TWI656132B - 融合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於包含經由使用肽連接子融合至人IgG Fc區的胰島素受體促效劑的融合蛋白，以及此類融合蛋白在糖尿病治療中的用途。本發明之融合蛋白具有延長的時間作用特性並且可用於提供延長時段的基礎葡萄糖控制。

Description

融合蛋白
本發明係關於用於治療糖尿病的融合蛋白。更特定言之，本發明係關於包含藉由肽連接子融合至人IgG Fc區的胰島素受體促效劑的融合蛋白，以及此類蛋白在糖尿病治療中的用途。本發明之融合蛋白具有延長的時間作用特性並且可用於提供對肝葡萄糖排出量之延長的基礎葡萄糖控制及抑制。
糖尿病為一種慢性病症，表徵為由於胰島素分泌、胰島素作用或者兩者之缺乏而導致的高血糖。1型糖尿病表徵為幾乎沒有胰島素分泌能力或者沒有胰島素分泌能力，並且患有1型糖尿病的患者需要胰島素來生存。2型糖尿病表徵為由於減弱的胰島素分泌、胰島素抗性、過多的肝葡萄糖排出量及/或來源於上述所有的貢獻而導致的升高的血糖水平。在患有2型糖尿病的患者的至少三分之一中，疾病進展至絕對需要胰島素療法。
為了實現正常的血糖，需要使胰島素替代療法儘可能接近地類似於正常個體體內的內源性胰島素分泌模式。胰島素之每日生理需要量波動並且可分成兩個階段；(a)進餐時階段，該階段需要脈衝量(大劑量)的胰島素來分解與進餐相關的血糖激增；及(b)進餐間階段，該階段需要維持(基礎)量之胰島素來調節肝葡萄糖排出量，從而維持最佳的空腹血糖。
因為1型糖尿病患者幾乎不產生胰島素或者不產生胰島素，所以用於1型糖尿病的有效胰島素療法一般涉及使用兩種類型外源給藥的 胰島素：一種為藉由快速注射提供的速效進餐時間胰島素，並且另一種為每日給藥一或兩次以控制進餐間之血糖水平的長效基礎胰島素。對患有2型糖尿病之患者的治療通常以規定的減輕體重、練習及糖尿病飲食開始，但是當該等措施未能控制升高的血糖時，則可能需要口服給藥法及基於腸促胰島素的療法，諸如投與賦能升高的腸促胰島素水平之升糖素樣肽-1(GLP-1)受體促效劑及/或二肽基肽酶4(DPP-4)抑制劑。當該等藥物療法仍然不足時，考慮用胰島素進行治療。疾病已經進展到需要胰島素療法程度的2型糖尿病患者一般以每日單次注射長效的基礎胰島素開始治療，但是在一些情況下，可根據需要包括速效胰島素的進餐時間注射。
若干種類型之基礎胰島素為當前可用的。以商品名LANTUS®出售的甘精胰島素(Insulin glargine)包含經修飾的胰島素結構，其中胰島素A鏈中位置21處的天冬醯胺酸由甘胺酸取代，並且兩個精胺酸被添加至B鏈之C末端。以商品名LEVEMIR®出售的地特胰島素(Insulin detemir)包含經修飾的胰島素結構，其中B鏈中的位置30處的蘇胺酸已經缺失並且B鏈中的位置29處的離胺酸已經經由14個碳原子的肉豆蔻醯脂肪酸與B29處的離胺酸之ε-胺基的共價鍵而衍生。可在歐洲及日本以商品名TRESIBA®購得之德穀胰島素(Insulin degludec)包含經修飾的胰島素結構，其中B鏈中的位置30處的蘇胺酸已經缺失，並且B鏈中的位置29處的離胺酸的ε-胺基經由γ-L-麩胺酸連接子與十六烷二酸共價地衍生。所有該等胰島素皆被指示為每日給藥一次。
涉及每日注射現有胰島素療法的治療方法可在給藥時為複雜及痛苦的並且可造成不期望的副作用，諸如低血糖及體重增加。因此，許多糖尿病患者不願意或者不能夠，或者不會順應維持對血糖水平之精密控制所必需的胰島素療法。不良的血糖控制增大了患者進展出嚴重的糖尿病相關併發症的風險，糖尿病相關併發症包括心臟病、中 風、神經損傷、下肢截肢、視力喪失以及腎病。正在進行研究以辨識具有較長作用持續時間；因此需要比當前可用的胰島素產品更少的注射次數以改良可接受性及順應性之胰島素產品。
CN103509118描述了一種蛋白質，該蛋白質具有藉由4至50個胺基酸構成的C-肽連接序列接合的人胰島素B鏈及人胰島素A鏈，以及直接附接(未使用額外的連接子)至免疫球蛋白Fc片段的胰島素A鏈，並且陳述小鼠體內試驗表明此類蛋白質具有長達約3天的體內半衰期。KR101324828描述了經由使用非肽基連接子連接至免疫球蛋白Fc區的胰島素原類似物，並且陳述此類蛋白質提供相較於現有療法延長的血清半衰期。該公開案陳述非肽基連接子表示對肽連接子的改良，宣稱使用肽連接子之融合蛋白無法延長活性藥物在血液中之半衰期，因為肽連接子易被體內的酶切斷。
不管上述及/或任何其他出版物中之揭示內容，本發明人克服了多個障礙而發現包含胰島素受體促效劑、肽連接子以及人IgG Fc區的融合蛋白滿足對具有延長之作用持續時間的降血糖產品的不斷需要，足以比當前可用的胰島素產品更不頻繁地定量給藥，包括不頻繁至一週一次地定量給藥。舉例而言，為了實現所期望之延長的時間作用特性，必須工程化出具有衰減效能以避免快速的受體介導清除(為胰島素清除之主要途徑)，但是仍然具有足夠的效能來提供充分降血糖的融合蛋白。此外，為了最小化腎清除(胰島素清除之另一種主要途徑)並且為了調節經由受流體動力學直徑限制的細胞旁路擴散實現之外周暴露，必須將融合蛋白工程化為足夠大並且不具有在給藥後以蛋白質水解作用從人IgG Fc區裂解的胰島素受體促效劑，因為即使人IgG Fc區在循環中保留，此類裂解也會導致對胰島素受體促效劑比所需更快的腎清除。此外，IgG Fc結構域已經進化成自締合(self-associate)以形成穩定的二聚物，並且當此類二聚物由兩種融合蛋白形成時，每一 種融合蛋白包含與IgG Fc區融合的胰島素部分，該兩種胰島素部分變成彼此緊鄰，使得該等胰島素部分能夠在胰島素B鏈自締合區的介導下自締合或者二聚化。此類胰島素二聚物為無活性的，因此必須工程化具有減少的自締合之胰島素受體促效劑部分的融合蛋白。克服了許多額外的挑戰來產生適用於工業製造及製劑作為治療劑的融合蛋白。本發明提供一種融合蛋白，該融合蛋白相較於現有胰島素療法具有延長的作用持續時間，從而允許比現有胰島素產品更不頻繁地注射(包括長達每週一次)，從而減少與涉及更頻繁之注射的現有治療方法相關的複雜性及疼痛。本發明之融合蛋白具有平坦的藥代動力學曲線及有限的外周暴露，從而導致低逐日變化性及最小的低血糖症發病率，包括當與額外的糖尿病藥療法(諸如基於腸促胰島素的療法)組合提供時。本發明之融合蛋白亦可提供延長的作用持續時間，而不會使體重增加。
本發明提供一種融合蛋白，其包含：a)胰島素受體促效劑，其具有通式Z1-Z2-Z3，其中i)Z1為胰島素B鏈類似物，包含以下胺基酸序列：X1X2X3QHLCGSHLVEALX4LVCGERGFX5YX6X7X8X9
其中X1為F、Q或A；X2為V或G；X3為N、K、D、G、Q、A或E；X4為E、Y、Q或H；X5為H或F；X6為G、T、S、H、V或不存在；X7為G、E、P、K、D、S、H或者不存在；X8為G、E、K、P、Q、D、H或者不存在；X9為G、T、S、E、K、A或者不存在，其限制條件為該胰島素B鏈類似物包括在X4、X5、X6、X7、X8或者X9處對人胰島素分子之B鏈的胺基酸序列的至少一種修飾(SEQ ID NO：1)；ii)Z2為第一肽連接子，包含5至10個胺基酸，其中該等胺基酸中的至少5個為G殘基；以及iii)Z3為胰島素A鏈類似物，包含以下胺基酸序列： GIVEQCCTSX1CSLX2QLENYCX3X4
X1為T或I；X2為D、Y、Q或E；X3為G、N、S或A；並且X4為任何天然存在的胺基酸或者不存在，其限制條件為若X3為N，則X4必須為除G或N以外的胺基酸(SEQ ID NO：2)；b)第二肽連接子；以及c)人IgG Fc區；其中胰島素受體促效劑之C末端殘基直接融合至第二肽連接子之N末端殘基，並且第二肽連接子之C末端殘基直接融合至IgG Fc區之N末端殘基。
本發明亦提供一種融合蛋白，其由以下項組成：a)胰島素受體促效劑，其具有通式Z1-Z2-Z3，其中i)Z1為胰島素B鏈類似物，具有以下胺基酸序列：X1X2X3QHLCGSHLVEALX4LVCGERGFX5YX6X7X8X9
其中X1為F、Q或A；X2為V或G；X3為N、K、D、G、Q、A或E；X4為E、Y、Q或H；X5為H或F；X6為G、T、S、H、V或不存在；X7為G、E、P、K、D、S、H或者不存在；X8為G、E、K、P、Q、D、H或者不存在；X9為G、T、S、E、K、A或者不存在，其限制條件為該胰島素B鏈類似物包括在X4、X5、X6、X7、X8或者X9處對人胰島素分子之B鏈的胺基酸序列的至少一種修飾(SEQ ID NO：1)；ii)Z2為第一肽連接子，包含5至10個胺基酸，其中該等胺基酸中的至少5個為G殘基；以及iii)Z3為胰島素A鏈類似物，具有以下胺基酸序列：GIVEQCCTSX1CSLX2QLENYCX3X4
X1為T或I；X2為D、Y、Q或E；X3為G、N、S或A；並且X4為任何天然存在的胺基酸或者不存在，其限制條件為若X3為N，則X4必須為除G或N以外的胺基酸(SEQ ID NO：2)； b)第二肽連接子；以及c)人IgG Fc區；其中胰島素受體促效劑之C末端殘基直接融合至第二肽連接子之N末端殘基，並且第二肽連接子之C末端殘基直接融合至IgG Fc區之N末端殘基。
本發明亦提供一種醫藥組合物，該醫藥組合物包含本發明之融合蛋白以及至少一種醫藥學上可接受的賦形劑。
本發明亦提供一種治療患有糖尿病、肥胖症、異常血脂症或代謝症候群之患者的方法，該方法包含向需要治療的患者投與治療有效量的本發明之融合蛋白。本發明亦提供一種治療或預防選自由以下項組成的群組之糖尿病相關症狀的方法：心臟病、中風、腎病變(nephropathy)、視網膜病以及腎臟疾病(kidney disease)，該方法包含向需要治療的患者投與治療有效量的本發明之融合蛋白。
本發明亦提供用於治療的本發明之融合蛋白。
本發明亦提供本發明之融合蛋白在藥物製造中之用途。
本發明亦提供編碼本發明之融合蛋白的聚核苷酸。
本發明亦提供用於產生本發明之融合蛋白的方法，該方法包含以下步驟：1. 在使本發明之融合蛋白表達的條件下培養包含編碼該融合蛋白之聚核苷酸的哺乳動物宿主細胞；以及2. 從該宿主細胞回收融合蛋白。
本發明亦提供由上述方法產生的融合蛋白。
在某些實施例中，胰島素B鏈類似物包括在SEQ ID NO：1之X4或X5處對人胰島素分子之B鏈的胺基酸序列的至少一種修飾，以及在SEQ ID NO：1之X6、X7、X8或者X9處對人胰島素分子之B鏈的胺基酸序列的至少一種修飾。
在某些實施例中，胰島素B鏈類似物包括在SEQ ID NO：1之X6、X7、X8或者X9處對人胰島素分子之B鏈的胺基酸序列的至少兩種修飾。
在某些實施例中，胰島素B鏈類似物包括在SEQ ID NO：1之X6、X7、X8及X9處對人胰島素分子之B鏈的胺基酸序列的修飾。
在某些實施例中，胰島素B鏈類似物具有SEQ ID NO：1之胺基酸序列，其中X6-X9各自為G。
在某些實施例中，胰島素B鏈類似物包括在SEQ ID NO：1之X4及X5處對人胰島素分子之B鏈的胺基酸序列的修飾。
在某些實施例中，胰島素B鏈類似物具有SEQ ID NO：1之序列，其中：X1為F；X2為V；X3為N或D；X4為E；X5為H。
在某些實施例中，胰島素B鏈類似物包括在SEQ ID NO：1之位置X4、X5、X6、X7、X8及X9中的每一位置對人胰島素分子之B鏈的胺基酸序列之修飾。
在某些實施例中，胰島素B鏈類似物包含SEQ ID NO：1之序列，其中：X1為F；X2為V；X3為N或D；X4為E；X5為H；並且X6-X9各自為G。
在某些實施例中，胰島素A鏈類似物包括在SEQ ID NO：2之X1或者X2處對人胰島素A鏈之胺基酸序列的至少一種修飾。
在某些實施例中，胰島素A鏈類似物包括在SEQ ID NO：2之X1及X2兩者處對人胰島素A鏈之胺基酸序列的修飾。
在某些實施例中，胰島素A鏈類似物具有SEQ ID NO：2之序列，其中：X1為I或T；X2為D；X3為G；並且X4不存在。
在某些實施例中，胰島素A鏈類似物具有SEQ ID NO：2之序列，其中X3為N並且其中X4為除了G、N、S、V、L或P以外的胺基酸。
在某些實施例中，胰島素B鏈類似物包括在SEQ ID NO：1之X4或者X5處對人胰島素分子之B鏈的胺基酸序列的至少一種修飾，以及SEQ ID NO：1之X6、X7、X8或者X9處對人胰島素分子之B鏈的胺基酸序列的至少一種修飾；並且胰島素A鏈類似物包括在SEQ ID NO：2之X1或者X2處對人胰島素A鏈之胺基酸序列的至少一種修飾。
在某些實施例中，胰島素B鏈類似物包括在SEQ ID NO：1之X6、X7、X8或者X9處對人胰島素分子之B鏈的胺基酸序列的至少兩種修飾；並且胰島素A鏈類似物包括在SEQ ID NO：2之X1或者X2處對人胰島素A鏈之胺基酸序列的至少一種修飾。
在某些實施例中，胰島素B鏈類似物包括在SEQ ID NO：1之X6、X7、X8及X9處對人胰島素分子之B鏈的胺基酸序列的修飾；並且胰島素A鏈類似物包括在SEQ ID NO：2之X1或者X2處對人胰島素A鏈之胺基酸序列的至少一種修飾。
在某些實施例中，胰島素B鏈類似物具有SEQ ID NO：1之胺基酸序列，其中X6-X9各自為G；並且胰島素A鏈類似物包括在SEQ ID NO：2之X1或者X2處對人胰島素A鏈之胺基酸序列的至少一種修飾。
在某些實施例中，胰島素B鏈類似物包括在SEQ ID NO：1之X4及X5處對人胰島素分子之B鏈的胺基酸序列的修飾；並且胰島素A鏈類似物包括在SEQ ID NO：2之X1或者X2處對人胰島素A鏈之胺基酸序列的至少一種修飾。
在某些實施例中，胰島素B鏈類似物包含SEQ ID NO：1之序列，其中：X1為F；X2為V；X3為N或D；X4為E；X5為H；並且胰島素A鏈類似物包括在SEQ ID NO：2之X1或者X2處對人胰島素A鏈之胺基酸序列的至少一種修飾。
在某些實施例中，胰島素B鏈類似物包括在SEQ ID NO：1之位置X4、X5、X6、X7、X8及X9中的每一位置對人胰島素分子之B鏈的胺基酸序列之修飾；並且胰島素A鏈類似物包括在SEQ ID NO：2之X1或者X2處對人胰島素A鏈之胺基酸序列的至少一種修飾。
在某些實施例中，胰島素B鏈類似物具有SEQ ID NO：1之序列，其中：X1為F；X2為V；X3為N或D；X4為E；X5為H；並且X6-X9各自為G；並且胰島素A鏈類似物包括在SEQ ID NO：2之X1或者X2處對人胰島素A鏈之胺基酸序列的至少一種修飾。
在某些實施例中，胰島素B鏈類似物包括在SEQ ID NO：1之X4或者X5處對人胰島素分子之B鏈的胺基酸序列的至少一種修飾，以及在SEQ ID NO：1之X6、X7、X8或者X9處對人胰島素分子之B鏈的胺基酸序列的至少一種修飾；並且胰島素A鏈類似物包括在SEQ ID NO：2之X1及X2兩者處對人胰島素A鏈之胺基酸序列的修飾。
在某些實施例中，胰島素B鏈類似物包括在SEQ ID NO：1之X6、X7、X8或者X9處對人胰島素分子之B鏈的胺基酸序列的至少兩種修飾；並且胰島素A鏈類似物包括在SEQ ID NO：2之X1及X2兩者處對人胰島素A鏈之胺基酸序列的修飾。
在某些實施例中，胰島素B鏈類似物包括在SEQ ID NO：1之X6、X7、X8及X9處對人胰島素分子之B鏈的胺基酸序列的修飾；並且胰島素A鏈類似物包括在SEQ ID NO：2之X1及X2兩者處對人胰島素A鏈之胺基酸序列的修飾。
在某些實施例中，胰島素B鏈類似物具有SEQ ID NO：1之胺基酸 序列，其中X6-X9各自為G；並且胰島素A鏈類似物包括在SEQ ID NO：2之X1及X2兩者處對人胰島素A鏈之胺基酸序列的修飾。
在某些實施例中，胰島素B鏈類似物包括在SEQ ID NO：1之X4及X5處對人胰島素分子之B鏈的胺基酸序列的修飾；並且胰島素A鏈類似物包括在SEQ ID NO：2之X1及X2兩者處對人胰島素A鏈之胺基酸序列的修飾。
在某些實施例中，胰島素B鏈類似物包含SEQ ID NO：1之序列，其中：X1為F；X2為V；X3為N或D；X4為E；X5為H；並且胰島素A鏈類似物包括在SEQ ID NO：2之X1及X2兩者處對人胰島素A鏈之胺基酸序列的修飾。
在某些實施例中，胰島素B鏈類似物包括在SEQ ID NO：1之位置X4、X5、X6、X7、X8及X9中的每一位置對人胰島素分子之B鏈的胺基酸序列之修飾；並且胰島素A鏈類似物包括在SEQ ID NO：2之X1及X2兩者處對人胰島素A鏈之胺基酸序列的修飾。
在某些實施例中，胰島素B鏈類似物具有SEQ ID NO：1之序列，其中：X1為F；X2為V；X3為N或D；X4為E；X5為H；並且X6-X9各自為G；並且胰島素A鏈類似物包括在SEQ ID NO：2之X1及X2兩者處對人胰島素A鏈之胺基酸序列的修飾。
在某些實施例中，胰島素B鏈類似物包括在SEQ ID NO：1之X4或X5處對人胰島素分子之B鏈的胺基酸序列的至少一種修飾，以及在SEQ ID NO：1之X6、X7、X8或X9處對人胰島素分子之B鏈的胺基酸序列的至少一種修飾；並且胰島素A鏈類似物具有SEQ ID NO：2之序列，其中：X1為I或T；X2為D；X3為G；並且X4不存在。
在某些實施例中，胰島素B鏈類似物包括在SEQ ID NO：1之X6、X7、X8或者X9處對人胰島素分子之B鏈的胺基酸序列的至少兩種修飾；並且胰島素A鏈類似物具有SEQ ID NO：2之序列，其中：X1為I或 T；X2為D；X3為G；並且X4不存在。
在某些實施例中，胰島素B鏈類似物包括在SEQ ID NO：1之X6、X7、X8及X9處對人胰島素分子之B鏈的胺基酸序列的修飾；並且胰島素A鏈類似物具有SEQ ID NO：2之序列，其中：X1為I或T；X2為D；X3為G；並且X4不存在。
在某些實施例中，胰島素B鏈類似物具有SEQ ID NO：1之胺基酸序列，其中X6-X9各自為G，其中：X1為I或T；X2為D；X3為G；並且X4不存在。
在某些實施例中，胰島素B鏈類似物包括在SEQ ID NO：1之X4及X5處對人胰島素分子之B鏈的胺基酸序列的修飾；並且胰島素A鏈類似物具有SEQ ID NO：2之序列，其中：X1為I或T；X2為D；X3為G；並且X4不存在。
在某些實施例中，胰島素B鏈類似物包含SEQ ID NO：1之序列，其中：X1為F；X2為V；X3為N或D；X4為E；X5為H；並且胰島素A鏈類似物具有SEQ ID NO：2之序列，其中：X1為I或T；X2為D；X3為G；並且X4不存在。
在某些實施例中，胰島素B鏈類似物包括在SEQ ID NO：1之位置X4、X5、X6、X7、X8及X9中的每一位置對人胰島素分子之B鏈的胺基酸序列之修飾；並且胰島素A鏈類似物具有SEQ ID NO：2之序列，其中：X1為I或T；X2為D；X3為G；並且X4不存在。
在某些實施例中，胰島素B鏈類似物具有SEQ ID NO：1之序列，其中：X1為F；X2為V；X3為N或D；X4為E；X5為H；並且X6-X9各自為G；並且胰島素A鏈類似物具有SEQ ID NO：2之序列，其中：X1為I或T；X2為D；X3為G；並且X4不存在。
在某些實施例中，第一肽連接子(Z2)包含以下胺基酸序列：X1GX2GGGG，其中X1為G或者不存在；並且X2為G、S或者不存在 (SEQ ID NO：3)。
在某些實施例中，胰島素受體促效劑，亦即上述融合蛋白中的Z1-Z2-Z3，包含以下胺基酸序列：X1X2X3QHLCGSHLVEALX4LVCGERGFX5YX6X7X8X9X10GX11GGGGGIVEQCCTSX12CSLX13QLENYCX14X15
其中X1為F、Q或A；X2為V或G；X3為N、K、D、G、Q、A或E；X4為E、Y、Q或H；X5為H或F；X6為G、T、S、H、V或不存在；X7為G、E、P、K、D、S、H或者不存在；X8為G、E、K、P、Q、D、H或者不存在；X9為G、T、S、E、K、A或者不存在；X10為G或者不存在；X11為G、S或者不存在；X12為T或I；X13為D、Y、Q或E；X14為G、N、S或A；並且X15為任何天然存在的胺基酸或者不存在，其限制條件為X4、X5、X6、X7、X8或者X9中的至少一者必須為與在人胰島素分子之B鏈的位置B16、B25、B27、B28、B29或者B30處分別發現的胺基酸不同的胺基酸，並且進一步限制條件為若X14為N，則X15必須為除G或者N以外的胺基酸(SEQ ID NO：4)。
在某些優選實施例中，胰島素受體促效劑，亦即上述融合蛋白中的Z1-Z2-Z3具有以下胺基酸序列：FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLDQLENYCG(SEQ ID NO：5)。
在某些實施例中，第二肽連接子為具有在10與25個之間的胺基酸的肽，其中該等胺基酸中至少50%為G殘基。在某些實施例中，第二肽連接子為包含胺基酸序列[GGGGX] n 的肽，其中X為Q、E或S；並且其中 n 為2-5。在某些實施例中，第二肽連接子包含以下胺基酸序列：GGGGX1GGGGX2GGGGX3GGGGX4X5X6
其中X1為Q或E；X2為Q或E；X3為Q或E；X4為G、E、Q或者不存在；X5為G或者不存在；並且X6為G或者不存在(SEQ ID NO：6)。
在某些優選實施例中，第二肽連接子具有以下胺基酸序列：GGGGQGGGGQGGGGQGGGGG(SEQ ID NO：7)。
在某些實施例中，人IgG Fc區包含來源於IgG抗體之一條重鏈的片段。包含此類IgG區的融合蛋白之示意圖提供於圖2中的圖解(A)中。在其他實施例中，人IgG Fc區包含來源於IgG抗體之兩個重鏈的片段。包含此類IgG區的融合蛋白之示意圖提供於圖2中的圖解(B)中。
在某些實施例中，人IgG Fc區為來源於IgG1、IgG2或者IgG4抗體的Fc區。
在某些實施例中，人IgG Fc區為來源於IgG1抗體的Fc區，包含以下胺基酸序列：
其中X1為F、Q或E；X2為F、Q或E；X3為V或T；X4為V或T；X5為N、D或Q；並且X6為K或者不存在。(SEQ ID NO：8)
在某些實施例中，IgG Fc區包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列並且進一步在SEQ ID NO：8中的位置1處的C殘基之N末端側包含在野生型IgG1 Fc序列中將發現的一些或所有胺基酸。
優選地，人IgG Fc區來源於IgG2或者IgG4抗體。
在某些實施例中，人IgG Fc區為來源於IgG4抗體的Fc區，包含以下胺基酸序列：
其中X1為F、Q或E；X2為F、Q或E；X3為V或T；X4為V或T；X5為N、D或Q；X6為R或K；X7為K或者不存在。(SEQ ID NO：9)
在某些實施例中，IgG Fc區包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列並且進一步在SEQ ID NO：9中的位置1處的C殘基之N末端側包含在野生型IgG4 Fc序列中將發現的一些或所有胺基酸。在某些實施例中，人IgG Fc區包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列，其中X1為F；X2為F；X3為V；X4為V；X5為N；X6為R；並且X7不存在。
在某些實施例中，人IgG Fc區為來源於IgG2抗體的Fc區，具有以下胺基酸序列：
其中X1為F、Q或E；X2為F、Q或E；X3為V或T；X4為V或T；X5為N、D或Q；並且X6為K或不存在。(SEQ ID NO：10)
在某些實施例中，IgG Fc區包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列並且進一步在SEQ ID NO：10中的位置1處的E殘基之N末端側包含在野生型IgG2 Fc序列中將發現的一些或所有胺基酸。在某些實施例中，人IgG Fc區包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列，其中X1為F；X2為F；X3為V；X4為V；X5為N；並且X6不存在。
在某些實施例中，融合蛋白包含以下胺基酸序列：
其中X1為F、Q或A；X2為V或G；X3為N、K、D、G、Q、A或E；X4為E、Y、Q或H；X5為H或F；X6為G、T、S、H、V或者不存在；X7為G、E、P、K、D、S、H或者不存在；X8為G、E、K、P、Q、D、H或者不存在；X9為G、T、S、E、K、A或者不存在，其限制條件為X4、X5、X6、X7、X8或X9中的至少一者為除了在人胰島素B鏈之位置B16、B25、B27、B28、B29或者B30處分別存在的胺基酸以外的胺基酸；X10為G或者不存在；X11為G、S或者不存在；X12為T或I；X13為D、Y、Q或E；X14為G、N、S或A；X15為任何天然存在的胺基酸或者不存在，其限制條件為若X14為N，則X15必須為除G或N以外的胺基酸；X16為Q或E；X17為Q或E；X18為Q或E；X19為G、E、Q或者不存在；X20為G或者不存在；X21為G或者不存在；X22為E或P；X23為E或P；X24為A或V；X25為G或者不存在；X26為Q或H；X27為Y或F；X28為L或V；X29為S或A；X30為S或P；X31為A或T；X32為Q或R；X33為V或M；X34為R或K；X35為E或Q；並且X36為L或P(SEQ ID NO：11)。
在某些實施例中，本發明提供選自由以下項組成的群組的融合蛋白：SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23以及SEQ ID NO：24。
在一個優選實施例中，融合蛋白具有以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：12)。
在某些實施例中，本發明之融合蛋白以二聚物形式存在。此類二聚物之示意圖提供於圖2中的圖解(C)中。在某些實施例中，二聚物為同質二聚體，其中構成二聚體的兩個融合蛋白之胺基酸序列為相同的。在某些實施例中，二聚物為異二聚體，其中構成二聚體的兩個融合蛋白之胺基酸序列為不同的。
在某些實施例中，本發明之醫藥組合物包含本發明之融合蛋白、緩衝劑、界面活性劑，等滲劑。在某些實施例中，緩衝劑為檸檬酸及/或檸檬酸鹽，界面活性劑為聚山梨酸酯80，並且等滲劑為甘露醇。在某些實施例中，組合物之pH在約5.5至約8.0的範圍內。在某些實施例中，pH在約6.0至約7.4的範圍內。在某些實施例中，pH在約6.0至6.75的範圍內。
在某些實施例中，醫藥組合物進一步包含額外的活性成分。在某些實施例中，額外的活性成分為基於腸促胰島素的療法。在某些優選實施例中，基於腸促胰島素的療法為GLP-1R促效劑。優選地，GLP-1R促效劑為度拉糖肽(dulaglutide)。
在某些實施例中，本發明之方法包含每日投與治療有效量之融合蛋白一次。在優選實施例中，每週投與治療有效量之融合蛋白一次。在某些實施例中，每月投與治療有效量之融合蛋白一次。在某些實施例中，本發明提供了一種治療患有糖尿病之患者，同時降低低血 糖及/或體重增加之風險的方法，該方法包含向患者投與治療有效量的本發明之融合蛋白。
本發明亦提供一種治療患有糖尿病、肥胖症、異常血脂症及/或代謝症候群之患者的方法，該方法包含投與治療有效量的本發明之融合蛋白以及額外的活性成分。在此類實施例中，融合蛋白及額外的活性成分可同時投與、順序投與或者以單一組合製劑形式投與。在某些實施例中，額外的活性成分為基於腸促胰島素的療法。在某些優選實施例中，基於腸促胰島素的療法為GLP-1R促效劑。優選地，GLP-1R促效劑為度拉糖肽。在某些實施例中，每日投與該組合一次。在某些優選實施例中，每週投與該組合一次。在某些實施例中，每月投與該組合一次。
在某些實施例中，本發明提供了用於治療糖尿病、肥胖症、異常血脂症或代謝症候群的本發明之融合蛋白。在某些實施例中，本發明提供用於治療或者預防選自由以下項組成的群組之糖尿病相關的症狀的本發明之融合蛋白：心臟病、中風、腎病變、視網膜病以及腎病。在某些實施例中，本發明提供用於治療患有糖尿病的患者，同時降低低血糖及/或體重增加之風險的本發明之融合蛋白，包含向患者投與本發明之融合蛋白。在某些實施例中，將本發明之融合蛋白提供為與另一活性成分同時、分開或者按順序地組合使用。在某些實施例中，額外的活性成分為基於腸促胰島素的療法。在某些優選實施例中，基於腸促胰島素的療法為GLP-1R促效劑。
在某些實施例中，本發明提供了本發明之融合蛋白在用於治療糖尿病、肥胖症、異常血脂症或代謝症候群的藥物之製造中的用途。在某些實施例中，本發明提供本發明之融合蛋白在用於治療或者預防選自由以下項組成的群組之糖尿病相關的症狀的藥物之製造 中的用途：心臟病、中風、腎病變、視網膜病以及腎病。在某些實 施例中，本發明提供本發明之融合蛋白在用於治療糖尿病同時降低低血糖及/或體重增加之風險的藥物之製造中的用途，包含向患者投與本發明之融合蛋白。在某些實施例中，本發明提供了本發明之融合蛋白在用於治療糖尿病、肥胖症、異常血脂症或代謝症候群的藥物之製造中的用途，其中該藥物與另一活性成分同時、分開或者按順序地組合投與。
當在本文中使用時，術語「胰島素受體促效劑」係指結合至並且活化胰島素受體，使血糖水平下降及/或抑制肝葡萄糖排出量的蛋白質，該蛋白質的特徵可使用已知技術(諸如在下文描述的研究中說明的那些技術)測試及量測。
本發明之融合蛋白的胰島素受體促效劑部分包括胰島素B鏈之類似物及胰島素A鏈之類似物。當在本文中使用時，術語「胰島素A鏈」及「胰島素B鏈」係指人胰島素分子(CAS No.11061-68-0)的A鏈及B鏈，該人胰島素分子的天然野生型序列為眾所周知的。人胰島素A鏈由21個胺基酸組成，在本文中被稱為A1-A21，具有以下序列：GIVEQCCTSICSLYQLENYCN(SEQ ID NO：13)。
人胰島素B鏈由30個胺基酸組成，在本文中被稱為B1-B30，具有以下序列：FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT(SEQ ID NO：14)。
在人胰島素分子中，A鏈及B鏈藉由兩個二硫鍵CysA7-CysB7與CysA20-CysB19接合。A鏈在CysA6-CysA11處具有鏈內二硫鍵。
為了實現所需的延長之時間作用特性，本發明之融合蛋白中的胰島素受體促效劑必須在循環中保留，並且能夠在延長的時間段內與胰島素受體相互作用。為了使本發明之融合蛋白在循環中保留所需時段，必須使對融合蛋白之清除減少。胰島素清除之兩種主要途徑為腎清除，以及胰島素受體介導的清除。參見Iglesias P等人，《糖尿病， 肥胖與代謝(Diabetes Obes.Metab.)》，2008；10：811-823。為了最小化腎清除，需要具有至少約人血清白蛋白粒徑的流體動力學直徑的分子，並且此類流體動力學直徑在本發明之融合蛋白中由人IgG Fc區提供。關於受體介導之清除，融合蛋白不可在胰島素受體處有效至造成比所期望更快的受體介導之清除，然而該融合蛋白必須足夠有效以在商業上可行的劑量下提供充分的血糖控制。因此，必須小心平衡融合蛋白之效能，並且本發明之融合蛋白的結構使得能夠實現此類平衡。
胰島素分子具有自締合成二聚體及六聚體之傾向。已經針對胰島素之進化上保守、自締合傾向提出了許多用途，包括：(1)在細胞內液泡貯存期間分子之化學及熱穩定化；(2)保護來源於體內原纖化作用的單體胰島素；(3)在細胞內表現期間替代伴護蛋白輔助的穩定化及摺疊；及/或(4)對於分泌輸送(secretory trafficking)為關鍵的。然而，胰島素之活性形式為單體。
胰島素分子之自締合傾向及此類自締合分子之無活性與本發明相關，因為人IgG Fc區亦傾向於自締合而形成二聚體，一般為在鉸鏈區中經由二硫鍵共價締合，並且此類二聚體由本發明之融合蛋白中的人IgG Fc區形成。作為人IgG Fc區二聚化之結果，兩個胰島素受體促效劑「臂」彼此緊鄰，並且由此以相對較高的局部濃度存在。在人胰島素的情況下，此類緊鄰將傾向於促成胰島素部分之自締合或二聚化，從而影響分子活性。具有已經變成自締合或二聚化的胰島素部分臂的Fc融合蛋白二聚體之示意圖提供於圖2之圖解(D)中。胰島素分子之自締合傾向亦可導致來自一個以上Fc融合蛋白二聚體的胰島素部分自締合或者二聚化；具有自締合或二聚化之胰島素部分的兩個Fc融合蛋白二聚體之二聚體的示意圖提供於圖2之圖解(E)中。此外，兩個以上Fc融合蛋白二聚體中的胰島素部分亦可以此方式自締合，而形成例如由三個二聚體組成的三聚體，或者由三個以上二聚體組成的更高等 級的聚合體。
然而，本發明之融合蛋白的胰島素受體促效劑部分具有降低的自締合或者二聚化傾向，因此由本發明之融合蛋白組成的融合蛋白二聚體傾向於促成圖2之圖解(C)中所描繪的結構，與圖2之圖解(D)及(E)中描繪的結構完全不同。因此，雖然本發明提供兩個融合蛋白之二聚體，但是該二聚體中的每一融合蛋白之胰島素受體促效劑「臂」主要維持單體狀態，如例如在圖1之圖解(C)中所描繪的，並且因此更加能夠與胰島素受體相互作用。
在本發明之融合蛋白中，胰島素受體促效劑中胰島素B鏈之類似物包括對人胰島素B鏈之胺基酸序列的一種或多種修飾。特定言之，為了降低胰島素受體促效劑部分之自締合或二聚化傾向，胰島素B鏈類似物包括對人胰島素分子之B鏈的位置B16、B25或者B27-B30處的一種或多種修飾，該等位置在SEQ ID NO：1中分別被表示為位置X4、X5及X6-9。舉例而言：X4(其對應於人胰島素分子之B鏈中的B16)可被修飾成E、Q或H；X5(其對應於人胰島素分子之B鏈中的B25)可被修飾成H；X6(其對應於人胰島素分子之B鏈中的B27)可缺失或被修飾成G、S、H或V；X7(其對應於人胰島素分子之B鏈中的B28)可缺失或被修飾成G、E、K、D、S或H；X8(其對應於人胰島素分子之B鏈中的B29)可缺失或被修飾成G、E、P、Q、D或H；並且X9(其對應於人胰島素分子之B鏈中的B30)可缺失或被修飾成G、S、E或K。除了降低胰島素受體促效劑部分之自締合傾向外，亦可分別對胰島素B鏈類似物上的位置B16及B25-SEQ ID NO：1之X4及X5-進行修飾以調節效能，改良表現，改良化學及/或物理穩定性，改良融合蛋白可與其他常用賦形劑一起製劑之容易度及/或以消除脫醯胺作用。胰島素B鏈類似物亦可包括出於該等原因進行的額外修飾。參照SEQ ID NO：1中的變化，此類額外修飾包括以下：將X1(其對應於人胰島素分子之B鏈中的B1)修飾 成Q或者A；將X2(其對應於人胰島素分子之B鏈中的B2)修飾成G；及/或將X3(其對應於人胰島素分子之B鏈中的B3)修飾成K、D或G。
在某些優選實施例中，胰島素B鏈類似物包括在SEQ ID NO：1之位置X4、X5及X6-9處對人胰島素B鏈之胺基酸序列的一種以上修飾。在一個優選實施例中，X4為E並且X5為H。在某些實施例中，SEQ ID NO：1之X6-X9的胺基酸序列選自由以下項組成的群組：GGES、GGGS、GGDS、GGEG、GGGG、SSES、SSGS、GGEE、GGGE、GGEK、GGGK、TPGS、TGGS、HGES、GHES、GGHS、GGEH、HGGS、GHGS、GGGH、GGDD、VGES、TEET、TKPT、GGGG、TGGG、TPGG、EPKT、TDKT、TPGS、EGGS、EGES、EEES、EPES、EPEP以及GGDD。在優選實施例中，該四個胺基酸之序列為GGGS、GGGG或者TEET。在特別優選的實施例中，X4為E，X5為H並且X6-9為GGGG。
應注意，雖然SEQ ID NO：1之X6-X9如上所述包含胰島素B鏈類似物(Z1)之C末端，但是該等胺基酸對於融合蛋白對胰島素受體的活性並非關鍵的，並且因此可替代地被視為第一肽連接子(Z2)之延伸。舉例而言，在SEQ ID NO：4之情況中，X6-X9可被視為彼胰島素受體促效劑中的胰島素B鏈類似物之組成部分或者第一肽連接子。
在本發明之融合蛋白中，該胰島素受體促效劑部分中的胰島素A鏈類似物可包括對人胰島素A鏈之胺基酸序列的一種或多種修飾，該等修飾意欲改良化學及物理穩定性、調節效能及/或增強表現。參照SEQ ID NO：2中的變化，該等修飾包括以下：將X1(其對應於人胰島素分子之A鏈中的A10)修飾成T；將X2(其對應於人胰島素分子之A鏈中的A14)修飾成D、Q或E；及/或將X3(其對應於人胰島素分子之A鏈中的A21)修飾成G、S或A。在一個優選實施例中，X1為T，X2為D，並且X3為G。
此外，為了避免脫醯胺作用以及化學及/或蛋白水解性裂解，若胰島素受體促效劑中之胰島素A鏈類似物中的位置21處的胺基酸(亦即，SEQ ID NO：2中的X3)為N-在人胰島素分子中的相應位置處存在的胺基酸-則在C末端側處不能緊接某些胺基酸，諸如G或N，或者在某些實施例中P、S、V或L。參見例如Vlasak J,Ionescu R.,MAbs.2011，五月到六月；3(3)：253-63.《單克隆抗體之片段化(Fragmentation of Monoclonal Antibodies)》。應注意，雖然在選擇屬於胰島素A鏈類似物之SEQ ID NO：2中的位置X4及X5的情況下在如上所述的第一融合蛋白中敍述了此要求，但是在被視為胰島素受體促效劑之組成部分的胰島素A鏈類似物中的位置21處的天冬醯胺酸殘基後接非甘胺酸殘基並非為關鍵的，與視為第二肽連接子完全不同。舉例而言，在SEQ ID NO：11的情況下，與A鏈類似物部分中的位置21相對應的殘基由X14表示，並且後接胺基酸X15可被視為胰島素受體促效劑之組成部分或者第二肽連接子。
如上所述，在本發明之融合蛋白中，胰島素B鏈類似物之C末端殘基直接融合至第一肽連接子之N末端殘基，並且第一肽連接子之C末端殘基直接融合至胰島素B鏈類似物之N末端殘基。第一肽連接子必須提供充分的柔性給胰島素A鏈類似物及胰島素B鏈類似物，以實現結合至胰島素受體所必需的結構，但是不能長到過度干擾彼結合。可調節第一肽連接子之長度及組成以便調節融合蛋白之效能及/或表現。在一些實施例中，第一肽連接子為5至10個胺基酸長，該等胺基酸中的至少5個為G殘基。在某些實施例中，第一肽連接子之胺基酸序列選自由以下項組成的群組：GGGGGG、GGGGG、EGGGGG、GEGGGG、GGEGGG、GGGEGG、GGGGEG、GGGGGE、KGGGGG、GKGGGG、GGKGGG、GGGKGG、GGGGKG、GGGGGK、HGGGGG、GHGGGG、GGHGGG、GGGHGG、 GGGGHG、GGGGGH、GGGGGA、GGGGGR、SGGGGG、GSGGGG、GGSGGG、GGSGGGK、GGSGGGG以及GGSGGG。在某些優選實施例中，第一肽連接子之序列包含SEQ ID NO：3。最優選地，第一肽連接子之序列為GGSGGGG(SEQ ID NO：15)。本發明之融合蛋白的胰島素受體促效劑部分亦包括在如上所述的人胰島素分子中存在的二硫鍵，亦即在CysA7-CysB7及CysA20-CysB19處接合胰島素A鏈類似物及胰島素B鏈類似物的兩個二硫鍵；以及在胰島素A鏈類似物中CysA6-CysA11處的鏈內二硫鍵。
如上所述，本發明之融合蛋白的胰島素受體促效劑部分之C末端殘基融合至第二肽連接子之N末端殘基，並且該第二肽連接子之C末端殘基直接融合至Fc部分之N末端殘基。優選地第二肽連接子富含甘胺酸，以提供充分的構象柔性。優選地，第二肽連接子為小於30個胺基酸長。在某些優選實施例中，第二肽連接子為在10與25個胺基酸之間長，其中該等胺基酸中至少50%為甘胺酸殘基。優選的第二肽連接子包括序列(GGGGX15)n，其中X15為Q、E或S並且n=2-5。更優選的第二肽連接子具有SEQ ID NO：6之胺基酸序列。最優選的第二肽連接子具有胺基酸序列GGGGQGGGGQGGGGQGGGGG(SEQ ID NO：7)。
如本文所用，術語「人IgG Fc區域」具有該術語在免疫學領域中通常給定之含義。特別地，此術語係指藉由從抗體移除兩個抗原結合區(Fab片段)獲得的人IgG抗體片段。特定言之，Fc區包括抗體之CH2及CH3恆定區結構域，並且亦可包括一些或者所有鉸鏈區。
如上所述，在本發明之融合蛋白的某些實施例中，人IgG Fc區包含來自IgG抗體的一條重鏈的恆定區之片段，該等片段之示意性描述提供於圖2之圖解(A)中，並且在其他實施例中，人IgG Fc區包含來自IgG抗體之兩條重鏈的恆定區之片段，該等片段之示意性描述提供於圖2之圖解(B)中。在此實施例中，該兩條重鏈之恆定區經由非共價的 相互作用及二硫鍵而彼此締合。
存在四種IgG子類(G1、G2、G3及G4)，該等IgG子類各自具有不同的結構及生物學功能，該等生物學功能被稱為效應物功能。該等效應物功能一般經由與Fc受體(FcγR)相互作用或者藉由結合補體因子C1q來介導。結合至FcγR可導致抗體依賴性的細胞介導之細胞溶解，而結合至補體因子可導致補體介導之細胞溶解。IgG子類之Fc區的結構及性質為本領域中已知的。本發明之融合蛋白可含有來自任何IgG子類的Fc區，但是G2及G4相較於G1及G3抗體具有更低的受體結合及效應物功能活性，因此為優選的。
當在本文中使用時，術語「人IgG Fc區」亦包括此類抗體片段之經修飾、延伸及/或截短以例如改變性質或特徵的版本，該等性質或特徵為諸如補體及/或Fc受體結合功能、效應物功能、二硫鍵形成、糖基化、抗體依賴性之細胞介導的細胞毒性(ADCC)、可製造性及/或穩定性。舉例而言，本發明之融合蛋白的人IgG Fc區可經修飾以減少或移除N-連接的糖基化位點，此將降低C1q結合親和力及細胞毒性，並且此可有助於免疫性，影響構象穩定性及體內清除率及/或改變效應物功能。本發明之融合蛋白的人IgG Fc區亦可將一些或所有鉸鏈區移除，以便簡化二硫鍵介導的Fc二聚化。變化的其他實例包括磷酸化、硫酸化、醯化、糖基化、甲基化、乙醯化、醯胺化及/或能夠產生異二聚體分子的修飾。用於改變IgG子類之人IgG Fc區的結構及性質的技術為本領域中已知的。
無論融合蛋白之最終結構如何，人IgG Fc區必須用於延長胰島素受體促效劑之體內血漿半衰期。在其中Fc部分出於其延長半衰期之能力而被利用的異源Fc融合蛋白的製備中，最小化任何效應物功能為重要的。此外，經融合的胰島素受體促效劑必須保持能夠結合至並且活化胰島素受體，以造成血糖水平之降低及/或肝葡萄糖排出量之抑 制，該經融合的胰島素受體促效劑的特徵可使用已知的技術(諸如在下文所描述的研究中展示的彼等技術)來測試及量測。本發明之融合蛋白的長半衰期可使用例如下文所描述的方法來證明。
一種優選的人IgG Fc區為IgG4 Fc區，該IgG4 Fc區經修飾以進一步降低效應物功能、促進同質二聚體形成並且其鉸鏈之一部分缺失，如SEQ ID NO：9所示，其中X1為F；X2為F；X3為V；X4為V；X5為N；X6為R；並且X7不存在。
另一種優選的人IgG Fc區為IgG2 Fc區，該IgG2 Fc區之鉸鏈的一部分缺失，如SEQ ID NO：10所示，其中X1為F；X2為F；X3為V；X4為V；X5為N；並且X6不存在。
應注意，雖然上文敍述的優選人IgG Fc區之胺基酸序列的鉸鏈區之部分被移除以簡化二硫鍵介導的二聚化，但是在某些實施例中彼等鉸鏈區可存在。舉例而言，野生型IgG2 Fc區在其N末端處包括六個胺基酸組成的序列ERKCCV，並且雖然該等胺基酸在以SEQ ID NO：10給出的IgG2 Fc區序列中未敍述，但是可預期包含以SEQ ID NO：10給出的胺基酸序列的人IgG Fc區可進一步在其N末端處包含由該六個胺基酸組成的序列ERKCCV中的一些或所有胺基酸。類似地，包含以SEQ ID NO：9給出的胺基酸序列的人IgG Fc區可進一步包含在IgG4 Fc區之N末端處存在的六個胺基酸(亦即ESKYGP)的一些或者所有胺基酸。類似地，包含以SEQ ID NO：8給出的胺基酸序列的人IgG Fc區可進一步包含在IgG1 Fc區之N末端處存在的十個胺基酸(亦即EPKSCDKTHT)中的一些或者所有胺基酸。此外，構成第二肽連接子之C末端的胺基酸與構成人IgG Fc區之N末端的胺基酸之間的精確界限劃定(precise delineation)對於本發明之融合蛋白的結構或功能而言並非關鍵的。舉例而言，在SEQ ID NO：11的情況中，與位置X19-X22相對應的殘基可被描述為第二肽連接子之C末端或者人IgG Fc區之N末端延伸。
如上所述，本發明亦係關於編碼本發明之融合蛋白中之任一者的聚核苷酸。編碼上述融合蛋白的聚核苷酸可為RNA或者DNA形式，其包括cDNA及合成DNA，並且其可為雙鏈或單鏈的。編碼本發明之蛋白質的編碼序列可由於遺傳密碼之冗餘或退化而變化。
編碼本發明之融合蛋白的聚核苷酸可包括以下：僅蛋白質之編碼序列，蛋白質及額外編碼序列(諸如前導或分泌序列或者前蛋白序列)之編碼序列；蛋白質及非編碼序列(諸如內含子或蛋白質編碼序列之5'及/或3'端的非編碼序列)之編碼序列。因此，術語「編碼蛋白的聚核苷酸」涵蓋的聚核苷酸可包括不僅蛋白質之編碼序列，還有包括額外編碼及/或非編碼序列的聚核苷酸。
本發明之聚核苷酸將在序列已經有效連接至表現控制序列後在宿主細胞中表達。表現載體一般可在宿主生物體中作為游離基因體或者作為宿主染色體DNA的組成部分來複製。通常，表現載體將含有選擇標記以允許偵測轉化有所需DNA序列的彼等細胞。
本發明之融合蛋白可在以下細胞中輕易產生：哺乳動物細胞，諸如CHO、NSO、HEK293、BHK或者COS細胞；細菌細胞，諸如大腸桿菌(E.coli)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)或者螢光假單胞菌(Pseudomonas fluorescence)；昆蟲細胞，或者真菌或酵母細胞，該等細胞使用本領域中已知的技術培養。然而，昆蟲及酵母或其他真菌細胞產生非人N-聚醣，因此在此類細胞中產生的具有N-連接糖基化的蛋白質若投與至患者則可造成免疫原性反應。此類細胞中的生產由此需要消除N-連接糖基化位點及/或對該等細胞進行基因工程化，以使用本領域中已知的技術來產生人N-聚醣。參見例如Hamilton SR等人，「酵母中複雜人糖蛋白之生產(Production of complex human glycoproteins in yeast)」，301《科學(Science)》(5637)：1244-6(2003年8月)。在哺乳動物細胞中進行生產為優選的，並且優選的哺乳動物宿 主細胞為包含殼胺醯胺合成酶(GS)表現系統的CHOK1SV細胞株(參見美國專利No.5,122,464)。
可藉由眾所周知的方法將包含所關注之聚核苷酸序列的載體(例如，融合蛋白及表現控制序列)轉移至宿主細胞內，該等方法可根據細胞宿主之類型而變化。舉例而言，氯化鈣轉化通常用於原核細胞，而磷酸鈣處理或電穿孔可用於其他細胞宿主。
可採用各種蛋白質純化方法，並且此類方法為本領域中已知的並且描述於例如Deutscher，《酶學方法(Methods in Enzymology)》182：83-89(1990)以及Scopes，《蛋白質純化：原理及實踐(Protein Purification：Principles and Practice)》，第三版，Springer，N.Y.(1994)中。
如上所述，本發明之融合蛋白在某些實施例中作為二聚體產生。在此類二聚體中，融合蛋白之人IgG Fc區域經由非共價相互作用及二硫鍵而彼此締合。此類二聚體之示意圖提供在圖2之圖解(C)中。當組成此類二聚體的兩個融合蛋白-例如，圖2之圖解(C)中描繪的二聚體中的融合蛋白A及融合蛋白B-的胺基酸序列為相同的時，該二聚體在本文中被稱為「同質二聚體」。如上所述，本發明之融合蛋白在哺乳動物細胞中表現為優選的，並且在此類細胞中的表現產生同質二聚體。此類同質二聚體中的融合蛋白經由Fc部分中的非共價相互作用及分子間二硫鍵來締合。舉例而言，由編碼SEQ ID NO：12之融合蛋白的基因產生的蛋白質將為經由鏈內二硫鍵(亦即C80至C80及C83至C83)共價鍵結的同質二聚體。
當組成此類二聚體的兩個融合蛋白-例如，圖2之圖解(C)中的融合蛋白A及融合蛋白B-的胺基酸序列為不同的時，該二聚體在本文中被稱為「異二聚體」。此類異二聚體可藉由本領域中已知的技術來製備。參見例如Lewis SM等人，《自然-生物技術(Nat. Biotechnol.)》，32(2)：191-8(2014)；Carter，《免疫學方法雜誌(J.Immunol.Methods)》，248(1-2)：7-15(2001)；Ridgway，J.B.等人，《蛋白質工程(Protein Eng.)》，9(7)：617-2(1996)。
在本文中所提及的包含融合蛋白的醫藥組合物包括：包含彼融合蛋白之同質二聚體的醫藥組合物及/或包含異二聚體的醫藥組合物，其中該異二聚體的一個成員為彼融合蛋白。類似地，本文所提及的包含投與融合蛋白之方法包括包含以下步驟的方法：投與彼融合蛋白之同質二聚體及/或投與異二聚體，其中該異二聚體中的一個成員為彼融合蛋白。類似地，所提及的用於治療的融合蛋白及/或用於製造藥物的融合蛋白包括：彼融合蛋白之同質二聚體及/或其中一個成員為彼融合蛋白的異二聚體，該同質二聚體及/或異二聚體用於治療及/或藥物製造。
如本文所用的術語「治療」係指管理及護理患有糖尿病或高血糖或者具有其他症狀的患者，對於該等症狀出於對抗或減輕彼等症狀之病徵及併發症的目的而指示投與胰島素。治療包括投與本發明之融合蛋白以預防或延遲病徵或併發症之發作，減輕病徵或併發症，或者消除疾病、症狀或病症。待治療的患者為哺乳動物，並且優選地為人類。
如本文所用的術語「預防」係指降低一種或多種症狀、病徵、併發症或病症之風險或發病率，或者消除或減緩該一種或多種症狀、病徵、併發症或者病症之進展。
本發明之融合蛋白可用於治療患有各種疾病及症狀的受試者。包括患有高血糖、胰島素依賴型糖尿病的受試者及患有非胰島素依賴型糖尿病的受試者，包括治療未接受過治療的受試者(naïve subject)以及正用口服藥物(諸如，磺醯脲、二甲雙胍、噻唑烷二酮如吡格列酮、α-葡糖苷酶抑制劑如阿卡波糖)及/或非胰島素可注射劑(包括基於 腸促胰島素的療法，諸如DPP-4抑制劑及GLP-1R促效劑)治療的受試者。本發明之融合蛋白可用於調節此類患者體內的血糖，並且可治療由於不足的血糖控制導致的症狀或併發症，諸如視網膜病、神經性病變或腎病。
在某些實施例中，將本發明之融合蛋白每天投與、每隔一天投與、每週投與兩次、每週投與三次、每週投與一次、每月投與兩次或者每月投與一次。在優選實施例中，作用持續時間延長至足以允許每週定量給藥一次。然而熟習此項技術者將認識到，甚至對於此類長效分子，亦可藉由使用更頻繁的治療方法(諸如，每日一次)，逐漸劑量累積具有長時藥代動力學特徵的藥物，來提供有效的血糖控制。參見例如Heise T及Meneghini LF，20《內分泌實踐(Endocr.Pract.)》，第75-83頁(2014)。
在某些實施例中，將本發明之融合蛋白與額外的活性成分組合投與，該額外的活性成分為諸如胰島素或胰島素類似物、基於腸促胰島素的療法，或者口服糖尿病藥物(諸如，磺醯脲、二甲雙胍、噻唑烷二酮如吡格列酮，或者α-葡糖苷酶抑制劑如阿卡波糖)。
術語「基於腸促胰島素的療法」包括：包含投與被稱為腸促胰島素的代謝激素群組或者促進、賦能、增強及/或模擬該代謝激素群組之效應的任何治療，該群組包括GLP-1及胃抑制肽(GIP)。當前可用的基於腸促胰島素的療法包括DPP-4抑制劑及GLP-1R促效劑。
「DPP-4抑制劑」為阻斷DPP-4酶的化合物，DPP-4酶負責降解腸促胰島素。當前可用的DPP-4抑制劑包括西他列汀(sitagliptin)(Januvia®)及利格列汀(linagliptin)(Tradjenta®)。
「GLP-1R促效劑」被定義為包含天然人GLP-1之胺基酸序列(SEQ ID NO：25)的化合物，GLP-1類似物，GLP-1衍生物或者GLP-1融合蛋白，其維持對GLP-1受體的活性。GLP-1R活性可藉由本領域中已知的 方法來量測，包括使用量測GLP-1受體結合活性或者受體活化的體內實驗及體外測定，例如採用蘭氏胰島細胞或胰島瘤細胞的測定，分別如EP 619,322及美國專利No.5,120,712所描寫的。GLP-1類似物為相較於天然人GLP-1之胺基酸序列(SEQ ID NO：25)具有修飾的分子，該等修飾包括一種或多種胺基酸取代、缺失、倒位或添加。GLP-1衍生物為具有天然人GLP-1之胺基酸序列(SEQ ID NO：25)或者GLP-1類似物之胺基酸序列，但是另外具有對其胺基酸側基、α-碳原子、末端胺基或者末端羧酸基團的至少一種化學修飾的分子。GLP-1融合蛋白為包含GLP-1、GLP-1類似物或者GLP-1衍生物部分以及第二多肽的異源性蛋白。當前可用的GLP-1R促效劑包括艾塞那肽(Byetta®及Bydureon®)、利拉魯肽(Victoza®)、阿必魯肽(Tanzeum®)以及度拉糖肽(Trulicity®)，該等促效劑的結構為本領域中已知的。參見例如US 5,424,286(艾塞那肽)；US 6,268,343(利拉魯肽)；US 2014044717(阿必魯肽)；以及US 7,452,966(度拉糖肽)。
在其中將本發明之融合蛋白與額外的活性成分組合提供的實施例中，融合蛋白與額外的活性成分可同時投與，連續投與，或者以單一混合的製劑投與。
本發明之融合蛋白可藉由以下方式來有效治療此類疾病及症狀：向需要治療的患者投與治療有效量的本發明之融合蛋白。如本文所用，用語「治療有效量」係指本發明之融合蛋白的量足以調節患者體內的血糖，而不會引起不可接受的副作用。投與至受試者的融合蛋白之治療有效量將取決於疾病之類型及嚴重程度以及受試者之特徵，諸如總體健康、年齡、性別、體重及耐藥性。熟習此項技術者將能夠根據該等及其他因素來確定合適的劑量。在某些實施例中，本發明之融合蛋白每週投與一次時的治療有效量在約0.01nmol/kg至約100nmol/kg的範圍內。更優選地，本發明之融合蛋白每週投與一次時的 治療有效量在約1nmol/kg至約50nmol/kg的範圍內。更優選地，本發明之融合蛋白每週投與一次時的治療有效量在約16nmol/kg至約25nmol/kg的範圍內。在某些實施例中，本發明之融合蛋白每週投與一次時的治療有效量在約1mg至約200mg的範圍內。更優選地，本發明之融合蛋白每週投與一次時的治療有效量在約25mg至約175mg的範圍內。更優選地，本發明之融合蛋白每週投與一次時的治療有效量在約100mg至約160mg的範圍內。
熟習此項技術者將理解當將本發明之融合蛋白與另一種活性成分(諸如，GLP-1R促效劑)組合投與時，可調節劑量以使得該兩種治療之組合活性足以調節患者體內的血糖。因此，以此類組合施加來調節血糖水平所必需的融合蛋白之用量可小於該融合蛋白作為單藥療法投與時所需之用量。舉例而言，當本發明之融合蛋白與GLP-1R促效劑組合提供時，以每週一次之劑量提供的融合蛋白之用量相較於相同融合蛋白用作單藥療法之用量(諸如在前一段中所描述的劑量)可減少多達50%。
優選地，在一些實施例中投與治療有效量的本發明之融合蛋白將提供有效的血糖控制，同時相較於現有治療減少低血糖及/或體重增加之風險。由對胰島素受體有促效作用的糖尿病治療造成的低血糖症之發病率可藉由避免治療劑之濃度在投與後快速飆升(rapid spike)來最小化。本發明之融合蛋白具有延時作用特徵，在投與後濃度不會迅速飆升。
此外，在其中本發明之融合蛋白與另一種活性成分(特別地，GLP-1R促效劑)組合提供的實施例中，本發明之融合蛋白的偏肝臟(hepatopreferential)活性亦可降低低血糖症之風險，同時控制血糖水平。因為本發明之融合蛋白可輕易地穿過有孔血竇內皮進入肝臟，所以該分子可控制肝葡萄糖排出量，對外周具有很少的活性(若有)，同 時GLP-1R促效劑促進來自胰腺的內源性胰島素之葡萄糖依賴型分泌，該內源性胰島素能夠輕易地散佈到外周中以控制肌肉及脂肪中的葡萄糖攝取。
本發明之融合蛋白係以非經腸給藥的，藉由鼻腔給藥或肺部吸入給藥。非經腸給藥為優選的，並且可包括例如全身給藥(systemic administration)，諸如藉由肌內注射、靜脈注射、皮下注射或者腹膜內注射。
可將融合蛋白以醫藥組合物形式投與至受試者，該醫藥組合物包含本發明之融合蛋白以及至少一種醫藥學上可接受的賦形劑。此類醫藥組合物通常本質上是非經腸的(但不必然是)，並且可使用非腸胃產品的習用賦形劑，藉由各種技術中的任一技術來製備，該等技術為本領域中眾所周知的。參見例如，Remington：《藥劑學科學與實踐(Science and Practice of Pharmacy)》(編輯者D.B.Troy，第21版本，Lippincott，Williams & Wilkins，2006)。如上所述，本發明之融合蛋白當在哺乳動物細胞中表現時為同質二聚體。因此，當在本文中使用時，術語「包含融合蛋白的組合物」包括含有融合蛋白之同質二聚體的組合物。在某些實施例中，本發明之醫藥組合物包括其中本發明之融合蛋白以以下濃度存在的組合物：至少1mg/mL，至少2mg/mL，至少5mg/mL，至少10mg/mL，至少20mg/mL，至少25mg/mL，至少30mg/mL，至少35mg/mL，至少50mg/mL，至少55mg/mL，至少50mg/mL，至少65mg/mL，至少75mg/mL，至少100mg/mL或更大。在優選實施例中，融合蛋白以10-100mg/mL之濃度存在。在更優選實施例中，融合蛋白以15-75mg/mL之濃度存在，並且在最優選實施例中，融合蛋白以20-65mg/mL之濃度存在。
術語「賦形劑(excipient)」意謂添加至該組合物中的除了融合蛋白或任何其他額外活性成分以外的任何物質。可在本發明之組合物中 使用的此類賦形劑之實例包括緩衝劑、界面活性劑、等滲劑以及防腐劑。
在某些實施例中，本發明之組合物包括一種或多種緩衝劑來控制組合物之pH。「緩衝劑」為藉由其酸鹼共軛組分的作用來抵抗pH變化的物質。在某些實施例中，本發明之組合物的pH為約5.5至約8.0，優選地在約6.0與約7.4之間，更優選地在約6.0及6.75之間。適用於將本發明之組合物的pH控制在所需範圍內的緩衝劑包括但不限於諸如以下試劑：磷酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽，或其酸，精胺酸、TRIS，以及組胺酸緩衝劑，及其組合。「TRIS」係指2-胺基-2-羥甲基-1,3-丙二醇，及其任何藥理學上可接受的鹽類。游離鹼及鹽酸鹽形式(即，TRIS-HCl)為TRIS的兩種常見形式。TRIS亦在本領域中被稱為三甲醇胺基甲烷、緩血酸胺(tromethamine)，以及三(羥甲基)胺基甲烷。本發明之組合物中的優選緩衝劑為檸檬酸鹽或檸檬酸，以及磷酸鹽。
在某些實施例中，本發明之組合物包括一種或多種等滲劑以最小化注射後由於細胞腫脹(cellular swelling)或者細胞破裂(cellular rupture)導致的疼痛。「等滲劑」為生理學上可耐受並且賦予合適的張力給製劑以防止跨細胞膜的水之淨流與所投與的醫藥組合物接觸的化合物。已知的等滲劑包括甘油、鹽類如氯化鈉，以及單糖，該等單糖包括但不限於甘露醇、右旋糖以及乳糖。優選等滲劑為甘露醇及氯化鈉。
在某些實施例中，本發明之組合物包括界面活性劑。「表面活性劑」為降低液體之表面張力的物質。在醫藥組合物中使用並且可在本發明之某些組合物中使用的界面活性劑之實例包括：聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、聚乙二醇(例如，PEG 400、PEG 3000、TRITON X-100)、聚乙二醇烷基醚(例如，BRIJ)、聚丙二醇、嵌段共聚物(例如，泊洛沙姆，PLURONIC F68；泊洛沙姆407，PLURONIC F127； TETRONICS)、山梨糖醇烷基酯(例如，SPAN)、聚乙氧基蓖麻油(例如，KOLLIPHOR，CREMOPHOR)，以及海藻糖。
本發明之醫藥組合物亦可含有防腐劑。術語「防腐劑」係指添加至醫藥製劑中以充當多用途及/或可滴定組合物中的抗微生物劑的化合物。在本領域中已知的防腐劑中，非經腸製劑中有效及可接受的防腐劑為氯化芣二甲烴銨、苄乙氧銨(benzethonium)、氯己啶、苯酚、間甲酚、苄醇、對羥苯甲酸甲酯或者對羥苯甲酸丙酯、氯代丁醇、鄰甲酚、對甲酚、氯甲酚、硝酸苯汞、硫柳汞、苯甲酸，及其各種混合物。酚類防腐劑包括以下化合物：苯酚、間甲酚、鄰甲酚、對甲酚、氯甲酚、對羥基苯甲酸甲酯，及其混合物。若防腐劑為必需的，則在本發明之組合物中使用的防腐劑優選為酚類防腐劑，優選地為間甲酚或者苯酚。
某些酚類防腐劑，諸如苯酚及間甲酚，已知結合至胰島素及胰島素六聚體並且由此使增強物理或化學穩定性或者該兩者的構象變化穩定化。然而，在包含其他蛋白質的組合物中，此類防腐劑可促成蛋白質聚集體或者高分子量聚合物(HMWP)之形成。參見例如，Maa YF及Hsu CC，《國際製藥學雜誌(Int J Pharm)》，140：155-168(1996)；Fransson J等人，《藥學研究(Pharm.Res.)》，14：606-612(1997)；Lam XM等人，《藥學研究(Pharm.Res.)》，14：725-729(1997)；Remmele RL Jr等人，《藥學研究(Pharm.Res.)》，15：200-208.(1998)；Thirumangalathu R等人，《製藥科學雜誌(J Pharm Sci)》，95：1480-1497(2006)。治療製劑中的此類蛋白質聚集體為非期望的，因為其傾向於誘發免疫反應。
在某些優選實施例中，優化本發明之融合蛋白的胺基酸序列以增強亦含有酚類防腐劑之組合物中的融合蛋白之物理穩定性。舉例而言，本發明人意外地發現，胰島素A鏈類似物中的位置10(SEQ ID NO：2所示的胰島素A鏈類似物中的可變X1)處的胺基酸突變的存在減少了酚類防腐劑存在下融合蛋白聚集體的積聚，如以下的穩定性研究所示。
本發明藉由以下實例進一步說明，但是該等實例不應被視為限制。
融合蛋白之表現及純化
本發明之融合蛋白係使用CHO殼胺醯胺合成酶(GS)敲除(GSKO)細胞株在哺乳動物細胞表現系統中產生的。GS基因敲除藉由消除會允許低生產性或非生產性細胞在選擇條件下存活的內源GS本底活性來實現加嚴的選擇嚴格性。將編碼融合蛋白的基因次選殖至含有殼胺醯胺合成酶(GS)的表現質粒內。將編碼融合蛋白的cDNA序列與增強融合蛋白到細胞培養基內之分泌的信號肽之編碼序列同框(in frame)融合。表現由巨細胞病毒(CMV)啟動子驅動。使用電穿孔及適量重組表現質粒來穩定地轉染CHO GSKO細胞。
經轉染細胞在無殼胺醯胺的培養基中經歷混合選擇(bulk selection)。將經轉染的細胞集合體以低密度平板接種，以允許穩定表現細胞近純系生長(close-to-clonal outgrowth)。篩選主要孔的融合蛋白表現，在用於生產的無血清懸浮培養物中按比例擴大。
可藉由蛋白A親和層析繼之以按照標準層析技術的尺寸排除層析來純化分泌到培養基中的融合蛋白。簡言之，藉由已經用pH為7.4的磷酸鹽緩衝鹽水平衡過的Mab選擇蛋白A(GE)來捕獲來自澄清培養基的融合蛋白。在使用pH為7.4的磷酸鹽緩衝鹽水的洗滌步驟之後，用pH為3.0的10mM檸檬酸溶離所結合的融合蛋白。彙集含有融合蛋白的級分，藉由添加1/10體積的pH為8.0的1M Tris來中和該等級分。可溶的聚集體及多聚體可藉由常用技術來有效地移除，該等常用技術包括尺寸排除、疏水性相互作用或者離子交換層析。將如藉由尺寸排除 層析所確定的含有單體融合蛋白(共價連接的同質二聚體)的級分彙集、滅菌過濾，並且儲存。
本發明之示例性融合蛋白的胺基酸序列如下所示：
實例1：
(SEQ ID NO：12)
實例2：
(SEQ ID NO：16)
實例3：
(SEQ ID NO：17)
實例4：
(SEQ ID NO：18)
實例5：
(SEQ ID NO：19)
實例6
(SEQ ID NO：20)
實例7
(SEQ ID NO：21)
實例8
(SEQ ID NO：22)
實例9
(SEQ ID NO：23)
實例10
(SEQ ID NO：24)
試管內活性
在磷酸鹽緩衝鹽水(PBS，pH 7.4)或者10mM檸檬酸鹽緩衝液(pH 6.5)中製備實例1-3、5及9的測試批次(Test-lots)，在4℃下儲存。在0.01N HCl中製備生物合成的人胰島素(禮來公司(Eli Lilly and Company))，作為冷凍等分試樣儲存，或者在含有間甲酚、鋅、氯化鈉及TRIS緩衝液(pH 7.3)的配製混合物中以100單位/毫升的濃度製備生物合成的人胰島素(禮來公司(Eli Lilly and Company))，在4℃下儲存。
以在P1膜上執行的受體結合測定來測定融合蛋白的親和力，該P1膜用過表達在C末端含有C9表位標籤的人胰島素受體異型體A(hIR-A)或人胰島素受體異型體B(hIR-B)的穩定轉染之293EBNA細胞(表達EBNA-1的293HEK人胚腎細胞)製備。根據使用人重組體(3-[125I]-碘酪胺醯-A14)-胰島素在穩態下執行的競爭性放射配體結合測定法來測定結合親和力。測試樣品的值被計算為相對於未標記人胰島素之活性的百分比。根據4參數邏輯的非線性回歸分析法(XLFit版本4.0，IDBS)測定IC50值。若必要，則將曲線頂端或底端參數分別設定為100或者0。
親和常數(Ki)為基於方程式Ki=IC50/(1+D/Kd)從IC50值計算的，其中D等於在實驗中使用的放射配體的濃度，並且Kd等於該放射配體對其關聯受體(cognate receptor)的平衡結合親和力常數，Kd為根據飽 和結合分析測定的(hIR-A=0.205nM；hIR-B=0.251nM)。Ki的報告值顯示為幾何平均數±平均值標準誤差(SEM)，其中平行測定的次數用「n」指示(表1)。
所例示的融合蛋白對hIR-A及hIR-B兩者皆具有親和力。相較於人胰島素，所例示的融合蛋白表現出對hIR-A及hIR-B降低的結合親和力(表1)。
Ki值為幾何平均數。SEM為平均值標準誤差。n為觀測次數。
體內研究 用鏈佐黴素(STZ)處理過的大鼠糖尿病模型中之研究
在用STZ處理過的大鼠糖尿病模型中探查融合蛋白之效應。將體重400-425公克的雄性Sprague-Dawley大鼠用異氟烷麻醉，並給予單次注射Zanosar®(STZ產品編號89256，Teva Parenteral Medicines公司，40mg/kg IV)。在注射Zanosar® 3天後將大鼠用於研究中；僅將非禁食血糖在400-550mg/dL之間的動物用於該等研究中。
將該等大鼠分組以提供相當的血糖及體重變化，隨後進行隨機化分組。使用Accucheck Aviva糖度計(Roche公司)量測血糖。給予用STZ處理過的大鼠單次皮下(SC)注射30nmol/kg的劑量。
藉由尾部取血來收集用於葡萄糖量測的血樣。在整個實驗過程中動物自由攝入食物及水。血糖資料提供於圖1中。圖1示出的資料為平均值±SEM(對於實例1及8，n=6；對於剩餘的實例，n=3)。收集初 始喂飼期(在0及24小時之間)期間的時間點之血糖資料，但是為了便於直觀表示該血糖資料不包括在圖1中。如圖1所示，實例1-10各自提供血糖下降達延長時段。
實例1、3-6及9-10的藥代動力學特性亦在向如上所述用STZ處理過的大鼠進行皮下注射(SC)定量給藥後進行鑑定。資料係使用胰島素受體ELISA測定產生的，該胰島素受體ELISA測定需要能夠結合胰島素受體的胰島素之存在。胰島素受體ELISA利用如所捕獲的人胰島素受體(R&D Systems#1544-IR/CF aa28-944)。人胰島素受體藉由小鼠抗6x HisTag抗體(Novagen 70796)附接至Immunlon 4 HBX平板。將融合蛋白標準曲線及樣品以100%大鼠K3 EDTA血漿稀釋，用小鼠抗人IgG Fc辣根過氧化物酶(SouthernBiotech 9040-05)偵測。在336小時時間點處實例3-6及9-10的濃度皆在22.1±9.8mg/mL及1498±690mg/mL之間。表3顯示實例1隨著時間推移的濃度，並且表4顯示在對實例1的資料進行非隔室模型分析(non-compartmental analysis)後獲得的藥代動力學參數。該資料證明本發明之融合蛋白具有延長的生物有效度持續時間。
資料表示n=3時的平均值及標準偏差。
資料表示n=3時的平均值及標準偏差。縮寫：AUC0-∞-從0至無窮大的曲線情況下的面積，C最大-最大濃度，T最大-最大濃度處的時間，CL-清除率，F-生物有效度，t1/2-半衰期。
對正常大鼠的血糖正常夾鉗研究
執行對雄性Sprague-Dawley大鼠的血糖正常夾鉗研究以瞭解實例1在葡萄糖利用方面的整體體內活性並且以測定實例1在肝臟中對照外周組織中的活性。對長期插管、禁食隔夜的大鼠開始3-3H-葡萄糖之大劑量/連續輸注，以測定基礎條件下的內源葡萄糖生產(EGP)。隨後投與測試製品-7nmol/kg[大劑量]及1nmol/kg/hr[連續速率]-大劑量/連續的靜脈輸注或者胰島素lispro對照品(comparator)-[非大劑量]及0.75mU/kg/min[連續速率]，並且開始及定期調節20%葡萄糖之可變靜脈輸注，以將血糖濃度維持在100-110mg/dL。選擇大劑量/輸注速率以使每組中在血糖正常夾鉗條件下實現相當的葡萄糖輸注速率(GIR)及相當的EGP抑制。投與生長素抑制因子以抑制內源胰島素之分泌。在實驗期間獲取動脈血樣品以監測血球比容、血漿胰島素及游離脂肪酸、C-肽，以及基礎及夾鉗EGP。在實驗結束時，投與2-[1-14C]-脫氧葡萄糖以量測穩態葡萄糖濃度下的組織葡萄糖攝取。在該等匹配條件下，將測試製品及對照品的外周活性作為比目魚肌中的葡萄糖攝取及對血漿游離脂肪酸(FFA)之抑制來分析。使用單向方差分析，利用杜納氏事後檢定(Dunnett's post-hoc test)，使用胰島素lispro群組作為對照組(control comparator)來分析所有資料。
實例1的大劑量及輸注劑量導致在夾鉗實驗的過程中274±57nM之穩定的血漿濃度。如表5所示，兩個動物群組皆在實驗之夾鉗階段 期間實現了相當的GIR。實例1群組中的平均血糖略高於胰島素lispro群組。兩個群組具有類似的基礎及夾鉗EGP速率(表5)。此外，在實例1群組中相對於基礎EGP的變化百分比與胰島素lispro對照群組相當(表5)。為了評定等效夾鉗條件下的外周活性，量測對血漿FFA的抑制以及肌肉葡萄糖攝取。然而胰島素lispro導致夾鉗實驗過程中血漿FFA水平下降，實例1則不會(表5)。此外，實例1之輸注導致比目魚肌中的葡萄糖攝取相較於胰島素lispro下降33%(表5)。總而言之，該等資料指示實例1相較於胰島素lispro表現出降低的外周活性。
值表示為胰島素lispro的13個動物以及實例1的17個動物的平均值±SEM。Rg=葡萄糖代謝指數。統計分析係藉由單向ANOVA繼之以杜納氏事後檢定完成的。*=顯著不同於胰島素lispro(p<0.05)。
對食蟹猴(Cynomolgus Monkeys)的體內功效
在對食蟹猴投與1.5nmol/kg之單次靜脈注射劑量及3nmol/kg之單次皮下注射劑量後評估實例1的藥代動力學(PK)參數。在3週過程中，從每群組/途徑三個動物收集用於PK分析的血漿樣品。利用以下兩種測定法來進行PK分析：胰島素受體ELISA及總IgG Fc ELISA。胰島素受體ELISA利用如所捕獲的人胰島素受體(R&D Systems1544-IR/CF)。人胰島素受體藉由小鼠抗HisTag抗體(Novagen 70796)附接至Immunlon 4 HBX平板。將實例1標準曲線及樣品以100%食蟹猴血漿(抗凝劑為K3 EDTA)稀釋，用小鼠抗人IgG Fc辣根過氧化物酶 (SouthernBiotech 9040-05)偵測。總IgG ELISA利用抗人IgG2(Abcam ab1933)作為捕獲試劑。將實例1用100%食蟹猴血漿稀釋，並且偵測抗體與胰島素受體ELISA中的相同。兩個測定的結果顯示在表6中，並且相關聯的PK參數顯示在表7中。實例1在猴子體內表現出完全生物有效度，並且有效胰島素測定及總Fc測定給出類似的結果。
資料表示n=3時的平均值及標準偏差。縮寫：IV=靜脈注射；SD=標準偏差；NC=未計算
資料表示n=3時的平均值及標準偏差。縮寫：AUC0-無窮大-從0至 無窮大的曲線情況下的面積，C最大-最大的濃度(對於IV投與，C最大被推知為時間0處的濃度)，T最大-最大濃度處的時間，CL-清除率，F-生物有效度，t1/2-半衰期，Vss-穩態分佈體積NA-不適用。
穩定性 實例1的非保藏性65mg/mL調配物
將實例1以65mg/mL之濃度在10mM檸檬酸鹽、46.4mg/mL甘露醇、0.02%聚山梨醇酯80(pH 6.5)中調配，在30℃下儲存。在0、2及4週時藉由注射1μL的65mg/mL樣品藉由尺寸排除層析(SEC)分析樣品的高分子量百分比。在裝備有TSKgel SuperSW3000(Tosoh Bioscience公司)柱及以0.4mL/min流動的50mM磷酸鈉、300mM NaCl(pH 7.0)流動相的Agilent 1100系統上執行分析性SEC歷時15分鐘。在280nm的吸光度下偵測峰，並且使用ChemStation軟件分析層析圖。零時的高分子量百分比為1.13%，兩週時的高分子量百分比為1.68%，並且四週時的高分子量百分比為1.74%。該等結果表明實例1在65mg/mL濃度時的穩定性，其中在30℃下4週後具有最小的可溶聚集體生長。
實例1及3的保藏及非保藏1mg/mL調配物
實例1及3在存在或不存在30mM間甲酚的情況下在10mM檸檬酸鹽(pH 6.5)中以1mg/mL濃度調配，在30℃下儲存。在0及2週時藉由注射10μL的1mg/mL樣品藉由尺寸排除層析(SEC)分析樣品的高分子量百分比。在裝備有TSKgel G3000SWx1(Tosoh Bioscience公司)柱及以0.5mL/min流動的PBS+350mM NaCl(pH 7.4)，流動相的Agilent 1100系統上分別對存在或不存在間甲酚的情況下的樣品執行分析性SEC歷時35分鐘或45分鐘。在214nm的吸光度下偵測峰，並且使用ChemStation軟件分析層析圖。對於實例3，在不具有及具有間甲酚的情況下，零時的高分子量百分比分別為0.2%及3.06%。在不具有及具有間甲酚的情況下，2週時的高分子量百分比分別為0.2%及1.73%。 該等結果表明對於實例3在零時添加間甲酚後可溶聚集體直接增多。對於實例1，在不存在及存在間甲酚的情況下，零時的高分子量百分比分別為0.16%及0.15%。在不存在及存在間甲酚的情況下，2週時的高分子量百分比分別為0.18%及0.31%。該等結果表明在防腐劑的存在下實例1的穩定性，實例1包括在胰島素A鏈類似物中的位置10(SEQ ID NO：2中的可變X1，如上所述的第一融合蛋白中的Z3)處的胺基酸修飾成T殘基，與實例3形成對比，實例3在彼位置處包括天然I殘基，但其另外包含與實例1相同的胰島素受體促效劑胺基酸序列。
序列
SEQ ID NO：1-胰島素B鏈類似物
X1X2X3QHLCGSHLVEALX4LVCGERGFX5YX6X7X8X9
其中X1為F、Q或A；X2為V或G；X3為N、K、D、G、Q、A或E；X4為E、Y、Q或H；X5為H或F；X6為G、T、S、H、V或不存在；X7為G、E、P、K、D、S、H或者不存在；X8為G、E、K、P、Q、D、H或者不存在；X9為G、T、S、E、K、A或者不存在，其限制條件為該胰島素B鏈類似物包括對人胰島素分子之B鏈的胺基酸序列之X4、X5、X6、X7、X8或者X9處的至少一種修飾
SEQ ID NO：2-胰島素A鏈類似物
GIVEQCCTSX1CSLX2QLENYCX3X4
X1為T或I；X2為D、Y、Q或E；X3為G、N、S或A；並且X4為任何天然存在的胺基酸或者不存在，其限制條件為若X3為N，則X4必須為除G或N以外的胺基酸
SEQ ID NO：3-第一肽連接子
X1GX2GGGG，其中X1為G或者不存在；並且X2為G、S或者不存在
SEQ ID NO：4-胰島素受體促效劑
X1X2X3QHLCGSHLVEALX4LVCGERGFX5YX6X7X8X9X10GX11GGGGGIVEQCCTSX12CSLX13QLENYCX14X15
其中X1為F、Q或A；X2為V或G；X3為N、K、D、G、Q、A或E；X4為E、Y、Q或H；X5為H或F；X6為G、T、S、H、V或不存在；X7為G、E、P、K、D、S、H或者不存在；X8為G、E、K、P、Q、D、H或者不存在；X9為G、T、S、E、K、A或者不存在；X10為G或者不存在；X11為G、S或者不存在；X12為T或者I；X13為D、Y、Q或者E；X14為G、N、S或者A；並且X15為任何天然存在的胺基酸或者不存在，其限制條件為X4、X5、X6、X7、X8或者X9中的至少一者必須為與在人胰島素分子之B鏈的位置B16、B25、B27、B28、B29或者B30處分別發現的胺基酸不同的胺基酸，並且進一步限制條件為若X14為N，則X15必須為除G或者N以外的胺基酸
SEQ ID NO：5-胰島素受體促效劑
FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLDQLENYCG
SEQ ID NO：6-第二肽連接子
GGGGX1GGGGX2GGGGX3GGGGX4X5X6
其中X1為Q或E；X2為Q或E；X3為Q或E；X4為G、E、Q或者不存在；X5為G或者不存在；並且X6為G或者不存在
SEQ ID NO：7-第二肽連接子
GGGGQGGGGQGGGGQGGGGG
SEQ ID NO：8-人IgG Fc區
其中X1為F、Q或E；X2為F、Q或E；X3為V或T；X4為V或T；X5為N、D或Q；並且X6為K或者不存在
SEQ ID NO：9-人IgG Fc區域
其中X1為F、Q或E；X2為F、Q或E；X3為V或T；X4為V或T；X5為N、D或Q；X6為R或K；X7為K或者不存在
SEQ ID NO：10-人IgG Fc區
其中X1為F、Q或E；X2為F、Q或E；X3為V或T；X4為V或T；X5為N、D或Q；並且X6為K或者不存在
SEQ ID NO：11-融合蛋白
其中X1為F、Q或A；X2為V或G；X3為N、K、D、G、Q、A或E；X4為E、Y、Q或H；X5為H或F；X6為G、T、S、H、V或不存在；X7為G、E、P、K、D、S、H或者不存在；X8為G、E、K、P、Q、D、H或者不存在；X9為G、T、S、E、K、A或者不存在，其限制條件為X4、X5、X6、X7、X8或者X9中的至少一者為除了在人胰島素B鏈的位置B16、B25、B27、B28、B29或者B30處分別存在的胺基酸以外的胺基酸；X10為G或者不存在；X11為G、S或者不存在；X12為T或I；X13 為D、Y、Q或E；X14為G、N、S或A；X15為任何天然存在的胺基酸或者不存在，其限制條件為若X14為N，則X15必須為除G或N以外的胺基酸；X16為Q或E；X17為Q或E；X18為Q或E；X19為G、E、Q或者不存在；X20為G或者不存在；X21為G或者不存在；X22為E或P；X23為E或P；X24為A或V；X25為G或者不存在；X26為Q或H；X27為Y或F；X28為L或V；X29為S或A；X30為S或P，X31為A或T；X32為Q或R；X33為V或M；X34為R或K；X35為E或Q；並且X36為L或P
SEQ ID NO：12-融合蛋白
SEQ ID NO：13-人胰島素A鏈
GIVEQCCTSICSLYQLENYCN
SEQ ID NO：14-人胰島素B鏈
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT
SEQ ID NO：15-第一肽連接子
GGSGGGG
SEQ ID NO：16-融合蛋白
SEQ ID NO：17-融合蛋白
SEQ ID NO：18-融合蛋白
SEQ ID NO：19-融合蛋白
SEQ ID NO：20-融合蛋白
SEQ ID NO：21-融合蛋白
SEQ ID NO：22-融合蛋白
SEQ ID NO：23-融合蛋白
SEQ ID NO：24-融合蛋白
SEQ ID NO：25-GLP-1
HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG
圖1. 圖1提供本發明之示例性融合蛋白在用鏈佐黴素(STZ)治療之大鼠糖尿病模型中的藥效動力學資料。
圖2. 圖2提供本文描述之蛋白質的構造示意圖。應注意，在圖2 中的圖解中使用的特定形狀(例如，橢圓形、半圓形等等)並非意欲描述或表徵，並且不應用於解釋本發明之融合蛋白的個別部件之含義或結構。
<110> 美國禮來大藥廠
<120> 融合蛋白
<150> 62/158079
<151> 2015-05-07
<160> 25
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (1)..(1)
<223> 位置1之Xaa為Phe,Gln或Ala
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (2)..(2)
<223> 位置2之Xaa為Val或Gly
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (3)..(3)
<223> 位置3之Xaa為Asn,Lys,Asp,Gly,Gln,Ala或Glu
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (16)..(16)
<223> 位置16之Xaa為Glu,Tyr,Gln或His
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (25)..(25)
<223> 位置25之Xaa為His或Phe
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (27)..(27)
<223> 位置27之Xaa為Gly,Thr,Ser,His,Val或不存在
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (28)..(28)
<223> 位置28之Xaa為Gly,Glu,Pro,Lys,Asp,Ser,His或不存在
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (29)..(29)
<223> 位置29之Xaa為Gly,Glu,Lys,Pro,Gln,Asp,His或不存在
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (30)..(30)
<223> 位置30之Xaa為Gly,Thr,Ser,Glu,Lys,Ala或不存在
<400> 1
<210> 2
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (10)..(10)
<223> 位置10之Xaa為Thr或Ile
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (14)..(14)
<223> 位置14之Xaa為Asp,Tyr,Gln或Glu
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (21)..(21)
<223> 位置21之Xaa為Gly,Asn,Ser或Ala
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (22)..(22)
<223> 位置22之Xaa為任何自然存在胺基酸或不存在
<400> 2
<210> 3
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (1)..(1)
<223> 位置1之Xaa為Gly或不存在
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (3)..(3)
<223> 位置3之Xaa為Gly,Ser或不存在
<400> 3
<210> 4
<211> 59
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (1)..(1)
<223> 位置1之Xaa為Phe,Gln或Ala
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (2)..(2)
<223> 位置2之Xaa為Val或Gly
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (3)..(3)
<223> 位置3之Xaa為Asn,Lys,Asp,Gly,Gln,Ala或Glu
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (16)..(16)
<223> 位置16之Xaa為Glu,Tyr,Gln或His
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (25)..(25)
<223> 位置25之Xaa為His或Phe
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (27)..(27)
<223> 位置27之Xaa為Gly,Thr,Ser,His,Val或不存在
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (28)..(28)
<223> 位置28之Xaa為Gly,Glu,Pro,Lys,Asp,Ser,His或不存在
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (29)..(29)
<223> 位置29之Xaa為Gly,Glu,Lys,Pro,Gln,Asp,His或不存在
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (30)..(30)
<223> 位置30之Xaa為Gly,Thr,Ser,Glu,Lys,Ala或不存在
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (31)..(31)
<223> 位置31之Xaa為Gly或不存在
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (33)..(33)
<223> 位置33之Xaa為Gly,Ser或不存在
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (47)..(47)
<223> 位置47之Xaa為Thr或Ile
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (51)..(51)
<223> 位置51之Xaa為Asp,Tyr,Gln或Glu
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (58)..(58)
<223> 位置58之Xaa為Gly,Asn,Ser或Ala
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (59)..(59)
<223> 位置59之Xaa為任何自然存在之胺基酸或不存在
<400> 4
<210> 5
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 5
<210> 6
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (5)..(5)
<223> 位置5之Xaa為Gln或Glu
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (10)..(10)
<223> 位置10之Xaa為Gln或Glu
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (15)..(15)
<223> 位置15之Xaa為Gln或Glu
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (20)..(20)
<223> 位置20之Xaa為Gly,Glu,Gln或不存在
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (21)..(21)
<223> 位置21之Xaa為Gly或不存在
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (22)..(22)
<223> 位置21之Xaa為Gly或不存在
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (22)..(22)
<223> 位置22之Xaa為Gly或不存在
<400> 6
<210> 7
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 7
<210> 8
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (16)..(16)
<223> 位置16之Xaa為Phe,Gln或Glu
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (18)..(18)
<223> 位置18之Xaa為Phe,Gln或Glu
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (37)..(37)
<223> 位置37之Xaa為Val或Thr
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (39)..(39)
<223> 位置39之Xaa為Val或Thr
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (72)..(72)
<223> 位置72之Xaa為Asn,Asp或Gln
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (222)..(222)
<223> 位置222之Xaa為Lys或不存在
<400> 8
<210> 9
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (17)..(17)
<223> 位置17之Xaa為Phe,Gln或Glu
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (19)..(19)
<223> 位置19之Xaa為Phe,Gln或Glu
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (38)..(38)
<223> 位置38之Xaa為Val或Thr
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (40)..(40)
<223> 位置40之Xaa為Val或Thr
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (73)..(73)
<223> 位置73之Xaa為Asn,Asp或Gln
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (185)..(185)
<223> 位置185之Xaa為Arg或Lys
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (223)..(223)
<223> 位置223之Xaa為Lys或不存在
<400> 9
<210> 10
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (16)..(16)
<223> 位置16之Xaa為Phe,Gln或Glu
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (18)..(18)
<223> 位置18之Xaa為Phe,Gln或Glu
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (37)..(37)
<223> 位置37之Xaa為Val或Thr
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (39)..(39)
<223> 位置39之Xaa為Val或Thr
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (72)..(72)
<223> 位置72之Xaa為Asn,Asp或Gln
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (222)..(222)
<223> 位置222之Xaa為Lys或不存在
<400> 10
<210> 11
<211> 303
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (1)..(1)
<223> 位置1之Xaa為Phe,Gln或Ala
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (2)..(2)
<223> 位置2之Xaa為Val或Gly
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (3)..(3)
<223> 位置3之Xaa為Asn,Lys,Asp,Gly,Gln,Ala或Glu
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (16)..(16)
<223> 位置16之Xaa為Glu,Tyr,Gln或His
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (25)..(25)
<223> 位置25之Xaa為His或Phe
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (27)..(27)
<223> 位置27之Xaa為Gly,Thr,Ser,His,Val或不存在
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (28)..(28)
<223> 位置28之Xaa為Gly,Glu,Pro,Lys,Asp,Ser,His或不存在
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (29)..(29)
<223> 位置29之Xaa為Gly,Glu,Lys,Pro,Gln,Asp,His或不存在
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (30)..(30)
<223> 位置30之Xaa為Gly,Thr,Ser,Glu,Lys,Ala或不存在
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (31)..(31)
<223> 位置31之Xaa為Gly或不存在
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (33)..(33)
<223> 位置33之Xaa為Gly,Ser或不存在
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (47)..(47)
<223> 位置47之Xaa為Thr或Ile
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (51)..(51)
<223> 位置51之Xaa為Asp,Tyr,Gln或Glu
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (58)..(58)
<223> 位置58之Xaa為Gly,Asn,Ser或Ala
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (59)..(59)
<223> 位置59之Xaa為任何自然存在之胺基酸或不存在
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (64)..(64)
<223> 位置64之Xaa為Gln或Glu
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (69)..(69)
<223> 位置69之Xaa為Gln或Glu
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (74)..(74)
<223> 位置74之Xaa為Gln或Glu
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (79)..(79)
<223> 位置79之Xaa為Gly,Glu,Gln或不存在
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (80)..(80)
<223> 位置80之Xaa為Gly或不存在
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (81)..(81)
<223> 位置81之Xaa為Gly或不存在
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (82)..(82)
<223> 位置82之Xaa為Glu或Pro
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (90)..(90)
<223> 位置90之Xaa為Glu或Pro
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (91)..(91)
<223> 位置91之Xaa為Ala及Val
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (94)..(94)
<223> 位置94之Xaa為Gly或不存在
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (125)..(125)
<223> 位置125之Xaa為Gln或His
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (157)..(157)
<223> 位置157之Xaa為Tyr或Phe
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (166)..(166)
<223> 位置166之Xaa為Leu或Val
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (187)..(187)
<223> 位置187之Xaa為Ser或Ala
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (188)..(188)
<223> 位置188之Xaa為Ser或Pro
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (196)..(196)
<223> 位置196之Xaa為Ala或Thr
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (212)..(212)
<223> 位置212之Xaa為Gln或Arg
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (254)..(254)
<223> 位置254之Xaa為Val或Met
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (266)..(266)
<223> 位置266之Xaa為Arg或Lys
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (276)..(276)
<223> 位置276之Xaa為Glu或Gln
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (302)..(302)
<223> 位置302之Xaa為Leu或Pro
<400> 11
<210> 12
<211> 299
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 12
<210> 13
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人
<400> 13
<210> 14
<211> 30
<212> PRT
<213> 智人
<400> 14
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 15
<210> 16
<211> 300
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 16
<210> 17
<211> 302
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 17
<210> 18
<211> 297
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 18
<210> 19
<211> 302
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 19
<210> 20
<211> 302
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 20
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 23
<210> 24
<211> 299
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 24
<210> 25
<211> 31
<212> PRT
<213> 智人
<400> 25

Claims (37)

  1. 一種融合蛋白，其包含：a)胰島素受體促效劑，其具有通式Z1-Z2-Z3，其中：i)Z1為胰島素B鏈類似物，包含以下胺基酸序列：X1X2X3QHLCGSHLVEALX4LVCGERGFX5YX6X7X8X9其中X1為F或A；X2為V或G；X3為N或G；X4為E或Y；X5為H或F；X6為G或T；X7為G、E或P；X8為G、E或K；X9為G或T，其限制條件為該胰島素B鏈類似物包括在X4、X5、X6、X7、X8或者X9處對人胰島素分子之B鏈的胺基酸序列的至少一種修飾(SEQ ID NO：1)；ii)Z2為包含5至10個胺基酸的第一肽連接子，其中該等胺基酸中的至少5個胺基酸為G殘基；並且iii)Z3為胰島素A鏈類似物，其包含以下胺基酸序列：GIVEQCCTSX1CSLX2QLENYCX3X4其中X1為T或I；X2為D或Y；X3為G；並且X4為G；b)第二肽連接子；以及c)人IgG Fc區；其中該胰島素受體促效劑的C末端殘基直接融合至該第二肽連接子的N末端殘基，並且該第二肽連接子的C末端殘基直接融合至該人IgG Fc區的N末端殘基。
  2. 如請求項1之融合蛋白，其中：該胰島素B鏈類似物包括在SEQ ID NO：1之X4或者X5處對該人胰島素B鏈的胺基酸序列的至少一種修飾；以及該胰島素A鏈類似物包括在SEQ ID NO：2之X1或者X2處對該人胰島素A鏈的胺基酸序列的至少一種修飾。
  3. 如請求項1或2中任一項之融合蛋白，其中：該胰島素B鏈類似物包含SEQ ID NO：1之序列，其中：X1為F；X2為V；X3為N；X4為E；X5為H；並且該胰島素A鏈類似物包含SEQ ID NO：2之序列，其中：X1為I或T；X2為D；X3為G；並且X4為G。
  4. 如請求項1或2之融合蛋白，其中該胰島素B鏈類似物包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列，其中X6-X9各自為G。
  5. 如請求項1或2之融合蛋白，其中該第一肽連接子包含以下胺基酸序列：X1GX2GGGG其中X1為G或者不存在；並且X2為G、S或者不存在(SEQ ID NO：3)。
  6. 如請求項5之融合蛋白，其中SEQ ID NO：3中的X1及X2分別為G及S。
  7. 如請求項1或2之融合蛋白，其中該胰島素受體促效劑具有以下胺基酸序列：FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLDQLENYCG(SEQ ID NO：5)。
  8. 如請求項1或2之融合蛋白，其中該第二肽連接子為具有10與25個之間的胺基酸的肽，其中該等胺基酸中的至少50%為G殘基。
  9. 如請求項1或2之融合蛋白，其中該第二肽連接子包含具有以下序列的肽：[GGGGX] n ，其中X為Q、E或S；並且其中 n 為2-5。
  10. 如請求項1或2之融合蛋白，其中該第二肽連接子包含以下胺基酸序列：GGGGX1GGGGX2GGGGX3GGGGX4X5X6 X1為Q或E X2為Q或E X3為Q或E X4為G、E、Q或者不存在X5為G或者不存在；並且X6為G或者不存在(SEQ ID NO：6)。
  11. 如請求項1或2之融合蛋白，其中該第二肽連接子具有以下胺基酸序列：GGGGQGGGGQGGGGQGGGGG(SEQ ID NO：7)。
  12. 如請求項1或2之融合蛋白，其中該人IgG Fc區為來源於IgG1、IgG2或者IgG4的Fc區。
  13. 如請求項1或2之融合蛋白，其中該人IgG Fc區包含選自由以下各項組成的群組的胺基酸序列：SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9以及SEQ ID NO：10。
  14. 一種融合蛋白，該融合蛋白具有SEQ ID NO：12之胺基酸序列。
  15. 如請求項1、2及14中任一項之融合蛋白，該融合蛋白用於療法中。
  16. 如請求項1、2及14中任一項之融合蛋白，該融合蛋白用於治療糖尿病。
  17. 如請求項1、2及14中任一項之融合蛋白，該融合蛋白係與額外的活性成分以同時、分開或者連續方式組合使用。
  18. 如請求項1、2及14中任一項之融合蛋白，該融合蛋白係與度拉糖肽(dulaglutide)以同時、分開或者連續方式組合使用。
  19. 一種同質二聚體，其為如請求項1至14中任一項之兩個融合蛋白的同質二聚體。
  20. 如請求項19之同質二聚體，該同質二聚體係與度拉糖肽以同時、分開或者連續方式組合使用。
  21. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至14中任一項之融合蛋白，或者如請求項19之同質二聚體，以及至少一種賦形劑。
  22. 如請求項21之醫藥組合物，其中該組合物進一步包含一種或多種緩衝劑、一種或多種界面活性劑，以及一種或多種等滲劑。
  23. 如請求項21之醫藥組合物，其進一步包含檸檬酸鹽、檸檬酸、聚山梨醇酯80以及甘露醇。
  24. 如請求項21至23中任一項之醫藥組合物，其中pH在約5.5至約8.0的範圍內。
  25. 如請求項21至23中任一項之醫藥組合物，其中pH在約6.0至約6.75的範圍內。
  26. 如請求項21至23中任一項之醫藥組合物，其進一步包含額外的活性成分。
  27. 如請求項26之醫藥組合物，其中該額外的活性成分為基於腸促胰島素的療法。
  28. 如請求項27之醫藥組合物，其中該基於腸促胰島素的療法為GLP-1R促效劑。
  29. 如請求項28之醫藥組合物，其中該GLP-1R促效劑為度拉糖肽。
  30. 一種醫藥組合物，其包含如請求項19之同質二聚體，以及度拉糖肽。
  31. 一種如請求項1-14中任一項之融合蛋白的用途，該融合蛋白用於製造用於治療患有糖尿病的患者的藥物。
  32. 如請求項31之用途，其中該藥物用於與額外的活性成分組合投與。
  33. 如請求項32之用途，其中該額外的活性成分為基於腸促胰島素的療法。
  34. 如請求項33之用途，其中該基於腸促胰島素的療法為GLP-1R促效劑。
  35. 如請求項34之用途，其中該GLP-1R促效劑為度拉糖肽。
  36. 一種如請求項19之同質二聚體的用途，該同質二聚體用於製造用於治療患有糖尿病的患者的藥物，其中該藥物係與度拉糖肽組合投與。
  37. 一種聚核苷酸，該聚核苷酸編碼如請求項1-14中任一項之融合蛋白。
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