相互作用が存在している。特定のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の実施形態では、ｃＮｇ－Ｓ変異を含むイヌＩｇＧＢ Ｆｃ変異体が好ましく、ｃＮｇ－Ｓに下線を引いたその配列は、以下のように示される：
ＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＳＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号１８）。
一般に、ヒトＦｃ ＩｇＧ２アイソタイプは、Ｆｃγエフェクター機能を持たないために、望ましくない免疫原性を誘発する傾向が低いことから、他のアイソタイプよりも好ましい。例として、ＦｃγＲＩ結合ＥＬＩＳＡおよびＣ１ｑ結合ＥＬＩＳＡの１つの実行において、ヒトＩｇＧ１フラグメントを含む配列番号７６のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の実施形態は、ビオチン化ＦｃγＲＩ濃度を３０００ｎｇ／ｍＬとしたヒトＦｃγＲＩ結合アッセイにおけるＯＤ４５０が２．０７８であり、ビオチン化Ｃ１ｑ濃度を１０００ｎｇ／ｍＬとしたヒトＣ１ｑ結合アッセイにおけるＯＤ４５０が３．００６であったが、このように高い値は、配列番号７６が患者において免疫原性を示す可能性があることを示している。これに対して、ＦｃγＲＩ結合ＥＬＩＳＡおよびＣ１ｑ結合ＥＬＩＳＡの同じ実行において、配列番号７のインスリンポリペプチドと、配列番号１３のペプチドリンカーと、ヒトＩｇＧ２ Ｆｃフラグメント（配列番号７４）と、を含むインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成（配列番号７５）は、ビオチン化ＦｃγＲＩ濃度を３，０００ｎｇ／ｍＬとしたヒトＦｃγＲＩ結合アッセイにおけるＯＤ４５０が０．０９３であり、ビオチン化Ｃ１ｑ濃度を１，０００ｎｇ／ｍＬとしたヒトＣ１ｑ結合アッセイにおけるＯＤ４５０が０．９２８であり、配列番号７５が患者において免疫原性を示す可能性が著しく減少したことが示された。
インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成のＯＤ４５０測定値の絶対値は、例えばアッセイの実行時の小さな変動によって、ＥＬＩＳＡの１つの実行から次の実行まで変化する可能性がある。これにより、試験対象のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成の濃度を一定としても、異なるＥＬＩＳＡ実行間の異なるインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成のＯＤ４５０の絶対値測定値の比較は、信頼性が低くなる。対照的に、あるＥＬＩＳＡ実行におけるあるインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成のＯＤ４５０測定値と、同じＥＬＩＳＡ実行からの第２のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成のＯＤ４５０測定値との比較（ここでも、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質濃度を一定に保つ）は、異なるＥＬＩＳＡ実行間の同じ２つのインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成において比較的安定となる。これを受けて、ヒトＦｃγＲＩ結合アッセイおよびＣ１ｑ結合アッセイのＯＤ４５０に関するインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の設計目標をＯＤ４５０比として表したが、この比は、参照インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成の絶対ＯＤ４５０値に対する分析中のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の絶対ＯＤ４５０値の比であり、両方の測定を同じＥＬＩＳＡ実験内で行うものである。試験された全ての試料について、ＦｃγＲＩ結合ＥＬＩＳＡ ＯＤ４５０におけるインスリン－Ｆｃ融合タンパク質構成試料のビオチン化ＦｃγＲＩ濃度は、３０００ｎｇ／ｍＬに設定し、Ｃ１ｑ結合ＥＬＩＳＡ ＯＤ４５０におけるインスリン－Ｆｃ融合タンパク質構成試料のビオチン化Ｃ１ｑ濃度は、１０００ｎｇ／ｍＬに設定する。
配列番号７６のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成（ヒトＩｇＧ１ Ｆｃフラグメントを含む）を、ＦｃγＲＩ結合ＥＬＩＳＡおよびＣ１ｑ結合ＥＬＩＳＡにおけるＯＤ４５０比を算出するための参照インスリン－Ｆｃ融合タンパク質として用いる。上記で与えられた測定ＯＤ４５０値を用いた、配列番号７５のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成（ヒトＩｇＧ２ Ｆｃフラグメントを含む）の、ＦｃγＲＩ結合ＥＬＩＳＡにおけるＯＤ４５０比は：
Figure 0007405486000002
 上記で与えられた測定ＯＤ４５０値を用いた、配列番号７５のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成の、Ｃ１ｑ結合ＥＬＩＳＡにおけるＯＤ４５０比は：
Figure 0007405486000003
配列番号７６のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成（ｈＩｇＧ１）に対する、配列番号７５のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成（ｈＩｇＧ２）のＦｃγＲＩ結合ＥＬＩＳＡ ＯＤ４５０比およびＣ１ｑ結合ＥＬＩＳＡ ＯＤ４５０比は、望ましくない免疫原性の傾向を低減することを目的として、種々のインスリン－Ｆｃ融合体構成のＦｃγＲＩ結合およびＣ１ｑ結合を評価するための設計目標を作成する際に使用した、意欲的な基準である。よって、ヒトＦｃγＲＩ結合（試験対象のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質のビオチン化ＦｃγＲＩ濃度は３０００ｎｇ／ｍＬ）の場合に設けられた設計目標は、０．５０未満のＯＤ４５０比であり、Ｃ１ｑ結合の場合に設けられた設計目標（試験対象のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質のビオチン化Ｃ１ｑ濃度は１０００ｎｇ／ｍＬ）は、０．３５未満のＯＤ４５０比である。
ヒトＩｇＧ２ Ｆｃフラグメントを含むこのインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成（配列番号７５）の２つの別々の合成から得られた平均ホモ二量体力価は、１１７ｍｇ／Ｌであった。
比較すると、同じ配列番号７のインスリンポリペプチドと、同じ配列番号１３のペプチドリンカーと、ヒトＩｇＧ１フラグメント（配列番号７３）と、を含むインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の実施形態（配列番号７６）では、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質は、２つの別々の合成からの平均ホモ二量体力価が１８０ｍｇ／Ｌであり、ヒトＩｇＧ２フラグメントを含む類似のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成の場合で得られた平均ホモ二量体力価よりも５０％以上大きいことが見出された。ヒトＩｇＧ１アイソタイプがヒトＩｇＧ２アイソタイプよりも高い親和性でヒトＦｃγＲＩ受容体と相互作用することを考えると、ヒトＩｇＧ１を含むインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成を反復注射した後に、望ましくない免疫原性のリスクが存在する可能性がある。
そこで、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質のホモ二量体力価を高く維持しつつ、ヒトＦｃγＲＩ受容体およびＣ１ｑに対する親和性を低減させるために、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃフラグメントに対する様々な変異の検討を行った。
前述のように、ＦｃγＲＩ相互作用を低減する１つの方法では、宿主細胞内でインスリン－Ｆｃ融合タンパク質を合成する際に、Ｆｃフラグメントの脱グリコシル化またはグリコシル化防止が行われる。合成されたインスリン－Ｆｃ融合タンパク質から結合したグリカンを除去する１つの方法として、宿主細胞での生産中にグリカンの結合を完全に防止するためにｃＮｇ部位を変異させることが挙げられる。
ｃＮｇ部位に下線が引かれた、変異型ヒトＩｇＧ１ Ｆｃフラグメントの一般構成は以下の通りであり：
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＸ １ ＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号７７）、
例において、Ｘ１はＳ、Ｄ、Ａ、Ｒ、またはＱである。
配列番号７のインスリンポリペプチドと、配列番号１３のペプチドリンカーと、Ｘ１がＳである（すなわち、ｃＮｇ－ＮＢ１５５－Ｓ変異を有する）配列番号７７のヒトＩｇＧ１ Ｆｃフラグメントと、を含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃフラグメントを、以下に示す：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＳＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号９１）
予想外にも、配列番号９１の非グリコシル化インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の実施形態は、グリコシル化した親物質（配列番号７６）と比べて、ホモ二量体力価が向上することが見出された。さらに、配列番号７６の参照インスリン－Ｆｃ融合タンパク質に対する配列番号９１のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質実施形態の、ビオチン化ＦｃγＲＩ濃度が３０００ｎｇ／ｍＬであるヒトＦｃγＲＩアッセイにおけるＯＤ４５０比は０．５０未満であり、配列番号７６の参照インスリン－Ｆｃ融合タンパク質に対する配列番号９１のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成の、ビオチン化Ｃ１ｑ濃度が１，０００ｎｇ／ｍＬである場合のヒトＣ１ｑ結合アッセイにおけるＯＤ４５０比は０．３５未満であった。しかし、得られた配列番号９１の非グリコシル化インスリン－Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号７６の親グリコシル化インスリン－Ｆｃ融合タンパク質に対して、ＩＲ結合の低減（ＩＲアッセイにおけるＩＣ５０値の増加）と、ＦｃＲｎ結合親和性の低減（ＥＣ５０値の増加）を示し、インビボにおける滞留時間の許容できない減少に伴って生物活性の許容できない低減を示す可能性が高いことが示された。
インスリン－Ｆｃ融合タンパク質
本明細書において、インスリンポリペプチドと、Ｆｃフラグメントと、当該インスリンポリペプチドと当該Ｆｃフラグメントとの間のリンカーと、を含む、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成が提供される。実施形態において、インスリンポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端へ以下の配向で各ドメインを含む：
（Ｎ末端）－－Ｂ鎖－－Ｃ鎖－－Ａ鎖－－（Ｃ末端）。
実施形態において、インスリンポリペプチドは、ＦｃフラグメントのＮ末端側に位置する。実施形態において、上記融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ以下の配向で各ドメインを含む：
（Ｎ末端）－－インスリンポリペプチド－－リンカー－－Ｆｃフラグメント－－（Ｃ末端）（例えば、（Ｎ末端）－－Ｂ鎖－－Ｃ鎖－－Ａ鎖－－リンカー－－Ｆｃフラグメント－－（Ｃ末端））（図１に図示）。
イヌインスリン－Ｆｃ融合タンパク質
実施形態において、配列番号５の好ましい非免疫原性生物活性インスリンポリペプチドを、配列番号１３の好ましいリンカーを用いて、配列番号１５の好ましいイヌＩｇＧＢ Ｆｃフラグメントと組み合わせたところ、イヌにおける一連の反復注射の３回目の注射の後、５０ｍｇ／Ｌを超えるホモ二量体力価、イヌにおいて１５０％ＦＢＧＬ・日・ｋｇ／ｍｇを超えるＮＡＯＣ値、および、０．５を超えるＮＡＯＣＲ値を示す、配列番号２０の、高いホモ二量体力価をもたらす、非凝集性の、生物活性を有する、非免疫原性の、イヌインスリン－Ｆｃ融合構成ファミリーが得られた。以下は配列番号２０を示しており、非天然型のアミノ酸には下線が引かれており：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＸ １ ＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＸ ２ ＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＸ ３ ＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＮＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号２０）、
Ｘ１はＤではなく、Ｘ２はＨではなく、Ｘ３は存在しないかＮである。
配列番号２０を含むイヌインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の好ましい実施形態においては、Ｘ１はＨであり、Ｘ２はＴであり、Ｘ３は存在しないかＮである。セレクションにより、イヌにおける一連の反復注射の３回目の注射の後、５０ｍｇ／Ｌを超えるホモ二量体力価、イヌにおいて１５０％ＦＢＧＬ・日・ｋｇ／ｍｇを超えるＮＡＯＣ値、および、０．５を超えるＮＡＯＣＲ値を示す、配列番号２１の、高いホモ二量体力価をもたらす、非凝集性の、生物活性を有する、非免疫原性の、イヌインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成が得られる。以下は配列番号２１を示しており、非天然型のアミノ酸には下線が引かれており：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＸ ３ ＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＮＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号２１）、
Ｘ３は存在しないかＮである。
好ましい実施形態において、配列番号２１においてＸ３が存在しない場合、イヌにおける一連の反復注射の３回目の注射の後、５０ｍｇ／Ｌを超えるホモ二量体力価、イヌにおいて１５０％ＦＢＧＬ・日・ｋｇ／ｍｇを超えるＮＡＯＣ値、および、０．５を超えるＮＡＯＣＲ値を示す、配列番号２６の、高いホモ二量体をもたらす、非凝集性の、生物活性を有する、非免疫原性の、イヌインスリン－Ｆｃ融合タンパク質が得られる。以下は配列番号２６を示しており、非天然型のアミノ酸には下線が引かれている：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＮＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号２６）。
好ましい実施形態において、配列番号２１においてＸ３がＮである場合、イヌにおける一連の反復注射の３回目の注射の後、５０ｍｇ／Ｌを超えるホモ二量体力価、イヌにおいて１５０％ＦＢＧＬ・日・ｋｇ／ｍｇを超えるＮＡＯＣ値、および、０．５を超えるＮＡＯＣＲ値を示す、配列番号２８の、高いホモ二量体力価をもたらす、非凝集性の、生物活性を有する、非免疫原性の、イヌインスリン－Ｆｃ融合タンパク質が得られる。以下は配列番号２８を示しており、非天然型のアミノ酸には下線が引かれている：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＮＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＮＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号２８）。
好ましい実施形態において、配列番号１８の好ましい非グリコシル化ｃＮｇ－Ｓ変異型イヌＩｇＧＢ Ｆｃフラグメントを、配列番号１３の好ましいリンカーを用いて、配列番号９の好ましいＢ１６Ａ変異型インスリンポリペプチド配列と組み合わせると、イヌにおける一連の反復注射の３回目の注射の後、５０ｍｇ／Ｌを超えるホモ二量体力価、イヌにおいて１５０％ＦＢＧＬ・日・ｋｇ／ｍｇを超えるＮＡＯＣ値、および、０．５を超えるＮＡＯＣＲ値を示す、配列番号２２の、高いホモ二量体力価をもたらす、非凝集性の、生物活性を有する、非免疫原性の、イヌインスリン－Ｆｃ融合タンパク質ファミリーが得られる。以下は配列番号２２を示しており、非天然型のアミノ酸には下線が引かれており：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＸ １ ＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＸ ２ ＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＳＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号２２）、
Ｘ１はＤではなく、Ｘ２はＨではない。
好ましい実施形態において、配列番号２２においてＸ１がＨであり、Ｘ２がＴである場合、イヌにおける一連の反復注射の３回目の注射の後、５０ｍｇ／Ｌを超えるホモ二量体力価、イヌにおいて１５０％ＦＢＧＬ・日・ｋｇ／ｍｇを超えるＮＡＯＣ値、および、０．５を超えるＮＡＯＣＲ値を示す、配列番号３０の、高いホモ二量体力価をもたらす、非凝集性の、生物活性を有する、非免疫原性の、イヌインスリン－Ｆｃ融合タンパク質が得られる。以下は配列番号３０を示しており、非天然型のアミノ酸には下線が引かれている：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＳＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号３０）。
配列番号３０の、製造性と有効性が高い、超長時間作用型イヌインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の実施形態が予想外にも発見されたことにより、本発明者らは、ヒト患者用の、同様の製造性と有効性を有する、超長時間作用型インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成をつくり出す試みを行った。
ヒトインスリン－Ｆｃ融合タンパク質
他の非グリコシル化インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成が同じ挙動を示すかどうかを判定するための、さらなる実験を行った。ｃＮｇ部位に下線が引かれた、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃフラグメントの一般構成は以下の通りであり：
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＸ １ ＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号７７）、
Ｘ１はＳ、Ｄ、Ａ、Ｒ、またはＱである。
配列番号７のインスリンポリペプチド（Ｂ１６Ａ変異なし）と、配列番号１３のリンカーと、グリコシル化を防ぐためのｃＮｇ変異を有していてもよいヒトＩｇＧ１ Ｆｃフラグメントの構成（配列番号７７、Ｘ１はＳ、Ｄ、Ａ、Ｒ、またはＱ）と、を含むインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の実施形態を、以下に示す：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＳＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号９１）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＤＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号９２）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＡＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号９３）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＲＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号９４）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＱＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号９５）
配列番号１３の好ましいリンカーを用いた、配列番号７のインスリンポリペプチドと、Ｘ１がＳ（ｃＮｇ－ＮＢ１５５－Ｓ：配列番号９１）、Ｄ（ｃＮｇ－ＮＢ１５５－Ｄ：配列番号９２）、Ａ（ｃＮｇ－ＮＢ１５５－Ａ：配列番号９３）、Ｒ（ｃＮｇ－ＮＢ１５５－Ｒ：配列番号９４）、またはＱ（ｃＮｇ－ＮＢ１５５－Ｑ：配列番号９５）である配列番号７７のヒトＩｇＧ１ Ｆｃフラグメントと、を含む実施形態においては、予想外にも、これらの非グリコシル化インスリン－Ｆｃ融合タンパク質のそれぞれが、グリコシル化型の親物質（配列番号７６）と比べて、ホモ二量体力価の向上を示すことが発見された。さらに、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、および配列番号９５の、脱グリコシル化インスリン－Ｆｃ融合タンパク質のそれぞれについては、ビオチン化ＦｃγＲＩ濃度が３０００ｎｇ／ｍＬである場合のヒトＦｃγＲＩアッセイにおけるＯＤ４５０比（ＯＤ４５０比算出に使用される参照インスリン－Ｆｃ融合タンパク質が配列番号７６のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質である場合）は全て０．５０未満であり、ビオチン化Ｃ１ｑ濃度が１，０００ｎｇ／ｍＬである場合のヒトＣ１ｑ結合アッセイにおけるＯＤ４５０比（ＯＤ４５０比算出に使用される参照インスリン－Ｆｃ融合タンパク質が配列番号７６のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質である場合）は全て０．３５未満であった。しかし、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、および配列番号９５の脱グリコシル化インスリン－Ｆｃ融合タンパク質は、その全てが、グリコシル化型の親物質（配列番号７６）と比べて、ＩＲ結合親和性が低く（ＩＲアッセイにおけるＩＣ５０値が高い）、ＦｃＲｎ結合親和性が低くなる（ＥＣ５０値が高い）ことが明らかとなり、これらの化合物が、インビボにおける生物活性および滞留時間の許容できない低減を示す可能性が高いことが示された。予想外にも、配列番号１３の好ましいリンカーを用いた、配列番号７のインスリンポリペプチドと、Ｘ１がＱである配列番号７７のヒトＩｇＧ１ Ｆｃフラグメントと、を含む実施形態（配列番号９５）においては、得られた非グリコシル化インスリン－Ｆｃ融合タンパク質は、ホモ二量体力価が１３６ｍｇ／Ｌであり、このインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成では、ホモ二量体力価の設計目標である１５０ｍｇ／Ｌが達成されなかった。
図２８は、配列番号７５（天然ヒトＩｇＧ２を含む）および配列番号７６（天然ヒトＩｇＧ１を含む）、並びに、配列番号７７のバリアントを含む配列である、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、および配列番号９５の、並列配列比較を示している。「＊」は、所与の配列位置において全ての配列間で完全に相同であることを示しており、一方、「：」、「．」、空白は、それぞれ、所与の配列位置における配列間のアミノ酸変異が保存的であること、中程度であること、または全く異なるものであること、を示している。
前述のイヌインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成に関する予想外の結果から学んだことを適用して、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、および配列番号９４のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の実施形態におけるインスリンポリペプチドのＢ鎖上の第１６アミノ酸（Ｂ１６）をアラニンに変異させた結果、配列番号７８（ｃＮｇ－ＮＢ１５５－Ｓを有する）、配列番号８０（ｃＮｇ－ＮＢ１５５－Ｄを有する）、配列番号８２（ｃＮｇ－ＮＢ１５５－Ａを有する）、配列番号８４（ｃＮｇ－ＮＢ１５５－Ｒを有する）が得られた。上記の通りＢ１６アミノ酸をアラニンに変異させて、配列番号１０のインスリンポリペプチドを得た場合の、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、および配列番号８４のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成においては、ホモ二量体力価の増加も、ＦｃγＲＩ結合親和性およびＣ１ｑ結合親和性の低減も損なうことなく、許容できるインスリン受容体結合が予想外に回復した（すなわち、ＩＲ結合親和性およびＦｃＲｎ受容体結合親和性が顕著に増加した）。
好ましい実施形態において、配列番号７８のヒトインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成は、配列番号１０のインスリンポリペプチドと、配列番号１３のリンカーと、配列番号７７のヒトＩｇＧ１ ＦｃフラグメントのｃＮｇ－ＮＢ１５５－Ｓ変異体と、を含む。配列番号７８のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質は、１５０ｍｇ／Ｌを超えるホモ二量体力価を示す。以下は、Ｂ１６Ａ変異およびｃＮｇ－ＮＢ１５５－Ｓ変異に下線が引かれた、配列番号７８のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質を示している：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＳＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号７８）。
イヌインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成での予想外の発見と同様に、Ｂ１６Ａ変異と、ｃＮｇ－ＮＢ１５５－Ｓ変異を有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃフラグメントと、を含む、配列番号７８の非グリコシル化インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の実施形態の生物活性は、Ｂ１６Ａ変異を含んでいない、配列番号９１の非グリコシル化インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の実施形態の生物活性と比較して、予想外に回復した（すなわち、ＩＲ結合親和性およびＦｃＲｎ受容体結合親和性が顕著に増加した）。配列番号７８のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の実施形態は、ＩＲアッセイにおけるＩＣ５０値が２４００ｎＭ未満、より好ましくは２０００ｎＭ未満であり、ヒトＦｃＲｎアッセイにおけるＥＣ５０値が１５００ｎｇ／Ｌ未満、より好ましくは１０００ｎｇ／ｍＬ未満であり、ビオチン化ＦｃγＲＩ濃度が３，０００ｎｇ／ｍＬである場合のヒトＦｃγＲＩアッセイにおけるＯＤ４５０比（ＯＤ４５０比算出に使用された参照インスリン－Ｆｃ融合タンパク質が配列番号７６のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質である場合）が０．５０未満であり、ビオチン化Ｃ１ｑ濃度が１，０００ｎｇ／ｍＬである場合のヒトＣ１ｑ結合アッセイにおけるＯＤ４５０比（ＯＤ４５０比算出に使用された参照インスリン－Ｆｃ融合タンパク質が配列番号７６のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質である場合）が０．３５未満であることが分かった。
好ましい実施形態において、配列番号８０のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１０のインスリンポリペプチドと、配列番号１３のリンカーと、配列番号７７（Ｘ１はＤ）のＦｃフラグメントのｃＮｇ－ＮＢ１５５－Ｄ変異体と、を含む。配列番号８０のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質は、ホモ二量体力価が１５０ｍｇ／Ｌを超え、ＩＲアッセイにおけるＩＣ５０値が２４００ｎＭ未満であり、ヒトＦｃＲｎアッセイにおけるＥＣ５０値が１０００ｎｇ／ｍＬ未満であり、ビオチン化ＦｃγＲＩ濃度が３，０００ｎｇ／ｍＬである場合のヒトＦｃγＲＩアッセイにおけるＯＤ４５０比が０．５０未満であり、ビオチン化Ｃ１ｑ濃度が１，０００ｎｇ／ｍＬである場合のヒトＣ１ｑ結合アッセイにおけるＯＤ４５０比が０．３５未満であった。以下は、Ｂ１６Ａ変異およびｃＮｇ－ＮＢ１５５－Ｄ変異に下線が引かれた、配列番号８０を示している：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＤＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号８０）。
好ましい実施形態において、配列番号８２のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１０のインスリンポリペプチドと、配列番号１３のリンカーと、配列番号７７（Ｘ１はＡ）のＦｃフラグメントのｃＮｇ－ＮＢ１５５－Ａ変異体と、を含む。配列番号８２のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質は、ホモ二量体力価が１５０ｍｇ／Ｌを超え、ＩＲアッセイにおけるＩＣ５０値が２４００ｎＭ未満であり、ヒトＦｃＲｎアッセイにおけるＥＣ５０値が１０００ｎｇ／ｍＬ未満であり、ビオチン化ＦｃγＲＩ濃度が３，０００ｎｇ／ｍＬである場合のヒトＦｃγＲＩアッセイにおけるＯＤ４５０比が０．５０未満であり、ビオチン化Ｃ１ｑ濃度が１，０００ｎｇ／ｍＬである場合のヒトＣ１ｑ結合アッセイにおけるＯＤ４５０比が０．３５未満であった。以下は、Ｂ１６Ａ変異およびｃＮｇ－ＮＢ１５５－Ａ変異に下線が引かれた、配列番号８２を示している：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＡＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号８２）。
好ましい実施形態において、配列番号８４のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１０のインスリンポリペプチドと、配列番号１３のリンカーと、配列番号７７（Ｘ１はＲ）のＦｃフラグメントのｃＮｇ－ＮＢ１５５－Ｒ変異体と、を含む。配列番号８４のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質は、ホモ二量体力価が１５０ｍｇ／Ｌを超え、ＩＲアッセイにおけるＩＣ５０値が２４００ｎＭ未満であり、ヒトＦｃＲｎアッセイにおけるＥＣ５０値が１０００ｎｇ／ｍＬ未満であり、ビオチン化ＦｃγＲＩ濃度が３，０００ｎｇ／ｍＬである場合のヒトＦｃγＲＩアッセイにおけるＯＤ４５０比が０．５０未満であり、ビオチン化Ｃ１ｑ濃度が１，０００ｎｇ／ｍＬである場合のヒトＣ１ｑ結合アッセイにおけるＯＤ４５０比が０．３５未満であった。以下は、Ｂ１６Ａ変異およびｃＮｇ－ＮＢ１５５－Ｒ変異に下線が引かれた、配列番号８４を示している：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＲＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号８４）。
配列番号７８での場合のように、ｃＮｇ－ＮＢ１５５－Ｄ変異、ｃＮｇ－ＮＢ１５５－Ａ変異、ｃＮｇ－ＮＢ１５５－Ｒ変異、およびｃＮｇ－ＮＢ１５５－Ｑ変異を有する各ヒトＩｇＧ１ Ｆｃフラグメントを含む非グリコシル化インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成（配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、および配列番号９５）の生物活性は、当該インスリンポリペプチドのＢ鎖上の第１６番アミノ酸（Ｂ１６）をアラニンに変異させた（配列番号１０のインスリンポリペプチドを得た）場合、配列番号９２、配列番号９３、および配列番号９４の非グリコシル化インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成の、ホモ二量体力価の増加も、ＦｃγＲＩ結合親和性およびＣ１ｑ結合親和性の低減も損なうことなく、回復した（すなわち、すなわち、ＩＲ結合親和性およびＦｃＲｎ受容体結合親和性が顕著に増加した）（前述の通り、配列番号９５のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成のホモ二量体力価は設計目標である１５０ｍｇ／Ｌを達成しなかった）。
しかし、配列番号１０のインスリンポリペプチドと、配列番号１３のリンカーと、配列番号７７（Ｘ１はＱ）のＦｃフラグメントのｃＮｇ－ＮＢ１５５－Ｑ変異体と、を含む配列番号８６のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号９５の非グリコシル化インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成の、ＦｃγＲＩ結合親和性およびＣ１ｑ結合親和性における低減を示さなかったが、配列番号８６のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成のホモ二量体力価は、配列番号９５のホモ二量体力価から１１１ｍｇ／Ｌまでさらに低下しており、１５０ｍｇ／Ｌを超えるホモ二量体力価という、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の設計目標を達成していない。以下は、Ｂ１６Ａ変異およびｃＮｇ－ＮＢ１５５－Ｑ変異に下線が引かれた、配列番号８６を示している：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＱＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号８６）。
これらの結果から、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃフラグメント上のｃＮｇ変異の選択と、インスリンポリペプチドの組成との間には、予想外且つ顕著な相互作用があることが示されたため、得られるインスリン－Ｆｃ融合タンパク質のＩＲ結合親和性およびＦｃＲｎ結合親和性に関して好ましい構成を特定するための実験法が必要である。
いくつかの構成において、本明細書に記載のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成は、Ｎ末端にリーダーアミノ酸配列を含まない。他の構成において、本明細書に記載のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成は、Ｎ末端などに、リーダー配列を含む。いくつかの実施形態において、例示的なリーダー配列としては、アミノ酸配列：
ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ（配列番号２４）
が挙げられる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成は、細胞（例えば、真核細胞、例えば、哺乳類細胞）での発現（例えば、組み換え発現）などのためのリーダー配列を含む核酸分子にコードされている。ある実施形態では、リーダー配列は、細胞培養などにおいて、発現中に切断される。リーダー配列をコードする例示的な核酸配列としては、核酸配列：
ａｔｇｇａａｔｇｇａｇｃｔｇｇｇｔｃｔｔｔｃｔｃｔｔｃｔｔｃｃｔｇｔｃａｇｔａａｃｇａｃｔｇｇｔｇｔｃｃａｃｔｃｃ（配列番号２３）
が挙げられる。実施形態において、配列番号２３の例示的な核酸は、配列番号２４の例示的なリーダー配列をコードする。
配列番号７８のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成を含む好ましい実施形態において、核酸配列（リーダー配列は下線部）は以下である：
ａｔｇｇａａｔｇｇａｇｃｔｇｇｇｔｃｔｔｔｃｔｃｔｔｃｔｔｃｃｔｇｔｃａｇｔａａｃｇａｃｔｇｇｔｇｔｃｃａｃｔｃｃｔｔｃｇｔｇａａｃｃａｇｃａｃｃｔｇｔｇｃｇｇｃｔｃｃｃａｃｃｔｇｇｔｇｇａａｇｃｔｃｔｇｇｃａｃｔｃｇｔｇｔｇｃｇｇｃｇａｇｃｇｇｇｇｃｔｔｃｃａｃｔａｃｇｇｇｇｇｔｇｇｃｇｇａｇｇａｇｇｔｔｃｔｇｇｔｇｇｃｇｇｃｇｇａｇｇｃａｔｃｇｔｇｇａａｃａｇｔｇｃｔｇｃａｃｃｔｃｃａｃｃｔｇｃｔｃｃｃｔｇｇａｃｃａｇｃｔｇｇａａａａｃｔａｃｔｇｃｇｇｔｇｇｃｇｇａｇｇｔｇｇｔｃａａｇｇａｇｇｃｇｇｔｇｇａｃａｇｇｇｔｇｇａｇｇｔｇｇｇｃａｇｇｇａｇｇａｇｇｃｇｇｇｇｇａｇａｃａａａａｃｔｃａｃａｃａｔｇｃｃｃａｃｃｇｔｇｃｃｃａｇｃａｃｃｔｇａａｃｔｃｃｔｇｇｇｇｇｇａｃｃｇｔｃａｇｔｃｔｔｃｃｔｃｔｔｃｃｃｃｃｃａａａａｃｃｃａａｇｇａｃａｃｃｃｔｃａｔｇａｔｃｔｃｃｃｇｇａｃｃｃｃｔｇａｇｇｔｃａｃａｔｇｃｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇａｃｇｔｇａｇｃｃａｃｇａａｇａｃｃｃｔｇａｇｇｔｃａａｇｔｔｃａａｃｔｇｇｔａｃｇｔｇｇａｃｇｇｃｇｔｇｇａｇｇｔｇｃａｔａａｔｇｃｃａａｇａｃａａａｇｃｃｇｃｇｇｇａｇｇａｇｃａｇｔａｃａｇｃａｇｃａｃｇｔａｃｃｇｔｇｔｇｇｔｃａｇｃｇｔｃｃｔｃａｃｃｇｔｃｃｔｇｃａｃｃａｇｇａｃｔｇｇｃｔｇａａｔｇｇｃａａｇｇａｇｔａｃａａｇｔｇｃａａｇｇｔｃｔｃｃａａｃａａａｇｃｃｃｔｃｃｃａｇｃｃｃｃｃａｔｃｇａｇａａａａｃｃａｔｃｔｃｃａａａｇｃｃａａａｇｇｇｃａｇｃｃｃｃｇａｇａａｃｃａｃａｇｇｔｇｔａｃａｃｃｃｔｇｃｃｃｃｃａｔｃｃｃｇｇｇａｔｇａｇｃｔｇａｃｃａａｇａａｃｃａｇｇｔｃａｇｃｃｔｇａｃｃｔｇｃｃｔｇｇｔｃａａａｇｇｃｔｔｃｔａｔｃｃｃａｇｃｇａｃａｔｃｇｃｃｇｔｇｇａｇｔｇｇｇａｇａｇｃａａｔｇｇｇｃａｇｃｃｇｇａｇａａｃａａｃｔａｃａａｇａｃｃａｃｇｃｃｔｃｃｃｇｔｇｃｔｇｇａｃｔｃｃｇａｃｇｇｃｔｃｃｔｔｃｔｔｃｃｔｃｔａｃａｇｃａａｇｃｔｃａｃｃｇｔｇｇａｃａａｇａｇｃａｇｇｔｇｇｃａｇｃａｇｇｇｇａａｃｇｔｃｔｔｃｔｃａｔｇｃｔｃｃｇｔｇａｔｇｃａｔｇａｇｇｃｔｃｔｇｃａｃａａｃｃａｃｔａｃａｃｇｃａｇａａｇａｇｃｃｔｃｔｃｃｃｔｇｔｃｔｃｃｇｇｇｔｔａｇ（配列番号７９）。
配列番号８０のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成を含む好ましい実施形態において、核酸配列（リーダー配列は下線部）は以下である：
ａｔｇｇａａｔｇｇａｇｃｔｇｇｇｔｃｔｔｔｃｔｃｔｔｃｔｔｃｃｔｇｔｃａｇｔａａｃｇａｃｔｇｇｔｇｔｃｃａｃｔｃｃｔｔｃｇｔｇａａｃｃａｇｃａｃｃｔｇｔｇｃｇｇｃｔｃｃｃａｃｃｔｇｇｔｇｇａａｇｃｔｃｔｇｇｃａｃｔｃｇｔｇｔｇｃｇｇｃｇａｇｃｇｇｇｇｃｔｔｃｃａｃｔａｃｇｇｇｇｇｔｇｇｃｇｇａｇｇａｇｇｔｔｃｔｇｇｔｇｇｃｇｇｃｇｇａｇｇｃａｔｃｇｔｇｇａａｃａｇｔｇｃｔｇｃａｃｃｔｃｃａｃｃｔｇｃｔｃｃｃｔｇｇａｃｃａｇｃｔｇｇａａａａｃｔａｃｔｇｃｇｇｔｇｇｃｇｇａｇｇｔｇｇｔｃａａｇｇａｇｇｃｇｇｔｇｇａｃａｇｇｇｔｇｇａｇｇｔｇｇｇｃａｇｇｇａｇｇａｇｇｃｇｇｇｇｇａｇａｃａａａａｃｔｃａｃａｃａｔｇｃｃｃａｃｃｇｔｇｃｃｃａｇｃａｃｃｔｇａａｃｔｃｃｔｇｇｇｇｇｇａｃｃｇｔｃａｇｔｃｔｔｃｃｔｃｔｔｃｃｃｃｃｃａａａａｃｃｃａａｇｇａｃａｃｃｃｔｃａｔｇａｔｃｔｃｃｃｇｇａｃｃｃｃｔｇａｇｇｔｃａｃａｔｇｃｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇａｃｇｔｇａｇｃｃａｃｇａａｇａｃｃｃｔｇａｇｇｔｃａａｇｔｔｃａａｃｔｇｇｔａｃｇｔｇｇａｃｇｇｃｇｔｇｇａｇｇｔｇｃａｔａａｔｇｃｃａａｇａｃａａａｇｃｃｇｃｇｇｇａｇｇａｇｃａｇｔａｃｇａｃａｇｃａｃｇｔａｃｃｇｔｇｔｇｇｔｃａｇｃｇｔｃｃｔｃａｃｃｇｔｃｃｔｇｃａｃｃａｇｇａｃｔｇｇｃｔｇａａｔｇｇｃａａｇｇａｇｔａｃａａｇｔｇｃａａｇｇｔｃｔｃｃａａｃａａａｇｃｃｃｔｃｃｃａｇｃｃｃｃｃａｔｃｇａｇａａａａｃｃａｔｃｔｃｃａａａｇｃｃａａａｇｇｇｃａｇｃｃｃｃｇａｇａａｃｃａｃａｇｇｔｇｔａｃａｃｃｃｔｇｃｃｃｃｃａｔｃｃｃｇｇｇａｔｇａｇｃｔｇａｃｃａａｇａａｃｃａｇｇｔｃａｇｃｃｔｇａｃｃｔｇｃｃｔｇｇｔｃａａａｇｇｃｔｔｃｔａｔｃｃｃａｇｃｇａｃａｔｃｇｃｃｇｔｇｇａｇｔｇｇｇａｇａｇｃａａｔｇｇｇｃａｇｃｃｇｇａｇａａｃａａｃｔａｃａａｇａｃｃａｃｇｃｃｔｃｃｃｇｔｇｃｔｇｇａｃｔｃｃｇａｃｇｇｃｔｃｃｔｔｃｔｔｃｃｔｃｔａｃａｇｃａａｇｃｔｃａｃｃｇｔｇｇａｃａａｇａｇｃａｇｇｔｇｇｃａｇｃａｇｇｇｇａａｃｇｔｃｔｔｃｔｃａｔｇｃｔｃｃｇｔｇａｔｇｃａｔｇａｇｇｃｔｃｔｇｃａｃａａｃｃａｃｔａｃａｃｇｃａｇａａｇａｇｃｃｔｃｔｃｃｃｔｇｔｃｔｃｃｇｇｇｔｔａｇ（配列番号８１）。
配列番号８２のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成を含む実施形態において、核酸配列（リーダー配列は下線部）は以下である：
ａｔｇｇａａｔｇｇａｇｃｔｇｇｇｔｃｔｔｔｃｔｃｔｔｃｔｔｃｃｔｇｔｃａｇｔａａｃｇａｃｔｇｇｔｇｔｃｃａｃｔｃｃｔｔｃｇｔｇａａｃｃａｇｃａｃｃｔｇｔｇｃｇｇｃｔｃｃｃａｃｃｔｇｇｔｇｇａａｇｃｔｃｔｇｇｃａｃｔｃｇｔｇｔｇｃｇｇｃｇａｇｃｇｇｇｇｃｔｔｃｃａｃｔａｃｇｇｇｇｇｔｇｇｃｇｇａｇｇａｇｇｔｔｃｔｇｇｔｇｇｃｇｇｃｇｇａｇｇｃａｔｃｇｔｇｇａａｃａｇｔｇｃｔｇｃａｃｃｔｃｃａｃｃｔｇｃｔｃｃｃｔｇｇａｃｃａｇｃｔｇｇａａａａｃｔａｃｔｇｃｇｇｔｇｇｃｇｇａｇｇｔｇｇｔｃａａｇｇａｇｇｃｇｇｔｇｇａｃａｇｇｇｔｇｇａｇｇｔｇｇｇｃａｇｇｇａｇｇａｇｇｃｇｇｇｇｇａｇａｃａａａａｃｔｃａｃａｃａｔｇｃｃｃａｃｃｇｔｇｃｃｃａｇｃａｃｃｔｇａａｃｔｃｃｔｇｇｇｇｇｇａｃｃｇｔｃａｇｔｃｔｔｃｃｔｃｔｔｃｃｃｃｃｃａａａａｃｃｃａａｇｇａｃａｃｃｃｔｃａｔｇａｔｃｔｃｃｃｇｇａｃｃｃｃｔｇａｇｇｔｃａｃａｔｇｃｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇａｃｇｔｇａｇｃｃａｃｇａａｇａｃｃｃｔｇａｇｇｔｃａａｇｔｔｃａａｃｔｇｇｔａｃｇｔｇｇａｃｇｇｃｇｔｇｇａｇｇｔｇｃａｔａａｔｇｃｃａａｇａｃａａａｇｃｃｇｃｇｇｇａｇｇａｇｃａｇｔａｃｇｃｃａｇｃａｃｇｔａｃｃｇｔｇｔｇｇｔｃａｇｃｇｔｃｃｔｃａｃｃｇｔｃｃｔｇｃａｃｃａｇｇａｃｔｇｇｃｔｇａａｔｇｇｃａａｇｇａｇｔａｃａａｇｔｇｃａａｇｇｔｃｔｃｃａａｃａａａｇｃｃｃｔｃｃｃａｇｃｃｃｃｃａｔｃｇａｇａａａａｃｃａｔｃｔｃｃａａａｇｃｃａａａｇｇｇｃａｇｃｃｃｃｇａｇａａｃｃａｃａｇｇｔｇｔａｃａｃｃｃｔｇｃｃｃｃｃａｔｃｃｃｇｇｇａｔｇａｇｃｔｇａｃｃａａｇａａｃｃａｇｇｔｃａｇｃｃｔｇａｃｃｔｇｃｃｔｇｇｔｃａａａｇｇｃｔｔｃｔａｔｃｃｃａｇｃｇａｃａｔｃｇｃｃｇｔｇｇａｇｔｇｇｇａｇａｇｃａａｔｇｇｇｃａｇｃｃｇｇａｇａａｃａａｃｔａｃａａｇａｃｃａｃｇｃｃｔｃｃｃｇｔｇｃｔｇｇａｃｔｃｃｇａｃｇｇｃｔｃｃｔｔｃｔｔｃｃｔｃｔａｃａｇｃａａｇｃｔｃａｃｃｇｔｇｇａｃａａｇａｇｃａｇｇｔｇｇｃａｇｃａｇｇｇｇａａｃｇｔｃｔｔｃｔｃａｔｇｃｔｃｃｇｔｇａｔｇｃａｔｇａｇｇｃｔｃｔｇｃａｃａａｃｃａｃｔａｃａｃｇｃａｇａａｇａｇｃｃｔｃｔｃｃｃｔｇｔｃｔｃｃｇｇｇｔｔａｇ（配列番号８３）。
配列番号８４のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成を含む好ましい実施形態において、核酸配列（リーダー配列は下線部）は以下である：
ａｔｇｇａａｔｇｇａｇｃｔｇｇｇｔｃｔｔｔｃｔｃｔｔｃｔｔｃｃｔｇｔｃａｇｔａａｃｇａｃｔｇｇｔｇｔｃｃａｃｔｃｃｔｔｃｇｔｇａａｃｃａｇｃａｃｃｔｇｔｇｃｇｇｃｔｃｃｃａｃｃｔｇｇｔｇｇａａｇｃｔｃｔｇｇｃａｃｔｃｇｔｇｔｇｃｇｇｃｇａｇｃｇｇｇｇｃｔｔｃｃａｃｔａｃｇｇｇｇｇｔｇｇｃｇｇａｇｇａｇｇｔｔｃｔｇｇｔｇｇｃｇｇｃｇｇａｇｇｃａｔｃｇｔｇｇａａｃａｇｔｇｃｔｇｃａｃｃｔｃｃａｃｃｔｇｃｔｃｃｃｔｇｇａｃｃａｇｃｔｇｇａａａａｃｔａｃｔｇｃｇｇｔｇｇｃｇｇａｇｇｔｇｇｔｃａａｇｇａｇｇｃｇｇｔｇｇａｃａｇｇｇｔｇｇａｇｇｔｇｇｇｃａｇｇｇａｇｇａｇｇｃｇｇｇｇｇａｇａｃａａａａｃｔｃａｃａｃａｔｇｃｃｃａｃｃｇｔｇｃｃｃａｇｃａｃｃｔｇａａｃｔｃｃｔｇｇｇｇｇｇａｃｃｇｔｃａｇｔｃｔｔｃｃｔｃｔｔｃｃｃｃｃｃａａａａｃｃｃａａｇｇａｃａｃｃｃｔｃａｔｇａｔｃｔｃｃｃｇｇａｃｃｃｃｔｇａｇｇｔｃａｃａｔｇｃｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇａｃｇｔｇａｇｃｃａｃｇａａｇａｃｃｃｔｇａｇｇｔｃａａｇｔｔｃａａｃｔｇｇｔａｃｇｔｇｇａｃｇｇｃｇｔｇｇａｇｇｔｇｃａｔａａｔｇｃｃａａｇａｃａａａｇｃｃｇｃｇｇｇａｇｇａｇｃａｇｔａｃａｇａａｇｃａｃｇｔａｃｃｇｔｇｔｇｇｔｃａｇｃｇｔｃｃｔｃａｃｃｇｔｃｃｔｇｃａｃｃａｇｇａｃｔｇｇｃｔｇａａｔｇｇｃａａｇｇａｇｔａｃａａｇｔｇｃａａｇｇｔｃｔｃｃａａｃａａａｇｃｃｃｔｃｃｃａｇｃｃｃｃｃａｔｃｇａｇａａａａｃｃａｔｃｔｃｃａａａｇｃｃａａａｇｇｇｃａｇｃｃｃｃｇａｇａａｃｃａｃａｇｇｔｇｔａｃａｃｃｃｔｇｃｃｃｃｃａｔｃｃｃｇｇｇａｔｇａｇｃｔｇａｃｃａａｇａａｃｃａｇｇｔｃａｇｃｃｔｇａｃｃｔｇｃｃｔｇｇｔｃａａａｇｇｃｔｔｃｔａｔｃｃｃａｇｃｇａｃａｔｃｇｃｃｇｔｇｇａｇｔｇｇｇａｇａｇｃａａｔｇｇｇｃａｇｃｃｇｇａｇａａｃａａｃｔａｃａａｇａｃｃａｃｇｃｃｔｃｃｃｇｔｇｃｔｇｇａｃｔｃｃｇａｃｇｇｃｔｃｃｔｔｃｔｔｃｃｔｃｔａｃａｇｃａａｇｃｔｃａｃｃｇｔｇｇａｃａａｇａｇｃａｇｇｔｇｇｃａｇｃａｇｇｇｇａａｃｇｔｃｔｔｃｔｃａｔｇｃｔｃｃｇｔｇａｔｇｃａｔｇａｇｇｃｔｃｔｇｃａｃａａｃｃａｃｔａｃａｃｇｃａｇａａｇａｇｃｃｔｃｔｃｃｃｔｇｔｃｔｃｃｇｇｇｔｔａｇ（配列番号８５）。
配列番号８６のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成を含む好ましい実施形態において、核酸配列（リーダー配列は下線部）は以下である：
ａｔｇｇａａｔｇｇａｇｃｔｇｇｇｔｃｔｔｔｃｔｃｔｔｃｔｔｃｃｔｇｔｃａｇｔａａｃｇａｃｔｇｇｔｇｔｃｃａｃｔｃｃｔｔｃｇｔｇａａｃｃａｇｃａｃｃｔｇｔｇｃｇｇｃｔｃｃｃａｃｃｔｇｇｔｇｇａａｇｃｔｃｔｇｇｃａｃｔｃｇｔｇｔｇｃｇｇｃｇａｇｃｇｇｇｇｃｔｔｃｃａｃｔａｃｇｇｇｇｇｔｇｇｃｇｇａｇｇａｇｇｔｔｃｔｇｇｔｇｇｃｇｇｃｇｇａｇｇｃａｔｃｇｔｇｇａａｃａｇｔｇｃｔｇｃａｃｃｔｃｃａｃｃｔｇｃｔｃｃｃｔｇｇａｃｃａｇｃｔｇｇａａａａｃｔａｃｔｇｃｇｇｔｇｇｃｇｇａｇｇｔｇｇｔｃａａｇｇａｇｇｃｇｇｔｇｇａｃａｇｇｇｔｇｇａｇｇｔｇｇｇｃａｇｇｇａｇｇａｇｇｃｇｇｇｇｇａｇａｃａａａａｃｔｃａｃａｃａｔｇｃｃｃａｃｃｇｔｇｃｃｃａｇｃａｃｃｔｇａａｃｔｃｃｔｇｇｇｇｇｇａｃｃｇｔｃａｇｔｃｔｔｃｃｔｃｔｔｃｃｃｃｃｃａａａａｃｃｃａａｇｇａｃａｃｃｃｔｃａｔｇａｔｃｔｃｃｃｇｇａｃｃｃｃｔｇａｇｇｔｃａｃａｔｇｃｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇａｃｇｔｇａｇｃｃａｃｇａａｇａｃｃｃｔｇａｇｇｔｃａａｇｔｔｃａａｃｔｇｇｔａｃｇｔｇｇａｃｇｇｃｇｔｇｇａｇｇｔｇｃａｔａａｔｇｃｃａａｇａｃａａａｇｃｃｇｃｇｇｇａｇｇａｇｃａｇｔａｃｃａａａｇｃａｃｇｔａｃｃｇｔｇｔｇｇｔｃａｇｃｇｔｃｃｔｃａｃｃｇｔｃｃｔｇｃａｃｃａｇｇａｃｔｇｇｃｔｇａａｔｇｇｃａａｇｇａｇｔａｃａａｇｔｇｃａａｇｇｔｃｔｃｃａａｃａａａｇｃｃｃｔｃｃｃａｇｃｃｃｃｃａｔｃｇａｇａａａａｃｃａｔｃｔｃｃａａａｇｃｃａａａｇｇｇｃａｇｃｃｃｃｇａｇａａｃｃａｃａｇｇｔｇｔａｃａｃｃｃｔｇｃｃｃｃｃａｔｃｃｃｇｇｇａｔｇａｇｃｔｇａｃｃａａｇａａｃｃａｇｇｔｃａｇｃｃｔｇａｃｃｔｇｃｃｔｇｇｔｃａａａｇｇｃｔｔｃｔａｔｃｃｃａｇｃｇａｃａｔｃｇｃｃｇｔｇｇａｇｔｇｇｇａｇａｇｃａａｔｇｇｇｃａｇｃｃｇｇａｇａａｃａａｃｔａｃａａｇａｃｃａｃｇｃｃｔｃｃｃｇｔｇｃｔｇｇａｃｔｃｃｇａｃｇｇｃｔｃｃｔｔｃｔｔｃｃｔｃｔａｃａｇｃａａｇｃｔｃａｃｃｇｔｇｇａｃａａｇａｇｃａｇｇｔｇｇｃａｇｃａｇｇｇｇａａｃｇｔｃｔｔｃｔｃａｔｇｃｔｃｃｇｔｇａｔｇｃａｔｇａｇｇｃｔｃｔｇｃａｃａａｃｃａｃｔａｃａｃｇｃａｇａａｇａｇｃｃｔｃｔｃｃｃｔｇｔｃｔｃｃｇｇｇｔｔａｇ（配列番号１００）。
用途によっては、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質に対して共有結合修飾を行うことで、その特性をさらに改変することが望ましい場合がある。例えば、Ｄｏｚｉｅｒ，Ｊ．；Ｄｉｓｔｅｆａｎｏ，Ｍ．、Ｓｉｔｅ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．、２０１５年、１６巻（１０号）、ｐｐ２５８３１～２５８６４）に記載されているように、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質を、様々な長さのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子に複合することで、その循環半減期をさらに延長させてもよい。１つのそのような複合法は、アシル転移反応を介して一級アミン（例えば、ＰＥＧ分子の末端）とグルタミン（例えば標的タンパク質上のＱ、例えば標的インスリン－Ｆｃ融合タンパク質上のＱ）のカルボキサミド基との間に共有結合を形成する、トランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）と呼ばれる酵素クラスに基づくものである（Ｄｏｚｉｅｒ，Ｊ．；Ｄｉｓｔｅｆａｎｏ，Ｍ．、ｐ２５８５３）。配列番号８６および配列番号９５のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質のＮＢ１５３位のＱは、好ましいＴＧａｓｅ結合部位であるが、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質はそれぞれがＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧ（配列番号１３）リンカーを含んでいるため、そのリンカーも当該Ｑ残基に結合することとなる。そのため、リンカーのＱ部位における望ましくないＴＧａｓｅ結合を最小限にするため、リンカーにおけるグルタミン（Ｑ）のアラニン（Ａ）への変異を調べた。従って、好ましい実施形態において、配列番号８７のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１０のインスリンポリペプチドと、ＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＧ（配列番号６７）のリンカーと、配列番号７７（Ｘ１はＳ）のＦｃフラグメントのｃＮｇ－ＮＢ１５５－Ｓ変異体と、を含む。配列番号８７のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質は、ホモ二量体力価が１５０ｍｇ／Ｌを超え、ＩＲアッセイにおけるＩＣ５０値が２４００ｎＭ未満であり、ヒトＦｃＲｎアッセイにおけるＥＣ５０値が１０００ｎｇ／ｍＬ未満であり、ビオチン化ＦｃγＲＩ濃度が３，０００ｎｇ／ｍＬである場合のヒトＦｃγＲＩアッセイにおけるＯＤ４５０比が０．５０未満であり、ビオチン化Ｃ１ｑ濃度が１，０００ｎｇ／ｍＬである場合のヒトＣ１ｑ結合アッセイにおけるＯＤ４５０比が０．３５未満であった。以下は、Ｂ１６Ａ変異およびｃＮｇ－ＮＢ１５５－Ｓ変異、並びにリンカー配列に下線が引かれた、配列番号８７を示している：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＧＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＳＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号８７）。
配列番号８７のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質を含む実施形態において、核酸配列（リーダー配列は下線部）は以下である：
ａｔｇｇａａｔｇｇａｇｃｔｇｇｇｔｃｔｔｔｃｔｃｔｔｃｔｔｃｃｔｇｔｃａｇｔａａｃｇａｃｔｇｇｔｇｔｃｃａｃｔｃｃｔｔｃｇｔｇａａｃｃａｇｃａｃｃｔｇｔｇｃｇｇｃｔｃｃｃａｃｃｔｇｇｔｇｇａａｇｃｔｃｔｇｇｃａｃｔｃｇｔｇｔｇｃｇｇｃｇａｇｃｇｇｇｇｃｔｔｃｃａｃｔａｃｇｇｇｇｇｔｇｇｃｇｇａｇｇａｇｇｔｔｃｔｇｇｔｇｇｃｇｇｃｇｇａｇｇｃａｔｃｇｔｇｇａａｃａｇｔｇｃｔｇｃａｃｃｔｃｃａｃｃｔｇｃｔｃｃｃｔｇｇａｃｃａｇｃｔｇｇａａａａｃｔａｃｔｇｃｇｇｔｇｇｃｇｇａｇｇｔｇｇｔｇｃａｇｇａｇｇｃｇｇｔｇｇａｇｃｃｇｇｔｇｇａｇｇｔｇｇｇｇｃｔｇｇａｇｇａｇｇｃｇｇｇｇｇａｇａｃａａａａｃｔｃａｃａｃａｔｇｃｃｃａｃｃｇｔｇｃｃｃａｇｃａｃｃｔｇａａｃｔｃｃｔｇｇｇｇｇｇａｃｃｇｔｃａｇｔｃｔｔｃｃｔｃｔｔｃｃｃｃｃｃａａａａｃｃｃａａｇｇａｃａｃｃｃｔｃａｔｇａｔｃｔｃｃｃｇｇａｃｃｃｃｔｇａｇｇｔｃａｃａｔｇｃｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇａｃｇｔｇａｇｃｃａｃｇａａｇａｃｃｃｔｇａｇｇｔｃａａｇｔｔｃａａｃｔｇｇｔａｃｇｔｇｇａｃｇｇｃｇｔｇｇａｇｇｔｇｃａｔａａｔｇｃｃａａｇａｃａａａｇｃｃｇｃｇｇｇａｇｇａｇｃａｇｔａｃａｇｃａｇｃａｃｇｔａｃｃｇｔｇｔｇｇｔｃａｇｃｇｔｃｃｔｃａｃｃｇｔｃｃｔｇｃａｃｃａｇｇａｃｔｇｇｃｔｇａａｔｇｇｃａａｇｇａｇｔａｃａａｇｔｇｃａａｇｇｔｃｔｃｃａａｃａａａｇｃｃｃｔｃｃｃａｇｃｃｃｃｃａｔｃｇａｇａａａａｃｃａｔｃｔｃｃａａａｇｃｃａａａｇｇｇｃａｇｃｃｃｃｇａｇａａｃｃａｃａｇｇｔｇｔａｃａｃｃｃｔｇｃｃｃｃｃａｔｃｃｃｇｇｇａｔｇａｇｃｔｇａｃｃａａｇａａｃｃａｇｇｔｃａｇｃｃｔｇａｃｃｔｇｃｃｔｇｇｔｃａａａｇｇｃｔｔｃｔａｔｃｃｃａｇｃｇａｃａｔｃｇｃｃｇｔｇｇａｇｔｇｇｇａｇａｇｃａａｔｇｇｇｃａｇｃｃｇｇａｇａａｃａａｃｔａｃａａｇａｃｃａｃｇｃｃｔｃｃｃｇｔｇｃｔｇｇａｃｔｃｃｇａｃｇｇｃｔｃｃｔｔｃｔｔｃｃｔｃｔａｃａｇｃａａｇｃｔｃａｃｃｇｔｇｇａｃａａｇａｇｃａｇｇｔｇｇｃａｇｃａｇｇｇｇａａｃｇｔｃｔｔｃｔｃａｔｇｃｔｃｃｇｔｇａｔｇｃａｔｇａｇｇｃｔｃｔｇｃａｃａａｃｃａｃｔａｃａｃｇｃａｇａａｇａｇｃｃｔｃｔｃｃｃｔｇｔｃｔｃｃｇｇｇｔｔａｇ（配列番号８８）。
Ｆｃ融合タンパク質複合体におけるリンカーの長さは、収量から生物活性の範囲にわたって、当該融合タンパク質の特徴に影響を与えることが知られている。従って、リンカーを短くしたインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成を試験にかけ、リンカーの長さによる収量や機能の増減を求めた。別の好ましい実施形態において、配列番号８９のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１０のインスリンポリペプチドと、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧ（配列番号１１）のリンカーと、配列番号７７（Ｘ１はＳ）のＦｃフラグメントのｃＮｇ－ＮＢ１５５－Ｓ変異体と、を含む。配列番号８９のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質は、ホモ二量体力価が１５０ｍｇ／Ｌを超え、ＩＲアッセイにおけるＩＣ５０値が２４００ｎＭ未満であり、ヒトＦｃＲｎアッセイにおけるＥＣ５０値が１０００ｎｇ／ｍＬ未満であり、ビオチン化ＦｃγＲＩ濃度が３，０００ｎｇ／ｍＬである場合のヒトＦｃγＲＩアッセイにおけるＯＤ４５０比が０．５０未満であり、ビオチン化Ｃ１ｑ濃度が１，０００ｎｇ／ｍＬである場合のヒトＣ１ｑ結合アッセイにおけるＯＤ４５０比が０．３５未満であった。
以下は、Ｂ１６Ａ変異およびｃＮｇ－ＮＢ１５５－Ｓ変異、並びにリンカー配列に下線が引かれた、配列番号８９を示している：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＡＧＧＧＧＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＳＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号８９）。
配列番号８９のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質を含む実施形態において、核酸配列（リーダー配列は下線部）は以下である：
ａｔｇｇａａｔｇｇａｇｃｔｇｇｇｔｃｔｔｔｃｔｃｔｔｃｔｔｃｃｔｇｔｃａｇｔａａｃｇａｃｔｇｇｔｇｔｃｃａｃｔｃｃｔｔｃｇｔｇａａｃｃａｇｃａｃｃｔｇｔｇｃｇｇｃｔｃｃｃａｃｃｔｇｇｔｇｇａａｇｃｔｃｔｇｇｃａｃｔｃｇｔｇｔｇｃｇｇｃｇａｇｃｇｇｇｇｃｔｔｃｃａｃｔａｃｇｇｇｇｇｔｇｇｃｇｇａｇｇａｇｇｔｔｃｔｇｇｔｇｇｃｇｇｃｇｇａｇｇｃａｔｃｇｔｇｇａａｃａｇｔｇｃｔｇｃａｃｃｔｃｃａｃｃｔｇｃｔｃｃｃｔｇｇａｃｃａｇｃｔｇｇａａａａｃｔａｃｔｇｃｇｇｔｇｇｃｇｇａｇｇｔｇｃｃｇｇａｇｇｃｇｇｇｇｇａｇａｃａａａａｃｔｃａｃａｃａｔｇｃｃｃａｃｃｇｔｇｃｃｃａｇｃａｃｃｔｇａａｃｔｃｃｔｇｇｇｇｇｇａｃｃｇｔｃａｇｔｃｔｔｃｃｔｃｔｔｃｃｃｃｃｃａａａａｃｃｃａａｇｇａｃａｃｃｃｔｃａｔｇａｔｃｔｃｃｃｇｇａｃｃｃｃｔｇａｇｇｔｃａｃａｔｇｃｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇａｃｇｔｇａｇｃｃａｃｇａａｇａｃｃｃｔｇａｇｇｔｃａａｇｔｔｃａａｃｔｇｇｔａｃｇｔｇｇａｃｇｇｃｇｔｇｇａｇｇｔｇｃａｔａａｔｇｃｃａａｇａｃａａａｇｃｃｇｃｇｇｇａｇｇａｇｃａｇｔａｃａｇｃａｇｃａｃｇｔａｃｃｇｔｇｔｇｇｔｃａｇｃｇｔｃｃｔｃａｃｃｇｔｃｃｔｇｃａｃｃａｇｇａｃｔｇｇｃｔｇａａｔｇｇｃａａｇｇａｇｔａｃａａｇｔｇｃａａｇｇｔｃｔｃｃａａｃａａａｇｃｃｃｔｃｃｃａｇｃｃｃｃｃａｔｃｇａｇａａａａｃｃａｔｃｔｃｃａａａｇｃｃａａａｇｇｇｃａｇｃｃｃｃｇａｇａａｃｃａｃａｇｇｔｇｔａｃａｃｃｃｔｇｃｃｃｃｃａｔｃｃｃｇｇｇａｔｇａｇｃｔｇａｃｃａａｇａａｃｃａｇｇｔｃａｇｃｃｔｇａｃｃｔｇｃｃｔｇｇｔｃａａａｇｇｃｔｔｃｔａｔｃｃｃａｇｃｇａｃａｔｃｇｃｃｇｔｇｇａｇｔｇｇｇａｇａｇｃａａｔｇｇｇｃａｇｃｃｇｇａｇａａｃａａｃｔａｃａａｇａｃｃａｃｇｃｃｔｃｃｃｇｔｇｃｔｇｇａｃｔｃｃｇａｃｇｇｃｔｃｃｔｔｃｔｔｃｃｔｃｔａｃａｇｃａａｇｃｔｃａｃｃｇｔｇｇａｃａａｇａｇｃａｇｇｔｇｇｃａｇｃａｇｇｇｇａａｃｇｔｃｔｔｃｔｃａｔｇｃｔｃｃｇｔｇａｔｇｃａｔｇａｇｇｃｔｃｔｇｃａｃａａｃｃａｃｔａｃａｃｇｃａｇａａｇａｇｃｃｔｃｔｃｃｃｔｇｔｃｔｃｃｇｇｇｔｔａｇ（配列番号９０）。
通常の好ましい構成において、配列番号７７（Ｘ１はＳ、Ｄ、Ａ、またはＲ）の、免疫原性の低い、非グリコシル化型の、ｃＮｇ変異型のヒトＩｇＧ１ Ｆｃフラグメントを、配列番号１０の好ましいＢ１６Ａ変異型インスリンポリペプチドおよび各種リンカー（配列番号１１、配列番号１３、配列番号６７）と組み合わせると、糖尿病患者における長期に亘る週１回投与を可能にするのに十分なインビボ効力および作用持続時間を示すことが期待される、高いホモ二量体力価をもたらし、生物活性を示し、非免疫原性である、ヒトインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成ファミリーが得られる。
インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の生産
実施形態において、融合タンパク質は、実施例のセクションでより詳細に記載されるように、細胞に発現させることができる。
発現および精製
実施形態において、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質は、哺乳類細胞や非哺乳類細胞などの真核細胞などにおいて、組換え発現することができる。発現に用いられる例示的な哺乳類細胞としては、ＨＥＫ細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）またはＣＨＯ細胞が挙げられる。ＣＨＯ細胞は種々の株やサブクラスに細分することができ（例えば、ＣＨＯ ＤＧ４４、ＣＨＯ－Ｍ、およびＣＨＯ－Ｋ１）、これらの細胞株のいくつかは、実施例セクションに記載されるような、特定の種類の核酸分子（例えば、ＤＮＡを含むベクター）や特定の細胞増殖培地組成との使用を最適化するために、遺伝子改変されていてもよい。実施形態において、細胞は、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸分子（例えば、ベクター）（例えば、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質全体が単一の核酸分子にコードされている）でトランスフェクトされる。実施形態において、ＨＥＫ２９３細胞は、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質をコードするベクターでトランスフェクトしても、当該宿主細胞がはっきり認められるレベルのインスリン－Ｆｃ融合タンパク質を発現しなくなるまでの期間（例えば、３日間、４日間、５日間、７日間、１０日間、１２日間、１４日間、またはそれ以上）、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質を一次的に発現するのみである（すなわち、一過性トランスフェクション）。インスリン－Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸配列で一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞は、複数のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質候補の作製と選別を容易にする、より迅速な組換えタンパク質生産を可能にする場合が多い。実施形態において、ＣＨＯ細胞は、宿主細胞ＤＮＡに恒久的に組み込まれ、細胞が適切に培養されている限りインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の一貫性のある永続的な発現（すなわち、安定なトランスフェクション）をもたらす、ベクターでトランスフェクトされる。インスリン－Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸で安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞およびＣＨＯ細胞株は、成長するのにより時間がかかる場合があるが、より高い総タンパク質収量が得られる場合が多く、低コスト製品（例えば、比較的コモディティ化が進んだヒトインスリン市場用の製品）の製造により適している。細胞および細胞株は、当該技術分野における標準方法を用いて培養することができる。
好ましい実施形態において、配列番号７９を含むｃＤＮＡ配列（配列番号７８のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の実施形態に対応）、配列番号８１を含むｃＤＮＡ配列（配列番号８０のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の実施形態に対応）、配列番号８３を含むｃＤＮＡ配列（配列番号８２のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の実施形態に対応）、配列番号８５を含むｃＤＮＡ配列（配列番号８４のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の実施形態に対応）、配列番号８８を含むｃＤＮＡ配列（配列番号８７のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の実施形態に対応）、および配列番号９０を含むｃＤＮＡ配列（配列番号８９のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の実施形態に対応）のうちの１つを含むＨＥＫ細胞を用いて、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質が発現される。好ましい実施形態において、配列番号７９を含むｃＤＮＡ配列（配列番号７８のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の実施形態に対応）、配列番号８１を含むｃＤＮＡ配列（配列番号８０のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の実施形態に対応）、配列番号８３を含むｃＤＮＡ配列（配列番号８２のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の実施形態に対応）、配列番号８５を含むｃＤＮＡ配列（配列番号８４のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の実施形態に対応）、配列番号８８を含むｃＤＮＡ配列（配列番号８７のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の実施形態に対応）、および配列番号９０を含むｃＤＮＡ配列（配列番号８９のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の実施形態に対応）のうちの１つを含むＣＨＯ細胞を用いて、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質が発現される。
いくつかの実施形態において、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質は、細胞から（例えば、細胞の溶解によって）精製または単離される。他の実施形態では、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質は、細胞によって分泌され、細胞が成長した細胞培地から精製または単離される。インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の精製は、カラムクロマトグラフィ（例えば、アフィニティークロマトグラフィー）の使用、または、サイズの違い、電荷の違い、および／もしくは特定の分子に対する親和性の違いに基づいた他の分離法の使用を含むことができる。実施形態において、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の精製は、例えば、Ｆｃフラグメントを含むタンパク質を、プロテインＡビーズに共有結合したプロテインＡに、中性溶液ｐＨにおいて高い親和性で結合させる、プロテインＡビーズまたはプロテインＡカラムを用いることで、Ｆｃフラグメントを含むタンパク質を、選別または濃縮することを含む。次いで、結合したインスリン－Ｆｃ融合タンパク質は、溶液における変量を変化（例えば、溶液ｐＨを低下）させることで、プロテインＡビーズから溶離させることができる。イオン交換クロマトグラフィーおよび／またはゲル濾過クロマトグラフィーなどの他の分離法を、代わりにまたは追加で使用することもできる。実施形態において、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の精製は、タンパク質調製物の濾過または遠心分離をさらに含む。実施形態において、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質のさらなる精製は、ダイアフィルトレーション、限外濾過、および各種サイズの多孔質膜を通す濾過を含み、さらに、医薬品添加物による最終的な製剤化が行われる。
精製インスリン－Ｆｃ融合タンパク質は、純度、総タンパク質収量、構造、および／または活性などについて、種々の方法、例えば、２８０ｎｍにおける吸光度（例えば、総タンパク質収量を測定するため）、分子ふるいまたはキャピラリー電気泳動（例えば、分子量、凝集率、および／または純度を測定するため）、質量分析（ＭＳ）および／もしくは液体クロマトグラフィー（ＬＣ－ＭＳ）（例えば、純度および／またはグリコシル化を測定するため）、並びに／または、ＥＬＩＳＡ（例えば、抗インスリン抗体に対する結合の程度、例えば親和性、を測定するため）を用いて、特徴付けすることができる。例示的な特徴付け方法も、実施例セクションに記載される。
実施形態において、一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ細胞で産生され、プロテインＡ精製された後の、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の総タンパク質収量は、５ｍｇ／Ｌ超、１０ｍｇ／Ｌ超、または２０ｍｇ／Ｌ超である。好ましい実施形態において、一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ細胞で産生され、プロテインＡ精製された後の、ヒトインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の総タンパク質収量は、１００ｍｇ／Ｌ超（例えば、１５０ｍｇ／Ｌ超）である。実施形態において、一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ細胞で産生され、プロテインＡ精製された後の、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質のホモ二量体率は、７０％超（例えば、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超、９９％超）である。好ましい実施形態において、インスリン－Ｆｃ融合体の総タンパク質収量とホモ二量体率との積として算出される、一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ細胞で産生され、プロテインＡ精製された後の、ヒトインスリン－Ｆｃ融合タンパク質のホモ二量体力価は、１００ｍｇ／Ｌ超（例えば、１５０ｍｇ／Ｌ超）である。ホモ二量体力価が１５０ｍｇ／Ｌより大きいヒトインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成のみを、本発明では有用と見なしたが、これは、このレベル未満のホモ二量体力価では、比較的コモディティ化したヒトインスリン市場の厳しい低製造コスト要件を満たすＣＨＯ細胞における商業生産力価が得られにくいことが、経験的に分かっているからである。
実施形態において、安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞（例えば、ＣＨＯ細胞株またはＣＨＯ細胞クローン）で産生され、プロテインＡ精製された後のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の総タンパク質収量は、１Ｌ当たり１００ｍｇ（例えば、ｍｇ／１Ｌの培地）超のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質である。好ましい実施形態において、安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞（例えば、ＣＨＯ細胞株またはＣＨＯ細胞クローン）で産生され、プロテインＡ精製された後のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の総タンパク質収量は、１５０ｍｇ超のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質／１Ｌの培地（例えば、２００ｍｇ／Ｌ超、３００ｍｇ／Ｌ超、４００ｍｇ／Ｌ超、５００ｍｇ／Ｌ超、６００ｍｇ／Ｌ超、またはそれ以上）である。実施形態において、安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞（例えば、ＣＨＯ細胞株またはＣＨＯ細胞クローン）で産生され、プロテインＡ精製された後のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質のホモ二量体率は、７０％超（例えば、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超、９９％超）である。実施形態において、安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞（例えば、ＣＨＯ細胞株またはＣＨＯ細胞クローン）で産生され、プロテインＡ精製された後のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の、インスリン－Ｆｃ融合体の総タンパク質収量とホモ二量体率との積として算出されるホモ二量体力価は、１５０ｍｇ／Ｌ超（例えば、２００ｍｇ／Ｌ超、３００ｍｇ／Ｌ超、４００ｍｇ／Ｌ超、５００ｍｇ／Ｌ超、６００ｍｇ／Ｌ超、またはそれ以上）である。
インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の機能的特徴
インスリン受容体との相互作用により標的対象（例えば、イヌまたはヒト）の血糖を低下させる方法であって、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質、例えば本明細書に記載の融合タンパク質を対象に投与することを含む、方法が本明細書に記載される。いくつかの実施形態において、対象は糖尿病と診断されたものである（例えば、イヌの場合はイヌ糖尿病、あるいは、ヒトの場合は１型糖尿病または２型糖尿病）。
実施形態において、本明細書に記載のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質は、実施例１２に記載の４℃でのＩＭ－９を用いたＩＲ結合アッセイにおけるＩＣ５０によって評価された場合に、かなりの親和性でＩＲに結合する（例えば、５０００ｎＭ未満のＩＣ５０、４０００ｎＭ未満のＩＣ５０、３０００ｎＭ未満のＩＣ５０、２４００ｎＭ未満のＩＣ５０、２０００ｎＭ未満のＩＣ５０）。経験に基づいて、５０００ｎＭ未満、好ましくは２４００ｎＭ未満、より好ましくは２０００ｎＭ未満の、ＩＲ活性ＩＣ５０値を示す化合物のみを、標的対象において生物活性を示す可能性があるものと見なした。通常、ＩＲ結合の親和性が高いほど（すなわち、ＩＣ５０値が低いほど）、好ましい。しかし、周知のように、インスリンおよびインスリン類似体（例えば、本明細書に記載のインスリンポリペプチド）のクリアランスは主に、ＩＲに結合後の、ＩＲの内部移行と細胞内分解によって支配されている。従って、ＩＲ結合親和性が高過ぎる（すなわち、ＩＣ５０が低過ぎる、例えば、ＩＣ５０が５００ｎＭ未満）インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成は、血行からの除去が早過ぎて、標的対象におけるグルコース低減生物活性の持続時間が所望のものよりも短くなる可能性がある。
実施形態において、本明細書に記載のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成は、実施例１９に従って測定される、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質参照標準のそれよりも高い親和性で、ＦｃＲｎ受容体に結合する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される、ヒトＦｃＲｎ受容体アッセイにおけるＥＣ５０値によって評価される、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成のＦｃＲｎ受容体に対する親和性は、１５００ｎｇ／ｍＬ以下、より好ましくは１０００ｎｇ／ｍＬ以下である。
実施形態において、本明細書に記載のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質は、対象に投与後、グルコースレベル（例えば、血糖値）を低下させることができる。実施形態において、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質のグルコース低減活性は、インスリン参照標準のそれよりも大きい。いくつかの実施形態において、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の活性の持続時間は、投与前空腹時血糖値に対する、空腹時血糖の減少、例えば統計的に有意な減少、によって評価することができる。実施形態において、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の活性の持続時間（例えば、投与前レベルと比べて、対象における空腹時血糖値の統計的に有意な減少がある期間）は、約２時間よりも長い。実施形態において、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の活性の持続時間（例えば、投与前レベルと比べて、対象における血糖値の統計的に有意な減少がある期間）は、約６時間よりも長い、９時間よりも長い、１２時間よりも長い、１８時間よりも長い、１日よりも長い、１．５日よりも長い、２日よりも長い、２．５日よりも長い、３日よりも長い、４日よりも長い、５日よりも長い、６日よりも長い、７日よりも長い、またはそれ以上である。実施形態において、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質は、長時間作用性である（例えば、半減期、例えば血清中半減期、が長い）。
実施形態において、標的対象における本明細書に記載のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の血清半減期は、インスリン参照標準や対照製剤のそれよりも長い。実施形態において、標的対象におけるインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の血清半減期（例えば、投与してすぐの対象の血液中のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の血清半減期）は、約２時間よりも長い。実施形態において、標的対象におけるインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の血清半減期は、約０．５日間、１日間、２日間、または２．５日間である。好ましい実施形態において、標的対象におけるインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の血清半減期は、約３日間以上である。
実施形態において、本明細書に記載のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の効力と、生物活性の持続時間とを組み合わせたものを、％ＦＢＧＬ・日・ｋｇ／ｍｇを単位として、所与の投与量（単位ｍｇ／ｋｇ）に対して正規化された空腹時血糖％（％ＦＢＧＬ）曲線上の面積（ＮＡＯＣ）を算出することで、定量化している場合がある。実施形態において、本明細書に記載のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質のＮＡＯＣは、１５０％ＦＢＧＬ・日・ｋｇ／ｍｇ超（例えば、２００％ＦＢＧＬ・日・ｋｇ／ｍｇ超、２５０％ＦＢＧＬ・日・ｋｇ／ｍｇ超、またはそれ以上）である。ここでも経験に基づくが、ＮＡＯＣ値が１５０％ＦＢＧＬ・日・ｋｇ／ｍｇより大きいと、標的対象における投与量要件は、許容できる治療コストを達成するのに十分に低いものとなる。実施形態において、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質のＮＡＯＣは、標的対象における反復投与後に維持されなければならない（すなわち、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の１回目投与後のＮＡＯＣに対する３回目投与後のＮＡＯＣの比は、０．５超（例えば、０．６超、０．７超、０．８超、０．９超、またはそれ以上）である。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成は、実施例１５に従って測定される、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質参照標準のそれよりも低い親和性で、Ｆｃγ受容体に結合する。いくつかの実施形態において、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質参照標準（すなわち、配列番号７６のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質）のＦｃγ受容体親和性に対する、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質のＦｃγ受容体親和性の比は、０．５０未満（例えば０．４０未満、０．３０未満、０．２０未満）である。いくつかの実施形態において、ビオチン化ＦｃγＲＩが３０００ｎｇ／ｍＬである場合のヒトＦｃγＲＩ受容体アッセイにおけるＯＤ４５０比（配列番号７６の参照インスリン－Ｆｃ融合タンパク質に対しての比）によって評価される、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質のＦｃγ受容体に対する親和性は、０．５０以下である。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成は、実施例１６に従って測定される、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質参照標準のそれよりも低い親和性で、Ｃ１ｑに結合する。いくつかの実施形態において、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質参照標準（すなわち、配列番号７６のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質）のＦｃγ受容体親和性に対する、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質のＣ１ｑ結合親和性の比は、０．５０未満（例えば０．４０未満、０．３０未満、０．２０未満）である。いくつかの実施形態において、ビオチン化Ｃ１ｑ濃度が１０００ｎｇ／ｍＬである場合のヒトＣ１ｑ結合アッセイにおけるＯＤ４５０比（配列番号７６の参照インスリン－Ｆｃ融合タンパク質に対しての比）によって評価される、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質のＣ１ｑ結合親和性は、０．３５以下である。
治療方法および対象選択の特徴
糖尿病（例えば、ヒトにおける１型糖尿病または２型糖尿病）を治療するための方法であって、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質（例えば、本明細書に記載のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成）を標的対象に投与することを含む、方法が、本明細書に記載される。
実施形態において、本明細書に記載の任意の方法で用いられる参照標準は、参照処置または参照治療を含む。いくつかの実施形態において、上記参照は、糖尿病治療のための標準的治療剤（例えば、イヌ糖尿病用の標準的治療剤、またはヒトの１型糖尿病用の標準的治療剤、またはヒトの２型糖尿病用の標準的治療剤）を含む。いくつかの実施形態において、参照標準は、市販のインスリンまたはインスリン類似体である。いくつかの実施形態において、参照標準は、長時間持続型インスリン、中間持続型インスリン、短時間持続型インスリン、速効型インスリン、短時間作用型、中間作用型、長時間作用型インスリンを含む。いくつかの実施形態において、イヌインスリンの参照標準は、Ｖｅｔｓｕｌｉｎ（登録商標）、Ｐｒｏｚｉｎｃ（登録商標）、インスリンＮＰＨ、インスリングラルギン（Ｌａｎｔｕｓ（登録商標））、または組換えヒトインスリンを含む。いくつかの実施形態において、ヒトインスリンの参照標準は、Ｈｕｍａｌｏｇ（登録商標）、ＮｏｖｏＬｏｇ（登録商標）、Ｎｏｖｏｌｉｎ（登録商標）Ｒ（ノボノルディスク社、バウスベア、デンマーク）、Ｎｏｖｏｌｉｎ（登録商標）Ｎ（ノボノルディスク社、バウスベア、デンマーク）、Ｈｕｍｕｌｉｎ（登録商標）Ｒ（イーライリリー社、インディアナポリス、インディアナ州）、Ｈｕｍｕｌｉｎ（登録商標）Ｎ（イーライリリー社、インディアナポリス、インディアナ州）、Ｌａｎｔｕｓ（登録商標）、およびＬｅｖｅｍｉｒ（登録商標）を含み、あるいは、遺伝子組換えヒトインスリンを含む。
実施形態において、本明細書に記載の任意の方法で用いられる参照標準は、糖尿病治療（例えば、イヌ糖尿病治療またはヒト糖尿病治療）の、成績、例えば本明細書に記載される成績、を含む。
実施形態において、参照標準は、治療の開始前の、例えば本明細書に記載のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質治療の開始前の、糖尿病を有する標的対象のマーカー（例えば、血糖またはＨｂＡ１ｃ）のレベルである。実施形態において、標的対象の血糖値は、治療の開始前で、２００ｍｇ／ｄＬ超（例えば２５０ｍｇ／ｄＬ超、３００ｍｇ／ｄＬ超、３５０ｍｇ／ｄＬ超、４００ｍｇ／ｄＬ超、またはそれ以上）である。実施形態において、イヌにおけるフルクトサミンレベルは、治療の開始前で、２５０μｍｏｌ／Ｌ超、３５０μｍｏｌ／Ｌ超（例えば、４００μｍｏｌ／Ｌ超、４５０μｍｏｌ／Ｌ超、５００μｍｏｌ／Ｌ超、５５０μｍｏｌ／Ｌ超、６００μｍｏｌ／Ｌ超、６５０μｍｏｌ／Ｌ超、７００μｍｏｌ／Ｌ超、７５０μｍｏｌ／Ｌ超、またはそれ以上）である。実施形態において、ヒト標的対象におけるＨｂＡ１ｃレベルは、治療の開始前で、７ｍｍｏｌ／Ｌ超（例えば、７．５ｍｍｏｌ／Ｌ超、８ｍｍｏｌ／Ｌ超、９ｍｍｏｌ／Ｌ超、１０ｍｍｏｌ／Ｌ超、１１ｍｍｏｌ／Ｌ超、１２ｍｍｏｌ／Ｌ超、またはそれ以上）である。実施形態において、参照標準は、疾患の存在、進行、または重症度の尺度である。実施形態において、参照標準は、例えば標的対象が糖尿病を有するものである、治療の開始前の、例えば本明細書に記載のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質治療の開始前の、病気の症状の存在または重症度の尺度である。
医薬組成物および投与経路
標的対象の血糖を低下させるために用いることができる、本明細書に記載のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成を含有する医薬組成物が、本明細書で提供される。医薬組成物中のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の含量および濃度、並びに医薬組成物の標的対象への投与量は、医学的に関連性がある対象の特徴（例えば、年齢、体重、性別、他の医学的条件など）、医薬組成物中の化合物の溶解性、化合物の効力および活性、並びに医薬組成物の投与様式などの臨床的に関連性がある要因に基づいて、選択することができる。投与経路および投与レジメンに関するさらなる情報について、読者は、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｃｏｒｗｉｎ Ｈａｎｓｃｈ；編集委員長）、ペルガモン・プレス社、１９９０年の第５巻の２５．３章を参照されたい。
本開示の製剤は、非経口投与に好適な製剤を包含する。「非経口投与」および「非経口的に投与される」という表現は、本明細書で使用される場合、腸内投与および局所投与以外の、通常は静脈内注射または皮下注射による投与様式を意味する。
本開示の医薬組成物中に使用されてもよい好適な水性担体および非水性担体の例として、水、エタノール、ポリオール類（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、およびこれらの好適な混合物、オリーブ油などの植物油、並びに、オレイン酸エチルなどの注射用有機酸エステル類が挙げられる。レシチンなどのコーティング材を使用し、分散液の場合は必要な粒径を維持し、界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎのような界面活性剤を使用するなどして、適切な流動性を維持することができる。いくつかの実施形態において、医薬組成物（例えば、本明細書に記載の医薬組成物）は、Ｔｗｅｅｎのような界面活性剤、例えば、ポリソルベート２０、ツイン２０、またはツイン８０を含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物（例えば、本明細書に記載の医薬組成物）は、Ｔｗｅｅｎのような界面活性剤、例えば、ツイン８０を、約０．００１％～約２％、または約０．００５％～約０．１％、または約０．０１％～約０．５％の濃度で含む。
いくつかの実施形態において、水性担体中のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の濃度は、約３ｍｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態において、水性担体中のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の濃度は、約６ｍｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態において、水性担体中のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の濃度は、約８ｍｇ／ｍＬ、９ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、１２ｍｇ／ｍＬ、１５ｍｇ／ｍＬ、またはそれ以上である。
いくつかの実施形態において、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質は、ボーラス投与、点滴投与、または静脈内プッシュ投与される。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、シリンジ注入、ポンプ、ペン、針、または留置カテーテルを介して投与される。いくつかの実施形態において、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質は、皮下ボーラス注入で投与される。また、導入方法は、充電式または生分解性のデバイスによって提供されてもよい。近年、タンパク質性バイオ医薬品を含む薬剤の制御送達用に、様々な徐放ポリマー製デバイスが開発され、インビボ試験されている。生分解性ポリマーおよび非分解性ポリマーの両方を含む、種々の生体適合性ポリマー（ヒドロゲルを含む）を用いて、特定の標的部位で化合物を持続放出するためのインプラントを形成することができる。
投与量
本明細書に記載される構成のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の実際の投与量レベルは、特定の標的対象（例えば、イヌまたはヒト）において、所望の治療反応を達成するのに有効な、有効成分の量を得るために、変えることができる。選択された投与量レベルは、種々の要因に依存することとなり、例えば、使用された特定の融合タンパク質、またはそのエステル、塩、もしくはアミドの活性、投与経路、投与時期、使用されている化合物の排泄速度、治療期間、使用された特定の融合タンパク質と組み合わせて使用された他の薬剤、化合物および／または物質、治療を受けている対象の年齢、性別、体重、状態、全体的な健康、および既往歴、並びに医学分野で周知の同様の要因が挙げられる。
通常、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の好適な投与量は、治療効果を生むのに有効な最低投与量である量となる。このような有効量は、上記の要因に通常は依存することとなる。通常、標的対象に対するインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の静脈内投与量および皮下投与量は、１日当たり体重１キログラム当たり約０．００１～約１ｍｇ（例えばｍｇ／ｋｇ）、例えば、約０．００１～１ｍｇ／ｋｇ／日、約０．０１～０．１ｍｇ／ｋｇ／日、約０．１～１ｍｇ／ｋｇ／日、または約０．０１～１ｍｇ／ｋｇ／日の範囲となる。さらに他の実施形態では、融合タンパク質は、０．０２５～４ｍｇ／キログラム体重／週、例えば、０．０２５～１．０ｍｇ／ｋｇ／週の投与量で投与される。
本開示は、上記の医薬組成物および製剤のうちのいずれかにおける、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の製剤化を企図している。さらに、本開示は、上記の投与経路のいずれかを介した投与を企図している。当業者は、治療中の状態、並びに治療中の対象の健康全般、年齢、および大きさに基づいて、適切な製剤および投与経路を選択することができる。
以下の実施例により本発明の技術のさらなる例示がなされるが、それらはいかなる限定とも見なされるべきではない。
一般的な方法、アッセイ、および材料
実施例１：ＨＥＫ２９３細胞におけるインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の合成および作製法
インスリン－Ｆｃ融合タンパク質を以下の通りに合成した。目的の遺伝子配列を、プロプライエタリソフトウェア（レイクファーマ社（ＬａｋｅＰｈａｒｍａ）、ベルモント、カリフォルニア州）を用いて構築し、高発現哺乳類ベクターにクローニングした。ＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクションの２４時間前に振盪フラスコ内に播種し、無血清合成培地を用いて増殖させた。目的のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質をコードするＤＮＡ発現コンストラクトを、一過性トランスフェクションのための標準操作手順（レイクファーマ社、ベルモント、カリフォルニア州）を用いて、ＨＥＫ２９３細胞浮遊液に一過性にトランスフェクトした。２０時間後、細胞を計数して生存率と生細胞数を求め、ＦｏｒｔｅＢｉｏ（登録商標）Ｏｃｔｅｔ（登録商標）（ポール・フォルテバイオ社（Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ ＬＬＣ）、フリーモント、カリフォルニア州）で力価を測定した。一過性トランスフェクションのプロダクションラン中、追加の測定値を得た。５日目以降に培養物の回収を行った。
実施例２：ＣＨＯ細胞におけるインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の合成および作製法
ＣＨＯ細胞株は、元はＣＨＯ－Ｋ１（レイクファーマ社、ベルモント、カリフォルニア州）由来のものであり、当該技術分野において公知の方法を用いた組換え技術によって内在性グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）遺伝子をノックアウトしたものである。ＣＨＯ発現およびＧＳセレクション用の安定発現ＤＮＡベクターを設計・最適化し、高発現哺乳類ベクター（レイクファーマ社、ベルモント、カリフォルニア州）に組み込んだ。完成したコンストラクトの配列をそれぞれ確認してから、スケールアップ実験を開始した。浮遊液順応ＣＨＯ細胞を、３７℃、５％ＣＯ２の加湿恒温器内の、合成培地（ＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ；インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カールズバッド、カリフォルニア州）中で、培養した。ＣＨＯ細胞の培養では、血清などの動物由来産物は用いなかった。
対数増殖期にＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ培地中で増殖中の、およそ８×１０７個の浮遊液順応ＣＨＯ細胞を、ＭａｘＣｙｔｅ（登録商標）ＳＴＸ（登録商標）系（マックスサイト社（ＭａｘＣｙｔｅ，Ｉｎｃ．）、ゲイサーズバーグ、メリーランド州）と、各インスリン－Ｆｃ融合タンパク質用の安定なＣＨＯ細胞株を作製するためのＤＮＡ（ＤＮＡコンストラクトはインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の完全長配列を含む）８０μｇを用いた、エレクトロポレーションによるトランスフェクションにかけた。２４時間後、トランスフェクト細胞を計数し、インスリン－Ｆｃ融合遺伝子の安定した組み込みのためのセレクションにかけた。トランスフェクト細胞を、振盪フラスコ内の０～１００μＭメチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）を含有するＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ選択培地中に、０．５×１０６細胞／ｍＬの細胞密度で播種し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。セレクション工程の間、ＣＨＯの安定なプールがその成長速度と生存率を回復させるまで、細胞は２～３日毎にスピンダウンして新鮮選択培地に再懸濁した。細胞培養物は、増殖および力価をモニターした。
細胞を２．５×１０６細胞／ｍＬまで増殖させた。細胞バンク用に回収した際、生存率は９５％超であった。次に細胞を遠心し、細胞数が１５×１０６細胞／ｍＬ／バイアルとなるように、細胞ペレットを７．５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含むＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ培地中に再懸濁した。バイアルを液体窒素中で凍結保存し貯蔵した。
小規模スケールアップ製造を、ＣＨＯ細胞を用いて以下の通りに行った。細胞を、３７℃の、１００μＭ ＭＳＸを含有するＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ増殖培地中で、製造用にスケールアップし、およそ１４～２１日間、グルコースと必要に応じて追加のアミノ酸とを添加したＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ増殖培地を、必要に応じて２～４日毎に添加した。安定プールのプロダクションランから回収された条件培地上清を遠心スピンで清澄化した。タンパク質を、結合バッファーで予め平衡化されたプロテインＡ（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ、ＧＥヘルスケア社（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、リトル・チャルフォント、英国）カラムに通した。ＯＤ２８０値（ＮａｎｏＤｒｏｐ、サーモサイエンティフィック社（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））を測定したときにバックグラウンドレベルかその付近になるまで、洗浄バッファーをカラムに通した。インスリン－Ｆｃ融合タンパク質を低ｐＨ緩衝液を用いて溶出させ、溶出画分を回収し、各画分のＯＤ２８０値を記録した。標的インスリン－Ｆｃ融合タンパク質を含有する画分をプールし、所望により、０．２μＭメンブランフィルターを用いてさらに濾過した。
この細胞株を所望によるさらなるサブクローニングにかけて単クローン性とし、当業者に公知の方法である限界希釈法を用いて、高力価インスリン－Ｆｃ－融合タンパク質発現クローンを求めて、所望によるさらなるセレクションを行った。高力価モノクローナルインスリン－Ｆｃ融合タンパク質発現細胞株を得た後、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の製造を、上記のように、ＭＳＸを含有しない増殖培地中、または所望によりＭＳＸを含有する増殖培地中で達成することで、組換え型の、ＣＨＯで作製された、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質を含有する細胞培養上清を得た。所望によりＭＳＸ濃度を経時的に増加させて、追加の選択性を及ぼすことで、より高い産物の力価をもたらすことが可能なクローンを得た。
実施例３：ＣＨＯ細胞におけるインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の合成および作製法
ＣＨＯ細胞株は、元はＣＨＯ－Ｋ１（レイクファーマ社、ベルモント、カリフォルニア州）由来のものであり、当該技術分野において公知の方法を用いた組換え技術によって内在性グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）遺伝子をノックアウトしたものである。ＣＨＯ発現およびＧＳセレクション用の安定発現ＤＮＡベクターを設計・最適化し、高発現哺乳類ベクター（レイクファーマ社、ベルモント、カリフォルニア州）に組み込む。完成したコンストラクトの配列をそれぞれ確認してから、スケールアップ実験を開始する。浮遊液順応ＣＨＯ細胞を、３７℃、５％ＣＯ２の加湿恒温器内の、合成培地（ＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ；インビトロジェン社、カールズバッド、カリフォルニア州）中で、培養する。ＣＨＯ細胞の培養では、血清などの動物由来産物は用いない。
対数増殖期にＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ培地中で増殖中の、およそ８×１０７個の浮遊液順応ＣＨＯ細胞を、ＭａｘＣｙｔｅ（登録商標）ＳＴＸ（登録商標）系（マックスサイト社、ゲイサーズバーグ、メリーランド州）と、各インスリン－Ｆｃ融合タンパク質用の安定なＣＨＯ細胞株を作製するためのＤＮＡ（ＤＮＡコンストラクトはインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の完全長配列を含む）８０μｇを用いた、エレクトロポレーションによるトランスフェクションにかける。２４時間後、トランスフェクト細胞を計数し、インスリン－Ｆｃ融合遺伝子の安定した組み込みのためのセレクションにかける。トランスフェクト細胞を、振盪フラスコ内の０～１００μＭメチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）を含有するＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ選択培地中に、０．５×１０６細胞／ｍＬの細胞密度で播種し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。セレクション工程の間、ＣＨＯの安定なプールがその成長速度と生存率を回復させるまで、細胞は２～３日毎にスピンダウンして新鮮選択培地に再懸濁する。細胞培養物は、増殖および力価をモニターする。
細胞を２．５×１０６細胞／ｍＬまで増殖させる。細胞バンク用に回収した際、生存率は９５％超を維持する。次に細胞を遠心し、細胞数が１５×１０６細胞／ｍＬ／バイアルとなるように、細胞ペレットを７．５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含むＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ培地中に再懸濁する。バイアルを液体窒素中で凍結保存し貯蔵する。
小規模スケールアップ製造を、ＣＨＯ細胞を用いて以下の通りに行う。細胞を、３７℃の、１００μＭ ＭＳＸを含有するＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ増殖培地中で、製造用にスケールアップし、およそ１４～２１日間、グルコースと必要に応じて追加のアミノ酸とを添加したＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ増殖培地を、必要に応じて２～４日毎に添加する。安定プールのプロダクションランから回収された条件培地上清を遠心スピンで清澄化する。タンパク質を、結合バッファーで予め平衡化されたプロテインＡ（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ、ＧＥヘルスケア社、リトル・チャルフォント、英国）カラムに通す。ＯＤ２８０値（ＮａｎｏＤｒｏｐ、サーモサイエンティフィック社（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））を測定したときにバックグラウンドレベルかその付近になるまで、洗浄バッファーをカラムに通す。インスリン－Ｆｃ融合タンパク質を低ｐＨ緩衝液を用いて溶出させ、溶出画分を回収し、各画分のＯＤ２８０値を記録する。標的インスリン－Ｆｃ融合タンパク質を含有する画分をプールし、所望により、０．２μＭメンブランフィルターを用いてさらに濾過する。
この細胞株を所望によるさらなるサブクローニングにかけて単クローン性とし、当業者に公知の方法である限界希釈法を用いて、高力価インスリン－Ｆｃ－融合タンパク質発現クローンを求めて、所望によるさらなるセレクションを行う。高力価モノクローナルインスリン－Ｆｃ融合タンパク質発現細胞株を得た後、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の製造を、上記のように、ＭＳＸを含有しない増殖培地中、または所望によりＭＳＸを含有する増殖培地中で達成することで、組換え型の、ＣＨＯで作製された、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質を含有する細胞培養上清を得る。所望によりＭＳＸ濃度を経時的に増加させて、追加の選択性を及ぼすことで、より高い産物の力価をもたらすことが可能なクローンを得る。
実施例４：インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の精製
インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の精製は以下の通りに行った。分泌インスリン－Ｆｃ融合タンパク質を含有する条件培地上清を、一過性トランスフェクトＨＥＫ、安定トランスフェクトＨＥＫ、または安定トランスフェクトＣＨＯのプロダクションランから回収し、遠心分離で清澄化した。所望のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質を含有する上清をプロテインＡカラムに流し、０．１５～０．５０Ｍ塩化ナトリウムを含む各種洗浄バッファーで洗浄し、その後、低ｐＨ液を用いて溶出させた。その後、所望のタンパク質を含有する溶出画分をプールし、緩衝液を２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＮａＯＡｃ、ｐＨ７．０の緩衝液に交換した。最後の濾過工程は０．２μｍメンブランフィルターを用いて行った。最終的なタンパク質濃度は２８０ｎｍでの溶液吸光度から算出した。イオン交換クロマトグラフィー（例えば、陰イオン交換ビーズ樹脂または陽イオン交換ビーズ樹脂を用いるイオン交換クロマトグラフィー）、ゲル濾過クロマトグラフィー、などの方法による任意のさらなる精製を、必要に応じて行った。
実施例５：インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の精製
インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の精製は以下の通りに行う。分泌インスリン－Ｆｃ融合タンパク質を含有する条件培地上清を、一過性トランスフェクトＨＥＫ、安定トランスフェクトＨＥＫ、または安定トランスフェクトＣＨＯのプロダクションランから回収し、遠心分離で清澄化する。所望のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質を含有する上清をプロテインＡカラムに流し、０．１５～０．５０Ｍ塩化ナトリウムを含む各種洗浄バッファーで洗浄し、その後、低ｐＨ液を用いて溶出させる。その後、所望のタンパク質を含有する溶出画分をプールし、緩衝液を２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＮａＯＡｃ、ｐＨ７．０の緩衝液に交換する。最後の濾過工程は０．２μｍメンブランフィルターを用いて行う。最終的なタンパク質濃度は２８０ｎｍでの溶液吸光度から算出する。イオン交換クロマトグラフィー（例えば、陰イオン交換ビーズ樹脂または陽イオン交換ビーズ樹脂を用いるイオン交換クロマトグラフィー）、ゲル濾過クロマトグラフィー、などの方法による任意のさらなる精製を、必要に応じて行う。
実施例６：非還元ＣＥ－ＳＤＳおよび還元ＣＥ－ＳＤＳによる構造確認
キャピラリー電気泳動ドデシル硫酸ナトリウム（ＣＥ－ＳＤＳ）分析を、ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）ＧＸＩＩ（パーキンエルマー社（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）、ウォルサム、マサチューセッツ州）において、２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＮａＯＡｃ、ｐＨ７．０の緩衝液中に溶解された精製インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の溶液に対して行い、電気泳動図をプロットした。非還元条件下で、試料を分子量（ＭＷ）既知のタンパク質標準と共に泳動した。溶出ピークはインスリン－Ｆｃ融合タンパク質ホモ二量体の「見かけの」分子量を表すものであった。
インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構造純度が正しいものであるらしいと判断する手段として、還元条件下（例えば、インスリン－Ｆｃ融合物ホモ二量体のジスルフィド結合を切断するためにβ－メルカプトエタノールを使用）で、得られたインスリン－Ｆｃ融合タンパク質モノマーの見かけの分子量を、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質ホモ二量体の分子量の半分と比較する。
実施例７：非還元ＣＥ－ＳＤＳおよび還元ＣＥ－ＳＤＳによる構造確認
キャピラリー電気泳動ドデシル硫酸ナトリウム（ＣＥ－ＳＤＳ）分析を、ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）ＧＸＩＩ（パーキンエルマー社（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）、ウォルサム、マサチューセッツ州）において、２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＮａＯＡｃ、ｐＨ７．０の緩衝液中に溶解された精製インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の溶液に対して行い、電気泳動図をプロットする。非還元条件下で、試料を分子量（ＭＷ）既知のタンパク質標準と共に泳動する。溶出ピークはインスリン－Ｆｃ融合タンパク質ホモ二量体の「見かけの」分子量を表す。
インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構造純度が正しいものであるらしいと判断する手段として、還元条件下（例えば、インスリン－Ｆｃ融合物ホモ二量体のジスルフィド結合を切断するためにβ－メルカプトエタノールを使用）で、得られたインスリン－Ｆｃ融合タンパク質モノマーの見かけの分子量を、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質ホモ二量体の分子量の半分と比較する。
実施例８：グリカンを含む化合物のグリカン除去を伴うＬＣ－ＭＳによる配列同定
質量分析（ＭＳ）によるインスリン－Ｆｃ融合タンパク質質量の正確な評価のために、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質が天然でグリコシル化されている場合は、試料にまず、ＭＳ分析に干渉し得る天然起源グリカンを除去する処理を行った。２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＮａＯＡｃ、ｐＨ７．０の緩衝溶液中に溶解させた２．５ｍｇ／ｍＬインスリン－Ｆｃ融合タンパク質１００μＬを、まず、Ｚｅｂａ脱塩カラム（ピアス、サーモフィッシャー・サイエンティフィック社、ウォルサム、マサチューセッツ州）を用いて、５ｍＭ ＥＤＴＡを含有する０．１Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０の緩衝液に緩衝液交換した。融合タンパク質に存在するＮ結合型グリカン（例えば、ｃＮｇ－Ｎ部位に位置するアスパラギンの側鎖に連結したグリカン）を除去するために、この溶液に、１．６７μＬのＰＮＧａｓｅ Ｆ酵素（Ｐｒｏｚｙｍｅ Ｎ－グリカナーゼ）を添加し、この混合物を３７℃の恒温器内で一晩インキュベートした。次に、試料をＬＣ－ＭＳ（ノババイオアッセイズ社、ウォバーン、マサチューセッツ州）による分析にかけ、グリカンを含まない所望のホモ二量体に対応する分子の分子量を得た。ｃＮｇ－アスパラギンからグリカンを切断するために用いられた酵素過程は、アスパラギン側鎖を脱アミノ化してアスパラギン酸の形成も引き起こすため、この質量のさらなる補正を次に行った。補正を行う場合、酵素処理後のホモ二量体は全体として２Ｄａ増加し、これは、ホモ二量体に存在する各鎖において、１Ｄａの質量に相当する。従って、実際の分子量は、分析試料中のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質構造の酵素修飾を補正するために、測定質量から２Ｄａを引いたものである。
インスリン－Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸組成が、天然グリコシル化がｃＮｇ部位で生じることを妨げるものである場合、当該分子をＰＮＧアーゼ酵素で前処理せずに、ＬＣ－ＭＳ（ノババイオアッセイズ社、ウォバーン、マサチューセッツ州）を用いて、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質質量の正確な評価を直接得た。
実施例９：グリカンを含む化合物のグリカン除去を伴うＬＣ－ＭＳによる配列同定
質量分析（ＭＳ）によるインスリン－Ｆｃ融合タンパク質質量の正確な評価のために、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質が天然でグリコシル化されている場合は、試料にまず、ＭＳ分析に干渉し得る天然起源グリカンを除去する処理を行う。２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＮａＯＡｃ、ｐＨ７．０の緩衝溶液中に溶解させた２．５ｍｇ／ｍＬインスリン－Ｆｃ融合タンパク質１００μＬを、まず、Ｚｅｂａ脱塩カラム（ピアス、サーモフィッシャー・サイエンティフィック社、ウォルサム、マサチューセッツ州）を用いて、５ｍＭ ＥＤＴＡを含有する０．１Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０の緩衝液に緩衝液交換する。融合タンパク質に存在するＮ結合型グリカン（例えば、ｃＮｇ－Ｎ部位に位置するアスパラギンの側鎖に連結したグリカン）を除去するために、この溶液に、１．６７μＬのＰＮＧａｓｅ Ｆ酵素（Ｐｒｏｚｙｍｅ Ｎ－グリカナーゼ）を添加し、この混合物を３７℃の恒温器内で一晩インキュベートする。次に、試料をＬＣ－ＭＳ（ノババイオアッセイズ社、ウォバーン、マサチューセッツ州）による分析にかけ、グリカンを含まない所望のホモ二量体に対応する分子の分子量を得る。ｃＮｇ－アスパラギンからグリカンを切断するために用いられた酵素過程は、アスパラギン側鎖を脱アミノ化してアスパラギン酸の形成も引き起こすため、この質量のさらなる補正を次に行う。補正を行う場合、酵素処理後のホモ二量体は全体として２Ｄａ増加し、これは、ホモ二量体に存在する各鎖において、１Ｄａの質量に相当する。従って、実際の分子量は、分析試料中のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質構造の酵素修飾を補正するために、測定質量から２Ｄａを引いたものである。
インスリン－Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸組成が、天然グリコシル化がｃＮｇ部位で生じることを妨げるものである場合、当該分子をＰＮＧアーゼ酵素で前処理せずに、ＬＣ－ＭＳ（ノババイオアッセイズ社、ウォバーン、マサチューセッツ州）を用いて、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質質量の正確な評価を直接得ることができる。
実施例１０：分子ふるいクロマトグラフィーによるホモ二量体の割合
インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の分子ふるいクロマトグラフィー（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）は、２９９８フォトダイオードアレイに接続したＷａｔｅｒｓ ２７９５ＨＴ ＨＰＬＣ（ウォーターズ社（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ミルフォード、マサチューセッツ州）を用いて、２８０ｎｍの波長で行った。１００μＬ以下の、目的のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質を含有する試料を、流速０．２ｍＬ／分で、５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、および０．０５％ｗ／ｖアジ化ナトリウムを含むｐＨ６．２の移動相を用いて機能する、ＭＡｂＰａｃ ＳＥＣ－１、５μｍ、４×３００ｍｍカラム（サーモフィッシャー・サイエンティフィック社、ウォルサム、マサチューセッツ州）に注入した。このＭＡｂＰａｃ ＳＥＣ－１カラムは、分子サイズ分離の原則に基づいて機能する。すなわち、大型の可溶性インスリン－Ｆｃ凝集体（例えば、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質ホモ二量体の多量体）ほど、より早い滞留時間で溶出し、非凝集性のホモ二量体はより遅い滞留時間に溶出した。分析用ＳＥＣ－ＨＰＬＣにより、ホモ二量体の凝集型多量体からホモ二量体の混合物を分離する場合、非凝集型ホモ二量体の割合に対して、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質溶液の純度を確認した。
実施例１１：分子ふるいクロマトグラフィーによるホモ二量体の割合
インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の分子ふるいクロマトグラフィー（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）は、２９９８フォトダイオードアレイに接続したＷａｔｅｒｓ ２７９５ＨＴ ＨＰＬＣ（ウォーターズ社、ミルフォード、マサチューセッツ州）を用いて、２８０ｎｍの波長で行う。１００μＬ以下の、目的のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質を含有する試料を、流速０．２ｍＬ／分で、５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、および０．０５％ｗ／ｖアジ化ナトリウムを含むｐＨ６．２の移動相を用いて機能する、ＭＡｂＰａｃ ＳＥＣ－１、５μｍ、４×３００ｍｍカラム（サーモフィッシャー・サイエンティフィック社、ウォルサム、マサチューセッツ州）に注入する。このＭＡｂＰａｃ ＳＥＣ－１カラムは、分子サイズ分離の原則に基づいて機能する。すなわち、大型の可溶性インスリン－Ｆｃ凝集体（例えば、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質ホモ二量体の多量体）ほど、より早い滞留時間で溶出し、非凝集性のホモ二量体はより遅い滞留時間に溶出することとなる。分析用ＳＥＣ－ＨＰＬＣにより、ホモ二量体の凝集型多量体からホモ二量体の混合物を分離する場合、非凝集型ホモ二量体の割合に対して、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質溶液の純度を確認する。
実施例１２：インビトロでのＩＭ－９における例示的なインスリン－Ｆｃ融合タンパク質のインスリン受容体（ＩＲ）への４℃での結合
ヒトＩＲを発現するヒトＩＭ－９細胞（ＡＴＴＣ番号ＣＣＬ－１５９）を、５％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ完全培地中で、７０～８０％コンフルエントに培養・維持した。ＩＭ－９細胞の培養物を２５０×ｇ（約１０００ｒｐｍ）で１０分間遠心し、細胞をペレット化した。細胞をＨＢＳＳ緩衝液またはＰＢＳ緩衝液で１回洗浄し、８×１０６細胞／ｍＬの濃度となるように冷ＦＡＣＳ染色用培地（ＨＢＳＳ／２ｍＭ ＥＤＴＡ／０．１％ナトリウムアジド＋４％ウマ血清）中に再懸濁し、試験液が作製されるまで氷上または４℃で維持した。インスリン－Ｆｃタンパク質を、１．２ｍＬチューブ内で、ＦＡＣＳ緩衝液で１：３連続希釈して（各希釈液の体積はおよそ６０μＬ）、２×濃度とし、この溶液はピペッティングの準備ができるまで氷上で保冷した。
ビオチン化ＲＨＩをＦＡＣＳ染色用培地で１．２５μｇ／ｍＬの濃度に希釈した。４０μＬの連続希釈された試験化合物と、８μＬの１．２５μｇ／ｍＬビオチン－ＲＨＩを、Ｖ底マイクロタイタープレートの各ウェルに添加し、ゆっくりとしたボルテックスで混合し、氷上に置いた。次いで、４０μＬのＩＭ－９細胞懸濁液（８×１０６細胞／ｍＬ）をマルチチャンネルピペットで各ウェルに加え、再度穏やかに混合し、３０分間氷上でインキュベートして、ＩＭ－９細胞上のＩＲに対する競合的結合を生じさせた。次いで、Ｖ底プレートを３０００ｒｐｍで３分間遠心し、上清を吸引除去することにより、細胞を２７５μＬの氷冷ＦＡＣＳ洗浄バッファー（ＨＢＳＳ／２ｍＭ ＥＤＴＡ／０．１％ナトリウムアジド＋０．５％ウマ血清）で２回洗浄した。次いで、細胞を、１：１００希釈ストレプトアビジン－ＰＥ（ライフテクノロジーズ社（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を含有するＦＡＣＳ染色用培地４０μＬ中に再懸濁し、氷上で２０分間置いた。次いで、細胞を２７５μＬの氷冷ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄し、最後に、３％パラホルムアルデヒドで室温で１０分間固定した。次いで、細胞を２７５μＬの氷冷ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄し、２５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁し、分析を行った。
次いで、細胞を含有するＶ底プレートを、Ｇｕａｖａ ８－ＨＴフローサイトメーター（ミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））で分析した。各濃度の試験化合物について、ビオチン化ＲＨＩのＩＲへの結合を、ＦＡＣＳ ＦＬ－２チャネル上の細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）によって定量化した。対照ウェルはビオチン化ＲＨＩのみで標識されたものであり、各試験化合物濃度よりもたらされる阻害率（％）の算出に用いた。ＩＭ－９細胞に対するビオチン化ＲＨＩ結合の試験化合物による阻害率を、試験化合物の対数濃度に対してプロットし、得られたＩＣ５０値は、各試験化合物について、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（グラフパッド・ソフトウェア社（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）、ラ・ホーヤ、カリフォルニア州）を用いて算出したものである。従って、試験化合物のＩＣ５０値が低いほど、低濃度でのビオチン化ＲＨＩの阻害レベルが大きいことを示し、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質のＩＲへの結合が強いことを示している。また、非標識組換えヒトインスリン（ＲＨＩ）などの対照化合物を内部標準として用いて、ＲＨＩ ＩＣ５０を求め、これに対し、所与の化合物のＩＣ５０の比を得ることができた（ＩＣ５０（化合物）／ＩＣ５０（ＲＨＩ））。ＩＣ５０比が低いほど、ＲＨＩにより類似した結合を有していることとなり（ＩＲとの結合が強くなる）、ＩＣ５０比が高いほど、ＲＨＩに比べて、ＩＲとの結合が弱くなる。
実施例１３：インビトロでのＩＭ－９における例示的なインスリン－Ｆｃ融合タンパク質のインスリン受容体（ＩＲ）への４℃での結合
ヒトＩＲを発現するヒトＩＭ－９細胞（ＡＴＴＣ番号ＣＣＬ－１５９）を、５％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ完全培地中で、７０～８０％コンフルエントに培養・維持する。ＩＭ－９細胞の培養物を２５０×ｇ（約１０００ｒｐｍ）で１０分間遠心し、細胞をペレット化する。細胞をＨＢＳＳ緩衝液またはＰＢＳ緩衝液で１回洗浄し、８×１０６細胞／ｍＬの濃度となるように冷ＦＡＣＳ染色用培地（ＨＢＳＳ／２ｍＭ ＥＤＴＡ／０．１％ナトリウムアジド＋４％ウマ血清）中に再懸濁し、試験液が作製されるまで氷上または４℃で維持する。インスリン－Ｆｃタンパク質を、１．２ｍＬチューブ内で、ＦＡＣＳ緩衝液で１：３連続希釈して（各希釈液の体積はおよそ６０μＬ）、２×濃度とし、この溶液はピペッティングの準備ができるまで氷上で保冷する。
ビオチン化ＲＨＩをＦＡＣＳ染色用培地で１．２５μｇ／ｍＬの濃度に希釈する。４０μＬの連続希釈された試験化合物と、８μＬの１．２５μｇ／ｍＬビオチン－ＲＨＩを、Ｖ底マイクロタイタープレートの各ウェルに添加し、ゆっくりとしたボルテックスで混合し、氷上に置く。次いで、４０μＬのＩＭ－９細胞懸濁液（８×１０６細胞／ｍＬ）をマルチチャンネルピペットで各ウェルに加え、再度穏やかに混合し、３０分間氷上でインキュベートして、ＩＭ－９細胞上のＩＲに対する競合的結合を生じさせる。次いで、Ｖ底プレートを３０００ｒｐｍで３分間遠心し、上清を吸引除去することにより、細胞を２７５μＬの氷冷ＦＡＣＳ洗浄バッファー（ＨＢＳＳ／２ｍＭ ＥＤＴＡ／０．１％ナトリウムアジド＋０．５％ウマ血清）で２回洗浄する。次いで、細胞を、１：１００希釈ストレプトアビジン－ＰＥ（ライフテクノロジーズ社）を含有するＦＡＣＳ染色用培地４０μＬ中に再懸濁し、氷上で２０分間置く。次いで、細胞を２７５μＬの氷冷ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄し、最後に、３％パラホルムアルデヒドで室温で１０分間固定する。次いで、細胞を２７５μＬの氷冷ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄し、２５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁し、分析を行う。
次いで、細胞を含有するＶ底プレートを、Ｇｕａｖａ ８－ＨＴフローサイトメーター（ミリポア社）で分析する。各濃度の試験化合物について、ビオチン化ＲＨＩのＩＲへの結合を、ＦＡＣＳ ＦＬ－２チャネル上の細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）によって定量化する。対照ウェルはビオチン化ＲＨＩのみで標識されたものであり、各試験化合物濃度よりもたらされる阻害率（％）の算出に用いる。ＩＭ－９細胞に対するビオチン化ＲＨＩ結合の試験化合物による阻害率を、試験化合物の対数濃度に対してプロットし、得られるＩＣ５０値は、各試験化合物について、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（グラフパッド・ソフトウェア社、ラ・ホーヤ、カリフォルニア州）を用いて算出されるものである。従って、試験化合物のＩＣ５０値が低いほど、低濃度でのビオチン化ＲＨＩの阻害レベルが大きいことを示し、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質のＩＲへの結合が強いことを示している。また、非標識組換えヒトインスリン（ＲＨＩ）などの対照化合物を内部標準として用いて、ＲＨＩ ＩＣ５０を求め、これに対し、所与の化合物のＩＣ５０の比を得ることができる（ＩＣ５０（化合物）／ＩＣ５０（ＲＨＩ））。ＩＣ５０比が低いほど、ＲＨＩとの結合と類似しており（ＩＲとの結合が強い）、ＩＣ５０比が高いほど、ＲＨＩとの結合に対して、ＩＲとの結合が弱い。
実施例１４：インビトロヒトにおけるＦｃγＲＩ結合親和性アッセイ
ヒトＦｃγＲＩ（すなわち、ｒｈＦｃγＲＩ）を用いた以下のようなＥＬＩＳＡアッセイを用いて、ｐＨ７．４におけるインスリン－Ｆｃ融合タンパク質のＦｃγＲＩに対する結合を実施した。インスリン－Ｆｃ融合タンパク質を、ｐＨ９．６の炭酸水素ナトリウム緩衝液で１０μｇ／ｍＬに希釈し、Ｍａｘｉｓｏｒｐ（ヌンク社（Ｎｕｎｃ））マイクロタイタープレート上に４℃で一晩コートし、その後、そのマイクロプレートの各ストリップをＰＢＳＴ（ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０）緩衝液で５回洗浄し、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋブロッキング試薬（サーモフィッシャー社）でブロッキングした。ビオチン化ｒｈＦｃγＲＩ（組換えヒトＦｃγＲＩ；Ｒ＆Ｄシステムズ社（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ））の連続希釈物を、３０００ｎｇ／ｍＬから４．１ｎｇ／ｍＬまで、ＰＢＳＴ／１０％Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ緩衝液中で作製し、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質でコートされたマイクロプレートストリップ上に１００μＬ／ウェルで添加した。このマイクロタイタープレートを室温で１時間インキュベートした後、マイクロプレートストリップをＰＢＳＴで５回洗浄してから、ＰＢＳＴ／１０％Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ緩衝液で１：１００００希釈したストレプトアビジン－ＨＲＰを１００μＬ／ウェルで添加した。４５分間のインキュベーション後、マイクロプレートストリップを再度ＰＢＳＴで５回洗浄した。ＴＭＢを添加して結合したＦｃγＲＩタンパク質を除去し、ＥＬＩＳＡ反応停止試薬（ボストン・バイオプロダクツ社（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ））で停止させた。プレートをＥＬＩＳＡプレートリーダーにおいて４５０ｎｍで読み取り、各ウェルに添加されたｒｈＦｃγＲＩの対数濃度に対してＯＤ４５０値（ｒｈＦｃγＲＩのインスリン－Ｆｃタンパク質に対する結合に比例）をプロットして、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて結合曲線を作成した。曲線がやや似ている化合物の分類については、例えば３０００ｎｇ／ｍＬのｒｈＦｃγＲＩ濃度のような、高濃度のうちの１つにおけるＯＤ４５０を用いることで、コートされたインスリン－Ｆｃ融合タンパク質化合物間の違いを識別することができる。様々な時間にランが行われた複数のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質間の違いを比較するために、ヒトＦｃγＲＩアッセイにおけるＯＤ４５０比は、を、３０００ｎｇ／ｍＬのビオチン化ＦｃγＲＩ濃度で得られた試験インスリン－Ｆｃ融合タンパク質化合物のＯＤ４５０値を、３０００ｎｇ／ｍＬのビオチン化ＦｃγＲＩ濃度で得られた配列番号７６の参照インスリン－Ｆｃ融合タンパク質のＯＤ４５０値で割ったものとして算出した。
実施例１５：インビトロヒトにおけるＦｃγＲＩ結合親和性アッセイ
ヒトＦｃγＲＩ（すなわち、ｒｈＦｃγＲＩ）を用いた以下のようなＥＬＩＳＡアッセイを用いて、ｐＨ７．４におけるインスリン－Ｆｃ融合タンパク質のＦｃγＲＩに対する結合を実施する。インスリン－Ｆｃ融合タンパク質を、ｐＨ９．６の炭酸水素ナトリウム緩衝液で１０μｇ／ｍＬに希釈し、Ｍａｘｉｓｏｒｐ（ヌンク社）マイクロタイタープレート上に４℃で一晩コートし、その後、そのマイクロプレートの各ストリップをＰＢＳＴ（ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０）緩衝液で５回洗浄し、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋブロッキング試薬（サーモフィッシャー社）でブロッキングする。ビオチン化ｒｈＦｃγＲＩ（組換えヒトＦｃγＲＩ；Ｒ＆Ｄシステムズ社）の連続希釈物を、３０００ｎｇ／ｍＬから４．１ｎｇ／ｍＬまで、ＰＢＳＴ／１０％Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ緩衝液中で作製し、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質でコートされたマイクロプレートストリップ上に１００μＬ／ウェルで添加する。このマイクロタイタープレートを室温で１時間インキュベートした後、マイクロプレートストリップをＰＢＳＴで５回洗浄してから、ＰＢＳＴ／１０％Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ緩衝液で１：１００００希釈したストレプトアビジン－ＨＲＰを１００μＬ／ウェルで添加する。４５分間のインキュベーション後、マイクロプレートストリップを再度ＰＢＳＴで５回洗浄する。ＴＭＢを添加して結合したＦｃγＲＩタンパク質を除去し、ＥＬＩＳＡ反応停止試薬（ボストン・バイオプロダクツ社）で停止させる。プレートをＥＬＩＳＡプレートリーダーにおいて４５０ｎｍで読み取り、各ウェルに添加されたｒｈＦｃγＲＩの対数濃度に対してＯＤ４５０値（ｒｈＦｃγＲＩのインスリン－Ｆｃタンパク質に対する結合に比例）をプロットして、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて結合曲線を作成する。曲線がやや似ている化合物の分類については、例えば３０００ｎｇ／ｍＬのｒｈＦｃγＲＩ濃度のような、高濃度のうちの１つにおけるＯＤ４５０を用いることで、コートされたインスリン－Ｆｃ融合タンパク質化合物間の違いを識別することができる。様々な時間にランが行われた複数のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質間の違いを比較するために、ヒトＦｃγＲＩアッセイにおけるＯＤ４５０比は、を、３０００ｎｇ／ｍＬのビオチン化ＦｃγＲＩ濃度で得られた試験インスリン－Ｆｃ融合タンパク質化合物のＯＤ４５０値を、３０００ｎｇ／ｍＬのビオチン化ＦｃγＲＩ濃度で得られた配列番号７６の参照インスリン－Ｆｃ融合タンパク質のＯＤ４５０値で割ったものとして算出する。
実施例１６：インビトロにおけるＣ１ｑ結合親和性アッセイ
ヒト補体成分Ｃ１ｑを用いた以下のようなＥＬＩＳＡアッセイを用いて、ｐＨ７．４におけるインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の補体成分Ｃ１ｑに対する結合を実施した。インスリン－Ｆｃ融合タンパク質を、ｐＨ９．６の炭酸水素ナトリウム緩衝液で１０μｇ／ｍＬに希釈し、Ｍａｘｉｓｏｒｐ（ヌンク社（Ｎｕｎｃ））マイクロタイタープレート上に４℃で一晩コートし、その後、そのマイクロプレートの各ストリップをＰＢＳＴ（ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０）緩衝液で５回洗浄し、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋブロッキング試薬（サーモフィッシャー社）でブロッキングした。ビオチン化補体成分Ｃ１ｑ（ヒト補体成分Ｃ１ｑ；シグマ・アルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ））の連続希釈物を、１０００ｎｇ／ｍＬから１．４ｎｇ／ｍＬまで、ＰＢＳＴ／１０％Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ緩衝液中で作製し、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質でコートされたマイクロプレートストリップ上に１００μＬ／ウェルで添加した。このマイクロタイタープレートを室温で１時間インキュベートした後、マイクロプレートストリップをＰＢＳＴで５回洗浄してから、ＰＢＳＴ／１０％Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ緩衝液で１：１２０００希釈したストレプトアビジン－ＨＲＰを１００μＬ／ウェルで添加した。４５分間のインキュベーション後、マイクロプレートストリップを再度ＰＢＳＴで５回洗浄した。ＴＭＢを添加して結合した補体Ｃ１ｑタンパク質を除去し、ＥＬＩＳＡ反応停止試薬（ボストン・バイオプロダクツ社）で停止させた。プレート吸光度をＥＬＩＳＡプレートリーダーにおいて４５０ｎｍで読み取り（ＯＤ４５０）、各ウェルに添加された補体成分Ｃ１ｑの対数濃度に対してこのＯＤ４５０値（補体成分Ｃ１ｑのインスリン－Ｆｃタンパク質に対する結合に比例）をプロットして、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて結合曲線を作成した。曲線がやや似ている化合物の分類については、例えば１０００ｎｇ／ｍＬの補体成分Ｃ１ｑ濃度のような、高濃度のうちの１つにおけるＯＤ４５０を用いることで、コートされたインスリン－Ｆｃ融合タンパク質化合物間の違いを識別した。さらに、様々な時間にランが行われた複数のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質間の違いを比較するために、ヒトＣ１ｑアッセイにおけるＯＤ４５０比は、を、１０００ｎｇ／ｍＬのビオチン化Ｃ１ｑ濃度で得られた試験インスリン－Ｆｃ融合タンパク質化合物のＯＤ４５０を、１０００ｎｇ／ｍＬのビオチン化Ｃ１ｑ濃度で得られた配列番号７６の参照インスリン－Ｆｃ融合タンパク質のＯＤ４５０で割ったものとして算出した。
実施例１７：インビトロにおけるＣ１ｑ結合親和性アッセイ
ヒト補体成分Ｃ１ｑを用いた以下のようなＥＬＩＳＡアッセイを用いて、ｐＨ７．４におけるインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の補体成分Ｃ１ｑに対する結合を実施する。インスリン－Ｆｃ化合物を、ｐＨ９．６の炭酸水素ナトリウム緩衝液で１０μｇ／ｍＬに希釈し、Ｍａｘｉｓｏｒｐ（ヌンク社）マイクロタイタープレート上に４℃で一晩コートし、その後、そのマイクロプレートの各ストリップをＰＢＳＴ（ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０）緩衝液で５回洗浄し、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋブロッキング試薬（サーモフィッシャー社）でブロッキングする。ビオチン化補体成分Ｃ１ｑ（ヒト補体成分Ｃ１ｑ；シグマ・アルドリッチ社）の連続希釈物を、１０００ｎｇ／ｍＬから１．４ｎｇ／ｍＬまで、ＰＢＳＴ／１０％Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ緩衝液中で作製し、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質でコートされたマイクロプレートストリップ上に１００μＬ／ウェルで添加する。このマイクロタイタープレートを室温で１時間インキュベートした後、マイクロプレートストリップをＰＢＳＴで５回洗浄してから、ＰＢＳＴ／１０％Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ緩衝液で１：１２０００希釈したストレプトアビジン－ＨＲＰを１００μＬ／ウェルで添加する。４５分間のインキュベーション後、マイクロプレートストリップを再度ＰＢＳＴで５回洗浄する。ＴＭＢを添加して結合した補体Ｃ１ｑタンパク質を除去し、ＥＬＩＳＡ反応停止試薬（ボストン・バイオプロダクツ社）で停止させる。プレート吸光度をＥＬＩＳＡプレートリーダーにおいて４５０ｎｍで読み取り（ＯＤ４５０）、各ウェルに添加された補体成分Ｃ１ｑの対数濃度に対してこのＯＤ４５０値（補体成分Ｃ１ｑのインスリン－Ｆｃタンパク質に対する結合に比例）をプロットして、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて結合曲線を作成する。曲線がやや似ている化合物の分類については、例えば１０００ｎｇ／ｍＬの補体成分Ｃ１ｑ濃度のような、高濃度のうちの１つにおけるＯＤ４５０を用いることで、コートされたインスリン－Ｆｃ融合タンパク質化合物間の違いを識別することができる。さらに、様々な時間にランが行われた複数のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質間の違いを比較するために、ヒトＣ１ｑアッセイにおけるＯＤ４５０比は、を、１０００ｎｇ／ｍＬのビオチン化Ｃ１ｑ濃度で得られた試験インスリン－Ｆｃ融合タンパク質化合物のＯＤ４５０を、１０００ｎｇ／ｍＬのビオチン化Ｃ１ｑ濃度で得られた配列番号７６の参照インスリン－Ｆｃ融合タンパク質のＯＤ４５０で割ったものとして算出する。
実施例１８：インビトロにおけるインスリン－Ｆｃ融合タンパク質のイヌＦｃＲｎ受容体に対する親和性の測定
イヌＩｇＧ由来のＦｃフラグメントを含むインスリン－Ｆｃ融合タンパク質のイヌＦｃＲｎ受容体に対するインビトロ結合親和性を、溶液ｐＨ５．５で実施されたＥＬＩＳＡ法により測定した。この弱酸性のｐＨは、Ｆｃフラグメント含有分子がＦｃＲｎ受容体に結合するのに好ましい結合環境である。インビボでは、細胞はＦｃＲｎを細胞表面上に発現し、また、エンドソーム内に内部発現する。Ｆｃフラグメントを含む分子が天然プロセス（ピノサイトーシスやエンドサイトーシスなど）を通じて細胞に運ばれると、エンドソーム内ではｐＨがより低いｐＨへと変化するため、そこでＦｃＲｎ受容体がエンドソーム－リソソーム区画で分解されるはずであったＦｃフラグメント含有分子に結合し、それによって、これらの分子がｐＨが中性付近（例えば、ｐＨ７．０～７．４）である細胞表面に戻されて再利用される。中性ｐＨはＦｃＲｎ受容体に対する結合に好適でないため、Ｆｃフラグメント含有分子は放出されて、血行中に戻される。これが、Ｆｃフラグメント含有分子がインビボにおいて示す薬物動態学的な血中半減期が長い、主な仕組みである。
イヌ由来Ｆｃフラグメントを含むインスリン－Ｆｃ融合タンパク質を炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）で１０μｇ／ｍｌに希釈し、Ｍａｘｉｓｏｒｂ ＥＬＩＳＡプレートストリップ上に室温で１～２時間、デュプリケートでコートした。次いで、各ストリップをＰＢＳＴ（ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０）緩衝液で４回洗浄し、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋブロッキング試薬（サーモフィッシャー社）で洗浄した。次いで、ＦｃＲｎ結合用のストリップを、再度、ｐＨ５．５のＭＥＳ／ＮａＣｌ／Ｔｗｅｅｎ（５０ｍＭ ＭＥＳ／１５０ｍＭ ＮａＣｌ／０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０）緩衝液で２回洗浄し、その後、ＦｃＲｎ試薬（ビオチン化イヌＦｃＲｎ；イムニトラック社（Ｉｍｍｕｎｉｔｒａｃｋ））を添加した。ビオチン化ＦｃＲｎ試薬の連続希釈物（１：３希釈）を、１０００ｎｇ／ｍｌから０．４５ｎｇ／ｍＬまでの濃度で、ｐＨ５．５のＭＥＳ／ＮａＣｌ／Ｔｗｅｅｎ／１０％Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ緩衝液中で作製し、マルチチャネルピペッターを用いて、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質化合物でコートされたストリップ上に１００μＬ／ウェルで添加した。その後、このアッセイプレートを室温で１時間インキュベートした。ＦｃＲｎが結合中のストリップをｐＨ５．５のＭＥＳ／ＮａＣｌ／Ｔｗｅｅｎ緩衝液で４回洗浄した後、ｐＨ５．５のＭＥＳ／ＮａＣｌ／１０％Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ緩衝液で１：１００００希釈されたストレプトアビジン－ＨＲＰを１００μｌ／ウェルで添加した。４５分間のインキュベーション後、再度ストリップをｐＨ５．５のＭＥＳ／ＮａＣｌ／Ｔｗｅｅｎ緩衝液で４回洗浄した。最後に、ＴＭＢを添加することで、結合したビオチン化イヌＦｃＲｎ試薬を除去し、発色はＥＬＩＳＡ反応停止試薬で停止させた。ＥＬＩＳＡプレートリーダーにおいて４５０ｎｍの波長でプレートの読み取りを行った。ＯＤ値（イヌＦｃＲｎのインスリン－Ｆｃ融合タンパク質試験化合物に対する結合に比例）を、各ウェルに添加されたＦｃＲｎの対数濃度に対してプロットして、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて結合曲線を作成した。各結合曲線のＥＣ５０値を算出し、様々な化合物間で比較を行った。
実施例１９：インビトロにおけるインスリン－Ｆｃ融合タンパク質のヒトＦｃＲｎ受容体に対する親和性の測定
ヒトＩｇＧ由来のＦｃフラグメントを含むインスリン－Ｆｃ融合タンパク質のヒトＦｃＲｎ受容体に対するインビトロ結合親和性を、溶液ｐＨ５．５で実施されたＥＬＩＳＡ法により測定した。この弱酸性のｐＨは、Ｆｃフラグメント含有分子がＦｃＲｎ受容体に結合するのに好ましい結合環境である。インビボでは、細胞はＦｃＲｎを細胞表面上に発現し、また、エンドソーム内に内部発現する。Ｆｃフラグメントを含む分子が天然プロセス（ピノサイトーシスやエンドサイトーシスなど）を通じて細胞に運ばれると、エンドソーム内ではｐＨがより低いｐＨへと変化するため、そこでＦｃＲｎ受容体がエンドソーム－リソソーム区画で分解されるはずであったＦｃフラグメント含有分子に結合し、それによって、これらの分子がｐＨが中性付近（例えば、ｐＨ７．０～７．４）である細胞表面に戻されて再利用される。中性ｐＨはＦｃＲｎ受容体に対する結合に好適でないため、Ｆｃフラグメント含有分子は放出されて、血行中に戻される。これが、Ｆｃフラグメント含有分子がインビボにおいて示す薬物動態学的な血中半減期が長い、主な仕組みである。
Ｆｃフラグメントを含むインスリン－Ｆｃ融合タンパク質を炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）で１０μｇ／ｍＬに希釈し、Ｍａｘｉｓｏｒｂ ＥＬＩＳＡプレートストリップ上に室温で１～２時間、デュプリケートでコートした。次いで、各ストリップをＰＢＳＴ（ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０）緩衝液で５回洗浄し、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋブロッキング試薬（サーモフィッシャー社）で洗浄した。次いで、ＦｃＲｎ結合用のストリップを、再度、ｐＨ５．５のＭＥＳ／ＮａＣｌ／Ｔｗｅｅｎ（５０ｍＭ ＭＥＳ／１５０ｍＭ ＮａＣｌ／０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０）緩衝液で３回洗浄し、その後、ＦｃＲｎ試薬（ビオチン化ヒトＦｃＲｎ；イムニトラック社）を添加した。ビオチン化ＦｃＲｎ試薬の連続希釈物（１：３希釈）を、６０００ｎｇ／ｍＬから８．２３ｎｇ／ｍＬまでの濃度で、ｐＨ５．５のＭＥＳ／ＮａＣｌ／Ｔｗｅｅｎ／５％Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ緩衝液中で作製し、マルチチャネルピペッターを用いて、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質化合物でコートされたストリップ上に１００μＬ／ウェルで添加した。その後、このアッセイプレートを室温で１．５時間インキュベートした。ＦｃＲｎが結合中のストリップをｐＨ５．５のＭＥＳ／ＮａＣｌ／Ｔｗｅｅｎ緩衝液で４回洗浄した後、ｐＨ５．５のＭＥＳ／ＮａＣｌ／５％Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ緩衝液で１：１００００希釈されたストレプトアビジン－ＨＲＰを１００μｌ／ウェルで添加した。４５分間のインキュベーション後、再度ストリップをｐＨ５．５のＭＥＳ／ＮａＣｌ／Ｔｗｅｅｎ緩衝液で５回洗浄した。最後に、ＴＭＢを添加することで、結合したビオチン化ＦｃＲｎ試薬を除去し、発色はＥＬＩＳＡ反応停止試薬で停止させた。ＥＬＩＳＡプレートリーダーにおいて４５０ｎｍの波長でプレートの読み取りを行った。ＯＤ４５０値（ヒトＦｃＲｎのインスリン－Ｆｃ融合タンパク質試験化合物に対する結合に比例）を、各ウェルに添加されたＦｃＲｎの対数濃度に対してプロットして、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて結合曲線を作成した。各結合曲線のＥＣ５０値を算出し、様々な化合物間で比較を行った。
実施例２０：インビトロにおけるインスリン－Ｆｃ融合タンパク質のヒトＦｃＲｎ受容体に対する親和性の測定
ヒトＩｇＧ由来のＦｃフラグメントを含むインスリン－Ｆｃ融合タンパク質のヒトＦｃＲｎ受容体に対するインビトロ結合親和性を、溶液ｐＨ５．５で実施されたＥＬＩＳＡ法により測定する。この弱酸性のｐＨは、Ｆｃフラグメント含有分子がＦｃＲｎ受容体に結合するのに好ましい結合環境である。インビボでは、細胞はＦｃＲｎを細胞表面上に発現し、また、エンドソーム内に内部発現する。Ｆｃフラグメントを含む分子が天然プロセス（ピノサイトーシスやエンドサイトーシスなど）を通じて細胞に運ばれると、エンドソーム内ではｐＨがより低いｐＨへと変化するため、そこでＦｃＲｎ受容体がエンドソーム－リソソーム区画で分解されるはずであったＦｃフラグメント含有分子に結合し、それによって、これらの分子がｐＨが中性付近（例えば、ｐＨ７．０～７．４）である細胞表面に戻されて再利用される。中性ｐＨはＦｃＲｎ受容体に対する結合に好適でないため、Ｆｃフラグメント含有分子は放出されて、血行中に戻される。これが、Ｆｃフラグメント含有分子がインビボにおいて示す薬物動態学的な血中半減期が長い、主な仕組みである。
イヌ由来Ｆｃフラグメントを含むインスリン－Ｆｃ融合タンパク質を炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）で１０μｇ／ｍＬに希釈し、Ｍａｘｉｓｏｒｂ ＥＬＩＳＡプレートストリップ上に室温で１～２時間、デュプリケートでコートする。次いで、各ストリップをＰＢＳＴ（ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０）緩衝液で５回洗浄し、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋブロッキング試薬（サーモフィッシャー社）で洗浄した。次いで、ＦｃＲｎ結合用のストリップを、再度、ｐＨ５．５のＭＥＳ／ＮａＣｌ／Ｔｗｅｅｎ（５０ｍＭ ＭＥＳ／１５０ｍＭ ＮａＣｌ／０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０）緩衝液で３回洗浄し、その後、ＦｃＲｎ試薬（ビオチン化イヌＦｃＲｎ；イムニトラック社）を添加した。ビオチン化ＦｃＲｎ試薬の連続希釈物（１：３希釈）を、６０００ｎｇ／ｍＬから８．２３ｎｇ／ｍＬまでの濃度で、ｐＨ５．５のＭＥＳ／ＮａＣｌ／Ｔｗｅｅｎ／５％Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ緩衝液中で作製し、マルチチャネルピペッターを用いて、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質化合物でコートされたストリップ上に１００μＬ／ウェルで添加する。その後、このアッセイプレートを室温で１．５時間インキュベートする。ＦｃＲｎが結合中のストリップをｐＨ５．５のＭＥＳ／ＮａＣｌ／Ｔｗｅｅｎ緩衝液で４回洗浄した後、ｐＨ５．５のＭＥＳ／ＮａＣｌ／５％Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ緩衝液で１：１００００希釈されたストレプトアビジン－ＨＲＰを１００μｌ／ウェルで添加する。４５分間のインキュベーション後、再度ストリップをｐＨ５．５のＭＥＳ／ＮａＣｌ／Ｔｗｅｅｎ緩衝液で５回洗浄する。最後に、ＴＭＢを添加することで、結合したビオチン化ＦｃＲｎ試薬を除去し、発色はＥＬＩＳＡ反応停止試薬で停止させる。ＥＬＩＳＡプレートリーダーにおいて４５０ｎｍの波長でプレートの読み取りを行う。ＯＤ４５０値（ヒトＦｃＲｎのインスリン－Ｆｃ融合タンパク質試験化合物に対する結合に比例）を、各ウェルに添加されたＦｃＲｎの対数濃度に対してプロットして、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて結合曲線を作成する。各結合曲線のＥＣ５０値を算出し、様々な化合物間で比較を行う。
実施例２１：イヌにイヌインスリンＦｃ融合タンパク質を単回投与した後のインビボ薬物動態（ＰＤ）を求めるための一般化手順
イヌにおける空腹時血糖値に対する作用について、以下のように、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質を評価した。およそ１０～１５ｋｇの重量の、Ｎ＝１、２、３、またはそれ以上の、健常な抗体未処置のイヌを、各インスリン－Ｆｃ融合タンパク質に対して１匹ずつ用いた。アナフィラキシー、嗜眠、窮迫、疼痛などの徴候がないか、動物の観察も１日２回行い、所望によりいくつかの化合物については、追加で３週間以上の皮下注射により治療を継続し、中和抗薬物抗体の誘導性を示すものとして重要な、当該化合物のグルコース低減能が経時的に低下するかどうかの確認を行った。０日目、動物に、インスリンＦｃ融合タンパク質ホモ二量体を含有する医薬組成物の、静脈内投与または皮下投与による単回投与を、１０～５０ｍＭのリン酸水素ナトリウム、５０～１５０ｍＭの塩化ナトリウム、０．００５～０．０５％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ－８０、および所望により濃度０．０２～１．００ｍｇ／ｍＬの静菌剤（例えば、フェノール、ｍ‐クレゾール、またはメチルパラベン）の溶液中１～１０ｍｇ／ｍＬの濃度、７．０～８．０の溶液ｐＨ、０．０８～０．８０ｍｇのインスリン－Ｆｃ融合タンパク質／ｋｇ（または、モルベースで、およそ１．２～１２．３ｎｍｏｌ／ｋｇまたはおよそ０．４～４．０Ｕ／ｋｇのインスリン当量に相当）の投与量で、実施した。０日目に、注射の直前と、注射の１５分後、３０分後、４５分後、６０分後、１２０分後、２４０分後、３６０分後、および４８０分後、並びに１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後、および７日後に、適当な静脈から、血液を採取した。
それぞれの時点について、最低１ｍＬの全血を採取した。グルコース計（ＡＣＣＵ－ＣＨＥＫ（登録商標）Ａｖｉｖａ Ｐｌｕｓ）を用いて直ちにグルコースレベルの読み取りを行い、これにはおよそ１滴の血液が必要であった。０日目から７日目までの平均空腹時血糖値％（％ＦＢＧＬ）をプロットし、所与のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の生物活性を評価した。
実施例２２：イヌにイヌインスリン－Ｆｃ融合タンパク質を反復投与した後のインビボ薬物動態（ＰＤ）を求めるための一般化手順
反復注射の際の血糖値に対する作用について、以下のように、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質を評価した。およそ１０ｋｇ～２０ｋｇの重量の健常な抗体未処置のイヌを用いて、各動物にインスリン－Ｆｃ融合タンパク質を反復投与した。アナフィラキシー、嗜眠、窮迫、疼痛などの負の副作用の徴候がないか、動物を１日２回観察し、所望によりいくつかの化合物については、追加で２～５回の皮下注射の分だけ治療を継続し、インビボで中和抗薬物抗体が存在する可能性を示す、当該化合物のグルコース低減能が経時的に低下するかどうかの確認を行った。０日目、動物に、インスリンＦｃ融合タンパク質を含有する医薬組成物の単回皮下注射を、１０～５０ｍＭのリン酸水素ナトリウム、５０～１５０ｍＭの塩化ナトリウム、０．００５～０．０５％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ－８０、および所望により濃度０．０２～１．００ｍｇ／ｍＬの静菌剤（例えば、フェノール、ｍ‐クレゾール、またはメチルパラベン）の溶液中、７．０～８．０の溶液ｐＨ、０．０８～０．８０ｍｇのインスリン－Ｆｃ融合タンパク質／ｋｇ（または、モルベースで、およそ１．２～１２．３ｎｍｏｌ／ｋｇまたはおよそ０．４～４．０Ｕ／ｋｇのインスリン当量に相当）の投与量で、実施した。０日目に、注射の直前と、注射の１５分後、３０分後、４５分後、６０分後、１２０分後、２４０分後、３６０分後、および４８０分後、並びに１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後、および７日後に、適当な静脈から、血液を採取した。
その後、皮下注射は週１回よりも少ない頻度で行い、場合によっては、所与のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質製剤の薬力学に基づいて異なる間隔で注射を行った。その後、明らかとなったインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の薬力学に応じて、各インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の注射を、より高用量またはより低用量に調整した。例えば、０日目の１回目注射の投与量が血糖を低下させる際に不十分であると分かった場合、注射されるインスリン－Ｆｃ融合タンパク質のその後の投与量レベルは上向きに調整した。同様に、０日目の１回目注射の投与量によるグルコースの低減が強力過ぎると分かった場合、注射されるインスリン－Ｆｃ融合タンパク質のその後の投与量レベルは下向きに調整した。また、中間投与量や最終投与量も、必要に応じて同様に調整できることが分かった。各投与量について、注射の直前と、注射の１５分後、３０分後、４５分後、６０分後、１２０分後、２４０分後、３６０分後、および４８０分後、並びに１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後、および７日後（並びに所望により１４日後）に、適当な静脈から、血液を採取した。それぞれの時点について、最低１ｍＬの全血を採取した。グルコース計（ＡＣＣＵ－ＣＨＥＫ（登録商標）Ａｖｉｖａ Ｐｌｕｓ）を用いて直ちにグルコースレベルの読み取りを行い、これにはおよそ１滴の血液が必要であった。試験全体を通じた平均空腹時血糖値％（％ＦＢＧＬ）を、融合タンパク質の生物活性を求めた時点に対して、プロットした。
各投与量の生物活性を求めるため、曲線上面積（ＡＯＣ）解析を以下のように行った。時間に対する％ＦＢＧＬのデータを作成した後、そのデータを、データ解析ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ、グラフパッド・ソフトウェア社、サンディエゴ、カリフォルニア州）に入力した。このソフトウェアを用いて、まず、曲線下面積解析（ＡＵＣ）を行って、各投与量について、％ＦＢＧＬ対時間曲線下面積の積分を行った。ＡＵＣデータを所望のＡＯＣデータに変換するために、以下の式を用いた：ＡＯＣ＝ＴＰＡ－ＡＵＣ；式中、ＴＰＡは、各投与存続期間（例えば、７日間、１４日間など）に、１００％（ここで、１００％は％ＦＢＧＬ対時間曲線のｙ＝１００％を表す）を掛けて得られる、総可能面積である。例えば、投与量存続期間が７日間であり、算出されたＡＵＣが５００％ＦＢＧＬ・日である場合、ＡＯＣは以下の通りに算出される：ＡＯＣ＝（１００％ＦＢＧＬ×７日）－（５００％ＦＢＧＬ・日）＝２００％ＦＢＧＬ・日。一連の注射量の注射量ごとにこの解析を行い、１回目注射、２回目注射、３回目注射などの場合のＡＯＣ値を得た。
前述のようにインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の投与量は異なる場合があるため、所与のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質について算出された全てのＡＯＣ値を、特定の投与量の当該インスリン－Ｆｃ融合タンパク質に対して、正規化した方が、都合がよい場合が多い。そうすることで、所与の試験の注射間で投与量レベルが変化しても、複数の注射間で、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質のグルコース低減能を、簡便に比較することが可能になる。所与の投与量の正規化後のＡＯＣ（ＮＡＯＣ）は以下のように算出した：ＮＡＯＣ＝ＡＯＣ／Ｄ（単位は％ＦＢＧＬ・日・ｋｇ／ｍｇ）；式中、Ｄはｍｇ／ｋｇを単位とする動物に注射された実際の投与量である。所与の動物において、一連の注射のそれぞれ注射ごとにＮＡＯＣ値を算出し、同じインスリン－Ｆｃ融合タンパク質製剤を投与された動物群間で平均した。
所与の動物において、一連の注射の注射ごとのＮＡＯＣ比（ＮＡＯＣＲ）を、以下のように、注射ごと（例えば１回目注射、２回目注射、３回目注射、…Ｎ回目注射）のＮＡＯＣ値を求め、所与の注射のそれぞれのＮＡＯＣを１回目注射から得られたＮＡＯＣで割ることにより算出した：
ＮＡＯＣＲ＝（ＮＡＯＣ（Ｎ回目注射）／ＮＡＯＣ（１回目注射））。
一連の注射のＮ回目注射についての所与のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質製剤のＮＡＯＣＲを評価することによって、インビボにおける所与のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質のグルコース低減能が、一連のＮ回の投与の間に、その生物活性を実質的に保持した（例えば、Ｎ回目投与のＮＡＯＣＲが０．５より大きい）かどうか、あるいは、所与のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質のインビボでのグルコース低減活性が、Ｎ回の投与の間に、その効力のかなりの部分を失った（例えば、Ｎ回目投与のＮＡＯＣＲが０．５未満）かどうか、を判定することができ、これにより、インビボにおいて中和抗薬物抗体が形成される可能性が示される。好ましい実施形態において、３回目皮下注射後のＮＡＯＣの、１回目皮下注射後のＮＡＯＣに対する比は、０．５よりも大きかった（すなわち、３回目の皮下注射のＮＡＯＣＲは０．５よりも大きかった）。
実施例２３：イヌ血清中のイヌインスリン－Ｆｃ融合タンパク質のインビボ薬物動態（ＰＫ）を求めるための一般化手順
イヌ血清中のイヌアイソタイプのＦｃフラグメントを含むインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の濃度を測定するためのアッセイを、以下のように構築した。このアッセイにはサンドイッチ形式のＥＬＩＳＡが含まれ、当該ＥＬＩＳＡでは、血清試料中の治療化合物を、ＥＬＩＳＡプレート上にコートされた抗インスリン／プロインスリンモノクローナル抗体（ｍＡｂ）に捕捉させ、次いでＨＲＰ結合型抗イヌＩｇＧ Ｆｃ特異的抗体で検出し、その後、ＴＭＢ基質系を用いて発色を行った。Ｍａｘｉｓｏｒｐ ＥＬＩＳＡプレート（ヌンク社）を、コーティング緩衝液（ｐＨ＝９．６の炭酸ナトリウム－重炭酸ナトリウム緩衝液）中５μｇ／ｍｌの抗インスリンｍＡｂクローンＤ６Ｃ４（バイオラド社（Ｂｉｏｒａｄ））で、４℃で一晩コートした。次いで、プレートを、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で５回洗浄し、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋブロッキング液（サーモフィッシャー社）で室温で最低１時間（または４Ｃで一晩）ブロッキングした。試験血清試料をＰＢＳＴ／ＳＢ／２０％ＨＳ試料希釈緩衝液（ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０＋１０％ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ＋２０％ウマ血清）で１：２０希釈した。検量線を作成する場合、目的のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質を、試料希釈緩衝液（ＰＢＳＴ／ＳＢ／２０％ＨＳ）＋５％ビーグル血清プール（バイオＩＶＴ社（ＢｉｏＩＶＴ））で、２００ｎｇ／ｍｌから０．８２ｎｇ／ｍｌまでの濃度範囲で、１：２．５連続希釈で、希釈した。標準および希釈後血清試料を、デュプリケートで１００μｌ／ウェルでブロッキング後のプレートに添加し、室温で１時間インキュベートした。インキュベーション後、試料および標準をＰＢＳＴで５回洗い流した。ＨＲＰ結合型ヤギ抗イヌＩｇＧ Ｆｃ（シグマ社）検出用抗体をＰＢＳＴ／ＳＢ／２０％ＨＳ緩衝液で約１：１５，０００希釈し、１００μｌを全てのウェルに添加し、室温、暗所で４５分間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで５回、脱イオン水で１回洗浄し、１００μｌ／ウェルのＴＭＢ（インビトロジェン社）を室温で８～１０分間添加することで発色させた。その後、１００μｌ／ウェルのＥＬＩＳＡ停止液（ボストン・バイオプロダクツ社）を添加することで発色を停止させ、３０分以内にＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダー（モレキュラーデバイス社）を用いて４５０ｎｍの吸光度を読み取った。試料中のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質化合物の濃度は、ＳｏｆｔＭａｘＰｒｏソフトウェアを用いて４－ＰＬ曲線上の補間を行うことにより算出した。
実施例２４：イヌ血清中の抗薬物抗体を測定するためのアッセイプロトコル
Ｍａｘｉｓｏｒｐ ＥＬＩＳＡプレート（ヌンク社）を、コーティング緩衝液（ｐＨ＝９．６、炭酸塩－重炭酸塩（Ｂｉｏｃａｒｂｏｎａｔｅ）緩衝液）で希釈された、１０μｇ／ｍＬの目的のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質で４℃で一晩コートし、試験化合物に対するＡＤＡの測定を行った。イヌＩｇＧ由来のＦｃフラグメントを含むインスリン－Ｆｃ融合タンパク質のインスリン部分に対するＡＤＡの測定のために、プレートをコーティング緩衝液中３０μｇ／ｍＬの精製インスリンでコートした。次いで、プレートを、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で５回洗浄し、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋブロッキング液（サーモフィッシャー社、ウォルサム、マサチューセッツ州）で少なくとも１時間（または一晩）ブロッキングした。イヌＩｇＧユニットにおけるＡＤＡを算出するため、ストリップを直接、ｐＨ＝９．６の炭酸－重炭酸（Ｂｉｏｃａｒｂ）コーティング緩衝液で１：２連続希釈した、濃度３００～４．６９ｎｇ／ｍｌのイヌＩｇＧ（ジャクソン・イムノリサーチ・ラボラトリーズ社（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ウェスト・グローブ、ペンシルベニア州）で、４℃で一晩コートし、７点疑似検量線の作成に用いた。標準用のストリッププレートも、洗浄して、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋブロッキング液で少なくとも１時間（または一晩）ブロッキングした。
試験血清試料をＰＢＳＴ／ＳＢ／２０％ＨＳ試料希釈緩衝液（ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０＋１０％ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ＋２０％ウマ血清）で１：１００以上（通常、１：２００として試験）に希釈し、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質でコート（またはＲＨＩでコート）したストリップに１００μＬ／ウェルでデュプリケートで添加した。イヌＩｇＧでコートした標準用ストリップのデュプリケートストリップも各プレートに加え、ＰＢＳＴ／ＳＢ（ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０＋１０％ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ）緩衝液を１００μＬ／ウェルで添加した。プレートを室温で１時間インキュベートした後、ＰＢＳＴで５回洗浄した。ＡＤＡの検出のために、ＨＲＰ結合型ヤギ抗ネコＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２（抗ネコＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２試薬はイヌ抗体に対して交差反応性を示した；ジャクソン・イムノリサーチ・ラボラトリーズ社、ウェスト・グローブ、ペンシルベニア州）をＰＢＳＴ／ＳＢで１：１００００希釈し、試料ウェルと標準ウェルの両方に１００μＬ／ウェルで添加し、室温、暗所で４５分間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで５回、次いで脱イオン水で１回洗浄した後、１００μＬ／ウェルのＴＭＢ基質（インビトロジェン、サーモフィッシャー・サイエンティフィック社、ウォルサム、マサチューセッツ州）を添加して室温、暗所で１５～２０分間置くことで、発色させた。その後、１００μＬ／ウェルのＥＬＩＳＡ停止液（ボストン・バイオプロダクツ社）を添加することで発色を停止させ、３０分以内にＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダーを用いて４５０ｎｍの吸光度を読み取った。ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏソフトウェア（モレキュラーデバイス社、サンノゼ、カリフォルニア州）を用いて、ＯＤ値を４－ＰＬ疑似検量線に内挿することにより抗薬物抗体濃度を求めた。
検出されたＡＤＡの特異性を明らかにするため、「阻害」アッセイを行った。薬物阻害ＡＤＡアッセイでは、血清試料をＰＢＳＴ／ＳＢ／２０％ＨＳ緩衝液で１：１００希釈し、等量の３００μｇ／ｍＬの関連治療化合物（最終的な試料希釈は１：２００であり、最終的な阻害性化合物は１５０μｇ／ｍＬである）と混合し、室温で３０～４０分間インキュベートすることで、抗薬物抗体を遊離阻害剤（すなわち、治療化合物）と結合させた。プレインキュベーションの後、試料を、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質でコート（またはＲＨＩでコート）したストリップに１００μＬ／ウェルでデュプリケートで添加した。阻害性化合物を含まないＰＢＳＴ／ＳＢ／２０％ＨＳ緩衝液で１：２００希釈した試料も、イヌＩｇＧでコートした標準のデュプリケートストリップと共に、試料プレートで試験した。アッセイ法の残りの工程は上記のように行った。薬物阻害ウェルで測定されたＡＤＡを、非阻害ＡＤＡ濃度と対応させることで、ＡＤＡの特異性を評価した。薬物阻害ウェルでＡＤＡシグナルの著しい阻害が確認された場合、これは、ＡＤＡが治療化合物に対して特異的であったことを意味する。
実施例２５：マウスにヒトインスリンＦｃ融合タンパク質を単回投与した後のインビボ薬物動態（ＰＤ）を求めるための一般化手順
空腹時血糖値に対する作用について、以下のように、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質を評価した。１群当たりＮ＝３のｂａｌｂ／ｃマウスまたは糖尿病の野生型非肥満性糖尿病（ｗｔ ＮＯＤ）マウス（ジャクソン・ラボラトリーズ社）からデータを収集した。実験の１時間前に動物を絶食させ、その後、０時間の時点で、マウスに、インスリンＦｃ融合タンパク質ホモ二量体を含有する医薬組成物の単回皮下投与を、１０～５０ｍＭのリン酸水素ナトリウム、５０～１５０ｍＭの塩化ナトリウム、０．００５～０．０５％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ－８０、および所望により濃度０．０２～１．００ｍｇ／ｍＬの静菌剤（例えばフェノール、ｍ‐クレゾール、またはメチルパラベン）の溶液中、３００μｇ／ｋｇのインスリン－Ｆｃ融合タンパク質濃度で、最終的な溶液ｐＨは水酸化ナトリウムおよび／または塩酸を用いて７．０～８．０に調整して、実施した。
各時点において、血液試料を採取し、グルコース計（ＡｌｐｈａＴＲＡＫ（登録商標）２ペット用グルコース計）を用いて直ちにグルコースレベルの読み取りを行い、これにはおよそ１滴の血液が必要であった。０時間から９時間までの平均空腹時血糖値％（％ＦＢＧＬ）をプロットし、所与のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の生物活性を評価した。
実施例２６：マウスにヒトインスリンＦｃ融合タンパク質を単回投与した後のインビボ薬物動態（ＰＤ）を求めるための一般化手順
空腹時血糖値に対する作用について、以下のように、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質を評価する。１群当たりＮ＝３のｂａｌｂ／ｃマウスまたは糖尿病ｗｔ ＮＯＤマウス（ジャクソン・ラボラトリーズ社）からデータを収集する。実験の１時間前に動物を絶食させ、その後、０時間の時点で、マウスに、インスリンＦｃ融合タンパク質ホモ二量体を含有する医薬組成物の単回皮下投与を、１０～５０ｍＭのリン酸水素ナトリウム、５０～１５０ｍＭの塩化ナトリウム、０．００５～０．０５％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ－８０、および所望により濃度０．０２～１．００ｍｇ／ｍＬの静菌剤（例えばフェノール、ｍ‐クレゾール、またはメチルパラベン）の溶液中、３００μｇ／ｋｇのインスリン－Ｆｃ融合タンパク質濃度で、最終的な溶液ｐＨは水酸化ナトリウムおよび／または塩酸を用いて７．０～８．０に調整して、実施する。
各時点において、血液試料を採取し、グルコース計（ＡｌｐｈａＴＲＡＫ（登録商標）２ペット用グルコース計）を用いて直ちにグルコースレベルの読み取りを行い、これにはおよそ１滴の血液が必要である。０時間から９時間までの平均空腹時血糖値％（％ＦＢＧＬ）をプロットし、所与のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の生物活性を評価する。
実施例２７：免疫原性エピトープを特定するためのアッセイ手順
ライブラリー中の各化合物をＥＬＩＳＡマイクロプレートウェルの個別のストリップ上にコートする以外は、実施例２５の抗薬物抗体ＥＬＩＳＡアッセイにおける記載と同様に、Ｍａｘｉｓｏｒｐ ＥＬＩＳＡマイクロプレート（ヌンク社）を、アミノ酸配列既知のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質ホモ二量体化合物ライブラリーでコートし、このコートされたプレートをブロッキングした。ライブラリー中の化合物は、様々なＢ鎖、Ｃ鎖、およびＡ鎖のアミノ酸変異を含んで、インスリンポリペプチドのアミノ酸組成が異なり、リンカー組成が異なり、ヒト由来のいくつかのものを含んで、Ｆｃフラグメント組成が異なる、一連のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質からなる。別に、実施例２４に記載したように、それぞれ、イヌＩｇＧユニットにおける抗薬物抗体（ＡＤＡ）を算出するため、いくつかのプレートストリップウェルを直接、１：２連続希釈したイヌＩｇＧ（ジャクソン・イムノリサーチ・ラボラトリーズ社、ウェスト・グローブ、ペンシルベニア州）でコートした。
インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の反復投与を受けた個々のイヌから得られた血清は、まず、実施例２４の抗薬物抗体ＥＬＩＳＡアッセイでの選別にかける。実施例２４のアッセイで中程度または高い陽性（例えば、中程度または高い抗体力価）を示す血清試料を、ＰＢＳＴ／ＳＢ／２０％ＨＳ試料希釈緩衝液（ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０＋１０％ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ＋２０％ウマ血清）で連続希釈（１：２００～１：８０００）し、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質化合物ライブラリーでコートしたプレートに添加し、室温で１時間置く。インキュベーション後、プレートをＰＢＳＴで５回洗浄する。コートされた化合物ライブラリーに対して交差反応可能なイヌ抗体の検出のため、イヌＩｇＧに交差反応性を示す、ＨＲＰ結合型ヤギ抗ネコＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２（ジャクソン・イムノリサーチ・ラボラトリーズ社、ウェスト・グローブ、ペンシルベニア州）を、ＰＢＳＴ／ＳＢで１：１００００希釈し、試料ウェルと標準ウェルの両方に１００μＬ／ウェルで添加し、室温、暗所で４５分間インキュベートする。プレートをＰＢＳＴで５回、脱イオン水で１回洗浄した後、１００μＬ／ウェルのＴＭＢ基質（インビトロジェン、サーモフィッシャー・サイエンティフィック社、ウォルサム、マサチューセッツ州）を添加して室温、暗所で１５～２０分間置くことで、発色させる。その後、１００μＬ／ウェルのＥＬＩＳＡ停止液（ボストン・バイオプロダクツ社、アシュランド、マサチューセッツ州）を添加することで発色を停止させ、３０分以内にＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダーを用いて４５０ｎｍの吸光度を読み取る。血清試料中に存在する抗化合物交差反応性の抗体濃度は、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏソフトウェア（モレキュラーデバイス社、サンノゼ、カリフォルニア州）を用いて、直接コートされたイヌＩｇＧ抗体対照に対する４－ＰＬ疑似検量線にＯＤ値を内挿することにより求める。
アッセイから得られた抗体濃度と、コートされたインスリン－Ｆｃ融合タンパク質ライブラリーの既知のアミノ酸組成とを相関させることで、特定のアミノ酸変異やエピトープが、アッセイ上の全抗体シグナルの、いずれの原因にもなっていない、あるいは、いくつか、大部分、または全ての原因になっているか、を判断し、各種のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質ホモ二量体に結合しないこと、弱く結合すること、または強く結合することを示すことができる。中程度または強い結合の原因となる変異やエピトープを、本明細書では、免疫原性の「ホットスポット」と称する。
実施例２８：高いホモ二量体力価と許容可能なレベルの急性および反復投与生物活性とを有するイヌインスリン－Ｆｃ融合タンパク質を得るための設計プロセス
発明を実施するための形態に記載された設計目標を達成するためのプロセスは、以下の工程を含むものであった。まず、得られるインスリン－Ｆｃ融合タンパク質が、免疫原性が最小限であり、長時間作用性の生物活性を有する産物をもたらす可能性が最も高いように（例えば、Ｆｃγ受容体Ｉ結合性が最小限の種特異的なＩｇＧアイソタイプを選択した）、配列番号４または配列番号５のインスリンポリペプチドを、特定のＩｇＧアイソタイプの種特異的なＦｃフラグメントおよびリンカーと組み合わせた。所望の融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を作製し、ベクター（レイクファーマ社、サン・カルロス、カリフォルニア州）にクローニングした後、そのベクターを用いて、実施例１に記載の手順に従って、ＨＥＫ細胞に一過性にトランスフェクトした。次いで、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質を実施例４に従って精製し、総タンパク質収量およびホモ二量体率を実施例１０に従って測定した。ホモ二量体力価が５０ｍｇ／Ｌよりも大きい候補のみを許容可能なものと見なしたが、これは、このレベルに満たない力価では、動物用製品の厳しい低製造コスト要件を満たす商業生産力価は得られにくいからである。選別されたインスリン－Ｆｃ融合タンパク質を、次に、実施例１２に記載したような、インビトロのインスリン受容体結合研究を通じて、生物活性の各指標でスクリーニングした。経験に基づいて、ＩＲ活性のＩＣ５０値が５０００ｎＭ未満の化合物のみを、標的種で生物活性を示す可能性があるものと見なした。インビトロにおけるＩＲのＩＣ５０値は、定性的なスクリーニングツールとして有用であるが、ヒトインスリン受容体を発現するヒトＩＭ－９細胞を利用するため、イヌＩＲとヒトＩＲとの間の親和性の小さな違いの一部を捉えられない場合がある。さらに、インスリン受容体結合以外の要素が、インビボにおける化合物の生物活性に影響を与える場合がある（例えば、インビボにおける薬物動態学的な排出半減期の延長を可能にするイヌＦｃＲｎに対する親和性）。そこで、製造およびＩＲ活性ＩＣ５０値の観点から許容できる選別されたインスリン－Ｆｃ融合タンパク質を、イヌでの生物活性についてさらに選別し、所望の効力および／または生物活性の持続時間に満たない（例えば、ＮＡＯＣが１５０％ＦＢＧＬ・日・ｋｇ／ｍｇ未満）物質を振るい落とした。ここでも経験に基づくが、ＮＡＯＣ値が１５０％ＦＢＧＬ・日・ｋｇ／ｍｇより大きいと、標的種における投与量要件は、許容できる治療コストを達成するのに十分に低いものとなる。最後に、当該技術分野ではほとんど言及されない評価基準をさらに追加した。下記の実施例でより詳細に論じるが、初回投与後の標的種で許容できるＮＡＯＣレベルを示す多くのインスリン－Ｆｃ融合タンパク質実施形態が、予想外にも、反復投与後にその生物活性レベルを維持できない。さらに、ほとんどの場合で、標的種における反復投与時の生物活性の低減は中和抗薬物抗体の発生と相関していた。抗薬物抗体がつくられて活性を維持できないというこの傾向は、このようなインスリン－Ｆｃ融合タンパク質のイヌ糖尿病などの慢性疾患の治療での使用を非実用的なものにしている。そこで、許容できる反復投与後生物活性レベル（例えば、１回目投与に対する３回目投与のＮＡＯＣＲ値が０．５よりも大きい）を示し、抗薬物抗体が最低レベルの、インスリン－Ｆｃ融合体タンパク質のみを、本発明で使用するのに許容できるものと見なした。
実施例２９：高いホモ二量体力価と許容可能なレベルの急性および反復投与生物活性とを有するヒトインスリン－Ｆｃ融合タンパク質を得るための設計プロセス
発明を実施するための形態に記載された設計目標を達成するためのプロセスは、以下の工程を含むものであった。まず、得られるインスリン－Ｆｃ融合タンパク質が、長時間作用性の生物活性を有する産物をもたらす可能性が最も高いように、配列番号７または配列番号１０のインスリンポリペプチドを、特定のＩｇＧアイソタイプ（ＩｇＧ２またはＩｇＧ１）のヒトＦｃフラグメントおよびリンカーと組み合わせた。所望の融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を作製し、ベクター（レイクファーマ社、サン・カルロス、カリフォルニア州）にクローニングした後、そのベクターを用いて、実施例１に記載の手順に従って、ＨＥＫ細胞に一過性にトランスフェクトした。次いで、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質を実施例４に従って精製し、総タンパク質収量およびホモ二量体率を実施例１０に従って測定し、ホモ二量体力価を算出した。ホモ二量体力価が１５０ｍｇ／Ｌよりも大きい候補のみを許容可能なものと見なしたが、これは、このレベルに満たないホモ二量体力価は、ホモ二量体力価が高いＣＨＯ安定感染細胞株とは換言しにくく、比較的コモディティ化したヒトインスリン市場の低製造コスト要件を満たす商業生産力価が得られにくいからである。選別されたインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成を、次に、実施例１２に記載したような、インビトロのＩＲ結合研究を通じて、生物活性の各指標でスクリーニングした。経験に基づいて、ＩＲ活性のＩＣ５０値が２４００ｎＭ未満、より好ましくは２０００ｎＭ未満の化合物のみを、インビボで生物活性を示す可能性があるものと見なした。インビトロにおけるＩＲ ＩＣ５０値は、このアッセイはヒトＩＲを発現するヒトＩＭ－９細胞を利用しており、結合性が小さい（ＩＲ ＩＣ５０値が大きい）化合物と比較して、結合性が大きいほど（ＩＲ ＩＣ５０値が小さいほど）、所与の投与量でインビボ効力が大きくなると予想されることから、有用な定性的スクリーニング手段である。さらに、ＩＲ結合以外の要因が、インビボにおける化合物の生物活性に影響を与えている可能性がある。例えば、Ｆｃ融合タンパク質のヒトＦｃＲｎ受容体に対する親和性は、化合物のインビボ薬物動態学的排出半減期に関係している。インスリン－Ｆｃ融合タンパク質のインビボ半減期の数日間以上の延長は、インビトロにおけるヒトＦｃＲｎ結合アッセイ（実施例１９）で測定されるＥＣ５０値が１５００ｎｇ／ｍＬ未満、より好ましくは１０００ｎｇ／ｍＬ未満であることと、よく相関している。
製造、ＩＲ活性ＩＣ５０値、およびヒトＦｃＲｎ活性ＥＣ５０値の各領域で許容できるものであった選別後のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成を、さらに、ヒトＦｃγＲＩ受容体結合親和性とヒトＣ１ｑ結合親和性を試験することによって、インビボ免疫原性の可能性についてスクリーニングした。これらの免疫系成分により強く結合する分子ほど、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の増加を経て、抗薬物抗体によって評価される免疫原性プロファイルがより大きい可能性が高い。抗薬物抗体は望ましくないものであり、上記分子のインビボ薬物動態学的半減期を阻害する可能性や、薬物の活性を中和する可能性や、あるいは、その両方の機能を果たす可能性がある。抗薬物抗体の可能性がインスリン－Ｆｃのインビボ成績に与える影響は、大きな問題になる可能性があった。そこで、望ましくない抗原提示のリスクと抗薬物抗体を誘導する免疫原性の可能性を軽減するために、ＦｃγＲＩ（実施例１４）およびＣ１ｑ（実施例１６）に対して、候補インスリン－Ｆｃ融合タンパク質をスクリーニングする研究を行った（Ｇｕｉｌｌｉａｍｓ，Ｍａｒｔｉｎ＆Ｂｒｕｈｎｓ，Ｐｉｅｒｒｅ＆Ｓａｅｙｓ，Ｙｖａｎ＆Ｈａｍｍａｄ，Ｈａｍｉｄａ＆Ｌａｍｂｒｅｃｈｔ，Ｂａｒｔ．（２０１４）、Ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｃ ｇａｍｍａ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｉｎ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ．、Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．、１４巻、１０．１０３８／ｎｒｉ３５８２）。ヒトＦｃγＲＩ結合（試験対象のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質のビオチン化ＦｃγＲＩ濃度は３０００ｎｇ／ｍＬ）の場合に設けられた設計目標は、０．５０未満のＯＤ４５０比（配列番号７６のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成に対しての比）であり、Ｃ１ｑ結合の場合に設けられた設計目標（試験対象のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質のビオチン化Ｃ１ｑ濃度は１０００ｎｇ／ｍＬ）は、０．３５未満のＯＤ４５０比（配列番号７６のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成に対しての比）である。
別の場所で記載したように、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃを含むインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成は、予想外にも、ヒトＩｇＧ２ Ｆｃを含むする構成よりも収量がかなり高いことが分かり、そのため、製造性の点で好ましいものであった。しかし、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃを含むインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成は、ｃＮｇ部位に天然のＮ結合型グリコシル化を含む場合、ＦｃγＲＩおよびＣ１ｑの両方に対して非常に高い結合性を示す場合が多く、これらの部分のうちの片方または両方に対する結合性が強いと、それに相関して、インビボにおける抗原提示および免疫原性が増強されている可能性が高かった（Ｋｏｕｓｅｒ，Ｌ．、Ｍａｄｈｕｋａｒａｎ，Ｓ．Ｐ．、Ｓｈａｓｔｒｉ，Ａ．、Ｓａｒａｏｎ，Ａ．、Ｆｅｒｌｕｇａ，Ｊ．、Ａｌ－Ｍｏｚａｉｎｉ，Ｍ．、およびＫｉｓｈｏｒｅ，Ｕ．（２０１５年）、Ｅｍｅｒｇｉｎｇ ａｎｄ Ｎｏｖｅｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ１ｑ．、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、６巻、３１７号、ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１５．００３１７）。そこで、ｈＩｇＧ１アイソタイプのＦｃを含むインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成のいくつかのバリアントを、まず、生合成中の自然なグリコシル化を防ぐために天然型のグリコシル化部位（ｃＮｇ）を変異させた化合物をスクリーニングすることにより、試験した。次に、これらの分子をさらに変異させ、インスリンポリペプチドの組成を操作することにより、その特性を向上させた。最後に、組成と長さの異なるいくつかのリンカーバリアントを検討し、種々の設計特性のさらなる最適化が可能であるかを確認した。複数回の最適化によるスクリーニングの後、許容レベルのホモ二量体力価、ＩＲ結合、ＦｃＲｎ結合、ＦｃγＲＩ結合、およびＣ１ｑ結合を示すインスリン－Ｆｃ融合タンパク質構成のみを、本発明で使用するのに許容できるものと見なした。
結果：イヌＦｃフラグメントを含むインスリン－ＦＣ融合タンパク質
実施例３０：イヌＦｃ ＩｇＧＡアイソタイプを含むイヌインスリン－Ｆｃ融合タンパク質
配列番号４のインスリンポリペプチド配列とイヌＩｇＧＡアイソタイプのＦｃフラグメント（配列番号１４）とを含み、配列番号１１のペプチドリンカーを用いる、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の作製を試みた。得られたインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の完全アミノ酸配列は以下の通りである：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＤＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＤＰＴＧＧＧＰＲＲＧＩＶＥＱＣＣＨＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮＧＧＧＧＡＧＧＧＧＲＣＴＤＴＰＰＣＰＶＰＥＰＬＧＧＰＳＶＬＩＦＰＰＫＰＫＤＩＬＲＩＴＲＴＰＥＶＴＣＶＶＬＤＬＧＲＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＥＶＨＴＡＫＴＱＳＲＥＱＱＦＮＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＥＨＱＤＷＬＴＧＫＥＦＫＣＲＶＮＨＩＤＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＲＡＨＫＰＳＶＹＶＬＰＰＳＰＫＥＬＳＳＳＤＴＶＳＩＴＣＬＩＫＤＦＹＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＲＫＨＲＭＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＱＧＤＰＦＴＣＡＶＭＨＥＴＬＱＮＨＹＴＤＬＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号３１）。
配列番号３１のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質は、実施例１に従ってＨＥＫ細胞で合成し、実施例４に従って精製した。プロテインＡ精製工程後のタンパク質収量は２２ｍｇ／Ｌであった。インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構造は実施例６に従って非還元ＣＥ－ＳＤＳおよび還元ＣＥ－ＳＤＳで確認し、さらに、実施例８に記載のグリカン除去を伴うＬＣ－ＭＳによって配列の確認を行った。実施例１０に従って分子ふるいクロマトグラフィーでホモ二量体率を測定したところ、２４％であると求められ、ホモ二量体の凝集の程度が高いことが示された。すなわち、得られたホモ二量体力価は５ｍｇ／Ｌに過ぎなかった。要約すると、ＨＥＫ細胞で配列番号３１のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質を製造した場合、凝集レベルが高く、ホモ二量体力価が低い（５ｍｇ／Ｌ）結果となり、５０ｍｇ／Ｌより大きいホモ二量体力価という設計目標を達成しなかった。
設計目標は達成されていないが、配列番号３１のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質を、生物活性について評価した。まず、配列番号３１のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質のインスリン受容体結合を実施例１２に従って測定したところ、ＩＣ５０値は２，７３３ｎＭという結果となり、当該化合物がインビボで生物活性を示す可能性があることが示された（すなわち、ＩＣ５０が５０００ｎＭ未満）。
次に、実施例２１に従って当該化合物をＮ＝３のイヌに単回静脈内投与した後、インビボにおける配列番号３１のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の薬力学的特性（ＰＤ）を測定した。図２は、時間の関数としての、配列番号３１の空腹時血糖値％を示している。配列番号３１のＮＡＯＣを実施例２２の手順に従って算出したところ、１０５％ＦＢＧＬ・日・ｋｇ／ｍｇであった。実施例２３の方法を用いて、配列番号３１のインビボ半減期を算出したところ、１日未満であった。ＮＡＯＣが比較的低いのは、試料中の凝集体量が多い（すなわち、ホモ二量体率が低い）ことの結果であると考えられるが、血行中に残った可溶性ホモ二量体は薬物動態学的排出半減期が１日未満であり、これは、週１回投与を支持するものにはなりにくいと見なされた。
実施例３１：イヌＩｇＧＡアイソタイプを含むインスリン－Ｆｃ融合タンパク質のＦｃフラグメント領域の変異
配列番号３１のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質のホモ二量体含有率を増加させ、生物活性を向上させ、半減期を延長する試みでは、当該ＦｃフラグメントのＣＨ３領域に変異を挿入して、分子間の会合（例えば、Ｆｃフラグメント－Ｆｃフラグメント分子間相互作用）を妨げて、ＦｃＲｎ受容体により強く結合する（例えば、ＦｃＲｎに対するより高い親和性）ことを促すことで、再循環および体循環時間を増加させる試みを行った。以下のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質を、実施例１に従ってＨＥＫ細胞で合成し、実施例４に従って精製し、実施例６、実施例８、および実施例１０に従って試験した。試験の結果は以下の表２に示す。配列番号３１に対しての、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、および配列番号３５の配列アラインメント、並びに、アミノ酸配列の相違を、図３に示す。
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＤＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＤＰＴＧＧＧＰＲＲＧＩＶＥＱＣＣＨＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮＧＧＧＧＡＧＧＧＧＲＣＴＤＴＰＰＣＰＶＰＥＰＬＧＧＰＳＶＬＩＦＰＰＫＰＫＤＩＬＲＩＴＲＴＰＥＶＴＣＶＶＬＤＬＧＲＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＥＶＨＴＡＫＴＱＳＲＥＱＱＦＮＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＥＨＱＤＷＬＴＧＫＥＦＫＣＲＶＮＨＩＤＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＲＡＨＫＰＳＶＹＶＬＰＰＳＰＫＥＬＳＳＳＤＴＶＳＩＴＣＬＩＫＤＦＹＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＲＫＨＲＭＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＱＧＤＰＦＴＣＡＶＬＨＥＡＬＨＳＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号３２）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＤＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＤＰＴＧＧＧＰＲＲＧＩＶＥＱＣＣＨＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮＧＧＧＧＡＧＧＧＧＲＣＴＤＴＰＰＣＰＶＰＥＰＬＧＧＰＳＶＬＩＦＰＰＫＰＫＤＩＬＲＩＴＲＴＰＥＶＴＣＶＶＬＤＬＧＲＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＥＶＨＴＡＫＴＱＳＲＥＱＱＦＮＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＥＨＱＤＷＬＴＧＫＥＦＫＣＲＶＮＨＩＤＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＲＡＨＫＰＳＶＹＶＬＰＰＳＰＫＥＬＳＳＳＤＴＶＳＩＴＣＬＩＫＤＦＹＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＲＫＨＲＭＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＱＧＤＰＦＴＣＡＶＬＨＥＴＬＱＳＨＹＴＤＬＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号３３）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＤＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＤＰＴＧＧＧＰＲＲＧＩＶＥＱＣＣＨＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮＧＧＧＧＡＧＧＧＧＲＣＴＤＴＰＰＣＰＶＰＥＰＬＧＧＰＳＶＬＩＦＰＰＫＰＫＤＩＬＲＩＴＲＴＰＥＶＴＣＶＶＬＤＬＧＲＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＥＶＨＴＡＫＴＱＳＲＥＱＱＦＮＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＥＨＱＤＷＬＴＧＫＥＦＫＣＲＶＮＨＩＤＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＲＡＨＫＰＳＶＹＶＬＰＰＳＰＫＥＬＳＳＳＤＴＶＳＩＴＣＬＩＫＤＦＹＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＲＫＨＲＭＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＱＧＤＰＦＴＣＡＶＭＨＥＴＬＱＳＨＹＴＤＬＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号３４）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＤＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＤＰＴＧＧＧＰＲＲＧＩＶＥＱＣＣＨＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮＧＧＧＧＡＧＧＧＧＲＣＴＤＴＰＰＣＰＶＰＥＰＬＧＧＰＳＶＬＩＦＰＰＫＰＫＤＩＬＲＩＴＲＴＰＥＶＴＣＶＶＬＤＬＧＲＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＥＶＨＴＡＫＴＱＳＲＥＱＱＦＮＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＥＨＱＤＷＬＴＧＫＥＦＫＣＲＶＮＨＩＤＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＲＡＨＫＰＳＶＹＶＬＰＰＳＰＫＥＬＳＳＳＤＴＶＳＩＴＣＬＩＫＤＦＹＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＲＫＨＲＭＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＱＧＤＰＦＴＣＡＶＬＨＥＴＬＱＮＨＹＴＤＬＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号３５）
各イヌＩｇＧＡバリアントをベースとしたインスリン－Ｆｃ融合タンパク質を、対応するタンパク質収量、ホモ二量体率、およびホモ二量体力価と共に、表２に列挙する。結果から分かるように、ＩｇＧＡ Ｆｃフラグメントに対する種々の変異は、ホモ二量体率およびホモ二量体力価を向上させず、高度なタンパク質凝集を引き起こし、ホモ二量体力価は５ｍｇ／Ｌ未満という極めて低いものであった。従って、これらの化合物のインビボにおける生物活性および薬物動態は、評価できなかった。
Figure 0007405486000004
実施例３２：他のイヌＦｃフラグメントアイソタイプを用いたイヌインスリン－Ｆｃ融合タンパク質
上記のように、イヌＩｇＧＡは、イヌにおいてＦｃγＩエフェクター機能を示さないため（ヒトにおけるヒトＩｇＧ２アイソタイプとよく似ている）、イヌ用の非免疫原性インスリン－Ｆｃ融合タンパク質を作製するためのＦｃフラグメントのアイソタイプとして好ましいと考えられている。しかし、イヌＩｇＧＡ Ｆｃフラグメントを用いて製造されたインスリン－Ｆｃ融合タンパク質は、凝集性が高く、ホモ二量体力価が許容できないほど低く、生物活性と作用持続時間が許容できないほど低いレベルであった。そのため、配列番号３１のインスリン－Ｆｃ融合物のイヌＩｇＧＡ Ｆｃフラグメントの代わりとして、他のイヌＩｇＧアイソタイプ（配列番号１５のイヌＩｇＧＢ）、配列番号１６のイヌＩｇＧＣ、および配列番号１７のイヌＩｇＧＤのＦｃフラグメントを評価した。イヌＩｇＧＢアイソタイプ、イヌＩｇＧＣアイソタイプ、およびイヌＩｇＧＤアイソタイプをベースとしたＦｃフラグメントを含むこれら３種のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号３１のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の作製に用いたものと同じ、配列番号４のインスリンポリペプチドと配列番号１１のペプチドリンカーを用いて、合成した。タンパク質製造は実施例１に従ってＨＥＫ２９３細胞で行った。次いで、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質を、実施例４に従ってプロテインＡカラムを用いて精製した。インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構造は実施例６に従って非還元ＣＥ－ＳＤＳおよび還元ＣＥ－ＳＤＳで確認し、さらに、実施例８に記載のグリカン除去を伴うＬＣ－ＭＳによって配列の確認を行った。ホモ二量体率は実施例１０に従って分子ふるいクロマトグラフィーで測定した。これらの配列を以下に示し、配列番号３１に対するこれらの配列アラインメント比較を図４に示す：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＤＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＤＰＴＧＧＧＰＲＲＧＩＶＥＱＣＣＨＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮＧＧＧＧＡＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＮＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号３６）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＤＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＤＰＴＧＧＧＰＲＲＧＩＶＥＱＣＣＨＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮＧＧＧＧＡＧＧＧＧＣＮＮＣＰＣＰＧＣＧＬＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＩＬＶＴＡＲＴＰＴＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＮＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＳＫＱＶＱＴＡＮＴＱＰＲＥＥＱＳＮＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＳＧＫＱＦＫＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＥＩＩＳＫＴＰＧＱＡＨＱＰＮＶＹＶＬＰＰＳＲＤＥＭＳＫＮＴＶＴＬＴＣＬＶＫＤＦＦＰＰＥＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＭＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＩＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号３７）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＤＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＤＰＴＧＧＧＰＲＲＧＩＶＥＱＣＣＨＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮＧＧＧＧＡＧＧＧＧＣＩＳＰＣＰＶＰＥＳＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＩＬＲＩＴＲＴＰＥＩＴＣＶＶＬＤＬＧＲＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＥＶＨＴＡＫＴＱＰＲＥＱＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＥＨＱＤＷＬＴＧＫＥＦＫＣＲＶＮＨＩＧＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＰＫＥＬＳＳＳＤＴＶＴＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＥＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＰＥＰＥＳＫＹＨＴＴＡＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＱＧＤＴＦＴＣＡＶＭＨＥＡＬＱＮＨＹＴＤＬＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号３８）
得られたタンパク質収量、ホモ二量体率、およびホモ二量体力価を表３に示す。予想外にも、イヌＩｇＧＢアイソタイプベースのＦｃフラグメントを含む配列番号３６のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質のみが、５０ｍｇ／Ｌ超という設計基準を達成するホモ二量体力価を示した。イヌＩｇＧＣアイソタイプベースのＦｃフラグメントを含む配列番号３７のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質からは、化合物が全く得られず、イヌＩｇＧＤアイソタイプベースのＦｃフラグメントを含む配列番号３８のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質は、かなりのタンパク質収量を示したものの、凝集度が高く、そのためホモ二量体力価が許容できないほどに低かった。
配列番号３６および配列番号３８のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の、インビトロにおけるインスリン受容体結合を、実施例１２の手順に従って試験した。配列番号３８のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質は５０００ｎＭより大きいＩＣ５０を示したが、これは、当該化合物がインビボにおいて生物活性を示さない可能性が高いことを示している。しかし、配列番号３６のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質は２８ｎＭというＩＣ５０を示し、これは、この配列がインビボにおいて生物活性を示す可能性があることを示している。
Figure 0007405486000005
実施例３３：イヌＩｇＧＢアイソタイプＦｃフラグメントを有する配列番号４のインスリンポリペプチドを含むインスリン－Ｆｃ融合タンパク質のインビボにおける効力
実施例３２の有望なホモ二量体力価およびインスリン受容体活性の結果を考慮して、配列番号３６のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質を、およそ１０ｋｇの重さのＮ＝３の健常な抗体未処置ビーグル犬のそれぞれに静脈内注射後、実施例２１に従ってインビボ生物活性について試験した。別の実験で、上記化合物をＮ＝３の未処置ビーグル犬に皮下投与した。図５は、配列番号３６のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質を単回静脈内投与した場合の、時間に対する％ＦＢＧＬを示しており、図６は、配列番号３６のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質を単回皮下投与した場合の、時間に対する％ＦＢＧＬを示しており、共に、配列番号３６のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質が、イヌにおいて顕著な生物活性を示すことを示している。
ＮＡＯＣを実施例２２の手順に従って算出して、上記インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の相対生物活性および作用持続時間を求めた。静脈内注射した配列番号３６のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質のＮＡＯＣは、３９９％ＦＢＧＬ・日・ｋｇ／ｍｇであり、これは、静脈内注射した配列番号３１のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質のＮＡＯＣの３．８倍であり、イヌＩｇＧＡ Ｆｃフラグメントを含むインスリン－Ｆｃ融合タンパク質に対する、イヌＩｇＧＢ Ｆｃフラグメントを含むインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の、生物活性における顕著な増加が示された。皮下注射した配列番号３６のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質のＮＡＯＣは３６６％ＦＢＧＬ・日・ｋｇ／ｍｇであり、皮下投与を介した生物活性レベルは静脈内投与を介して得られる生物活性レベルと同様であることが明らかとなった。
実施例３４：イヌＩｇＧＢアイソタイプＦｃフラグメントを有する配列番号４のインスリンポリペプチドを含むインスリン－Ｆｃ融合タンパク質を反復皮下投与した後のインビボ免疫原性スクリーニング
イヌにおいて、配列番号３６のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質を反復皮下投与した場合の生物活性を、実施例２２に記載の方法に従って試験した。Ｎ＝３の動物に０日目、３５日目、および４２日目に皮下投与を行い、実施例２２に従って、各投与後の７日間の枠について、％ＦＢＧＬを測定した。反復皮下注射のそれぞれについて、実施例２２の手順に従って、ＮＡＯＣおよびＮＡＯＣＲを算出した。表４に示されているように、イヌにおける反復皮下投与では、予想外にも、ＮＡＯＣＲにおける顕著な減少（すなわち、３回目注射のＮＡＯＣが、１回目注射のＮＡＯＣの０．４０、すなわち４０％しかない）によって判断されるように、３回目の投与までに生物活性が顕著に減衰することが明らかになった。
Figure 0007405486000006
特定の説明に束縛されるものではないが、イヌにおける３回目の反復皮下投与後に配列番号３６のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の生物活性が顕著に減少した原因は、その生物活性を中和する抗薬物抗体の発生によるものであると想定された。抗薬物抗体は、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質のインスリンポリペプチド部分、リンカー部分、またはＦｃフラグメント部分に対するものである場合がある。免疫原性反応が抗原提示細胞間、ヘルパーＴ細胞間、Ｂ細胞間、およびその関連サイトカイン間の相互作用として現れ、当該薬物（例えば、抗薬物抗体）に対する内因性抗体の産生に繋がり得る。結合抗体は、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質と結合可能な全てのアイソタイプであり、これらは実施例２４に記載されているような免疫学的検定で検出できる。インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の機能活性を阻害する中和抗体は、通常は、生物活性のために必要なエピトープに対するものである。この通りであるかどうかの判断を行うため、各投与の施行前と、実施例１１および実施例１２に記載の実験の最後に血清を採取し、これを実施例２４に従って抗薬物抗体レベルを定量化する試験にかけた。図７に示されているように、抗薬物抗体のレベルは上記化合物の複数回の皮下投与に伴って確かに増加し、配列番号３６のインスリンＦｃ融合タンパク質の３回目の注射後の中和抗薬物抗体の産生が、ＮＡＯＣＲの減少の原因である可能性があることが示された。
実施例３５：潜在的な免疫原性リスクを低減するための、配列番号４のインスリンポリペプチドとイヌＩｇＧＢアイソタイプＦｃフラグメントとを含む非グリコシル化インスリン－Ｆｃ融合タンパク質
実施例３２および実施例３３で示したように、配列番号３６のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質は、イヌにおいて、許容可能なホモ二量体含有率、ホモ二量体力価、および生物活性を示した。しかし、糖尿病などの慢性疾患へのその使用には、反復皮下投与に伴って生物活性が低減し（実施例３４）、抗薬物抗体が産生される（実施例３４）という欠陥がある。特定の理論に束縛されるものではないが、抗薬物抗体の産生と生物活性の低減の可能性のある１つの原因として、イヌＩｇＧＢ Ｆｃフラグメントが、イヌ免疫系の各種受容体（例えば、ＦｃγＲＩなどのＦｃγ受容体）と、相互作用することが増えることが挙げられる。しかしながら、イヌＩｇＧＢアイソタイプは、４種のイヌＩｇＧアイソタイプの中で、Ｆｃフラグメントに用いられた場合に、製造性および単回投与生物活性の各設計目標を達成するインスリン－Ｆｃ融合タンパク質をもたらす（実施例２８）、唯一のアイソタイプであった。発明を実施するための形態に記載したように、Ｆｃγ相互作用を低減するための１つの方法には、ＦｃフラグメントのｃＮｇ部位を変異させることで、宿主細胞内で合成される際のグリコシル化を妨げることが行われる。すなわち、ｃＮｇ部位の変異を配列番号３６のＦｃフラグメント領域に対して行ったことで、実施例１４に記載のインビトロヒトＦｃγＲＩアッセイにおける結合性によって評価される、インビボにおけるＦｃγ受容体に対するＦｃフラグメントの結合親和性が低減された。グリカンを持たないことの確認は、実施例８のＬＣ－ＭＳ法を用いて行い、ただし、ＰＮＧアーゼＦ処理工程は省略した。配列番号３６のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質におけるｃＮｇ部位の位置はｃＮｇ－ＮＢ１３９である。配列番号３６への変異としては、ｃＮｇ－ＮＢ１３９－Ｑという変異を含む配列番号３９、ｃＮｇ－ＮＢ１３９－Ｓという変異を含む配列番号４０、ｃＮｇ－ＮＢ１３９－Ｄという変異を含む配列番号４１、およびｃＮｇ－ＮＢ１３９－Ｋという変異を含む配列番号４２があった。ｃＮｇ変異型インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の完全アミノ酸配列を以下に挙げ（ＮＢ１３９位には下線）、得られた配列アラインメントを図８に示した（クラスタルオメガ）：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＤＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＤＰＴＧＧＧＰＲＲＧＩＶＥＱＣＣＨＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮＧＧＧＧＡＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＱＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号３９）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＤＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＤＰＴＧＧＧＰＲＲＧＩＶＥＱＣＣＨＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮＧＧＧＧＡＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＳＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号４０）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＤＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＤＰＴＧＧＧＰＲＲＧＩＶＥＱＣＣＨＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮＧＧＧＧＡＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＤＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号４１）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＤＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＤＰＴＧＧＧＰＲＲＧＩＶＥＱＣＣＨＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮＧＧＧＧＡＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＫＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号４２）。
インスリン－Ｆｃ融合タンパク質を、実施例１に従ってＨＥＫ２９３細胞で製造し、実施例４に従ってプロテインＡカラムを用いて精製した。インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構造は実施例６に従って非還元ＣＥ－ＳＤＳおよび還元ＣＥ－ＳＤＳで確認し、さらに、実施例８に記載のグリカン除去を伴うＬＣ－ＭＳによって配列の確認を行った。ホモ二量体率は実施例１０に従って分子ふるいクロマトグラフィーで測定した。表５に示すように、配列番号４０、配列番号４１、および配列番号４２のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質のホモ二量体力価は設計目標を達成しているが、予想外なことに、ｃＮｇ－ＮＢ１３９－Ｑ変異を含む配列番号３９のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質はホモ二量体力価の設計目標を達成しなかった。
Figure 0007405486000007
残り３種の化合物のうちのどれが低減された免疫原性を示す可能性が最も高いかを判断するため、実施例１５の手順に従ってＦｃγ受容体との結合を測定した。Ｆｃγ受容体との結合性が低いことが、免疫原性が最小となることと、相関している可能性が最も高い。表６は、これらのインスリン－Ｆｃ融合タンパク質のＦｃγ受容体Ｉ結合を、配列番号３６のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質のＦｃγ受容体結合と比較しており、予想外にも、ｃＮｇ－Ｄ変異を含む配列番号４１のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質が、ｃＮｇ－Ｓ変異を含む配列番号４０およびｃＮｇ－Ｋ変異を含む配列番号４２の各インスリン－Ｆｃ融合タンパク質のＦｃγ受容体結合活性のおよそ２倍の、Ｆｃγ受容体結合活性を示すことが明らかにされている。このことから、ｃＮｇ－Ｓ変異およびｃＮｇ－Ｋ変異を含む後者２つの化合物を含むインスリン－Ｆｃ融合タンパク質のみを、イヌにおける反復投与生物活性試験に好適であると見なした。
Figure 0007405486000008
実施例３６：非グリコシル化ｃＮｇ－ＫイヌＩｇＧＢアイソタイプＦｃフラグメントを有する配列番号４のインスリンポリペプチド、および非グリコシル化ｃＮｇ－ＳイヌＩｇＧＢアイソタイプＦｃフラグメントを有する配列番号４のインスリンポリペプチドの、インビボにおける生物活性および免疫原性の評価
ｃＮｇ－Ｓ変異を含む配列番号４０のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質が、イヌにおける反復投与時の生物活性の成績を向上させたかどうかを確かめるため、当該化合物をＮ＝１のイヌに、０日目、７日目、１４日目、および２８日目に、実施例２２の手順に従って皮下投与した。イヌの％ＦＢＧＬが低下し過ぎた場合、そのイヌに餌を与えて、血糖を安全なレベルまで上昇させた。１回目注射のＮＡＯＣは１９１％ＦＢＧＬ・日・ｋｇ／ｍｇであり、配列番号４０のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質がインビボにおいて十分な生物活性を示すことが示された。それ以降の各投与についても、実施例２２の一般手順に従って、ＮＡＯＣおよびＮＡＯＣＲの測定を行い、投与を施行した時間から次の投与を施行する直前までを算出した。表７に示されるＮＡＯＣおよびＮＡＯＣＲは、配列番号４０のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質が、４回投与レジメンの３回目投与および４回目投与時にＮＡＯＣＲの顕著な減少を示したことを表している。すなわち、ｃＮｇ－Ｓ変異を含む配列番号４０のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号３６のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質のＦｃγＲＩ結合の１／４という低いＦｃγＲＩ結合を有しているにもかかわらず、イヌにおいて反復投与時の生物活性を示すことができない。
Figure 0007405486000009
ｃＮｇ－Ｋ変異を含む配列番号４２のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質が、イヌにおける反復投与時の生物活性の成績を向上させたかどうかを確かめるため、当該化合物をＮ＝１のイヌに、０日目、７日目、１４日目、および２８日目に、実施例２２の手順に従って皮下投与した。イヌの％ＦＢＧＬが低下し過ぎた場合、そのイヌに餌を与えて、血糖を安全なレベルまで上昇させた。１回目注射のＮＡＯＣは４４９％ＦＢＧＬ・日・ｋｇ／ｍｇであり、配列番号４２のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質がインビボにおいて十分な生物活性を示すことが示された。また、当該化合物の薬物動態プロファイルを、ＥＬＩＳＡを使用する実施例２３の方法で測定し、２コンパートメントモデルをそのデータに適合し、当該化合物の排出半減期を求めたところ、約０．９日であった。それ以降の各投与についても、実施例２２の一般手順に従って、ＮＡＯＣおよびＮＡＯＣＲの測定を行い、投与を施行した時間から次の投与を施行する直前までを算出した。表８に示されるＮＡＯＣおよびＮＡＯＣＲは、配列番号４２のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質が、４回の投与中、０．６よりも大きなＮＡＯＣＲを維持することを示している。以上から、予想外にも、ｃＮｇ－Ｋ変異を含む配列番号４２のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質が、イヌにおける反復投与時の生物活性を顕著に向上させた唯一の、配列番号３６のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の非グリコシル化変異体であった。
Figure 0007405486000010
また、抗薬物抗体レベルおよび抗インスリン抗体レベルを、治療の全期間（２８日間）と、追加で２週間、実施例２４に従って測定した。図９は、配列番号４２のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質が、イヌにおける反復皮下投与に伴って、抗薬物抗体を発生させるものの、その抗薬物抗体価は、配列番号３６のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質によって発生するもの（実施例３２）よりもずっと低いことを示している。
実施例３７：抗薬物抗体を含有するイヌ血清のスクリーニング、並びにインスリンポリペプチドのＢ１０Ｄ位およびＡ８Ｈ位における免疫原性である可能性があるエピトープの特定
イヌＩｇＧＢ ＦｃフラグメントのｃＮｇ部位のＬｙｓへの変異（すなわち、ｃＮｇ－Ｋ）は、配列番号４のインスリンポリペプチドと配列番号１１のペプチドリンカーとを含むインスリン－融合タンパク質の反復投与時の生物活性を向上させたが（実施例３６）、得られた配列番号４２のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質は抗薬物抗体を発生させてしまった（実施例３６）。このことから、配列番号４のインスリンポリペプチドが、予想外にも、イヌの免疫系の対象にされる特定のエピトープ（すなわち、免疫原性の「ホットスポット」）を含む可能性があるという仮定が得られた。そのため、実施例２４に記載の血清試料中に存在する抗体の結合特異性を、実施例２７の一般手順に従って評価した。コートされたインスリン－Ｆｃ融合タンパク質ライブラリーに対する、配列番号３６のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質（実施例３２）の反復投与から得られた抗体含有血清試料の解析によって、予想外にも、配列番号５のインスリンポリペプチド配列内に、Ｂ鎖のＮ末端から１０番目の位置（すなわち、Ｂ１０）のアスパラギン酸変異、および、別に、Ａ鎖のＮ末端から８番目の位置（すなわち、Ａ８）のヒスチジン変異という、２つの主要な「ホットスポット」が存在することが示された。これらの結果は、これら２つの特定のアミノ酸変異を含むインスリンポリペプチドアミノ酸組成を含むインスリン－Ｆｃ融合タンパク質が、イヌにおいて免疫原性である可能性があり、そのため、反復注射後に生物活性を中和する抗薬物抗体を発生する可能性があることを示唆している。以上から、Ｂ１０アスパラギン酸とＡ８ヒスチジンを含んでいないインスリンポリペプチドが、長期間に亘ってイヌに反復投与（例えば、イヌ糖尿病を治療するため）する必要があるインスリン－Ｆｃ融合タンパク質には好適であることが確認された。
実施例３８：配列番号４のインスリンポリペプチドと非グリコシル化イヌＩｇＧＢアイソタイプＦｃフラグメントとを含むインスリン－Ｆｃ融合タンパク質において、インスリンポリペプチドのＢ１０Ｄ変異およびＡ８Ｈ変異を天然組成に戻すと、潜在的な免疫原性リスクが低減される
「ホットスポット」変異の置換が、配列番号４のインスリンポリペプチドとイヌＩｇＧＢアイソタイプフラグメントとを含むインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の免疫原性および反復投与時の生物活性を向上させるかどうかを評価するために、例示的なインスリン－Ｆｃ融合タンパク質（配列番号４３）において、インスリンポリペプチドのＢ１０アミノ酸とＡ８アミノ酸を、以下に挙げる当該インスリンポリペプチドの天然組成であるヒスチジンおよびスレオニンにそれぞれ戻したもの（配列番号６３）（非天然アミノ酸には下線）を合成した。
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＤＰＴＧＧＧＰＲＲＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ（配列番号６３）。
さらに、非グリコシル化ｃＮｇ変異体にさらなる利点がある可能性を考慮して、配列番号４３のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質はｃＮｇ－Ｑ変異を含んでいる。配列番号４３のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の全アミノ酸配列を以下に示す：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＤＰＴＧＧＧＰＲＲＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮＧＧＧＧＡＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＱＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号４３）。
配列番号４３のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質を、実施例１に従ってＨＥＫ２９３細胞で製造し、実施例４に従ってプロテインＡカラムを用いて精製した。得られたタンパク質収量はわずか２１ｍｇ／Ｌであった。構造の確認を実施例６に従って非還元ＣＥ－ＳＤＳおよび還元ＣＥ－ＳＤＳで行い、さらに、配列の確認を実施例８に記載のグリカン除去を伴うＬＣ－ＭＳによって行った。実施例１０に従って分子ふるいクロマトグラフィーによって測定されたホモ二量体率は９８．０％であり、このタンパク質には比較的凝集体がないことが示された。
ホモ二量体力価は２１ｍｇ／Ｌと比較的低かったが、配列番号４３のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質を、イヌにおいて、インビボにおける生物活性および免疫原性について、実施例２２、実施例２３、および実施例２４の手順にそれぞれ従って、評価した。図１０から明らかなように、配列番号４３のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質において、Ｂ１０Ｄ変異およびＡ８Ｈ変異を天然アミノ酸（すなわち、Ｂ１０ＨおよびＡ８Ｔ）に戻すことで、親化合物（配列番号３６）の免疫原性が顕著に低減した。
しかしながら、図１１に示されているように、天然のＢ１０アミノ酸およびＡ８アミノ酸を含む配列番号４３のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質は、生物活性を示さなかった（すなわち、ＮＡＯＣが実質的にゼロであった）。
実施例３９：イヌＩｇＧＢ Ｆｃフラグメントを含むインスリン－Ｆｃ融合タンパク質会合体の生物活性を向上させるために、配列番号６３のインスリンポリペプチドにさらなるＢ鎖変異およびＡ鎖変異を組み込む試み
配列番号３６のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質（実施例３３）と比べて、配列番号４３のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質が抗薬物抗体を発生させなかったこと（実施例３８）は、配列番号４のインスリンポリペプチドにおけるＢ１０Ｄ変異およびＡ８Ｈ変異が、抗薬物抗体産生の原因となる、免疫原性のエピトープである可能性があるという説の強力な証拠である。しかし、配列番号３６のものと比較して、配列番号４３のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質はインビボにおける効力が欠如しており、このことは、これら２つのアミノ酸変異が、許容できる生物活性レベルの達成にも関与していることを示している。配列番号４３のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質のインビボにおける効力の欠如は、実施例１２の方法に従ってインスリン受容体結合アッセイで測定された、その高いＩＣ５０（以下の表９に示す）と関連がある。よって、インスリンポリペプチドにおける天然のＢ１０アミノ酸およびＡ８アミノ酸を保持することで免疫原性の程度を低く維持しながら、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の生物活性を増加させる（すなわち、インスリン受容体結合アッセイにおけるＩＣ５０値を５０００ｎＭ未満、より好ましくは４０００ｎＭ未満、さらにより好ましくは３０００ｎＭ未満に減少させる）ための、さらなる試みが必要であった。
ＩＲに対する強力な結合には、インスリンのＢ鎖およびＡ鎖の各種部分が必要であることが知られている（Ｈｕｂｂａｒｄ Ｓ．Ｒ．、“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ： Ｉｎｓｕｌｉｎ ｍｅｅｔｓ ｉｔｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒ”、Ｎａｔｕｒｅ．、２０１３年；４９３巻（７４３１号）：ｐｐ１７１－１７２）。よって、Ｂ１０およびＡ８を天然インスリンにおけるものと同じに、且つ、Ｃ鎖およびペプチドリンカーを一定に維持しながら、Ｂ鎖またはＡ鎖の一部を改変した。これらのインスリン－Ｆｃ融合タンパク質のいくつかを、実施例１に従ってＨＥＫ２９３細胞で製造し、実施例４に従ってプロテインＡカラムを用いて精製した。構造の確認を実施例６に従って非還元ＣＥ－ＳＤＳおよび還元ＣＥ－ＳＤＳで行い、さらに、配列の確認を実施例８に記載のグリカン除去を伴うＬＣ－ＭＳによって行った。ホモ二量体含有率を実施例１０に従って分子ふるいクロマトグラフィーで測定し、インスリン受容体結合親和性を実施例１２に従って測定した。これらの配列を以下に示し、配列番号４３に対して得られた配列アラインメントを図１２に示す（クラスタルオメガ）。
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＱＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＤＰＴＧＧＧＰＲＲＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＡＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＳＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号４４）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＥＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＤＰＴＧＧＧＰＲＲＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＡＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＳＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号４５）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＡＧＦＦＹＴＤＰＴＧＧＧＰＲＲＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＡＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＳＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号４６）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＹＹＴＤＰＴＧＧＧＰＲＲＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＡＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＳＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号４７）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＤＰＴＧＧＧＰＲＲＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＡＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＳＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号４８）
Figure 0007405486000011
配列番号４３と比べて、提唱された変異がＩＲ結合を向上させた（すなわち、ＩＣ５０値を低下させた）のは、３つの場合（配列番号４４、配列番号４５、および配列番号４７）でだけであった。しかし、いずれの変異でも、５０ｍｇ／Ｌより大きいホモ二量体力価という製造設計目標を達成する化合物は得られず、また、場合によっては、変異により製造性が顕著に低減する（例えば、２０ｍｇ／Ｌ未満のホモ二量体力価）こともあった。
実施例４０：イヌＩｇＧＢ Ｆｃフラグメントを含むインスリン－Ｆｃ融合タンパク質会合体の生物活性を向上させるために、配列番号６３のインスリンポリペプチドにＣ鎖変異を組み込む試み
実施例３９で得られた結果は、配列番号６３のインスリンポリペプチドのＡ鎖およびＢ鎖を変異させる試みが全て、関連インスリン－Ｆｃ融合物のＨＥＫホモ二量体力価が許容できないほどに低い（すなわち、２５ｍｇ／Ｌ以下のホモ二量体力価）結果となったことを示している。そのため、さらなる実験が必要となった。本実施例では、配列番号６３のインスリンポリペプチドのＣ鎖組成を、より長くすることで、あるいは可動性を増加させることで、変異させた。天然インスリン（例えばヒトインスリン）は、インスリン受容体に結合する際に、Ｂ鎖およびＡ鎖両方の折り畳みの移動を含む、顕著な立体構造変化を起こすことが示されている（例えば、Ｍｅｎｔｉｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ、２０１３年；４９３巻（７４３１号）：ｐｐ２４１～２４５によって説明されている）。本発明のインスリンポリペプチドと異なり、天然インスリンは、天然型では２鎖ポリペプチドであり、２本のジスルフィド結合だけで接続され、Ａ鎖とＢ鎖の可動性を制限するＣ鎖は存在しないため、インスリン受容体においてこの立体構造変化を自由に起こすことができる。特定の理論に束縛されるものではないが、配列番号６３のインスリンポリペプチド内に含まれるＣ鎖が、柔軟でなさ過ぎる（例えば、Ｂ鎖とＡ鎖の間での動きを容易なものにしないアミノ酸組成およびアミノ酸配列）、且つ／または、短過ぎる（例えば、Ｂ鎖のＣ末端とＡ鎖のＮ末端との間のアミノ酸が十分ではない）ために、インスリンポリペプチドが、インスリン受容体への強力な結合に必要な分子形状変化を起こすことが妨げられると仮定した。よって、以下に示すように、配列番号４３のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質をベースとして、インスリンポリペプチドＣ鎖を変化させて、いくつかのインスリン－Ｆｃ融合タンパク質を合成した。配列番号４３に対して得られた配列アラインメントを図１３に示す（クラスタルオメガ）。
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＱＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＤＰＴＱＲＧＧＧＧＧＱＲＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＡＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＳＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号４９）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＤＰＴＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＡＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＳＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号５０）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＤＰＧＧＧＧＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＡＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＳＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号５１）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＧＧＧＧＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＡＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＳＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号５２）
Figure 0007405486000012
インスリン－Ｆｃ融合タンパク質を、実施例１に従ってＨＥＫ２９３細胞で製造し、実施例４に従ってプロテインＡカラムを用いて精製した。構造の確認を実施例６に従って非還元ＣＥ－ＳＤＳおよび還元ＣＥ－ＳＤＳで行い、さらに、配列の確認を実施例８に記載のグリカン除去を伴うＬＣ－ＭＳによって行った。ホモ二量体含有率を実施例１０に従って分子ふるいクロマトグラフィーで測定し、インスリン受容体結合親和性を実施例１２に従って測定した。結果を表１０に示す。配列番号４３のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質のものとの比較において、Ｃ鎖変異がインスリン受容体結合親和性を顕著に向上させた（３０００ｎＭ未満のＩＣ５０）のは、最も長いＣ鎖（ＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧ：配列番号７１）を含む１例（配列番号５０）でだけであった。しかし、これらのＣ鎖変異型インスリン－Ｆｃ融合タンパク質のいずれも、５０ｍｇ／Ｌという製造設計目標を超えるホモ二量体力価を示さなかった。実際に、１つの例（配列番号４９）では、Ｃ鎖変異は予想外にも、顕著に低いホモ二量体力価をもたらした。
実施例４１：生物活性を向上させるために、配列番号６３のインスリンポリペプチドとイヌＩｇＧＢ Ｆｃフラグメントとを含むインスリン－Ｆｃ融合タンパク質にペプチドリンカー変異を組み入れる試み
特定の理論に束縛されるものではないが、配列番号４３のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質のインスリン受容体結合が不十分であることの、別の考えられる理由として、はるかに大きいＦｃフラグメント分子がペプチドリンカーを介してインスリンポリペプチドに極めて近接して結合していることから生じる、インスリンポリペプチドとインスリン受容体との間の立体障害が関係していると考えられていた。ペプチドリンカーがより短かったり、ペプチドリンカーの折り畳みがより密であると、この問題が悪化する可能性があると考えられ、一方、ペプチドリンカーがより長かったり、ペプチドリンカーが自ら折り返しを起こしにくい（例えば、リンカーの分子剛性がより高い）場合、インスリンポリペプチドとＦｃフラグメントとの間により多くの空間がつくられることで、この問題が緩和されることがある。インスリンポリペプチドとＦｃフラグメントとの間の空間の増加は、インスリン受容体とＦｃフラグメントとの間の距離も増加させ、インスリン受容体結合中の干渉が少なくなる。配列番号４３のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構築に用いられた配列番号１１（すなわち、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧ）のペプチドリンカーは、当該リンカーを構成するアミノ酸が側鎖を含まないものである（すなわち、グリシンとアラニンというアミノ酸しか含んでいない）ため、短過ぎ、且つ／または可動性があり過ぎる可能性がある、という仮説が立てられた。よって、この仮説を検証するため、配列番号４３のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質とは別の２つのインスリン－Ｆｃ融合タンパク質バリアントを合成した。配列番号４８のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号４３のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構築に用いられたものと同じペプチドリンカーを含むが、Ａ鎖のＮ末端から２１番目の位置（すなわち、Ａ２１）のアスパラギンが存在しない（すなわち、ｄｅｓ－Ａ２１）インスリンポリペプチドを含む。この特定の変異を組み込むことにより、Ａ鎖とペプチドリンカーとの間の接合部が、タンパク質収量および／または上記分子の生物活性に影響しているかどうかを確かめた。もう一方の配列番号５３のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質は、このｄｅｓ－Ａ２１Ｎ Ａ鎖変異と、配列番号４３のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構築に用いられたものの長さの２倍より長いペプチドリンカーと、を含む。このより長いペプチドリンカーにおいては、アラニンは好ましくなく、代わりに、極性アミド側鎖を含むグルタミンと置き換わっている。このグルタミン置換は、このペプチドリンカーの親水性を増強し、場合によってはリンカーが折れ返ることを妨げることが期待された。これらの配列を以下に示し、配列番号４３に対する配列アラインメントを図１４に示す（クラスタルオメガ）：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＤＰＴＧＧＧＰＲＲＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＳＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号５３）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＤＰＴＧＧＧＰＲＲＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＡＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＳＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号４８）
Figure 0007405486000013
２種のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質を、実施例１に従ってＨＥＫ２９３細胞で製造し、実施例４に従ってプロテインＡカラムを用いて精製した。構造の確認を実施例６に従って非還元ＣＥ－ＳＤＳおよび還元ＣＥ－ＳＤＳで行い、さらに、配列の確認を実施例８に記載のグリカン除去を伴うＬＣ－ＭＳによって行った。ホモ二量体含有率を実施例１０に従って分子ふるいクロマトグラフィーで測定し、インスリン受容体結合親和性を実施例１２に従って測定した。結果を表１１に示す。組成の異なる（配列番号５３の場合ではＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧ（配列番号１３）、対して、配列番号４３の場合ではＧＧＧＧＡＧＧＧＧ（配列番号１１））より長いペプチドリンカーを組み込んだ場合、ＩＣ５０値の顕著な低減によって評価される、インスリン受容体結合の向上が生じ、リンカーを長くすることが、他のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の、インスリン受容体結合を増加させるための戦略になり得ることが示された。しかし、より長いリンカーを組み込んでも、ホモ二量体力価は、５０ｍｇ／Ｌ超という製造設計目標を超えては向上しなかった。
実施例４２：イヌＩｇＧＢ Ｆｃフラグメントを含むインスリン－Ｆｃ融合タンパク質会合体のホモ二量体力価を向上させるために、配列番号６３のインスリンポリペプチドのＢ鎖の一部を欠失させる試み
実施例４１の結果は、ペプチドリンカーを改変することで、天然のＢ１０アミノ酸とＡ８アミノ酸を含む配列番号４３のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質のインスリン受容体に対する結合親和性を増加させることができることを示している。しかし、このペプチドリンカーの変異では、ホモ二量体力価を、製造設計目標を達成するのに十分なほどに増加させることはできなかった。ホモ二量体力価は、細胞内合成および細胞内プロセシングを含むいくつかの特性の関数であるため、インスリン－Ｆｃ分子は、合成中および合成後、２つのホモ二量体モノマー間で分子内で、または、２以上の別々のホモ二量体間で分子間で、自己会合（すなわち、凝集）していたかもしれないという仮説を立てた。この凝集によって、実施例１、実施例４、および実施例１０に記載された製造工程中に細胞培養上清から得られたホモ二量体力価は許容できないほどに低いものであった。このインスリン－Ｆｃ融合タンパク質分子間の相互作用の可能性は、部分的には、自己会合し凝集体を形成するインスリンの周知の傾向によるものであり得る。インスリンの自己会合する傾向を低減するための当該技術分野において公知の１つの方法は、Ｂ鎖のＣ末端付近のアミノ酸を変異させることを含む。例えば、インスリンリスプロ（Ｂ２８Ｋ変異；Ｂ２９Ｐ変異）およびインスリンアスパルト（Ｂ２８Ｄ変異）は、会合と凝集を防ぐことで、主に単量体型のインスリンを溶液中に生じさせる非天然型のＢ鎖変異を含む、周知の市販２鎖インスリンである。凝集を防ぐための別のアプローチは、アミノ酸の構造的な欠失を含む。例えば、デスペンタペプチドインスリンとして知られている２鎖インスリン（ｄｅｓｐｅｎｔａｐｅｐｔｉｄｅ ｉｎｓｕｌｉｎ）（ＤＰＰＩ；Ｂｒａｎｇｅ Ｊ．、Ｄｏｄｓｏｎ Ｇ．Ｇ．、Ｅｄｗａｒｄｓ Ｊ．、Ｈｏｌｄｅｎ Ｐ．Ｈ．、Ｗｈｉｔｔｉｎｇｈａｍ Ｊ．Ｌ．、１９９７年ｂ．、“Ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｉｎｓｕｌｉｎ ｆｉｂｒｉｌｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｘ－ｒａｙ ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａ ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ ｉｎｓｕｌｉｎ （ｄｅｓｐｅｎｔａｐｅｐｔｉｄｅ ｉｎｓｕｌｉｎ）”、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、２７巻、ｐｐ５０７～５１６を参照）は、Ｂ鎖の５個のＣ末端アミノ酸（ＹＴＰＫＴ）が除去されている以外は、天然型の２鎖ヒトインスリンと同一である。ＤＰＰＩは、天然型２鎖ヒトインスリンと比べて、インスリン受容体に対する結合親和性が低いが、溶液中で完全に単量体の状態であり、これは、ＤＰＰＩ分子間では会合も凝集もほとんど起こらないことを意味している。よって、分子内および分子間の自己会合の可能性を低減し、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質のホモ二量体力価を向上させる試みでは、ＤＰＰＩ、インスリンリスプロ、およびインスリンアスパルトについて上記したような、部分的なＢ鎖アミノ酸切断およびＢ鎖アミノ酸変異を用いて、配列番号４３のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質のいくつかのバリアントを構築した。これらの配列を以下に示し、配列番号４３に対する配列アラインメントを図１５に示す（クラスタルオメガ）：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＤＰＧＧＧＧＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＡＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＳＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号５１）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＧＧＧＧＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＡＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＳＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号５２）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＱＧＧＧＧＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＡＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＳＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号５４）
Figure 0007405486000014
インスリン－Ｆｃ融合タンパク質を、実施例１に従ってＨＥＫ２９３細胞で製造し、実施例４に従ってプロテインＡカラムを用いて精製した。構造の確認を実施例６に従って非還元ＣＥ－ＳＤＳおよび還元ＣＥ－ＳＤＳで行い、さらに、配列の確認を実施例８に記載のグリカン除去を伴うＬＣ－ＭＳによって行った。ホモ二量体含有率を実施例１０に従って分子ふるいクロマトグラフィーで測定し、インスリン受容体結合親和性を実施例１２に従って測定した。結果を表１２に示す。得られた化合物のホモ二量体力価は１例（配列番号５１）で顕著に増加しただけであったが、予想外にも、変異型化合物（配列番号５１、配列番号５４、および配列番号５２）の全てにおいて、インスリン受容体親和性が向上した。
実施例４３：ホモ二量体力価および生物活性をさらに向上させるための、配列番号４３のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質に対する、Ｂ鎖変異、Ｃ鎖変異、およびＡ鎖変異、Ｂ鎖切断、並びにリンカー変異を組み合わせる試み
実施例３９、実施例４０、実施例４１、および実施例４２で示されたように、単一の戦略で、非免疫原性の天然型のＢ１０アミノ酸およびＡ８アミノ酸を含むインスリンポリペプチドと、イヌＩｇＧＢ Ｆｃフラグメントを組み込んで、許容できるインスリン受容体活性およびホモ二量体力価を有するインスリン－Ｆｃ融合タンパク質を形成することに成功したものはない。そこで、Ｃ鎖をより長くし、ペプチドリンカーをより長くし、Ｂ鎖のＣ末端アミノ酸を切断するというコンセプトを組み合わせた。さらに、自己会合や凝集の傾向をさらに低減する可能性があるため、生理的ｐＨで負または正に帯電する側基を有するアミノ酸といった、疎水性の低いアミノ酸を用いて、天然型インスリンの疎水性アミノ酸残基部位にさらなる点変異を導入した。変異の例としては、チロシンからアラニン、チロシンからグルタミン酸、イソロイシンからスレオニン、およびフェニルアラニンからヒスチジンの変異が挙げられる。さらに、解析を単純にするため、全ての場合で、イヌＩｇＧＢ ＦｃフラグメントのｃＮｇ部位を天然型であるアスパラギンに戻した。これらのインスリン－Ｆｃ融合タンパク質バリアントの配列を以下に示し、配列番号４３に対して得られた配列アラインメントを図１６に示す（クラスタルオメガ）：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＮＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号５５）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＮＨＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＮＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号５６）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＮＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＮＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号２８）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＮＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号２６）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＮＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号５７）
Figure 0007405486000015
インスリン－Ｆｃ融合タンパク質を、実施例１に従ってＨＥＫ２９３細胞で製造し、実施例４に従ってプロテインＡカラムを用いて精製した。構造の確認を実施例６に従って非還元ＣＥ－ＳＤＳおよび還元ＣＥ－ＳＤＳで行い、さらに、配列の確認を実施例８に記載のグリカン除去を伴うＬＣ－ＭＳによって行った。ホモ二量体含有率を実施例１０に従って分子ふるいクロマトグラフィーで測定し、インスリン受容体結合親和性を実施例１２に従って測定した。結果を表１３に示す。結果に示されているように、特定のＢ鎖アミノ酸およびＡ鎖アミノ酸の疎水性を低減すること、より長くより可動性が高いＣペプチド配列を使用すること、いくつかのＣ末端Ｂ鎖アミノ酸を切断すること、並びにより長いペプチドリンカーを用いること、を組み合わせることで、ホモ二量体力価およびインスリン受容体結合活性の設計基準を最低限達成する有用なインスリン－Ｆｃ融合タンパク質がいくつか得られた。配列番号５６、配列番号２８、配列番号２６、および配列番号５７は、配列番号４３または配列番号５５のいずれよりも、より好ましいインスリン受容体ＩＣ５０値（３０００ｎＭ未満）と、より好ましいＨＥＫホモ二量体力価（１００ｍｇ／Ｌ超）を示した。驚くべきことに、わずか数個のアミノ酸を変えるだけで、元の配列番号４３のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質に対して、インスリン受容体親和性が数倍に向上し、配列番号２６のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の場合では、ホモ二量体力価が劇的に増加している。
実施例４４：配列番号７のインスリンポリペプチドと配列番号１３のペプチドリンカーと配列番号１５のイヌＩｇＧＢ Ｆｃフラグメントとから構築されたインスリン－Ｆｃ融合タンパク質のインビボ生物活性、反復投与生物活性、および免疫原性
実施例４３より得られた肯定的なホモ二量体力価およびインスリン受容体結合活性の結果から、２種の最も有望なインスリン－Ｆｃ融合タンパク質（配列番号２６および配列番号２８）を、イヌにおいて、反復投与生物活性および免疫原性を評価する試験にかけた。それぞれの化合物は、より長く、より親水性が高い配列番号１３のペプチドリンカーと、より製造性が高く、より凝集性が低い配列番号１５のイヌＩｇＧＢ Ｆｃフラグメントと、を含む。最も重要なこととして、どちらのインスリン－Ｆｃ融合タンパク質も、免疫原性が低いと推定される天然型のＢ１０アミノ酸およびＡ８アミノ酸（すなわち、一般配列番号６）を有するインスリンポリペプチドを含んでいる。配列番号２８のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の場合、Ａ２１位にアスパラギンが存在する（すなわちインスリンポリペプチドは配列番号８を含む）。配列番号２６のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の場合、Ａ２１位にアスパラギンが存在しない（すなわちインスリンポリペプチドは配列番号７を含む）。
配列番号２８のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質のインビボ生物活性を、実施例２１の手順に従ってＮ＝１のイヌで試験した。単回皮下投与の図１７に示される結果は、配列番号２８のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質が、実施例２２の手順に従って算出されたＮＡＯＣが１０７６％ＦＢＧＬ・日・ｋｇ／ｍｇであり、インビボにおいて確かに生物活性を示すことが示された。配列番号２８のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の薬物動態プロファイルを、ＥＬＩＳＡを使用する実施例２３の方法で測定し、２コンパートメントモデルをそのデータに適合し、その排出半減期を求めたところ、約３．５日であった。
次いで、実施例１５の手順に従って、配列番号２８のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の皮下投与を、Ｎ＝１のイヌに、最初の注射後の１４日目、２８日目、および４２日目に続けることで、反復投与時の生物活性を評価した。イヌの％ＦＢＧＬが低下し過ぎた場合、そのイヌに餌を与えて、血糖を安全なレベルまで上昇させた。それ以降の各投与については、実施例２２の一般手順に従って、ＮＡＯＣおよびＮＡＯＣＲの測定を行い、投与を施行した時間から次の投与を施行する直前までを算出した。表１４に示されるＮＡＯＣおよびＮＡＯＣＲは、配列番号２８のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質が、４回の投与中、０．８よりも大きなＮＡＯＣＲを維持することから、反復投与時の生物活性の設計目標を達成していることを示している。
Figure 0007405486000016
配列番号２８のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の免疫原性を、実施例２４の手順に従って試験した。図１８に示されているように、配列番号２８のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質は、反復投与実験を通してインビボ生物活性が維持されたことと一致して、インビボにおける免疫原性を見かけ上示していない。
インスリンポリペプチド鎖のＡ２１のアスパラギンが存在しない、配列番号２６のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質についても、イヌにおける反復投与時の生物活性成績を評価した。上記化合物を、Ｎ＝１のイヌに、０日目、１４日目、２８日目、および４２日目に、実施例２２の手順に従って皮下投与した。イヌの％ＦＢＧＬが低下し過ぎた場合、そのイヌに餌を与えて、血糖を安全なレベルまで上昇させた。１回目注射のＮＡＯＣは堂々の２２７８％ＦＢＧＬ・日・ｋｇ／ｍｇであり、配列番号２６のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号２８のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質のほぼ２倍の効力で、インビボにおいて十分な生物活性を示すことが示された。インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の薬物動態プロファイルを、ＥＬＩＳＡを使用する実施例２３の方法で測定し、２コンパートメントモデルをそのデータに適合し、その排出半減期を求めたところ、４．１±０．７日であった。図１９および図２０は、動物に配列番号２６のホモ二量体を投与する場合の、単回投与による血糖調節と、複数回投与による複数週に亘る血糖調節を示している。それ以降の各投与についても、実施例２２の一般手順に従って、ＮＡＯＣおよびＮＡＯＣＲの測定を行い、投与を施行した時間から次の投与を施行する直前までを算出した。表１５に示されるＮＡＯＣおよびＮＡＯＣＲは、配列番号２６のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質が、４回の投与中、１．０以上のＮＡＯＣＲを維持することから、実施例２９に記載の反復投与時の生物活性の設計目標を達成していることを示している。
配列番号２６のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の免疫原性を、実施例２４の手順に従って試験した。図２１に示されているように、配列番号２６のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質は、反復投与実験を通してインビボ生物活性が維持されたことと一致して、インビボにおける免疫原性を見かけ上示していない。
Figure 0007405486000017
発明を実施するための形態で論じたように、アスパラギン－グリシン結合間には既知の酵素的切断部位が存在する（Ｖｌａｓａｋ，Ｊ．、Ｉｏｎｅｓｃｕ，Ｒ．、（２０１１年）ＭＡｂｓ、３巻、３号、ｐｐ２５３～２６３）。配列番号１３のペプチドリンカーを有する配列番号２６のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質に含まれる配列番号７のインスリンポリペプチドの、Ａ鎖の２１番目のアミノ酸（すなわち、Ａ２１）にあるアスパラギンを取り除くことで、Ａ鎖のＣ末端とペプチドリンカーのＮ末端との間のアスパラギン－グリシン結合が酵素的に切断される可能性が排除される。しかし、配列番号２８のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１３のペプチドリンカーと、Ａ２１にアスパラギンを保持する配列番号８のインスリンポリペプチドと、を含んでいる。そのため、配列番号２８のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質は、合成中または皮下投与後のインビボで、酵素による消化を受けるであろうと予想されていた。しかし、かなり予想外なことに、配列番号２８のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質は、許容できるホモ二量体力価を伴ってＨＥＫ細胞で製造可能であり、また、その生物活性を損なう酵素消化の徴候もなく、許容できるインビボ生物活性を示した。
実施例４５：好ましい配列番号７のインスリンポリペプチドと好ましい配列番号１３のペプチドリンカーとを含むインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の製造性およびインビボ効力を最適とするための、イヌＩｇＧＢアイソタイプＦｃフラグメントの確認
実施例４３および実施例４４に記載されたように、免疫原性がなく、収量が多く、純度が高く、生物活性が高いインスリン－Ｆｃ融合タンパク質が得られる、インスリンポリペプチドとペプチドリンカーの新規組み合わせが発見されたことから、イヌＩｇＧＢ Ｆｃフラグメントが、実施例３２および実施例３３でのインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の場合では事実であったように、ホモ二量体力価および生物活性の観点で好ましいアイソタイプであるどうかに関する疑問が、残った。そこで、配列番号２６のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質のインスリンポリペプチド（配列番号７）とペプチドリンカー（配列番号１３）は維持し、配列番号１５のイヌＩｇＧＢ Ｆｃフラグメントを配列番号１４のイヌＩｇＧＡ Ｆｃフラグメント、配列番号１６のイヌＩｇＧＣ Ｆｃフラグメント、または配列番号１７のイヌＩｇＧＤ Ｆｃフラグメントに置き換えた、さらなるインスリン－Ｆｃ融合タンパク質を設計した。これらの得られたインスリン－Ｆｃ融合タンパク質バリアントの配列を以下に示す：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＮＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号２６）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＲＣＴＤＴＰＰＣＰＶＰＥＰＬＧＧＰＳＶＬＩＦＰＰＫＰＫＤＩＬＲＩＴＲＴＰＥＶＴＣＶＶＬＤＬＧＲＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＥＶＨＴＡＫＴＱＳＲＥＱＱＦＮＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＥＨＱＤＷＬＴＧＫＥＦＫＣＲＶＮＨＩＤＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＲＡＨＫＰＳＶＹＶＬＰＰＳＰＫＥＬＳＳＳＤＴＶＳＩＴＣＬＩＫＤＦＹＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＲＫＨＲＭＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＱＧＤＰＦＴＣＡＶＭＨＥＴＬＱＮＨＹＴＤＬＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号５８）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＣＮＮＣＰＣＰＧＣＧＬＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＩＬＶＴＡＲＴＰＴＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＮＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＳＫＱＶＱＴＡＮＴＱＰＲＥＥＱＳＮＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＳＧＫＱＦＫＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＥＩＩＳＫＴＰＧＱＡＨＱＰＮＶＹＶＬＰＰＳＲＤＥＭＳＫＮＴＶＴＬＴＣＬＶＫＤＦＦＰＰＥＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＭＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＩＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号５９）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＣＩＳＰＣＰＶＰＥＳＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＩＬＲＩＴＲＴＰＥＩＴＣＶＶＬＤＬＧＲＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＥＶＨＴＡＫＴＱＰＲＥＱＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＥＨＱＤＷＬＴＧＫＥＦＫＣＲＶＮＨＩＧＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＰＫＥＬＳＳＳＤＴＶＴＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＥＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＰＥＰＥＳＫＹＨＴＴＡＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＱＧＤＴＦＴＣＡＶＭＨＥＡＬＱＮＨＹＴＤＬＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号６０）。
インスリン－Ｆｃ融合タンパク質を、実施例１に従ってＨＥＫ２９３細胞で製造し、実施例４に従ってプロテインＡカラムまたはプロテインＧカラムを用いて精製した。構造の確認を実施例６に従って非還元ＣＥ－ＳＤＳおよび還元ＣＥ－ＳＤＳで行い、さらに、配列の確認を実施例８に記載のグリカン除去を伴うＬＣ－ＭＳによって行った。ホモ二量体含有率を実施例１０に従って分子ふるいクロマトグラフィーで測定し、インスリン受容体結合親和性を実施例１２に従って測定した。さらに、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質のイヌＦｃＲｎ受容体に対する親和性を、実施例１５に従って測定した。表１６に示されているように、イヌＩｇＧＢ Ｆｃフラグメントを含む配列番号２６のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質は、これらの配列の中で最も高いホモ二量体力価を示した。イヌＩｇＧＡ Ｆｃフラグメントを含む配列番号５８のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質は、プロテインＡカラムを用いて精製された場合は不十分なホモ二量体力価しか示さなかったが、プロテインＧカラムを用いて精製された場合では、ホモ二量体力価は顕著に向上し、５０ｍｇ／Ｌ超という設計目標を上回った。イヌＩｇＧＣ Ｆｃフラグメントを含む配列番号５９のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質についても同じであった。イヌＩｇＧＤ Ｆｃフラグメントを含む配列番号６０のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質は、プロテインＡまたはプロテインＧカラムのどちらで精製した場合も、化合物が得られなかった。以上から、異なるインスリンポリペプチド（配列番号４）およびペプチドリンカー（配列番号１１）を含む配列番号３６のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質で示されたように、イヌＩｇＧＢはホモ二量体力価の観点で好ましいＦｃフラグメントであった（実施例３２参照）。
Figure 0007405486000018
プロテインＧを介して精製されたイヌＩｇＧＡ Ｆｃフラグメントを含む配列番号５８のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質のインビボ生物活性を、実施例２１の手順に従って試験した。図２２に示される結果は、配列番号５８のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質が、実施例２２に従って算出されたＮＡＯＣがわずか１７４％ＦＢＧＬ・日・ｋｇ／ｍｇであり、インビボにおいてある程度の生物活性しか示さないことが示された。
プロテインＧを介して精製されたイヌＩｇＧＣ Ｆｃフラグメントを含む配列番号５９のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質のインビボ生物活性を、実施例２１の手順に従って試験した。図２３に示される結果は、配列番号５９のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質が、実施例２２に従って算出されたＮＡＯＣがわずか３９％ＦＢＧＬ・日・ｋｇ／ｍｇであり、インビボにおいてある程度の生物活性しか示さないことが示された。
以上から、異なるインスリンポリペプチド（配列番号４）およびペプチドリンカー（配列番号１１）を含む配列番号３６のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質で示されたように、イヌＩｇＧＢは生物活性の観点で好ましいＦｃフラグメントであった（実施例３２および実施例３３、並びに上記の表１６を参照）。
実施例４６：潜在的な免疫原性リスクを低減するための、配列番号８のインスリンポリペプチドと、配列番号１３のペプチドリンカーと、イヌＩｇＧＢ Ｆｃフラグメントとを含む非グリコシル化インスリン－Ｆｃ融合タンパク質
配列番号２６のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質は設計目標の全てを達成しているが（実施例２８）、治療が長期に亘った場合（例えば、６か月、１年、２年、またはそれ以上）に免疫原性リスクが生じる恐れがあり、これが起こった場合、糖尿病治療における本インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の使用が損なわれる可能性がある。発明を実施するための形態、実施例３４および実施例３５に記載したように、反復投与後の生物活性を低減させる、考えられる原因の１つは、イヌＩｇＧＢ Ｆｃフラグメントがイヌの免疫系と望ましくない相互作用を起こすことによる、中和抗薬物抗体の産生である。しかし、実施例４５で示された結果は、予想外にも、イヌＩｇＧＢアイソタイプが、４種のイヌＩｇＧアイソタイプの中で、所望の製造性および生物活性をもたらす唯一の選択肢であったことを示している。そこで、ＦｃγＲＩ受容体結合性が低く、長期の慢性的な免疫原性リスクが低減されるはずの、非グリコシル化インスリン－Ｆｃ融合タンパク質を得るための、さらなるＦｃ変異を探索した。
発明を実施するための形態に記載したように、ＦｃγＲＩ相互作用を低減するための１つの方法には、ＦｃフラグメントのｃＮｇ部位を変異させることで、宿主細胞内で合成される際のグリコシル化を妨げることが行われる。すなわち、ｃＮｇ部位の変異を配列番号２６のＦｃフラグメント領域に対して行ったことで、実施例１５に記載のインビトロヒトＦｃγＲＩアッセイにおける結合性によって評価される、インビボにおけるＦｃγ受容体に対するＦｃフラグメントの結合親和性が低減された。配列番号２６のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質におけるｃＮｇ部位の位置はｃＮｇ－ＮＢ１５１である。配列番号２６に対する変異として、配列番号６２にはｃＮｇ－ＮＢ１５１－Ｓ変異が含まれ、配列番号６１には同じｃＮｇ－ＮＢ１５１－Ｓ変異に加えてＮＢ１１９－Ａ変異が含まれた。Ｌｏ，Ｍ．ら、“Ｅｆｆｅｃｔｏｒ ａｔｔｅｎｕａｔｉｎｇ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ ｔｈａｔ ｍａｉｎｔａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｅ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ ｍｉｃｅ”、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、（２０１７年）、ｐｐ．１～２０により、マウス抗体での使用しか記載されていないが、ＮＢ１１９－Ａは、ＦｃγＲＩとの相互作用を低減させるさらなる試みにおいて組み込まれたものである。得られたインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の完全アミノ酸配列を以下に挙げ（明確にするためにＮＢ１１９部位およびＮＢ１５１部位には下線）、さらに、これらの配列アラインメント（クラスタルオメガ）を図２４に示す：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＡＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＳＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号６１）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＳＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号６２）。
インスリン－Ｆｃ融合タンパク質を、実施例１に従ってＨＥＫ２９３細胞で製造し、実施例４に従ってプロテインＡカラムを用いて精製した。構造の確認を実施例６に従って非還元ＣＥ－ＳＤＳおよび還元ＣＥ－ＳＤＳで行い、さらに、配列の確認を実施例８に記載のグリカン除去を伴うＬＣ－ＭＳによって行った。ホモ二量体含有率を実施例１０に従って分子ふるいクロマトグラフィーで測定し、インスリン受容体結合親和性を実施例１２に従って測定した。表１７に示されているように、Ｆｃフラグメントに対してｃＮｇ－ＮＢ１５１－Ｓ変異を組み込むと、ホモ二量体率が減少し、許容できないほどに高い凝集レベルを示した（すなわち、ホモ二量体率が７０％強まで低下した）。
Figure 0007405486000019
配列番号６１および配列番号６２のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質のインビボ生物活性を、実施例２１の手順に従ってＮ＝１のイヌで試験した。単回皮下投与についての図２５に示される結果は、両化合物が、配列番号２６のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質よりもインビボ生物活性が顕著に低かったことを示している（配列番号６２のＮＡＯＣ＝５７４％ＦＢＧＬ・日・ｋｇ／ｍｇ；配列番号６１のＮＡＯＣ＝９２１％ＦＢＧＬ・日・ｋｇ／ｍｇ）。これらの結果は、Ｆｃフラグメントに対してｃＮｇ－ＮＢ１５１－Ｓ変異を組み込んで、配列番号２６のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の非グリコシル化型を作製したところ、予想外にも、得られる化合物のインビボ生物活性が低減されたことを示している。
ｃＮｇ－ＮＢ１５１－Ｓ部位の変異を含む配列番号６２のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の凝集度を減らし、生物活性を向上させる試みにおいて、凝集に関与すると考えられている領域に変異を含む、各種インスリンポリペプチドＢ鎖バリアントを検討した。インスリン－Ｆｃ融合タンパク質を、実施例１に従ってＨＥＫ２９３細胞で製造し、実施例４に従ってプロテインＡカラムを用いて精製した。構造の確認を実施例６に従って非還元ＣＥ－ＳＤＳおよび還元ＣＥ－ＳＤＳで行い、さらに、配列の確認を実施例８に記載のグリカン除去を伴うＬＣ－ＭＳによって行った。ホモ二量体含有率は実施例１０に従って分子ふるいクロマトグラフィーで測定した。試験されたＢ鎖バリアントの中で、Ｂ鎖のＮ末端から１６番目のアミノ酸（すなわち、Ｂ１６）にチロシンからアラニンへの置換を含む１つのインスリンＦｃ融合タンパク質（配列番号３０）が、予想外にも、ホモ二量体力価が高く（１０５ｍｇ／Ｌ）、凝集が少なく（９９％ホモ二量体）、１０４ｍｇ／Ｌというホモ二量体力価が得られることが分かった。実施例１２に従って測定されたインスリン受容体結合は許容できるものであり、ＩＣ５０は２０４０ｎＭであった。実施例１６に従って測定されたＦｃＲｎ受容体結合親和性ＥＣ５０値は１１９４ｎｇ／ｍＬであった。配列番号３０のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の薬物動態プロファイルを、ＥＬＩＳＡを使用する実施例２３の方法で測定し、２コンパートメントモデルをそのデータに適合し、その排出半減期を求めたところ、４．１±０．７日であった。配列番号３０の配列を以下に示す（明確にするためにＢ１６Ａ変異およびｃＮｇ－ＮＢ１５１－Ｓ変異には下線）。
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＳＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号３０）。
次に、配列番号３０のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質を、イヌにおいて、反復投与時の生物活性成績について評価した。上記化合物を、Ｎ＝１のイヌに、０日目、７日目、１４日目、および２８日目に、実施例２２の手順に従って皮下投与した。イヌの％ＦＢＧＬが低下し過ぎた場合、そのイヌに餌を与えて、血糖を安全なレベルまで上昇させた。予想外にも、配列番号６２のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質と比較して、Ｂ１６Ａ変異を含む配列番号３０のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の１回目注射のＮＡＯＣは、顕著に高かった（１１８５％ＦＢＧＬ・日・ｋｇ／ｍｇ）。１回目投与のインビボ生物活性のグラフを図２６に示す。また、当該化合物の薬物動態プロファイルを、ＥＬＩＳＡを使用する実施例２３の方法で測定し、２コンパートメントモデルをそのデータに適合し、当該化合物の排出半減期を求めたところ、３．５日であった。それ以降の各投与についても、実施例２２の一般手順に従って、ＮＡＯＣおよびＮＡＯＣＲの測定を行い、投与を施行した時間から次の投与を施行する直前までを算出した。表１８に示されるＮＡＯＣおよびＮＡＯＣＲは、配列番号３０のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質が、４回の投与中、０．６以上のＮＡＯＣＲを維持することから、反復投与時の生物活性の設計目標を達成していることを示している。まとめると、これらの結果は、好適な、配列番号２６の非グリコシル化ｃＮｇ－Ｓバリアントを得るには、インスリンＢ鎖配列を変異することが必要であったことを示している。よって、配列番号１０のインスリンポリペプチドは、ｃＮｇ変異型イヌＩｇＧＢ Ｆｃフラグメントを含む非グリコシル化インスリン－Ｆｃ融合タンパク質に好適であった。
Figure 0007405486000020
最後に、選択された化合物の、免疫系との相互作用のしやすさを、実施例１５の手順に従ってそのＦｃγ受容体結合活性を測定することにより、調べた。表１９は、これらのインスリン－Ｆｃ融合タンパク質のＦｃγ受容体Ｉ結合と、配列番号３６のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質のＦｃγ受容体結合とを比較している。非グリコシル化インスリン－Ｆｃ融合タンパク質（ｃＮｇ－Ｓ変異によって達成）が、最も低い、配列番号３６に対するＦｃγ受容体結合比を示したことが分かる。
Figure 0007405486000021
実施例４７：安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞株を介して作製されたイヌＩｇＧＢ由来のＦｃフラグメントを含む好ましいインスリン－Ｆｃ融合タンパク質を用いた、例示的なＣＨＯベースのプロダクションラン
配列番号２６または配列番号３０をコードするベクターで安定にトランスフェクトされた別々のＣＨＯ細胞株を、実施例２に記載されたように構築した。フェッドバッチ式振盪フラスコ１４日間プロダクションラン（０．５～２．０Ｌの培地規模）の播種を、３７℃、５％二酸化炭素に設定された振盪恒温器内で、０．５×１０６細胞／ｍＬとなるように行った。増殖培地としてＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯをＤｙｎａｍｉｓ（サーモフィッシャー社）に置き換え、フィードとしてＥｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｆｅｅｄ Ｃ（サーモフィッシャー社）を用いた以外は、上記実施例２に記載したように、ランを実行した。３％ｖ／ｖのフィードの添加をプロダクションラン３日目から開始して、さらに４日目にも添加を行い、振盪フラスコ温度を３２℃に調整し、振盪恒温器内の二酸化炭素濃度を５％から２％に下げた。このランの間に、細胞は８～１４×１０６細胞／ｍＬまで増加し、１４日目に、プロダクションランを回収して細胞を取り除き、実施例４、実施例６、実施例８、および実施例１０に記載されたように培養上清の精製と試験を行って、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質を得た。表２０には、安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞株を含むプロダクションランから得られた製造データが記載されている。
Figure 0007405486000022
実施例４８：安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞株を介して作製されたイヌＩｇＧＢ由来のＦｃフラグメントを含む好ましいインスリン－Ｆｃ融合タンパク質を用いた、例示的なＣＨＯベースのプロダクションラン
配列番号２８をコードするベクターで安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞株を、実施例２に記載されたように構築する。フェッドバッチ式振盪フラスコ１４日間プロダクションラン（０．５～２．０Ｌの培地規模）の播種を、３７℃、５％二酸化炭素に設定された振盪恒温器内で、０．５×１０６細胞／ｍＬとなるように行う。増殖培地としてＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯをＤｙｎａｍｉｓ（サーモフィッシャー社）に置き換え、フィードとしてＥｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｆｅｅｄ Ｃ（サーモフィッシャー社）を用いる以外は、実施例２に記載したように、ランを実行する。３％ｖ／ｖのフィードの添加をプロダクションラン３日目から開始して、さらに４日目にも添加を行い、振盪フラスコ温度を３２℃に調整し、振盪恒温器内の二酸化炭素濃度を５％から２％に下げる。１４日目に、プロダクションランを回収して細胞を取り除き、実施例４、実施例６、実施例８、および実施例１０に記載されたように培養上清の精製と試験を行って、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質を得る。得られるプロダクションランからは、配列番号２８の、２００ｍｇ／Ｌを超えるタンパク質収量、９５％を超えるホモ二量体、および１９０ｍｇ／Ｌを超えるホモ二量体力価が得られると期待される。
結果：ヒトＦｃフラグメントを含むインスリン－ＦＣ融合タンパク質
実施例４９：ヒトＦｃ ＩｇＧ１アイソタイプのＦｃフラグメントを含むインスリン－Ｆｃ融合タンパク質、およびヒトＦｃ ＩｇＧ２アイソタイプのＦｃフラグメントを含むインスリン－Ｆｃ融合タンパク質
配列番号７のインスリンポリペプチド配列とヒトＩｇＧ２アイソタイプのＦｃフラグメント（配列番号７４）とを含み、配列番号１３のペプチドリンカーを用いる、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の作製を試みた。得られたインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の完全アミノ酸配列は以下の通りである：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号７５）。
さらに、配列番号７のインスリンポリペプチド配列とヒトＩｇＧ１アイソタイプのＦｃフラグメント（配列番号７３）とを含み、配列番号１３のペプチドリンカーを用いる、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の作製を試みた。得られたインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の完全アミノ酸配列は以下の通りである：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号７６）。
配列番号７５および配列番号７６のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成は、実施例１に従ってＨＥＫ細胞で合成し、実施例４に従って精製した。それぞれのインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成について、２つの別々の合成工程およびプロテインＡ精製工程を経て、総タンパク質収量から、表２１に示されるような平均ホモ二量体力価が得られた。インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成の構造は実施例６に従って非還元ＣＥ－ＳＤＳおよび還元ＣＥ－ＳＤＳで確認し、さらに、実施例８に記載のグリカン除去を伴うＬＣ－ＭＳによって配列の確認を行った。実施例１０に従って分子ふるいクロマトグラフィーでホモ二量体率を測定したところ、以下の表２１に示すように求められた。まとめると、ＨＥＫ細胞における配列番号７６のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の製造では、凝集レベルとホモ二量体力価レベルが許容できるものであり、１５０ｍｇ／Ｌよりも大きいホモ二量体力価という設計目標が達成されたが、その一方、ＨＥＫ細胞における配列番号７５のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の製造では、ホモ二量体力価設計目標が達成されなかった。
次に、配列番号７６のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質を、インビボで生物活性を示す可能性があるかについて評価した。まず、配列番号７６のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質のＩＲ結合を実施例１２に従って測定したところ、ＩＣ５０値は１７９９ｎＭという結果となり、当該化合物がインビボで生物活性を示す可能性があることが示された（すなわち、ＩＣ５０が２４００ｎＭ未満）。ＦｃＲｎアッセイにおけるＥＣ５０値は５７８ｎｇ／ｍＬであり、イヌでのスクリーニング研究（例えば、実施例２８に記載のもの）やヒト糖尿病患者において測定された場合に、長期のインビボ生物活性プロファイルを有する可能性が高いことが示された。
次に、望ましくない免疫原性の傾向について、実施例１４の方法および実施例１６の方法により、各化合物のインビトロにおけるＦｃγＲＩ結合およびＣ１ｑ結合を測定することで、スクリーニングを行った。配列番号７５のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の、ＦｃγＲＩアッセイにおけるＯＤ４５０比およびＣ１ｑアッセイにおけるＯＤ４５０比（ＯＤ４５０比の参照インスリン－Ｆｃ融合タンパク質は配列番号７６）は、それぞれ０．０４５および０．３０９であることが明らかとなり、配列番号７５のホモ二量体が、ＦｃγＲＩ結合の設計目標（アッセイＯＤ４５０比が０．５０未満）およびＣ１ｑ結合の設計目標（アッセイＯＤ４５０比が０．３５未満）（実施例２９）を達成したことが示された。しかし、上記のように、ＨＥＫ細胞における配列番号７５のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の収量は、ホモ二量体力価の設計目標を達成しなかった。
Figure 0007405486000023
実施例５０：ヒトＩｇＧ１アイソタイプを含むインスリン－Ｆｃ融合タンパク質のＦｃフラグメント領域のｃＮｇ変異
配列番号７６のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の、ホモ二量体含有率、ＩＲ結合親和性、および許容できるＦｃＲｎ受容体に対する結合親和性を維持する試みの中で、ＦｃγＲＩに対する結合およびＣ１ｑに対する結合を低減しようと、ｃＮｇ－Ｓ変異をＦｃフラグメントのＣＨ３領域に挿入したところ、以下のような配列番号９１のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成が得られた：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＳＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号９１）。
配列番号９１の非グリコシル化インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成を、実施例１に従ってＨＥＫ細胞において合成し、実施例４に従って精製し、実施例６、実施例８、実施例１０、実施例１２、実施例１４、および実施例１６に従って試験を行った。表２２に示される結果は、配列番号７６の親グリコシル化インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成の結果と共に、総タンパク質収量、ホモ二量体率、およびホモ二量体力価を示している。これらの結果は、配列番号７６のヒトＩｇＧ１ Ｆｃフラグメント内のｃＮｇ－Ｓ変異により得られた、配列番号９１のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成が、ＦｃγＲＩ親和性およびＣ１ｑ親和性の望ましい低減を示したことを示している。配列番号９１のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成のホモ二量体力価は、配列番号７６のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成のホモ二量体力価と比べて、顕著に増加していた。ホモ二量体力価は向上したが、配列番号９１のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成は、ＩＲアッセイにおけるＩＣ５０値が、２４００ｎＭよりも大きく（２４００ｎＭ未満という設計基準の外）、且つ、配列番号７６のものよりもかなり高く（すなわち、ＩＲ親和性がより低い）、このインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成が、許容できる効力を示したり、設計目標（実施例２９）を達成する可能性が低いことが示された。
Figure 0007405486000024
実施例５１：変異型インスリンポリペプチド（配列番号１０）、リンカー（配列番号１３）、およびｃＮｇ－Ｓ変異を含むＩｇＧ１アイソタイプＦｃを用いたヒトインスリン－Ｆｃ融合タンパク質
上記のように、ＩｇＧ１アイソタイプＦｃフラグメントにおけるｃＮｇ－Ｓ変異では、ＦｃγＲＩおよびＣ１ｑに対する親和性が顕著に低減した、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成が得られたが、このインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成は、許容できないほどに低いＩＲ受容体親和性を有している（すなわち、ＩＣ５０値が２４００ｎＭより大きい）。そこで、インスリンポリペプチドに変異を加え、その変異がＩＲ親和性を改善させるかどうかを確かめる目的で、得られた物質をＩＲアッセイにおけるＩＣ５０に対するスクリーニングにかけた。Ｂ鎖のＮ末端から１６番目のアミノ酸をチロシンからアラニンにかえた（すなわち、Ｂ１６Ａ）ところ、配列番号１０のインスリンポリペプチドが得られた。配列番号１０の変異型インスリンポリペプチドおよび配列番号１３のペプチドリンカーを、Ｘ１がＳである配列番号７７のｃＮｇ変異型Ｆｃフラグメントと共に用いたところ、配列番号７８のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成が得られた。インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成におけるｃＮｇ－Ｓ変異を、Ｆｃフラグメント領域に対して行うことで、実施例１５に記載のインビトロヒトＦｃγＲＩアッセイにおける結合性によって評価される、インビボにおける当該ＦｃフラグメントのＦｃγ受容体に対する結合親和性が低減された。配列番号７８のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質におけるｃＮｇ－Ｓ部位の位置は、ｃＮｇ部位における「Ｎ」から「Ｓ」への変異を含むｃＮｇ－ＮＢ１５５である。
配列番号７８のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成を、実施例１に従ってＨＥＫ２９３細胞で製造し、実施例４に従ってプロテインＡカラムを用いて精製した。配列番号７８のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構造は実施例６に従って非還元ＣＥ－ＳＤＳおよび還元ＣＥ－ＳＤＳで確認し、さらに、実施例８に記載のグリカン除去を行わないＬＣ－ＭＳによって配列の確認を行った。配列番号７８の化合物の分子量を、酵素による糖鎖除去を行わない実施例８のＬＣ－ＭＳ法で測定した。配列番号７８のターゲット質量は６５０４６．９Ｄａであり、実測質量は６５０４６．７Ｄａであり、配列番号７８の化合物のアミノ酸組成およびホモ二量体構造が正しいことが確認された。
ホモ二量体率は実施例１０に従って分子ふるいクロマトグラフィーで測定した。ｃＮｇ変異型インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の完全アミノ酸配列を以下に挙げる（ＮＢ１５５位には下線）：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＳＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号７８）。
配列番号７８のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成の総タンパク質収量、ホモ二量体率、およびホモ二量体力価の結果が表２３に示され、配列番号７６および配列番号９１の結果と比較されている。インスリンポリペプチド配列のＢ１６Ａ変異を非グリコシル化ｃＮｇ－Ｓ変異型インスリン－Ｆｃ融合タンパク質に含めたところ、配列番号７６と比較してホモ二量体力価が向上した。配列番号７８のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質のインビトロＩＲ結合を、実施例１２の手順に従って試験した。配列番号１０のインスリンポリペプチドへのＢ１６Ａ変異を配列番号７８のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質に含めたところ、インスリンポリペプチド（配列番号７）がＢ１６Ｅ変異を含む配列番号９１と比較して、ＩＲ親和性が著しく向上した（すなわち、ＩＲ ＩＣ５０測定値が低くなった）。このＢ１６Ａ変異を別のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質で行った際（米国特許第１０，５９７，４３５号の配列番号３）、ＩＲ ＩＣ５０測定値が５０００ｎＭよりも大きくなり、インビボにおいてグルコースを低下させる生物活性を示さなかったことを考えると、これは特に驚くべきことである。アミノ酸配列の相違を強調した、配列番号７６、配列番号７８、および配列番号９１の配列アラインメントを、図２７に示す。「＊」は、所与の配列位置において全ての配列間で完全に相同であることを示しており、一方、「：」、「．」、空白は、それぞれ、所与の配列位置における配列間のアミノ酸変異が保存的であること、中程度であること、または全く異なるものであること、を示している。
Figure 0007405486000025
さらに、配列番号７８のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質のインスリンポリペプチドにＢ１６Ａ変異を含めた（配列番号１０が得られる）ところ、実施例１９の手順で測定される、ＦｃＲｎ結合が許容できるものとなり、このインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の、インビボにおける薬物動態学的半減期が延長され、インビボにおけるグルコース低減生物活性プロファイルが延長される可能性があることが示された。なお、配列番号７８のＦｃＲｎ結合親和性は、Ｂ１６Ａ変異を含まない類似のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質（配列番号９１）のそれよりも大きく（ＦｃＲｎ結合アッセイにおいてＥＣ５０測定値がより小さいことによって示される）、Ｂ１６Ａ変異を含めることが、ＩＲ受容体親和性に加えて、予想外にもＦｃＲｎ受容体親和性に影響を与えることがさらに明らかとなった。ＦｃＲｎ親和性が高くなるほど、それに相関して、治療薬のインビボにおける薬物動態学的半減期が長くなる場合が多いことから、このようにＦｃＲｎ受容体親和性を徐々に増加させることは、望ましいことであろうと考えられる。
配列番号７８のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の、ＦｃγＲＩ結合特性およびＣ１ｑ結合特性を、実施例１４の方法および実施例１６の方法で測定したところ、許容できるものであることが示された。また、配列番号７８のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質のＣ１ｑ結合親和性ははるかに低く、配列番号７６のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質に対して８０％超のＣ１ｑ結合の低減を示した。以上から、配列番号７８のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質は、製造性、インビボ効力、インビボ生物活性の延長、および免疫原性の可能性の低さについての各設計目標（実施例２９）を達成した。
実施例５２：ヒトＩｇＧ１アイソタイプを含むインスリン－Ｆｃ融合タンパク質のＦｃフラグメント領域の他のｃＮｇ変異
インビボ生物活性が延長され、免疫原性を示す可能性が低く、配列番号７６のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質と同様のホモ二量体含有率とＩＲ結合親和性を維持し、ＦｃＲｎ受容体に対する結合親和性が許容できるものである、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成を作製するさらなる試みにおいて、ＦｃγＲＩ結合およびＣ１ｑ結合を低減しようと、他のｃＮｇ変異をＦｃフラグメントのＣＨ３領域に挿入し、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、および配列番号９５を得た。インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の実施形態を、実施例１に従ってＨＥＫ細胞で合成し、実施例４に従って精製し、実施例６、実施例８、実施例１０、実施例１２、実施例１４、および実施例１６に従って試験した。結果は表２４に示す。配列番号７５、配列番号７６、および配列番号９１に対しての、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、および配列番号９５の配列アラインメントを、アミノ酸配列の相違を強調表示して、図２８に示す（クラスタルオメガ）。「＊」は、所与の配列位置において全ての配列間で完全に相同であることを示しており、一方、「：」、「．」、空白は、それぞれ、所与の配列位置における配列間のアミノ酸変異が保存的であること、中程度であること、または全く異なるものであること、を示している。
インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の実施形態の完全アミノ酸配列を以下に示し、ｃＮｇ変異には下線を引く。
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＤＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号９２）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＡＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号９３）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＲＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号９４）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＱＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号９５）。
Ｘ１がＤ、Ａ、Ｒ、Ｑである、配列番号７７のヒトＩｇＧ１ Ｆｃフラグメントを含む、上記のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の実施形態を、配列番号７６と共に、表２４に挙げ、表２４は対応する総タンパク質収量、ホモ二量体率、およびホモ二量体力価を示している。これらの結果は、ｃＮｇ部位への各種変異をヒトＩｇＧ１ Ｆｃフラグメント内に含めて、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、および配列番号９５を得た結果、望ましいＦｃγＲＩ親和性およびＣ１ｑ親和性の低減がもたらされたことを示している。配列番号９２、配列番号９３、および配列番号９４のホモ二量体力価は、配列番号７６に比べて顕著に増加した。配列番号９５のホモ二量体力価が、設計目標（実施例２９）を達成するには低すぎたため、インスリン受容体結合は測定しなかった。ホモ二量体力価は向上したが、配列番号９２、配列番号９３、および配列番号９４は、ＩＲアッセイにおけるＩＣ５０値が、全ての場合で２４００ｎＭよりも大きく、配列番号７６のそれよりもかなり高かった（すなわち、ＩＲ親和性がより低い）。全ての場合で、ＩＲアッセイにおけるＩＣ５０値は設計基準である２４００ｎＭ未満よりも大きく、これらのインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の実施形態が、許容できる効力と商品原価を示しそうにないことが示された。配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、および配列番号９５のいずれも、設計目標（実施例２９）を達成していない。
Figure 0007405486000026
実施例５３：インスリンポリペプチド（配列番号１０）、リンカー（配列番号１３）、および各種ｃＮｇ変異を含むＩｇＧ１アイソタイプＦｃを用いたヒトインスリン－Ｆｃ融合タンパク質
上記のように、ＩｇＧ１アイソタイプＦｃフラグメントのｃＮｇ部位における変異では、ＦｃγＲＩおよびＣ１ｑに対する親和性が顕著に低減した、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質が得られたが、これらの化合物は、許容できないほどに低いＩＲ受容体親和性を有している（すなわち、ＩＣ５０値が２４００ｎＭより大きい）。そこで、配列番号７８中のインスリンポリペプチドに同じ変異をなして（Ｂ鎖のＮ末端から１６番目のアミノ酸をチロシンからアラニンにかえ（すなわち、Ｂ１６Ａ）ところ、配列番号１０のインスリンポリペプチドが得られた）、ＩＲ親和性を向上させた変異型インスリンポリペプチドがあるかどうかを確かめるために、得られたインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成を、ＩＲアッセイにおけるＩＣ５０に対するスクリーニングにかけた。配列番号１０の変異型インスリンポリペプチドおよび配列番号１３のペプチドリンカーを用いて、以下に示すような、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、および配列番号８６のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成を作製した。これらのインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成はそれぞれ、実施例１５に記載のインビトロヒトＦｃγＲＩアッセイにおける結合性によって評価される、インビボにおけるＦｃフラグメントのＦｃγ受容体に対する結合親和性を低減されせるためにＦｃフラグメント領域に対して行われた、ｃＮｇ部位変異を含む。配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、および配列番号８６のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成におけるｃＮｇ部位の位置はｃＮｇ－ＮＢ１５５である。配列番号８０のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質は、ｃＮｇ部位に「Ｎ」から「Ｄ」への変異を含む。配列番号８２のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質は、ｃＮｇ部位に「Ｎ」から「Ａ」への変異を含む。配列番号８４のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質は、ｃＮｇ部位に「Ｎ」から「Ｒ」への変異を含む。配列番号８６のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質は、ｃＮｇ部位に「Ｎ」から「Ｑ」への変異を含む。
タンパク質製造は実施例１に従ってＨＥＫ２９３細胞で行った。驚くべきことに、ｃＮｇ－ＮＢ１５５－Ｑ変異とＢ１６Ａ変異とを一緒に含む配列番号８６のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成のホモ二量体力価は、ホモ二量体力価の設計目標を達成するのに必要なものよりも著しく低かった。次に、配列番号８０、配列番号８２、および配列番号８４のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成を、実施例４に従ってプロテインＡカラムを用いて精製した。インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成の構造は実施例６に従って非還元ＣＥ－ＳＤＳおよび還元ＣＥ－ＳＤＳで確認し、さらに、実施例８に記載のグリカン除去を行わないＬＣ－ＭＳによって配列の確認を行った。配列番号８０のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の化合物分子量を、酵素による糖鎖除去を行わない実施例８のＬＣ－ＭＳ法で測定した。配列番号８０のターゲット質量は６５１０２．９Ｄａであり、実測質量は６５１０２．８Ｄａであり、配列番号８０の化合物のアミノ酸組成およびホモ二量体構造が正しいことが確認された。配列番号８２のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の化合物分子量を、酵素による糖鎖除去を行わない実施例８のＬＣ－ＭＳ法で測定した。配列番号８２のターゲット質量は６５０１４．９Ｄａであり、実測質量は６５０１４．９Ｄａであり、配列番号８２の化合物のアミノ酸組成およびホモ二量体構造が正しいことが確認された。配列番号８４のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の化合物分子量を、酵素による糖鎖除去を行わない実施例８のＬＣ－ＭＳ法で測定した。配列番号８４のターゲット質量は６５１８５．１Ｄａであり、実測質量は６５１８４．８Ｄａであり、配列番号８４の化合物のアミノ酸組成およびホモ二量体構造が正しいことが確認された。
ホモ二量体率は実施例１０に従って分子ふるいクロマトグラフィーで測定した。ｃＮｇ変異型インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成の完全アミノ酸配列を以下に挙げ（配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、および配列番号８６；ＮＢ１５５位には下線）、配列番号７６および配列番号７８に対して得られた配列アラインメントを図２９に示す（クラスタルオメガ）。「＊」は、所与の配列位置において全ての配列間で完全に相同であることを示しており、一方、「：」、「．」、空白は、それぞれ、所与の配列位置における配列間のアミノ酸変異が保存的であること、中程度であること、または全く異なるものであること、を示している。
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＤＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号８０）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＡＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号８２）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＲＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号８４）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＱＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号８６）。
得られた総タンパク質収量、ホモ二量体率、およびホモ二量体力価を表２５に示す。上記のような配列番号８６を除いて、インスリンポリペプチド配列のＢ１６Ａ変異を非グリコシル化ｃＮｇ変異型インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の実施形態に含めたところ、配列番号７６と比較してホモ二量体力価が向上した。ｃＮｇ－ＮＢ１５５－Ｄ組成物は、２２２ｍｇ／Ｌにおいて最も高いホモ二量体力価を示した。インスリン－Ｆｃ融合タンパク質のインビトロＩＲ結合を、実施例１２の手順に従って試験した。配列番号７８の場合のように、配列番号８０、配列番号８２、および配列番号８４のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の実施形態のインスリンポリペプチドにＢ１６Ａ変異を含めたところ、インスリンポリペプチドがＢ１６Ｅ変異を含む配列番号９２、配列番号９３、および配列番号９４のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成と比べて、ＩＲ親和性が著しく向上した（すなわち、ＩＲアッセイにおけるＩＣ５０値が低かった）。
さらに、配列番号８０、配列番号８２、および配列番号８４のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質のインスリンポリペプチドにＢ１６Ａ変異を含めたところ、実施例１９の手順で測定される、これらのインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の実施形態のＦｃＲｎ結合が許容できるものとなり、これらの化合物の、インビボにおける薬物動態学的半減期が延長され、インビボにおけるグルコース低減生物活性プロファイルが延長される可能性があることが示された。なお、Ｂ１６Ａ変異を含むインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成（配列番号８０、配列番号８２、および配列番号８４）のＦｃＲｎ結合親和性は、Ｂ１６Ａ変異を含まない類似のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成（配列番号９２、配列番号９３、および配列番号９４）のそれよりも顕著に大きく、Ｂ１６Ａ変異を含めることが、ＩＲ受容体親和性に加えて、予想外にもＦｃＲｎ受容体親和性に影響を与えることがさらに明らかとなった。ＦｃＲｎ親和性が高くなるほど、それに相関して、治療薬のインビボにおける薬物動態学的半減期が長くなる場合が多いことから、これらのようにＦｃＲｎ受容体親和性を徐々に増加させることは、望ましいことであろうと考えられる。
配列番号８０、配列番号８２、および配列番号８４のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成の、ＦｃγＲＩ結合特性およびＣ１ｑ結合特性を、実施例１４の方法および実施例１６の方法で測定したところ、許容できるものであることが示された。さらに、ｃＮｇ－ＮＢ１５５－Ｒ（配列番号８４）変異に伴ってＦｃγＲＩ結合親和性が非常に顕著に低減し、配列番号７６のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質に対して８０％超のＦｃγＲＩ結合低減を示した。配列番号８０、配列番号８２、および配列番号８４のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質は、Ｃ１ｑ結合親和性についてもかなり低く、これらのインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の実施形態はいずれも、配列番号７６のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質に対して８０％超のＣ１ｑ結合低減を示した。以上から、配列番号８０、配列番号８２、および配列番号８４のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質は、製造性、インビボ効力、インビボ生物活性の延長、および免疫原性の可能性の低さについての各設計目標（実施例２９）を達成した。
Figure 0007405486000027
実施例５４：配列番号１０のインスリンポリペプチドと、ｃＮｇ－Ｓ変異を含むＩｇＧ１アイソタイプＦｃと、各種リンカーと、を含むヒトインスリン－Ｆｃ融合タンパク質
上記のように、ＩｇＧ１アイソタイプＦｃフラグメントのｃＮｇ部位における変異と、インスリンポリペプチド上の変異は、ＩＲ、ＦｃＲｎ、ＦｃγＲＩ（受容体）結合、およびＣ１ｑ結合といった物性に予想外の変化をもたらした。リンカー組成物がこれらの特性にどのような影響を与えたかをさらに深く理解するため、配列番号１０のＢ１６Ａ変異型インスリンポリペプチドと、ｃＮｇ－Ｓ変異を有する非グリコシル化ｈＩｇＧ１ Ｆｃフラグメント（配列番号７７；Ｘ１はＳ）と、配列番号１３のリンカー配列と、を含む特定のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成（配列番号７８）を出発点として選び、そこから、リンカーの長さと組成を以下の表２６に示すように変更した。
Figure 0007405486000028
配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号８７、および配列番号８９のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の実施形態を、実施例１に従ってＨＥＫ２９３細胞で製造した。次いで、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成を、実施例４に従ってプロテインＡカラムを用いて精製した。インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成の構造は実施例６に従って非還元ＣＥ－ＳＤＳおよび還元ＣＥ－ＳＤＳで確認し、さらに、実施例８に記載のグリカン除去を行わないＬＣ－ＭＳによって配列の確認を行った。グリカンを持たないことの確認は、実施例８のＬＣ－ＭＳ法を用いて行い、ただし、ＰＮＧアーゼＦ処理工程は省略した。配列番号８７のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成の化合物分子量を、酵素による糖鎖除去を行わない実施例８のＬＣ－ＭＳ法で測定した。ターゲット質量は６４７０４．６Ｄａであり、実測質量は６４７０４．４Ｄａであり、配列番号８７の化合物のアミノ酸組成およびホモ二量体構造が正しいことが確認された。配列番号８９のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成の化合物分子量を、酵素による糖鎖除去を行わない実施例８のＬＣ－ＭＳ法で測定した。ターゲット質量は６３２７９．２Ｄａであり、実測質量は６３２７８．８Ｄａであり、配列番号８９の化合物のアミノ酸組成およびホモ二量体構造が正しいことが確認された。
ホモ二量体率は実施例１０に従って分子ふるいクロマトグラフィーで測定した。インビトロにおけるＩＭ－９ ＩＲ結合のＩＣ５０は実施例１２に記載されように測定し、Ｆｃγ受容体結合親和性は実施例１５に記載されたようなインビトロヒトＦｃγＲＩアッセイを用いて測定し、Ｃ１ｑ結合親和性は実施例１６に記載されたように測定し、ヒトＦｃＲｎ受容体に対する親和性は実施例１９に記載されたように測定した。結果を表２７に示す。
Figure 0007405486000029
 得られたインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の完全アミノ酸配列を以下に挙げる（ｃＮｇ－Ｓ位には下線）（クラスタルオメガ）。図３０（クラスタルオメガ）は、配列番号８７、配列番号９６、配列番号７８、配列番号９７、配列番号８９、および配列番号９８の並列配列比較を示している。「＊」は、所与の配列位置において全ての配列間で完全に相同であることを示しており、一方、「：」、「．」、空白は、それぞれ、所与の配列位置における配列間のアミノ酸変異が保存的であること、中程度であること、または全く異なるものであること、を示している。
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＧＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＳＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号８７）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＳＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号９６）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＱＧＧＧＧＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＳＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号９７）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＡＧＧＧＧＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＳＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号８９）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＳＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号９８）。
これらの結果は、インスリンポリペプチドのＣ末端がＦｃフラグメントのＮ末端に直接連結している、リンカーを含まないインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成（配列番号９８）において、ホモ二量体力価が許容できないほどに低い（すなわち、３８ｍｇ／Ｌ）ことを示している。少なくとも９アミノ酸長のグリシン－グルタミンリンカー組成物を有するインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成（配列番号９７、配列番号７８、および配列番号９６）では、生理化学的性質に、リンカー長によって変化する重要な傾向はないように思われた。グリシン－アラニン組成物リンカーを含む配列番号８７のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成を、グリシン－グルタミン組成物リンカーを含む配列番号７８のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成と比較したところ、リンカー長が同じく２１アミノ酸である場合、配列番号８７のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成が、ホモ二量体力価の向上、ＩＲ結合の増強、およびＦｃＲｎ結合の増強を示すが、ＦｃγＲＩ結合特性とＣ１ｑ結合特性はほぼ同じであることが示された。よって、配列番号９６、配列番号９７、配列番号８７、および配列番号８９のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成の全てが設計目標（実施例２９）を達成したが、配列番号８７のホモ二量体が好ましい実施形態である。
実施例５５：Ｂ１６Ａ変異型インスリンポリペプチドと、ｃＮｇ－ＮＢ１５５－Ｘ部位変異を有するヒトＩｇＧ１アイソタイプＦｃフラグメントと、リンカー（配列番号１３）とを含むインスリン－Ｆｃ融合タンパク質のインビボ効力
実施例５３の有望なホモ二量体力価、ＩＲ活性、およびＦｃＲｎ活性の結果を考慮して、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、および配列番号８４のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質を、およそ１０ｋｇの重さのＮ＝３の健常な抗体未処置ビーグル犬のそれぞれに皮下注射後、実施例２２に従ってインビボ生物活性について試験する。配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、および配列番号８４の各インスリン－Ｆｃ融合タンパク質を単回皮下投与した場合の、時間に対する％ＦＢＧＬのプロットを作成する。この時間に対する％ＦＢＧＬのデータは、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、および配列番号８４のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質が、イヌにおいて顕著な生物活性を有することを示すと期待される。
実施例５６：Ｂ１６Ａ変異型インスリンポリペプチドと、ｃＮｇ－ＮＢ１５５－Ｓ変異を有するヒトＩｇＧ１アイソタイプＦｃフラグメントと、リンカー（配列番号１１）とを含むインスリン－Ｆｃ融合タンパク質のインビボ効力
実施例５４の有望なホモ二量体力価、ＩＲ活性、およびＦｃＲｎ活性の結果を考慮して、配列番号８９のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質を、およそ１０ｋｇの重さのＮ＝３の健常な抗体未処置ビーグル犬のそれぞれに皮下注射後、実施例２２に従ってインビボ生物活性について試験する。配列番号８９のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質を単回皮下投与した場合の、時間に対する％ＦＢＧＬのプロットを作成する。この時間に対する％ＦＢＧＬのデータは、配列番号８９のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質が、イヌにおいて顕著な生物活性を有することを示すと期待される。
実施例５７：Ｂ１６Ａ変異型インスリンポリペプチドと、ｃＮｇ－ＮＢ１５５－Ｓ変異を有するヒトＩｇＧ１アイソタイプＦｃフラグメントと、リンカー（配列番号６７）とを含むインスリン－Ｆｃ融合タンパク質のインビボ効力
実施例５４の有望なホモ二量体力価、ＩＲ活性、およびＦｃＲｎ活性の結果を考慮して、配列番号８７のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質を、およそ１０ｋｇの重さのＮ＝３の健常な抗体未処置ビーグル犬のそれぞれに皮下注射後、実施例２２に従ってインビボ生物活性について試験する。配列番号８７のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質を単回皮下投与した場合の、時間に対する％ＦＢＧＬのプロットを作成する。この時間に対する％ＦＢＧＬのデータは、配列番号８７のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質が、イヌにおいて顕著な生物活性を有することを示すと期待される。
実施例５８：安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞株を介して作製されたヒトＩｇＧ１由来のＦｃフラグメントを含む好ましいインスリン－Ｆｃ融合タンパク質を用いた、例示的なＣＨＯベースのプロダクションラン
配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８７、および配列番号８９のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成をコードするベクターで安定にトランスフェクトされた別々のＣＨＯ細胞株を、実施例２に記載されたように作製する。フェッドバッチ式振盪フラスコ１４日間プロダクションラン（０．５～２．０Ｌの培地規模）の播種を、３７℃、５％二酸化炭素に設定された振盪恒温器内で、０．５×１０６細胞／ｍＬとなるように行う。増殖培地としてＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯをＤｙｎａｍｉｓ（サーモフィッシャー社）に置き換え、フィードとしてＥｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｆｅｅｄ Ｃ（サーモフィッシャー社）を用いる以外は、実施例２に記載したように、ランを実行する。３％ｖ／ｖのフィードの添加をプロダクションラン３日目から開始して、さらに４日目にも添加を行い、振盪フラスコ温度を３２℃に調整し、振盪恒温器内の二酸化炭素濃度を５％から２％に下げる。このランの間に、細胞密度は８～１４×１０６細胞／ｍＬまで増加し、１４日目に、プロダクションランを回収して細胞を取り除き、実施例４、実施例６、実施例８、および実施例１０に記載されたように培養上清の精製と試験を行って、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質を得る。安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞株を用いた配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８７、および配列番号８９のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成の別々のプロダクションランからの、製造およびインビトロ試験データは、ホモ二量体力価が一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞で得られたものよりも大きく、ＩＲ、ＦｃＲｎ受容体、ＦｃγＲＩ受容体結合特性、およびＣ１ｑ結合特性が設計目標（実施例２９）を達成することを示すと期待される。
実施例５９：マウスにヒトインスリンＦｃ融合タンパク質を単回投与した後のインビボ薬物動態（ＰＤ）
空腹時血糖値に対する作用について、以下のように、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質を評価した。１群当たりＮ＝３のｂａｌｂ／ｃマウスまたは糖尿病のｗｔ ＮＯＤマウス（ジャクソン・ラボラトリーズ社）からデータを収集した。実験の１時間前に動物を絶食させ、その後、０時間の時点で、マウスに、インスリンＦｃ融合タンパク質ホモ二量体を含有する医薬組成物の単回皮下投与を、１０～５０ｍＭのリン酸水素ナトリウム、５０～１５０ｍＭの塩化ナトリウム、０．００５～０．０５％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ－８０、および所望により濃度０．０２～１．００ｍｇ／ｍＬの静菌剤（例えばフェノール、ｍ‐クレゾール、またはメチルパラベン）の溶液中、３００μｇ／ｋｇのインスリン－Ｆｃ融合タンパク質濃度で、最終的な溶液ｐＨは水酸化ナトリウムおよび／または塩酸を用いて７．０～８．０に調整して、実施した。
各時点において、血液試料を採取し、グルコース計（ＡｌｐｈａＴＲＡＫ（登録商標）２ペット用グルコース計）を用いて直ちにグルコースレベルの読み取りを行い、これにはおよそ１滴の血液が必要であった。０時間から９時間までの平均空腹時血糖値％（％ＦＢＧＬ）をプロットし、所与のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成の生物活性を評価した。配列番号８７および配列番号８９を単回皮下投与した場合の、図３８に示される結果は、両方の化合物がマウスにおいて顕著な生物活性を示したことを示している。
実施例６０：マウスにヒトインスリンＦｃ融合タンパク質を単回投与した後のインビボ薬物動態（ＰＤ）
空腹時血糖値に対する作用について、以下のように、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質を評価する。１群当たりＮ＝３のｂａｌｂ／ｃマウスまたは糖尿病ｗｔ ＮＯＤマウス（ジャクソン・ラボラトリーズ社）からデータを収集する。実験の１時間前に動物を絶食させ、その後、０時間の時点で、マウスに、インスリンＦｃ融合タンパク質ホモ二量体を含有する医薬組成物の単回皮下投与を、１０～５０ｍＭのリン酸水素ナトリウム、５０～１５０ｍＭの塩化ナトリウム、０．００５～０．０５％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ－８０、および所望により濃度０．０２～１．００ｍｇ／ｍＬの静菌剤（例えばフェノール、ｍ‐クレゾール、またはメチルパラベン）の溶液中、３００μｇ／ｋｇのインスリン－Ｆｃ融合タンパク質濃度で、最終的な溶液ｐＨは水酸化ナトリウムおよび／または塩酸を用いて７．０～８．０に調整して、実施する。
各時点において、血液試料を採取し、グルコース計（ＡｌｐｈａＴＲＡＫ（登録商標）２ペット用グルコース計）を用いて直ちにグルコースレベルの読み取りを行い、これにはおよそ１滴の血液が必要である。０時間から９時間までの平均空腹時血糖値％（％ＦＢＧＬ）をプロットし、所与のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構成の生物活性を評価する。配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、または配列番号８４の単回皮下投与によって、これらのインスリン－Ｆｃ融合タンパク質がマウスにおいて顕著な生物活性を示すことが明らかになると期待される。
実施例６１：例示的なインスリン－Ｆｃ融合タンパク質のドメインおよび配列
上記の実施例で使用された例示的なインスリン－Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸配列および対応するＤＮＡ配列を、図３１、図３２、図３３、図３４、図３５、図３６、および図３７に示す。
均等論
クレームにおいて、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」などの冠詞は、反対の趣旨が示されていない限り、または文脈から明らかでない限り、１つを意味する場合も２つ以上を意味する場合もある。ある群の１または複数の要素の間に「または」を含むクレームまたは記述は、反対の趣旨が示されていない限り、または文脈から明らかでない限り、前記群の要素の１、２以上、または全てが、所与の製品または工程に存在していれば、それに使用されていれば、またはそれに関連していれば、満たされているものとする。本開示は、前記群の厳密に１つの要素が所与の製品または工程に存在している、それに使用されている、またはそれに関連している、実施形態を包含する。本開示は、前記群の要素のうちの２以上または全てが所与の製品または工程に存在している、それに使用されている、またはそれに関連している、実施形態を包含する。
さらに、本開示は、列挙されたクレームのうちの１または複数からの１または複数の制限、要素、節、および記述用語が別のクレームに導入された、全ての変形、組み合わせ、および入れ替えを包含する。例えば、別のクレームに従属する任意のクレームを、同じ基本クレームに従属する任意の他のクレームに存在する１または複数の制限を含むように修正することができる。要素がリストとして、例えばマーカッシュ群形式で提示されている場合、要素の各部分群を開示し、任意の要素を当該群から除外することもできる。一般的に、本開示または本開示の側面が、特定の要素および／または特徴を含むものとして言及される場合、本開示または本開示の側面のある実施形態は、かかる要素および／または特徴からなるか、またはこれらから本質的になることが、理解されるべきである。簡潔さのために、これらの実施形態は、本明細書において、特にこの通りの言葉では記載されていない。また、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、および「含有すること（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、オープンであることを意図され、その使用は、さらなる要素または工程の包含を許容することに留意する。範囲が示される場合、端点が含まれる。さらに、別段に示されるかまたは別段に文脈および当業者の理解から明らかでない限り、範囲として表される値は、本開示の異なる実施形態において記述される範囲内の任意の特定の値または部分範囲を、文脈によって特に明示されない限り、当該範囲の下限の単位の１０分の１まで想定し得る。

Claims (29)

  1. インスリンポリペプチドと、Ｆｃフラグメントと、を含む融合タンパク質であって、
    前記インスリンポリペプチドおよび前記Ｆｃフラグメントはリンカーによって接続されており、Ｎ末端からＣ末端へ以下の配向：
    （Ｎ末端）－インスリンポリペプチド－リンカー－Ｆｃフラグメント－（Ｃ末端）
    で各ドメインを含み、
    前記Ｆｃフラグメントはヒト由来であり、且つ以下の配列（配列番号７７）：
    Figure 0007405486000030
     を含み、Ｘ１はＳまたはＲであり、
    前記インスリンポリペプチドは
    以下の配列：
    ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣ（配列番号１０）、
    を含み、かつ
    前記リンカーが以下の配列：
    ＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＧ（配列番号６７）；
    ＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧ（配列番号９９）；または
    ＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧ（配列番号１３）
    を含む、
    融合タンパク質。
  2. インスリンポリペプチドと、Ｆｃフラグメントと、を含む融合タンパク質であって、
    前記インスリンポリペプチドおよび前記Ｆｃフラグメントはリンカーによって接続されており、
    前記融合タンパク質は以下の配列（配列番号８７）：
    Figure 0007405486000031
     を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
  3. 以下の配列（配列番号７８）：
    Figure 0007405486000032
     を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
  4. 以下の配列（配列番号８４）：
    Figure 0007405486000033
     を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
  5. 以下の配列（配列番号９６）：
    Figure 0007405486000034
     を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
  6. ホモ二量体である、請求項１に記載の融合タンパク質。
  7. ホモ二量体である、請求項２～５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  8. 融合タンパク質のホモ二量体率が９０％超である、請求項６または請求項７に記載の融合タンパク質。
  9. ホモ二量体の力価が１５０ｍｇ／Ｌを超える、請求項６または請求項７に記載の融合タンパク質。
  10. 融合タンパク質のインスリン受容体ＩＣ５０が５０００ｎＭ以下である、請求項６または請求項７に記載の融合タンパク質。
  11. 融合タンパク質のインスリン受容体ＩＣ５０が２４００ｎＭ以下である、請求項６または請求項７に記載の融合タンパク質。
  12. 融合タンパク質のヒトＦｃＲｎ受容体ＥＣ５０が１０００ｎｇ／ｍＬ以下である、請求項６または請求項７に記載の融合タンパク質。
  13. 融合タンパク質の、ビオチン化ＦｃγＲＩ濃度が３０００ｎｇ／ｍＬである場合のヒトＦｃγＲＩ受容体アッセイにおけるＯＤ４５０比が０．５０以下である、請求項６または請求項７に記載の融合タンパク質。
  14. ビオチン化Ｃ１ｑ濃度が１０００ｎｇ／ｍＬである場合のヒトＣ１ｑアッセイにおけるＯＤ４５０比が０．３５以下である、請求項６または請求項７に記載の融合タンパク質。
  15. 請求項６または請求項７に記載の融合タンパク質を含む、医薬組成物。
  16. 前記融合タンパク質が約３ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で医薬組成物中に存在する、請求項１５に記載の医薬組成物。
  17. 皮下投与に好適である、請求項１５に記載の医薬組成物。
  18. 患者の血糖値を低下させるために用いられる、請求項１５～１７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  19. 前記患者が糖尿病と診断された患者である、請求項１８に記載の医薬組成物。
  20. 前記融合タンパク質が皮下投与される、請求項１８に記載の医薬組成物。
  21. 前記融合タンパク質が毎日、週２回、または週１回患者に投与される、請求項１８に記載の医薬組成物。
  22. 前記融合タンパク質が０．０２５～０．５ｍｇ／ｋｇ／週の投与量で患者に週１回投与される、請求項１８に記載の医薬組成物。
  23. 請求項２～５のいずれか一項に記載の融合タンパク質を発現するように改変された細胞。
  24. 前記融合タンパク質をコードする核酸でトランスフェクトされた、請求項２３に記載の細胞。
  25. ＨＥＫ２９３細胞またはＣＨＯ細胞である、請求項２３に記載の細胞。
  26. 請求項１に記載の融合タンパク質をコードするｃＤＮＡ。
  27. 以下の核酸配列（配列番号８８）：
    Figure 0007405486000035
     を含む、配列番号８７の融合タンパク質をコードするｃＤＮＡ。
  28. 以下の核酸配列（配列番号７９）：
    Figure 0007405486000036
     を含む、配列番号７８の融合タンパク質をコードするｃＤＮＡ。
  29. 以下の核酸配列（配列番号８５）：
    Figure 0007405486000037
     を含む配列番号８４の融合タンパク質をコードするｃＤＮＡ。
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