JP2018515088A - 融合タンパク質 - Google Patents
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Abstract
Description
a)一般式Z1−Z2−Z3を有するインスリン受容体アゴニストと
[式中、
i)Z1が、以下のアミノ酸配列を含むインスリンB鎖類似体であり、
X1X2X3QHLCGSHLVEALX4LVCGERGFX5YX6X7X8X9
(式中、X1が、F、Q、またはAであり;X2が、VまたはGであり;X3が、N、K、D、G、Q、A、またはEであり;X4が、E、Y、Q、またはHであり;X5が、HまたはFであり;X6が、G、T、S、H、Vであるか、または存在せず;X7が、G、E、P、K、D、S、Hであるか、または存在せず;X8が、G、E、K、P、Q、D、Hであるか、または存在せず;X9が、G、T、S、E、K、Aであるか、または存在せず;但し、インスリンB鎖類似体が、X4、X5、X6、X7、X8、またはX9に、ヒトインスリン分子のB鎖のアミノ酸配列からの少なくとも1つの修飾を含む)(配列番号1)、
ii)Z2が、5〜10個のアミノ酸を含む第1のペプチドリンカーであり(ここで、アミノ酸のうちの少なくとも5個が、G残基である)、
iii)Z3が、以下のアミノ酸配列を含むインスリンA鎖類似体である
GIVEQCCTSX1CSLX2QLENYCX3X4
(式中、X1が、TまたはIであり;X2が、D、Y、Q、またはEであり;X3が、G、N、S、またはAであり;X4が、任意の天然に存在するアミノ酸であるか、または存在せず;但し、X3がNである場合には、X4はGまたはN以外のアミノ酸でなければならない)(配列番号2)]、
b)第2のペプチドリンカーと、
c)ヒトIgGのFc領域と、を含み、
インスリン受容体アゴニストのC末端残基が、第2のペプチドリンカーのN末端残基に直接融合し、第2のペプチドリンカーのC末端残基が、IgGのFc領域のN末端残基に直接融合している、融合タンパク質を提供する。
a)一般式Z1−Z2−Z3を有するインスリン受容体アゴニストと、
[式中、
i)Z1が、以下のアミノ酸配列を有するインスリンB鎖類似体であり、
X1X2X3QHLCGSHLVEALX4LVCGERGFX5YX6X7X8X9
(式中、X1が、F、Q、またはAであり;X2が、VまたはGであり;X3が、N、K、D、G、Q、A、またはEであり;X4が、E、Y、Q、またはHであり;X5が、HまたはFであり;X6が、G、T、S、H、Vであるか、または存在せず;X7が、G、E、P、K、D、S、Hであるか、または存在せず;X8が、G、E、K、P、Q、D、Hであるか、または存在せず;X9が、G、T、S、E、K、Aであるか、または存在せず;但し、インスリンB鎖類似体が、X4、X5、X6、X7、X8、またはX9に、ヒトインスリン分子のB鎖のアミノ酸配列からの少なくとも1つの修飾を含む)(配列番号1)、
ii)Z2が、5〜10個のアミノ酸を含む第1のペプチドリンカーであり(ここで、アミノ酸のうちの少なくとも5個が、G残基である)、
iii)Z3が、以下のアミノ酸配列を有するインスリンA鎖類似体である
GIVEQCCTSX1CSLX2QLENYCX3X4
(式中、X1が、TまたはIであり;X2が、D、Y、Q、またはEであり;X3が、G、N、S、またはAであり;X4が、任意の天然に存在するアミノ酸であるか、または存在せず;但し、X3がNである場合には、X4はGまたはN以外のアミノ酸でなければならない)(配列番号2)]、
b)第2のペプチドリンカーと、
c)ヒトIgGのFc領域と、からなり、
インスリン受容体アゴニストのC末端残基が、第2のペプチドリンカーのN末端残基に直接融合し、第2のペプチドリンカーのC末端残基が、IgGのFc領域のN末端残基に直接融合している、融合タンパク質を提供する。
1.本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む哺乳動物宿主細胞を、該融合タンパク質が発現されるような条件下で培養するステップと、
2.融合タンパク質を該宿主細胞から回収するステップと、を含む。
X1X2X3QHLCGSHLVEALX4LVCGERGFX5YX6X7X8X9X10GX11GGGGGIVEQCCTSX12CSLX13QLENYCX14X15
式中、X1が、F、Q、またはAであり、X2が、VまたはGであり、X3が、N、K、D、G、Q、A、またはEであり、X4が、E、Y、Q、またはHであり、X5が、HまたはFであり、X6が、G、T、S、H、Vであるか、または存在せず、X7が、G、E、P、K、D、S、Hであるか、または存在せず、X8が、G、E、K、P、Q、D、Hであるか、または存在せず、X9が、G、T、S、E、K、Aであるか、または存在せず、X10が、Gであるか、または存在せず、X11が、G、Sであるか、または存在せず、X12が、TまたはIであり、X13が、D、Y、Q、またはEであり、X14が、G、N、S、またはAであり、X15が、任意の天然に存在するアミノ酸であるか、または存在せず、但し、X4、X5、X6、X7、X8、またはX9のうちの少なくとも1つが、それぞれ、ヒトインスリン分子のB鎖の位置B16、B25、B27、B28、B29、またはB30に見出されるものとは異なるアミノ酸でなければならず、更に、X14がNである場合には、X15が、GまたはN以外のアミノ酸でなければならない(配列番号4)。
FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLDQLENYCG(配列番号5)
GGGGX1GGGGX2GGGGX3GGGGX4X5X6
式中、X1が、QまたはEであり、X2が、QまたはEであり、X3が、QまたはEであり、X4が、G、E、Qであるか、または存在せず、X5が、Gであるか、または存在せず、X6が、Gであるか、または存在しない(配列番号6)。
GGGGQGGGGQGGGGQGGGGG(配列番号7)
CPPCPAPELLGGPSVX1LX2PPKPKDTLMISRTPEVTCX3VX4DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYX5STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGX6
式中、X1が、F、Q、またはEであり、X2が、F、Q、またはEであり、X3が、VまたはTであり、X4が、VまたはTであり、X5が、N、D、またはQであり、
X6が、Kであるか、または存在しない。(配列番号8)
PCPPCPAPEAAGGPSVX1LX2PPKPKDTLMISRTPEVTCX3VX4DVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFX5STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSX6LTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGX7
式中、X1が、F、Q、またはEであり、X2が、F、Q、またはEであり、X3が、VまたはTであり、X4が、VまたはTであり、X5が、N、D、またはQであり、X6が、RまたはKであり、X7が、Kであるか、または存在しない。(配列番号9)
ECPPCPAPPVAGPSVX1LX2PPKPKDTLMISRTPEVTCX3VX4DVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFX5STFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGX6
式中、X1が、F、Q、またはEであり、X2が、F、Q、またはEであり、X3が、VまたはTであり、X4が、VまたはTであり、X5が、N、D、またはQであり、X6が、Kであるか、または存在しない。(配列番号10)
X1X2X3QHLCGSHLVEALX4LVCGERGFX5YX6X7X8X9X10GX11GGGGGIVEQCCTSX12CSLX13QLENYCX14X15GGGGX16GGGGX17GGGGX18GGGGX19X20X21X22CPPCPAPX23X24AGX25PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSX26EDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTX27RVVSVLTVX28HQDWLNGKEYKCKVSNKGLPX29X30IEKTISKX31KGQPREPQVYTLPPSX32EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPX33LDSDGSFFLYSX34LTVDKSRWQX35GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSX36G
式中、X1が、F、Q、またはAであり、X2が、VまたはGであり、X3が、N、K、D、G、Q、A、またはEであり、X4が、E、Y、Q、またはHであり、X5が、HまたはFであり、X6が、G、T、S、H、Vであるか、または存在せず、X7が、G、E、P、K、D、S、Hであるか、または存在せず、X8が、G、E、K、P、Q、D、Hであるか、または存在せず、X9が、G、T、S、E、K、Aであるか、または存在せず、但し、X4、X5、X6、X7、X8、またはX9のうちの少なくとも1つが、それぞれ、ヒトインスリンB鎖の位置B16、B25、B27、B28、B29、またはB30に存在するもの以外のアミノ酸であり、X10が、Gであるか、または存在せず、X11が、G、Sであるか、または存在せず、X12が、TまたはIであり、X13が、D、Y、Q、またはEであり、X14が、G、N、S、またはAであり、X15が、任意の天然に存在するアミノ酸であるか、または存在せず、但し、X14がNである場合には、X15がGまたはN以外のアミノ酸でなければならず、X16が、QまたはEであり、X17が、QまたはEであり、X18が、QまたはEであり、X19が、G、E、Qであるか、または存在せず、X20が、Gであるか、または存在せず、X21が、Gであるか、または存在せず、X22が、EまたはPであり、X23が、EまたはPであり、X24が、AまたはVであり、X25が、Gであるか、または存在せず、X26が、QまたはHであり、X27が、YまたはF、X28が、LまたはVであり、X29が、SまたはAであり、X30が、SまたはPであり、X31が、AまたはTであり、X32が、QまたはRであり、X33が、VまたはMであり、X34が、RまたはKであり、X35が、EまたはQであり、X36が、LまたはPである(配列番号11)。
(配列番号12)。
GIVEQCCTSICSLYQLENYCN(配列番号13)
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT(配列番号14)
本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、以下を含み得る:タンパク質に対するコード配列のみ、タンパク質に対するコード配列及び更なるコード配列、例えば、リーダーもしくは分泌配列または前駆タンパク質配列、タンパク質に対するコード配列及び非コード配列、例えば、タンパク質に対するコード配列のイントロンまたは非コード配列5’及び/もしくは3’。このため、「タンパク質をコードするポリヌクレオチド」という用語は、タンパク質に対するコード配列だけでなく、更なるコード及び/または非コード配列を含むポリヌクレオチドを含み得るポリヌクレオチドを包含する。
「DPP−4阻害剤」は、インクレチン分解に関与するDPP−4酵素を妨害する化合物である。現在利用可能なDPP−4阻害剤としては、シタグリプチン(Januvia(登録商標))及びリナグリプチン(Tradjenta(登録商標))が挙げられる。
本発明の融合タンパク質は、CHOグルタミン合成酵素(GS)ノックアウト(GSKO)細胞株を使用して、哺乳動物細胞発現系において産生させる。GS遺伝子ノックアウトは、分泌条件下で低生産性または非生産性の細胞の生存を許容し得る内因性GS背景活性を排除することによって、厳しい選択厳密性を可能にする。融合タンパク質をコードする遺伝子を、発現プラスミドを含有するグルタミン合成酵素(GS)にサブクローニングする。融合タンパク質をコードするcDNA配列を、細胞培地への融合タンパク質の分泌を強化するシグナルペプチドのコード配列とインフレームで融合させる。発現はサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターによって駆動される。CHO GSKO細胞を、エレクトロポレーション及び適量の組み換え発現プラスミドを使用して安定してトランスフェクトする。
(配列番号12)
(配列番号16)
(配列番号17)
(配列番号18)
(配列番号19)
(配列番号20)
(配列番号21)
(配列番号22)
(配列番号23)
(配列番号24)
実施例1〜3、5、及び9の試験ロットをリン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH7.4)または10mMのクエン酸塩緩衝液(pH6.5)中で調製し、4℃で貯蔵する。生合成ヒトインスリン(Eli Lilly and Company)を0.01NのHCl中で調製し、凍結したアリコートとして貯蔵するか、または100単位/mLでm−クレゾール、亜鉛、塩化ナトリウム、及びTRIS緩衝液(pH7.3)を含有する配合混合物中で調製し、4℃で貯蔵する。
ストレプトゾトシン(STZ)処理したラット糖尿病モデルにおける研究
融合タンパク質の効果をSTZ処理したラット糖尿病モデルにおいて調査する。体重400〜425グラムの雄のSprague−Dawley系ラットをイソフルランで麻酔し、Zanosar(登録商標)(STZ品番89256、Teva Parenteral Medicines、40mg/kg IV)の単回注射を与える。ラットをZanosar(登録商標)の注射から3日後に研究に使用する。非空腹時の血糖が400〜550mg/dLである動物のみをこれらの研究に使用する。
実施例1のグルコース利用に対する全体的なインビボ活性を理解するため、及び肝臓対周辺組織における実施例1の活性を決定するために、雄のSprague−Dawley系ラットにおける正常血糖クランプ研究を行った。3−3H−グルコースのボーラス/持続注入を、慢性的にカテーテル処置した一晩絶食させたラットにおいて開始して、基礎条件下での内因性グルコース産生(EGP)を決定した。次に、試験物品のボーラス/持続静脈内注入(7nmol/kg[ボーラス]及び1nmol/kg/時間[持続速度])またはインスリンリスプロコンパレーター([ボーラスなし]及び0.75mU/kg/分[持続速度])を投与し、20%のグルコースの変動する静脈内注入を開始し、血糖濃度を100〜110mg/dLに維持するように定期的に調整する。ボーラス/注入速度は、各群において正常血糖クランプ条件下で同等のグルコース注入速度(GIR)及びEGPの同等の抑制を達成するように選択する。ソマトスタチンを投与して、内因性インスリン分泌を阻害する。実験中に動脈血試料を得て、ヘマトクリット、血漿インスリン、及び遊離脂肪酸、C−ペプチド、ならびに基礎及びクランプEGPを監視する。実験終了時、2−[1−14C]−デオキシグルコースを投与して、定常状態グルコース濃度下の組織グルコース取り込みを測定する。これらの一致条件下で、試験物品及びコンパレーターの周辺活性を、ヒラメ筋におけるグルコース取り込み及び血漿遊離脂肪酸(FFA)の抑制として分析する。全てのデータを、インスリンリスプロ群を対照コンパレーターとして使用するダネットのポストホック検定による一方向性の分散分析を使用して分析する。
実施例1の薬物動態(PK)パラメータを、カニクイザルにおいて1.5nmol/kgの単回静脈内投薬及び3nmol/kgの単回皮下投薬後に評価する。PK分析のための血漿試料を、3週かけて群/経路当たり3匹の動物から収集する。インスリン受容体ELISA及び総IgG Fc ELISAという2つのアッセイをPK分析に利用する。インスリン受容体ELISAは、ヒトインスリン受容体(R&D Systems1544−IR/CF)を捕捉として利用する。ヒトインスリン受容体をマウス抗HisTag抗体(Novagen 70796)によってImmunlon 4 HBXプレートに結合させる。実施例1の標準曲線及び試料を100%のカニクイザル血漿中で希釈し(抗凝血剤はK3 EDTAであった)、マウス抗ヒトIgGのFc西洋ワサビペルオキシダーゼ(SouthernBiotech 9040−05)によって検出する。総IgG ELISAは、抗ヒトIgG2(Abcam ab1933)を捕捉試薬として利用する。実施例1を100%のカニクイザル血漿中で希釈し、検出抗体はインスリン受容体ELISAのものと同じである。両アッセイからの結果を表6に示し、関連するPKパラメータを表7に示す。実施例1はサルにおいて完全なバイオアベイラビリティを示し、活性インスリンアッセイ及び総Fcアッセイは同様の結果を出す。
実施例1の非保存65mg/mL製剤化
実施例1は、pH6.5の10mMのクエン酸塩、46.4mg/mLのマンニトール、0.02%のポリソルベート80中で65mg/mLで製剤化し、30℃で貯蔵する。試料を、1μLの65mg/mL試料を注射することによって、0、2、及び4週目に、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によって高分子量パーセントについて分析する。TSKgel SuperSW3000(Tosoh Bioscience)カラムを装備し、50mMのリン酸ナトリウム、300mMのNaCl、pH7.0の移動相を15分間0.4mL/分で流すAgilent 1100システム上で分析SECを行う。ピークを280nmの吸光度で検出し、ChemStationソフトウェアを使用して分析する。ゼロ時点での高分子量パーセントは1.13%であり、2週時点では1.68%であり、4週時点では1.74%である。これらの結果は、30℃での4週後の可溶性集合体の成長が最小限で、65mg/mLの濃度での実施例1の安定性を支持する。
実施例1及び3を、30mMのm−クレゾールの存在下または非存在下で、pH6.5の10mMのクエン酸塩中1mg/mLで製剤化し、30℃で貯蔵する。試料を、10μLの1mg/mL試料を注射することによって、ゼロ時点及び2週目に、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によって高分子量パーセントについて分析する。TSKgel G3000SWxl(Tosoh Bioscience)カラムを装備し、PBS+350mMのNaCl、pH7.4の移動相を、それぞれm−クレゾールの存在下または非存在下の試料について35分間または45分間0.5mL/分で流すAgilent 1100システム上で分析SECを行う。ピークを214nmの吸光度で検出し、ChemStationソフトウェアを使用して分析する。実施例3については、m−クレゾールなし及びありで、ゼロ時点の高分子量パーセントは、それぞれ、0.2%及び3.06%である。m−クレゾールなし及びありでの2週目の高分子量パーセントは、それぞれ、0.2%及び1.73%であった。これらの結果は、ゼロ時点での実施例3へのm−クレゾール添加後の可溶性集合体の即時の増加を示す。実施例1については、m−クレゾールの非存在下及び存在下で、ゼロ時点での高分子量パーセントは、それぞれ、0.16%及び0.15%であった。m−クレゾールの非存在下及び存在下での2週目の高分子量パーセントは、それぞれ、0.18%及び0.31%であった。これらの結果は、防腐剤の存在下での実施例1の安定性を示し、この実施例1は、インスリンA鎖の類似体における位置10でのアミノ酸(配列番号2中の変数X1、上記の最初の融合タンパク質中のZ3)のT残基への修飾を、その位置に天然のI残基を含むがそれ以外は実施例1と同じインスリン受容体アゴニストアミノ酸配列を含む実施例3と比較して、含む。
配列
X1X2X3QHLCGSHLVEALX4LVCGERGFX5YX6X7X8X9
式中、X1が、F、Q、またはAであり、X2が、VまたはGであり、X3が、N、K、D、G、Q、A、またはEであり、X4が、E、Y、Q、またはHであり、X5が、HまたはFであり、X6が、G、T、S、H、Vであるか、または存在せず、X7が、G、E、P、K、D、S、Hであるか、または存在せず、X8が、G、E、K、P、Q、D、Hであるか、または存在せず、X9が、G、T、S、E、K、Aであるか、または存在せず、但し、前記インスリンB鎖類似体が、X4、X5、X6、X7、X8、またはX9に、ヒトインスリン分子のB鎖のアミノ酸配列からの少なくとも1つの修飾を含む。
GIVEQCCTSX1CSLX2QLENYCX3X4
式中、X1が、TまたはIであり、X2が、D、Y、Q、またはEであり、X3が、G、N、S、またはAであり、X4が、任意の天然に存在するアミノ酸であるか、または存在せず、但し、X3がNである場合には、X4はGまたはN以外のアミノ酸でなければならない。
X1GX2GGGG、式中、X1が、Gであるか、または存在せず、X2が、G、Sであるか、または存在しない。
X1X2X3QHLCGSHLVEALX4LVCGERGFX5YX6X7X8X9X10GX11GGGGGIVEQCCTSX12CSLX13QLENYCX14X15
式中、X1が、F、Q、またはAであり、X2が、VまたはGであり、X3が、N、K、D、G、Q、A、またはEであり、X4が、E、Y、Q、またはHであり、X5が、HまたはFであり、X6が、G、T、S、H、Vであるか、または存在せず、X7が、G、E、P、K、D、S、Hであるか、または存在せず、X8が、G、E、K、P、Q、D、Hであるか、または存在せず、X9が、G、T、S、E、K、Aであるか、または存在せず、X10が、Gであるか、または存在せず、X11が、G、Sであるか、または存在せず、X12が、TまたはIであり、X13が、D、Y、Q、またはEであり、X14が、G、N、S、またはAであり、X15が、任意の天然に存在するアミノ酸であるか、または存在せず、但し、X4、X5、X6、X7、X8、またはX9のうちの少なくとも1つが、それぞれ、ヒトインスリン分子のB鎖の位置B16、B25、B27、B28、B29、またはB30に見出されるものとは異なるアミノ酸でなければならず、更に、X14がNである場合には、X15が、GまたはN以外のアミノ酸でなければならない。
FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLDQLENYCG
GGGGX1GGGGX2GGGGX3GGGGX4X5X6
式中、X1が、QまたはEであり、X2が、QまたはEであり、X3が、QまたはEであり、X4が、G、E、Qであるか、または存在せず、X5が、Gであるか、または存在せず、X6が、Gであるか、または存在しない。
GGGGQGGGGQGGGGQGGGGG
CPPCPAPELLGGPSVX1LX2PPKPKDTLMISRTPEVTCX3VX4DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYX5STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGX6
式中、X1が、F、Q、またはEであり、X2が、F、Q、またはEであり、X3が、VまたはTであり、X4が、VまたはTであり、X5が、N、D、またはQであり、
X6が、Kであるか、または存在しない。
PCPPCPAPEAAGGPSVX1LX2PPKPKDTLMISRTPEVTCX3VX4DVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFX5STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSX6LTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGX7
式中、X1が、F、Q、またはEであり、X2が、F、Q、またはEであり、X3が、VまたはTであり、X4が、VまたはTであり、X5が、N、D、またはQであり、X6が、RまたはKであり、X7が、Kであるか、または存在しない。
ECPPCPAPPVAGPSVX1LX2PPKPKDTLMISRTPEVTCX3VX4DVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFX5STFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGX6
式中、X1が、F、Q、またはEであり、X2が、F、Q、またはEであり、X3が、VまたはTであり、X4が、VまたはTであり、X5が、N、D、またはQであり、X6が、Kであるか、または存在しない。
X1X2X3QHLCGSHLVEALX4LVCGERGFX5YX6X7X8X9X10GX11GGGGGIVEQCCTSX12CSLX13QLENYCX14X15GGGGX16GGGGX17GGGGX18GGGGX19X20X21X22CPPCPAPX23X24AGX25PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSX26EDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTX27RVVSVLTVX28HQDWLNGKEYKCKVSNKGLPX29X30IEKTISKX31KGQPREPQVYTLPPSX32EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPX33LDSDGSFFLYSX34LTVDKSRWQX35GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSX36G
式中、X1が、F、Q、またはAであり、X2が、VまたはGであり、X3が、N、K、D、G、Q、A、またはEであり、X4が、E、Y、Q、またはHであり、X5が、HまたはFであり、X6が、G、T、S、H、Vであるか、または存在せず、X7が、G、E、P、K、D、S、Hであるか、または存在せず、X8が、G、E、K、P、Q、D、Hであるか、または存在せず、X9が、G、T、S、E、K、Aであるか、または存在せず、但し、X4、X5、X6、X7、X8、またはX9のうちの少なくとも1つが、それぞれ、ヒトインスリンB鎖の位置B16、B25、B27、B28、B29、またはB30に存在するもの以外のアミノ酸であり、X10が、Gであるか、または存在せず、X11が、G、Sであるか、または存在せず、X12が、TまたはIであり、X13が、D、Y、Q、またはEであり、X14が、G、N、S、またはAであり、X15が、任意の天然に存在するアミノ酸であるか、または存在せず、但し、X14がNである場合には、X15がGまたはN以外のアミノ酸でなければならず、X16が、QまたはEであり、X17が、QまたはEであり、X18が、QまたはEであり、X19が、G、E、Qであるか、または存在せず、X20が、Gであるか、または存在せず、X21が、Gであるか、または存在せず、X22が、EまたはPであり、X23が、EまたはPであり、X24が、AまたはVであり、X25が、Gであるか、または存在せず、X26が、QまたはHであり、X27が、YまたはF、X28が、LまたはVであり、X29が、SまたはAであり、X30が、SまたはPであり、X31が、AまたはTであり、X32が、QまたはRであり、X33が、VまたはMであり、X34が、RまたはKであり、X35が、EまたはQであり、X36が、LまたはPである。
GIVEQCCTSICSLYQLENYCN
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT
GGSGGGG
HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG
HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG
以下に、本願の当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
[1] 融合タンパク質であって、
a)一般式Z 1 −Z 2 −Z 3 を有するインスリン受容体アゴニストと
[式中、
i)Z 1 が、以下のアミノ酸配列を含むインスリンB鎖類似体であり、
X 1 X 2 X 3 QHLCGSHLVEALX 4 LVCGERGFX 5 YX 6 X 7 X 8 X 9
(式中、X 1 が、F、Q、またはAであり;X 2 が、VまたはGであり;X 3 が、N、K、D、G、Q、A、またはEであり;X 4 が、E、Y、Q、またはHであり;X 5 が、HまたはFであり;X 6 が、G、T、S、H、Vであるか、または存在せず;X 7 が、G、E、P、K、D、S、Hであるか、または存在せず;X 8 が、G、E、K、P、Q、D、Hであるか、または存在せず;X 9 が、G、T、S、E、K、Aであるか、または存在せず;但し、前記インスリンB鎖類似体が、X 4 、X 5 、X 6 、X 7 、X 8 、またはX 9 に、ヒトインスリン分子のB鎖のアミノ酸配列からの少なくとも1つの修飾を含む)(配列番号1)、
ii)Z 2 が、5〜10個のアミノ酸を含む第1のペプチドリンカーであり(ここで、前記アミノ酸のうちの少なくとも5個が、G残基である)、
iii)Z 3 が、以下のアミノ酸配列を含むインスリンA鎖類似体である
GIVEQCCTSX 1 CSLX 2 QLENYCX 3 X 4
(式中、X 1 が、TまたはIであり;X 2 が、D、Y、Q、またはEであり;X 3 が、G、N、S、またはAであり;X 4 が、任意の天然に存在するアミノ酸であるか、または存在せず;但し、X 3 がNである場合には、X 4 がGまたはN以外のアミノ酸でなければならない)(配列番号2)]、
b)第2のペプチドリンカーと、
c)ヒトIgGのFc領域と、を含み、
前記インスリン受容体アゴニストのC末端残基が、前記第2のペプチドリンカーのN末端残基に直接融合し、前記第2のペプチドリンカーのC末端残基が、前記ヒトIgGのFc領域のN末端残基に直接融合している、融合タンパク質。
[2] 前記インスリンB鎖類似体が、配列番号1のX 4 またはX 5 に、前記ヒトインスリンB鎖のアミノ酸配列からの少なくとも1つの修飾を含み、
前記インスリンA鎖類似体が、配列番号2のX 1 またはX 2 に、前記ヒトインスリンA鎖のアミノ酸配列からの少なくとも1つの修飾を含む、[1]に記載の融合タンパク質。
[3] 前記インスリンB鎖類似体が、配列番号1の配列を含み(式中、X 1 がFであり、X 2 がVであり、X 3 がNまたはDであり、X 4 がEであり、X 5 がHである)、
前記インスリンA鎖類似体が、配列番号2の配列を含む(式中、X 1 がIまたはTであり、X 2 がDであり、X 3 がGであり、X 4 が存在しない)、[1]または[2]のいずれかに記載の融合タンパク質。
[4] 前記インスリンB鎖類似体が、配列番号1の配列を含む(式中、X 6 〜X 9 が、各々Gである)、[1]〜[3]のいずれかに記載の融合タンパク質。
[5] 前記第1のペプチドリンカーが、以下のアミノ酸配列を含む、[1]〜[4]のいずれかに記載の融合タンパク質:
X 1 GX 2 GGGG
(式中、X 1 がGであるか、または存在せず;X 2 が、GもしくはSであるか、または存在しない)(配列番号3)。
[6] 配列番号3のX 1 及びX 2 が、それぞれ、G及びSである、[5]に記載の融合タンパク質。
[7] 前記インスリン受容体アゴニストが、以下のアミノ酸配列を有する、[1]〜[6]のいずれかに記載の融合タンパク質:
FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLDQLENYCG(配列番号5)。
[8] 前記第2のペプチドリンカーが、10〜25個のアミノ酸を有するペプチドであり、前記アミノ酸の少なくとも50%がG残基である、[1]〜[7]のいずれかに記載の融合タンパク質。
[9] 前記第2のペプチドリンカーが、配列[GGGGX] n を有するペプチドを含む(式中、Xが、Q、E、またはSであり; n が、2〜5である)、[1]〜[8]のいずれかに記載の融合タンパク質。
[10] 前記第2のペプチドリンカーが、以下のアミノ酸配列を含む、[1]〜[9]のいずれかに記載の融合タンパク質:
GGGGX 1 GGGGX 2 GGGGX 3 GGGGX 4 X 5 X 6
X 1 が、QまたはEであり、
X 2 が、QまたはEであり、
X 3 が、QまたはEであり、
X 4 が、G、E、Qであるか、または存在せず、
X 5 が、Gであるか、または存在せず、
X 6 が、Gであるか、または存在しない
(配列番号6)。
[11] 前記第2のペプチドリンカーが、以下のアミノ酸配列を有する、[1]〜[10]のいずれかに記載の融合タンパク質:
GGGGQGGGGQGGGGQGGGGG(配列番号7)。
[12] 前記ヒトIgGのFc領域が、IgG1、IgG2、またはIgG4からのFc領域である、[1]〜[11]のいずれかに記載の融合タンパク質。
[13] 前記ヒトIgGのFc領域が、配列番号8、配列番号9、及び配列番号10からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、[1]〜[12]のいずれかに記載の融合タンパク質。
[14] 配列番号12のアミノ酸配列を有する、融合タンパク質。
[15] [1]〜[14]のいずれかに記載の2つの融合タンパク質のホモ二量体。
[16] [1]〜[14]のいずれかに記載の融合タンパク質または[15]に記載のホモ二量体のいずれか、及び少なくとも1つの賦形剤を含む、医薬組成物。
[17] 前記組成物が、1つ以上の緩衝剤、1つ以上の界面活性剤、及び1つ以上の等張剤を更に含む、[16]に記載の医薬組成物。
[18] クエン酸塩、クエン酸、ポリソルベート80、及びマンニトールを更に含む、[16]に記載の医薬組成物。
[19] pHが約5.5〜約8.0の範囲である、[16]〜[18]のいずれかに記載の医薬組成物。
[20] pHが約6.0〜約6.75の範囲である、[16]〜[19]のいずれかに記載の医薬組成物。
[21] 付加的な活性成分を更に含む、[16]〜[20]のいずれかに記載の医薬組成物。
[22] 前記付加的な活性成分がインクレチン系療法剤である、[21]に記載の医薬組成物。
[23] 前記インクレチン系療法剤がGLP−1Rアゴニストである、[23]に記載の医薬組成物。
[24] 前記GLP−1Rアゴニストがデュラグルチドである、[23]に記載の医薬組成物。
[25] [15]に記載のホモ二量体及びデュラグルチドを含む、医薬組成物。
[26] 治療有効量の[1]〜[14]のいずれかに記載の融合タンパク質を、それを必要とする患者に投与することを含む、真性糖尿病を患う患者を治療する方法。
[27] [1]〜[14]のいずれかに記載の融合タンパク質が、付加的な活性成分と組み合わせて投与される、[26]に記載の方法。
[28] 前記付加的な活性成分がインクレチン系療法剤である、[27]に記載の方法。
[29] 前記インクレチン系療法剤がGLP−1Rアゴニストである、[28]に記載の方法。
[30] 前記GLP−1Rアゴニストがデュラグルチドである、[29]に記載の方法。
[31] [15]に記載のホモ二量体をデュラグルチドと組み合わせて、それを必要とする患者に投与することを含む、真性糖尿病を患う患者を治療する方法。
[32] 療法に使用するための、[1]〜[14]のいずれかに記載の融合タンパク質。
[33] 真性糖尿病の治療に使用するための、[1]〜[14]のいずれかに記載の融合タンパク質。
[34] 付加的な活性成分と、同時、別々、または逐次の組み合わせで使用するための[1]〜[14]のいずれかに記載の融合タンパク質。
[35] デュラグルチドと、同時、別々、または逐次の組み合わせで使用するための[1]〜[14]のいずれかに記載の融合タンパク質。
[36] デュラグルチドと、同時、別々、または逐次の組み合わせで使用するための[15]に記載のホモ二量体。
[37]
[1]〜[14]のいずれかに記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
Claims (37)
- 融合タンパク質であって、
a)一般式Z1−Z2−Z3を有するインスリン受容体アゴニストと
[式中、
i)Z1が、以下のアミノ酸配列を含むインスリンB鎖類似体であり、
X1X2X3QHLCGSHLVEALX4LVCGERGFX5YX6X7X8X9
(式中、X1が、F、Q、またはAであり;X2が、VまたはGであり;X3が、N、K、D、G、Q、A、またはEであり;X4が、E、Y、Q、またはHであり;X5が、HまたはFであり;X6が、G、T、S、H、Vであるか、または存在せず;X7が、G、E、P、K、D、S、Hであるか、または存在せず;X8が、G、E、K、P、Q、D、Hであるか、または存在せず;X9が、G、T、S、E、K、Aであるか、または存在せず;但し、前記インスリンB鎖類似体が、X4、X5、X6、X7、X8、またはX9に、ヒトインスリン分子のB鎖のアミノ酸配列からの少なくとも1つの修飾を含む)(配列番号1)、
ii)Z2が、5〜10個のアミノ酸を含む第1のペプチドリンカーであり(ここで、前記アミノ酸のうちの少なくとも5個が、G残基である)、
iii)Z3が、以下のアミノ酸配列を含むインスリンA鎖類似体である
GIVEQCCTSX1CSLX2QLENYCX3X4
(式中、X1が、TまたはIであり;X2が、D、Y、Q、またはEであり;X3が、G、N、S、またはAであり;X4が、任意の天然に存在するアミノ酸であるか、または存在せず;但し、X3がNである場合には、X4がGまたはN以外のアミノ酸でなければならない)(配列番号2)]、
b)第2のペプチドリンカーと、
c)ヒトIgGのFc領域と、を含み、
前記インスリン受容体アゴニストのC末端残基が、前記第2のペプチドリンカーのN末端残基に直接融合し、前記第2のペプチドリンカーのC末端残基が、前記ヒトIgGのFc領域のN末端残基に直接融合している、融合タンパク質。 - 前記インスリンB鎖類似体が、配列番号1のX4またはX5に、前記ヒトインスリンB鎖のアミノ酸配列からの少なくとも1つの修飾を含み、
前記インスリンA鎖類似体が、配列番号2のX1またはX2に、前記ヒトインスリンA鎖のアミノ酸配列からの少なくとも1つの修飾を含む、請求項1に記載の融合タンパク質。 - 前記インスリンB鎖類似体が、配列番号1の配列を含み(式中、X1がFであり、X2がVであり、X3がNまたはDであり、X4がEであり、X5がHである)、
前記インスリンA鎖類似体が、配列番号2の配列を含む(式中、X1がIまたはTであり、X2がDであり、X3がGであり、X4が存在しない)、請求項1または2のいずれか一項に記載の融合タンパク質。 - 前記インスリンB鎖類似体が、配列番号1の配列を含む(式中、X6〜X9が、各々Gである)、請求項1〜3のいずれかに記載の融合タンパク質。
- 前記第1のペプチドリンカーが、以下のアミノ酸配列を含む、請求項1〜4のいずれかに記載の融合タンパク質:
X1GX2GGGG
(式中、X1がGであるか、または存在せず;X2が、GもしくはSであるか、または存在しない)(配列番号3)。 - 配列番号3のX1及びX2が、それぞれ、G及びSである、請求項5に記載の融合タンパク質。
- 前記インスリン受容体アゴニストが、以下のアミノ酸配列を有する、請求項1〜6のいずれかに記載の融合タンパク質:
FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLDQLENYCG(配列番号5)。 - 前記第2のペプチドリンカーが、10〜25個のアミノ酸を有するペプチドであり、前記アミノ酸の少なくとも50%がG残基である、請求項1〜7のいずれかに記載の融合タンパク質。
- 前記第2のペプチドリンカーが、配列[GGGGX]nを有するペプチドを含む(式中、Xが、Q、E、またはSであり;nが、2〜5である)、請求項1〜8のいずれかに記載の融合タンパク質。
- 前記第2のペプチドリンカーが、以下のアミノ酸配列を含む、請求項1〜9のいずれかに記載の融合タンパク質:
GGGGX1GGGGX2GGGGX3GGGGX4X5X6
X1が、QまたはEであり、
X2が、QまたはEであり、
X3が、QまたはEであり、
X4が、G、E、Qであるか、または存在せず、
X5が、Gであるか、または存在せず、
X6が、Gであるか、または存在しない
(配列番号6)。 - 前記第2のペプチドリンカーが、以下のアミノ酸配列を有する、請求項1〜10のいずれかに記載の融合タンパク質:
GGGGQGGGGQGGGGQGGGGG(配列番号7)。 - 前記ヒトIgGのFc領域が、IgG1、IgG2、またはIgG4からのFc領域である、請求項1〜11のいずれかに記載の融合タンパク質。
- 前記ヒトIgGのFc領域が、配列番号8、配列番号9、及び配列番号10からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1〜12のいずれかに記載の融合タンパク質。
- 配列番号12のアミノ酸配列を有する、融合タンパク質。
- 請求項1〜14のいずれかに記載の2つの融合タンパク質のホモ二量体。
- 請求項1〜14のいずれかに記載の融合タンパク質または請求項15に記載のホモ二量体のいずれか、及び少なくとも1つの賦形剤を含む、医薬組成物。
- 前記組成物が、1つ以上の緩衝剤、1つ以上の界面活性剤、及び1つ以上の等張剤を更に含む、請求項16に記載の医薬組成物。
- クエン酸塩、クエン酸、ポリソルベート80、及びマンニトールを更に含む、請求項16に記載の医薬組成物。
- pHが約5.5〜約8.0の範囲である、請求項16〜18のいずれかに記載の医薬組成物。
- pHが約6.0〜約6.75の範囲である、請求項16〜19のいずれかに記載の医薬組成物。
- 付加的な活性成分を更に含む、請求項16〜20のいずれかに記載の医薬組成物。
- 前記付加的な活性成分がインクレチン系療法剤である、請求項21に記載の医薬組成物。
- 前記インクレチン系療法剤がGLP−1Rアゴニストである、請求項23に記載の医薬組成物。
- 前記GLP−1Rアゴニストがデュラグルチドである、請求項23に記載の医薬組成物。
- 請求項15に記載のホモ二量体及びデュラグルチドを含む、医薬組成物。
- 治療有効量の請求項1〜14のいずれかに記載の融合タンパク質を、それを必要とする患者に投与することを含む、真性糖尿病を患う患者を治療する方法。
- 請求項1〜14のいずれかに記載の融合タンパク質が、付加的な活性成分と組み合わせて投与される、請求項26に記載の方法。
- 前記付加的な活性成分がインクレチン系療法剤である、請求項27に記載の方法。
- 前記インクレチン系療法剤がGLP−1Rアゴニストである、請求項28に記載の方法。
- 前記GLP−1Rアゴニストがデュラグルチドである、請求項29に記載の方法。
- 請求項15に記載のホモ二量体をデュラグルチドと組み合わせて、それを必要とする患者に投与することを含む、真性糖尿病を患う患者を治療する方法。
- 療法に使用するための、請求項1〜14のいずれかに記載の融合タンパク質。
- 真性糖尿病の治療に使用するための、請求項1〜14のいずれかに記載の融合タンパク質。
- 付加的な活性成分と、同時、別々、または逐次の組み合わせで使用するための請求項1〜14のいずれかに記載の融合タンパク質。
- デュラグルチドと、同時、別々、または逐次の組み合わせで使用するための請求項1〜14のいずれかに記載の融合タンパク質。
- デュラグルチドと、同時、別々、または逐次の組み合わせで使用するための請求項15に記載のホモ二量体。
- 請求項1〜14のいずれかに記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
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