KR20220164736A - 안지오텐신 전환 효소 2(ace2)의 드노보 단백질 디코이 - Google Patents

Abstract

본원에는 ACE2의 드노보 단백질 디코이 및 이의 용도가 제공된다. 일부 실시양태에서, ACE2 단백질 디코이를 사용하여 코로나바이러스 감염을 치료하는 방법이 제공된다.

Description

안지오텐신 전환 효소 2(ACE2)의 드노보 단백질 디코이

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2020년 4월 7일에 출원된 미국 가출원 번호 제63/006,463호; 2020년 5월 21일에 출원된 미국 가출원 번호 제63/028,401호; 2020년 6월 13일에 출원된 미국 가출원 번호 제62/705,150호; 2020년 7월 22일에 출원된 미국 가출원 번호 제63/055,051호; 2020년 8월 3일에 출원된 미국 가출원 번호 제63/060,489호; 2020년 10월 20일에 출원된 미국 가출원 번호 제63/094,179호; 및 2021년 2월 3일에 출원된 미국 가출원 번호 제63/145,352호의 우선권을 주장한다; 이들 각각은 전체가 임의의 목적을 위해 본 명세서에 참고로 포함된다.

분야

본 발명은 ACE2의 드노보 단백질 디코이(decoy)에 관한 것이다.

바이러스는 종종 세포 표면 연관 단백질을 이용하여 숙주 세포에 들어가 숙주 세포를 감염시킨다. 중화 항체는 바이러스 표면에 결합하여 표적 세포의 표면 단백질(들)과의 상호작용을 방해하고/하거나 감염에 필요한 바이러스 연관 입체형태적 변화를 방지함으로써 이 과정을 저해할 수 있다. 따라서, 백신접종은 많은 바이러스 질환을 퇴치하는 데 광범위하게 유용한 도구였다. RNA 기반 바이러스는 이 전략에서 자주 예외적이다. 중화 항체는 바이러스가 세포 표적과 상호작용하는 방식보다 근본적으로 상이한 방식으로 바이러스 단백질에 결합한다. 따라서, 높은 돌연변이율을 갖는 RNA 바이러스는 종종 이러한 구조적 모순을 이용하여, 수용체-결합 단백질의 모양을 리모델링하여 중화 항체를 피하면서 표적 수용체(들)와의 상호작용을 유지함으로써, 면역계를 탈피한다.

코로나바이러스는 크고 외피가 있는 양성 가닥 RNA 바이러스이다. 게놈은 뉴클레오캡시드 단백질에 의해 형성된 나선형 캡시드 내부에 채워져 있으며 바이러스 외피에 의해 더 둘러싸여 있다. 외피-고정된 스파이크 단백질을 포함하여 적어도 3개의 구조 단백질이 바이러스 외피와 연관되어 있다. 코로나바이러스는 다양한 수용체를 인식하고, 스파이크 단백질에 의한 결합은 이러한 수용체를 통해 숙주 세포 내로 코로나바이러스 진입을 매개한다. 코로나바이러스는 2 단계 과정을 통해 숙주 세포에 진입하는 것으로 여겨진다. 첫째, 스파이크 단백질은 S1 소단위를 통해 숙주 세포 표면의 수용체에 결합하고, 그 다음 S2 소단위를 통해 바이러스 및 숙주 막을 융합한다. 바이러스 부착 단계와 막 융합 과정은 모두 스파이크 단백질에 의한 숙주 수용체의 인식에 의해 매개된다. 알파코로나바이러스 HCoV-NL63 및 베타코로나바이러스 SARS-CoV는 둘 다 수용체 아연 펩티다제 안지오텐신 전환 효소 2(ACE2)를 인식한다. 최근 ACE2는 SARS-CoV-2라고도 지칭되는, 2019년 중국 우한에서 발생한 신종 SARS 유사 코로나바이러스인 2019-nCov의 기능적 수용체인 것으로 발견되었다.

SARS-CoV-2는 코로나바이러스 질병 2019(COVID-19)를 일으키는 전염성이 높은 바이러스이다. 2019년 12월에 출현한 이후, SARS-CoV-2는 수백만 건의 COVID19 사례를 일으켰고 전 세계적인 유행병이 되었다. 대부분의 대상체는 무증상이거나 경미한 질병을 갖지만, 다수의 대상체는 호흡곤란 또는 저산소증이 있는 심각한 질병 또는 양압 환기를 필요로 하는 호흡 부전, 쇼크 또는 다발성 장기 부전의 증상을 갖는 심각한 질병으로 발전할 것이다. 코로나바이러스와 같은 바이러스가 숙주 세포에 침범하는 것을 방지할 수 있는 작용제를 식별할 필요가 있다. 본 발명은 이러한 필요성 및 다른 필요성을 충족시킨다.

도 1 - 도 1은 드노보 설계된 ACE2 단백질 디코이에 의한 세포 내로의 바이러스 진입 저해를 보여주는 개략도이다. SARS-CoV 및 SARS-CoV-2 바이러스는 먼저 스파이크 단백질의 RBD 도메인을 통해 인간 세포 표면 상의 ACE2 수용체에 결합하여 세포로 진입한다(왼쪽). 드노보 설계된 ACE2 디코이는 천연 ACE2와 동일한 방식으로 RBD 도메인에 결합하지만, ACE2와 달리 생물학적 기능이 없다. 디코이는 바이러스가 천연 ACE2 수용체에 결합하는 것을 효과적으로 격리하고 천연 ACE2 기능 수준을 온전하게 유지하면서 세포 내로 바이러스 진입을 방지한다(오른쪽).
도 2a-f - 도 2a-f는 드노보 ACE2 단백질 디코이 CTC-445가 SARS-CoV-2 스파이크/RBD 단백질에 결합한다는 것을 효모 표면 디스플레이에 의해 입증한다. 도 2a-b는 양성(ACE-2) 대조군을 보여주고, 도 2c-d는 음성 대조군(인간 IL-21R)을 보여준다. 도 2e-f는 CTC-445를 보여준다.
도 3a-d - 도 3a-d는 대조군 인간 ACE2(3a-b) 및 드노보 단백질 디코이 CTC-445(3c-d)가 SARS-CoV-2 스파이크/RBD 단백질에 결합하며 스파이크/RBD 단백질에 결합하기 위해 가용성 ACE2와 경쟁한다는 것을 입증한다.
도 4 - 도 4는 Octet 생물층 간섭계(BLI) 결합 검정을 통한 정제된 ACE2 단백질 디코이 CTC-445의 결합 동역학을 보여준다.
도 5a-h - 도 5a-h는 Octet BLI 결합 검정을 통한 선택 정제된 ACE2 단백질 디코이의 결합 동역학을 보여준다.
도 6a-h - 도 6a-h는 Octet BLI 결합 검정을 통한 선택 정제된 ACE2 단백질 디코이의 결합 동역학을 보여준다.
도 7a-h - 도 7a-h는 Octet BLI 결합 검정을 통한 선택 정제된 ACE2 단백질 디코이 CTC-445 변이체의 결합 동역학을 보여준다.
도 8a-c - ACE2 단백질 디코이 CTC-445(A), CTC-445.2(B) 및 CTC-445.2d(C)의 222 nm에서의 원편광 이색성 흡수. 삽입도는 20℃, 95-99℃로 가열 후(대시선), 및 가열된 샘플을 20℃로 냉각 후의 테스트 물품의 원자외선 파장 스펙트럼을 보여준다. 8b 및 8c의 Y축은 8a의 Y축과 동일하다.
도 9a-c - 도 9a-c는 가열 및 냉각의 반복 사이클 후 ACE2 단백질 디코이 CTC-445, CTC-445.2 및 CTC-445.2d의 열 회복을 보여준다. 데이터는 설계된 단백질이 반복적인 열 변성 후에도 재폴딩됨을 보여준다.
도 10a-c - 도 10a-c는 Octet BLI 결합 검정을 통한 정제된 ACE2 단백질 디코이 CTC-445(A), CTC 445.2(B) 및 CTC-445.2d(C)의 결합 동역학을 보여준다.
도 11 - 도 11은 선택 ACE2 단백질 디코이의 효능 대 분자량의 플롯을 제공한다. IC₅₀은 ELISA에 의해 측정된다.
도 12a-b - 도 12a는 루시퍼라제 리포터 유전자를 운반하고 표면에 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질을 발현하는 비-복제성 VSV 슈도바이러스를 사용하여 수행한 중화 검정을 보여준다. ACE2 단백질 디코이 CTC-445.2 및 CTC-445.2d를 사용한 바이러스 중화는 ACE2를 과발현하는 HEK 293T 세포에서 수행했다. 테스트 단백질은 세포와 인큐베이션하기 전에 슈도바이러스와 사전 인큐베이션했다. 샘플은 20μM(CTC-445.2) 또는 10μM(CTC-445.2d)에서 시작하는 3배 연속 희석물을 사용하여 이반복으로 테스트했다. 세포 생존력 검정(12b)은 나란히 실행했다.
도 13 - 도 13은 비강내 투여 후 마우스 폐(상부) 및 혈장(하부)에서 ACE2 단백질 디코이 CTC-445.2d의 생체이용률을 보여준다. 폐 용해물 및 혈장의 단백질 농도는 Meso Scale Discovery 플랫폼을 사용하여 정량한다.
도 14 - 도 14는 Mca-APK(DNP) 기질로부터 유리 형광단의 효소적 방출에 의해 측정된 ACE2 기능적 활성을 보여준다. ACE2 저해는 양성 대조군으로서 DX600 펩타이드를 사용하여 보여주었다.
도 15a-b - 도 15는 Octet BLI 결합 검정을 통한 SARS-CoV-1에 대한 ACE2 단백질 디코이 CTC-445.2(A) 및 CTC-445.2d(B)의 결합 동역학을 보여준다.
도 16a-e - 도 16a-e는 Octet 결합 검정을 통한 SARS-CoV-2 RBD 돌연변이체에 대한 ACE2 단백질 디코이 CTC-445.2의 결합 동역학을 보여준다.
도 17 - 도 17은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 RBD(표면 표현)와 복합체로 설계된 ACE2 단백질 디코이 CTC-445를 제공한다. 카툰 표현 상의 오른쪽 그래프는 설계된 서열의 편향된 정방향 폴딩 시뮬레이션을 보여준다. 설계된 서열은 Rosetta를 사용하여 초기 구조 예측으로 처리되었다. 플롯의 각 점은 해명된 단백질 구조로부터 단편의 몬테 카를로(Monte Carlo) 삽입에 의해 계산된 독립적인 폴딩 궤적을 나타낸다. 폴딩 시뮬레이션은 설계된 구조에 대해 가장 낮은 RMSD(9- 및 3-mer)를 갖는 단편의 작은 하위세트를 각 잔기 위치에 사용하여 설계된 입체형태쪽으로 편향되었다. 적색(또는 흑백인 경우에는 흑색) 점은 각 아미노산 위치의 설계에 대해 최저 RMSD를 갖는 Rosetta의 vall 구조 데이터베이스로부터의 5개 단편을 사용하여 계산된 궤적이다. 갈색(또는 회색) 점은 설계 모델 자체의 단편 및 8개의 최저 RMSD 3mer 및 9mer를 사용하여 계산된 궤적이다. 깔때기 모양의 에너지 랜드스케이프는 설계된 구조가 전반적인 에너지 최소값이며 대체 입체형태와 관련하여 실질적인 에너지 갭이 있음을 시사한다.
도 18a-b - 도 18a-b는 공지된 구조의 비-과잉 데이터베이스와 ACE2 단백질 디코이 CTC-640의 구조적 정렬을 보여준다. 구조적 정렬은 정렬될 Cα 원자 사이의 최대 거리를 10.0Å로 하여 MICAN을 사용하여 재권선 및 역방식(rewiring/reverse mode)으로 수행했다. 각 회색 점은 데이터베이스에서 상이한 구조를 갖는 CTC-640의 구조적 정렬을 표현한다. 각 검은색 점은 ACE2의 상이한 구조와 CTC-640의 구조적 정렬을 표현한다. 두 플롯 모두에서 50개 미만의 총 잔기의 구조적 정렬이 폐기되었다. A) 구조 정렬은 폴리펩타이드 사슬 내 2차 구조 요소의 순서에 기초하여 구조를 정렬하는 TMalign을 사용하여 수행한다. 서열 동일성은 구조적으로 정렬된 잔기에 기초하여 계산한다. CTC-640은 ACE2 결합 표면을 모방하지만, ACE2를 포함하는 데이터베이스의 임의의 단백질에 대해 선형 구조 또는 서열로 잘 정렬되지 않는다. B) 구조적 정렬은 MICAN을 사용하여 재권선/역방식으로 수행되며, 이는 2차 구조의 반대 방향, 대체 정렬 및 비순차적 정렬을 허용한다. CTC-640에서 관찰된 가장 높은 서열 동일성은 H1+H2+H3이 정렬된 잔기에 대해 33.7%의 서열 동일성으로, ACE2의 대응물에 정확하게 정렬하는 ACE2에 의한 것이다.
도 19a-c - 도 19a-c는 SARS-CoV-2(19a), SARS-CoV-1(19b)에 대한 Octet 결합 검정을 통한 ACE2 단백질 디코이 CTC-708(CTC-445.2t)의 결합 동역학, 및 경쟁 검정의 결과를 보여준다.
도 20a-c - 도 20a-c는 ACE2 단백질 디코이 CTC445.2의 심층 돌연변이 스캐닝으로부터의 결과를 제공하고 로고메이커를 사용하여 서열 로고로서 플로팅했다[https://www.biorxiv.org/content/10.1101/635029v1 참조]. 문자는 확률에 따라 크기가 조정되며 가장 높은 확률(상부)부터 가장 낮은 확률(하부)로 순서가 매겨진다. CTC445.2의 천연 서열은 검은 색으로 음영 처리된다. 잔기 1-54는 20a에, 잔기 55-107은 20b에, 잔기 108-160은 패널 20c에 도시된다.
도 21a-c - 도 21a는 루시퍼라제 리포터 유전자를 운반하고 표면에서 SARS-CoV-2(GenBank: QHD43416.1)의 스파이크 단백질을 발현하는 비복제성 VSV 슈도바이러스를 사용하여 결정된, hACE2를 과발현하는 조작된 HEK293T 세포에서 ACE2 단백질 디코이 CTC445.2d 및 CTC445.3d를 사용한 SARS-CoV-2 감염의 중화를 보여준다. 도 21b는 스파이크 단백질 대신 VSVg를 발현하는 대조용 슈도바이러스를 사용한 중화 검정을 보여준다. 도 21c는 ACE2 단백질 디코이 CTC-445.2d 및 CTC-445.3d와 함께 인큐베이션된 조작된 HEK293T 세포의 세포 생존력을 보여준다.

요약

본 발명자들은 일부 코로나바이러스에 의해 표적화된 천연 결합 표면을 정확하게 재현할 수 있는 드노보(de novo) 단백질을 구축했다. 특히, 본 발명자들은 코로나바이러스, 특히 ACE2를 사용하여 숙주 세포로의 진입을 매개하는 코로나바이러스에 의해 인식되는 결합 표면을 제시하는 드노보 단백질을 구축했다. 코로나바이러스에 결합함으로써, 이들 드노보 단백질은 숙주 ACE2 단백질에 대한 디코이(decoy)로서 작용할 수 있고, 특정 측면에서는 바이러스가 이의 수용체인 ACE2에 결합하는 것을 방지한다. 따라서, 본원에는 특히 SARS-CoV 및 SARS-CoV-2의 코로나바이러스 스파이크 단백질에 결합하는 드노보 단백질인 ACE2 단백질 디코이가 제공된다. 본 발명의 단백질은 특히 바이러스의 활성을 저해하거나 중화하는데 유용하다. 일부 실시양태에서, 단백질은 바이러스가 이의 숙주 세포 수용체에 결합하는 것을 차단하고 코로나바이러스가 숙주 세포 내로 진입하는 것을 방지하는 데 유용하다. 일부 실시양태에서, 단백질은 바이러스의 세포간 전파를 저해하여 기능한다. 특정 실시양태에서, 단백질은 대상체에서 코로나바이러스 감염의 적어도 하나의 증상을 예방, 치료 또는 호전시키는데 유용하다. 특정 실시양태에서, 단백질은 코로나바이러스 감염을 갖거나 가질 위험이 있는 대상체에게 예방적으로 또는 치료적으로 투여될 수 있다.

제1 측면에서, 본 발명은 코로나바이러스 스파이크 단백질, 특히 표적 세포로 바이러스 진입을 용이하게 하기 위해 수용체로서 ACE2를 사용하는 코로나바이러스, 예를 들어, SARS-CoV 및 SARS-CoV-2로부터의 스파이크 단백질에 특이적으로 결합하는 드노보 단백질인 ACE2 단백질 디코이를 제공한다. 또한, 코로나바이러스 스파이크 단백질이 이의 천연 수용체에 결합하는 것을 차단하고(예를 들어, 부분적으로 또는 완전히), 특히 코로나바이러스 스파이크 단백질이 ACE2에 결합하는 것을 차단하는 드노보 단백질인 ACE2 단백질 디코이가 제공된다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 코로나바이러스가 이의 천연 인간, 낙타 또는 박쥐 ACE2 수용체에 결합하는 것을 차단하는 드노보 단백질인 ACE2 단백질 디코이를 제공한다.

본 발명의 드노보 단백질은 비-천연 발생이고 적어도 2개의 알파 나선 도메인 H1 및 H2, 및 선택적 베타 헤어핀 도메인 H3을 포함하는 펩타이드 도메인을 포함한다. 이들 3가지 도메인은 코로나바이러스 스파이크 단백질과 계면화(interface)한다. 본 발명의 예시적인 드노보 단백질은 코로나바이러스 스파이크 단백질에 대한 H1 및 H2 알파 나선 및 H3 베타 헤어핀 도메인의 단백질 폴딩 및 결합-적격 제시(binding-competent presentation)를 용이하게 하는 적어도 하나의 구조적 도메인을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 본 발명의 예시적인 드노보 단백질은 코로나바이러스 스파이크 단백질에 대한 H1 및 H2 알파 나선 및 H3 베타 헤어핀 도메인의 단백질 폴딩 및 결합-적격 제시를 용이하게 하는 적어도 2개의 구조적 도메인을 포함한다. H1 및 H2 알파 나선 도메인 및 선택적 베타 헤어핀은 코로나바이러스 스파이크 단백질에 대한 결합 부위와 상호작용/결합 부위로서 작용하는 아미노산 잔기를 포함한다.

본 발명의 드노보 단백질은 코로나바이러스 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인에 있는 아미노산 잔기와 상호작용한다. 이론에 얽매임이 없이, SARS-CoV의 경우, RBD(수용체 결합 도메인) 상의 예상 결합 잔기는 442, 443, 461, 462, 463, 470, 471, 472, 473, 475, 476, 479, 481, 482, 483, 486, 487, 488, 489 및 491이고, SARS-CoV-2의 경우, 예상 결합 잔기는 455, 456, 475, 476, 477, 486, 487, 489, 490, 493, 496, 497, 498, 500, 501, 502, 504, 및 505이다.

관련 측면에서, 본 발명은 펩타이드 도메인 H1, H2 및 H3을 포함하는 단백질 뿐만 아니라 펩타이드 도메인 자체를 제공한다.

제2 측면에서, 본 발명은 본 발명의 드노보 단백질 및 펩타이드 도메인을 암호화하는 핵산 분자를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 단백질 및 펩타이드 도메인을 암호화하는 핵산 분자를 제공한다.

관련 측면에서, 본 발명은 본 발명의 단백질을 발현할 수 있는 재조합 발현 벡터를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 상기 언급된 임의의 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 포함한다. 또한, 본 발명의 범위 내에는 이러한 벡터가 도입된 숙주 세포, 및 단백질의 생산을 허용하는 조건하에서 숙주 세포를 배양하고 그렇게 생산된 단백질을 회수함으로써 단백질을 생산하는 방법도 포함된다.

제3 측면에서, 본 발명은 치료학적 유효량의 본 발명의 드노보 ACE2 단백질 디코이 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 관련 측면에서, 본 발명은 본 발명의 드노보 단백질과 제2 치료제의 조합인 조성물을 특징으로 한다. 일 실시양태에서, 제2 치료제는 본 발명의 드노보 단백질과 유리하게 조합되는 임의의 작용제이다. 예시적인 작용제는 숙주 세포의 감염성을 포함하는 바이러스 활성을 저해하는 다른 작용제를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.

제4 측면에서, 본 발명은 표적 세포로의 바이러스 진입을 용이하게 하는 수용체로서 ACE2를 사용하는 코로나바이러스와 연관된 질병 또는 장애를 치료하기 위한 치료 방법을 제공한다. 이 방법은, 예를 들어, 본 발명의 드노보 ACE2 단백질 디코이를 사용하여 대상체의 바이러스 감염을 치료하는 것을 포함하며, 여기서 치료 방법은 ACE2 단백질 디코이를 포함하는 약제학적 조성물의 치료 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 치료되는 장애는 SARS-CoV 또는 SARS-CoV-2 코로나바이러스 활성 또는 ACE2 수용체를 사용하여 표적 세포에 접근하는 임의의 다른 코로나바이러스의 활성을 저해함으로써 개선, 호전, 저해 또는 예방되는 임의의 질병 또는 상태이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 코로나바이러스 감염의 적어도 하나의 증상을 예방, 치료 또는 호전시키는 방법을 제공하며, 이 방법은 본 발명의 단백질의 치료 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 단백질을 투여하여 대상체의 코로나바이러스 감염에 의한 적어도 하나의 증상 또는 징후의 중증도를 호전 또는 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서 적어도 하나의 증상 또는 징후는 폐 염증, 폐포 손상, 발열, 기침, 호흡곤란, 설사, 심부전, 부정맥, 다발성 장기 기능장애, 폐렴, 패혈성 쇼크 및/또는 사망으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 대상체의 바이러스 부하를 감소시키는 방법을 제공하며, 이 방법은 SARS-CoV 또는 SARS-CoV-2 유래의 코로나바이러스 스파이크 단백질 또는 ACE2 수용체를 이용하여 표적 세포로 진입하게 되는 코로나바이러스 유래의 다른 코로나바이러스 스파이크 단백질에 결합하고 이의 숙주 세포 수용체에 대한 스파이크 단백질의 결합을 차단하는 본 발명의 ACE2 단백질 디코이의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 드노보 단백질은 코로나바이러스 감염을 갖거나 가질 위험이 있는 대상체에게 예방적으로 또는 치료적으로 투여될 수 있다. 위험이 있는 대상체로는 면역 저하자, 노인(65세 초과), 의료 종사자, 코로나바이러스 감염이 확인되거나 의심되는 사람(들)과 밀접 접촉한 성인 또는 어린이, 및 폐 질환 또는 감염, 심장 질환 또는 당뇨병과 같은 기저 의학 상태가 있는 사람을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 드노보 단백질은 제2 치료제와 조합으로 이를 필요로 하는 대상체에게 투여된다. 제2 치료제는, 예를 들어, 소염 약물(예컨대, 코르티코스테로이드, 및 비스테로이드성 소염제), 항감염 약물 또는 항바이러스 약물로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 특정 실시양태에서, 제2 치료제는 본 발명의 드노보 단백질과 연관된 임의의 가능한 부작용(들)을, 이러한 부작용(들)이 발생한다면, 중화하거나 감소시키는 것을 돕는 작용제일 수 있다. 예를 들어, 일부 측면에서, 제2 치료제는 사이토카인 방출 증후군(예를 들어, 사이토카인 폭풍)을 치료하기 위한 것이다. 이의 드노보 단백질은, 예를 들어, 피하, 정맥내, 피내, 복강내, 경구 또는 근육내 투여될 수 있다. 일부 측면에서, 드노보 단백질은 흡입된다.

또한, 본 발명에는 본 발명의 핵산을 사용하여 대상체의 바이러스 감염을 치료하는 방법이 포함된다. 이 방법은 본 발명의 ACE2 단백질 디코이를 암호화하는 핵산의 치료 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.

본 발명은 또한 코로나바이러스 결합 및/또는 활성의 차단으로부터 이익을 얻을 질병 또는 장애의 치료용 약제의 제조에 사용되는 본 발명의 단백질 또는 핵산의 용도를 포함한다.

제5 측면에서, 본 발명은 생물학적 샘플에서 코로나바이러스 스파이크 단백질을 검출하는 방법을 제공한다. 이 방법은 생물학적 샘플을 본 발명의 ACE2 단백질 디코이와 접촉시키는 단계 및 생물학적 샘플 중 코로나바이러스 스파이크 단백질을 검출하는 단계를 포함한다.

다른 실시양태는 이어지는 상세한 설명의 검토로부터 명백해질 것이다.

정의

"SARS-CoV"라는 용어는 2002년 중국에서 발생한 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스를 지칭한다. 이는 바이러스 스파이크 단백질을 통해 인간 숙주 세포 수용체 ACE2에 결합한다. "S 단백질"이라고도 하는 "SARS-CoV-S"라는 용어는 SARS 코로나바이러스(S1 및 S2)의 스파이크 단백질을 지칭한다. SARS-CoV 스파이크 단백질은 수용체 인식과 막 융합을 매개한다. 바이러스 감염 동안 S 단백질은 S1 및 S2라는 2개의 소단위로 절단된다. 수용체 결합 도메인은 S1 소단위에서 발견되며 ACE2의 펩티다제 도메인(PD)에 직접 결합한다. S2는 막 융합을 담당한다. S1이 ACE2에 결합하면 S2는 숙주 프로테아제에 의해 절단된다. S2의 이러한 절단은 바이러스 감염에 중요한 것으로 여겨진다. 예시적인 SARS-CoV-S 단백질은 서열번호 2로서 본원에 제공된다. 신호 펩타이드는 아미노산 1-13이고, S1 스파이크 단백질은 아미노산 14-667이며, S2 스파이크 단백질은 아미노산 668-1255이다. SARS-CoV-S 및 SARS-CoV 스파이크 단백질이라는 용어는 다른 SARS-CoV 분리주에서 분리된 SARS-CoV 스파이크 단백질의 단백질 변이체를 포함한다. SARS-CoV 분리주로는, 예를 들어, 분리주 BJ01, 분리주 BJ02, 분리주 BJ03, 분리주 BJ04, 분리주 GZ50, 분리주 CUHK-W1, 분리주 HKU-36871, 분리주 GD01, 분리주 GD03, 분리주 상하이 LY, 분리주 프랑크푸르트 1, 분리주 FRA, 분리주 SZ23, 분리주 SZ3 및 분리주 Tor2를 포함한다.

"COVID-19" 또는 "2019-nCov" 또는 "SARS-CoV-2"라는 용어는 2019년 중국 우한에서 출현하고 WHO에 의해 2020년 3월 11일에 범유행병으로 표지된 새로운 SARS 유사 코로나바이러스를 지칭한다. SARS-CoV와 마찬가지로, 이는 바이러스 스파이크 단백질을 통해 인간 숙주 세포 수용체 ACE2에 결합한다. "S 단백질"이라고도 불리는 "SARS-CoV-2-S"라는 용어는 SARS-CoV-2 코로나바이러스의 스파이크 단백질을 지칭한다. 예시적인 SARS-CoV-2 S 단백질은 서열번호 3으로서 본원에 제공된다. SARS-CoV-2-S 및 SARS-CoV-2 스파이크 단백질이라는 용어는 여러 SARS-CoV-2 분리주에서 분리된 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 단백질 변이체를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "코로나바이러스 ACE2-결합 스파이크 단백질" 또는 "ACE2-결합 스파이크 단백질"은 ACE2를 사용하여 숙주 세포 내로의 진입을 매개하는 코로나바이러스 스파이크 단백질을 지칭한다.

"ACE2"는 선택 코로나바이러스에 대한 수용체로서 작용하는 안지오텐신-전환 효소 2를 지칭한다. 인간 ACE2 단백질의 전체 길이는 본원에서 서열번호 1로서 제공된다. 신호 펩타이드는 아미노산 잔기 1-17이고; 세포외 PD 도메인은 아미노산 잔기 18-740이며; 막관통 분절은 잔기 741-761이고; 세포내 도메인은 잔기 762-805이다.

ACE2의 주요 생리학적 역할은 안지오텐신의 성숙에 있지만, 일부 코로나바이러스에 대한 세포 수용체로서 장악되기도 했다. 본 발명의 ACE2 단백질 디코이는 인간 ACE2에 대한 디코이로서 작용하도록 설계되었지만, 그럼에도 불구하고, 일부 실시양태에서는 다른 포유동물 종 유래의 ACE2에 대한 단백질 디코이로서 작용할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "코로나바이러스 감염" 또는 "SARS-CoV 감염" 또는 "SARS-CoV-2 감염"은 숙주 세포로 진입하기 위해 ACE2 수용체를 사용하는 코로나바이러스, 특히, SARS 또는 COVID-19 코로나바이러스에 의한 감염을 지칭한다. 중증 급성 호흡기 병은 SARS 및 COVID-19 코로나바이러스 감염과 연관이 있다. 혈전 이벤트 및 신경계 질환을 비롯한 광범위한 추가 합병증이 COVID-19 코로나바이러스와 연관되어 있다. 감염의 증상으로는 발열, 기침, 호흡곤란 폐렴, 위장관 증상, 예컨대, 설사, 장기 부전(신부전, 심부전, 및 신장 기능장애), 패혈성 쇼크 및 심한 경우 사망을 포함한다.

본원에 사용된 "재조합체"라는 용어는, 예를 들어, DNA 스플라이싱 및 전이유전자 발현을 포함하는 재조합 DNA 기술로서 본 기술분야에 공지된 기술 또는 방법에 의해 생성, 발현, 단리 또는 수득된 본 발명의 단백질을 지칭한다.

용어 "특이적으로 결합한다", 또는 "에 특이적으로 결합한다" 등은 제1 모이어티가 다른 모이어티에 대한 것보다 제2 모이어티에 대해 더 큰 친화도를 갖는다는 것을 의미한다. 하지만, 특이적 결합은 배타적 결합이어야 하는 것은 아니다. 일부 실시양태에서, 제1 모이어티는 제2 모이어티에 특이적으로 결합하고 결과적으로 생성된 복합체는 생리학적 조건 하에 비교적 안정하다. 특이적 결합은 일부 실시양태에서는 약 650 nM 이하, 또는 일부 실시양태에서는 100 nM 이하의 평형 해리 상수를 특징으로 할 수 있다(예를 들어, 더 작은 K_D는 더 단단한 결합을 나타냄). 2개의 모이어티가 특이적으로 결합하는지 여부를 결정하는 방법은 본 기술분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 평형 투석, 표면 플라즈몬 공명 등을 포함한다. 본원에 기재된 바와 같이, 코로나바이러스 스파이크 단백질에 특이적으로 결합하는 단백질, 특히 코로나바이러스 ACE2-결합 스파이크 단백질에 특이적으로 결합하는 단백질은 식별되어 있다.

"치료 유효량"이라는 문구는 투여되어 원하는 효과를 생성하는 양을 지칭한다. 정확한 양은 치료 목적에 따라 달라질 것이고, 본 기술분야의 기술자라면 공지된 기술을 사용하여 확인할 수 있을 것이다(예를 들어, Lloyd (1999) The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding 참조).

본원에 사용된 용어 "대상체"는 바이러스 감염과 같은 질병 또는 장애의 호전, 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간을 지칭한다. 이 용어는 코로나바이러스 감염을 갖거나 가질 위험이 있는 인간 대상체를 포함한다.

본원에 사용된 용어 "치료한다", "치료하는" 또는 "치료"는 본 발명의 단백질과 같은 치료제를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함으로 인해 코로나바이러스 감염의 적어도 하나의 증상 또는 징후의 중증도에 대한 감소 또는 호전을 지칭한다. 이 용어는 질환 진행 또는 감염 악화의 저해를 포함한다. 치료제는 치료 용량으로 대상체에게 투여될 수 있다.

용어 "예방한다", "예방하는" 또는 "예방"은 코로나바이러스 감염의 증상 발병의 저해를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 예방은 코로나바이러스 감염의 저해 및/또는 대상체로부터 다른 개체로 코로나바이러스 감염의 확산 저해를 포괄한다.

본원에 사용된 용어 "항바이러스 약물"은 대상체의 바이러스 감염을 치료, 예방 또는 호전시키기 위해 사용되는 임의의 항감염 약물 또는 요법을 지칭한다. "항바이러스 약물"이라는 용어는 리바비린(ribavirin), 렘데시비르(remdesivir), 오셀타미비르(oseltamivir), 자나미비르(zanamivir), 인터페론-알파2b, 진통제 및 코르티코스테로이드를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 정황에서, 바이러스 감염은 SARS-CoV 및 SARS-CoV-2를 포함하는 인간 코로나바이러스에 의해 유발된 감염을 포함한다.

폴리펩타이드 서열과 관련하여 본원에 사용된 용어 "동일성"은 2개 분자 사이의 아미노산 서열 동일성을 지칭한다. 두 분자의 한 아미노산 위치에 동일한 아미노산이 차지하고 있다면, 분자들은 그 위치에서 동일한 것이다. 두 폴리펩타이드 간의 동일성은 동일한 위치 수의 직접적인 함수이다. 일반적으로, 서열은 최고의 일치가 수득되도록 정렬된다(필요한 경우, 갭 포함). 동일성은 공개된 기술 및 널리 이용가능한 컴퓨터 프로그램, 예컨대, GCG 프로그램 패키지(Devereux et al., Nucleic Acids Res. 12:387, 1984), BLASTP, FASTA(Atschul et al., J. Molecular Biol. 215:403, 1990) 등을 사용하여 계산할 수 있다. 서열 동일성은, 예를 들어, 위스콘신 대학교 생명공학 센터(위스콘신주 53705 매디슨 유니버시티 애버뉴 1710)의 유전학 컴퓨터 그룹의 서열 분석 소프트웨어 패키지와 같은 서열 분석 소프트웨어를 이의 디폴트 매개변수와 함께 사용하여 측정할 수 있다. 본 발명에서 동일성을 결정할 때에는 또한 코로나바이러스 스파이크 단백질과 결합 계면 잔기의 위치결정을 고려하는 것도 중요하다. 아미노산이 첨가되거나 결실된다면, 이는 결합 파트너에 단백질의 제시 또는 2차 구조에 실질적으로 방해되지 않는 방식으로 수행되어야 한다. 달리 표시되지 않는 한, 동일성 퍼센트는 기준 서열의 길이에 걸쳐 결정된다.

일부 측면에서, 기준 펩타이드 도메인에 상대적인 아미노산 치환은 예를 들어 보존적 아미노산 치환일 수 있다. 본원에 사용된 "보존적 아미노산 치환"은 주어진 아미노산이 유사한 물리화학적 특성을 갖는 아미노산으로 대체될 수 있는 것, 예를 들어, 하나의 지방족 잔기를 다른 것으로 치환하는 것(예를 들어, Ile, Val, Leu 또는 Ala을 서로), 또는 하나의 극성 잔기를 다른 것으로 치환하는 것(예를 들어, Lys과 Arg 사이; Glu와 Asp 사이; 또는 Gln과 Asn 사이)을 의미한다. 이와 같은 다른 보존적 치환, 예를 들어 유사한 소수성 특성을 갖는 전체 영역의 치환이 공지되어 있다. 보존적 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩타이드는 원하는 활성이 유지되는지 확인하기 위해 본원에 기재된 검정 중 어느 하나로 테스트할 수 있다. 아미노산은 측쇄 성질의 유사성에 따라 그룹화될 수 있다. 대안적으로, 천연 발생의 잔기는 공통 측쇄 성질에 기초하여 그룹으로 나뉠 수 있다. 비보존적 치환은 이러한 클래스 중 하나의 구성원을 다른 클래스의 구성원으로 교환하는 것을 수반한다. 특별한 보존적 치환은, 예를 들어, 다음을 포함한다: Ala에서 Gly 또는 Ser으로; Arg에서 Lys으로; Asn에서 Gln 또는 H로; Asp에서 Glu로; Cys에서 Ser으로; Gln에서 Asn으로; Glu에서 Asp으로; Gly에서 Ala 또는 Pro으로; His에서 Asn 또는 Gln으로; Ile에서 Leu 또는 Val으로; Leu에서 Ile 또는 Val으로; Lys에서 Arg, Gln 또는 Glu으로; Met에서 Leu, Tyr 또는 Ile으로; Phe에서 Met, Leu 또는 Tyr으로; Ser에서 Thr으로; Thr에서 Ser으로; Trp에서 Tyr으로; Tyr에서 Trp으로; 및/또는 Phe에서 Val, Ile 또는 Leu으로. 일반적인 소수성 그룹은 글리신(Gly), 알라닌(Ala), 발린(Val), 류신(Leu), 이소류신(Ile), 프롤린(Pro) 및 페닐알라닌(Phe)이다.

본원에 사용된 천연 아미노산 잔기는 다음과 같이 약칭된다: 알라닌(Ala; A), 아스파라긴(Asn; N), 아스파르트산(Asp; D), 아르기닌(Arg; R), 시스테인(Cys; C), 글루탐산(Glu; E), 글루타민(Gln; Q), 글리신(Gly; G), 히스티딘(His; H), 이소류신(Ile; I), 류신(Leu; L), 라이신(Lys; K), 메티오닌(Met; M), 페닐알라닌(Phe; F), 프롤린(Pro; P), 세린(Ser; S), 트레오닌(Thr; T), 트립토판(Trp; W), 티로신(Tyr; Y), 및 발린(Val; V). 본원에 사용된 "임의의 아미노산"은 전형적으로 20개의 천연 아미노산을 지칭한다. 하지만, 숙련된 실무자는 하나 이상(예를 들어, 1 내지 10개, 1 내지 5개, 1 내지 3개, 또는 1개 또는 2개)의 비천연 아미노산이 천연 아미노산 대신에 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 본원에 사용된 용어 "비천연 아미노산"은 단백질에서 천연적으로 발생하는 20개 아미노산 외의 다른 아미노산을 지칭한다. 비천연 아미노산은 본 기술분야에 공지되어 있다.

본원에 사용된 용어 "폴리펩타이드", "단백질" 또는 "펩타이드"는 길이 또는 해독후 변형(예를 들어, 글리코실화 또는 인산화)에 관계없이 아미노산 잔기의 임의의 사슬을 지칭한다.

"작동가능하게 연결된"은 뉴클레오타이드 서열이 조절 서열(들)에 뉴클레오타이드 서열의 발현을 허용하는 방식으로(예를 들어, 시험관내 전사/해독 시스템에서, 또는 벡터가 숙주 세포에 도입되는 경우에는 숙주 세포에서) 조절 서열(들)에 연결됨을 의미하려는 것이다. "조절 서열"은 프로모터, 인핸서, 및 기타 발현 제어 요소(예를 들어, 폴리아데닐화 신호)를 포함한다. 본 발명의 발현 작제물은 숙주 세포 내로 도입되어 본원에 개시된 단백질을 생산할 수 있다.

용어 "숙주 세포" 및 "재조합 숙주 세포"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 이러한 용어는 특정 대상체 세포, 뿐만 아니라 이러한 세포의 자손 또는 잠재적 자손을 지칭하는 것으로 이해한다. 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 후속 세대에서 특정 변형이 발생할 수 있기 때문에, 이러한 자손은 사실상 모세포와 동일하지 않을 수 있지만, 본원에 사용된 용어의 범위 내에 여전히 포함된다.

본원에 사용된 용어 "형질전환" 및 "형질감염"은 인산칼슘 또는 염화칼슘 공침, DEAE-덱스트란 매개 형질감염, 리포펙션, 입자 총 또는 전기천공을 비롯하여, 외래 핵산(예를 들어, DNA)을 숙주 세포 내로 도입시키기 위한 다양한 공인된 기술을 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 약제학적 투여에 화합할 수 있는, 식염수, 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 보조 활성 화합물(예를 들어, 항생제)도 조성물에 혼입될 수 있다.

일반

본 발명자들은 코로나바이러스 상의 스파이크 단백질에 특이적으로 결합하고 스파이크 단백질과 이들의 선천적인 수용체의 상호작용을 조정하는 드노보 ACE2 단백질 디코이를 본원에서 설명하고 있다. 특히, 드노보 ACE2 단백질 디코이는 ACE2를 수용체로 사용하여 표적 세포 내로 바이러스 진입을 용이하게 하는 코로나바이러스 상의 스파이크 단백질에 결합한다. 특히, 본 발명의 드노보 ACE2 단백질 디코이는 코로나바이러스 스파이크 단백질과 상호작용하고 이에 결합하는 데 필수적인 도메인을 함유하지만, 전형적으로 천연 ACE2의 다른 효소적 활성과 연관된 도메인, 예를 들어, ACE2의 촉매성 도메인(예를 들어, 메탈로프로테아제 촉매성 도메인)을 함유하지 않는다. 본 발명의 예시적인 드노보 ACE2 단백질 디코이는 안지오텐신(즉, 안지오텐신 I 및 II를 비롯한 안지오텐신의 임의의 형태)의 절단을 촉매하지 않는다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 ACE2 단백질 디코이는 인간 ACE2(서열 1)에 대해 60%, 55%, 50%, 45%, 40% 또는 35% 이하의 서열 동일성을 갖는다. ACE2에 대한 동일성과 관련하여, 동일성 퍼센트는 질의(query) 길이에 걸쳐, ACE2 단백질 디코이를 질의로서, ACE2를 기준으로서 사용하여 계산한다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 단백질 디코이는 스파이크 단백질(예를 들어, SARS-CoV-2의 스파이크 단백질)에 700 nM 이하의 K_d, 600 nM 이하의 K_d, 500 nM 이하의 K_d, 400 nM 이하의 K_d, 300 nM 이하의 K_d, 200 nM 이하의 K_d, 100 nM 이하의 K_d, 50 nM 이하의 K_d, 바람직하게는 약 20 nM 이하, 또는 심지어 15 nM, 10 nM, 또는 5 nM 이하로 결합한다. K_d를 결정하는 방법은 본 기술분야에 공지되어 있고 실시예에 기재되어 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 드노보 단백질 디코이는 코로나바이러스 스파이크 단백질(예를 들어, SARS-CoV-2 유래)에 결합할 수 있고 스파이크 단백질과 이의 천연 수용체(즉, ACE2)의 상호작용을 차단할 수 있다는 점에서 차단 단백질이다. 본원에 사용된 바와 같이, 차단 단백질은 스파이크 단백질과 이의 천연 수용체의 상호작용을 완전히 차단할 수 있거나, 또는 스파이크 단백질과 이의 천연 수용체의 상호작용을 부분적으로 차단할 수 있다. 특정 실시양태에서, 드노보 단백질 디코이는 스파이크 단백질과 이의 천연 수용체(즉, ACE2)의 상호작용을 100 nM 이하의 IC₅₀으로 저해한다. 일부 실시양태에서, 드노보 단백질은 스파이크 단백질과 이의 천연 수용체(즉, ACE2)의 상호작용을 50, 40, 30, 20, 10, 또는 5 nM 이하의 IC₅₀으로 저해한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 차단 단백질은 코로나바이러스 스파이크 단백질이 이의 수용체에 결합하는 것을 차단하고/하거나 숙주 세포의 바이러스 감염성을 저해 또는 중화 또는 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 차단 단백질은 코로나바이러스 감염(예를 들어, COVID-19 코로나바이러스 감염)을 앓고 있는 대상체를 치료하는 데 유용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 드노보 단백질 디코이는 이를 필요로 하는 대상체에게 투여될 때 대상체에서 SARS-CoV-2와 같은 코로나바이러스에 의한 감염을 감소시킨다. 이들은 대상체에서 바이러스 부하를 줄이는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 단백질 디코이는 단독으로 사용되거나 또는 바이러스 감염 치료를 위한 본 기술분야에 공지된 다른 치료 모이어티 또는 양식과 함께 보조 요법으로서 사용될 수 있다. SARS-CoV 또는 SARS-CoV-2에 결합하고 이의 활성을 저해/중화하는 본 발명의 드노보 단백질의 능력은 본원에 기재된 바와 같은 결합 검정, 또는 활성 검정을 비롯한 본 기술분야의 기술자에게 공지된 임의의 표준 방법을 사용하여 측정할 수 있다. 예를 들어, 결합 및 저해 및/또는 차단 활성을 측정하기 위한 시험관내 검정은 실시예에 예시된다.

본 발명의 드노보 단백질 디코이는 추가적인 표지 또는 모이어티를 전혀 함유하지 않을 수 있거나, 또는 표지(예를 들어, N-말단 또는 C-말단 표지 또는 모이어티)를 함유할 수 있다. 일 실시양태에서, 표지 또는 모이어티는 비오틴이다. 결합 검정에서 표지(존재하는 경우)의 위치는 펩타이드가 결합된 표면에 상대적으로 펩타이드의 배향을 결정할 수 있다. 예를 들어, 표면이 아비딘으로 코팅된 경우, N-말단 비오틴을 함유하는 펩타이드는 펩타이드의 C-말단 부분이 그 표면에 대해 멀리 있도록 배향될 것이다. 표지는, 예를 들어, 효소, 방사성 핵종, 형광 염료 또는 MRI 검출 가능한 표지일 수 있다. 이러한 표지된 단백질은 이미지 검정을 비롯한 진단 검정에 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 트립토판을 함유하지 않는 ACE-2 단백질 디코이의 경우, 표지는 280 nm에서의 흡광도에 의한 단백질 검출을 허용하는 C-말단 펩타이드일 수 있다(예를 들어, GSGWGSG, 서열번호 248).

ACE2 단백질 디코이의 구조 및 서열 특성

본원에는 ACE2 단백질 디코이로서 본원에서 지칭되는 본 발명의 드노보 단백질이 제공된다. 이들 단백질 디코이는 본질적으로 비천연 발생의 단백질이며, 코로나바이러스 스파이크 단백질과 계면화하는 적어도 2개의 알파 나선 도메인, 및 바람직하게는 알파 나선의 단백질 폴딩 및 결합-적격 제시를 용이하게 하는 적어도 하나의 구조적 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 드노보 단백질은 선택적인 베타 헤어핀 도메인을 추가로 포함한다. 코로나바이러스 스파이크 단백질과 계면화하는 알파 나선 도메인 및 선택적인 베타-헤어핀 도메인은 코로나바이러스 스파이크 단백질과 상호작용하고/코로나바이러스 스파이크 단백질에 대한 결합 부위로서 작용한다. 본원에서 H1, H2 및 H3으로 지칭되는 이들 도메인은 코로나바이러스 스파이크 단백질과의 결합 상호작용에 관여하는 아미노산 잔기 및 코로나바이러스 스파이크 단백질과의 결합 상호작용에 관여하지 않는 아미노산 잔기 둘 모두를 포함한다. 일반적으로, H1 및 H2 도메인과 관련하여, 코로나바이러스 ACE2-결합 스파이크 단백질과 결합 상호작용에 관여하지 않는 아미노산 잔기는 그 위치에 있는 아미노산의 정체와 관련하여 매우 잡다한 것일 수 있는 위치에 있다. 다수의 이들 잔기는 또한 용매 노출된 위치에 있다. 일부 실시양태에서, 용매 노출된 위치의 아미노산을 대체하는 경우, 친수성 아미노산의 사용이 특히 바람직하지만, 비친수성 아미노산도 허용 가능하다.

본 기술분야의 기술자는 본 발명의 드노보 단백질인 ACE2 단백질 디코이가 천연 ACE2 단백질의 상응하는 결합 부위에 결합 도메인이 구조적으로 정렬되는 반면, 지원 구조적 도메인은 ACE2의 임의의 다른 2차 구조에 구조적으로 또는 순차적으로 정렬하지 않도록 설계되었음을 이해할 것이다. 일부 측면에서, 본 발명의 드노보 단백질은 예를 들어, 2.75A RMSD(평균 제곱근 편차) 내에서 천연 ACE2 결합 모티프에 구조적으로 정렬하고, ACE2의 임의의 다른 2차 구조 요소에 구조적 또는 순차적으로 정렬하지 않는 하나 이상의 2차 구조 요소를 함유한다. RMSD를 결정하는 방법은, 예를 들어, MICAN 단백질 구조 정렬 알고리즘을 사용하는 것이, 본 기술분야에 알려져 있다. MICAN은 2차 구조 요소 간의 연계성을 무시함으로써 단백질 쌍 간의 최상의 구조적 정렬을 식별한다.

일부 측면에서, 본 발명의 드노보 단백질은 2개의 알파 나선 도메인, H1 및 H2와 선택적인 베타 헤어핀 도메인 H3을 포함하며, 여기서

H1은 다음 아미노산 서열을 포함하고:

SX₁X₂X₃EQX₄X₅TFX₆DKX₇X₈HEX₉EDX₁₀X₁₁YQX₁₂X₁₃L (서열번호 4) 또는

X₂X₃EQX₄X₅TFX₆DKX₇X₈HEX₉EDX₁₀X₁₁YQX₁₂X₁₃L (서열번호 176);

H2는 다음 아미노산 서열을 포함하며:

NX₁₄X₁₅NX₁₆X₁₇X₁₈KX₁₉X₂₀X₂₁FX₂₂X₂₃EQX₂₄X₂₅LX₂₆X₂₇MY (서열번호 5); 및

H3은, 존재한다면, 다음 아미노산 서열을 포함한다:

X₂₈X₂₉X₃₀X₃₁X₃₂X₃₃KGDX₃₄RX₃₅X₃₆ (서열번호 6), 여기서, X₁, X₂, X₃, X₄, X₅, X₆, X₇, X₈, X₉, X₁₀, X₁₁, X₁₂, X₁₃, X₁₄, X₁₅, X₁₆, X₁₇, X₁₈, X₁₉, X₂₀, X₂₁, X₂₂, X₂₃, X₂₄, X₂₅, X₂₆, X₂₇, X₂₈, X₂₉, X₃₀, X₃₁, X₃₂, X₃₃, X₃₄, X₃₅, 및 X₃₆은 임의의 아미노산으로부터 각각 독립적으로 선택된다.

이러한 드노보 단백질은 H1, H2 및 H3의 단백질 폴딩 및 결합-적격 제시를 용이하게 하는 하나 이상의 구조적 도메인을 추가로 포함한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, ACE2 단백질 디코이의 코로나바이러스 결합 아미노산 잔기는 ACE2 단백질의 코로나바이러스 결합 아미노산 잔기와 동일하다. 예를 들어, 일부 이러한 실시양태에서, H1, H2 및 H3의 결합 잔기는 천연 ACE2 단백질의 동일한 구조적 위치에 있는 아미노산과 동일하다. 또한, 일부 예시적인 실시양태에서, H1의 용매 노출된 아미노산 중 전부 또는 1개 내지 6개를 제외한 전부, 또는 1 내지 5개, 또는 1개 내지 4개, 또는 1개 내지 3개 및 H2의 용매 노출된 아미노산 중 전부, 또는 1개 내지 6개를 제외한 전부, 또는 1개 내지 5개, 또는 1개 내지 4개, 또는 1개 내지 3개는 이들이 결합에 관여하는지 여부에 관계 없이, 천연 ACE2 단백질의 동일한 구조적 위치에 있는 아미노산과 동일하다. 단백질 ACE2에서 바이러스가 표적으로 하는 것과 사실상 동일한 표면을 제시함으로써, 본 발명의 ACE2 단백질 디코이에 대한 결합을 피하기 위해 돌연변이하는 바이러스의 능력은 최소화된다. 서열번호 4에서 위치 1, 5, 6, 9, 10, 12, 13, 16, 17, 19, 20, 23, 24 및 27의 아미노산 잔기는 대부분 용매에 노출되고/되거나 코로나바이러스 ACE2-결합 스파이크 단백질에 대한 결합에 관여하고; 서열번호 176에서 위치 3, 4, 7, 8, 10, 11, 14, 15, 17, 18, 21, 22 및 25의 아미노산 잔기는 대부분 용매에 노출되고/되거나 코로나바이러스 ACE2 결합 스파이크 단백질에 대한 결합에 관여하며; 서열번호 5에서 위치 1, 4, 8, 12, 15, 16, 19, 22 및 23의 아미노산 잔기는 대부분 용매에 노출되고/되거나 코로나바이러스 ACE2 결합 스파이크 단백질에 대한 결합에 관여하고; 서열번호 6에서 위치 7, 8 및 9의 아미노산 잔기는 대부분 용매에 노출되고/되거나 코로나바이러스 ACE2-결합 스파이크 단백질에 대한 결합에 관여한다. 일부 측면에서, 아미노산 치환이 이루어질 때, 이들 잔기는 치환되지 않는다. 다른 측면에서, 이러한 잔기는 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 이들 잔기에 대한 변형은 천연 코로나바이러스 스파이크 단백질보다 더 높은 친화도로 ACE2에 결합하는 단백질을 생성하도록 이루어질 수 있다. 이러한 단백질은, 예를 들어, 진단 목적으로 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 서열번호 4의 위치 1, 5, 6, 9, 10, 12, 13, 16, 17, 19, 20, 23, 24 및 27에 있는 잔기 중 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하 또는 1개 이하가 치환되거나, 또는 서열번호 176의 위치 3, 4, 7, 8, 10, 11, 14, 15, 17, 18, 21, 22 및 25에 있는 잔기 중 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하 또는 1개 이하가 치환되고; 서열번호 5의 위치 1, 4, 8, 12, 15, 16, 19, 22 및 23에 있는 잔기 중 3개 이하, 2개 이하 또는 1개 이하가 치환되고; 서열번호 6의 위치 7, 8, 9 또는 11에 있는 잔기 중 1개 이하가 치환되거나 서열번호 6의 위치 7, 8 또는 9에 있는 잔기 중 1개 이하가 치환된다. 일부 이러한 측면에서, 이러한 치환은 D, E, G, K, N, P, Q, R, S, 또는 T로부터 선택되는 아미노산에 의한 것이다. 일부 이러한 측면에서, 치환은 보존적 아미노산에 의한 것이다. 다른 측면에서, 다음 치환 중 하나 이상이 서열번호 4에 이루어진다: S1I; E5D; E5Q; E5V; D12V, D12E; Q24K; 및 Q24L. 다른 측면에서, 다음 치환 중 하나 이상이 서열번호 176에 이루어진다: E3D; E3Q; E3V; D10V, D10E; Q22K; 및 Q22L. 일부 예외는 있지만, 서열번호 4, 176, 5 및 6에서 X(아래첨자 숫자 포함)로서 식별된 잔기는 용매에 노출되지 않고/않거나 코로나바이러스 ACE2-결합 스파이크 단백질에 대한 결합에 직접 관여하지 않는다. 이들 잔기는 전형적으로 ACE2의 상응하는 아미노산과 상이할 수 있다. 본 발명에는 X(아래첨자 숫자 포함)로 표시되는 아미노산 중 절반 이하 또는 8개 이하가 서열번호 1로 표시되는 천연 ACE2의 상응하는 위치와 동일한 아미노산인 단백질이 포함된다. 일부 측면에서, H1에서 X(아래첨자 숫자 포함)로 표시된 아미노산 중 4, 3 또는 2개 이하; H2에서 X(아래첨자 숫자 포함)로 표시된 아미노산 중 4, 3 또는 2개 이하; 및/또는 H3에서 X(아래첨자 숫자 포함)로 표시된 아미노산 중 5, 4, 3 또는 2개 이하가 천연 ACE2의 상응하는 위치와 동일하다. ACE2에서 H1의 예시적인 상응하는 서열은 ST IEEQAKTFLD KFNHEAEDLF YQSSL(서열번호 7)이고; ACE2에서 H2의 예시적인 상응하는 서열은 NMNNAGDKWS AFLKEQSTLA QMY(서열번호 8)이고; ACE2에서 H3의 예시적인 상응하는 서열은 TAWD LGKGDFRIL(서열번호 9)이다.

알파 나선 도메인 H1

본 발명의 드노보 단백질(즉, ACE2 단백질 디코이)은 2개의 알파 나선 도메인, H1 및 H2와 선택적인 베타 헤어핀 도메인 H3을 포함할 수 있으며, 여기서:

H1은 다음 아미노산 서열을 포함하고:

SX₁X₂X₃EQX₄X₅TFX₆DKX₇X₈HEX₉EDX₁₀X₁₁YQX₁₂X₁₃L (서열번호 4) 또는

X₂X₃EQX₄X₅TFX₆DKX₇X₈HEX₉EDX₁₀X₁₁YQX₁₂X₁₃L (서열번호 176); 여기서, X₁, X₂, X₃, X₄, X₅, X₆, X₇, X₈, X₉, X₁₀, X₁₁, X₁₂, X₁₃은 임의의 아미노산으로부터 각각 독립적으로 선택된다.

본 발명에는 H1이 하기 아미노산 서열을 포함하는 본 발명의 드노보 단백질이 포함된다:

SX₁X₂X₃EQX₄X₅TFX₆DKX₇X₈HEX₉EDX₁₀X₁₁YQX₁₂X₁₃L (서열번호 4) 또는

X₂X₃EQX₄X₅TFX₆DKX₇X₈HEX₉EDX₁₀X₁₁YQX₁₂X₁₃L (서열번호 176); 여기서:

X₁은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는 A, C, E, F, G, I, L, M, N, Q, R, S, T, V, 또는 Y)로부터 선택되는 아미노산이고;

X₂는 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, V, A, D, H, I, N, P, T, 또는 W)로부터 선택되는 아미노산이며;

X₃은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, R, L, C, H, I, K, M, S, T, 또는 Y)로부터 선택되는 아미노산이고;

X₄는 C, I, L, M, T, 또는 V(바람직하게는 L, I, T, 또는 V)로부터 선택되는 아미노산이고;

X₅는 A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y (바람직하게는, A, K, C, E, I, L, N, R, V, 또는 Y)로부터 선택되는 아미노산이고;

X₆은 A, C, G, L, M, S, T, 또는 V(바람직하게는, A, C, S, 또는 T)로부터 선택되는 아미노산이며;

X₇은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, S, T, 또는 V(바람직하게는, A, C, E, F, I, L, N, Q, S, T, 또는 V)로부터 선택되는 아미노산이고;

X₈은 A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y (바람직하게는, F, D, E, H, L, M, N, Q, 또는 W)로부터 선택되는 아미노산이고;

X₉는 A, C, D, F, G, H, I, L, M, N, Q, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, M, A, C, F, G, L, S, T, 또는 V)로부터 선택되는 아미노산이며;

X₁₀은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, R, A, C, E, F, G, H, I, M, P, Q, T, V, W, 또는 Y)로부터 선택되는 아미노산이고;

X₁₁은 N, C, F, G, H, L, M, W, 또는 Y (바람직하게는, F, N, W, 또는 Y)로부터 선택되는 아미노산이고;

X₁₂는 A, C, F, G, H, I, L, M, N, Q, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, A, C, S, 또는 T)로부터 선택되는 아미노산이고;

X₁₃은 A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, Q, S, T, 또는 V(바람직하게는, A, C, F, G, L, M, N, S, T, 또는 V)로부터 선택되는 아미노산이다.

본 발명에는 H1이 하기 아미노산 서열을 포함하는 본 발명의 드노보 단백질이 포함된다:

SX₁X₂X₃EQX₄X₅TFX₆DKX₇X₈HEX₉EDX₁₀X₁₁YQX₁₂X₁₃L (서열번호 4) 또는

X₂X₃EQX₄X₅TFX₆DKX₇X₈HEX₉EDX₁₀X₁₁YQX₁₂X₁₃L (서열번호 176); 여기서:

X₁은 D, E, G, K, N, P, Q, R, S, 또는 T로부터 선택되는 아미노산이고;

X₂, X₆, X₉, X₁₁, X₁₂, 및 X₁₃은 각각 독립적으로 A, F, I, L, M, P 또는 V로부터 선택되는 아미노산이며;

X₅, X₇, X₈, 및 X₁₀은 각각 독립적으로 A, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y로부터 선택되는 아미노산이고;

X₃은 A, C, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y로부터 선택되는 아미노산이거나, 또는 A, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y로부터 선택되는 아미노산이며;

X₄는 A, F, I, L, M, P, V, D, E, G, K, N, P, Q, R, S, 또는 T로부터 선택되는 아미노산이다.

본 발명의 드노보 ACE2 단백질 디코이는 X₁에 대한 아미노산 목록에 페닐알라닌이 포함되고, X₂에 대한 아미노산 목록에 아스파라긴이 포함되며, X₈에 대한 아미노산 목록에 히스티딘이 포함되고, X₁₁의 아미노산 목록에 아스파라긴이 포함되는 전술한 것을 포함한다. 본 발명의 드노보 ACE2 단백질 디코이는 X₁에 대한 아미노산 목록에 페닐알라닌이 포함되고, X₂에 대한 아미노산 목록에 아스파라긴이 포함되며, X₃에 대한 아미노산 치환 목록으로부터 아스파라긴이 제거되고, X₄는 I, L, M, P, V, 또는 T로부터 선택되는 아미노산이고; 아스파르트산은 X₅에 대한 아미노산 치환 목록에서 제거되고, X₆은 A, L, M, 또는 V로부터 선택되는 아미노산이고; 프롤린은 X₇에 대한 아미노산 치환 목록에서 제거되며, 히스티딘은 X₈에 대한 아미노산 목록에 포함되고, 라이신과 프롤린은 제거되며, X₉에 대한 아미노산 목록에서 프롤린이 제거되고, 아스파라긴은 X₁₁에 대한 아미노산 목록에 포함되고, 알라닌, 이소류신, 프롤린 및 발린이 제거되고, 프롤린은 X₁₂ 및 X₁₃에 대한 아미노산 치환 목록에서 제거된다.

본 발명에는 본 발명의 드노보 ACE2 단백질 디코이가 포함되며, 여기서

(i) X₄는 A, F, I, L, M, P 또는 V(바람직하게는, I, L, M 또는 V)로부터 선택되는 아미노산이고; X₁, X_2, X_3, X_5, X_6, X_7, X_8, X_9, X_10, X_11, X_12, 및 X₁₃은 본원에 제공된 임의의 실시양태에 기재된 바와 같고;

(ii) X₄는 A, F, I, L, M, P 또는 V(바람직하게는, I, L, M 또는 V)로부터 선택되는 아미노산이고; X₅는 D, E, G, K, N, P, Q, R, S, 또는 T(바람직하게는 E, G, K, N, P, Q, R, S, 또는 T)로부터 선택되는 아미노산이고; X₁, X_2, X_3, X_6, X_7, X_8, X_9, X_10, X_11,X_12, 및 X₁₃은 본원에 제공된 임의의 실시양태에 기재된 바와 같으며;

(iii) X₁은 R 또는 S 또는 F로부터 선택되는 아미노산이고; X_2, X_3, X_4, X_5, X_6, X_7, X_8, X_9, X_10, X_11, X_12, 및 X₁₃은 본원에 제공된 임의의 실시양태에 기재된 바와 같고;

(iv) X₃은 R, L, A, F, I, M, P, 또는 V로부터 선택되는 아미노산이고; X_1, X_2, X_4, X_5, X_6, X_7, X_8, X_9, X_10, X_11, X_12, 및 X₁₃은 본원에 제공된 임의의 실시양태에 기재된 바와 같고;

(v) X₃은 R, L, C, 또는 S로부터 선택되는 아미노산이고; X_1, X_2, X_4, X_5, X_6, X_7, X_8, X_9, X_10, X_11, X_12, 및 X₁₃은 본원에 제공된 임의의 실시양태에 기재된 바와 같고;

(vi) X₇은 A 또는 T로부터 선택되는 아미노산이고; X_1, X_2, X_3, X_4, X_5, X_6, X_8, X_9, X_10, X_11, X_12, 및 X₁₃은 본원에 제공된 임의의 실시양태에 기재된 바와 같고;

(vii) X₁₀은 R, S 또는 L로부터 선택되는 아미노산이거나, 또는 R 또는 S로부터 선택되는 아미노산이고; X_1, X_2, X_3, X_4, X_5, X_6, X_7, X_8, X_9, X_11, X_12, 및 X₁₃은 본원에 제공된 임의의 실시양태에 기재된 바와 같고;

(viii) X₁은 R 또는 S 또는 F로부터 선택되는 아미노산; X₃은 R 또는 L로부터 선택되는 아미노산; X₇은 A 또는 T로부터 선택되는 아미노산이고; X₁₀은 R, S 또는 L로부터 선택되는 아미노산이고; X_2, X_4, X_5, X_6, X_8, X_9, X_11, X_12, 및 X₁₃은 본원에 제공된 임의의 실시양태에 기재된 바와 같고;

(ix) X₅는 D, E, G, K, N, P, Q, R, S, 또는 T(바람직하게는, E, G, K, N, P, Q, R, S, 또는 T)로부터 선택되는 아미노산이고; X_1, X_2, X_3, X_4, X_6, X_7, X_8, X_9, X_10, X_11, X_12, 및 X₁₃은 본원에 제공된 임의의 실시양태에 기재된 바와 같고;

(x) X₅는 리신이고; X_1, X_2, X_3, X_4, X_6, X_7, X_8, X_9, X_10, X_11, X_12, 및 X₁₃은 본원에 제공된 임의의 실시양태에 기재된 바와 같고;

(xi) X₉는 M 또는 L로부터 선택되는 아미노산이고; X_1, X_2, X_3, X_4, X_5, X_6, X_7, X_8, X_10, X_11, X_12, 및 X₁₃은 본원에 제공된 임의의 실시양태에 기재된 바와 같고;

(xii) X₁은 세린이고; X₃은 L이며; X_2, X_4, X_5, X_6, X_7, X_8, X_9, X_10, X_11, X_12, 및 X₁₃은 본원에 제공된 임의의 실시양태에 기재된 바와 같고; 또는

(xiii) X₈은 A, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W, 또는 Y(바람직하게는 A, D, E, F, G, I, L, M, N, Q, R, S, T, W, 또는 Y)로부터 선택되는 아미노산이거나, 또는 X₈은 F, D, E, G, K, N, P, Q, R, S, 또는 T(바람직하게는, F, D, E, G, N, Q, R, S, 또는 T)로부터 선택되는 아미노산이거나, 또는 X₈은 페닐알라닌이거나 또는 X₈은 페닐알라닌 또는 히스티딘이고; X_1, X_2, X_3, X_4, X_5, X_6, X_7, X_9, X_10, X_11, X_12, 및 X₁₃은 본원에 제공된 임의의 실시양태에 기재된 바와 같다.

본 발명의 드노보 단백질은 2개의 알파 나선 도메인, H1 및 H2와 선택적인 베타 헤어핀 도메인 H3을 포함할 수 있으며, 여기서:

H1은 다음 아미노산 서열을 포함하고:

SX₁X₂X₃EQX₄X₅TFX₆DKX₇X₈HEX₉EDX₁₀X₁₁YQX₁₂X₁₃L (서열번호 4) 또는

X₂X₃EQX₄X₅TFX₆DKX₇X₈HEX₉EDX₁₀X₁₁YQX₁₂X₁₃L (서열번호 176); 여기서,

X₁ 및 X₅는 각각 독립적으로 D, E, G, K, N, P, Q, R, S, 또는 T로부터 선택되는 아미노산이고;

X_2,X_4, X_6,X_9,X_11,X_12,및 X₁₃은 각각 독립적으로 A, F, I, L, M, P 또는 V로부터 선택되는 아미노산이며;

X_3,X_7, 및 X₁₀은 각각 독립적으로 A, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y로부터 선택되는 아미노산이고;

X₈은 A, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W, 또는 Y(보다 바람직하게는, F, D, E, G, K, N, P, Q, R, S, 또는 T)로부터 선택되는 아미노산이다. 본 발명의 드노보 단백질은 X₁에 대한 아미노산 목록에 페닐알라닌이 포함되고, X₂에 대한 아미노산 목록에 아스파라긴이 포함되며, X₈에 대한 아미노산 목록에 히스티딘이 포함되고, X₁₁에 대한 아미노산 목록에 아스파라긴이 포함되는 전술한 것을 포함한다. 본 발명의 드노보 단백질은 X₁에 대한 아미노산 목록에 페닐알라닌이 포함되고, X₂에 대한 아미노산 목록에 아스파라긴이 포함되며, X₃에 대한 아미노산 치환 목록으로부터 아스파라긴이 제거되고, X₄는 I, L, M, P, 또는 V로부터 선택되는 아미노산이고; 아스파르트산은 X₅에 대한 아미노산 치환 목록에서 제거되고, X₆은 A, L, M, 또는 V로부터 선택되는 아미노산이고; 프롤린은 X₇에 대한 아미노산 치환 목록에서 제거되며, 히스티딘은 X₈에 대한 아미노산 목록에 포함되고, 라이신 및 프롤린은 제거되며; X₉에 대한 아미노산 목록에서 프롤린이 제거되고, 아스파라긴은 X₁₁에 대한 아미노산 목록에 포함되고, 알라닌, 이소류신, 프롤린 및 발린은 제거되고, 프롤린은 X₁₂ 및 X₁₃에 대한 아미노산 치환 목록에서 제거된다.

본 발명의 드노보 단백질은 2개의 알파 나선 도메인, H1 및 H2와 선택적인 베타 헤어핀 도메인 H3을 포함할 수 있으며, 여기서 H1은 다음 아미노산 서열을 포함하고:

SX₁X₂X₃EQX₄X₅TFX₆DKX₇X₈HEX₉EDX₁₀X₁₁YQX₁₂X₁₃L (서열번호 4) 또는

X₂X₃EQX₄X₅TFX₆DKX₇X₈HEX₉EDX₁₀X₁₁YQX₁₂X₁₃L (서열번호 176); 여기서,

X₁은 R 또는 S로부터 선택되는 아미노산이고;

X₃은 R 또는 L로부터 선택되는 아미노산이며;

X₇은 A 또는 T로부터 선택되는 아미노산이고;

X₁₀은 R 또는 S 또는 L(바람직하게는 R 또는 S)로부터 선택되는 아미노산이며;

X_2, X_4, X_6, X_9, X_11, X_12, 및 X₁₃은 각각 독립적으로 A, F, I, L, M, P 또는 V로부터 선택되는 아미노산이고;

X₅는 D, E, G, K, N, P, Q, R, S, 또는 T로부터 선택되는 아미노산이고;

X₈은 A, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W, 또는 Y(바람직하게는 F, D, E, G, K, N, P, Q, R, S, 또는 T)로부터 선택되는 아미노산이다. 본 발명의 드노보 단백질은 X₁에 대한 아미노산 목록에 페닐알라닌이 포함되고, X₂에 대한 아미노산 목록에 아스파라긴이 포함되며, X₈에 대한 아미노산 목록에 히스티딘이 포함되고, X₁₁에 대한 아미노산 목록에 아스파라긴이 포함되는 전술한 것을 포함한다. 본 발명의 드노보 단백질은 X₁에 대한 아미노산 목록에 페닐알라닌이 포함되고, X₂에 대한 아미노산 목록에 아스파라긴이 포함되며, X₃에 대한 아미노산 치환 목록으로부터 아스파라긴이 제거되고, X₄는 I, L, M, P, 또는 V로부터 선택되는 아미노산이고; 아스파르트산은 X₅에 대한 아미노산 치환 목록에서 제거되고, X₆은 A, L, M, 또는 V로부터 선택되는 아미노산이고; 프롤린은 X₇에 대한 아미노산 치환 목록에서 제거되며, 히스티딘은 X₈에 대한 아미노산 목록에 포함되고, 라이신과 프롤린은 제거되며; X₉에 대한 아미노산 목록에서 프롤린이 제거되고, 아스파라긴은 X₁₁에 대한 아미노산 목록에 포함되고, 알라닌, 이소류신, 프롤린 및 발린은 제거되고, 프롤린은 X₁₂ 및 X₁₃에 대한 아미노산 치환 목록에서 제거된다.

본 발명의 드노보 단백질은 2개의 알파 나선 도메인, H1 및 H2와 선택적인 베타 헤어핀 도메인 H3을 포함할 수 있으며, 여기서 H1은 다음 아미노산 서열을 포함하고:

SX₁X₂X₃EQX₄X₅TFX₆DKX₇X₈HEX₉EDX₁₀X₁₁YQX₁₂X₁₃L (서열번호 4) 또는

X₂X₃EQX₄X₅TFX₆DKX₇X₈HEX₉EDX₁₀X₁₁YQX₁₂X₁₃L (서열번호 176); 여기서,

X₁은 R 또는 S로부터 선택되는 아미노산이고; X₂는 V이고; X₃은 R 또는 L로부터 선택되는 아미노산이고; X₄는 류신이고; X₅는 라이신이고; X₆은 알라닌이고; X₇은 A 또는 T로부터 선택되는 아미노산이고; X₈은 페닐알라닌이고; X₉는 메티오닌이고; X₁₀은 R 또는 S 또는 L(바람직하게는 R 또는 S)로부터 선택되는 아미노산이고; X₁₁은 페닐알라닌이고; X₁₂는 A이고; X₁₃은 A이다.

본 발명의 드노보 단백질은 2개의 알파 나선 도메인, H1 및 H2와 선택적인 베타 헤어핀 도메인 H3을 포함할 수 있으며, 여기서 H1은 다음 아미노산 서열을 포함하고:

SX₁X₂X₃EQX₄X₅TFX₆DKX₇X₈HEX₉EDX₁₀X₁₁YQX₁₂X₁₃L (서열번호 4) 또는

X₂X₃EQX₄X₅TFX₆DKX₇X₈HEX₉EDX₁₀X₁₁YQX₁₂X₁₃L (서열번호 176); 여기서,

X₁은 R 또는 S로부터 선택되는 아미노산이고; X₂는 발린이고; X₃은 R 또는 L 또는 C 또는 S로부터 선택되는 아미노산이고; X₄는 류신이고; X₅는 라이신이고; X₆은 알라닌이고; X₇은 A 또는 T로부터 선택되는 아미노산이고; X₈은 페닐알라닌이고; X₉는 M 또는 L이고; X₁₀은 R 또는 S 또는 L(바람직하게는 R 또는 S)로부터 선택되는 아미노산이고; X₁₁은 페닐알라닌이고; X₁₂는 알라닌이고; X₁₃은 알라닌이다.

본 발명의 드노보 단백질은 2개의 알파 나선 도메인, H1 및 H2와 선택적인 베타 헤어핀 도메인 H3을 포함할 수 있으며, 여기서 H1은 다음 아미노산 서열을 포함하고:

SX₁X₂X₃EQX₄X₅TFX₆DKX₇X₈HEX₉EDX₁₀X₁₁YQX₁₂X₁₃L (서열번호 4) 또는

X₂X₃EQX₄X₅TFX₆DKX₇X₈HEX₉EDX₁₀X₁₁YQX₁₂X₁₃L (서열번호 176); 여기서,

X₁은 R 또는 S 또는 F로부터 선택되는 아미노산이고; X₂는 N 또는 V로부터 선택되는 아미노산이며; X₃은 R 또는 L 또는 C 또는 S로부터 선택되는 아미노산이고; X₄는 류신이고; X₅는 라이신이고; X₆은 알라닌이고; X₇은 A 또는 T로부터 선택되는 아미노산이고; X₈은 F 또는 H로부터 선택되는 아미노산이고; X₉는 M 또는 L로부터 선택되는 아미노산이고; X₁₀은 R 또는 S 또는 L(바람직하게는 R 또는 S)로부터 선택되는 아미노산이고; X₁₁은 F 또는 N으로부터 선택되는 아미노산이고; X₁₂는 알라닌이고; X₁₃은 알라닌이다.

본 발명의 드노보 단백질은 2개의 알파 나선 도메인, H1 및 H2와 선택적인 베타 헤어핀 도메인 H3을 포함할 수 있으며, 여기서 H1은 다음 아미노산 서열을 포함하고:

SX₁X₂X₃EQX₄X₅TFX₆DKX₇X₈HEX₉EDX₁₀X₁₁YQX₁₂X₁₃L (서열번호 4) 또는

X₂X₃EQX₄X₅TFX₆DKX₇X₈HEX₉EDX₁₀X₁₁YQX₁₂X₁₃L (서열번호 176); 여기서, (i) X₈은 발린이 아니거나, 또는 (ii) X₈은 V, A, I, L, M, 또는 P로부터 선택되는 아미노산이고 아니거나, 또는 (iii) X₈은 페닐알라닌이고; X_1, X_2, X_3, X_4, X_5, X_6, X_7, X_9, X_10, X_11, X_12, 및 X₁₃은 본원에 제공된 임의의 실시양태에서 본원에 기재된 바와 같다.

본 발명의 드노보 단백질은 2개의 알파 나선 도메인, H1 및 H2와 선택적인 베타 헤어핀 도메인 H3을 포함할 수 있으며, 여기서 H1은 다음 아미노산 서열을 포함한다:

SX₁X₂X₃EQX₄X₅TFX₆DKX₇X₈HEX₉EDX₁₀X₁₁YQX₁₂X₁₃L X₃₇X₃₈X₃₉X₄₀X₄₁X₄₂ X₄₃X₄₄X₄₅X₄₆ (서열번호 10);

여기서, X₁ 내지 X₁₃은 H1에 대해 본원의 임의의 실시양태에 제공된 바와 같고; 및 X₃₇, X_38, X_41, X_42, X_45, 및 X₄₆은 각각 독립적으로 임의의 아미노산으로부터 선택된다. 일부 측면에서, X₁ 내지 X₁₃은 H1에 대해 본원의 임의의 실시양태에 제공된 바와 같고; 및 X₃₇, X_38, X_41, X_42, X_45, 및 X₄₆은 각각 독립적으로 A, F, I, L, M, P 또는 V로부터 선택되는 아미노산이고;

X₄₀ 및 X₄₄는 각각 독립적으로 A, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y로부터 선택되는 아미노산이며;

X₃₉는 A, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는 A, F, I, L, M, P 또는 V)로부터 선택되는 아미노산이고;

X₄₃은 D, E, G, K, N, P, Q, R, S, 또는 T로부터 선택되는 아미노산이다. 본 발명의 드노보 단백질은 X₃₇에 대한 아미노산 목록에서 이소류신이 제거되고, X₃₈에 대한 아미노산 목록에서 프롤린이 제거되며; X₃₉는 F, I, L, M, V, W, 또는 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X₄₀에 대한 아미노산 목록에는 히스티딘이 포함되고 프롤린이 제거되며, X₄₁에 대한 아미노산 목록에는 프롤린이 제거되고; 아미노산 T 및 Y는 X₄₂에 대한 아미노산 목록에 포함되는 상기 단백질이 포함된다. 일부 이러한 측면에서, X₄₂는 A 또는 V로부터 선택되는 아미노산이다.

또한, 본 발명에는 X₁, X₂, X₃, X₄, X₅, X₆, X₇, X₈, X₉, X₁₀, X₁₁, X₁₂, X₁₃이 본원의 임의의 실시양태에 기재된 바와 같고, 서열번호 4의 위치 1, 5, 6, 9, 10, 12, 13, 16, 17, 19, 20, 23, 24 및 27에 있는 아미노산 중 하나 이상(바람직하게는 1 내지 3개 이하)(또는 서열번호 176의 동등 위치)이 치환된 ACE2 단백질 디코이도 포함된다. 예를 들어, 일부 측면에서는 다음 치환 중 하나 이상이 이루어진다: S1I; E5D; E5Q; E5V; D12V, D12E; Q24L; 및 Q24K. 일부 측면에서, 다음 치환 중 하나가 서열번호 4에 이루어진다: S1I; E5D; E5Q; E5V; D12V, D12E; Q24L; 및 Q24K(또는 서열번호 176의 동등 위치). 일부 측면에서, 다음 치환 중 하나 이상이 서열번호 4에 이루어진다: T9F, D12I, D12N, E17I, Y23H 또는 서열번호 176의 동등 위치).

일부 실시양태에서, 본 발명의 드노보 단백질은 단 X₄가 D, E, G, H, K, N, P, Q, R, S, W, 또는 Y로부터 선택되는 아미노산이 아니고; X₆은 D, E, F, H, K, P, Q, R, W, 또는 Y로부터 선택되는 아미노산이 아니며; X₇은 P가 아니고; X₈은 프롤린이 아니며; X₉는 K, P, 또는 R로부터 선택되는 아미노산이 아니고; X₁₁은 D E, K, P, R, T 또는 V로부터 선택되는 아미노산이 아니고; X₁₂는 K, P, 또는 R로부터 선택되는 아미노산이 아니고; X₁₃은 P 또는 W로부터 선택되는 아미노산이 아니며; X₃₈은 H, K, P, 또는 R로부터 선택되는 아미노산이 아니고; X₃₉는 D, E, G, K, 또는 P로부터 선택되는 아미노산이 아니고; 및/또는 X₄₁은 프롤린이 아닌, 본원에 기재된 것을 포함한다.

본 발명의 ACE2 단백질 디코이는 H1이 서열번호 11-17, 177-183, 198 또는 199에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것을 포함한다:

본 발명의 ACE2 단백질 디코이는 H1이 서열번호 15 (SSVLEQLKTFADKAFHEMEDRFYQAAL) (서열번호15)에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것을 포함한다:

여기서, 위치 1의 아미노산은 S 또는 치환된다면 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W, 또는 Y이고;

위치 2의 아미노산은 S 또는 치환된다면 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W, 또는 Y이며;

위치 3의 아미노산은 V 또는 치환된다면 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W, 또는 Y이고;

위치 4의 아미노산은 L 또는 치환된다면 A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이고;

위치 5의 아미노산은 E 또는 치환된다면 A, C, D, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이고;

위치 6의 아미노산은 Q 또는 치환된다면 A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, S, T, V, 또는 W이고;

위치 7의 아미노산은 L 또는 치환된다면 C, I, M, T, 또는 V이고;

위치 8의 아미노산은 K 또는 치환된다면 A, C, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이고;

위치 9의 아미노산은 T 또는 치환된다면 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, V, W, 또는 Y이고;

위치 10의 아미노산은 F 또는 치환된다면 A, C, H, V, W, 또는 Y이고;

위치 11의 아미노산은 A 또는 치환된다면 C, G, L, M, S, T, 또는 V이고;

위치 12의 아미노산은 D 또는 치환된다면 A, C, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이고;

위치 13의 아미노산은 K 또는 치환된다면 A, C, F, H, I, L, M, N, Q, R, S, V, W, 또는 Y이고;

위치 14의 아미노산은 A 또는 치환된다면 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, S, T, 또는 V이고;

위치 15의 아미노산은 F 또는 치환된다면 A, C, D, E, G, H, I, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이고;

위치 16의 아미노산은 H 또는 치환된다면 A, C, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이고;

위치 17의 아미노산은 E 또는 치환된다면 A, C, D, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이고;

위치 18의 아미노산은 M 또는 치환된다면 A, C, D, F, G, H, I, L, N, Q, S, T, V, W, 또는 Y이고;

위치 19의 아미노산은 E 또는 치환된다면 D, M, N, P, Q, T, 또는 V이고;

위치 20의 아미노산은 D 또는 치환된다면 E, F, G, H, L, N, 또는 Q이고;

위치 21의 아미노산은 R 또는 치환된다면 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W, 또는 Y이고;

위치 22의 아미노산은 F 또는 치환된다면 C, G, H, L, M, N, W, 또는 Y이고;

위치 23의 아미노산은 Y 또는 치환된다면 H, D, 또는 F이고;

위치 24의 아미노산은 Q 또는 치환된다면 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, W, 또는 Y이고;

위치 25의 아미노산은 A 또는 치환된다면 C, F, G, H, I, L, M, N, Q, S, T, V, W, 또는 Y이고;

위치 26의 아미노산은 A 또는 치환된다면 C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, Q, S, T, 또는 V이고;

위치 27의 아미노산은 L 또는 치환된다면 A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이다. 또한, 위치 1 및 2의 아미노산이 존재하지 않는 ACE-2 단백질 디코이도 포함된다. 일부 특히 바람직한 실시양태에서, 위치 1, 5, 6, 9, 10, 12, 13, 16, 17, 19, 20, 23, 24 및 27의 아미노산 중 3개, 2개, 또는 1개 이하가 치환된다.

일부 측면에서, H1은 C 말단에 추가 아미노산을 포함한다(예를 들어, C 말단에 추가 11개 아미노산). 본원에서 H1에 대한 임의의 실시형태(서열번호 11-17, 177-183, 198 또는 199에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가진 H1을 포함)에서, 아미노산 서열AVFEAAEAAAG(서열번호 18), AVWEAAEAAAG(서열번호 19), AVFEAVEAAAG(서열번호 249) 또는 AVWEAVEAAAG(서열번호 250)는 C 말단에 선택적으로 존재할 수 있다.

따라서, 일부 측면에서, H1은 서열번호 240-243 또는 251-254에 제시된 서열에 대해 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함한다:

알파 나선 도메인 H2

본 발명의 드노보 단백질은 2개의 알파 나선 도메인, H1 및 H2와 선택적인 베타 헤어핀 도메인 H3을 포함할 수 있고, 여기서 H2는 다음 아미노산 서열을 포함한다:

NX₁₄X₁₅NX₁₆X₁₇X₁₈KX₁₉X₂₀X₂₁FX₂₂X₂₃EQX₂₄X₂₅LX₂₆X₂₇MY (서열번호 5)

여기서, X₁₄, X₁₅, X₁₆, X₁₇, X₁₈, X₁₉, X₂₀, X₂₁, X₂₂, X₂₃, X₂₄, X₂₅, X₂₆, X₂₇은 각각 독립적으로 임의의 아미노산으로부터 선택된다.

본 발명에는 H2가 하기 아미노산 서열을 포함하는 본 발명의 드노보 단백질이 포함된다:

NX₁₄X₁₅NX₁₆X₁₇X₁₈KX₁₉X₂₀X₂₁FX₂₂X₂₃EQX₂₄X₂₅LX₂₆X₂₇MY (서열번호 5)

여기서, X₁₄는 A, C, D, G, H, I, L, M, N, P, R, S, T, V, 또는 W(바람직하게는, A, C, G, P, T, 또는 V)로부터 선택되는 아미노산이고;

X₁₅는 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, A, C, D, E, F, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, 또는 V)로부터 선택되는 아미노산이며;

X₁₆은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, A, C, E, H, I, L, M, N, Q, R, S, V, W, 또는 Y)로부터 선택되는 아미노산이고;

X₁₇은 A, C, D, E, G, I, L, M, N, P, Q, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, A, C, G, I, 또는 S)로부터 선택되는 아미노산이며;

X₁₈은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, Y, 또는 W(바람직하게는 A, C, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, 또는 Y)로부터 선택되는 아미노산이고;

X₁₉는 A, C, D, G, I, L, Q, S, T, V, 또는 W (바람직하게는, A, L, T, 또는 V)로부터 선택되는 아미노산이고;

X₂₀은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y (바람직하게는, A, C, D, E, F, G, H, I, K, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y)로부터 선택되는 아미노산이며;

X₂₁은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y (바람직하게는, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, R, S, T, V, 또는 W)로부터 선택되는 아미노산이고;

X₂₂는 A, C, D, F, G, I, L, M, N, S, T, V, W, 또는 Y (바람직하게는, A, C, F, G, I, L, S, 또는 T)로부터 선택되는 아미노산이며;

X₂₃은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y (바람직하게는, A, C, D, E, G, H, I, L, M, N, R, S, T, V, 또는 Y)로부터 선택되는 아미노산이고;

X₂₄는 A, C, E, F, G, I, L, M, Q, S, T, V, 또는 W (바람직하게는, A, I, 또는 S)로부터 선택되는 아미노산이며;

X₂₅는 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y (바람직하게는, K, D, G, H, I, Q, 또는 R)로부터 선택되는 아미노산이고;

X₂₆은 A, C, F, G, I, L, S, T, V, 또는 Y (바람직하게는, A, 또는 I)로부터 선택되는 아미노산이며;

X₂₇은 A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y (바람직하게는, D, C, F, I, S, 또는 T)로부터 선택되는 아미노산이다.

본 발명에는 H2가 다음 아미노산 서열을 포함하는 본 발명의 드노보 단백질이 포함된다:

NX₁₄X₁₅NX₁₆X₁₇X₁₈KX₁₉X₂₀X₂₁FX₂₂X₂₃EQX₂₄X₂₅LX₂₆X₂₇MY (서열번호 5)

여기서, X₁₅, X₁₈, X₂₁, X₂₃, X₂₅, 및 X₂₇은 각각 독립적으로 D, E, G, K, N, P, Q, R, S, 또는 T로부터 선택되는 아미노산이고;

X₁₄, X₁₆, X₁₇, X₁₉, X₂₂, X₂₄, 및 X₂₆은 각각 독립적으로 A, F, I, L, M, P 또는 V로부터 선택되는 아미노산이며;

X₂₀은 A, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y로부터 선택되는 아미노산이다. 드노보 단백질은 X₁₄ 및 X₁₇에 대한 아미노산 목록에서 페닐알라닌이 제거되고, X₁₈에 대한 아미노산 목록에 티로신이 포함되며, X₁₉에 대한 아미노산 목록에서 글루탐산 및 프롤린이 제거되고, X₂₀, X₂₂, X₂₃, X₂₄ 및 X₂₅에 대한 아미노산 목록에서 프롤린이 제거되며, X₂₁에 대한 아미노산 목록에 메티오닌이 포함되고, X₂₃에 대한 아미노산 목록에 히스티딘이 포함되고, X₂₆에 대한 아미노산 목록에서 메티오닌 및 프롤린이 제거되며, 이소류신이 X₂₇에 대한 아미노산 목록에 포함되고, 라이신 및 프롤린이 제거된 것을 포함한다.

본 발명에는 H2가 다음 아미노산 서열을 포함하는 본 발명의 드노보 단백질이 포함된다:

NX₁₄X₁₅NX₁₆X₁₇X₁₈KX₁₉X₂₀X₂₁FX₂₂X₂₃EQX₂₄X₂₅LX₂₆X₂₇MY (서열번호 5)

여기서, X₁₅, X₁₈, X₂₁, X₂₃, X₂₅, 및 X₂₇은 각각 독립적으로 D, E, G, K, N, P, Q, R, S, 또는 T로부터 선택되는 아미노산이고;

X₁₄, X₁₇, X₂₂, X₂₄, 및 X₂₆은 각각 독립적으로 A, F, I, L, M, P 또는 V로부터 선택되는 아미노산이며;

X₁₆은 A, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y로부터 선택되는 아미노산이고;

X₁₉는 A, F, I, L, M, P, E, T, 또는 V로부터 선택되는 아미노산이고;

X₂₀은 A, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y로부터 선택되는 아미노산이다. 드노보 단백질은 X₁₄ 및 X₁₇에 대한 아미노산 목록에서 페닐알라닌이 제거되고, X₁₈에 대한 아미노산 목록에 티로신이 포함되고, X₁₉에 대한 아미노산 목록에서 글루탐산 및 프롤린이 제거되고, X₂₀, X₂₂, X₂₃, X₂₄ 및 X₂₅에 대한 아미노산 목록에서 프롤린이 제거되고, X₂₁에 대한 아미노산 목록에 메티오닌이 포함되고, X₂₃에 대한 아미노산 목록에 히스티딘이 포함되며, X₂₆에 대한 아미노산 목록에서 메티오닌 및 프롤린이 제거되고, 이소류신이 X₂₇에 대한 아미노산 목록에 포함되고, 라이신 및 프롤린이 제거된 상기 단백질을 포함한다.

본 발명에는 H2가 다음 아미노산 서열을 포함하는 본 발명의 드노보 단백질이 포함된다:

NX₁₄X₁₅NX₁₆X₁₇X₁₈KX₁₉X₂₀X₂₁FX₂₂X₂₃EQX₂₄X₂₅LX₂₆X₂₇MY (서열번호 5)

여기서, X₁₅, X₁₈, X₂₁, X₂₃, X₂₅, 및 X₂₇은 각각 독립적으로 D, E, G, K, N, P, Q, R, S, 또는 T로부터 선택되는 아미노산이고;

X₁₄, X₁₇, X₁₉, X₂₂, X₂₄, 및 X₂₆은 각각 독립적으로 A, F, I, L, M, P 또는 V로부터 선택되는 아미노산이며;

X₁₆은 A, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y (바람직하게는, A, F, I, L, M, P, E, 또는 V)로부터 선택되는 아미노산이고, 및

X₂₀은 A, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y로부터 선택되는 아미노산이다.

드노보 단백질은 X₁₄ 및 X₁₇에 대한 아미노산 목록에서 페닐알라닌이 제거되고, X₁₈에 대한 아미노산 목록에 티로신이 포함되고, X₁₉에 대한 아미노산 목록에서 글루탐산 및 프롤린이 제거되고, X₂₀, X₂₂, X₂₃, X₂₄ 및 X₂₅에 대한 아미노산 목록에서 프롤린이 제거되고, X₂₁에 대한 아미노산 목록에 메티오닌이 포함되고, X₂₃에 대한 아미노산 목록에 히스티딘이 포함되며, X₂₆에 대한 아미노산 목록에서 메티오닌 및 프롤린이 제거되고, 이소류신이 X₂₇에 대한 아미노산 목록에 포함되고, 라이신 및 프롤린이 제거된 상기 단백질을 포함한다.

본 발명의 드노보 단백질은 2개의 알파 나선 도메인, H1 및 H2와, 선택적인 베타 헤어핀 도메인 H3을 포함할 수 있고, 여기서 H2는 다음 아미노산 서열을 포함한다:

NX₁₄X₁₅NX₁₆X₁₇X₁₈KX₁₉X₂₀X₂₁FX₂₂X₂₃EQX₂₄X₂₅LX₂₆X₂₇MY (서열번호 5)

여기서,

X₁₄는 A 또는 V이고,

X₁₆은 A 또는 E (또는 X₁₆은 A 또는 E 또는 N)이며,

X₂₀은 K 또는 Q이고,

X₁₅, X₁₈, X₂₁, X₂₃, X₂₅, 및 X₂₇은 각각 독립적으로 D, E, G, K, N, P, Q, R, S, 또는 T로부터 선택되는 아미노산이고;

X₁₇, X₁₉, X₂₂, X₂₄, 및 X₂₆은 각각 독립적으로 A, F, I, L, M, P 또는 V로부터 선택되는 아미노산이다. 본 발명의 드노보 단백질은 X₁₇에 대해, 티로신이 X₁₈에 대한 아미노산 목록에 포함되고, 프롤린이 X₁₉에 대한 아미노산 목록에서 제거되며, 프롤린이 X₂₂, X₂₃, X₂₄ 및 X₂₅에 대한 아미노산 목록에서 제거되고, 메타오닌이 X₂₁에 대한 아미노산 목록에 포함되고, 히스티딘이 X₂₃에 대한 아미노산 목록에 포함되고, 메티오닌 및 프롤린이 X₂₆에 대한 아미노산 목록에서 제거되고, 이소류신이 X₂₇에 대한 아미노산 목록에 포함되고, 라이신 및 프롤린이 제거된 상기 단백질을 포함한다다.

본 발명의 드노보 단백질은 2개의 알파 나선 도메인, H1 및 H2와, 선택적인 베타 헤어핀 도메인 H3을 포함할 수 있고, 여기서 H2는 다음 아미노산 서열을 포함한다:

NX₁₄X₁₅NX₁₆X₁₇X₁₈KX₁₉X₂₀X₂₁FX₂₂X₂₃EQX₂₄X₂₅LX₂₆X₂₇MY (서열번호 5)

여기서,

X₁₄는 A 또는 V; X₁₅는 E; X₁₆은 A 또는 E; X₁₇은 A; X₁₈은 R; X₁₉는 A; X₂₀은 K 또는 Q이고;

X₂₁은 E; X₂₂는 A; X₂₃은 E; X₂₄는 A; X₂₅는 K; X₂₆은 A; 및 X₂₇은 D이다.

본 발명의 드노보 단백질은 2개의 알파 나선 도메인, H1 및 H2와, 선택적인 베타 헤어핀 도메인 H3을 포함할 수 있고, 여기서 H2는 다음 아미노산 서열을 포함한다:

NX₁₄X₁₅NX₁₆X₁₇X₁₈KX₁₉X₂₀X₂₁FX₂₂X₂₃EQX₂₄X₂₅LX₂₆X₂₇MY (서열번호 5)

여기서, X₁₄, X₁₇, X₁₉, X₂₂, X₂₄, 및 X₂₆은 각각 독립적으로 A, F, I, L, M, P 또는 V로부터 선택되는 아미노산이고;

X₁₅는 E이고;

X₁₆은 A, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y (바람직하게는, A, F, I, L, M, P, E, 또는 V)로부터 선택되는 아미노산이고;

X₁₈은 R이고;

X₂₀은 A, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y로부터 선택되는 아미노산이고;

X₂₁은 E이고;

X₂₃은 E이고;

X₂₅는 K이고;

X₂₇은 D이다. 본 발명의 드노보 단백질은 페닐알라닌이 X₁₄ 및 X₁₇에 대한 아미노산 목록에서 제거되고, 프롤린이 X₂₀, X₂₂, 및 X₂₄에 대한 아미노산 목록에서 제거되며, 메티오닌 및 프롤린이 X₂₆에 대한 아미노산 목록에서 제거되는 상기 단백질을 포함한다.

일부 이러한 측면에서, X₁₄는 A 또는 V로부터 선택되는 아미노산이고; X₁₆은 A 또는 E로부터 선택되는 아미노산이며; X₂₀은 K 또는 Q로부터 선택되는 아미노산이다.

본 발명의 드노보 단백질은 2개의 알파 나선 도메인, H1 및 H2와, 선택적인 베타 헤어핀 도메인 H3을 포함할 수 있고, 여기서 H2는 다음 아미노산 서열을 포함한다:

NX₁₄X₁₅NX₁₆X₁₇X₁₈KX₁₉X₂₀X₂₁FX₂₂X₂₃EQX₂₄X₂₅LX₂₆X₂₇MY (서열번호 5)

여기서,

X₁₄는 A 또는 V로부터 선택되는 아미노산이고

X₁₆은 A 또는 E로부터 선택되는 아미노산이며

X₂₀은 K 또는 Q로부터 선택되는 아미노산이고

X₁₅, X₁₇, X₁₈, X₁₉, X₂₁, X₂₂, X₂₃, X₂₄, X₂₆ X₂₅, X₂₆ 및 X₂₇은 본원의 임의의 실시양태에 제공된 바와 같은 것일 수 있다.

본 발명의 드노보 단백질은 2개의 알파 나선 도메인, H1 및 H2와, 선택적인 베타 헤어핀 도메인 H3을 포함할 수 있고, 여기서 H2는 다음 아미노산 서열을 포함한다:

NX₁₄X₁₅NX₁₆X₁₇X₁₈KX₁₉X₂₀X₂₁FX₂₂X₂₃EQX₂₄X₂₅LX₂₆X₂₇MY (서열번호 5)

여기서,

(i) X₁₅는 E이고, X₁₄, X₁₆, X₁₇, X₁₈, X₁₉, X₂₀, X₂₁, X₂₂, X₂₃, X₂₄, X_25, X₂₆, 및 X₂₇는 H2에 대해 본원의 임의의 실시양태에 제공된 바와 같고;

(ii) X₁₈은 R이고, X₁₄, X_15, X₁₆, X₁₇, X₁₉, X₂₀, X₂₁, X₂₂, X₂₃, X₂₄, X_25, X₂₆, 및 X₂₇은 H2에 대해 본원의 임의의 실시양태에 제공된 바와 같고;

(iii) X₂₁은 E이고 X₁₄, X_15, X₁₆, X₁₇, X₁₈, X₁₉, X₂₀, X₂₂, X₂₃, X₂₄, X_25, X₂₆, 및 X₂₇은 H2에 대해 본원의 임의의 실시양태에 제공된 바와 같고;

(iv) X₂₃은 E이고 X₁₄, X_15, X₁₆, X₁₇, X₁₈, X₁₉, X₂₀, X₂₁, X₂₂, X₂₄, X_25, X₂₆, 및 X₂₇은 H2에 대해 본원의 임의의 실시양태에 제공된 바와 같고;

(v) X₂₅는 K이고 X₁₄, X_15, X₁₆, X₁₇, X₁₈, X₁₉, X₂₀, X₂₁, X₂₂, X₂₃, X₂₄, X₂₆, 및 X₂₇은 H2에 대해 본원의 임의의 실시양태에 제공된 바와 같고;

(vi) X₂₆은 A이고 X₁₄, X_15, X₁₆, X₁₇, X₁₈, X₁₉, X₂₀, X₂₁, X₂₂, X₂₃, X₂₄, X_25, 및 X₂₇은 H2에 대해 본원의 임의의 실시양태에 제공된 바와 같고;

(vii) X₂₇은 D이고 X₁₄, X_15, X₁₆, X₁₇, X₁₈, X₁₉, X₂₀, X₂₁, X₂₂, X₂₃, X₂₄, X_25, 및 X₂₆은 H2에 대해 본원의 임의의 실시양태에 제공된 바와 같고;

(viii) X₁₆은 A이고 X₁₄, X₁₅, X₁₇, X₁₈, X₁₉, X₂₀, X₂₁, X₂₂, X₂₃, X₂₄, X_25, X₂₆, 및 X₂₇은 H2에 대해 본원의 임의의 실시양태에 제공된 바와 같고; 또는

(ix) 다음 중 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개가 진실이다: X₁₅는 E; X₁₈은 R; X₂₁은 E; X₂₃은 E; X₂₅는 K; 및 X₂₇은 D.

본 발명의 드노보 단백질은 2개의 알파 나선 도메인, H1 및 H2와, 선택적인 베타 헤어핀 도메인 H3을 포함할 수 있고, 여기서 H2는 다음 아미노산 서열을 포함한다:

X₄₇X₄₈X₄₉X₅₀X₅₁NX₁₄X₁₅NX₁₆X₁₇X₁₈KX₁₉X₂₀X₂₁FX₂₂X₂₃EQX₂₄X₂₅LX₂₆X₂₇MYX₅₂ X₅₃X₅₄X₅₅X₅₆ (서열번호 20)

여기서, X₁₄-X₂₇은 H2에 대해 본원의 임의의 실시양태에 제공된 바와 같고; X₄₇, X_48, X_49, X_50, X_51, X_52, X_53, X_54, X_55, 및 X₅₆은 각각 독립적으로 임의의 아미노산으로부터 선택된다. 일부 측면에서, X₁₄-X₂₇은 H2에 대해 본원의 임의의 실시양태에 제공된 바와 같고; 및

X₄₉, X_52, 및 X₅₅는 각각 독립적으로 A, F, I, L, M, P 또는 V로부터 선택되는 아미노산이고;

X₅₀은 A, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y로부터 선택되는 아미노산이며;

X₅₄는 A, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y (바람직하게는 A, F, I, L, M, P 또는 V)로부터 선택되는 아미노산이고;

X₄₇, X_48, X_51, X_53, 및 X₅₆은 각각 독립적으로 D, E, G, K, N, P, Q, R, S, 또는 T로부터 선택되는 아미노산이다.

본 발명의 드노보 단백질은 시스테인 및 글루타민이 X₄₇에 대한 아미노산 목록에 포함되고, 라이신이 제거되고, 페닐알라닌 및 티로신이 X₄₈에 대한 아미노산 목록에 포함되며, X₅₂ 및 X₅₄에 대한 아미노산 목록에 히스티딘이 포함되고, X₅₆에 대한 아미노산 목록에서 아스파르트산이 제거된 상기 단백질을 포함한다.

본 발명에는 X₁₄-X₂₇이 H2에 대해 본원의 임의의 실시양태에 제공된 바와 같고;

X₄₉, X_52, 및 X₅₅는 각각 독립적으로 A, F, I, L, M, P 또는 V로부터 선택되는 아미노산이고;

X₅₀은 A, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y로부터 선택되는 아미노산이며;

X₅₄는 A, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y (바람직하게는 A, F, I, L, M, P 또는 V)로부터 선택되는 아미노산이고;

X_48, X_51, X_53, 및 X₅₆은 각각 독립적으로 D, E, G, K, N, P, Q, R, S, 또는 T로부터 선택되는 아미노산이며; X₄₇은 G인 ACE2 단백질 디코이가 포함된다. 본 발명의 드노보 단백질은 시스테인 및 글루타민이 X₄₇에 대한 아미노산 목록에 포함되고, 라이신이 제거되고, 페닐알라닌 및 티로신이 X₄₈에 대한 아미노산 목록에 포함되며, X₅₂ 및 X₅₄에 대한 아미노산 목록에 히스티딘이 포함되고, X₅₆에 대한 아미노산 목록에서 아스파르트산이 제거된 상기 단백질을 포함한다.

본 발명에는 X₁₄-X₂₇이 H2에 대해 본원의 임의의 실시양태에 제공된 바와 같고;

X₄₉, X_52, 및 X₅₅가 각각 독립적으로 A, F, I, L, M, P 또는 V로부터 선택되는 아미노산이고;

X₅₀은 A, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y로부터 선택되는 아미노산이며;

X₅₄는 L이고; X_48, X_51, X_53, 및 X₅₆은 각각 독립적으로 D, E, G, K, N, P, Q, R, S, 또는 T로부터 선택되는 아미노산이고; X₄₇은 G인 ACE2 단백질 디코이가 포함된다. 본 발명의 드노보 단백질은 X₄₈에 대한 아미노산 목록에서 페닐알라닌 및 티로신이 포함되며, X₅₂에 대한 아미노산 목록에 히스티딘이 포함되고, X₅₆에 대한 아미노산 목록에서 아스파르트산이 제거된 상기 단백질을 포함한다.

일부 측면에서, X₄₇은 G 또는 E; X₄₈은 D; X₄₉는 A; X₅₀은 A; 및 X₅₁은 R이다. 일부 이러한 측면에서, X₄₇은 G이다. 다른 이러한 측면에서, X₄₇은 E이다.

일부 측면에서, X₅₂는 A; X₅₃은 E; X₅₄는 L 또는 F 또는 N; X₅₅는 A; 및 X₅₆은 K이다. 일부 이러한 측면에서, X₅₄는 L이다. 다른 이러한 측면에서, X₅₄는 F이다. 또 다른 측면에서, X₅₄는 N이다.

또한, 본 발명에는 서열번호 5의 아미노산 위치 1, 4, 8, 12, 15, 16, 19, 22 및 23 중 하나 이상(바람직하게는 1개 내지 3개 이하)이 치환되고 X₁₄, X₁₅, X₁₆, X₁₇, X₁₈, X₁₉, X₂₀, X₂₁, X₂₂, X₂₃, X₂₄, X₂₅, X₂₆, X₂₇이 본원에 제공된 임의의 실시양태에 기재된 바와 같은 상기 ACE2 단백질 디코이가 포함된다. 예를 들어, 일부 측면에서, 다음과 같은 치환, E15G가 이루어진다. 일부 측면에서, 다음 치환 중 하나 이상이 이루어진다: Q16N, Q16Y, L19Y, 또는 M22H.

본 발명의 드노보 단백질은 X₄가 K 또는 R로부터 선택되는 아미노산이 아니고; X₂₂가 E, K, Q, 또는 R로부터 선택되는 아미노산이 아니며; X₂₃이 P로부터 선택되는 아미노산이 아니고; X₂₄가 D 또는 P로부터 선택되는 아미노산이 아니고; X₂₆이 D, E, H, K, P, Q, 또는 R로부터 선택되는 아미노산이 아니고; X₉가 K, P, 또는 R이 아니고; X₂₇이 P가 아닌 것을 포함한다.

본 발명의 드노보 단백질은 H2가 하기에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것을 포함한다:

NAENAARKAKEFAEEQAKLADMY (서열번호 21)

NVENEARKAQEFAEEQAKLADMY (서열번호 22)

본 발명의 ACE2 단백질 디코이는 H2가 서열번호 21에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것을 포함한다:

여기서, 위치 1의 아미노산은 N 또는 치환된다면 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이고;

위치 2의 아미노산은 A 또는 치환된다면 C, D, G, H, I, L, M, N, P, R, S, T, V, 또는 W이며;

위치 3의 아미노산은 E 또는 치환된다면 A, C, D, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이고;

위치 4의 아미노산은 N 또는 치환된다면 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이고;

위치 5의 아미노산은 A 또는 치환된다면 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이고;

위치 6의 아미노산은 A 또는 치환된다면 C, D, E, G, I, L, M, N, P, Q, S, T, V, W, 또는 Y이고;

위치 7의 아미노산은 R 또는 치환된다면 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, Y, 또는 W이고;

위치 8의 아미노산은 K 또는 치환된다면 A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이고;

위치 9의 아미노산은 A 또는 치환된다면 C, D, G, I, L, Q, S, T, V, 또는 W이고;

위치 10의 아미노산은 K 또는 치환된다면 A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, Q, R, S, T, V, 또는 W이고;

위치 11의 아미노산은 E 또는 치환된다면 A, C, D, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이고;

위치 12의 아미노산은 F 또는 치환된다면 A, C, D, E, G, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이고;

위치 13의 아미노산은 A 또는 치환된다면 C, D, F, G, I, L, M, N, S, T, V, W, 또는 Y이고;

위치 14의 아미노산은 E 또는 치환된다면 A, C, D, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이고;

위치 15의 아미노산은 E 또는 치환된다면 A, C, D, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이고;

위치 16의 아미노산은 Q 또는 치환된다면 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, R, S, T, Y, 또는 V이고;

위치 17의 아미노산은 A 또는 치환된다면 C, E, F, G, I, L, M, Q, S, T, V, 또는 W이고;

위치 18의 아미노산은 K 또는 치환된다면 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이고;

위치 19의 아미노산은 L 또는 치환된다면 A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, Q, R, S, T, V, Y, 또는 W이고;

위치 20의 아미노산은 A 또는 치환된다면 C, F, G, I, L, S, T, V, 또는 Y이고;

위치 21의 아미노산은 D 또는 치환된다면 A, C, E, F, G, H, I, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이고;

위치 22의 아미노산은 M 또는 치환된다면 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이고;

위치 23의 아미노산은 Y 또는 치환된다면 D, F, H, I, L, M, 또는 V이다.

또한, 위치 1, 4, 8, 12, 15, 16, 19, 22 및 23의 아미노산 중 3개, 2개 또는 1개 이하가 치환된 ACE-2 단백질 디코이가 포함된다.

일부 측면에서, H2는 N 말단에 추가 아미노산(예를 들어, N 말단에 적어도 5개의 추가 아미노산)을 포함한다. 일부 측면에서, 아미노산 서열 EDAAR(서열번호 23) 또는 GDAAR(서열번호 24)이 N 말단에 존재한다. 따라서, 일부 측면에서, H1은 서열 GDAAR NAENAARKAKEFAEEQAKLADMY AELAK (서열번호 244)에 대해 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.

일부 측면에서, H2는 C 말단에 추가 아미노산(예를 들어, C 말단에 적어도 5개의 추가 아미노산)을 포함한다. 일부 측면에서, 아미노산 서열 AELAK(서열번호 25) 또는 AEFAK(서열번호 26) 또는 AENAK(서열번호 27)가 C 말단에 존재한다.

일부 측면에서, 아미노산 서열 AELAK(서열번호 25)는 C 말단에 존재하고, 아미노산 서열 GDAAR(서열번호 24)은 N 말단에 존재한다.

베타 도메인 H3

본 발명의 드노보 단백질은 2개의 알파 나선 도메인, H1 및 H2와, 선택적인 베타 헤어핀 도메인 H3을 포함할 수 있고, 여기서 H3은 존재한다면, 다음 아미노산 서열을 포함한다:

X₂₈X₂₉X₃₀X₃₁X₃₂X₃₃KGDX₃₄RX₃₅X₃₆ (서열번호 6); 여기서,

X₂₈, X₂₉, X₃₀, X₃₁, X₃₂, X₃₃, X₃₄, X₃₅, 및 X₃₆은 각각 독립적으로 임의의 아미노산으로부터 선택된다.

본 발명에는 H3이 다음 아미노산 서열을 포함하는 본 발명의 드노보 단백질이 포함된다:

X₂₈X₂₉X₃₀X₃₁X₃₂X₃₃KGDX₃₄RX₃₅X₃₆ (서열번호 6); 여기서,

X₂₈은 A, C, D, E, G, I, L, M, P, Q, R, S, T, V, 또는 W(바람직하게는, A, G, I, L, M, Q, T, V, 또는 W)로부터 선택되는 아미노산이고;

X₂₉는 A, C, D, E, G, L, M, P, R, S, T, V, 또는 W(바람직하게는, E, L, M, P, S, T, V, 또는 W)로부터 선택되는 아미노산이며;

X₃₀은 C, F, I, L, M, T, V, 또는 W(바람직하게는, I, F, 또는 V)로부터 선택되는 아미노산이고;

X₃₁은 A, C, D, E, G, I, K, L, M, N, S, T, 또는 V(바람직하게는, D, M, 또는 N)로부터 선택되는 아미노산이며;

X₃₂는 F, I, L, M, 또는 V(바람직하게는, L, M, 또는 F)로부터 선택되는 아미노산이고;

X₃₃은 D, G, 또는 L로부터 선택되는 아미노산이며;

X₃₄는 A, C, E, F, G, I, K, L, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, F, A, E, I, K, L, Q, R, S, 또는 V)로부터 선택되는 아미노산이고;

X₃₅는 A, C, D, E, G, H, K, L, M, P, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, E, D, G, L, M, P, S, V, 또는 W)로부터 선택되는 아미노산이며; 및

X₃₆은 A, C, D, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, 또는 W(바람직하게는, I, C, F, M, P, Q, S, T, V, 또는 W)로부터 선택되는 아미노산이다.

본 발명에는 H3이 존재한다면 다음 아미노산 서열을 포함하는 본 발명의 드노보 단백질이 포함된다:

X₂₈X₂₉X₃₀X₃₁X₃₂X₃₃KGDX₃₄RX₃₅X₃₆ (서열번호 6); 여기서,

X₃₁은 D, E, G, K, N, P, Q, R, S, 또는 T로부터 선택되는 아미노산이고;

X₃₅는 D, E, G, K, N, P, Q, R, S, V, 또는 T로부터 선택되는 아미노산이며;

X₂₉는 A, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, D, E, G, K, N, P, Q, R, S, T, 또는 V)로부터 선택되는 아미노산이고;

X₃₃은 A, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, G, A, F, I, L, M, P 또는 V)로부터 선택되는 아미노산이며;

X₃₀, X₃₂, 및 X₃₆은 각각 독립적으로 A, F, I, L, M, P 또는 V로부터 선택되는 아미노산이고;

X₂₈은 A, F, I, L, M, P, T, 또는 V로부터 선택되는 아미노산이고;

X₃₄는 A, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y 및 선택적으로, C(바람직하게는, F, D, E, G, K, N, P, Q, R, S, Y, 또는 T)로부터 선택되는 아미노산이다. 본 발명의 드노보 단백질은 글루타민이 X₂₈에 대한 아미노산 목록에 포함되고, 알라닌 및 프롤린이 X₃₀에 대한 아미노산 목록에서 제거되며, 프롤린, 글루타민, 및 아르기닌이 X₃₁에 대한 아미노산 목록에서 제거되고, 알라닌 및 프롤린이 X₃₂에 대한 아미노산 목록에서 제거되고, X₃₃이 D, G, 또는 L로부터 선택되는 아미노산이고; 아스파르트산 및 프롤린이 X₃₄에 대한 아미노산 목록에서 제거된, 상기 단백질을 포함한다.

본 발명에는 H3이 존재한다면 다음 아미노산 서열을 포함하는 본 발명의 드노보 단백질이 포함된다:

X₂₈X₂₉X₃₀X₃₁X₃₂X₃₃KGDX₃₄RX₃₅X₃₆ (서열번호 6); 여기서,

X₃₁ 및 X₃₅는 각각 독립적으로 D, E, G, K, N, P, Q, R, S, 또는 T로부터 선택되는 아미노산이고;

X₂₉는 A, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, D, E, G, K, N, P, Q, R, S, T, 또는 V)로부터 선택되는 아미노산이며;

X₃₃은 A, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, G, A, F, I, L, M, P, 또는 V)로부터 선택되는 아미노산이고;

X₂₈, X₃₀, X₃₂, 및 X₃₆은 각각 독립적으로 A, F, I, L, M, P, 또는 V로부터 선택되는 아미노산이고;

X₃₄는 A, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y 및 선택적으로 C(바람직하게는, F, D, E, G, K, N, P, Q, R, S, Y, 또는 T)로부터 선택되는 아미노산이다. 본 발명의 드노보 단백질은 글루타민이 X₂₈에 대한 아미노산 목록에 포함되고, 알라닌 및 프롤린이 X₃₀에 대한 아미노산 목록에서 제거되며, 프롤린, 글루타민, 및 아르기닌이 X₃₁에 대한 아미노산 목록에서 제거되고, 알라닌 및 프롤린이 X₃₂에 대한 아미노산 목록에서 제거되고, X₃₃이 D, G, 또는 L로부터 선택되는 아미노산이고; 아스파르트산 및 프롤린이 X₃₄에 대한 아미노산 목록에서 제거된, 상기 단백질을 포함한다.

본 발명의 드노보 단백질은 2개의 알파 나선 도메인, H1 및 H2와 선택적인 베타 헤어핀 도메인 H3을 포함할 수 있고, 여기서 H3은 존재한다면, 다음 아미노산 서열을 포함한다:

X₂₈X₂₉X₃₀X₃₁X₃₂X₃₃KGDX₃₄RX₃₅X₃₆ (서열번호 6); 여기서,

X₃₅는 D, E, G, K, N, P, Q, R, S, 또는 T로부터 선택되는 아미노산이고;

X₂₈은 A, 또는 V이며;

X₂₉는 E, 또는 V이고;

X₃₁은 D이고;

X₃₂는 M, 또는 L이고;

X₃₃은 G이고;

X₃₀, 및 X₃₆은 각각 독립적으로 A, F, I, L, M, P, 또는 V로부터 선택되는 아미노산이고;

X₃₄는 F, Y, K, 또는 C로부터 선택되는 아미노산이다. 본 발명의 드노보 단백질은 알라닌 및 프롤린이 X₃₀에 대한 아미노산 목록에서 제거된, 상기 단백질을 포함한다.

본 발명의 드노보 단백질은 2개의 알파 나선 도메인, H1 및 H2와 선택적인 베타 헤어핀 도메인 H3을 포함할 수 있고, 여기서 H3은 존재한다면, 다음 아미노산 서열을 포함한다:

X₂₈X₂₉X₃₀X₃₁X₃₂X₃₃KGDX₃₄RX₃₅X₃₆ (서열번호 6); 여기서,

X₂₈은 A, 또는 V;

X₂₉는 E, 또는 V;

X₃₀은 I;

X₃₁은 D

X₃₂는 M, 또는 L;

X₃₃은 G;

X₃₄는 F, Y, K, 또는 C로부터 선택되는 아미노산;

X₃₅는 E; 및

X₃₆은 I임.

본 발명의 드노보 단백질은 2개의 알파 나선 도메인, H1 및 H2와 선택적인 베타 헤어핀 도메인 H3을 포함할 수 있고, 여기서 H3은 존재한다면, 다음 아미노산 서열을 포함한다:

X₂₈X₂₉X₃₀X₃₁X₃₂X₃₃KGDX₃₄RX₃₅X₃₆ (서열번호 6); 여기서,

X₂₈은 A, 또는 V, 또는 T;

X₂₉는 E, 또는 V;

X₃₀은 I;

X₃₁은 D

X₃₂는 M, 또는 L, 또는 I;

X₃₃은 G;

X₃₄는 F, Y, K, I, 또는 C로부터 선택되는 아미노산;

X₃₅는 E, 또는 V; 및

X₃₆은 I임.

본 발명의 드노보 단백질은 2개의 알파 나선 도메인, H1 및 H2와 선택적인 베타 헤어핀 도메인 H3을 포함할 수 있고, 여기서 H3은 존재한다면, 다음 아미노산 서열을 포함한다:

X₅₇X₂₈X₂₉X₃₀X₃₁X₃₂X₃₃KGDX₃₄RX₃₅X₃₆X₅₈ (서열번호 28)

여기서, X₂₈-X₃₆은 H3에 대해 본원의 임의의 실시양태에 제공된 바와 같고;

X₅₇은 A, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y로부터 선택되는 아미노산이고;

X₅₈은 D, E, G, K, N, P, Q, R, S, C, 또는 T로부터 선택되는 아미노산이다. 본 발명의 드노보 단백질은 시스테인이 X₂₈에 대한 아미노산 목록에 포함되고, 아미노산 D, K, M, N, P, Q, 및 Y가 X₂₈에 대한 아미노산 목록에서 제거되고, 아미노산 A, C, F, H, I, L, M, V, 또는 W가 X₅₈에 대한 아미노산 목록에 포함된다. 또한, 본 발명에는 X₂₈, X₂₉, X₃₀, X₃₁, X₃₂, X₃₃, X₃₄, X₃₅, 및 X₃₆이 본원의 임의의 실시양태에 기재된 바와 같고, 서열번호 6의 위치 7 및/또는 위치 8의 아미노산이 치환된 ACE2 단백질 디코이가 포함된다. 예를 들어, 일부 측면에서, 다음 치환 중 하나 이상이 이루어진다: K7M, 또는 G8R.

본 발명의 단백질은 H3이 서열번호 29-34 또는 200에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것을 포함한다.

AEIDLGKGDFREI (서열번호 29)

AEIDLGKGDCREI (서열번호 30)

VVIDLGKGDFREI (서열번호 31)

VVIDLGKGDCREI (서열번호 32)

AEIDMGKGDCREI (서열번호 33)

AEIDMGKGDFREI (서열번호 34)

VEIDLGKGDFREI (서열번호 200).

본 발명의 ACE2 단백질 디코이는 H3이 서열번호 29에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고;

위치 1의 아미노산이 A, 또는 치환된다면 C, D, E, G, I, L, M, P, Q, R, S, T, V, 또는 W이고;

위치 2의 아미노산이 E, 또는 치환된다면 A, C, D, G, L, M, P, R, S, T, V, 또는 W이며;

위치 3의 아미노산이 I, 또는 치환된다면 C, F, L, M, T, V, 또는 W이고;

위치 4의 아미노산이 D, 또는 치환된다면 A, C, E, G, I, K, L, M, N, S, T, 또는 V이고;

위치 5의 아미노산이 L, 또는 치환된다면 F, I, M, 또는 V이고;

위치 6의 아미노산이 G, 또는 치환된다면 D, 또는 L이고;

위치 7의 아미노산이 K, 또는 치환된다면 I, M, N, Q, R, 또는 T이고;

위치 8의 아미노산이 G, 또는 치환된다면 D, E, M, R, 또는 S이고;

위치 9의 아미노산이 D, 또는 치환된다면 E, K, 또는 T이고;

위치 10의 아미노산이 F, 또는 치환된다면 A, C, E, G, I, K, L, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이고;

위치 11의 아미노산이 R, 또는 치환된다면 K, M, Q, 또는 S이고;

위치 12의 아미노산이 E, 또는 치환된다면 A, C, D, G, H, K, L, M, P, R, S, T, V, W, 또는 Y이고;

위치 13의 아미노산이 I, 또는 치환된다면 A, C, D, F, G, H, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, 또는 W인 것을 포함한다.

또한, 위치 7, 8, 9, 및 11의 아미노산 중 3개, 2개, 또는 1개 이하가 치환되고, 여기서 넘버링은 서열번호 29에 따른 것인 ACE-2 단백질 디코이가 포함된다.

또한, 본 발명에는 위치 X₃₄의 아미노산이 시스테인이 아닌 H3 도메인을 포함하는 ACE2 단백질이 포함된다. 또한, 본 발명에는 X₃₄가 시스테인이면, X₃₂가 류신인 H3 도메인을 포함하는 ACE2 단백질 디코이가 포함된다. 또한, 본 발명에는 위치 X₃₄의 아미노산이 D, E, G, K, N, P, Q, R, S, 또는 T로부터 선택되는 H3 도메인을 포함하는 ACE2 단백질 디코이가 포함된다. 또한, 본 발명에는 위치 X₃₄의 아미노산이 F, Y, K, 또는 C로부터 선택되는 아미노산인 H3 도메인을 포함하는 ACE2 단백질 디코이가 포함된다.

일부 측면에서, H3은 N 말단에 적어도 하나의 추가 아미노산, 바람직하게는 코로나바이러스 스파이크 단백질에 대한 결합에 부정적으로 영향을 미치지 않는 아미노산을 포함한다. 일부 측면에서, 아미노산은 D, E, G, K, N, P, Q, R, S, Y, 또는 T로부터 선택된다. 일부 측면에서, 아미노산은 A, C, E, F, G, I, L, R, S, T, V, 또는 W로부터 선택된다. 다른 측면에서, 아미노산은 S, P, T, 또는 Y로부터, 또는 L, S, P, T, 또는 Y로부터 선택된다. 일부 측면에서, 아미노산은 S, 또는 P(바람직하게는, S)이다. 따라서, 일부 측면에서, H3은 서열 SAEIDLGKGDFREIR (서열번호 245), 또는 SVEIDLGKGDFREIR (서열번호 246)에 대해 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.

일부 측면에서, H3은 C 말단에 적어도 하나의 추가 아미노산, 바람직하게는, 코로나바이러스 스파이크 단백질에 대한 결합에 부정적인 영향을 미치지 않는 아미노산을 포함한다. 일부 측면에서, 아미노산은 L, D, E, G, K, N, P, Q, R, S, 또는 T로부터, 또는 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, 또는 W로부터 선택된다. 일부 측면에서, 아미노산은 R이다.

숙련된 실습자라면, 본원에 기재된 임의의 H1, H2, 및 선택적인 H3 도메인이 본 발명에 사용되기 위해 조합될 수 있음을 이해할 것이다.

본 발명의 드노보 단백질은 코로나바이러스 스파이크 단백질에 대한 알파 나선 및 베타 헤어핀 도메인의 단백질 폴딩 및 결합-적격 제시를 용이하게 하는 적어도 하나의 구조적 도메인을 포함한다. 바람직한 구조적 도메인은 소수성 코어를 갖는 드노보 단백질을 제공하고 결합 모티프의 상대적인 위치 및 배향을 결합에 적격인 방식으로 안정화시키는 작용을 한다. 지원 구조는 계산적으로 생성되고 이용가능한 방법(예를 들어, 로제타 단편 어셈블리, 매개변수 생성 등)에 의해 위치될 수 있거나, 또는 기존 구조(예를 들어, 본원의 실시예 참조)에서 추출될 수 있다. H1, H2, 및 H3 영역과 달리, 이들 구조적 도메인은 ACE2 단백질의 구조적 도메인에 대해 실질적으로 매핑되지 않는다(즉, ACE2의 다른 2차 구조 요소에 구조적으로 또는 순차적으로 정렬하지 않는다). 본 기술분야의 기술 외에도 본 발명의 교시를 사용하여 숙련된 실습자는 단백질 설계 원리를 사용하여 본 발명에 사용하기 위한 구조적 도메인을 생성할 수 있었을 것이다.

H1, H2, 및 존재한다면 H3의 단백질 폴딩 및 결합-적격 제시를 용이하게 하는 구조적 도메인은 D1 및 D2에 대해 이하에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다:

D1 - X_AX_AX_BX_BX_CX_BX_BX_BX_AX_BX_BX_AX_CX_BX_CX_AX_BX_CX_AX_CX_CX_AX_AX_BX_CX_AX_A (서열번호 35).

D2 - X_AX_CX_CX_AX_BX_BX_AX_CX_BX_BX_AX_BX_BX_AX_CX_BX_BX_AX_BX_BX_DX_AX_BX_BX_AX_CX_BX_BX_A X_C (서열번호 36)

여기서, 각 X_A는 독립적으로 D, E, G, K, N, P, Q, R, S, C, 및 T로부터 선택되는 아미노산이고; 각 X_B는 독립적으로 A, F, I, L, M, C, 및 P(바람직하게는, A, F, I, L, M, 및 P)로부터 선택되는 아미노산이며, 각 X_C는 독립적으로 A, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y, 또는 C로부터 선택되는 아미노산이고; 각 X_D는 독립적으로 A, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y, 또는 C로부터의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, X_D는 A, F, I, L, M, P, 또는 V로부터 선택되는 아미노산이다. 다른 실시양태에서, X_D는 D, E, G, K, N, P, Q, R, S, T, 또는 C로부터 선택되는 아미노산이다.

일부 실시양태에서, D1은 이하에 제시된 아미노산 서열을 포함한다:

X_AX_AAAX_AALAX_AA AX_AAMKX_AALX_AI IX_AX_AIAX_AX_A (서열번호 37); 여기서, 각 X_A는 독립적으로 D, E, G, K, N, P, Q, R, S, C, 또는 T로부터 선택되는 아미노산이다.

일부 실시양태에서, D1은 이하에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다:

REAAEALAEAARAMKEALEIIREIAEK (서열번호 38)

REAAEALAEAARAMKEALEILREIAEK (서열번호 222).

본 발명의 ACE2 단백질 디코이는 적어도 하나의 구조적 도메인(예를 들어, D1)이 서열번호 38에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고;

위치 1의 아미노산이 R, 또는 치환된다면 A, C, E, F, G, I, K, L, M, P, S, T, V, 또는 W(바람직하게는, C, E, F, G, K, L, M, P, S, T, 또는 W)이고;

위치 2의 아미노산이 E, 또는 치환된다면 A, C, D, F, G, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, A, G, K, M, V, W, 또는 Y)이며;

위치 3의 아미노산이 A, 또는 치환된다면 C, E, G, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, C, K, P, Q, 또는 V)이고;

위치 4의 아미노산이 A, 또는 치환된다면 D, E, G, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, 또는 W(바람직하게는, E, N, T, V, 또는 W)이고;

위치 5의 아미노산이 E, 또는 치환된다면 C, D, G, K, L, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, C, D, Q, S, V, W, 또는 Y)이고;

위치 6의 아미노산이 A, 또는 치환된다면 C, D, E, G, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, D, K, P, R, V, 또는 Y)이고;

위치 7의 아미노산이 L, 또는 치환된다면 A, C, F, I, M, Q, S, T, 또는 V(바람직하게는, T)이고;

위치 8의 아미노산이 A, 또는 치환된다면 C, D, E, F, G, H, I, K, Q, L, M, R, S, T, V, 또는 W(바람직하게는, D, E, G, H, I, L, Q, R, S, V, 또는 W)이고;

위치 9의 아미노산이 E, 또는 치환된다면 A, C, D, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, V, W, 또는 Y(바람직하게는, A, D, H, L, M, N, R, S, 또는 V)이고;

위치 10의 아미노산이 A, 또는 치환된다면 C, G, L, M, Q, S, T, V, 또는 W(바람직하게는, C, G, M, 또는 S)이고;

위치 11의 아미노산이 A, 또는 치환된다면 C, D, G, L, M, N, Q, R, S, T, 또는 V(바람직하게는, C, G, M, S, T, 또는 V)이고;

위치 12의 아미노산이 R, 또는 치환된다면 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, V, W, 또는 Y)이고;

위치 13의 아미노산이 A, 또는 치환된다면 C, D, E, F, G, H, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, D, E, K, M, R, S, 또는 V)이고;

위치 14의 아미노산이 M, 또는 치환된다면 A, C, D, E, G, H, I, K, L, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, A, C, D, E, G, K, R, S, T, V, 또는 Y)이고;

위치 15의 아미노산이 K, 또는 치환된다면 A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, E, G, H, M, R, S, 또는 Y)이고;

위치 16의 아미노산이 E, 또는 치환된다면 A, C, D, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, A, C, D, G, K, L, M, Q, T, V, 또는 W)이고;

위치 17의 아미노산이 A, 또는 치환된다면 C, G, P, S, T, 또는 V(바람직하게는, C, G, 또는 T)이고;

위치 18의 아미노산이 L, 또는 치환된다면 C, F, H, I, K, M, N, Q, R, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, C, F, H, 또는 V)이고;

위치 19의 아미노산이 E, 또는 치환된다면 A, C, D, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, A, C, F, G, L, Q, R, S, T, V, 또는 Y)이고;

위치 20의 아미노산이 I, 또는 치환된다면 A, C, D, E, F, G, H, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, C, E, G, L, Q, R, S, T, V, 또는 Y)이고;

위치 21의 아미노산이 I, 또는 치환된다면 A, C, D, E, F, G, K, L, M, N, Q, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, A, C, D, F, L, M, N, S, T, V, 또는 Y)이고;

위치 22의 아미노산이 R, 또는 치환된다면 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, S, T, V, Y, 또는 W(바람직하게는, A, C, D, E, F, G, I, L, M, Q, S, T, V, 또는 Y)이고;

위치 23의 아미노산이 E, 또는 치환된다면 A, C, D, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, A, C, D, F, H, I, M, N, P, T, 또는 W)이고;

위치 24의 아미노산이 I, 또는 치환된다면 A, C, E, F, G, H, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, 또는 Y(바람직하게는, C, S, T, 또는 V)이고;

위치 25의 아미노산이 A, 또는 치환된다면 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, D, G, H, I, M, N, S, V, 또는 Y)이고;

위치 26의 아미노산이 E, 또는 치환된다면 A, C, D, F, G, H, I, K, L, M, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, C, F, I, L, S, T, 또는 Y)이고;

위치 27의 아미노산이 K, 또는 치환된다면 A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, C, D, E, F, G, H, M, N, S, 또는 Y)인 것을 포함한다.

일부 실시양태에서, D2는 서열번호 39 또는 40에 제시된 아미노산 서열을 포함한다:

X_AAX_AX_AAAX_AX_A IAX_AAIX_AX_AAAX_A AIAX_AAAX_AIAA X_AA (서열번호 39)

X_AAX_AX_AAAX_AX_A VAX_AAIX_AX_AAAX_A AIVX_AAAX_AIAA X_AA (서열번호 40);

여기서, 각 X_A는 독립적으로 D, E, G, K, N, P, Q, R, S, C, 또는 T로부터 선택되는 아미노산이다.

일부 실시양태에서, D2는 이하에 제시된 아미노산 서열을 포함한다:

RASEAAKRX₅₉AX₆₀AIRKAAD AIX₆₁X₆₂AAKIAA RA (서열번호 41), 여기서, X₅₉는 I, 또는 V, X₆₀은 K, 또는 R, 또는 C, X₆₁은 A, 또는 V, 또는 C, X₆₂는 E, 또는 C이다.

일부 실시양태에서, D2는 서열번호 42-46에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다:

RASEAAKR IAKAIRKAAD AIAEAAKIAA RA (서열번호 42);

RASEAAKR IACAIRKAAD AIAEAAKIAA RA (서열번호 43);

RASEAAKR IAKAIRKAAD AIACAAKIAA RA (서열번호 44);

RASEAAKR VARAIRKAAD AIVEAAKIAA RA (서열번호 45);

RASEAAKR VACAIRKAAD AIVEAAKIAA RA (서열번호 46).

본 발명의 ACE2 단백질 디코이는 적어도 하나의 구조적 도메인(예를 들어, D2)이 서열번호 42에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고;

위치 1의 아미노산이 R, 또는 치환된다면 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, A, C, D, E, H, K, L, N, Q, S, 또는 Y)이고;

위치 2의 아미노산이 A, 또는 치환된다면 C, G, I, L, M, N, P, Q, S, T, V, 또는 Y(바람직하게는, C, M, Q, T, 또는 V)이고;

위치 3의 아미노산이 S, 또는 치환된다면 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, C, E, F, G, I, L, M, Q, 또는 R)이고;

위치 4의 아미노산이 E, 또는 치환된다면 A, C, D, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, C, D, I, N, S, 또는 W)이고;

위치 5의 아미노산이 A, 또는 치환된다면 C, D, E, F, G, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, D, E, I, M, 또는 Y)이고;

위치 6의 아미노산이 A, 또는 치환된다면 C, F, G, S, 또는 T(바람직하게는, C, 또는 S)이고;

위치 7의 아미노산이 K, 또는 치환된다면 A, C, D, E, G, H, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, A, C, D, E, G, H, L, M, R, S, T, V, W, 또는 Y)이고;

위치 8의 아미노산이 R, 또는 치환된다면 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, A, C, D, E, G, H, L, M, Q, S, T, V, 또는 Y)이고;

위치 9의 아미노산이 I, 또는 치환된다면 A, C, F, G, K, L, M, Q, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, A, C, F, G, L, M, S, T, W, 또는 Y)이고;

위치 10의 아미노산이 A, 또는 치환된다면 D, G, T, 또는 V(바람직하게는, D, G, 또는 V)이고;

위치 11의 아미노산이 K, 또는 치환된다면 A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, A, C, D, E, F, G, H, L, M, Q, R, S, V, W, 또는 Y)이고;

위치 12의 아미노산이 A, 또는 치환된다면 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, E, G, I, S, 또는 T)이고;

위치 13의 아미노산이 I, 또는 치환된다면 A, C, D, E, F, G, H, L, M, N, Q, S, T, V, 또는 Y(바람직하게는, A, C, D, F, G, L, M, N, Q, S, T, 또는 V)이고;

위치 14의 아미노산이 R, 또는 치환된다면 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, F, H, K, L, N, V, 또는 W)이고;

위치 15의 아미노산이 K, 또는 치환된다면 A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y)이고;

위치 16의 아미노산이 A, 또는 치환된다면 C, F, G, M, P, S, T, V, 또는 Y(바람직하게는, G, T, 또는 Y)이고;

위치 17의 아미노산이 A, 또는 치환된다면 C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, G, T, 또는 V)이고;

위치 18의 아미노산이 D, 또는 치환된다면 A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, A, F, G, I, L, N, R, S, T, W, 또는 Y)이고;

위치 19의 아미노산이 A, 또는 치환된다면 C, D, E, F, G, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, G, K, M, Q, S, 또는 T)이고;

위치 20의 아미노산이 I, 또는 치환된다면 A, C, F, G, H, L, M, Q, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, G, L, M, T, V, 또는 Y)이고;

위치 21의 아미노산이 A, 또는 치환된다면 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, Y, 또는 W(바람직하게는, D, E, G, I, K, M, N, Q, S, T, V, W, 또는 Y)이고;

위치 22의 아미노산이 E, 또는 치환된다면 A, C, D, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, A, D, G, K, M, P, S, T, V, W, 또는 Y)이고;

위치 23의 아미노산이 A, 또는 치환된다면 C, G, N, S, T, 또는 V(바람직하게는, G, S, 또는 T)이고;

위치 24의 아미노산이 A, 또는 치환된다면 C, D, E, G, K, M, N, S, T, 또는 V(바람직하게는, C, G, 또는 T)이고;

위치 25의 아미노산이 K, 또는 치환된다면 A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, A, C, D, E, G, I, L, P, Q, R, S, V, W, 또는 Y)이고;

위치 26의 아미노산이 I, 또는 치환된다면 A, C, D, E, F, G, H, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, C, D, E, K, L, M, P, Q, R, S, 또는 V)이고;

위치 27의 아미노산이 A, 또는 치환된다면 C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, F, G, M, N, S, T, 또는 V)이고;

위치 28의 아미노산이 A, 또는 치환된다면 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, Y, 또는 W(바람직하게는, C, D, E, G, H, Q, S, T, V, 또는 Y)이고;

위치 29의 아미노산이 R, 또는 치환된다면 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, A, C, D, G, H, I, K, L, M, N, P, S, T, V, W, 또는 Y)이고;

위치 30의 아미노산이 A, 또는 치환된다면 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, C, D, G, H, K, N, P, Q, R, S, T, 또는 V)인 것을 포함한다.

숙련된 실습자라면 본원에 기재된 D1 및 D2 도메인이 본원에 기재된 임의의 H1, H2, 및 H3 도메인과 조합될 수 있다는 것을 이해할 것이다.

본 발명의 드노보 단백질은 도메인들 사이에 아미노산 링커를 선택적으로 포함한다. 아미노산 링커는 의도된 용도에 적절한 것으로 간주되는 임의의 길이일 수 있다. 링커는, 예를 들어, 길이가 1 내지 100개의 아미노산, 예컨대, 길이가 1-100, 1-90, 1-80, 1-70, 1-60, 1-50, 1-40, 1-30, 1-20, 1-10, 또는 1-5개의 아미노산일 수 있다. 아미노산 잔기에 허용된 가변성 및 도메인 순서의 유연성과 마찬가지로, 링커의 유연성은 본 발명의 단백질을 작제하기 위한 드노보 단백질 설계의 사용에서 기인한다. 이들 단백질에서, 단백질 폴딩에 대한 기여의 대부분은 링커에서보다는 2차 구조 요소 간의 상호작용에서 생겨난다. 최소한 이러한 이유 때문에, 링커는 일반적으로 단백질 폴딩을 훼손함이 없이 드노보 설계된 단백질에서 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 도메인 사이에 가변 루프 영역을 초래한다.

본 발명의 예시적인 ACE2 단백질 디코이는 CTC-445이고, 서열번호 47에 제시된 바와 같다:

SAEIDMGKGDFREIRASEDAREAAEALAEAARAMKEALEIIREIAEKLRDSSRASEAAKRIAKAIRKAADAIAEAAKIAARAAKDEDAARNAENAARKAKEFAEEQAKLADMYAEFAKNGDKSRVREQLKTFADKAFHEMEDRFYQAALAVFEAAEAAAG (서열번호 47)

ACE2 단백질 디코이 CTC-445는 H1, H2, 및 H3 도메인, 뿐만 아니라 H1, H2, 및 H3의 단백질 폴딩 및 결합-적격 제시를 용이하게 하는 2개의 구조적 도메인을 포함한다. CTC-445에서, 도메인 순서는 H3-D1-D2-H2-H1이다. H3은 아미노산 1-15이고; D1은 아미노산 21-47이며; D2는 아미노산 53-82이고; H2는 아미노산 86-118이고; H1은 아미노산 123-160이다. ACE2 단백질 디코이는 또한 다양한 도메인을 함께 연결하는 4개의 링커를 추가로 포함한다. 제1 링커는 아미노산 16-20이고, 제2 링커는 아미노산 48-52이며, 제3 링커는 아미노산 83-85이고, 제4 링커는 아미노산 119-122이다. 넘버링은 서열번호 47에 따른다. 본원에 제공된 실시예 외에도 H1, H2, H3, D1 및 D2 도메인에 관하여 본원에 제공된 교시, 및 본 기술분야의 기술은 CTC-445의 변이체인 ACE2 단백질 디코이를 제조하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 예시적인 변이체는 단백질의 안정성 및/또는 폴딩을 최적화하는데 역할을 하는 아미노산 치환을 도입시킨 것이다. 전형적으로, 이러한 치환은 결합 계면에 있지 않고 단백질의 다른 위치에 존재한다. 이러한 치환이 결합 계면에 있지 않아도, 이들은 개선된 활성 외에도 개선된 결합 친화성을 추가로 야기할 수 있다. 개선된 결합, 안정성, 및 또는 단백질 폴딩에 대해 단백질을 테스트하는 방법은 본 기술분야에 알려져 있고 본원에 기재되어 있다. CTC-445는 SARS-COV-2 스파이크 단백질에 특이적으로 결합하지만, SARS-CoV-1 스파이크 단백질에 단지 약하게 결합하는 것으로 입증된 바 있다. 일부 실시양태에서, CTC-445의 변이체인 ACE2 단백질 디코이는 CTC-445에 비해 더 높은 친화성으로 SARS-COV-2 스파이크 단백질 및 SARS-COV-1 스파이크 단백질 모두에 결합할 수 있다. CTC-445에 대한 동일성을 갖는 예시적인 ACE2 단백질 디코이는 서열번호 48-68, 184-188, 104-172, 및 224-239에 제시된 것을 포함한다. 또한, 본 발명에는 서열번호 47-68, 184-188, 104-172, 224-239, 255-257, 또는 265에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 ACE2 단백질 디코이가 포함된다. 본원에 제공된 실시예 및 본 기술분야의 기술 외에도, H1, H2, H3, D1 및 D2 도메인에 관하여 본원에 제공된 교시는 이러한 ACE2 단백질 디코이의 변이체를 제조하는 데 사용될 수 있다.

일부 실시양태에서, 임의의 서열번호 47-68, 184-187, 및 104-172의 위치 88에 있는 아미노산 잔기는 A가 아니라면, F, I, L, M, P 또는 V로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 임의의 서열번호 47-68의 위치 137에 있는 아미노산 잔기는 F가 아니라면, D, E, G, K, N, P, Q, R, S, 또는 T이다. 일부 실시양태에서, 임의의 서열번호 47-68, 184-187, 및 104-172의 위치 11에 있는 아미노산 잔기가 시스테인이라면, 위치 6의 아미노산 잔기는 L이고, 및/또는 위치 126의 아미노산 잔기는 L이며, 및/또는 위치 124의 아미노산 잔기는 S이다. 일부 실시양태에서, ACE2 단백질 디코이는 CTC-625 또는 CTC-626의 아미노산 서열을 갖지 않는다. 일부 실시양태에서, ACE2 단백질 디코이는 CTC-625(즉, S1P_F11Y_R42S_E46S_A88N_F116N_R124S_F137V_R143L) 또는 CTC-626(즉, S1P_M6L_F11Y_R42S_E46S_A88N_F116N_R124S_F137V_R143L-F152W)에 제시된 아미노산 치환을 갖지 않는다.

본 발명의 예시적인 드노보 단백질은 서열번호 47-68, 184-187, 또는 104-172에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하고, 여기서,

a. 위치 2의 아미노산 잔기가 V; 또는

b. 위치 3의 아미노산 잔기가 V; 또는

c. 위치 6의 아미노산 잔기가 L; 또는

d. 위치 11의 아미노산 잔기가 F 또는 C; 또는

e. 위치 41의 아미노산 잔기가 L; 또는

f. 위치 61의 아미노산 잔기가 V; 또는

g. 위치 63의 아미노산 잔기가 R 또는 C; 또는

h. 위치 73의 아미노산 잔기가 V; 또는

i. 위치 74의 아미노산 잔기가 E 또는 C; 또는

j. 위치 84의 아미노산 잔기가 T; 또는

k. 위치 86의 아미노산 잔기가 G; 또는

l. 위치 92의 아미노산 잔기가 V; 또는

m. 위치 95의 아미노산 잔기가 E; 또는

n. 위치 100의 아미노산 잔기가 Q; 또는

o. 위치 116의 아미노산 잔기가 L; 또는

p. 위치 124의 아미노산 잔기가 S; 또는

q. 위치 126의 아미노산 잔기가 L; 또는

r. 위치 136의 아미노산 잔기가 T; 또는

s. 위치 143의 아미노산 잔기가 S 또는 L; 또는

t. 상기 (a) 내지 (s)의 임의의 조합인 것을 포함한다.

본 발명의 예시적인 드노보 단백질은 서열번호 47-68, 184-187, 104-172, 255-256, 또는 224-239에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하고, 여기서, 위치 8, 9, 또는 10의 아미노산 중 1개 이하가 치환되고; 위치 91, 94, 98, 102, 105, 106, 109, 112, 또는 113의 아미노산 중 3개 이하, 2개 이하, 또는 1개 이하가 치환되며; 위치 123, 127, 128, 131, 132, 134, 138, 139, 141, 142, 145, 146, 또는 149의 아미노산 중 4개, 3개, 및/또는 2개 또는 1개 이하가 치환된 것을 포함한다.

본 발명의 예시적인 드노보 단백질은 서열번호 47-68, 184-187, 104-172, 255-256, 또는 224-239에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하고, 여기서, 위치 8, 9, 10, 91, 94, 98, 102, 105, 106, 109, 112, 113 123, 127, 128, 131, 132, 134, 138, 139, 141, 142, 145, 146, 또는 149의 아미노산 중 4개 이하, 3개 이하, 및/또는 2개 이하 또는 1개 이하가 치환되는 것을 포함한다.

본 발명의 예시적인 드노보 단백질은 서열번호 47-68, 184-187, 104-172, 255-256, 또는 224-239에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하고, 여기서,

a. 위치 8의 아미노산 잔기가 K;

b. 위치 9의 아미노산 잔기가 G;

c. 위치 10의 아미노산 잔기가 D

d. 위치 91의 아미노산 잔기가 N

e. 위치 94의 아미노산 잔기가 N

f. 위치 98의 아미노산 잔기가 K

g. 위치 102의 아미노산 잔기가 F

h. 위치 105의 아미노산 잔기가 E

i. 위치 106의 아미노산 잔기가 Q

j. 위치 109의 아미노산 잔기가 L

k. 위치 112의 아미노산 잔기가 M

l. 위치 113의 아미노산 잔기가 Y

m. 위치 123의 아미노산 잔기가 S

n. 위치 127의 아미노산 잔기가 E

o. 위치 128의 아미노산 잔기가 Q

p. 위치 131의 아미노산 잔기가 T

q. 위치 132의 아미노산 잔기가 F

r. 위치 134의 아미노산 잔기가 D

s. 위치 138의 아미노산 잔기가 H

t. 위치 139의 아미노산 잔기가 E

u. 위치 141의 아미노산 잔기가 E

v. 위치 142의 아미노산 잔기가 D

w. 위치 145의 아미노산 잔기가 Y

x. 위치 146의 아미노산 잔기가 Q; 및

y. 위치 149의 아미노산 잔기가 L인 것을 포함한다.

본원에 교시된 바와 같이, 예시적인 단백질 디코이의 링커에는 다량의 가변성이 존재할 수 있다. 본원에는 서열번호 69-90, 258-260, 266, 또는 189-193에 제시된 아미노산 서열과 적어도 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하고, 여기서 X_L이 아미노산 링커인 것을 포함하는 드노보 단백질이 제공된다. 일부 이러한 측면에서, 각 드노보 단백질에서 제1 및 제2 X_L 링커는 0 내지 5개 아미노산이고, 각 드노보 단백질에서 제3 X_L 링커는 0 내지 3개 아미노산이며, 각 드노보 단백질에서 제4 X_L 링커는 0 내지 4개 아미노산이다.

일부 실시양태에서, 임의의 서열번호 69-90, 258-259, 또는 189-192 중 위치 88의 아미노산 잔기는 A가 아니라면, F, I, L, M, P 또는 V로부터 선택되고; 위치 88은 고정된 링커 길이를 갖는 서열번호 47을 참고로 한다. 일부 실시양태에서, 임의의 서열번호 69-90 또는 189-192 중 위치 137의 아미노산 잔기는 F가 아니라면, D, E, G, K, N, P, Q, R, S, 또는 T이다. 일부 실시양태에서, 임의의 서열번호 69-90, 258-259, 또는 189-192 중 위치 11의 아미노산 잔기가 시스테인이라면, 위치 6의 아미노산 잔기는 L이고, 및/또는 위치 126의 아미노산 잔기는 L이며, 및/또는 위치 124의 아미노산 잔기는 S이다. 상기에 언급된 위치 88, 137, 11, 124, 및 126은 서열번호 69-90 또는 189-193의 실제 위치가 아닌, 서열번호 47의 위치 88, 137, 11, 124, 및 126에 각각 상응하는 서열번호 69-90, 258-259, 또는 189-192의 위치를 의미하는데, 이는 링커 X_L의 비고정 길이 때문에 달라질 수 있다. 따라서, "서열번호 69-90 또는 189-192 중 어느 하나의 위치 88"에 대한 언급은 서열번호 47의 위치 88에 상응하는 서열번호 69-90, 258-259, 또는 189-193 중 어느 하나의 위치를 의미한다.

본 발명의 예시적인 드노보 단백질은 서열번호 69-90, 258-259, 또는 189-192에 제시된 아미노산 서열과 적어도 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하고, 여기서,

a. 위치 2의 아미노산 잔기가 V; 또는

b. 위치 3의 아미노산 잔기가 V; 또는

c. 위치 6의 아미노산 잔기가 L; 또는

d. 위치 11의 아미노산 잔기가 F 또는 C; 또는

e. 위치 41의 아미노산 잔기가 L; 또는

f. 위치 61의 아미노산 잔기가 V; 또는

g. 위치 63의 아미노산 잔기가 R 또는 C; 또는

h. 위치 73의 아미노산 잔기가 V; 또는

i. 위치 74의 아미노산 잔기가 E 또는 C; 또는

j. 위치 86의 아미노산 잔기가 G; 또는

k. 위치 92의 아미노산 잔기가 V; 또는

l. 위치 95의 아미노산 잔기가 E; 또는

m. 위치 100의 아미노산 잔기가 Q; 또는

n. 위치 116의 아미노산 잔기가 L; 또는

o. 위치 124의 아미노산 잔기가 S; 또는

p. 위치 126의 아미노산 잔기가 L; 또는

q. 위치 136의 아미노산 잔기가 T; 또는

r. 위치 143의 아미노산 잔기가 S 또는 L; 또는

상기 (a) 내지 (r)의 임의의 조합인 것을 포함하고, 여기서 언급된 위치는 앞서 논한 링커 X_L의 비고정 길이 때문에 서열번호 69-90 또는 189-192가 아닌 서열번호 47의 넘버링에 따른다.

본 발명의 예시적인 드노보 단백질은 서열번호 69-90, 258-259, 또는 189-192에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하고, 여기서, 위치 8, 9, 또는 10의 아미노산 중 1개 이하가 치환되고; 위치 91, 94, 98, 102, 105, 106, 109, 112, 또는 113의 아미노산 중 3개 이하, 2개 이하, 또는 1개 이하가 치환되며; 위치 123, 127, 128, 131, 132, 134, 138, 139, 141, 142, 145, 146, 또는 149의 아미노산 중 3개 이하, 2개 이하 또는 1개 이하가 치환된 것을 포함한다. 언급된 위치는 앞서 논한 링커 X_L의 비고정 길이 때문에 서열번호 69-90, 258-259, 또는 189-192가 아닌 서열번호 47의 넘버링에 따른다.

본 발명의 예시적인 드노보 단백질은 서열번호 69-90, 258-259, 또는 189-192에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하고, 위치 8, 9, 10, 91, 94, 98, 102, 105, 106, 109, 112, 113 123, 127, 128, 131, 132, 134, 138, 139, 141, 142, 145, 146, 또는 149의 아미노산 중 4개, 3개, 2개 또는 1개 이하가 치환된 것을 포함한다. 언급된 위치는 앞서 논한 링커 X_L의 비고정 길이 때문에 서열번호 69-90, 258-259, 또는 189-192가 아닌 서열번호 47의 넘버링에 따른다.

본 발명의 예시적인 드노보 단백질은 서열번호 69-90, 258-259, 또는 189-192에 제시된 아미노산 서열과 적어도 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하고, 여기서,

a. 위치 8의 아미노산 잔기가 K;

b. 위치 9의 아미노산 잔기가 G;

c. 위치 10의 아미노산 잔기가 D

d. 위치 91의 아미노산 잔기가 N

e. 위치 94의 아미노산 잔기가 N

f. 위치 98의 아미노산 잔기가 K

g. 위치 102의 아미노산 잔기가 F

h. 위치 105의 아미노산 잔기가 E

i. 위치 106의 아미노산 잔기가 Q

j. 위치 109의 아미노산 잔기가 L

k. 위치 112의 아미노산 잔기가 M

l. 위치 113의 아미노산 잔기가 Y

m. 위치 123의 아미노산 잔기가 S

n. 위치 127의 아미노산 잔기가 E

o. 위치 128의 아미노산 잔기가 Q

p. 위치 131의 아미노산 잔기가 T

q. 위치 132의 아미노산 잔기가 F

r. 위치 134의 아미노산 잔기가 D

s. 위치 138의 아미노산 잔기가 H

t. 위치 139의 아미노산 잔기가 E

u. 위치 141의 아미노산 잔기가 E

v. 위치 142의 아미노산 잔기가 D

w. 위치 145의 아미노산 잔기가 Y

x. 위치 146의 아미노산 잔기가 Q; 및

y. 위치 149의 아미노산 잔기가 L인 것을 포함하고; 여기서, 언급된 위치는 앞서 논한 링커 X_L의 비고정 길이 때문에 서열번호 69-90, 또는 189-192가 아닌 서열번호 47의 넘버링에 따른다.

본 발명에 포함되는 것은 서열번호 47에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하고, 단, 다음과 같은 치환이 존재하는 ACE2 단백질 디코이이다:

(i) M6L_R126L; (ii) F116L_R124S; (iii) M6L_F116L_R124S_R126L; (iv) M6L_E86G_F116L_R124S_R126L; (v) A2V_E3V_M6L_I61V_K63R_A73V_K84T_E86G_A92V_A95E_K100Q_F116L_R124S_R126L_A136T_R143S; (vi) M6L_F11C_R126L; (vii) M6L_K63C_R126L; (viii) M6L_E74C_R126L; (ix) F11C_F116L_R124S; (x) K63C_F116L_R124S; (xi) E74C_F116L_R124S; (xii) M6L_F11C_F116L_R124S_R126L; (xiii) M6L_K63C_F116L_R124S_R126L; (xiv) M6L_E74C_F116L_R124S_R126L; (xv) A2V_E3V_M6L_F11C_I61V_K63R_A73V_K84T_E86G_A92V_A95E_K100Q_F116L_R124S_R126L_A136T_R143S; (xvi) A2V_E3V_M6L_I61V_K63C_A73V_K84T_E86G_A92V_A95E_K100Q_F116L_R124S_R126L_A136T_R143S; (xvii) A2V_E3V_M6L_I61V_K63R_A73V_E74C_K84T_E86G_A92V_A95E_K100Q_F116L_R124S_R126L_A136T_R143S; (xviii) M6L_F11C_E86G_F116L_R124S_R126L; (xix) M6L_K63C_E86G_F116L_R124S_R126L; (xx) M6L_E74C_E86G_F116L_R124S_R126L; (xxi) A2V_M6L_E86G_F116L_R124S_R126L; (xxii) A2V_M6L_E86G_F116L_R124S_R126L_R143L; (xxiii) M6L_I41L_E86G_F116L_R124S_R126L_R143L; 또는 (xxiv) A2V_M6L_I41L_E86G_F116L_R124S_R126L_R143L.

본 발명의 일부 바람직한 실시양태에서, ACE2 단백질 디코이는 다음에 대한 아미노산 서열과 적어도 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함한다: (i) CTC 637: 다음 아미노산이 존재함: 6L 및 126L; (ii) CTC-638; 다음 아미노산이 존재함: 116L 및 124S; (iii) CTC-639; 다음 아미노산이 존재함: 6L, 116L, 124S, 및 126L (iv) CTC-640; 다음 아미노산이 존재함: 6L, 86G, 116L, 124S, 및 126L (v) CTC-641; 다음 아미노산이 존재함: 2V, 3V, 6L, 61V, 63R, 73V, 84T, 86G, 92V, 95E, 100Q, 116L, 124S, 126L, 136T, 및 143S (vi) CTC-642; 다음 아미노산이 존재함: 6L, 11C, 및 126L (vii) CTC-643; 다음 아미노산이 존재함: 6L, 63C, 및 126L (viii) CTC-644; 다음 아미노산이 존재함: 6L, 74C, 및 126L (ix) CTC-645; 다음 아미노산이 존재함: 11C, 116L, 및 124S (x) CTC-646; 다음 아미노산이 존재함: 63C, 116L, 및 124S (xi) CTC-647; 다음 아미노산이 존재함:74C, 116L, 및 124S (xii) CTC-648; 다음 아미노산이 존재함: 6L, 11C, 116L, 124S, 및 126L (xiii) CTC-649; 다음 아미노산이 존재함: 6L, 63C, 116L, 124S, 및 126L (xiv) CTC-650; 다음 아미노산이 존재함: 6L, 74C, 116L, 124S, 및 126L (xv) CTC-651; 다음 아미노산이 존재함: 2V, 3V, 6L, 11C, 61V, 63R, 73V, 84T, 86G, 92V, 95E, 100Q, 116L, 124S, 126L, 136T, 및 143S (xvi) CTC-652; 다음 아미노산이 존재함: 2V, 3V, 6L, 61V, 63C, 73V, 84T, 86G, 92V, 95E, 100Q, 116L, 124S, 126L, 136T, 및 143S (xvii) CTC-653; 다음 아미노산이 존재함: 2V, 3V, 6L, 61V, 63R, 73V, 74C, 84T, 86G, 92V, 95E, 100Q, 116L, 124S, 126L, 136T, 및 143S (xviii) CTC-656: 다음 아미노산이 존재함:1P, 11K, 42S, 46S, 81H, 88N, 116N, 124S, 137V, 및 143L; (xix) CTC-693: 다음 아미노산이 존재함: 6L, 11C, 86G, 116L, 124S, 및 126L; (xx) CTC-694: 다음 아미노산이 존재함: 6L, 63C, 86G, 116L, 124S, 및 126L; (xxi) CTC-695: 다음 아미노산이 존재함: 6L, 74C, 86G, 116L, 124S, 및 126L; (xxii) CTC-699; 다음 아미노산이 존재함 2V, 6L, 86G, 116L, 124S, 및 126L; (xxiii) CTC-700; 다음 아미노산이 존재함: 2V, 6L, 86G, 116L, 124S, 126L, 143L; (xxiv) CTC-701; 다음 아미노산이 존재함 6L, 41L, 86G, 116L, 124S, 126L, 및 143L; 및 (xxv) CTC-702; 다음 아미노산이 존재함 2V, 6L, 41L, 86G, 116L, 124S, 126L, 및 R143.

본 발명에는 서열번호 50에 제시된 아미노산 서열(CTC-640)과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 디코이 단위를 포함하고, 여기서,

위치 1의 아미노산이 S 또는 치환된다면, A, C, E, F, G, I, L, R, S, T, V, 또는 W(바람직하게는, C, E, G, I, 또는 L)이고;

위치 2의 아미노산이 A 또는 치환된다면, C, D, E, G, I, L, M, P, Q, R, S, T, V, 또는 W(바람직하게는, G, I, L, M, Q, T, V, 또는 W)이고;

위치 3의 아미노산이 E 또는 치환된다면, A, C, D, G, L, M, P, R, S, T, V, 또는 W(바람직하게는, L, M, P, S, T, V, 또는 W)이고;

위치 4의 아미노산이 I 또는 치환된다면, C, F, L, M, T, V, 또는 W(바람직하게는, F, 또는 V)이고;

위치 5의 아미노산이 D 또는 치환된다면, A, C, E, G, I, K, L, M, N, S, T, 또는 V(바람직하게는, M 또는 N)이고;

위치 6의 아미노산이 L 또는 치환된다면, F, I, M, 또는 V(바람직하게는, M 또는 F)이고;

위치 7의 아미노산이 G 또는 치환된다면, D 또는 L이고;

위치 8의 아미노산이 K 또는 치환된다면, I, M, N, Q, R, 또는 T(바람직하게는, M)이고;

위치 9의 아미노산이 G 또는 치환된다면, D, E, M, R, 또는 S(바람직하게는, R)이고;

위치 10의 아미노산이 D 또는 치환된다면, E, K, 또는 T(바람직하게는, 비치환됨)이고;

위치 11의 아미노산이 F 또는 치환된다면, A, C, E, G, I, K, L, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, A, E, I, K, L, Q, R, S, 또는 V)이고;

위치 12의 아미노산이 R 또는 치환된다면, K, M, Q, 또는 S(바람직하게는, 비치환됨)이고;

위치 13의 아미노산이 E 또는 치환된다면, A, C, D, G, H, K, L, M, P, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, D, G, L, M, P, S, V, 또는 W)이고;

위치 14의 아미노산이 I 또는 치환된다면, A, C, D, F, G, H, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W(바람직하게는, I, C, F, M, P, Q, S, T, V, 또는 W)이고;

위치 15의 아미노산이 R 또는 치환된다면, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W(바람직하게는, C, D, E, F, H, K, L, Q, S, V, W)이고;

위치 16의 아미노산이 A 또는 치환된다면, A, D, E, F, G, L, M, R, S, T, V, W(바람직하게는, E, F, G, L, M, S, T, V, W)이고;

위치 17의 아미노산이 S 또는 치환된다면, A, C, D, E, G, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W(바람직하게는, A, C, D, E, G, L, P, T, V, W)이고;

위치 18의 아미노산이 E 또는 치환된다면, A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y(바람직하게는, C, G, I, L, M, N, P, R, S, T, V)이고;

위치 19의 아미노산이 D 또는 치환된다면, A, C, D, E, G, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, W, Y(바람직하게는, C, E, G, M, P, R, V, W)이고;

위치 20의 아미노산이 A 또는 치환된다면, A, C, E, G, I, L, P, Q, R, S, T, V, W(바람직하게는, L, R, S, T, V, W)이고;

위치 21의 아미노산이 R 또는 치환된다면, A, C, E, F, G, I, K, L, M, P, S, T, V, 또는 W(바람직하게는, C, E, F, G, K, L, M, P, S, T, 또는 W)이고;

위치 22의 아미노산이 E 또는 치환된다면, A, C, D, F, G, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, A, G, K, M, V, W, 또는 Y)이고;

위치 23의 아미노산이 A 또는 치환된다면, C, E, G, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, C, K, P, Q, 또는 V)이고;

위치 24의 아미노산이 A 또는 치환된다면, D, E, G, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, 또는 W(바람직하게는, E, N, T, V, 또는 W)이고;

위치 25의 아미노산이 E 또는 치환된다면, C, D, G, K, L, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, C, D, Q, S, V, W, 또는 Y)이고;

위치 26의 아미노산이 A 또는 치환된다면, C, D, E, G, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, D, K, P, R, V, 또는 Y)이고;

위치 27의 아미노산이 L 또는 치환된다면, A, C, F, I, M, Q, S, T, 또는 V(바람직하게는, T)이고;

위치 28의 아미노산이 A 또는 치환된다면, C, D, E, F, G, H, I, K, Q, L, M, R, S, T, V, 또는 W(바람직하게는, D, E, G, H, I, L, Q, R, S, V, 또는 W)이고;

위치 29의 아미노산이 E 또는 치환된다면, A, C, D, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, V, W, 또는 Y(바람직하게는, A, D, H, L, M, N, R, S, 또는 V)이고;

위치 30의 아미노산이 A 또는 치환된다면, C, G, L, M, Q, S, T, V, 또는 W(바람직하게는, C, G, M, 또는 S)이고;

위치 31의 아미노산이 A 또는 치환된다면, C, D, G, L, M, N, Q, R, S, T, 또는 V(바람직하게는, C, G, M, S, T, 또는 V)이고;

위치 32의 아미노산이 R 또는 치환된다면, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, V, W, 또는 Y)이고;

위치 33의 아미노산이 A 또는 치환된다면, C, D, E, F, G, H, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, D, E, K, M, R, S, 또는 V)이고;

위치 34의 아미노산이 M 또는 치환된다면, A, C, D, E, G, H, I, K, L, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, A, C, D, E, G, K, R, S, T, V, 또는 Y)이고;

위치 35의 아미노산이 K 또는 치환된다면, A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, E, G, H, M, R, S, 또는 Y)이고;

위치 36의 아미노산이 E 또는 치환된다면, A, C, D, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, A, C, D, G, K, L, M, Q, T, V, 또는 W)이고;

위치 37의 아미노산이 A 또는 치환된다면, C, G, P, S, T, 또는 V(바람직하게는, C, G, 또는 T)이고;

위치 38의 아미노산이 L 또는 치환된다면, C, F, H, I, K, M, N, Q, R, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, C, F, H, 또는 V)이고;

위치 39의 아미노산이 E 또는 치환된다면, A, C, D, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, A, C, F, G, L, Q, R, S, T, V, 또는 Y)이고;

위치 40의 아미노산이 I 또는 치환된다면, A, C, D, E, F, G, H, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, C, E, G, L, Q, R, S, T, V, 또는 Y)이고;

위치 41의 아미노산이 I 또는 치환된다면, A, C, D, E, F, G, K, L, M, N, Q, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, A, C, D, F, L, M, N, S, T, V, 또는 Y)이고;

위치 42의 아미노산이 R 또는 치환된다면, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, S, T, V, Y, 또는 W(바람직하게는, A, C, D, E, F, G, I, L, M, Q, S, T, V, 또는 Y)이고;

위치 43의 아미노산이 E 또는 치환된다면, A, C, D, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, A, C, D, F, H, I, M, N, P, T, 또는 W)이고;

위치 44의 아미노산이 I 또는 치환된다면, A, C, E, F, G, H, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, 또는 Y(바람직하게는, C, S, T, 또는 V)이고;

위치 45의 아미노산이 A 또는 치환된다면, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, D, G, H, I, M, N, S, V, 또는 Y)이고;

위치 46의 아미노산이 E 또는 치환된다면, A, C, D, F, G, H, I, K, L, M, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, C, F, I, L, S, T, 또는 Y)이고;

위치 47의 아미노산이 K 또는 치환된다면, A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, C, D, E, F, G, H, M, N, S, 또는 Y)이고;

위치 48의 아미노산이 L 또는 치환된다면, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, Y(바람직하게는, C, D, F, G, H, I, P, Q, S, T, W, Y)이고;

위치 49의 아미노산이 R 또는 치환된다면, A,C, D, E, F, G, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, Y(바람직하게는, A, D, K, M, Q, S, T, V, Y)이고;

위치 50의 아미노산이 D 또는 치환된다면, A, C, D, E, F, G, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W(바람직하게는, C, E, M, T, V)이고;

위치 51의 아미노산이 S 또는 치환된다면, A, C, D, E, F, G, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, Y(바람직하게는, A, D, E, F, K, M, P, T, V, Y)이고;

위치 52의 아미노산이 S 또는 치환된다면, A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y(바람직하게는, A, E, M, Q)이고;

위치 53의 아미노산이 R 또는 치환된다면, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, A, C, D, E, H, K, L, N, Q, S, 또는 Y)이고;

위치 54의 아미노산이 A 또는 치환된다면, C, G, I, L, M, N, P, Q, S, T, V, 또는 Y(바람직하게는, C, M, Q, T, 또는 V)이고;

위치 55의 아미노산이 S 또는 치환된다면, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, C, E, F, G, I, L, M, Q, 또는 R)이고;

위치 56의 아미노산이 E 또는 치환된다면, A, C, D, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, C, D, I, N, S, 또는 W)이고;

위치 57의 아미노산이 A 또는 치환된다면, C, D, E, F, G, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, D, E, I, M, 또는 Y)이고;

위치 58의 아미노산이 A 또는 치환된다면, C, F, G, S, 또는 T(바람직하게는, C 또는 S)이고;

위치 59의 아미노산이 K 또는 치환된다면, A, C, D, E, G, H, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, A, C, D, E, G, H, L, M, R, S, T, V, W, 또는 Y)이고;

위치 60의 아미노산이 R 또는 치환된다면, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, A, C, D, E, G, H, L, M, Q, S, T, V, 또는 Y)이고;

위치 61의 아미노산이 I 또는 치환된다면, A, C, F, G, K, L, M, Q, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, A, C, F, G, L, M, S, T, W, 또는 Y)이고;

위치 62의 아미노산이 A 또는 치환된다면, D, G, T, 또는 V(바람직하게는, D, G, 또는 V)이고;

위치 63의 아미노산이 K 또는 치환된다면, A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, A, C, D, E, F, G, H, L, M, Q, R, S, V, W, 또는 Y)이고;

위치 64의 아미노산이 A 또는 치환된다면, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, E, G, I, S, 또는 T)이고;

위치 65의 아미노산이 I 또는 치환된다면, A, C, D, E, F, G, H, L, M, N, Q, S, T, V, 또는 Y(바람직하게는, A, C, D, F, G, L, M, N, Q, S, T, 또는 V)이고;

위치 66의 아미노산이 R 또는 치환된다면, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, F, H, K, L, N, V, 또는 W)이고;

위치 67의 아미노산이 K 또는 치환된다면, A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y)이고;

위치 68의 아미노산이 A 또는 치환된다면, C, F, G, M, P, S, T, V, 또는 Y(바람직하게는, G, T, 또는 Y)이고;

위치 69의 아미노산이 A 또는 치환된다면, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, G, T, 또는 V)이고;

위치 70의 아미노산이 D 또는 치환된다면, A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, A, F, G, I, L, N, R, S, T, W, 또는 Y)이고;

위치 71의 아미노산이 A 또는 치환된다면, C, D, E, F, G, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, G, K, M, Q, S, 또는 T)이고;

위치 72의 아미노산이 I 또는 치환된다면, A, C, F, G, H, L, M, Q, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, G, L, M, T, V, 또는 Y)이고;

위치 73의 아미노산이 A 또는 치환된다면, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, Y, 또는 W(바람직하게는, D, E, G, I, K, M, N, Q, S, T, V, W, 또는 Y)이고;

위치 74의 아미노산이 E 또는 치환된다면, A, C, D, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, A, D, G, K, M, P, S, T, V, W, 또는 Y)이고;

위치 75의 아미노산이 A 또는 치환된다면, C, G, N, S, T, 또는 V(바람직하게는, G, S, 또는 T)이고;

위치 76의 아미노산이 A 또는 치환된다면, C, D, E, G, K, M, N, S, T, 또는 V(바람직하게는, C, G, 또는 T)이고;

위치 77의 아미노산이 K 또는 치환된다면, A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, A, C, D, E, G, I, L, P, Q, R, S, V, W, 또는 Y)이고;

위치 78의 아미노산이 I 또는 치환된다면, A, C, D, E, F, G, H, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, C, D, E, K, L, M, P, Q, R, S, 또는 V)이고;

위치 79의 아미노산이 A 또는 치환된다면, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, F, G, M, N, S, T, 또는 V)이고;

위치 80의 아미노산이 A 또는 치환된다면, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, Y, 또는 W(바람직하게는, C, D, E, G, H, Q, S, T, V, 또는 Y)이고;

위치 81의 아미노산이 R 또는 치환된다면, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, A, C, D, G, H, I, K, L, M, N, P, S, T, V, W, 또는 Y)이고;

위치 82의 아미노산이 A 또는 치환된다면, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, C, D, G, H, K, N, P, Q, R, S, T, 또는 V)이고;

위치 83의 아미노산이 A 또는 치환된다면, C, D, E, G, K, L, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, C, E, L, S, T, 또는 Y)이고;

위치 84의 아미노산이 K 또는 치환된다면, A, C, D, E, F, G, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, 또는 W(바람직하게는, E, F, G, M, N, S, 또는 W)이고;

위치 85의 아미노산이 D 또는 치환된다면, A, C, E, G, H, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, C, L, M, N, Q, S, T, V, 또는 W)이고;

위치 86의 아미노산이 G 또는 치환된다면, A, C,D, E, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, 또는 W(바람직하게는, C, D, E, I, M, N, P, Q, R, S, 또는 T)이고;

위치 87의 아미노산이 D 또는 치환된다면, A, C, E, F,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, E, F, G, H, I, M, P, Q, R, S, V, W, 또는 Y)이고;

위치 88의 아미노산이 A 또는 치환된다면, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, D, E, H, L, M, N, R, T, V, W, 또는 Y)이고;

위치 89의 아미노산이 A 또는 치환된다면, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, E, F, G, L, N, P, Q, S, T, V, 또는 W)이고;

위치 90의 아미노산이 R 또는 치환된다면, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, A, C, D, E, H, K, N, P, Q, T, V, W, 또는 Y)이고;

위치 91의 아미노산이 N 또는 치환된다면, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, A, D, E, G, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, 또는 W)이고;

위치 92의 아미노산이 A 또는 치환된다면, C, D, G, H, I, L, M, N, P, R, S, T, V, 또는 W(바람직하게는, C, G, P, T, 또는 V)이고;

위치 93의 아미노산이 E 또는 치환된다면, A, C, D, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, A, C, D, F, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, 또는 V)이고;

위치 94의 아미노산이 N 또는 치환된다면, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, D, F, G, I, L, M, Q, S, T, V, 또는 W)이고;

위치 95의 아미노산이 A 또는 치환된다면, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, C, E, H, I, L, M, N, Q, R, S, V, W, 또는 Y)이고;

위치 96의 아미노산이 A 또는 치환된다면, C, D, E, G, I, L, M, N, P, Q, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, C, G, I, 또는 S)이고;

위치 97의 아미노산이 R 또는 치환된다면, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, Y, 또는 W(바람직하게는, A, C, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, S, T, V, 또는 Y)이고;

위치 98의 아미노산이 K 또는 치환된다면, A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, A, F, G, I, L, P, Q, T, V)이고;

위치 99의 아미노산이 A 또는 치환된다면, C, D, G, I, L, Q, S, T, V, 또는 W(바람직하게는, L, T, 또는 V)이고;

위치 100의 아미노산이 K 또는 치환된다면, A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, Q, R, S, T, V, 또는 W(바람직하게는, A, C, D, E, F, G, H, I, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y)이고;

위치 101의 아미노산이 E 또는 치환된다면, A, C, D, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, A, D, F, G, H, I, K, L, M, N, R, S, T, V, 또는 W)이고;

위치 102의 아미노산이 F 또는 치환된다면, A, C, D, E, G, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(C, G, I, K, P, V, W, Y)이고;

위치 103의 아미노산이 A 또는 치환된다면, C, D, F, G, I, L, M, N, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, C, F, G, I, L, S, 또는 T)이고;

위치 104의 아미노산이 E 또는 치환된다면, A, C, D, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, A, C, D, G, H, I, L, M, N, R, S, T, V, 또는 Y)이고;

위치 105의 아미노산이 E 또는 치환된다면, A, C, D, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, A, C, F, G, H, K, L, M, Q, R, S)이고;

위치 106의 아미노산이 Q 또는 치환된다면, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, R, S, T, Y, 또는 V(바람직하게는, C, D, I, K, N, R, T, Y)이고;

위치 107의 아미노산이 A 또는 치환된다면, C, E, F, G, I, L, M, Q, S, T, V, 또는 W(바람직하게는, I 또는 S)이고;

위치 108의 아미노산이 K 또는 치환된다면, A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, D, G, H, I, Q, 또는 R)이고;

위치 109의 아미노산이 L 또는 치환된다면, A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, Q, R, S, T, V, Y, 또는 W(바람직하게는, A, C, D, F, G, H, I, K, M, N, Q, R, S, T, V, W, Y)이고;

위치 110의 아미노산이 A 또는 치환된다면, C, F, G, I, L, S, T, V, 또는 Y(바람직하게는, I)이고;

위치 111의 아미노산이 D 또는 치환된다면, A, C, E, F, G, H, I, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, C, F, I, S, 또는 T)이고;

위치 112의 아미노산이 M 또는 치환된다면, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, A, D, E, F, H, I, K, L, Q, R, S, T, V, Y)이고;

위치 113의 아미노산이 Y 또는 치환된다면, D, F, H, I, L, M, 또는 V(바람직하게는, F)이고;

위치 114의 아미노산이 A 또는 치환된다면, C, D, E, F, G, H, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, 또는 W(바람직하게는, C, D, G, H, N, R, S, 또는 V)이고;

위치 115의 아미노산이 E 또는 치환된다면, A, C, D, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, A, G, L, M, Q, R, S, T, 또는 V)이고;

위치 116의 아미노산이 L 또는 치환된다면, A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, A, C, D, E, F, G, H, I, M, N, Q, S, T, V, 또는 Y)이고;

위치 117의 아미노산이 A 또는 치환된다면, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, C, D, F, G, I, N, P, 또는 T)이고;

위치 118의 아미노산이 K 또는 치환된다면, A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, A, C, D, E, F, G, H, L, M, N, R, S, T, V, 또는 Y)이고;

위치 119의 아미노산이 N 또는 치환된다면, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, A, D, F, G, H, I, K, M, Q, R, S, T, 또는 Y)이고;

위치 120의 아미노산이 G 또는 치환된다면, A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, A, D, E, N, 또는 Q)이고;

위치 121의 아미노산이 D 또는 치환된다면, A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, E, F, 또는 N)이고;

위치 122의 아미노산이 K 또는 치환된다면, A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, 또는 W)이고;

위치 123의 아미노산이 S 또는 치환된다면, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, R, T, V, 또는 W)이고;

위치 124의 아미노산이 S 또는 치환된다면, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, A, C, E, F, G, I, L, M, N, Q, R, T, V, 또는 Y)이고;

위치 125의 아미노산이 V 또는 치환된다면, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W, 또는 Y(바람직하게는, A, D, H, I, N, P, T, 또는 W)이고;

위치 126의 아미노산이 L 또는 치환된다면, A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, R, C, H, I, K, M, S, T, 또는 Y)이고;

위치 127의 아미노산이 E 또는 치환된다면, A, C, D, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, A, C, D, F, G, H, M, P, Q, R, T, V, W, 또는 Y)이고;

위치 128의 아미노산이 Q 또는 치환된다면, A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, S, T, V, 또는 W(바람직하게는, N 또는 P)이고;

위치 129의 아미노산이 L 또는 치환된다면, C, I, M, T, 또는 V(바람직하게는, I, T, 또는 V)이고;

위치 130의 아미노산이 K 또는 치환된다면, A, C, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, A, C, E, I, L, N, R, V, 또는 Y)이고;

위치 131의 아미노산이 T 또는 치환된다면, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, V, W, 또는 Y(바람직하게는, A, C, F, H, I, K, L, M, Q, R, S, V, W, 또는 Y이고);

위치 132의 아미노산이 F 또는 치환된다면, A, C, H, V, W, 또는 Y(바람직하게는, W)이고;

위치 133의 아미노산이 A 또는 치환된다면, C, G, L, M, S, T, 또는 V(바람직하게는, C, S, 또는 T)이고;

위치 134의 아미노산이 D 또는 치환된다면, A, C, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, A, E, H, I, L, N, Q, R, S, T, V, Y)이고;

위치 135의 아미노산이 K 또는 치환된다면, A, C, F, H, I, L, M, N, Q, R, S, V, W, 또는 Y(바람직하게는, A, H, M, N, R, S, V, W, 또는 Y)이고;

위치 136의 아미노산이 A 또는 치환된다면, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, S, T, 또는 V(바람직하게는, C, E, F, I, L, N, Q, S, T, 또는 V)이고;

위치 137의 아미노산이 F 또는 치환된다면, A, C, D, E, G, H, I, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, D, E, H, L, M, N, Q, 또는 W)이고;

위치 138의 아미노산이 H 또는 치환된다면, A, C, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, A, D, G, I, K, M, P, Q, R, S, 또는 Y)이고;

위치 139의 아미노산이 E 또는 치환된다면, A, C, D, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, D, G, I, L, N, Q, S, T, V)이고;

위치 140의 아미노산이 M 또는 치환된다면, A, C, D, F, G, H, I, L, N, Q, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, A, C, F, G, L, S, T, 또는 V)이고;

위치 141의 아미노산이 E 또는 치환된다면, D, M, N, P, Q, T, 또는 V(바람직하게는, D, N, 또는 T)이고;

위치 142의 아미노산이 D 또는 치환된다면, E, F, G, H, L, N, 또는 Q(바람직하게는, E)이고;

위치 143의 아미노산이 R 또는 치환된다면, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, A, C, E, F, G, H, I, M, P, Q, T, V, W, 또는 Y)이고;

위치 144의 아미노산이 F 또는 치환된다면, C, G, H, L, M, N, W, 또는 Y(바람직하게는, N, W, 또는 Y)이고;

위치 145의 아미노산이 Y 또는 치환된다면, H, D, 또는 F(바람직하게는, H)이고;

위치 146의 아미노산이 Q 또는 치환된다면, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, A, C, D, F, G, H, I, K, M, N, S, 또는 V)이고;

위치 147의 아미노산이 A 또는 치환된다면, C, F, G, H, I, L, M, N, Q, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, C, S, 또는 T)이고;

위치 148의 아미노산이 A 또는 치환된다면, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, Q, S, T, 또는 V(바람직하게는, C, F, G, L, M, N, S, T, 또는 V)이고;

위치 149의 아미노산이 L 또는 치환된다면, A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, C, F, I, K, R, T, 또는 V)이고;

위치 150의 아미노산이 A 또는 치환된다면, A, C, D, E, F, G, H, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, K, M, N, S, 또는 T)이고;

위치 151의 아미노산이 V 또는 치환된다면, A, C, D, F, G, I, L, M, N, Q, S, 또는 T(바람직하게는, A, I, L, 또는 T)이고;

위치 152의 아미노산이 F 또는 치환된다면, C, H, I, L, M, V, W, 또는 Y(바람직하게는, H, 또는 W)이고;

위치 153의 아미노산이 E 또는 치환된다면, A, C, D, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, D, G, H, I, K, M, N, Q, S, 또는 T)이고;

위치 154의 아미노산이 A 또는 치환된다면, C, E, F, G, I, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, C, L, Q, 또는 V)이고;

위치 155의 아미노산이 A 또는 치환된다면, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, Y, 또는 W(바람직하게는, C, D, E, G, H, I, L, M, P, Q, S, T, V, W, 또는 Y)이고;

위치 156의 아미노산이 E 또는 치환된다면, A, C, D, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는, D, H, I, M, N, P, Q, R, S, 또는 T)이고;

위치 157의 아미노산이 A 또는 치환된다면, E, S, 또는 V이고;

위치 158의 아미노산이 A 또는 치환된다면, E, G, S, T, 또는 V(바람직하게는, V)이고;

위치 159의 아미노산이 A 또는 치환된다면, E, G, S, T, 또는 V(바람직하게는, S 또는 T)이고;

위치 160의 아미노산이 G 또는 치환된다면, E, R, 또는 V(바람직하게는, R)인, 본 발명의 드노보 단백질이 포함된다. 일부 바람직한 실시양태에서, 위치 8, 9, 10, 12, 91, 94, 98, 102, 105, 106, 109, 112, 113, 123, 127, 128, 131, 132, 134, 135, 138, 139, 141, 142, 145, 146, 및 140 중 6개, 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개 이하가 치환된다.

일부 예시적인 실시양태에서, 아미노산 잔기는 안정성을 첨가하기 위해 단백질 디코이의 N 말단에 첨가된다. 예를 들어, 예시적인 실시양태에서, N 말단에는 PG 서열(즉, 프롤린-글리신)이 첨가된다. 서열번호 47-90, 104-172, 184-193, 224-239, 255-260 및 265-266 및 서열번호 91-95, 194-197, 223, 및 261-263(이하에 제공됨)에 제시된 임의의 아미노산 서열 앞에는, 예를 들어, PG 서열, 또는 MPG 서열이 선행될 수 있다.

ACE2 단백질 디코이는 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 그 이상의 디코이 단위를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, ACE2 단백질 디코이는 1개, 2개, 3개, 또는 4개의 디코이 단위를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 디코이 단위는 (i) 적어도 2개의 알파 나선 도메인, H1 및 H2, (ii) 선택적인 베타 헤어핀 도메인, H3, 및 (iii) 적어도 하나의 구조적 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 디코이 단위는 (i) 2개의 알파 나선 도메인, H1 및 H2, (ii) 하나의 베타 헤어핀 도메인, H3, 및 (iii) 2개의 구조적 도메인을 포함한다. 예시적인 실시양태에서, H1, H2, H3 및 구조적 도메인은 본원에 기재된 바와 같다. 비제한적인 예시적 디코이 단위는 서열번호 47-90, 104-172, 184-193, 224-239, 및 255-260에 제공된다. 일부 측면에서, ACE2 단백질 디코이는 다가(예를 들어, 2가, 3가, 4가)이며, 이는 적어도 2개의 디코이 단위를 포함하는 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, ACE2 단백지 디코이는 서열번호 47-90, 104-172, 184-193, 224-239, 255-260, 또는 265-266으로부터 독립적으로 선택되는 2개, 3개, 4개, 또는 그 이상의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, ACE2 단백질 디코이는 동일한 디코이 단위의 다중 카피를 포함한다. 일부 실시양태에서, ACE2 단백질 디코이는 동일한 또는 상이한 디코이 단위의 2 내지 4개 카피를 포함한다.

일부 측면에서, 제1 디코이 단위의 C 말단은 제2 디코이 단위의 N 말단에 연결된다. 연결은 화학적 또는 효소적 가교(예를 들어, 비스말레이미드)를 통해 이루어질 수 있다. 2개 또는 그 이상의 디코이 단위는 해독 융합체에서 서로 인접할 수 있거나, 또는 의도된 목적에 적합한 폴리펩타이드 링커에 의해 연결될 수 있다. 예시적인 이러한 링커로는 WO2016178905, WO2018153865, 및 WO 2018170179에 개시된 것을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 다른 실시양태에서, 적합한 링커로는 펩타이드 링커, 예컨대, 예를 들어, GGGGG (서열번호 96), GSGGG (서열번호 97), GGGGGG (서열번호 98), GGSGGG (서열번호 99), GGSGGSGGGSGGSGSG (서열번호 100), GSGGSGGGSGGSGSG (서열번호 101), GGSGGSGGGSGGSGGGGSGGSGGGSGGGGS (서열번호 102), GGGGSGGSGSGGSGGGS (서열번호 175), [GGGGX]_n (서열번호 103), 여기서 X는 Q, E 또는 S이고 n은 2-5임, 및 GGGSGGSGSGGSGGGS (서열번호 264)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 디코이 단위 사이의 아미노산 링커는 1-100, 1-80, 1-60, 1-50, 1-40, 1-30, 또는 1-20개의 아미노산 길이이다.

일부 측면에서, 2개 이상의 ACE2 단백질 디코이는 상이하다. 본원에 제공된 임의의 ACE2 단백질 디코이는 본 발명에서 사용하기 위해 함께 연결될 수 있다.

예시적인 ACE2 단백질 디코이로는 CTC-640, CTC-693, CTC-694, CTC-695, CTC-702, CTC-705, 또는 CTC-726 중 하나 이상을 포함하는 것을 포함한다. 일부 측면에서, ACE2 단백질 디코이는 (i) CTC-640 및/또는 CTC-693; (ii) CTC-640 및/또는 CTC-694; (iii) CTC-640 및/또는 CTC-694를 포함한다. 일부 측면에서, 본 발명의 ACE2 단백질 디코이는 CTC-640의 다가의 연속 이반복된 버전; 각각의 개별 디코이 단위가 CTC-640에 대해 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95%, 97%, 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 다가의 ACE2 단백질 디코이; CTC-702의 다가의 연속 이반복된 버전; 각각의 개별 디코이 단위가 CTC-702에 대해 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95%, 97%, 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 다가의 ACE2 단백질 디코이; CTC-705의 다가의 연속 이반복된 버전; 각각의 개별 디코이 단위가 CTC-705에 대해 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95%, 97%, 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 다가의 ACE2 단백질 디코이; CTC-726의 다가의 연속 이반복된 버전; 또는 각각의 개별 디코이 단위가 CTC-726에 대해 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95%, 97%, 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 다가의 ACE2 단백질 디코이 중 하나 이상을 포함하는 것을 포함한다.

본 기술분야의 기술자라면, 링커 외에도, 추가적인 아미노산 잔기가 각 개별 디코이 단위의 N 또는 C 말단에 첨가된 후, 함께 융합되어 다가의 ACE2 단백질 디코이, 예를 들어, 2가, 3가, 4가 등을 생성할 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 다가의 ACE2 단백질 디코이는 환형화될 수 있다. 단백질을 환형화하는 방법은 본 기술분야에 알려져 있고, 예를 들어, Wood et al., Journal of Biological Chemistry, 289:21; 14512-14519, 2014를 참조한다.

예시적인 다가 ACE2 단백질 디코이는 서열번호 91-95, 194-197, 223, 또는 261-263에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 것을 포함한다.

도메인 순서

드노보 합성된 단백질인 본 발명의 단백질의 결과로서, 아미노산 잔기 뿐만 아니라 도메인의 정렬(예를 들어, H1, H2, H3, D1 및 D2) 모두에 있어서 상당한 가변성이 허용된다. 도메인은 다양한 순서로 아미노산 링커를 통해 함께 연결될 수 있고, 여전히 적당히 폴딩되어 코로나바이러스 스파이크 단백질에 대한 결합에 대해 제시될 수 있다. 언급한 바와 같이, CTC-445 및 본원에 제공된 많은 CTC-445 변이체에서 도메인의 순서는 H3-D1-D2-H2-H1이다. 하지만, 숙련된 기술자는 도메인이 재정렬되어 여전히 활성 단백질을 초래할 수 있음을 이해할 것이다. 일부 실시양태에서, 도메인의 재정렬은 원순열이라 하며, 디코이 단위의 아미노산 서열은 새로운 N-말단 및 C-말단을 생성하도록 순서가 이동된다. 일부 이러한 측면에서, 재정렬은 H1-H3-D1-D2-H2인 새로운 도메인 순서를 초래한다. H3-D1-D2-H2-H1의 도메인 순서를 갖는 본원에 기재된 모든 CTC-445 변이체는 원순열되어 H1-H3-D1-D2-H2의 새로운 도메인 순서를 생성할 수 있다. H1 도메인의 이동으로 인해, H1과 H3 도메인 사이에는 아미노산 링커가 첨가되어 도메인 H1과 H3 사이에 가변 루프 영역을 생성한다. CTC-705는 CTC-640의 원순열된 버전이다. CTC-726 및 CTC-786은 도메인 H1과 H3 사이의 링커와 관련하여 상이한 CTC-702의 2개의 원순열된 버전이다. 이러한 방식의 원순열성 CTC-640 및 CTC-726은 ACE2 단백질 디코이의 말단을 재배치하여 다가 하위단위의 여러 배향을 허용한다. 도메인의 또 다른 정렬로는, 예를 들어, H2-H1-H3-D1-D2, D2-H2-H1-H3-D1, 및 D1-D2-H2-H1-H3을 포함한다.

ACE2 단백질 디코이의 예시적인 생물학적 특성

일반적으로, 본 발명의 단백질은 코로나바이러스 스파이크 단백질, 특히 수용체로서 ACE2를 통해 숙주 세포 내로 진입을 획득한 코로나바이러스(즉, 코로나바이러스 ACE2-결합 스파이크 단백질) 유래의 코로나바이러스 스파이크 단백질에 결합하여 기능한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 드노보 단백질은 스파이크 단백질 SARS-COV-2의 수용체 결합 도메인(RBD)에 있는 하나 이상의 아미노산에 결합한다. 예를 들어, 본 발명은 생물층 간섭계 또는 효모 디스플레이에 의해, 예를 들어 실시예에 정의된 바와 같은 검정 형식을 사용하여 측정했을 때, 100 nM 미만, 50 nm 미만, 20 nM 미만의 K_d로 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 결합하는 드노보 단백질을 포함한다. 특정 실시형태에서, 드노보 단백질은 생물층 간섭계 또는 효모 디스플레이에 의해, 예를 들어, 본원에 정의된 바와 같은 검정 형식, 또는 실질적으로 유사한 검정을 사용하여 측정했을 때, 약 20 nM 미만, 약 15 nM 미만, 약 5 nM 미만의 K_d로 SARS-CoV-S에 결합한다.

본 발명은 또한 본 기술분야에 공지된 검정을 사용하여 결정했을 때, ACE2에 대한 SARS-CoV-2-S 결합을 50% 초과, 60% 초과, 70% 초과, 80% 초과, 또는 90% 초과로 차단하는 본 발명의 드노보 ACE2 단백질 디코이를 포함한다.

또한, 본 발명은 숙주 세포에 대한 코로나바이러스(예를 들어, SARS-CoV-2)의 감염성을 중화 또는 저해하는 드노보 단백질을 포함한다. 특정 실시양태에서, 이 단백질은 SARS-CoV-2-유사 의사입자의 감염성을 중화시킨다. 일부 실시양태에서, 단백질은, 예를 들어, 실시예에 제시된 바와 같은 최적화된 바이러스 유사 의사입자(VLP) 중화 검정, 또는 실질적으로 유사한 검정에서 인간 숙주 세포에 대한 SARS-CoV-2의 결합을 50% 초과, 60% 초과, 70% 초과, 80% 초과, 또는 90% 초과로 저해한다.

본 발명은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인 또는 이 도메인의 단편에 결합하는 드노보 ACE2 단백질 디코이를 포함한다.

본 발명의 ACE2 단백질 디코이는 하나 이상의 전술한 생물학적 특성, 또는 이의 임의의 조합을 보유할 수 있다.

본 발명의 단백질의 다른 생물학적 특성은 본원에 제공된 실시예를 포함하는 본 개시내용의 검토로부터 본 기술분야의 기술자에게 명백할 것이다.

핵산, 발현 벡터, 숙주 세포

추가 측면에서, 본 발명은 본 발명의 단백질 또는 펩타이드를 암호화하는 핵산, 예를 들어 단리된 핵산을 제공한다. 단리된 핵산 서열은 RNA 또는 DNA를 포함할 수 있다. 이러한 단리된 핵산 서열은 폴리A 서열, 변형된 코작(Kozak) 서열, 및 에피토프 태그, 수송 신호, 및 분비 신호, 핵 국재화 신호, 및 형질막 국재화 신호를 암호화하는 서열을 포함하나, 이에 제한되지 않는 암호화된 단백질의 발현 및/또는 정제를 촉진하는 데 유용한 추가 서열을 포함할 수 있다. 본원의 교시에 기초하면 어떤 핵산 서열이 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화할 것인지는 본 기술분야의 기술자에게 명백할 것이다.

다른 측면에서, 본 발명은 적합한 제어 서열에 작동가능하게 연결된 본 발명의 임의의 측면에 따른 단리된 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다. "재조합 발현 벡터"는 유전자 산물의 발현을 달성할 수 있는 임의의 제어 서열에 핵산 암호 영역 또는 유전자를 작동가능하게 연결하는 벡터를 포함한다. 본 발명의 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 "제어 서열"은 핵산 분자의 발현을 달성할 수 있는 핵산 서열이다. 제어 서열은 핵산 서열의 발현을 유도하는 기능을 하는 한, 그 핵산 서열에 근접할 필요는 없다. 따라서, 예를 들어, 해독되지 않았지만 전사된 개재 서열은 프로모터 서열과 핵산 서열 사이에 존재할 수 있고, 프로모터 서열은 여전히 암호 서열에 "작동가능하게 연결된" 것으로 간주될 수 있다. 이러한 다른 제어 서열로는 폴리아데닐화 신호, 종결 신호, 및 리보솜 결합 부위를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 이러한 발현 벡터는 플라스미드 및 바이러스 기반의 발현 벡터를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 포유동물계에서 개시된 핵산 서열의 발현을 유도하는 데 사용된 제어 서열은 구성적(CMV, SV40, RSV, 액틴, EF를 포함하나, 이에 제한되지 않는 임의의 다양한 프로모터에 의해 구동됨), 또는 유도적(테트라사이클린, 엑디손, 스테로이드-반응성을 포함하나, 이에 제한되지 않는 임의의 다수의 유도성 프로모터에 의해 구동됨)일 수 있다. 발현 벡터는 숙주 유기체에서 에피솜으로서, 또는 숙주 염색체 DNA에 통합함으로써 복제가능해야 한다. 다양한 실시양태에서, 발현 벡터는 플라스미드, 바이러스계 벡터(레트로바이러스 벡터 또는 종양용해성 바이러스를 포함하나, 이에 제한되지 않음), 또는 임의의 다른 적합한 발현 벡터를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 발현 벡터는 치료 이익을 위해 생체내에서 단백질을 발현하도록 본 개시내용의 방법으로 투여될 수 있다. 본 발명의 핵산은 본원에 기재된 질환을 치료하기 위해 대상체에게 투여될 수 있다.

추가 측면에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 재조합 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공하며, 여기서 숙주 세포는 원핵세포 또는 진핵세포일 수 있다. 세포는 본 발명의 발현 벡터를 혼입시키기 위해, 박테리아 형질전환, 인산칼슘 공침전, 전기천공, 또는 리포솜 매개, DEAE 덱스트란 매개, 다가양이온 매개, 또는 바이러스 매개의 형질감염을 포함하나, 이에 제한되지 않는 기술을 사용하여 일시적 또는 안정적으로 조작될 수 있다(예를 들어, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook, et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press); Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 2 ^nd Ed. (R.I. Freshney. 1987. Liss, Inc. New York, NY) 참조). 본 발명에 따른 단백질을 생산하는 방법은 본 발명의 추가 부분이다. 이 방법은 (a) 단백질의 발현에 도움이 되는 조건하에서 본 발명의 이러한 측면에 따라 숙주를 배양하는 단계, 및 (b) 선택적으로, 발현된 단백질을 회수하는 단계를 포함한다. 발현된 단백질은 무세포 추출물로부터 회수될 수 있지만, 바람직하게는 배양 배지로부터 회수된다.

추가 측면에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 단백질에 선택적으로 결합하는 항체를 제공한다. 항체는 다클론, 단클론 항체, 인간화 항체, 및 이들의 단편일 수 있고, 본 기술분야의 기술자에게 공지된 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 본원에 사용된 "선택적으로 결합한다"는 본 기술분야의 기술자라면 잘 알고 있듯이, 하나 이상의 다른 생물학적 분자, 구조, 세포, 조직 등과 대조적으로, 본 개시내용의 단백질에 대한 항체의 우선적 결합을 의미한다.

융합 단백질 및 접합체

본 발명의 예시적인 단백질은 본 발명의 드노보 ACE2 단백질 디코이 및 이종 폴리펩타이드를 포함하는 융합 또는 키메라 폴리펩타이드로서 제조될 수 있다. 예시적인 이종 폴리펩타이드는 결과적으로 생성된 키메라 폴리펩타이드의 순환 반감기를 생체내에서 증가시킬 수 있고, 따라서 본 발명의 단백질의 성질을 더욱 향상시킬 수 있다. 다양한 실시양태에서, 순환 반감기를 증가시키는 폴리펩타이드는 인간 혈청 알부민과 같은 혈청 알부민, 또는 IgG 중쇄 가변 영역이 결여된 항체의 IgG 서브클래스의 Fc 영역일 수 있다. 예시적인 Fc 영역은 돌연변이(예를 들어, 보체 고정 및/또는 Fc 수용체 결합을 저해하는 돌연변이)를 포함할 수 있거나, 용해성일 수 있으며, 즉, 항체-의존성 보체 용해와 같은 다른 기전을 통해 세포를 용해시키거나 보체에 결합할 수 있다. "Fc 영역"은 파파인에 의한 IgG의 분해에 의해 생성된 IgG C-말단 도메인과 상동성인 천연 발생 또는 합성 폴리펩타이드일 수 있다. 융합 단백질은 전체 Fc 영역, 또는 이것이 일부인 키메라 폴리펩타이드의 순환 반감기를 연장시키는 능력을 보유하는 더 작은 부분을 포함할 수 있다. 또한, 전체 길이 또는 단편화된 Fc 영역은 야생형 또는 야생형 분자의 변이체일 수 있다. 즉, 이들은 폴리펩타이드의 기능에 영향을 미칠 수 있거나 영향을 미치지 않을 수 있는 돌연변이를 함유할 수 있다. 예를 들어, 이들은 이펙터 기능을 가질 수 있거나, 이펙터 기능과 연관된 하나 이상의 활동이 감소되거나 완전히 제거되도록 변형될 수 있다. 이펙터 기능은 면역글로불린 동형(isotype)에 따라 달라지는 면역글로불린의 Fc 영역에 기인하는 생물학적 활성을 지칭한다. 이펙터 기능의 예로는 C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성(CDC), Fc 수용체 결합, 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC), 항체 의존성 세포 식세포작용(ADCP), 사이토카인 분비, 항원 제시 세포에 의한 면역 복합체 매개 항원 흡수, 세포 표면 수용체의 하향 조절 및 B 세포 활성화를 포함한다.

일부 예시적인 실시양태에서, 본 발명의 드노보 단백질은 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 Fc 영역을 포함한다. 일부 예시적인 실시양태에서, 드노보 단백질은 변이체 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 Fc 영역을 포함한다. 일부 측면에서, 변이체 Fc 영역은 이펙터 기능이 결여되어 있다. 일부 측면에서, 본 발명의 드노보 단백질은 Fc 영역(예를 들어, 천연 또는 변이체 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 Fc 영역)의 C-말단에 융합된다. 일부 측면에서, 본 발명의 2개의 드노보 단백질은 Fc 영역(예를 들어, N 및 C 말단에)에 융합된다.

다른 실시형태에서, 본 발명의 단백질은 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜 사슬의 부착(PEG화)을 포함하나, 이에 제한되지 않는 생체내 증가된 반감기를 촉진하기 위해 다른 유형의 안정화 화합물에 연결될 수 있다.

이와 관련하여, 드노보 단백질은 단백질 단독에 비해 순환 반감기를 증가시키는 수용성 중합체(예를 들어, PEG)와의 화학적 접합을 가능하게 하는 아미노산 치환을 가질 수 있다. "PEG"는 에틸렌 글리콜의 수용성 중합체인 폴리(에틸렌 글리콜) 분자이다. PEG는 다양한 크기로 수득될 수 있고, 또한 단백질에 대한 공유 접합을 가능하게 하는 화학적 반응성 기에 의해 유도체화된 화학적으로 활성화된 형태로 상업적으로 수득될 수 있다. 선형 PEG는 중량 평균 분자량이 5,000 달톤, 10,000 달톤, 20,000 달톤, 30,000 달톤 및 40,000 달톤인 PEG 중합체와 같은 다양한 분자량으로 생산된다. 분지형 PEG 중합체도 개발되어 있다. 일반적으로 사용되는 활성화된 PEG 중합체는 N-하이드록시숙신이미드 기(라이신 잔기 및 단백질 N-말단과 같은 1차 아민에 대한 접합용)으로, 알데하이드 기(N-말단에 접합용), 및 말레이미드 또는 요오도아세트아미드 기(시스테인 잔기와 같은 티올에 커플링하기 위해)에 의해 유도체화된 것이다. PEG에 대한 접합용 모이어티를 설계하는 방법은 본 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜("PEG") 함유 모이어티의 첨가는 단백질의 시스테인 잔기에 대한 말레이미드 기에 연결된 PEG 기(예를 들어, "PEG-MAL")의 부착을 포함할 수 있다. PEG-MAL의 적합한 예로는, 예를 들어, 메톡시 PEG-MAL 5kD; 메톡시 PEG-MAL 20kD; 메톡시(PEG)2-MAL 40kD; 메톡시 PEG(MAL)2 5kD; 메톡시 PEG(MAL)2 20kD; 메톡시 PEG(MAL)2 40kD; 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.

본 발명의 드노보 단백질과 관련하여, 결합에 필요하지 않은 아미노산은 원하는 모이어티의 부착을 허용하기 위해 시스테인으로 대체될 수 있다. 일부 실시양태에서, ACE2 단백질 디코이는 0-4개의 시스테인 아미노산을 포함하거나, 일부 실시양태에서 0 또는 1개의 시스테인 아미노산을 포함한다. 일부 이러한 측면에서, PEG 분자와 같은 수용성 중합체는 하나 이상(바람직하게는 하나)의 시스테인 잔기에 연결된다. 연결은, 예를 들어, 말레이미드기를 통해 이루어질 수 있다. 안정성 모이어티에 접합시키기에 바람직한 시스테인 잔기의 배치는 안정성 모이어티가 ACE2 코로노바이러스 스파이크 단백질에 대한 결합(예를 들어, 코로나바이러스 스파이크 단백질에 대한 알파 나선 및 베타 헤어핀 도메인의 단백질 폴딩 및 결합-적격 제시를 용이하게 하는 구조적 도메인에서)을 방해하지 않도록 결합 부위에 대해 멀리 떨어진 것이다. 시스테인 잔기는 안정성 모이어티에 대한 접합 이외의 다른 이유로 첨가될 수 있으며, 예를 들어, 2 이상의 시스테인 잔기는 이황화 결합의 형성을 허용하도록 배치될 수 있다. 이황화 결합은 일부 측면에서 ACE2 단백질 디코이에 추가적인 안정성을 제공할 수 있다. 이러한 실시양태에서, 첨가된 시스테인 잔기는 결합 부위에 대해 멀리 떨어질 필요는 없고, 일부 측면에서 ACE2 단백질 디코이의 N 및 C 말단에 있을 수 있다. 따라서, 하나 이상의 이황화 결합을 포함하는 ACE2 단백질 디코이가 본 발명에 포함된다.

일부 예시적인 실시양태에서, PEG 기는 ACE-2 단백질 디코이 중 어느 하나에 존재하는 시스테인 잔기에 연결된다. 예를 들어, 본원에는 (i) 위치 11에 시스테인 잔기가 존재하고 PEG 기에 연결된 CTC-648의 아미노산 서열; (ii) 위치 63에 시스테인 잔기가 존재하고 PEG 기에 연결된 CTC-649의 아미노산 서열; (iii) 위치 74에 시스테인 잔기가 존재하고 PEG 기에 연결된 CTC-650의 아미노산 서열; (iv) 위치 11에 시스테인 잔기가 존재하고 PEG 기에 연결된 CTC-651의 아미노산 서열; (v) 위치 63에 시스테인 잔기가 존재하고 PEG 기에 연결된 CTC-652의 아미노산 서열; (vi) 위치 74에 시스테인 잔기가 존재하고 PEG 기에 연결된 CTC-653의 아미노산 서열; (vii) 위치 11에 시스테인 잔기가 존재하고 PEG 기에 연결된 CTC-642 또는 CTC-645의 아미노산 서열; (ix) 위치 63에 시스테인 잔기가 존재하고 PEG 기에 연결된 CTC-643 또는 CTC-646의 아미노산 서열; (x) 위치 74에 시스테인 잔기가 존재하고 PEG 기에 연결된 CTC-647의 아미노산 서열; (xi) 위치 11에 시스테인 잔기가 존재하고 PEG 기에 연결된 CTC-693의 아미노산 서열; 위치 63에 시스테인 잔기가 존재하고 PEG 기에 연결된 CTC-694의 아미노산 서열; 또는 위치 74에 시스테인 잔기가 존재하고 PEG 기에 연결된 CTC-695의 아미노산 서열에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 ACE2 단백질 디코이가 제공된다. 연결은, 예를 들어, 말리미드 기를 포함하는 본 기술분야에 공지된 임의의 방법론을 통해 이루어질 수 있다.

본 발명의 드노보 단백질 및 이종 폴리펩타이드를 포함하는 키메라 폴리펩타이드는 표적화 도메인을 포함하는 키메라 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 표적화 도메인은 드노보 단백질의 세포 국재화를 유도할 수 있다.

표적화 도메인이 폴리펩타이드인 경우, 표적화 도메인은 하나 이상의 관심 표적에 결합하고 본 발명의 폴리펩타이드에 부착되거나 연관될 수 있는 임의의 적합한 폴리펩타이드일 수 있다. 비제한적인 실시양태에서, 표적화 도메인은 scFv, F(ab), F(ab')₂, B 세포 수용체(BCR), DARPin, 아피바디, 모노바디, 나노바디, 디아바디, 항체(단일특이성 또는 이중특이성 항체 포함); RGD 인테그린 결합 펩타이드, 드노보 설계된 결합제, 압타머, 이환형 펩타이드, 코노톡신, 엽산과 같은 소분자, 및 세포 표면에 결합하는 바이러스를 포함하나, 이에 제한되지 않는 세포 표적화 올리고펩타이드를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 표적화 도메인은 단백질에 공유적으로 또는 비공유적으로 결합될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 표적화 도메인은 존재하는 경우 단백질과의 해독 융합체이다. 이 실시양태에서, 단백질 및 표적화 도메인은 해독 융합체에서 서로 직접 근접할 수 있고, 또는 의도된 목적에 적합한 폴리펩타이드 링커에 의해 연결될 수 있다. 예시적인 이러한 링커로는 WO2016178905, WO2018153865, 및 WO 2018170179에 개시된 것을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 융합 단백질 및 접합체의 제조 방법은 본 기술분야에 공지되어 있고 본원에서 상세하게 논의되지 않는다.

치료 방법

본 발명의 드노보 ACE2 단백질 디코이는 ACE2를 수용체로서 사용하는 코로나바이러스, 예를 들어 SARS-CoV 또는 SARS-CoV-2와 연관된 질병 또는 장애 또는 상태의 치료 및/또는 예방에, 및/또는 이러한 질병, 장애 또는 상태와 연관된 적어도 하나의 증상을 호전시키는 데 유용하다. 일 실시양태에서, 본 발명의 단백질은 SARS-CoV 또는 SARS-CoV-2 감염을 갖는 환자에게 치료적 용량으로 투여될 수 있다.

특정 실시양태에서, 본 발명의 단백질은 SARS-CoV 또는 SARS-CoV-2에 의해 유발된 중증 및 급성 호흡기 감염을 앓고 있는 대상체를 치료하는 데 유용하다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 단백질은 숙주에서 바이러스 역가를 감소시키거나 바이러스 부하를 감소시키는 데 유용하다. 일 실시양태에서, 본 발명의 단백질은 SARS-CoV 또는 SARS-CoV-2 또는 ACE2를 숙주 세포로의 진입구로서 사용하는 또 다른 코로나바이러스를 갖는 대상체의 폐 염증을 예방하거나 감소시키는 데 유용하다. 일 실시양태에서, 본 발명의 단백질은 SARS-CoV 또는 SARS-CoV-2 또는 ACE2를 숙주 세포로의 진입구로서 사용하는 또 다른 코로나바이러스를 갖는 대상체에서 사이질, 세기관지주위 또는 혈관주위 염증, 폐포 손상 및 흉막 변화를 예방하거나 감소시키는 데 유용하다.

본 발명의 하나 이상의 단백질은 질병 또는 장애의 하나 이상의 증상 또는 상태의 중증도를 완화 또는 예방 또는 감소시키기 위해 투여될 수 있다. 단백질은 SARS-CoV 또는 SARS-CoV-2 또는 ACE2를 숙주 세포로의 진입구로서 사용하는 다른 코로나바이러스 감염의 적어도 하나의 증상, 예를 들어, 비제한적으로, 발열, 기침, 호흡 곤란, 폐렴, 설사, 장기 부전(예를 들어, 신부전, 심부전 및 신장 기능이상), 패혈성 쇼크 및 사망을 포함하나, 이들로 이루어지는 것에 제한되지 않는 증상의 중증도를 호전시키거나 감소시키는 데 사용될 수 있다.

또한, 본원에서는 코로나바이러스 감염이 발병할 위험이 있는 대상체에게 예방적으로 본 발명의 단백질을 사용하는 것이 고려된다. 일부 측면에서, 대상체는 면역 저하된 개인, 노인(65세 이상), 의료 종사자, 낙타 또는 박쥐와 직업적 또는 오락적으로 접촉이 있는 사람, 코로나바이러스 환자와 근접해 있던 가족 구성원, 코로나바이러스 감염이 확인되었거나 의심되는 사람과 접촉한 성인 또는 아동, 및 병력(예를 들어, 폐 감염, 심장 질환 또는 당뇨병의 위험 증가)이 있는 환자이다.

본 발명의 추가 실시양태에서, 본 발명의 드노보 단백질은 코로나바이러스 감염을 앓고 있는 환자를 치료하기 위한 약제학적 조성물 또는 약제의 제조에 사용된다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 본 단백질은 코로나바이러스 감염을 치료하거나 호전시키는데 유용한 본 기술분야의 기술자에게 공지된 임의의 다른 작용제 또는 임의의 다른 요법과 함께 보조 요법으로서 사용된다.

드노보 단백질은 본 발명의 단백질과 유리하게 조합될 수 있는 임의의 추가 치료제와 같은 다른 요법과 조합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 단백질은 코로나바이러스 감염 환자의 바이러스 부하를 감소시키거나 감염의 하나 이상의 증상을 호전시키기 위해 제2 치료제와 조합될 수 있다.

드노보 ACE2 단백질 디코이는 환자에게 투여될 수 있는 임의의 형태일 수 있다. 예를 들어, 고체 또는 액체의 형태일 수 있다. 드노보 단백질은 임의의 편리한 경로, 예를 들어 주입 또는 볼러스 주사, 상피 또는 점막피부 내벽(예를 들어, 구강 점막, 직장 및 장 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있다. 투여는 전신적이거나 국소적일 수 있다. 전형적인 투여 경로는 경구, 국소, 비경구, 설하, 직장, 질, 안구, 종양내 및 비강내를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 비경구 투여는 피하 주사, 정맥내, 근육내, 흉골내 주사 또는 주입 기술을 포함한다. 일 측면에서, 드노보 단백질은 비경구적으로 투여된다. 또 다른 측면에서, 드노보 단백질은 정맥내 또는 피하 투여된다. 일부 측면에서, 전신 노출과 연관될 수 있는 독성을 피할 수 있으므로 국소 투여가 바람직하다. 따라서, 일부 바람직한 측면에서, 드노보 단백질은 국소적으로 투여된다. 일부 측면에서, 드노보 단백질은 예를 들어 흡입을 통해 호흡기에 국소적으로 투여된다. 흡입은 예를 들어 에어로졸 흡입기 또는 흡입가능한 분말에 의한 것일 수 있다.

본 발명의 단백질은 항염증 약물(예를 들어, 코르티코스테로이드 및 비스테로이드성 항염증 약물), 항감염 약물 또는 항바이러스 약물과 조합으로 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 본 발명의 단백질은 사이토카인 방출 증후군(예를 들어, 사이토카인 폭풍)을 치료하기 위한 약물과 조합으로 사용될 수 있다.

또한, 본원에는 ACE2를 수용체로 사용하는 코로나바이러스, 예를 들어, SARS-CoV 또는 SARS-CoV-2와 연관된 질병 또는 장애 또는 상태의 치료 및/또는 예방을 위해, 및/또는 이러한 질병, 장애 또는 상태와 연관된 적어도 하나의 증상을 호전시키기 위해 대상체에 본 발명의 핵산을 사용하는 것이 고려된다. 일 실시양태에서, 본 발명의 핵산은 SARS-CoV 또는 SARS-CoV-2 감염 환자에게 치료적 용량으로 투여될 수 있다.

약제학적 조성물

약제학적 조성물은 환자에게 조성물을 투여할 때 드노보 ACE2 단백질 디코이가 생체이용가능하도록 제형화될 수 있다. 드노보 단백질은 용액, 현탁액, 에멀젼, 마이크로입자, 정제, 알약, 펠렛, 캡슐, 액체를 함유한 캡슐, 분말, 지속 방출 제형, 좌약, 에멀젼, 에어로졸, 스프레이, 현탁액 또는 사용하기에 적합한 임의의 다른 형태의 형태를 취할 수 있다. 적합한 약제학적 담체의 다른 예는 E. W. Martin의 "Remington's Pharmaceutical Sciences"에 기재되어 있다. 약제학적 조성물에서 활성 성분(들)의 최적 투여량은 다양한 인자에 의존적일 것임은 본 기술분야의 기술자에게 명백할 것이다. 관련 인자로는 동물(예를 들어, 인간)의 유형, ACE2 단백질 디코이의 특정 형태, 투여 방식 및 사용되는 조성물이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.

약제학적으로 허용되는 담체 또는 비히클은 조성물이, 예를 들어. 정제 또는 분말 형태이도록 미립자일 수 있다. 담체(들)는 액체일 수 있으며, 조성물은, 예를 들어, 경구 시럽 또는 주사가능한 액체이다. 또한, 담체(들)는, 예를 들어, 흡입 투여에 유용한 에어로졸 조성물을 제공하기 위해 기체 또는 미립자일 수 있다.

경구 투여하고자 하는 경우, 드노보 단백질은 바람직하게는 고체 또는 액체 형태이고, 여기서 반고체, 반액체, 현탁액 및 겔 형태가 고체 또는 액체로서 본원에서 고려된 형태 내에 포함된다. 경구 투여용 고체 조성물로서, 조성물은 분말, 과립, 압축 정제, 환제, 캡슐, 츄잉 검, 웨이퍼 또는 유사 형태로 제형화될 수 있다. 이러한 고체 조성물은 전형적으로 하나 이상의 불활성 희석제를 함유한다. 또한, 다음 중 하나 이상이 존재할 수 있다: 카르복시메틸셀룰로스, 에틸 셀룰로스, 미세결정질 셀룰로스 또는 젤라틴과 같은 결합제; 전분, 락토스 또는 덱스트린과 같은 부형제, 알긴산, 알긴산나트륨, 프리모겔(Primogel), 옥수수 전분 등과 같은 붕해제; 마그네슘 스테아레이트 또는 스테로텍스(Sterotex)와 같은 윤활제; 콜로이드성 이산화규소와 같은 활택제; 수크로스 또는 사카린과 같은 감미제, 페퍼민트, 메틸 살리실레이트 또는 오렌지 향과 같은 향미제, 및 착색제.

조성물이 캡슐, 예를 들어 젤라틴 캡슐의 형태인 경우, 이는 상기 유형의 물질 외에, 폴리에틸렌 글리콜, 시클로덱스트린 또는 지방 오일과 같은 액체 담체를 함유할 수 있다. 조성물은 액체, 예를 들어, 엘릭서, 시럽, 용액, 에멀젼 또는 현탁액의 형태일 수 있다. 액체는 경구 투여 또는 주사에 의한 전달에 유용할 수 있다. 경구 투여용으로 의도된 경우, 조성물은 감미제, 보존제, 염료/착색제 및 향미 증강제 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 주사 투여용 조성물에는 계면활성제, 보존제, 습윤제, 분산제, 현탁제, 완충제, 안정제 및 등장제 중 하나 이상이 포함될 수도 있다. 또한, 장용성 코팅을 갖는 것을 포함한 지연 방출 캡슐이 고려된다.

액체 조성물은 용액, 현탁액 또는 기타 유사한 형태이든지 간에 다음 중 하나 이상을 또한 포함할 수 있다: 주사용수, 식염수, 바람직하게는 생리 식염수, 링거액, 등장성 염화나트륨과 같은 멸균 희석제, 용매 또는 현탁 매질로서 작용할 수 있는 합성 모노 또는 디글리세라이드와 같은 고정 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 시클로덱스트린, 프로필렌 글리콜 또는 기타 용매; 벤질알코올 또는 메틸파라벤과 같은 항균제; 아스코르브산 또는 중황산나트륨과 같은 산화방지제; 에틸렌디아민테트라아세트산과 같은 킬레이트제; 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트와 같은 완충제 및 염화나트륨 또는 덱스트로스와 같은 장성 조정용 제제. 비경구 조성물은 앰플, 일회용 주사기 또는 유리, 플라스틱 또는 기타 재료로 만들어진 다중 용량 바이알에 동봉될 수 있다. 생리식염수는 예시적인 보조제이다. 주사가능한 조성물은 바람직하게는 멸균 상태이다.

또 다른 측면에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 하나 이상의 단백질 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. "담체"라는 용어는 본 발명의 드노보 단백질이 투여되는 희석제, 보조제 또는 부형제를 지칭한다. 약제학적 조성물은, 예를 들어, 본 개시내용의 폴리펩타이드 외에도, (a) 동결보호제; (b) 계면활성제; (c) 증량제; (d) 장성 조절제; (e) 안정제; (f) 보존제 및/또는 (g) 완충제를 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 약제학적 조성물 중 완충제는 트리스 완충제, 히스티딘 완충제, 포스페이트 완충제, 시트레이트 완충제 또는 아세테이트 완충제이다. 약제학적 조성물은 또한 동결보호제, 예를 들어, 수크로스, 소르비톨 또는 트레할로스를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 약제학적 조성물은 보존제, 예를 들어, 벤잘코늄 클로라이드, 벤제토늄, 클로로헥시딘, 페놀, m-크레졸, 벤질 알코올, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로로부탄올, o-크레졸, p-크레졸, 클로로크레졸, 질산페닐수은, 티메로살, 벤조산, 및 이들의 다양한 혼합물을 포함한다. 다른 실시양태에서, 약제학적 조성물은 글리신과 같은 증량제를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 약제학적 조성물은 계면활성제, 예를 들어, 폴리소르베이트-20, 폴리소르베이트-40, 폴리소르베이트-60, 폴리소르베이트-65, 폴리소르베이트-80 폴리소르베이트-85, 폴록사머-188, 소르비탄 모노라우레이트, 소르비탄 모노팔미테이트, 소르비탄 모노스테아레이트, 소르비탄 모노올리에이트, 소르비탄 트리라우레이트, 소르비탄 트리스테아레이트, 소르비탄 트리올레아스트, 또는 이들의 조합을 포함한다. 약제학적 조성물은 또한 장성 조절제, 예를 들어 제형을 인간 혈액과 실질적으로 등장성 또는 등삼투성으로 만드는 화합물을 포함할 수 있다. 예시적인 장성 조절제로는 수크로스, 소르비톨, 글리신, 메티오닌, 만니톨, 덱스트로스, 이노시톨, 염화나트륨, 아르기닌 및 아르기닌 염산염을 포함한다. 다른 실시양태에서, 약제학적 조성물은 추가로 안정화제, 예를 들어 관심 단백질과 조합될 때 동결건조 또는 액체 형태의 관심 단백질의 화학적 및/또는 물리적 불안정성을 실질적으로 방지하거나 감소시키는 분자를 포함한다. 예시적인 안정화제는 수크로스, 소르비톨, 글리신, 이노시톨, 염화나트륨, 메티오닌, 아르기닌, 및 아르기닌 염산염을 포함한다.

단백질은 약제학적 조성물에서 유일한 활성제일 수 있거나, 조성물은 의도된 용도에 적합한 하나 이상의 다른 활성제를 추가로 포함할 수 있다.

질병을 치료하기 위해, 단백질은 치료학적 유효량으로 제공된다. 이는 질병의 치료에 유효하거나 원하는 효과를 내는 단백질의 양을 지칭한다. 세포 배양 검정 및 동물 연구에서 수득되는 데이터는 사람에게 사용하기 위한 투여량 범위를 제형화하는 데 사용될 수 있다. 투여량 요법은 최적의 원하는 반응(예를 들어, 치료 또는 예방 반응)을 제공하기 위해 임상의에 의해 조정될 수 있다. 조성물은 1일 1회 이상 내지 1주 1회 이상 중 하나로 투여될 수 있고; 격일에 1회를 포함한다. 숙련된 기술자는 질병 또는 장애의 중증도, 이전 치료, 대상체의 일반적인 건강 및/또는 연령, 및 존재하는 다른 질환을 포함하나, 이에 제한되지 않는 특정 요인이 대상체를 효과적으로 치료하는 데 필요한 투여량 및 시기에 영향을 미칠 수 있음을 인식할 것이다. 더욱이, 치료적 유효량의 폴리펩타이드에 의한 대상체의 치료는 단일 치료를 포함할 수 있거나, 또는 일련의 치료를 포함할 수 있다.

드노보 ACE2 단백질 디코이에 대한 예시적인 투여량 범위는, 예를 들어, 0.1 μg/kg 내지 100 mg/kg 체중; 대안적으로, 0.5 μg/kg 내지 50 mg/kg일 수 있고; 1 μg/kg 내지 25 mg/kg 또는 5 μg/kg 내지 10 mg/kg 체중일 수 있다. 일부 실시양태에서, 특히 국소 투여되는 경우, 권장 용량은 0.1 mcg/kg 미만일 수 있다. 다른 실시양태에서, 권장 용량은 중량/㎡(즉, 체표면적)에 기초할 수 있고/있거나, 고정 용량(예를 들어, 0.05 내지 100 mg)으로 투여될 수 있다. 일부 측면에서, 고정 용량은 1, 3, 10 또는 20 mg 용량일 것이다. 폴리펩타이드는 단일 볼루스로 전달될 수 있거나, 주치의에 의해 결정되는 바와 같이 1회 초과(예를 들어, 2, 3, 4, 5회 또는 그 이상)로 투여될 수 있다.

일부 실시양태에서, 투여는 비내 스프레이를 통해 이루어질 것이고, 투약은 고정 용량일 것이다. 일부 측면에서, 고정 용량은 0.5, 1, 2, 3, 10 또는 20 mg 용량일 것이다. 일부 실시양태에서, 투약은 연속 일수 동안 1일 1회 또는 1일 2회일 것이다.

하기 실시예는 본원에 제공된 본 발명의 특정 실시양태를 설명하기 위해 제공되며 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.

ACE2 단백질 - 서열번호 1

SARS-CoV 코로나바이러스 스파이크 단백질 - 서열번호 2

SARS-CoV-2- 코로나바이러스 스파이크 단백질 - GenBank: QHD43416.1 - 서열번호 3

실시예

실시예 1 - 드노보 ACE2 단백질 디코이 CTC-445 및 이의 변이체의 설계.

CTC-445의 계산 설계 ACE2 모방체의 계산 설계는 4 단계로 이루어졌다: 모방할 ACE2로부터 구조적 모티프의 선택, 이러한 구조적 모티프를 지지하기 위한 폴리펩타이드 백본의 설계, 생성된 백본을 지지하기 위한 서열의 설계, 및 실험적으로 테스트할 설계 세트를 줄이기 위한 설계 필터링.

모방할 ACE2 구조적 모티프의 선택 구조적 모티프를 수득했고 다음 구조 중 하나 이상을 사용하여 계산 설계 및 분석을 수행했다: 1) 키메라 SARS-CoV + SARS-CoV-2 RBD에 결합된 ACE2의 결정 구조(PDB ID: 6vw1); 2) SARS-CoV-2 RBD에 결합된 ACE2의 초저온-EM 구조(PDB ID: 6m17); 또는 3) SARS-CoV RBD에 결합된 ACE2의 초저온-EM 구조(PDB ID: 6cs2). ACE2에서 2개의 RBD 결합 나선이 식별되었고, 구조에서 추출되었다; 하나("H1")는 잔기 19-53에 걸쳐 있고; 및 다른 하나("H2")는 잔기 55-84에 걸쳐 있다. 일부 디자인에서, 잔기 346-360에 걸쳐 있는 베타-헤어핀 모티프도 모방할 모티프 세트에 포함되었다. 이러한 구조적 모티프는 백본 설계의 출발점으로 사용되었다. 이들 모티프에서 최종 서열 설계에 보존될 잔기 세트가 선택되었다: 19, 23, 24, 27, 28, 30, 31, 34, 35, 37, 38, 41, 42, 45, 61, 64, 68, 72, 75, 76, 79, 82, 83, 352, 353, 354, 355 및 357. 이러한 구조적 모티프만으로는 ACE2의 다른 2차 구조 요소에 의해 충분히 지지되지 않으므로, 드노보 2차 구조가 결합 모티프에 대하여 배치되었다. 이러한 새로운 2차 구조는 설계된 단백질에 소수성 코어를 제공하고 결합에 적격인 방식으로 결합 모티프의 상대적 위치 및 배향을 안정시키는 역할을 한다. 지지 구조는 사용가능한 방법(예를 들어, Rosetta 조합 단편 조립, 매개변수 생성 등)에 의해 계산적으로 생성 및 배치되거나, 기존 구조에서 추출 및 카피되었다. 지지하는 2차 구조가 기존 구조로부터 매개변수적으로 생성되거나 추출될 때, 나선의 초기 위치 및 배향은 육안 검사(pymol 사용)에 의해 결정되고 최적의 위치를 식별하기 위해 몬테카를로 검색에 의해 개량되었다.

이상적인 단편 데이터베이스 구축 드노보 모방체를 위한 백본의 설계에 사용된 매우 이상적인 단편의 데이터베이스는 7-mer 데이터베이스용 7062 PDB로 구성된 RCSB 단백질 데이터 뱅크로부터 비중복(공개적으로 이용가능한) 단백질 구조의 광범위한 데이터베이스를 사용하여 로제타 애플리케이션 "kcenters_clustering_of_fragments"로 구축했다.

ACE2 RBD 결합 모티프를 지지하는 백본의 계산 설계

결과적으로 생성된 불연속 구조적 모티프를 이전에 설명된 PyRosetta 기반의 모방체 프로토콜에 대한 입력값으로서 사용했다(Silva et al., De novo design of potent and selective mimics of IL-2 and IL-15, Nature 2019, 565:186). 먼저, 코어 요소(즉, 시작 모티프 및 지지성 2차 구조)는 나선들이 곡률을 가질 가능성을 갖도록 세 번째 잔기마다 허용되는 파이와 싸이 각도의 "피치"를 허용하는, 가능한 한 가깝게 목표 나선 각각에 재현되는 2차 구조를 초래하는 반복적인 파이 및 싸이 각도(오메가는 180°로 고정됨)의 매개변수 방정식을 식별하여 재구축하였다. 이러한 매개변수 방정식을 사용하면 알고리즘은 각 코어 요소의 길이를 최대 +/- 12개 아미노산까지 변경할 수 있다(입력 구조 모티프와 비교하여). 그런 다음 코어 요소의 모든 길이 변이를 매우 이상적인 루프의 클러스터링된 데이터베이스의 루프와 쌍으로 다시 연결했다(7개 아미노산의 단편 크기; 상기 "이상적인 단편 데이터베이스 구축" 참조). 2차 구조 요소의 쌍을 연결하기 위해 모방체 빌딩 프로토콜은 이상적인 요소를 가능한 모든 조합의 쌍으로 재연결하는 것을 목표로 한다. 2차 구조 요소의 각 쌍에 대해 루프 데이터베이스를 필터링하여 2차 구조 요소의 쌍을 연결할 수 있는 루프를 식별했다. 루프의 말단은 핵심 요소의 말단에 중첩되었고 코어 요소 말단으로부터 <1.2A RMSD이어야 했고, 각 개별 루프 말단은 해당 개별 코어 요소 말단으로부터 <1.5A RMSD이어야 했다. 이제 루프로 결합된 코어 요소는 카르테시안-제약된 백본 최소화에 의해 최소화되었다. 최소화 후, 용액은 매우 이상적인 단편(즉, 2개의 연결된 요소를 구성하는 모든 중첩 단편이 또한 데이터베이스 내에 함유되어 있음)을 함유하고, 표적(컨텍스트) 결합 파트너와 충돌하는 백본이 없는 것으로 검증된다. 그런 다음 각 위치에 가장 가능성 있는 아미노산을 결정하기 위해 동일한 단편 데이터베이스를 사용하여 성공적인 쌍으로 연결된 코어 요소를 프로파일링했다(이 정보는 각 설계에 대한 메타데이터로 암호화되었다). 다음으로, 연결된 2차 구조 쌍에 대한 용액을 조합적으로 조합하여(그래프 이론을 사용하여 성분을 연결시킴) 완전히 연결된 백본을 생성했다. 용액의 수가 각 요소 쌍과 함께 기하급수적으로 증가하기 때문에, 각 단편 조합 단계에서 본 발명자들은 2차 구조 코어 요소 쌍 간에 더 짧은 상호연결을 갖는 것(즉, 더 짧은 루프를 사용하여 효과적으로)이 유리하도록 설계 순위를 매겨 최상위 용액만을 유지했다. 완전히 연결된 백본 용액은 가능한 아미노산의 정체를 층-적합성인 것으로 제한하기 위해 층별(계면, 코어, 비코어 표면, 표면)로 프로파일링했다. 마지막으로, 핫스팟, 양립가능한 내장 단편 아미노산 및 층에 대한 모든 정보를 조합했다.

계산 서열 설계 유연한 백본 설계 및 필터링을 위해 완전히 프로파일링된 단백질 백본을 RosettaScript로 전달했다. 서열 설계에 사용된 Rosetta 에너지 함수는 "베타"였다. 서열 설계는 백본 설계 중에 식별된 층 프로파일을 사용하여 수행하여, 각 루프 위치에 가장 빈번한 60% 누적 분율의 아미노산만을 허용했다. 각 백본에 대해 적어도 9개의 서열이 설계되었다. ACE2 단백질 디코이인 CTC-445는 정방향으로 전진하도록 선택되었다.

CTC-445:

효모 디스플레이 스크리닝 EB100 효모는 선형화된 pETcon3 벡터와 함께 표시될 단백질을 암호화하는 유전자로 형질전환시켰다. 벡터는 NdeI 및 XhoI(New England Biolabs)에 의한 100배 과분해에 의해 선형화한 다음, 겔 추출(Qiagen)에 의해 정제했다. 유전자는 상동성 재조합이 벡터 상의 Myc 태그와 AGA2 유전자 사이에 프레임에 맞게 유전자를 배치하도록 5' 및 3' 양 말단에서 벡터와 중첩되는 60개 염기를 포함했다. 효모는 이전에 기술된 바와 같이 SGCAA 배지에서 유도하기 전에, SDCAA 배지에서 포화 상태까지 밤새 성장시켰다(Boder and Wittrup, "Yeast Surface Display for Screening Combinatorial Polypeptide Libraries." Nature Biotechnology 1997 15(6): 553-557). 12 내지 16시간 동안 유도한 후, 세포를 차가운 디스플레이 완충액(50 mM NaPO4 pH 7.4, 150mM NaCl, 1% BSA)에서 세척하고 200 nM의 2019-nCoV 스파이크/RBD 단백질-Fc 태그 수용체(Sino Biological; 잔기 Arg319-Phe541)와 4℃에서 교반하면서 항온처리했다. 약 30분 후, 세포를 차가운 완충액에서 다시 세척한 다음, FITC-접합된 항-Myc 항체(3 x 10⁶ 세포당 1μl) 및 PE 항 인간 IgG Fc(3 x 10⁶ 세포당 5μl)와 함께 얼음 위에서 5분 동안 인큐베이션했다. 그런 다음, 효모를 세척하고 유세포 분석법(guava easyCyte™ HT 시스템)으로 계수하거나 형광 활성화 세포 분류법(FACS)(Sony SH800)으로 분류했다.

변이체 설계 CTC-613-636에 대해, CTC-445 돌연변이 및 돌연변이 조합의 세트를 인간 ACE2에 대한 설계 모델 및 구조적 정렬의 육안 조사를 기반으로 하여 선택했다. CTC-637 내지 CTC-653에 대해, 200pM에서 SARS-CoV-2에 결합하는 CTC-445를 기반으로 하는 프로테아제-안정한 서열은 오류가 발생하기 쉬운 PCR DNA 라이브러리의 효모 디스플레이에 의해 식별되었다. 선택된 서열의 풀로부터 돌연변이 세트가 식별되었고 돌연변이는 CTC-445 변이체 세트로 합리적으로 조합되었다.

재조합 단백질 발현 단백질 서열을 합성하고(IDT), pET-29b(+) E. 콜라이 플라스미드 발현 벡터(C-말단 6-His 태그가 있거나 없는) 내로 클로닝했다. 단백질 정량화를 돕기 위해 각 작제물의 발현 서열에 C-말단 GSGWGSG 서열을 함유시켰다. ACE2 단백질 디코이의 2개 클론, 하나의 비발현성 음성 대조군 및 양성 대조군 단백질의 유전자를 함유하는 플라스미드를 화학적으로 적격인 E. 콜라이 Lemo21 세포(NEB)에 형질전환시켰다. 그런 다음 37℃에서 1mM의 이소프로필 β-d-티오갈락토피라노사이드(IPTG)로 단백질 발현을 유도했다. 4시간 발현 후, 샘플을 수집하고 PageRuler Plus Prestained Protein Ladder와 함께 SDS-PAGE 겔에서 진행시켰다. CTC-445는 예상 분자량만큼 진행되었다. (데이터는 표시되지 않음)

변이체에 대한 아미노산 서열은 언급된 치환(들)을 제외하고 CTC-445의 아미노산 서열과 동일하다. 시스테인 잔기가 있는 선택 변이체를 PEG화했다. 간단히 말해서, 단백질을 이미다졸 완충액에서 정제하고 완충액을 Centripep(10K MWCO)을 이용하여 pH 7.4의 PBS로 교환했다. TCEP를 10x 몰 과량으로 샘플 1mg에 첨가했다. 30분 동안 37℃에서 인큐베이션했다. 말레이미드-PEG(20K 링커 및 40K 분지형)를 PBS에 용해시키고 샘플에 10배 과량으로 첨가하고 12시간 동안 인큐베이션했다. 미반응 말레이미드를 제거하고 SEC를 통해 정제했다.

실시예 2 - SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 대한 CTC-445의 결합 및 경쟁 검정: 효모 디스플레이

EB100 효모는 실시예 1에 기술된 바와 같이 형질전환 및 유도했다. 12 내지 16시간 동안 유도 후, 인간 ACE2("데이터 1") 또는 네오류킨 CTC-445("데이터 2")를 발현하는 세포를 차가운 디스플레이 완충액(50mM NaPO4 pH 7.4, 150mM NaCl, 1% BSA)에서 세척하고, 0 내지 80nM의 2019-nCoV 스파이크/RBD 단백질 - mFc 태그 수용체(Sino Biological; 잔기 Arg319-Phe541)와 4℃에서 교반하면서 인큐베이션했다. 약 30분 후, 세포를 차가운 완충액에서 다시 세척한 다음, FITC-접합된 항-Myc 항체(3 x 10⁶ 세포당 1 μl) 및 PE 항 마우스 IgG Fc(3 x 10⁶ 세포당 5μl)와 함께 얼음 위에서 5분 동안 인큐베이션했다. 그런 다음, 효모를 세척하고, 유세포 분석법(guava easyCyte™ HT 시스템)으로 계수했다. 다음으로, 인간 ACE2 및 테스트 ACE2 단백질 디코이("데이터 5")을 발현하는 세포를 9nM 2019-nCoV 스파이크/RBD 단백질-Fc 태그 수용체 및 0 내지 750nM 가용성 인간 ACE2와 함께 인큐베이션했다. 도 2a-f는 효모 디스플레이를 통해 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 대한 양성, 음성 대조군 및 CTC-445의 결합을 보여주고, 도 3a-d는 대조군 인간 ACE2 및 드노보 단백질 CTC-445가 2019-nCoV 스파이크/RBD 단백질에 결합할 수 있고 가용성 ACE2와 결합하기 위해 경쟁할 수 있음을 보여준다.

실시예 3 - 드노보 ACE2 단백질 디코이의 특성화

CTC-445 변이체는 발현 수준(0-5), 용해도(0-5) 및 생물층 간섭계를 통한 결합 친화도(0-5)에 대해 특성화했다. 응집 성향은 크기 배제 크로마토그래피 동안 고분자량 응집체 또는 올리고머가 존재하는지 여부를 나타내며, 비단량체 단백질의 분율은 분석용 크기 배제 크로마토그래피에 의해 단량체 및 올리고머 종의 피크 면적을 비교하여 측정한다.

다중각도 광산란을 이용한 크기 배제 크로마토그래피(SEC-MALS). SEC-MALS 검정은 인라인 정적 광산란 기기(MiniDawn, Wyatt Technology) 및 시차 굴절계(Optilab rEX, Wyatt Technology) 및 UV 검출 시스템에 커플링된 Superdex 75 10/300 크기 배제 컬럼(GE Healthcare)이 있는 1260 infinity II LC HPLC 시스템(Agilent Technologies)을 사용하여 수행했다. 단백질 샘플은 2 내지 4 mg/mL 범위의 농도로 PBS 완충액에 제조하고 0.22 μm 주사기 필터로 여과했다; 100μL의 샘플을 주입하고 0.5 mL/분의 유속으로 진행시켰다. 데이터는 소프트웨어 ASTRA 7(Wyatt Technologies)을 사용하여 분석했다. SEC-MALS는 CTC-445 변이체, CTC-632, 633, 634, 642, 643 및 644가 대부분 응집되거나 또는 올리고머이고, CTC-635, 636, 637, 639, 640, 641, 643, 644, 646, 648, 649, 650, 651, 652, 및 653이 대부분 단량체였음을 입증했다(데이터는 표시되지 않음). 데이터는 아래 표에 제시된다.

생물층 간섭계. 정제된 ACE2 단백질 디코이의 옥텟(Octet) 결합 검정. 결합 데이터는 Octet RED96(ForteBio)에서 수집하고 1:1 결합 모델을 사용하는 기기의 통합 소프트웨어를 사용하여 프로세싱했다. SARS-CoV-2 스파이크 단백질(RBD 도메인만, mFc 태그, Sino Biological)은 결합 완충액(10mM HEPES, pH 7.4, 150mM NaCl, 3mM EDTA, 0.05% 계면활성제 P20, 0.5% 무지방 분유)에 2 μg ml^-1으로 단백질 A 센서(ProtA, ForteBio)에 고정시켰다. 결합 완충액 단독에서 기준선 측정 후, 결합 동역학은 정의된 농도의 설계된 단백질(2.4-200 nM)을 함유하는 웰에 바이오센서를 침지시키고(결합), 그 다음 센서를 기준선 웰에 다시 침지시켜(해리) 모니터링했다. 이하 표 5에서 1의 값은 CTC-445와 유사한 결합을 나타내며; 1보다 큰 값은 CTC-445보다 더 단단한 결합을 나타내고; 1 미만의 값은 CTC-445보다 약한 결합을 나타내며; 4 이상의 값은 매우 단단한 결합을 나타낸다. N.D.의 표기는 결합 스크린에서의 테스트를 나타내지만 검정은 의도한 대로 작동하지 않았고, 결정적이지 않은 결과로 이어졌다. 단백질은 응집되었을 수 있는 것으로 여겨진다. 도 4, 5a-h, 6a-h 및 7a-h는 옥텟에 의한 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 대한 CTC-445 및 선택된 CTC-445 변이체의 결합을 보여준다.

실시예 4 - 드노보 단백질 디코이 CTC-445, CTC-445.2 및 CTC-445.2d의 결합 동역학 및 안정성

CTC-445 및 선택된 변이체의 열 안정성은 원형 이색성을 사용하여 측정했다. 원자외선 원형 이색성 측정은 단백질 농도 0.2 mg ml^-1로 0.1mm 경로-길이 큐벳 중 PBS 완충액(pH 7.4)에서 CHIRASCAN 분광계 V100(Applied Photophysics)으로 수행했다(텍스트에서 달리 언급하지 않는 한). 20 내지 95℃에서 온도 용융물을 수득했고, 222nm에서 흡수 신호를 모니터링했다(분당 0.5℃의 단계, 단계별 평형 30초). 파장 스캔(195-250 nm)은 20℃, 95℃, 및 재폴딩(대략 5분) 후 다시 20℃에서 수집했다. 용융 온도(T_m) 값은 열 용융물을 다음 방정식에 피팅시켜 계산했다:

여기서, f_D는 언폴딩(unfolding) 상태의 단백질 중 분율이고, △H_vH는 펼쳐지는 과정과 연관된 엔탈피 변화이고, yN 및 mN은 천연 상태의 신호 및 온도에 대한 이의 의존성을 나타내며, yD 및 mD는 펼쳐진 상태의 신호 및 온도에 대한 이의 의존성을 나타내며 R은 기체 상수이다. C-말단 트롬빈 부위 및 6x His 태그에 융합된 CTC-445, CTC-445.2 또는 CTC-445.2d의 열 유도 용융에 이어, 20℃ 내지 95℃의 온도 범위에 걸쳐(가열 속도 2℃/분) 208nm에서 이의 원형 이색성 신호를 검출했다. 도 8은 CTC-445(8a), CTC-445.2(8b) 및 CTC-445.2d(8c)에 대한 결과를 보여준다. 삽입도는 20℃에서, 95 내지 99℃로 가열 후(대시선), 및 가열된 샘플을 20℃로 냉각 후, CTC-445.2의 원자외선 파장 스펙트럼을 보여준다. 냉각 시 완전한 타원 스펙트럼 회복(완전 가역성)이 관찰되었다.

연속 열 경사식 단백질 안정성. CTC-445, CTC-445.2, CTC-445.2d 및 hACE2(Sino Biological)의 언폴딩 가역성(열 회복)을 테스트하기 위해 연속 열 경사식 검정을 수행했다; 이를 위해 UNCLE 플랫폼(Unchained Labs)을 사용했다. 0.5 mg/mL의 CTC-445, CTC-445.2 및 CTC-445.2d를 8.8 μL로 모세관 큐벳에 로딩하고 온도를 반복적으로 증가 및 감소시키면서 각 샘플에 대해 형광 스펙트럼(약 300-400 nm)을 측정했다. 온도 경사는 다음 순서로 수행했다: 20℃에서 35℃, 20℃에서 50℃, 20℃에서 65℃, 20℃에서 80℃, 20℃에서 95℃, 20℃에서 80℃, 20℃에서 65℃, 20℃에서 50℃ 및 20℃에서 35℃. 모든 샘플은 PBS 완충액 pH 7.4에 제조했다. UNCLE 분석 프로그램(Unchained Labs)을 사용하여 각 형광 스펙트럼에 대해 무게 중심 평균(BCM)을 계산했다. 3개의 단백질에 대해 가열 및 냉각의 반복 주기 전후에 동일한 BCM 값이 관찰되었다(도 9a-c).

고정된 SARS-CoV-2 S RBD에 대한 CTC-445, CTC-445.2(좌측) 및 CTC-445.2d(우측)의 옥텟 결합 검정은 도 10에 도시된다. 비오틴화되고 His-태그화된 SARS-CoV-2 S RBD를 Anti-Penta-HIS(HIS1K, ForteBio)에 고정시키고 다양한 농도의 ACE2 디코이와 함께 인큐베이션했다. 정해진 농도(4.7 내지 300 nM)의 CTC-445, CTC-445.2, CTC-445.2d를 함유하는 웰에 바이오센서를 침지한 다음(결합), 기준선 웰에 다시 센서를 침지(해리)하여 결합 동역학을 모니터링했다. CTC-445 및 CTC-445.2의 경우, 결과는 1:1 결합 모델을 통해 전반적으로 피팅되었다(K_d=646 및 25nM, k_on=8.6 x10⁴ 및 4.5 x 10⁵M^-1s^-1, k_off=5.5 x 10^-2 및 1.1 x 10^-2 s^-1). CTC-445.2d의 경우, 결과는 2:1 결합 모델을 통해 전반적으로 피팅되었다(K_d ≤ 7.0 nM, k_on =3.0 x 10⁵ M^-1s^-1, k_off=≤2.0 x 10^-3 s^-1). 삽입도는 각 농도에서 정규화된 반응의 정상 상태 결합을 보여준다.

실시예 5 - CTC-445는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 RBD가 인간 ACE2에 결합하는 것을 저해한다.

SARS-CoV2 S 단백질 RBD는 평평하고 투명한 바닥의 고결합 폴리스티렌 96-웰 플레이트(Thermo, Cat#15041)에 0.5 μg/mL(100 μL/웰)로 4℃에서 밤새 코팅했다. 다음 날, 검정 플레이트를 0.05% Tween-PBS로 3회 세척하고 37℃에서 1 내지 1.5시간 동안 2% BSA/0.05% Tween-PBS로 차단시켰다. 차단 인큐베이션 동안, CTC-445의 경우 20 μM(최종 2X)에서 시작하고, 그리고 양성 대조군 저해제(Acro)의 경우 360nM(최종 2X)에서 시작하여 각 테스트 물품의 3배 7점 연속 희석액을 제조했다. 모든 테스트 물품에 대해, 마지막 농도에 대해서는 3배보다는 10배 희석액을 제조했다. 또한, 비오틴-hACE2의 용량 반응은 0.3 μg/mL(3.44nM)로 시작하는 비오틴-hACE2의 2배 연속 희석을 수행하여 제조했다. 0.3 μg/mL 비오틴-hACE2로부터 0.06 μg/mL의 일정한 농도(최종 2X)는 테스트 물품에 의한 저해에 대해 사용하기 위해 제조했다. 차단 후, 검정 플레이트를 세척하고(3X), 각 테스트 물품 희석액을 플레이트에 50 μL/웰로 첨가한 다음, 50 μL/웰의 비오틴-hACE2(0.03μg/mL 최종)를 첨가했다. 비오틴-hACE2와 함께 테스트 물품의 인큐베이션은 37℃에서 1시간 동안 수행했다. 그 후, 플레이트를 세척(3X)한 다음, 0.1 μg/mL(100 μL/웰) 스트렙타비딘-HRP를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션했다. 플레이트는 100 μL/웰 TMB(abCam, Cat#171524)를 첨가하기 전에 마지막으로 세척했다(3X). TMB는 7분 동안 인큐베이션하고 50 μL/웰 1M HCl을 첨가하여 반응을 중단시켰다. 각 웰의 평균 흡광도는 450 nm로 4개 지점에서 측정했다. IC₅₀ 결과는 이하 표 6에 제시된다.

실시예 6 - 선택된 CTC-445 변이체는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 RBD가 인간 ACE2에 결합하는 것을 저해한다

SARS-CoV2 S 단백질 RBD는 평평한 투명 바닥의 고결합성 폴리스티렌 96-웰 플레이트(Thermo, Cat#15041)에 0.5 ug/mL(100 ul/웰)로 4℃에서 밤새 코팅했다. 다음 날, 검정 플레이트를 0.05% Tween-PBS로 3회 세척하고 37℃에서 1-1.5시간 동안 2% BSA/0.05% Tween-PBS로 차단했다. 하기 표 7에 나타낸 CTC-445 변이체에 대해 4uM(최종 2X)에서 시작하고, 양성 대조군 저해제(Acro)의 경우 360nM(최종 2X)에서 시작하여 각 테스트 물품의 3배 6-점 연속 희석액을 제조했다. 모든 테스트 물품에 대해, 마지막 2개의 농도는 3배가 아닌 10배 희석액을 제조했다. 또한, 비오틴-hACE2의 용량 반응은 0.1 μg/mL(1.15nM)에서 시작하는 비오틴-hACE2의 3배 연속 희석을 수행하여 준비했다. 0.1μg/mL 비오틴-hACE2로부터 0.066μg/mL의 일정 농도(최종 2X)를 준비하여 테스트 물품에 의한 저해에 사용했다. 차단 후, 검정 플레이트를 세척하고(3X), 각 테스트 물품 희석액을 플레이트에 30 ul/웰(이반복 웰)로 첨가한 다음, 30 ul/웰의 비오틴-hACE2(0.033 μg/mL 최종)를 첨가했다. 비오틴-hACE2와 테스트 물품의 인큐베이션은 37℃에서 1시간 동안 수행했다. 그 후, 플레이트를 세척하고(3X), 이어서 0.1 μg/mL(100 ul/웰) 스트렙타비딘-HRP를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션했다. 플레이트는 100 ul/웰 TMB(abCam, Cat#171524)를 첨가하기 전에 마지막으로 세척했다(3X). TMB를 7분 동안 인큐베이션하고, 50 ul/웰 1M HCl 또는 등가물을 첨가하여 반응을 중단시켰다. 각 웰의 평균 흡광도는 450nm에서 4개 지점에서 측정했다. IC₅₀ 결과는 이하 표 7에 제시된다:

실시예 7 - 선택된 PEG화 및 비PEG화 CTC-445 변이체는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 RBD가 인간 ACE2에 결합하는 것을 저해한다.

SARS-CoV2 S 단백질 RBD를 평평하고 투명한 바닥의 고결합성 폴리스티렌 96-웰 플레이트(Thermo, Cat#15041)에 0.5 μg/mL(100 ul/웰)로 4℃에서 밤새 코팅했다. 다음 날, 검정 플레이트를 0.05% Tween-PBS로 3회 세척하고 37℃에서 1-1.5시간 동안 2% BSA/0.05% Tween-PBS로 차단했다. 각 테스트 물품의 4배 6점 연속 희석액은 이하 표 8에 나타낸 선택된 CTC 변이체에 대해 4uM(최종 2X)에서 시작하고 양성 대조군 저해제(Acro)에 대해 360nM(최종 2X)에서 시작하는 것으로 준비했다. 모든 테스트 물품에 대해, 마지막 2가지 농도에 대해서는 3배가 아닌 10배 희석액을 제조했다. 또한, 비오틴-hACE2의 용량 반응은 0.1 μg/mL(1.15 nM)에서 시작하는 비오틴-hACE2의 3배 연속 희석을 수행하여 준비했다. 0.1μg/mL 비오틴-hACE2로부터 0.066μg/mL의 일정한 농도(최종 2X)를 준비하여 테스트 물품에 의한 저해에 사용했다. 차단 후, 검정 플레이트를 세척하고(3X), 각 테스트 물품 희석액을 플레이트에 30 ul/웰(이반복 웰)로 첨가한 다음, 30 ul/웰의 비오틴-hACE2(0.033 μg/mL 최종)를 첨가했다. 비오틴-hACE2와 테스트 물품의 인큐베이션은 37℃에서 1시간 동안 수행했다. 그 후, 플레이트를 세척하고(3X), 이어서 0.1 μg/mL(100 ul/웰) 스트렙타비딘-HRP를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션했다. 플레이트는 100 ul/웰 TMB(abCam, Cat#171524)를 첨가하기 전에 마지막으로 세척했다(3X). TMB를 7분 동안 인큐베이션하고, 50 ul/웰 1M HCl 또는 등가물을 첨가하여 반응을 중단시켰다. 각 웰의 평균 흡광도는 450nm로 4개 지점에서 측정했다. (주: 실험 수행 후 CTC654 및 CTC655에 대한 시작 농도는 수정됨; 시작 농도 2 uM 대신 >6uM). IC₅₀ 결과는 이하 표 8에 제시된다:

실시예 8 - 선택된 CTC-445 변이체는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 RBD(및 SARS-CoV-1 스파이크 단백질 RBD)가 인간 ACE2에 결합하는 것을 저해한다.

SARS-CoV2 S 단백질 수용체-결합 도메인(RBD)(Acro Biosystems, Cat#EP-105) 또는 SARS-CoV-1 S 단백질 RBD(Acro Biosystems, Cat#SPD-S52H6)를 0.5μg/mL(100ul/웰)으로 평평하고 투명한 바닥의 고결합성 폴리스티렌 96웰 플레이트(ThermoFisher, Cat#15041)에 4℃에서 밤새 코팅했다. 다음 날, 각 검정 플레이트를 0.05% Tween-PBS로 3회 세척하고, 37℃에서 1-1.5시간 동안 2% BSA/0.05% Tween-PBS로 차단했다. 다음 날, 각 테스트 물품의 12점 연속 희석액을 최종 농도보다 2배 높은 농도로 제조했다. 테스트 물품에 대해 4μM에서 시작하여 3배 연속 희석을 수행했다. 인간 ACE2(SinoBiological, Cat#10108-H08B)에 대해서는 0.8μM에서 시작하여 3배 연속 희석을 수행했다. 또한, 비오틴-hACE2의 용량 반응은 0.174μg/mL(2nM)에서 시작하여 2배 연속 희석을 수행하여 준비했다. 0.174 μg/mL 비오틴-hACE2로부터 0.07 μg/mL의 일정 농도(0.8 nM, 최종 2X)를 준비하여 테스트 물품에 의한 저해에 사용했다. 차단 후, 각 검정 플레이트를 세척하고(3X) 각 테스트 물품 희석액을 50μL/웰(농도당 단일 반복 웰)로 플레이트에 첨가한 다음, 50μL/웰의 비오틴-hACE2(0.035μg/mL 최종)를 첨가했다. 0.4 nM 비오틴-hACE2와 함께 테스트 물품의 인큐베이션을 37℃에서 1시간 동안 수행했다. 그 후, 각 검정 플레이트를 세척(3X)한 다음, 0.1μg/mL(100μL/웰) 스트렙타비딘-HRP를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션했다. 마지막으로, 100 μL/웰 TMB(abCam, Cat#171524)를 첨가하기 전에 각 플레이트를 세척(3X)했다. TMB는 7-8분 동안 인큐베이션하고 50 μL/웰 TMB 정지 용액(abCam, Cat# ab171529)을 첨가하여 반응을 중단시켰다. 각 웰의 평균 흡광도는 450nm로 4개 지점에서 측정했다.

표 9에 제시된 바와 같이, 테스트된 모든 작제물은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질이 인간 ACE2에 결합하는 것을 저해했다. CTC654는 또한 SARS-CoV-1 스파이크 단백질이 인간 ACE2에 결합하는 것을 저해했다.

실시예 9 - CTC-445 변이체는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 RBD가 인간 ACE2에 결합하는 것을 저해한다.

추가 CTC-445 변이체를 실질적으로 상기 기술된 바와 같은, 인간 ACE2에 대한 SARS-Cov-2 스파이크 단백질의 결합 저해에 대해 검정했다. 표 10A에 제시된 바와 같이, 테스트된 작제물은 SARS-Cov-2 스파이크 단백질이 인간 ACE2에 결합하는 것을 30 nM 미만, 대부분의 경우 15 nM 미만의 IC₅₀으로 저해했다. 또한, CTC-708에 대한 도 19c도 참조한다.

SARS-Cov-2 스파이크 단백질이 인간 ACE2에 결합하는 것을 저해하는 것에 대해 추가 단백질 디코이를 다음과 같이 검정했다:

SARS-CoV-2 S 단백질(D614G), His Tag, Super stable(Acro Biosystems, Cat#SPD-C52H3)을 평평한 흰색 바닥의 고결합성 폴리스티렌 96웰 플레이트(LumiNunc MaxiSorp Thermo Scientific, Cat# 437796)에 0.5μg/mL(50ul/웰)로 4℃에서 밤새 코팅했다. 다음 날, 각 검정 플레이트를 0.05% Tween-PBS로 4회 세척하고 600rpm으로 설정된 진탕기에서 21℃에서 1-1.5시간 동안 2% BSA/0.05%Tween-PBS로 차단했다. 각 테스트 물품의 12점 연속 희석액을 최종 농도보다 2배 높은 농도로 제조했다. 테스트 물품의 경우 220nM에서 시작하여 0.107nM로 끝나는 2배 연속 희석을 수행했다. 또한, 비오틴-hACE2의 용량 반응은 600ng/mL(68.81nM, 최종 2X)에서 시작하여 0.585ng/ml(6.71pM)으로 끝나는 2배 연속 희석을 수행하여 준비했다. 600ng/mL 비오틴-hACE2로부터 80ng/mL(0.92nM, 최종 2X)의 일정 농도를 제조하여 각 테스트 물품 희석액에 의한 저해에 사용했다. 각 테스트 물품 희석액을 U-바닥 폴리스티렌 플레이트에 90μL/웰로 첨가한 다음 90μL/웰의 비오틴-hACE2(최종 0.46nM)를 첨가하고 잘 혼합했다. 비오틴-hACE2 용량 반응을 동일한 부피의 검정 완충액과 혼합했다. 차단 후, 각 검정 플레이트를 세척하고(4X) 테스트 물품 희석액을 50 μL/웰씩 이반복 웰로 플레이트에 첨가했다. 0.46 nM 비오틴-hACE2와 함께 테스트 물품의 인큐베이션을 600rpm으로 설정된 진탕기에서 21℃에서 1시간 동안 수행했다. 그 후, 각 검정 플레이트를 세척하고(4X), 스톡으로부터 1:1000 희석으로 준비된 스트렙타비딘-HRP(R&D Systems, DY998)를 21℃에서 1시간 동안 인큐베이션했다. 마지막으로, 동일한 부피의 루미놀 및 과산화물 용액(EMD Millipore, Cat# ELLUF0100)과 미리 혼합된 70 μL/웰 LuminataForte ELISA HRP 화학발광 기질을 첨가하기 전에 각 플레이트를 세척(4X)했다. 기질을 600rpm으로 설정된 진탕기에서 20-30분 동안 인큐베이션했다. 각 웰의 평균 발광성은 Tecan Infinite M1000 마이크로플레이트 판독기에서 4개 지점으로부터 450nm에서 측정했다. GraphPad Prism 소프트웨어에서 1/Y² 가중치를 갖는 4개 매개변수 로지스틱(4PL) 회귀 모델을 사용하여 각 테스트 물품의 1/2 최대 저해 농도(IC₅₀)를 결정했다.

단백질 디코이를 발현시키고 정제하여 본원에 기재된 바와 같이 옥텟을 통해 결합에 대해 테스트했다. 결과는 표 10C에 제시된다:

CTC-726의 연속 이반복 버전을 포함하는 2가 ACE-2 단백질 디코이에서 ACE2 단백질 디코이 단위 사이의 최적 아미노산 링커 길이를 결정하기 위해, 10개 아미노산, 20개 아미노산, 30개 아미노산, 50개 아미노산 및 60개 아미노산 GS 링커를 사용하여 2개의 디코이 단위를 연결했다. IC50은 상기에 제공된 바와 같이 결정했다. 단백질 디코이를 발현 및 정제하고 본원에 기재된 바와 같은 옥텟을 통해 결합에 대해 테스트했고, 약 1 nM의 추정된 Kd를 갖는 것으로 결정되었다.

실시예 10 - CTC-445 변이체의 효능 대 분자량.

SARS-CoV-2 S/RBD에 대한 결합에 대해 CTC-445 변이체의 IC50 값은 0.033 nM 비오틴화된 가용성 hACE2의 존재 하에 ELISA로 측정했다. RBD에 결합된 hACE2는 스트렙타비딘-HRP로 처리하고 450 nm에서 흡광도를 측정하여 정량했다. SARS-CoV2 S 단백질 RBD(Acro, Cat#EP-105)를 0.5μg/mL(100μL/웰)로 평평한 투명 바닥의 고결합성 폴리스티렌 96웰 플레이트(Thermo, Cat#15041)에 4℃에서 밤새 코팅했다. 다음 날, 각 검정 플레이트를 0.05% Tween-PBS로 3회 세척하고 37℃에서 1-1.5시간 동안 2% BSA/0.05%Tween-PBS로 차단했다. 다음 날, 각 테스트 물품의 11점 4배 연속 희석액을 2μM(최종 2배)에서 시작하여 제조했다. 또한, 비오틴-hACE2의 용량 반응은 0.174μg/mL(2nM)에서 시작하여 2배 연속 희석을 수행하여 준비했다. 0.174 μg/mL 비오틴-hACE2로부터 0.07 μg/mL의 일정 농도(0.8 nM, 최종 2X)를 제조하여 테스트 물품에 의한 저해에 사용했다. 차단 후, 각 검정 플레이트를 세척하고(3X) 각 테스트 물품 희석액을 50μL/웰(농도당 단일 반복물 웰)로 플레이트에 첨가한 다음, 50μL/웰의 비오틴-hACE2(0.035μg/mL 최종)를 첨가했다. 0.4 nM 비오틴-hACE2와 함께 테스트 물품의 인큐베이션은 37℃에서 1시간 동안 수행했다. 그 후, 각 검정 플레이트를 세척(3X)한 다음, 0.1μg/mL(100μL/웰) 스트렙타비딘-HRP를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션했다. 마지막으로, 각 플레이트를 세척(3X)한 후, 100μl/웰 TMB(abCam, Cat#171524)를 첨가했다. TMB를 7-8분 동안 인큐베이션하고 50 μL/웰 TMB 정지 용액(abCam, Cat# ab171529)을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 각 웰의 평균 흡광도는 450 nm로 4개 지점에서 측정했다. 결과는 도 11에 제시된다.

실시예 11 - VSV-luc 슈도바이러스 중화

반딧불이 루시퍼라제 유전자를 갖고 우한(Wuhan)-1 SARS-CoV-2 분리주(GenBank: QHD43416.1)로부터의 스파이크 단백질을 발현하는 비-복제 VSV 슈도바이러스를 사용하여 중화 활성을 결정했다. SARS-CoV-2/VSV-Luc(슈도바이러스 표면에서 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 전체 엑토도메인을 발현함) 또는 VSVg/VSV-Luc(VSVg를 발현함)를 이용하여 중화 검정을 수행했다. 30,000개의 293T-ACE2 세포를 하이그로마이신(100μg/mL)의 존재하에 흰색 플레이트에 전날에 파종했다. 중화 검정 당일, 슈도바이러스를 함유하는 배지 25μL를 다른 플레이트에 있는 테스트 물품의 연속 희석액 25μL와 혼합한 다음, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션했다. 슈도바이러스 및 테스트 물품 희석은 5% 열불활성화된 소 태아 혈청(DMEM5)을 함유하는 DMEM 배지에서 수행했다. 60m 인큐베이션 후, 테스트 물품/슈도바이러스 혼합물을 293T-ACE2 세포에 첨가했다. 감염은 24시간 동안 허용되었다. 반딧불이 루시퍼라제 활성은 Britelite 리포터 유전자 검정(Perkin Elmer)을 사용하여 24시간째에 모니터링했다.

테스트 물품은 연속 3배 희석액을 사용하여 이반복으로 평가했다. 대조군에는 스파이크 단백질이 없는 VSV 슈도바이러스(NoEnv/VSV-Luc), VSVg를 운반하는 슈도바이러스(VSVg/VSV-Luc)로 감염된 세포, 또는 감염되지 않은 세포("모의 감염")가 포함되었다. 슈도바이러스-감염된 세포는 테스트 물품 또는 비히클 단독(DMEM5)과 함께 인큐베이션했다. 일부 웰에는 COVID-19에서 회복된 회복기 환자(COV+)의 혈장 희석액 또는 대조군 혈장(COV-)과 함께 인큐베이션된 슈도바이러스로 챌린지된 세포가 포함되었다. COV+로부터 채혈하기 전에, 이 환자가 RT-PCR을 통해 SARS-CoV-2에 의해 감염된 것을 확인했고, SARS-CoV-2 스파이크(S)에 대한 IgG의 존재에 대해서도 측면 유동 항체 테스트로 평가했다. COV-혈장은 S 항체에 대한 PCR-음성 및 IgG-음성에서 유래되었다.

모의 감염된 세포의 평균 RLU 값을 모든 값("모의 감산 값")에서 뺐다. 비히클 존재하에 감염된 샘플의 평균 RLU 값을 수득했다. 각 데이터 포인트에 대해, 모의 값을 뺀 후, 비히클만의 존재 하에 감염된 세포의 평균 값으로 값을 나눈 다음 100을 곱하여 비히클만이 있는 샘플에 대해 정규화된 감염 백분율 값을 수득했다. 이반복물의 표준 편차와 함께 각 농도에 대한 평균 감염 백분율은 생성된 이반복 값으로부터 수득했다.

GraphPad Prism으로 50% 저해 농도(IC50)를 결정했다. IC50은 테스트 물품의 부재 하에 슈도바이러스로 감염된 세포의 값과 비교하여 상대 발광 단위(RLU)가 50% 감소한 테스트 물품의 농도로서 정의되었다. 세포 생존력 검정(오른쪽)을 나란히 진행했다. 검정은 CTC-445.2 및 CTC-445.2d(도 12a-b) 및 CTC-445.2d 및 CTC-445.3d(도 21a-c)를 사용하여 수행했다. CTC 445.2, CTC-445.2d 및 CTC-445.3d는 SARS-CoV-2를 발현하는 VSV 슈도바이러스를 중화했다. CTC-445.2d 및 CTC-445.3d에 의한 VSVg를 발현하는 HEK293T 세포에서 슈도바이러스 감염의 저해는 관찰되지 않았으며, 이는 HEK293 세포 생존력의 식별가능한 손실 없이, SARS-CoV-2의 RBD에 대한 특이성을 입증했다.

실시예 12 - 드노보 디코이의 약동학

8주령 Balb/c 마우스(Charles River)를 이소플루란으로 마취하고 30μl의 CTC-445.2d를 비강내로 전달했다. 표시된 시점에서 마우스를 안락사시키고 전혈 및 폐를 분리했다. 전혈을 원심분리하고 동결 전에 별도의 튜브에 피펫팅하여 혈장을 세포로부터 분리했다. Precellys 조직 균질화기(Bertin)를 사용하여 조직을 기계적 파괴한 후 프로테아제/포스파타제 저해제 칵테일(ThermoFisher)을 함유하는 T-PER 조직 용해 완충액(ThermoFisher)으로 용해시켜 폐 용해물을 제조했다. 용해물은 원심분리에 의해 클리어링되었고 분석을 위해 동결시켰다. 표준 96웰 MSD(L15XA) 플레이트를 4℃에서 밤새 50μL의 0.5μg/mL 테그없는 SARS-CoV-2 S Protein RBD(Sino, 40592-VNAH)로 사전 코팅하고 밀봉했다. 포획 시약의 희석액은 PBS에서 준비했다. 다음 날, 검정 플레이트를 0.05% Tween-PBS로 세척하고(6X) 실온에서 최소 2시간 동안 150μL/웰 MSD 차단제 A(5% 단백질-PBS 용액)로 차단했다. 모든 인큐베이션 기간 동안 플레이트 진탕을 수행했다. 차단 인큐베이션 동안, 10,000 ng/mL로 미처리 폐 용해물 또는 미처리 혈장에 CTC-445.2d의 4배 연속 희석을 수행하여 표준 곡선을 작성했다. 검정 플레이트에 첨가하기 전에, 각 샘플 및 표준물질은 검정 희석 완충액(0.5% MSD 차단제 A)에 5배(MRD = 5) 희석했다. 또한, 샘플을 별도의 웰에서 10배 희석했다. 차단 후, 검정 플레이트를 세척하고(6X) 각 샘플 또는 표준 희석액 50 μL/웰을 첨가했다. 검정 플레이트를 플레이트 진탕 하에 실온에서 추가로 1시간 동안 인큐베이션한 후 세척했다(6X). 검출을 위해 1-단계 검출 방법을 사용했다. 1-단계 검출을 통해 토끼 항-His mAb(RevMab, 31-1048-00) 및 SULFOTAG 염소 항-토끼 IgG(H+L) pAb(MSD, R32AB)를 각각 1 μg/mL씩 사전 혼합하고, 1시간 후, 50 μL/웰씩 검정 플레이트에 첨가했다. 마지막 세척 후, 150μL/웰의 MSD Gold Read 완충액을 첨가하고 MSD Quickplex SQ120에서 발광을 측정했다. 발광은 표준 곡선에 기초하여 농도로 변환되었다. 도 13은 비강내 투여 후 마우스 폐(상부) 및 혈장(하부) 중 CTC-445.2d의 생체이용률을 보여준다. Meso Scale Discovery 플랫폼을 사용하여 폐 용해물 및 혈장의 단백질 농도를 정량했다. 결과는 24시간 넘게 폐에서 완전히 기능성인 CTC-445.2d의 높은 지속성을 보여준다. 비강내 투여 경로를 사용함에도 불구하고, 혈액에서 CTC-445.2d가 검출되어 비강내 전달이 또한 상기 단백질에 어느 정도의 전신 노출을 가능하게 할 수 있다는 가능성을 높였다.

실시예 13 ACE2 기능 검정.

ACE2 효소 활성의 저해는 ACE2 저해제 스크리닝 키트(Promocell, Heidelberg, Germany)를 사용하여 수행했다. 50 μL의 ACE2 효소 용액을 96웰 흰색 벽이 있는 플레이트(Corning, New York)의 각 웰에 첨가했다. 테스트 샘플은 최고 농도 시, 제공된 검정 완충액에서 20μM로 희석했고, 8점 1 내지 4회의 연속 희석이 이루어졌다. DX600은 ACE2 저해제 양성 대조군으로 사용되었다. 10 μL의 희석된 샘플을 ACE2 효소 용액에 첨가하고 실온에서 15분 동안 인큐베이션했다. 그런 다음, 40 μL의 ACE2 기질 혼합물을 각 웰에 첨가했다. 15분 후, 320 nm 여기 및 420 방출 필터를 사용하여 Infinite M1000 플레이트 판독기(Tecan Mannedorf, 스위스)에서 형광을 측정했다. 형광 값은 음성 대조군을 사용하여 정규화되었다. 도 14는 Mca-APK(DNP) 기질로부터 유리 형광단의 효소적 방출에 의해 측정된 ACE2 기능적 활성을 보여준다. ACE2 저해는 양성 대조군으로서 DX600 펩타이드를 사용하여 밝혀졌다. 이 검정은 드노보 설계된 단백질이 ACE2의 기능적 활성에 유의미한 영향을 미치지 않음을 나타낸다.

실시예 14 SARS-1 결합.

SARS-CoV-1 RBD에 대한 CTC-445.2 및 CTC-445.2d의 결합 동역학은 본원에 기재된 바와 같이 옥텟(Octet)에 의해 측정했다. CTC-445.2(왼쪽) 및 CTC-445.2d(오른쪽)를 Anti-Penta_HIS 센서에 고정된 SARS-CoV-1 S RBD와 함께 인큐베이션하고 다양한 농도의 CTC-445.2(123-10000 nM; 왼쪽) 및 CTC-445.2d(82-6667 nM; 오른쪽)와 함께 인큐베이션했다. 결과는 CTC-445.2(K_d=3864 nM, k_on=1.0x10⁵ M^-1s^-1, koff=3.9x10^-1 s^-1) 및 CTC-445.2d SARS-CoV-1 S RBD(K_d=1280 nM, k_on=3.7 x 10⁵ M^-1s^-1, koff=4.7x10^-1 s^-1)에 대해 전술한 바와 같이 전반적으로 피팅되었다. 도 15 및 표 11을 참조한다.

실시예 15 - SARS-CoV-2 RBD 돌연변이체에 대한 CTC-445.2의 결합 동역학.

5개의 SARS-CoV-2 RBD 돌연변이체를 Anti-Penta-His 센서를 통해 고정화하고 CTC-445.2를 용액에서 적정했다. 데이터는 각 RBD 돌연변이체의 경우 1:1 모델에서 전반적으로 피팅되었다. 도 16은 CTC-445.2가 돌연변이체에 결합함을 입증한다.

실시예 16 - 세포보호 검정

PBS 중 테스트 화합물은 50μg/mL 젠타마이신 및 2% FBS를 포함하는 MEM 용액에 8개의 농도로 제조했다. 테스트 물질 CTC-640 및 CTC-641은 50μM의 높은 테스트 농도와 7개의 연속 3배 희석액을 사용하여 평가했다. CTC-655는 10μM의 높은 테스트 농도와 7개의 연속 3배 희석액을 사용하여 평가했다. 나머지 테스트 물품은 20μM의 높은 테스트 농도와 7개의 연속 3배 희석액을 사용하여 평가했다. 각 농도를 100 마이크로리터씩 효능을 위해 3반복 웰에 첨가하고 세포독성을 위해 2반복 웰에 첨가했다. 각 희석액을 80-100% 융합성의 Vero76 세포(웰당 3 x 104개 세포)가 있는 96웰 플레이트의 5개 웰에 첨가하고 37℃/5% CO2에서 2시간 동안 인큐베이션했다. SARS-CoV-2 바이러스(균주 USA-WA1/2020)는 4일째에 >80%의 세포변성 효과(CPE)를 산출하는 가능한 한 가장 낮은 감염 다중도(MOI, 0.002)를 달성하도록 제조했다. 각 희석액의 3개 웰은 바이러스로 감염되었고 2개 웰은 독성 대조군으로서 감염되지 않은 채로 두었다. 미처리 바이러스 대조군 웰이 4일 감염 후 최대 세포변성 효과(CPE)를 달성한 후, 플레이트는 대략 2시간 동안 중성 적색 염료로 염색한 다음, 상층액 염료를 제거하고 혼입된 염료는 50:50 Sorensen 시트레이트 완충액/에탄올에서 추출한 다음, 분광 광도계에서 판독했다. OD 값은 세포 및 바이러스 대조군을 기준으로 정규화한 다음, EC50(50% 유효 농도) 및 TC50(50% 독성 농도)을 회귀 분석에 의해 계산했다. 결과는 표 12에 제시된다.

실시예 17 - 융합 단백질

CTC-702를 IgG1 Fc 도메인의 C-말단에 융합시켰다. 융합 단백질을 발현 및 정제하고 본원에 기재된 바와 같이 옥텟을 통해 결합에 대해 테스트했다. 결과는 1:1 결합 모델(Kd=0.54nM)에 의해 전반적으로 피팅되었다. 융합은 CTC-654 및 CTC-725에 대해 비슷한 결합 및 IC50을 나타내었다.

융합 단백질에 대한 서열은 서열번호 247에 제시된 바와 같다:

다음으로, CTC-702를 하나의 IgG1 Fc 도메인의 C-말단 및 다른 것의 N-말단에 융합시켰다. 융합 단백질을 발현 및 정제하고 본원에 기재된 바와 같이 옥텟을 통해 결합에 대해 테스트했다. 융합은 융합되지 않은 단백질 디코이와 비슷한 결합을 보여주었다.

실시예 18 - 오류가 발생하기 쉬운 PCR 및 효모 디스플레이 FACS를 사용한 CTC-445의 최적화

GeneMorph II 무작위 돌연변이유발 키트(Agilent)를 사용하여 CTC-445를 암호하는 유전자의 오류가 발생하기 쉬운 PCR(epPCR)을 표준 프로토콜에 따라 수행했다. 더 높고 더 낮은 오류율 풀을 수득하기 위해 초기 표적 DNA로서 10ng 및 1ng의 CTC-445 암호 유전자를 사용하여 2가지 별도의 PCR 반응을 수행했다. 이 PCR에는 55℃의 어닐링 온도에서 30 주기의 증폭을 사용했다. 두 PCR의 생성물을 합하고 에탄올 침전에 의해 정제했다. 12 μg의 CTC-445 epPCR DNA를 전기천공법에 의해 상태조정된 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 균주 EBY100 세포에 4 μg의 선형화된 pETcon3 벡터(NdeI 및 XhoI 제한 효소로 분해되고 겔 추출에 의해 정제됨)와 함께 이전에 설명한 프로토콜(Benatuil, L., Perez, J. M., Belk, J. & Hsieh, C.-M. An improved yeast transformation method for the generation of very large human antibody libraries. Protein Eng. Des. Sel. PEDS 23, 155-159 (2010))을 사용하여 형질전환시켰다. 이 유전자는 5' 말단과 3' 말단 모두에서 벡터와 중첩되는 60개 염기를 포함하여, 상동성 재조합이 벡터 상의 NdeI 및 XhoI 부위 사이에 프레임에 맞게 유전자를 배치할 것이다. 형질전환 효율은 2x10⁶ 형질전환체였다. 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 사용하여 SARS-CoV-2에 대한 결합을 개선하고 프로테아제에 대한 안정성을 개선하는 돌연변이를 식별하기 위해 CTC-445 epPCR 라이브러리에 대해 여러 라운드의 세포 분류를 수행했다. 효모는 C-Trp-Uraselective 배지에서 성장시킨 후, SGCAA 배지에서 12-18시간 동안 유도했다. 세포는 PBSF(50mM NaPO4, 150mM NaCl, pH 7.4)에 희석된 다양한 농도의 SARS-CoV-2 RBD mFc와 함께 인큐베이션했고, 분류 라운드마다 RBD 농도는 감소되었다: 200nM(라운드 1, 108 세포 분류됨), 10 nM(라운드 2, 107 세포 분류됨), 1 nM(라운드 3, 106 세포 분류됨), 100pM(라운드 4, 106 세포 분류됨), 10pM 및 1pM(라운드 5, 106 세포 분류됨). 이 인큐베이션은 얼음 위에서 30분 동안 수행했고 이후에 차가운 PBSF로 세척했다. 분류 라운드 4 및 5에서 개선된 koff를 위한 추가 선택이 이 단계에서 추가되었으며, 여기서 세포는 37℃에서 1시간 동안 1 ml PBSF 완충액에서 인큐베이션되었다. 세포를 차가운 PBSF 완충액으로 다시 세척했다. 마지막으로, 세포를 FITC-접합된 닭 항-cMyc 항체(ICL) 및 피코에리트린-접합된 염소 항-mFc 항체(Jackson ImmunoResearch)와 함께 3 × 106 세포당 1μl씩 얼음 위에서 10분 동안 인큐베이션하고 차가운 PBSF 완충액으로 다시 세척했다. Sony SH800 기기로 분류를 수행하고 각 라운드에서 PE/FITC 형광 비율에 의해 표시나는 하위집단의 상위 5%를 선택했다. 라운드 2부터 시작하여, 1차 표지화 전에 세포는 TBS 완충액(25mM Tris-HCl, 150mM NaCl, pH 8.0) 중 트립신(12.5μg/mL)과 키모트립신(5μg/mL)의 혼합물로 실온에서 5분 동안 전처리했다. 이 반응은 큰 과량의 얼음처럼 차가운 TBSF 1%(25mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 1% w/v BSA, pH 8.0)를 첨가하고 세포를 TBSF 1%로 추가 4회 세척하여 중단시켰다. 라운드 1에서 시작하여 선택된 세포를 SDCAA 한천 플레이트에 플레이팅하고 각 라운드에서 약 20개의 콜로니를 취하여 PCR에 의해 증폭시키고 FACS의 각 라운드에서 선택된 돌연변이를 식별하기 위해 생거(Sanger) 시퀀싱(Genewiz)으로 시퀀싱했다. (Chao, G. et al. Isolating and engineering human antibodies using yeast surface display. Nat. Protoc. 1, 755-768 (2006)). CTC-445.01 내지 CTC-445.68로서 식별된 서열은 오류가 발생하기 쉬운 PCR 및 효모 디스플레이 FACS를 사용하여 식별되었다. 숙련된 기술자는 이 결과를 사용하여 코로나바이러스 스파이크 단백질에 대한 결합을 실질적으로 방해하지 않는 ACE2 단백질 디코이에 대한 치환을 식별할 수 있다.

실시예 19 - 포괄적인 인간 프로테옴 결합 검정을 사용하여 평가된 CTC445.2d의 결합 특이성.

Alexa-647로 화학적으로 표지된 1μg/mL(=30nM)의 CTC445.2d를 단백질-단백질 상호작용 검정에 사용했다. 21,218개의 단백질 및 단백질 이소형(S 단백질 RBD 포함)을 함유하는 바코드가 있는 HuProt^TM 어레이(CDI Laboratories, Baltimore, MD)를 단백질 샘플과 함께 1시간 동안 인큐베이션했다. 탐침 후, 어레이를 세척하고 데이터 수집을 위해 이미지를 촬영했다. CDI 소프트웨어를 사용하여 Z 점수를 기반으로 어레이 상의 특정 단백질에 대한 각 개별 샘플의 결합 프로필을 정량했다. Z 점수는 주어진 단백질의 이반복 지점의 평균 Z 점수를 사용하여 계산했다(각 단백질은 HuProt^TM 어레이에 이반복으로 인쇄됨). 주어진 어레이 상의 각 지점의 Z 점수는 공식 Z = [F635-F635(avg)] / F635(std)에 따라 계산되며, 여기서 F635는 검출 채널(635nm)에서 주어진 단백질의 2개의 반복 지점의 평균 전경 신호 강도이고; B635는 검출 채널에서 주어진 단백질의 2개의 반복 지점의 평균 배경 신호 강도이다; F635(avg) 및 F635(std)는 각각 어레이에 있는 모든 지점의 F635 값의 평균 및 표준 편차이다. S 점수는 주어진 단백질의 Z 점수와 그 뒤를 있는 것과의 차이이다. 최고 적중의 S 점수가 다음 적중으로부터 > 3이면, 테스트 단백질은 해당 적중에 대해 매우 특이적인 것으로 간주된다.

표 13은 Z 점수 > 10인 모든 적중을 보여준다. CTC445.2d는 SARS-CoV-2 RBD에 대한 특이적인 결합을 입증하며, 형광 값 65,535는 88.6의 최고의 Z 점수로 해석된다. 다음으로 가장 높은 결합 유전자인 QDPR에 대한 S 점수는 27.6으로, SARS-CoV-2의 의도된 표적 RBD에 대한 고도로 특이적인 결합을 입증한다. 고정된 SARS-CoV-2 RBD-his, QDPR-his 및 CLEC10A-his에 대한 CTC-445.2d의 결합은 생물층 간섭계에 의해 테스트되었다. QDPR 및 CLEC10A에 대한 결합은 테스트된 임의의 CTC-445.2d 농도(10μM, 5μM 및 1μM)에서 검출되지 않았다(데이터는 제시되지 않음).

실시예 20 - 결합 선택 후 돌연변이의 위치 확률

여러 상이한 농도의 SARS-CoV-2 RBD 단백질(6.25pM, 3.125pM, 및 1.5625pM)에 결합하는 CTC445.2의 포화 돌연변이유발 라이브러리 상에서 효모 디스플레이에 의해 심층 돌연변이 스캐닝을 수행했다. 심층 시퀀싱을 사용하여 각 돌연변이에 대한 농축 값을 계산하고 3개 농도에 대한 값을 평균화했다. 그런 다음 농축 값을 각 위치의 각 돌연변이에 대한 위치 확률 점수로 변환하고 로고 메이커[ref: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/635029v1]를 사용하여 서열 로고로서 플로팅했다. 문자는 확률에 따라 크기가 조정되고 가장 높은 확률(위)부터 가장 낮은 확률(아래) 순서로 정렬된다. CTC445.2의 천연 서열은 검은색으로 음영 처리된다. 숙련된 기술자는 ACE2 단백질 디코이에 대한 다양한 위치에서 바람직한 및 바람직하지 않은 치환의 선택을 안내하기 위해 결과를 사용할 수 있다. 도 20a-c 참조.

실시예 21 - 드노보 ACE2 단백질 디코이에 대한 예시적인 임상 시험 설계

드노보 ACE2 단백질 디코이에 대한 임상 설계는 드노보 ACE2 단백질 디코이의 안전성 프로파일, 권장 용량 및 일정, 및 임상 활성을 식별하도록 설계되었다. 투여 경로는 분무된 드노보 ACE2 단백질 디코이의 흡입에 의한 기도(비인두 및 폐 포함)로의 국소 투여, 및/또는 정맥내 전신 투여이다. 한 연구에서 환자 집단은 SARS-CoV-2로 인한 임상적 이환 또는 사망 위험이 높은 COVID-19 환자, 예를 들어, 입원하고 저산소증에 대한 산소 보충이 필요한 자이다. 이 시험은 양압 환기가 필요한 환자 모집을 피할 수 있다. 시험은 2 부분으로 시행된다. 제1 부분은 입원한 저산소 COVID-19 환자에서 드노보 ACE2 단백질 디코이의 안전성을 조사하고 권장되는 파트 2 용량 및 일정(RP2DS)을 식별하기 위한 용량 증량 연구이다. 제2 부분은 RP2DS로 투여될 때 입원한 저산소 COVID-19 환자에서 드노보 ACE2 단백질 디코이의 임상 활성을 탐색하기 위한 코호트 확장 연구이다. 평가변수로는, 예를 들어, 생존, 양압 환기 요구 사항, 회복 및/또는 퇴원 시간, 및 임상 안전성 프로파일을 포함한다. 대안적으로, 환자 집단은 코로나바이러스 감염의 위험이 있는 개인일 수 있고 투여는 예방적일 수 있다. 다른 연구에서 환자 집단은 SARS-CoV-2에 노출될 위험이 있거나 최근에 SARS-CoV-2에 노출된 건강한 대상체이다.

실시예 22: 토론

SARS-CoV-2는 2019년 12월에 세계적 대유행으로 출현한 이후 수백만 건의 COVID-19 사례를 유발했다. 질병을 예방하고 치료하기 위한 효과적인 전략의 필요성은 여전히 충족되지 않고 시급하다. 다양한 접근법을 사용하여 예방 및 치료제를 개발하기 위한 여러 지속적인 노력이 있다. 문제는 양의 센스 단일 가닥 RNA(+ssRNA) 바이러스(8-10)의 높은 돌연변이 비율이 종종 바이러스 탈출을 야기할 수 있다는 것이며, 이는 개발 중인 많은 SARS-CoV-2 치료제의 효능을 훼손시킬 수 있다. 감염된 집단의 SARS-CoV-2의 스파이크(S) 단백질에서는 이미 여러 돌연변이가 발생했다. 수용체 결합 도메인(RBD)에 대한 심층 시퀀싱 연구에 따르면, 단순한 돌연변이로 인해 바이러스가 공지된 중화 항체를 피할 수 있음이 밝혀졌다. 따라서, SARS-CoV-2 돌연변이 탈출에 대해 더욱 내성일 수 있는 신규 치료제의 개발이 절실하다.

바이러스를 퇴치하기 위한 전통적인 접근법(예를 들어, 백신접종 및 단클론 항체)은 궁극적으로 병원체가 이의 세포 표적과 체결하는 방식과 근본적으로 다른 방식으로 병원체와 상호작용하는 분자에 의존한다. 바이러스는 중화를 피하기 위해 이러한 구조적 불일치를 이용할 수 있어, 바이러스 적합성을 보존하면서 중화 분자(예를 들어, 항체)에 의한 인식을 방지하기 위해 단백질의 모양을 변화시킨다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 본 발명자들은 세포를 감염시키기 위해 바이러스가 부착하는 단백질 수용체 계면을 복제하고 안정화한, 초안정 드노보 단백질 "디코이"의 빠르고 정확한 설계를 가능하게 하는 컴퓨터 단백질 설계 전략을 개발했다. 디코이는 결합 계면을 안정화하는 기여로 인해 원래의 단백질 수용체와 유사하거나 심지어 더 높은 친화성을 달성할 수 있다. 따라서, 충분히 높은 농도에서, 디코이는 세포와의 상호작용을 능가함으로써 바이러스를 중화시키는데 사용될 수 있다.

SARS-CoV-2는 2단계 과정에서 숙주 세포를 침범한다. 첫째, 이의 S 단백질 RBD는 막 결합 단백질인 hACE2에 결합함으로써 세포에 부착하여 세포내이입을 유발한다. 이어서, 바이러스는 프로테아제-절단-매개 융합 펩타이드를 통해 엔도솜을 탈출한다. 이 과정은 세포 진입을 위해 hACE2도 표적으로 삼는 베타 코로나바이러스 HCoV-NL63 및 SARS-CoV-1과 유사하다. 원칙적으로, hACE2와의 바이러스 상호작용을 저해하면 감염을 예방해야 한다. 설계 전략은 드노보 hACE2 디코이를 조작, 검증 및 최적화하여 SARS-CoV-2를 중화시키기 위해 적용되었다.

대략 35,000개의 드노보 ACE2 디코이의 타당성 있는 컴퓨터 모델이 설계되었다. 효모 디스플레이를 사용하여, 상위 196개의 설계를 결합에 대해 개별적으로 테스트했다. 즉시 사용 가능한 설계 중 하나인 CTC-445는 SARS-CoV-2 RBD에 대해 효모 디스플레이에 의해 강력한/나노몰 및 특이적 결합을 보여주었다. 용액에서 CTC-445는 18개의 천연 아미노산을 포함하는 160 a.a 단백질(시스테인 또는 트립토판 잔기를 함유하지 않음)이고, hACE2(K _D = 31 nM, IC_{50 @ ACE2[0.4nM]} = 10.9 nM)보다 SARS-CoV-2에 대해 약한 결합 친화도(K_D 약 357 nM), 및 SARS-CoV-1에 대한 약한 교차 반응성(Kd ≒ 55 μM)을 나타낸다. 결과적으로, CTC-445는 hACE2에 결합하는 SARS-CoV-2 RBD의 약한 경쟁자이다(IC_{50 @ ACE2[0.4nM]} = 1.7 μM, 도 1i). CTC-445의 낮은 결합 친화성 및 효능은 폴딩된 상태의 불안정성의 결과일 가능성이 있다(ΔG_NI~ -2.7 kcal mol^-1, T_m~ 75.3℃). 단일 라운드의 유도 진화 및 가장 빈번하게 관찰되는 5가지 안정화 및 친화성 개선 돌연변이(이들은 전부 결합 계면에 존재하지 않음)의 후속적인 합리적 조합은 드노보 단백질 디코이 CTC-445.2를 야기했다. CTC-445.2는 주로 단량체이고 열역학적으로 초안정하며(ΔG_NI~ -5.0 kcal mol^-1, T_m ~ 93℃), SARS-CoV-2의 RBD에 대해 낮은 나노몰 친화성을 나타내며(K _D ~ 21.0 nM), SARS-CoV-1에 대해 개선된 교차 반응성을 갖고(K _D ~ 7.1 μM), SARS-CoV-2 RBD에 대한 hACE2 결합과 효율적으로 경쟁할 수 있다(IC_{50 @ ACE2[0.4nM]} ~ 10.4 nM). CTC-445.2의 서열은 hACE2와 유의미한 동일성을 갖지 않는다(선형 서열 정렬 또는 구조적 서열 정렬의 관점에서, 각각 ClustalW ~ 22%, MICAN ~ 34%, 도 S9). CTC-445.2의 연속 이반복(즉, 결합력의 증가)은 유리한 생화학적 특성을 가진 더 높은 효능의 분자를 야기했다. 예를 들어, CTC-445.2의 2가 버전인 CTC-445.2d(도 2a)는 SARS-CoV-2 RBD(K _D ~ 3.5nM) 및 SARS-CoV-1 RBD(K _D ~ 587 nM)에 대한 결합 친화도의 약 10배 개선, 및 SARS-CoV-2 RBD(IC_{50 @ ACE2[0.4nM]} ~ 700 pM)에 대한 hACE2 결합과 경쟁하는 능력의 유사한 증가를 갖는다. 또한, CTC-445.2의 3가 버전은 훨씬 더 높은(피코몰) 결합 친화도 및 경쟁 효능을 초래했다(K_D= 270 pM, IC_{50 @ ACE@[0.4nM]} ~ 110 pM). >21,000개의 인간 단백질을 함유하는 교차 반응성 결합 검정에서 CTC-445.2d는 SARS-CoV-2 RBD에 높은 선택도로 결합하는 것으로 확인되었다.

SARS-CoV-2 스파이크 단백질을 발현하는 VSV 슈도바이러스 시스템에서, 드노보 디코이는 감염으로부터 hACE2를 과발현하는 HEK 293T 세포를 특이적으로 보호했다. CTC-445.2d의 활성을 감염으로부터 기도를 보호할 수 있는 국소 전달 치료제로서 정의하기 위해 고용량(100μg)의 CTC-445.2d를 비강내 소적 흡입을 통해 Balb/c 마우스로 전달했다. 완전히 기능하는 CTC-445.2d의 지속성은 24시간 넘게 폐에서 관찰되었다. CTC-445.2d는 혈액에서도 검출되어 흡입 요법이 어느 정도 전신 노출을 야기할 가능성을 높였다.

설계된 바와 같이, SARS-CoV-2 RBD와 CTC-445.2의 결합 계면은 표적 hACE2 계면을 근접 반영한다. CTC-445.2의 심층 돌연변이 스캐닝 결과는 예상한 대로, 설계의 코어 및 결합 계면에서의 돌연변이는 일반적으로 바람직하지 않은 반면, 표면/노출된 잔기에서의 돌연변이는 대부분 관련이 없다.

SARS-CoV-2 RBD 결합 계면의 심층 돌연변이 스캐닝을 수행하여, hACE2 또는 CTC-445.2에 대한 결합에 있어서 모든 단일 돌연변이의 효과를 비교했다. 분석된 약 1700개의 SARS-CoV-2 RBD 돌연변이의 효과는 hACE2와 CTC-445.2에 대한 결합 사이에 강한 상관관계를 보여주며, 이는 SARS-CoV-2가 표적으로 하는 hACE2 계면을 정확하게 재정리한 결과로서 돌연변이 탈출에 대한 디코이 고유의 탄력성을 강조한다. 특히, 낮은 표적 농도(100pM)에서 CTC-445.2는 많은 RBD 돌연변이에 대해 ACE2보다 큰 결합 이점을 갖고 있고, 이는 아마도 더 높은 안정성과 더 작은 크기의 결과일 것이다.

최적화된 드노보 단백질 디코이의 높고 특이적인 결합 친화성은 SARS-CoV-2 바이러스 감염의 효과적이고 특이적인 시험관내 중화로 해석되었다. 시험관내에서 드노보 디코이의 존재는 포유동물 세포 생존력이나 hACE2의 효소 활성에 어떠한 영향을 미치지 않음을 보여주었다. 실시예에서 볼 수 있듯이, 드노보 디코이는 세포 감염의 시험관내 시스템에서 바이러스 감염을 완전히 중화할 수 있었다.

디코이를 생성하기 위한 드노보 단백질 설계 접근법은 전통적인 치료법에 대해 직교성이며 돌연변이 바이러스 회피 문제를 더 잘 극복할 가능성이 있다. 다른 목적에 맞게 만든 천연 단백질은 제조, 운송 및 저장을 복잡하게 할 수 있는 낮은 안정성; 잔류/바람직하지 않은 생물학적 활성; 및 자가면역 반응을 유인하는 위험과 같은 치료제로서의 개발에 상당한 과제를 종종 제시한다. 대조적으로, 드노보 단백질 디코이는 제조하기가 쉽고(즉, 전통적인 박테리아 시스템에서), 이들의 열역학적 초안정성으로 인해 콜드 체인의 필요 없이 운반 및 보관을 단순화할 수 있다. 또한, 바이러스 탈출에 대한 드노보 디코이의 순응성은 기술된 설계 전략의 고유한 특징으로 여겨진다.

Claims (144)

1. (i) 적어도 2개의 알파 나선 도메인 H1 및 H2, (ii) 선택적 베타 헤어핀 도메인 H3, 및 (iii) 적어도 하나의 구조적 도메인을 포함하는 디코이 단위를 포함하는 ACE2 단백질 디코이로서; 상기 ACE2 단백질 디코이는 코로나바이러스 ACE2-결합 스파이크 단백질에 특이적으로 결합하고, 상기 적어도 2개의 알파 나선 도메인 및 선택적 베타 헤어핀 도메인은 상기 코로나바이러스 ACE2-결합 스파이크 단백질과 계면을 형성하고, 상기 적어도 하나의 구조적 도메인은 상기 알파 나선 및 베타 헤어핀 도메인의 단백질 폴딩 및 결합-적격 제시(binding-competent presentation)를 용이하게 하는 것인, ACE2 단백질 디코이(decoy).
2. 2개의 알파 나선 도메인 H1 및 H2, 및 선택적 베타 헤어핀 도메인 H3을 포함하는 디코이 단위를 포함하는 ACE2 단백질 디코이로서,
   (a) H1은 다음 아미노산 서열을 포함하고:
   SX₁X₂X₃EQX₄X₅TFX₆DKX₇X₈HEX₉EDX₁₀X₁₁YQX₁₂X₁₃L (서열번호 4) 또는
   X₂X₃EQX₄X₅TFX₆DKX₇X₈HEX₉EDX₁₀X₁₁YQX₁₂X₁₃L (서열번호 176);
   (b) H2는 다음 아미노산 서열을 포함하며:
   NX₁₄X₁₅NX₁₆X₁₇X₁₈KX₁₉X₂₀X₂₁FX₂₂X₂₃EQX₂₄X₂₅LX₂₆X₂₇MY (서열번호 5);
   (c) H3은, 존재한다면, 다음 아미노산 서열을 포함하고:
   X₂₈X₂₉X₃₀X₃₁X₃₂X₃₃KGDX₃₄RX₃₅X₃₆ (서열번호 6),
   여기서,
   (i) H1, H2, 및 존재한다면, H3은 상기 단백질에 임의의 순서로 존재할 수 있고;
   (ii) H1, H2, 및 존재한다면 H3 중 임의의 2개 사이에 아미노산 링커가 존재할 수 있고;
   (iii) X₁, X₂, X₃, X₄, X₅, X₆, X₇, X₈, X₉, X₁₀, X₁₁, X₁₂, X₁₃, X₁₄, X₁₅, X₁₆, X₁₇, X₁₈, X₁₉, X₂₀, X₂₁, X₂₂, X₂₃, X₂₄, X₂₅, X₂₆, X₂₇, X₂₈, X₂₉, X₃₀, X₃₁, X₃₂, X₃₃, X₃₄, X₃₅, 및 X₃₆은 임의의 아미노산으로부터 각각 독립적으로 선택되며;
   (iv) 상기 ACE2 단백질 디코이는 코로나바이러스 ACE2-결합 스파이크 단백질에 특이적으로 결합하는 것인, ACE2 단백질 디코이.
3. 제2항에 있어서, 상기 디코이 단위는 H1, H2 및 존재한다면 H3의 단백질 폴딩 및 결합-적격 제시를 용이하게 하는 하나 이상의 구조적 도메인을 추가로 포함하고, 여기서 상기 하나 이상의 구조적 도메인 및 H1, H2 및 존재한다면 H3은 상기 단백질에 임의의 순서로 존재할 수 있으며, 상기 하나 이상의 구조적 도메인 중 어느 하나와 H1, H2, 및 존재한다면, H3 사이에 아미노산 링커가 존재할 수 있는 것인, ACE2 결합 단백질 디코이.
4. 제2항 또는 제3항에 있어서, X_번호로 표현된 아미노산의 절반 이하는 서열번호 1로 표현되는 천연 ACE2의 상응하는 위치에 있는 동일한 아미노산인, ACE2 단백질 디코이.
5. 제2항 또는 제3항에 있어서, X_번호로 표현된 아미노산의 8개 이하는 천연 ACE2의 상응하는 위치에 있는 동일한 아미노산인, ACE2 단백질 디코이.
6. 제2항 또는 제3항에 있어서, H1에서 X_번호로 표현된 아미노산의 4, 3 또는 2개 이하; H2에서 X_번호로 표현된 아미노산 중 4, 3 또는 2개 이하; 및 존재한다면, H3에서 아미노산 중 5, 4, 3 또는 2개 이하가 천연 ACE2의 상응하는 위치에 있는 동일한 아미노산인, ACE2 단백질 디코이.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, H1이 다음 아미노산 서열을 포함하는, ACE2 단백질 디코이:
   SX₁X₂X₃EQX₄X₅TFX₆DKX₇X₈HEX₉EDX₁₀X₁₁YQX₁₂X₁₃L (서열번호 4) 또는
   X₂X₃EQX₄X₅TFX₆DKX₇X₈HEX₉EDX₁₀X₁₁YQX₁₂X₁₃L (서열번호 176);
   여기서
   X₁은 D, E, G, K, N, P, Q, R, S, 또는 T로부터 선택되는 아미노산이고;
   X₂, X₆, X₉, X₁₁, X₁₂, 및 X₁₃은 각각 독립적으로 A, F, I, L, M, P 또는 V로부터 선택되는 아미노산이며;
   X₅, X₇, X₈, 및 X₁₀은 각각 독립적으로 A, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y로부터 선택되는 아미노산이고;
   X₃은 A, C, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y로부터 선택되는 아미노산이고;
   X₄는 A, F, I, L, M, P, V, D, E, G, K, N, P, Q, R, S, 또는 T로부터 선택되는 아미노산임.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, H1이 다음 아미노산 서열을 포함하는 ACE2 단백질 디코이:
   SX₁X₂X₃EQX₄X₅TFX₆DKX₇X₈HEX₉EDX₁₀X₁₁YQX₁₂X₁₃L (서열번호 4) 또는
   X₂X₃EQX₄X₅TFX₆DKX₇X₈HEX₉EDX₁₀X₁₁YQX₁₂X₁₃L (서열번호 176);
   여기서
   X₁은 D, E, G, K, N, P, Q, R, S, 또는 T로부터 선택되는 아미노산이고;
   X₂, X₆, X₉, X₁₁, X₁₂, 및 X₁₃은 각각 독립적으로 A, F, I, L, M, P 또는 V로부터 선택되는 아미노산이며;
   X₃, X₅, X₇, X₈, 및 X₁₀은 각각 독립적으로 A, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y로부터 선택되는 아미노산이고;
   X₄는 A, F, I, L, M, P, V, D, E, G, K, N, P, Q, R, S, 또는 T로부터 선택되는 아미노산임.
9. 제2항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, X₄는 A, F, I, L, M, P 또는 V로부터 선택되는 아미노산인, ACE2 단백질 디코이.
10. 제2항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, X₅가 D, E, G, K, N, P, Q, R, S, 또는 T(바람직하게는 K)로부터 선택되는 아미노산인, ACE2 단백질 디코이.
11. 제2항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, X₁이 R 또는 S로부터 선택되는 아미노산인, ACE2 단백질 디코이.
12. 제2항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, X₃이 R, L, A, F, I, M, P 또는 V로부터 선택되는 아미노산인, ACE2 단백질 디코이.
13. 제12항에 있어서, X₃이 R 또는 L로부터 선택되는 아미노산인, ACE2 단백질 디코이.
14. 제2항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, X₇이 A 또는 T로부터 선택되는 아미노산인, ACE2 단백질 디코이.
15. 제2항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, X₁₀이 R, S 또는 L로부터 선택되는 아미노산인, ACE2 단백질 디코이.
16. 제2항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    X₁은 R 또는 S로부터 선택되는 아미노산이고;
    X₃은 R 또는 L로부터 선택되는 아미노산이며;
    X₇은 A 또는 T로부터 선택되는 아미노산이고;
    X₁₀은 R, S 또는 L로부터 선택되는 아미노산인, ACE2 단백질 디코이.
17. 제2항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, X₁₀은 R 또는 S로부터 선택되는 아미노산인, ACE2 단백질 디코이.
18. 제2항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    X₈은 A, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W, 또는 Y로부터 선택되는 아미노산인, ACE2 단백질 디코이.
19. 제18항에 있어서, X₈은 F, D, E, G, K, N, P, Q, R, S, 또는 T로부터 선택되는 아미노산인, ACE2 단백질 디코이.
20. 제19항에 있어서, X₈은 F인, ACE2 단백질 디코이.
21. 제8항에 있어서,
    X₁은 R 또는 S로부터 선택되는 아미노산이고; X₂는 V이고; X₃은 R 또는 L로부터 선택되는 아미노산이고;
    X₄는 L이고; X₅는 K이고; X₆은 A이고; X₇은 A 또는 T로부터 선택되는 아미노산이고; X₈은 F이고;
    X₉는 M이고; X₁₀은 R, S 또는 L로부터 선택되는 아미노산이고; X₁₁은 F이며;
    X₁₂는 A이고; X₁₃은 A인, ACE2 단백질 디코이.
22. 제2항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, X₁이 S인, ACE2 단백질 디코이.
23. 제2항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, X₃이 L인, ACE2 단백질 디코이.
24. 제2항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, X₁이 S이고 X₃이 L인, ACE2 단백질 디코이.
25. 제2항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, H1이 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, ACE2 단백질 디코이:
    SX₁X₂X₃EQX₄X₅TFX₆DKX₇X₈HEX₉EDX₁₀X₁₁YQX₁₂X₁₃L X₃₇X₃₈X₃₉X₄₀X₄₁X₄₂ X₄₃X₄₄X₄₅X₄₆ (서열번호 10);
    여기서, X₃₇, X_38, X_39, X_41, X_42, X_45, 및 X₄₆은 각각 독립적으로 A, F, I, L, M, P 또는 V로부터 선택되는 아미노산이고;
    X₄₀ 및 X₄₄는 각각 독립적으로 A, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y로부터 선택되는 아미노산이며;
    X₄₃은 D, E, G, K, N, P, Q, R, S, 또는 T로부터 선택되는 아미노산임.
26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, H1이 서열번호 11-17, 177-183, 198 또는 199에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 ACE2 단백질 디코이:
    

    
27. 제26항에 있어서, 서열번호 11-17 또는 198의 위치 1, 5, 6, 9, 10, 12, 13, 16, 17, 19, 20, 23, 24 및 27에 있는 아미노산, 또는 서열번호 177-183 또는 199의 위치 3, 4, 7, 8, 10, 11, 14, 15, 17, 18, 21, 22 및 25에 있는 아미노산은 변경되지 않는 것인, ACE2 단백질 디코이.
28. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, H1이 서열번호 15에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 ACE2 단백질 디코이:
    (SSVLEQLKTFADKAFHEMEDRFYQAAL) (서열번호 15)
    여기서, 위치 1의 아미노산은 S 또는 치환된다면 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W, 또는 Y이고; 위치 2의 아미노산은 S 또는 치환된다면 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W, 또는 Y이며; 위치 3의 아미노산은 V 또는 치환된다면 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W, 또는 Y이고; 위치 4의 아미노산은 L 또는 치환된다면 A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이고; 위치 5의 아미노산은 E 또는 치환된다면 A, C, D, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이고; 위치 6의 아미노산은 Q 또는 치환된다면 A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, S, T, V, 또는 W이고; 위치 7의 아미노산은 L 또는 치환된다면 C, I, M, T, 또는 V이고; 위치 8의 아미노산은 K 또는 치환된다면 A, C, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이고; 위치 9의 아미노산은 T 또는 치환된다면 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, V, W, 또는 Y이고; 위치 10의 아미노산은 F 또는 치환된다면 A, C, H, V, W, 또는 Y이고; 위치 11의 아미노산은 A 또는 치환된다면 C, G, L, M, S, T, 또는 V이고; 위치 12의 아미노산은 D 또는 치환된다면 A, C, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이고; 위치 13의 아미노산은 K 또는 치환된다면 A, C, F, H, I, L, M, N, Q, R, S, V, W, 또는 Y이고; 위치 14의 아미노산은 A 또는 치환된다면 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, S, T, 또는 V이고; 위치 15의 아미노산은 F 또는 치환된다면 A, C, D, E, G, H, I, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이고; 위치 16의 아미노산은 H 또는 치환된다면 A, C, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이고; 위치 17의 아미노산은 E 또는 치환된다면 A, C, D, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이고; 위치 18의 아미노산은 M 또는 치환된다면 A, C, D, F, G, H, I, L, N, Q, S, T, V, W, 또는 Y이고; 위치 19의 아미노산은 E 또는 치환된다면 D, M, N, P, Q, T, 또는 V이고; 위치 20의 아미노산은 D 또는 치환된다면 E, F, G, H, L, N, 또는 Q이고; 위치 21의 아미노산은 R 또는 치환된다면 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W, 또는 Y이고; 위치 22의 아미노산은 F 또는 치환된다면 C, G, H, L, M, N, W, 또는 Y이고; 위치 23의 아미노산은 Y 또는 치환된다면 H, D, 또는 F이고; 위치 24의 아미노산은 Q 또는 치환된다면 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, W, 또는 Y이고; 위치 25의 아미노산은 A 또는 치환된다면 C, F, G, H, I, L, M, N, Q, S, T, V, W, 또는 Y이고; 위치 26의 아미노산은 A 또는 치환된다면 C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, Q, S, T, 또는 V이고; 위치 27의 아미노산은 L 또는 치환된다면 A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이며, 여기서 위치 넘버링은 서열번호 15에 따른 것임.
29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, H2가 다음 아미노산 서열을 포함하는 것인 ACE2 단백질 디코이:
    NX₁₄X₁₅NX₁₆X₁₇X₁₈KX₁₉X₂₀X₂₁FX₂₂X₂₃EQX₂₄X₂₅LX₂₆X₂₇MY (서열번호 5)
    여기서, X₁₅, X₁₈, X₂₁, X₂₃, X₂₅, 및 X₂₇은 각각 독립적으로 D, E, G, K, N, P, Q, R, S, 또는 T로부터 선택되는 아미노산이고;
    X₁₄, X₁₇, X₂₂, X₂₄, 및 X₂₆은 각각 독립적으로 A, F, I, L, M, P 또는 V로부터 선택되는 아미노산이며;
    X₁₆은 A, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y로부터 선택되는 아미노산이고;
    X₁₉는 A, F, I, L, M, P, E, T, 또는 V로부터 선택되는 아미노산이고;
    X₂₀은 A, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y로부터 선택되는 아미노산임.
30. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, H2가 다음 아미노산 서열을 포함하는 것인 ACE2 단백질 디코이:
    NX₁₄X₁₅NX₁₆X₁₇X₁₈KX₁₉X₂₀X₂₁FX₂₂X₂₃EQX₂₄X₂₅LX₂₆X₂₇MY (서열번호 5)
    여기서, X₁₅, X₁₈, X₂₁, X₂₃, X₂₅, 및 X₂₇은 각각 독립적으로 D, E, G, K, N, P, Q, R, S, 또는 T로부터 선택되는 아미노산이고;
    X₁₄, X₁₇, X₁₉, X₂₂, X₂₄, 및 X₂₆은 각각 독립적으로 A, F, I, L, M, P 또는 V로부터 선택되는 아미노산이며;
    X₁₆은 A, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y로부터 선택되는 아미노산이고,
    X₂₀은 A, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y로부터 선택되는 아미노산임.
31. 제2항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, X₁₆은 A, F, I, L, M, P, E 또는 V인, ACE2 단백질 디코이.
32. 제2항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, X₁₅는 E; X₁₈은 R; X₂₁은 E; X₂₃은 E; X₂₅는 K; X₂₇은 D인, ACE2 단백질 디코이.
33. 제2항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, X₁₄는 A 또는 V; X₁₆은 A 또는 E; X₂₀은 K 또는 Q인, ACE2 단백질 디코이.
34. 제33항에 있어서, X₁₄는 A 또는 V이고; X₁₅는 E이고; X₁₆은 A 또는 E이고; X₁₇은 A이고; X₁₈은 R이고; X₁₉는 A이고; X₂₀은 K 또는 Q이고; X₂₁은 E이고; X₂₂는 A이고; X₂₃은 E이고; X₂₄는 A이고; X₂₅는 K이고; X₂₆은 A이고; X₂₇은 D인, ACE2 단백질 디코이.
35. 제2항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, H2가 이의 N 말단에 서열번호 173에 제시된 아미노산 서열 및 이의 C 말단에 서열번호 174에 제시된 아미노산 서열을 추가로 포함하는 것인, ACE2 단백질 디코이:
    X₄₇X₄₈X₄₉X₅₀X₅₁ (서열번호 173)
    X₅₂X₅₃X₅₄X₅₅X₅₆ (서열번호 174)
    여기서, X₄₉, X_52, 및 X₅₅는 각각 독립적으로 A, F, I, L, M, P 또는 V로부터 선택되는 아미노산이고;
    X₅₀은 A, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y로부터 선택되는 아미노산이고;
    X₅₄는 A, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y로부터 선택되는 아미노산이며; 및
    X₄₇, X_48, X_51, X_53, 및 X₅₆은 각각 독립적으로 D, E, G, K, N, P, Q, R, S 또는 T로부터 선택되는 아미노산임.
36. 제35항에 있어서, X₄₇은 G 또는 E이고; X₄₈은 D이고; X₄₉는 A이고; X₅₀은 G 또는 A이고; X₅₁은 R인, ACE2 단백질 디코이.
37. 제35항에 있어서, X₄₇이 G 또는 E인, ACE2 단백질 디코이.
38. 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, X₄₇이 G인, ACE2 단백질 디코이.
39. 제35항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, X₅₄가 A, F, I, L, M, P 또는 V인, ACE2 단백질 디코이.
40. 제35항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, X₅₂는 A이고; X₅₃은 E이고; X₅₄는 L 또는 F 또는 N이고; X₅₅는 A이고; X₅₆은 K인, ACE2 단백질 디코이.
41. 제35항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, X₅₄가 F 또는 L인, ACE2 단백질 디코이.
42. 제41항에 있어서, X₅₄가 L인, ACE2 단백질 디코이.
43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, H2가 서열번호 21-22에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, ACE2 단백질 디코이:
    NAENAARKAKEFAEEQAKLADMY (서열번호 21)
    NVENEARKAQEFAEEQAKLADMY (서열번호 22).
44. 제43항에 있어서, 서열번호 21 또는 22의 위치 1, 4, 8, 12, 15, 16, 19, 22 및 23에 있는 아미노산은 변하지 않는 것인, ACE2 단백질 디코이.
45. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, H2가 다음 아미노산 서열을 포함하는 것인, ACE2 단백질 디코이:
    NX₁₄X₁₅NX₁₆X₁₇X₁₈KX₁₉X₂₀X₂₁FX₂₂X₂₃EQX₂₄X₂₅LX₂₆X₂₇MY (서열번호 5)
    여기서,
    X₁₅, X₁₈, X₂₁, X₂₃, X₂₅, 및 X₂₇은 각각 독립적으로 D, E, G, K, N, P, Q, R, S, 또는 T로부터 선택되는 아미노산이고;
    X₁₄, X₁₆, X₁₇, X₁₉, X₂₂, X₂₄, 및 X₂₆은 각각 독립적으로 A, F, I, L, M, P 또는 V로부터 선택되는 아미노산이고;
    X₂₀은 A, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y로부터 선택되는 아미노산임.
46. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, H2가 서열번호 21에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, ACE2 단백질 디코이:
    여기서, 위치 1의 아미노산은 N 또는 치환된다면 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이고; 위치 2의 아미노산은 A 또는 치환된다면 C, D, G, H, I, L, M, N, P, R, S, T, V, 또는 W이며; 위치 3의 아미노산은 E 또는 치환된다면 A, C, D, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이고; 위치 4의 아미노산은 N 또는 치환된다면 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이고; 위치 5의 아미노산은 A 또는 치환된다면 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이고; 위치 6의 아미노산은 A 또는 치환된다면 C, D, E, G, I, L, M, N, P, Q, S, T, V, W, 또는 Y이고; 위치 7의 아미노산은 R 또는 치환된다면 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, Y, 또는 W이고; 위치 8의 아미노산은 K 또는 치환된다면 A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이고; 위치 9의 아미노산은 A 또는 치환된다면 C, D, G, I, L, Q, S, T, V, 또는 W이고; 위치 10의 아미노산은 K 또는 치환된다면 A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, Q, R, S, T, V, 또는 W이고; 위치 11의 아미노산은 E 또는 치환된다면 A, C, D, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이고; 위치 12의 아미노산은 F 또는 치환된다면 A, C, D, E, G, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이고; 위치 13의 아미노산은 A 또는 치환된다면 C, D, F, G, I, L, M, N, S, T, V, W, 또는 Y이고; 위치 14의 아미노산은 E 또는 치환된다면 A, C, D, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이고; 위치 15의 아미노산은 E 또는 치환된다면 A, C, D, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이고; 위치 16의 아미노산은 Q 또는 치환된다면 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, R, S, T, Y, 또는 V이고; 위치 17의 아미노산은 A 또는 치환된다면 C, E, F, G, I, L, M, Q, S, T, V, 또는 W이고; 위치 18의 아미노산은 K 또는 치환된다면 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이고; 위치 19의 아미노산은 L 또는 치환된다면 A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, Q, R, S, T, V, Y, 또는 W이고; 위치 20의 아미노산은 A 또는 치환된다면 C, F, G, I, L, S, T, V, 또는 Y이고; 위치 21의 아미노산은 D 또는 치환된다면 A, C, E, F, G, H, I, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이고; 위치 22의 아미노산은 M 또는 치환된다면 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이고; 위치 23의 아미노산은 Y 또는 치환된다면 D, F, H, I, L, M, 또는 V이며; 여기서 위치 넘버링은 서열번호 21에 따른 것임.
47. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, H3이 존재하는 ACE2 단백질 디코이.
48. 제47항에 있어서, H3이 다음 아미노산 서열을 포함하는 것인, ACE2 단백질 디코이:
    X₂₈X₂₉X₃₀X₃₁X₃₂X₃₃KGDX₃₄RX₃₅X₃₆ (서열번호 6); 여기서,
    X₃₁은 D, E, G, K, N, P, Q, R, S, 또는 T로부터 선택되는 아미노산이고;
    X₃₅는 D, E, G, K, N, P, Q, R, S, V, 또는 T로부터 선택되는 아미노산이며;
    X₂₉는 A, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y로부터 선택되는 아미노산이고;
    X₃₃은 A, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y로부터 선택되는 아미노산이며;
    X₃₀, X₃₂, 및 X₃₆은 각각 독립적으로 A, F, I, L, M, P 또는 V로부터 선택되는 아미노산이고;
    X₂₈은 A, F, I, L, M, P, T, 또는 V로부터 선택되는 아미노산이고;
    X₃₄는 A, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y로부터 선택되는 아미노산 및 선택적으로 C임.
49. 제47항에 있어서, H3이 다음 아미노산 서열을 포함하는, ACE2 단백질 디코이:
    X₂₈X₂₉X₃₀X₃₁X₃₂X₃₃KGDX₃₄RX₃₅X₃₆ (서열번호 6); 여기서,
    X₃₁ 및 X₃₅는 각각 독립적으로 D, E, G, K, N, P, Q, R, S, 또는 T로부터 선택되는 아미노산이고;
    X₂₉는 A, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y로부터 선택되는 아미노산이며;
    X₃₃은 A, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y로부터 선택되는 아미노산이고;
    X₂₈, X₃₀, X₃₂, 및 X₃₆은 각각 독립적으로 A, F, I, L, M, P, 또는 V로부터 선택되는 아미노산이고;
    X₃₄는 A, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y로부터 선택되는 아미노산 및 선택적으로 C임.
50. 제47항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, X₃₄가 F, D, E, G, K, N, P, Q, R, S, Y, C, 또는 T인, ACE2 단백질 디코이.
51. 제47항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, X₃₃이 G, A, F, I, L, M, P 또는 V인 ACE2 단백질 디코이.
52. 제47항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, X₂₉가 D, E, G, K, N, P, Q, R, S, T, 또는 V인 ACE2 단백질 디코이.
53. 제47항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, X₂₈은 A 또는 V이고; X₂₉는 E 또는 V이고; X₃₁은 D이고; X₃₂는 M 또는 L이고; X₃₃은 G이고; X₃₄는 F, Y, K 또는 C로부터 선택되는 아미노산인, ACE2 단백질 디코이.
54. 제47항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, X₃₀은 I이고; X₃₅는 E이고; X₃₆은 I인, ACE2 단백질 디코이.
55. 제47항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, X₃₂가 L인, ACE2 단백질 디코이.
56. 제47항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, X₃₁이 D인, ACE2 단백질 디코이.
57. 제47항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, H3이 이의 N 말단에 A, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로부터 선택되는 아미노산을 추가로 포함하고; H3이 이의 C 말단에 D, E, G, K, N, P, Q, R, S, C 또는 T로부터 선택되는 아미노산을 추가로 포함하는 것인, ACE2 단백질 디코이.
58. 제47항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, X₃₄가 C가 아니거나, X₃₄가 C인 경우, X₃이 L이고/이거나 X₃₂가 L인, ACE2 단백질 디코이.
59. 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, H3이 서열번호 29-34 또는 200에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, ACE2 단백질 디코이:
    

    
60. 제47항에 있어서, H3이 서열번호 29에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것이고,
    여기서, 위치 1의 아미노산은 A이거나, 치환된 경우 C, D, E, G, I, L, M, P, Q, R, S, T, V 또는 W이고; 위치 2의 아미노산은 E이거나, 치환된 경우 A, C, D, G, L, M, P, R, S, T, V 또는 W이고; 위치 3의 아미노산은 I이거나, 치환된 경우 C, F, L, M, T, V 또는 W이고; 위치 4의 아미노산은 D이거나, 치환된 경우 A, C, E, G, I, K, L, M, N, S, T 또는 V이고; 위치 5의 아미노산은 L이거나, 치환된 경우 F, I, M 또는 V이고; 위치 6의 아미노산은 G이거나, 치환된 경우 D 또는 L이고; 위치 7의 아미노산은 K이거나, 치환된 경우 I, M, N, Q, R 또는 T이고; 위치 8의 아미노산은 G이거나, 치환된 경우 D, E, M, R 또는 S이고; 위치 9의 아미노산은 D이거나, 치환된 경우 E, K 또는 T이고; 위치 10의 아미노산은 F이거나, 치환된 경우 A, C, E, G, I, K, L, Q, R, S, T, V, W 또는 Y이고; 위치 11의 아미노산은 R이거나, 치환된 경우 K, M, Q 또는 S이고; 위치 12의 아미노산은 E이거나, 치환된 경우 A, C, D, G, H, K, L, M, P, R, S, T, V, W, 또는 Y이고; 위치 13의 아미노산은 I이거나, 치환된 경우 A, C, D, F, G, H, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, 또는 W이고; 여기서 위치 넘버링은 서열번호 29에 따른 것인, ACE2 단백질 디코이.
61. 제1항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 디코이 단위가 상기 코로나바이러스 스파이크 단백질에 대한 알파 나선 및 베타 헤어핀 도메인의 단백질 폴딩 및 결합-적격 제시를 용이하게 하는 2개 이상의 구조적 도메인을 포함하는 것인, ACE2 단백질 디코이.
62. 제61항에 있어서, 상기 코로나바이러스 스파이크 단백질에 대한 알파 나선 및 베타 헤어핀 도메인의 단백질 폴딩 및 결합-적격 제시를 용이하게 하는 2개 이상의 구조적 도메인이 다음으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 독립적으로 포함하는 것인, ACE2 단백질 디코이:
    D1 - X_AX_AX_BX_BX_CX_BX_BX_BX_AX_BX_BX_AX_CX_BX_CX_AX_BX_CX_AX_CX_CX_AX_AX_BX_CX_AX_A (서열번호 35) 및
    D2 - X_AX_CX_CX_AX_BX_BX_AX_CX_BX_BX_AX_BX_BX_AX_CX_BX_BX_AX_BX_BX_DX_AX_BX_BX_AX_CX_BX_BX_A X_C (서열번호 36)
    여기서, 각각의 X_A는 D, E, G, K, N, P, Q, R, S, C, 또는 T로부터 선택되는 아미노산이고; 각각의 X_B는 독립적으로 A, F, I, L,M, 또는 P로부터 선택되는 아미노산이며, 각각의 X_C는 독립적으로 A, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y 또는 C로부터 선택되는 아미노산이고; 각각의 X_D는 독립적으로 A, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R,S, T, V, W, Y 또는 C(바람직하게는 A, F, I, L, M, P 또는 V)로부터 선택되는 아미노산임.
63. 제62항에 있어서, 상기 디코이 단위가 상기 코로나바이러스 스파이크 단백질에 대한 알파 나선 및 베타 헤어핀 도메인의 단백질 폴딩 및 결합-적격 제시를 용이하게 하는 적어도 2개의 구조적 도메인을 포함하고, 제1 구조적 도메인은 서열번호 35의 서열을 포함하고, 제2 구조적 도메인은 서열번호 36의 서열을 포함하는 것인, ACE2 단백질 디코이.
64. 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 디코이 단위가 D1로 표현되는 구조적 도메인을 포함하고, D1은 서열번호 38에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 ACE2 단백질 디코이:
    REAAEALAEAARAMKEALEIIREIAEK (서열번호38).
65. 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 디코이 단위가 D1로 표현되는 구조적 도메인을 포함하고, D1은 서열번호 222에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 ACE2 단백질 디코이:
    REAAEALAEAARAMKEALEILREIAEK (서열번호 222).
66. 제1항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 디코이 단위가 D2로 표현되는 구조적 도메인을 포함하고, D2가 서열번호 41 내지 46에 제시된 아미노산 서열과 적어도 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 ACE2 단백질 디코이:
    RASEAAKRX₅₉AX₆₀AIRKAADAIX₆₁X₆₂AAKIAARA (서열번호 41), 여기서, X₅₉는 I 또는 V, X₆₀은 K 또는 R 또는 C, X₆₁은 A 또는 V 또는 C, 및 X₆₂는 E 또는 C임;
    RASEAAKR IAKAIRKAADAIAEAAKIAARA (서열번호 42);
    RASEAAKR IACAIRKAADAIAEAAKIAARA (서열번호 43);
    RASEAAKR IAKAIRKAAD AIACAAKIAA RA (서열번호 44);
    RASEAAKR VARAIRKAAD AIVEAAKIAA RA (서열번호 45);
    RASEAAKR VACAIRKAAD AIVEAAKIAA RA (서열번호 46).
67. 제61항에 있어서, 적어도 하나의 구조적 도메인(예를 들어, D1)은 서열번호 38에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 위치 1의 아미노산은 R이거나, 치환된 경우 A, C, E, F, G, I, K, L, M, P, S, T, V 또는 W(바람직하게는 C, E, F, G, K, L, M, P, S, T 또는 W)이고; 위치 2의 아미노산은 E이거나 치환된 경우 A, C, D, F, G, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는 A, G, K, M, V, W 또는 Y)이고; 위치 3의 아미노산은 A이거나 치환된 경우 C, E, G, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y(바람직하게는 C, K, P, Q, 또는 V)이고; 위치 4의 아미노산은 A이거나 치환된 경우 D, E, G, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V 또는 W(바람직하게는 E, N, T, V, 또는 W)이고; 위치 5의 아미노산은 E이거나 치환된 경우 C, D, G, K, L, Q, R, S, T, V, W 또는 Y(바람직하게는 C, D, Q, S, V, W, 또는 Y)이고; 위치 6의 아미노산은 A이거나 치환된 경우 C, D, E, G, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는 D, K, P, R, V 또는 Y)이고; 위치 7의 아미노산은 L이거나 치환된 경우 A, C, F, I, M, Q, S, T 또는 V(바람직하게는 T)이고; 위치 8의 아미노산은 A이거나 치환된 경우 C, D, E, F, G, H, I, K, Q, L, M, R, S, T, V, 또는 W(바람직하게는 D, E, G, H, I, L, Q, R, S, V, 또는 W)이고; 위치 9의 아미노산은 E이거나 치환된 경우 A, C, D, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, V, W 또는 Y(바람직하게는 A, D, H, L, M, N, R, S 또는 V)이고; 위치 10의 아미노산은 A이거나 치환된 경우 C, G, L, M, Q, S, T, V, 또는 W(바람직하게는 C, G, M 또는 S)이고; 위치 11의 아미노산은 A이거나 치환된 경우 C, D, G, L, M, N, Q, R, S, T 또는 V(바람직하게는 C, G, M, S, T 또는 V)이고; 위치 12의 아미노산은 R이거나 치환된 경우 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는 A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, V, W, 또는 Y)이고; 위치 13의 아미노산은 A이거나 치환된 경우 C, D, E, F, G, H, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는 D, E, K, M, R, S 또는 V)이고; 위치 14의 아미노산은 M이거나 치환된 경우 A, C, D, E, G, H, I, K, L, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는 A, C, D, E, G, K, R, S, T, V 또는 Y)이고; 위치 15의 아미노산은 K이거나 치환된 경우 A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는 E, G, H, M, R, S, 또는 Y)이고; 위치 16의 아미노산은 E이거나 치환된 경우 A, C, D, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y(바람직하게는 A, C, D, G, K, L, M, Q, T, V 또는 W)이고; 위치 17의 아미노산은 A이거나 치환된 경우 C, G, P, S, T 또는 V(바람직하게는 C, G 또는 T)이고; 위치 18의 아미노산은 L이거나 치환된 경우 C, F, H, I, K, M, N, Q, R, T, V, W 또는 Y(바람직하게는 C, F, H 또는 V); 위치 19의 아미노산은 E이거나 치환된 경우 A, C, D, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y(바람직하게는 A, C, F, G, L, Q, R, S, T, V, 또는 Y)이고; 위치 20의 아미노산은 I이거나 치환된 경우 A, C, D, E, F, G, H, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W 또는 Y(바람직하게는 C, E, G, L, Q, R, S, T, V, 또는 Y)이고; 위치 21의 아미노산은 I이거나 치환된 경우 A, C, D, E, F, G, K, L, M, N, Q, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는 A, C, D, F, L, M, N, S, T, V 또는 Y)이고; 위치 22의 아미노산은 R이거나 치환된 경우 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, S, T, V, Y 또는 W(바람직하게는 A, C, D, E, F, G, I, L, M, Q, S, T, V, 또는 Y)이고; 위치 23의 아미노산은 E이거나 치환된 경우 A, C, D, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는 A, C, D, F, H, I, M, N, P, T, 또는 W)이고; 위치 24의 아미노산은 I이거나 치환된 경우 A, C, E, F, G, H, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V 또는 Y(바람직하게는 C, S, T 또는 V)이고; 위치 25의 아미노산은 A이거나 치환된 경우 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는 D, G, H, I, M, N, S, V, 또는 Y); 위치 26의 아미노산은 E이거나 치환된 경우 A, C, D, F, G, H, I, K, L, M, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는 C, F, I, L, S, T 또는 Y)이고; 위치 27의 아미노산은 K이거나 치환된 경우 A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는 C, D, E, F, G, H, M, N, S, 또는 Y)이고; 적어도 하나의 구조적 도메인(예를 들어, D2)은 서열번호 42에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서, 위치 1의 아미노산은 R이거나 치환된 경우 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는 A, C, D, E, H, K, L, N, Q, S, 또는 Y)이고; 위치 2의 아미노산은 A이거나 치환된 경우 C, G, I, L, M, N, P, Q, S, T, V 또는 Y(바람직하게는 C, M, Q, T 또는 V)이고; 위치 3의 아미노산은 S이거나 치환된 경우 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는 C, E, F, G, I, L, M, Q, 또는 R)이고; 위치 4의 아미노산은 E이거나 치환된 경우 A, C, D, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y(바람직하게는 C, D, I, N, S, 또는 W)이고; 위치 5의 아미노산은 A이거나 치환된 경우 C, D, E, F, G, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W 또는 Y(바람직하게는 D, E, I, M 또는 Y)이고; 위치 6의 아미노산은 A이거나 치환된 경우 C, F, G, S 또는 T(바람직하게는 C 또는 S)이고; 위치 7의 아미노산은 K이거나 치환된 경우 A, C, D, E, G, H, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는 A, C, D, E, G, H, L, M, R, S, T, V, W 또는 Y)이고; 위치 8의 아미노산은 R이거나 치환된 경우 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, S, T, V, W 또는 Y(바람직하게는 A, C, D, E, G, H, L, M, Q, S, T, V 또는 Y)이고; 위치 9의 아미노산은 I이거나 치환된 경우 A, C, F, G, K, L, M, Q, S, T, V, W 또는 Y(바람직하게는 A, C, F, G, L, M, S, T, W 또는 Y)이고; 위치 10의 아미노산은 A이거나, 또는 치환된 경우 D, G, T 또는 V(바람직하게는 D, G 또는 V)이고; 위치 11의 아미노산은 K이거나 치환된 경우 A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는 A, C, D, E, F, G, H, L, M, Q, R, S, V, W, 또는 Y)이고; 위치 12의 아미노산은 A이거나 치환된 경우 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W 또는 Y(바람직하게는 E, G, I, S, 또는 T)이고; 위치 13의 아미노산은 I이거나 치환된 경우 A, C, D, E, F, G, H, L, M, N, Q, S, T, V, 또는 Y(바람직하게는 A, C, D, F, G, L, M, N, Q, S, T 또는 V)이고; 위치 14의 아미노산은 R이거나 치환된 경우 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, S, T, V, W 또는 Y(바람직하게는 F, H, K, L, N, V, 또는 W)이고; 위치 15의 아미노산은 K이거나 치환된 경우 A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는 A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y)이고; 위치 16의 아미노산은 A이거나 치환된 경우 C, F, G, M, P, S, T, V 또는 Y(바람직하게는 G, T 또는 Y)이고; 위치 17의 아미노산은 A이거나 치환된 경우 C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W 또는 Y(바람직하게는 G, T 또는 V)이고; 위치 18의 아미노산은 D이거나 치환된 경우 A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는 A, F, G, I, L, N, R, S, T, W, 또는 Y)이고; 위치 19의 아미노산은 A이거나 치환된 경우 C, D, E, F, G, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y(바람직하게는 G, K, M, Q, S, 또는 T)이고; 위치 20의 아미노산은 I이거나 또는 치환된 경우 A, C, F, G, H, L, M, Q, T, V, W 또는 Y(바람직하게는 G, L, M, T, V 또는 Y)이고; 위치 21의 아미노산은 A이거나 치환된 경우 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, Y, 또는 W(바람직하게는 D, E, G, I, K, M, N, Q, S, T, V, W, 또는 Y)이고; 위치 22의 아미노산은 E이거나 치환된 경우 A, C, D, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는 A, D, G, K, M, P, S, T, V, W, 또는 Y)이고; 위치 23의 아미노산은 A이거나, 또는 치환된 경우 C, G, N, S, T 또는 V(바람직하게는 G, S 또는 T)이고; 위치 24의 아미노산은 A이거나 치환된 경우 C, D, E, G, K, M, N, S, T 또는 V(바람직하게는 C, G 또는 T)이고; 위치 25의 아미노산은 K이거나 치환된 경우 A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는 A, C, D, E, G, I, L, P, Q, R, S, V, W, 또는 Y)이고; 위치 26의 아미노산은 I이거나 치환된 경우 A, C, D, E, F, G, H, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는 C, D, E, K, L, M, P, Q, R, S, 또는 V)이고; 위치 27의 아미노산은 A이거나 치환된 경우 C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y(바람직하게는 F, G, M, N, S, T 또는 V)이고; 위치 28의 아미노산은 A이거나 치환된 경우 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, Y, 또는 W(바람직하게는 C, D, E, G, H, Q, S, T, V, 또는 Y)이고; 위치 29의 아미노산은 R이거나 치환된 경우 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는 A, C, D, G, H, I, K, L, M, N, P, S, T, V, W, 또는 Y)이고; 위치 30의 아미노산은 A이거나 치환된 경우 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y(바람직하게는 C, D, G, H, K, N, P, Q, R, S, T, 또는 V)인 것을 포함하고; 여기서, 위치 넘버링은 서열번호 38에 따른 것인, ACE2 단백질 디코이.
68. 제1항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, H1이 하기 아미노산 서열을 포함하는 것인 ACE2 단백질 디코이:
    SX₁X₂X₃EQX₄X₅TFX₆DKX₇X₈HEX₉EDX₁₀X₁₁YQX₁₂X₁₃L (서열번호 4).
69. 제1항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, H1이 하기 아미노산 서열을 포함하는 것인 ACE2 단백질 디코이:
    X₂X₃EQX₄X₅TFX₆DKX₇X₈HEX₉EDX₁₀X₁₁YQX₁₂X₁₃L (서열번호 176).
70. 제68항에 있어서, 서열번호 4에 하기 치환 중 하나 이상이 이루어지고: S1I; E5D; E5Q; E5V; D12V, D12E; Q24K; 및 Q24L; 여기서, 언급된 위치는 서열번호 4의 넘버링에 따른 것인, ACE2 단백질 디코이.
71. 제69항에 있어서, 서열번호 176에 하기 치환 중 하나 이상이 이루어지고; E3D; E3Q; E3V; D10V, D10E; Q22K; 및 Q22L; 여기서 언급된 위치는 서열번호 176의 넘버링에 따른 것인, ACE2 단백질 디코이.
72. 제1항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 5에 다음 치환이 이루어지고: E15G; 여기서, 언급된 위치는 서열번호 4의 넘버링에 따른 것인, ACE2 단백질 디코이.
73. 제1항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 포함하는 ACE2 단백질 디코이:
    VLEQLKTFADKAFHEMEDRFYQAAL (서열번호 177) 또는
    VLEQLKTFADKAFHEMEDLFYQAAL (서열번호 199)에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 H1 도메인;
    NAENAARKAKEFAEEQAKLADMY (서열번호 21)에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 H2 도메인; 및
    AEIDLGKGDFREI (서열번호 29) 또는 VEIDLGKGDFREI (서열번호 200)에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 H3 도메인.
74. 제73항에 있어서, 하기를 포함하는, ACE2 단백질 디코이:
    VLEQLKTFADKAFHEMEDRFYQAAL (서열번호 177) 또는
    VLEQLKTFADKAFHEMEDLFYQAAL (서열번호 199)에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 H1 도메인;
    NAENAARKAKEFAEEQAKLADMY (서열번호 21)에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 H2 도메인; 및
    AEIDLGKGDFREI (서열번호 29) 또는 VEIDLGKGDFREI (서열번호 200)에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 H3 도메인.
75. 제73항에 있어서, 하기를 포함하는 ACE2 단백질 디코이:
    아미노산 서열 VLEQLKTFADKAFHEMEDRFYQAAL (서열번호 177) 또는 VLEQLKTFADKAFHEMEDLFYQAAL (서열번호 199)을 포함하는 H1 도메인;
    아미노산 서열 NAENAARKAKEFAEEQAKLADMY (서열번호 21)을 포함하는 H2 도메인; 및
    아미노산 서열 AEIDLGKGDFREI (서열번호 29) 또는 VEIDLGKGDFREI (서열번호 200)을 포함하는 H3 도메인.
76. 제1항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 포함하는 ACE2 단백질 디코이:
    VLEQLKTFADKAFHEMEDRFYQAALAVFEAAEAAAG (서열번호 241) 또는 VLEQLKTFADKAFHEMEDLFYQAAL AVFEAAEAAAG (서열번호 243)에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 H1 도메인;
    GDAARNAENAARKAKEFAEEQAKLADMYAELAK (서열번호 244)에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 H2 도메인; 및
    SAEIDLGKGDFREIR (서열번호 245) 또는 SVEIDLGKGDFREIR (서열번호 246)에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 H3 도메인.
77. 제76항에 있어서, 하기를 포함하는 ACE2 단백질 디코이:
    VLEQLKTFADKAFHEMEDRFYQAALAVFEAAEAAAG (서열번호 241) 또는 VLEQLKTFADKAFHEMEDLFYQAAL AVFEAAEAAAG (서열번호 243)에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 H1 도메인;
    GDAARNAENAARKAKEFAEEQAKLADMYAELAK (서열번호 44)에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 H2 도메인; 및
    SAEIDLGKGDFREIR (서열번호 245) 또는 SVEIDLGKGDFREIR (서열번호 246)에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 H3 도메인.
78. 제76항에 있어서, 하기를 포함하는 ACE2 단백질 디코이:
    아미노산 서열 VLEQLKTFADKAFHEMEDRFYQAALAVFEAAEAAAG (서열번호 241) 또는 VLEQLKTFADKAFHEMEDLFYQAAL AVFEAAEAAAG (서열번호 243)을 포함하는 H1 도메인;
    아미노산 서열 GDAARNAENAARKAKEFAEEQAKLADMYAELAK (서열번호 44)를 포함하는 H2 도메인; 및
    아미노산 서열 SAEIDLGKGDFREIR (서열번호 245) 또는 SVEIDLGKGDFREIR (서열번호 246)을 포함하는 H3 도메인.
79. 제73항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, D1로 표현되는 구조적 도메인을 포함하고, 여기서 상기 D1 도메인은 REAAEALAEAARAMKEALEIIREIAEK (서열번호 38) 또는 REAAEALAEAARAMKEALEILREIAEK (서열번호 222)에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, ACE2 단백질 디코이.
80. 제73항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, D2로 표현되는 구조적 도메인을 포함하고, 여기서 D2는 RASEAAKR IAKAIRKAADAIAEAAKIAARA (서열번호 42)에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, ACE2 단백질 디코이.
81. 제1항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 디코이 단위에서 상기 2개의 알파 나선 도메인 H1 및 H2와 베타 헤어핀 도메인 H3의 순서가 H3, H2, 및 H1인, ACE2 단백질 디코이.
82. 제1항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 디코이 단위에서 상기 알파 나선 도메인 H1 및 H2와 베타 헤어핀 도메인 H3의 순서가 H1, H3, 및 H2인, ACE2 단백질 디코이.
83. 제1항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 디코이 단위가 상기 도메인들 사이에 적어도 하나의 링커(X_L)를 포함하고, 상기 적어도 하나의 링커(X_L), 또는 각 링커(X_L)는 1-100, 1-90, 1-80, 1-70, 1-60, 1-50, 1-40, 1-30, 1-20, 1-10, 또는 1-5개의 아미노산을 포함하는, ACE2 단백질 디코이.
84. 제83항에 있어서, 각 링커(X_L)가 1-20, 1-10, 또는 1-5개 아미노산을 포함하는, ACE2 단백질 디코이.
85. 제83항 또는 제84항에 있어서, 상기 디코이 단위에서 알파 나선 도메인 H1 및 H2와 베타 헤어핀 도메인 H3의 순서가 H3, H2, 및 H1이고, 상기 디코이 단위는 H3과 H2 사이에 제1 링커 및 H2와 H1 사이에 제2 링커를 포함하거나; 또는 상기 순서가 H1, H3, 및 H2이고, 상기 디코이 단위가 H1과 H3 사이에 제1 링커 및 H3과 H2 사이에 제2 링커를 포함하는 것인, ACE2 단백질 디코이.
86. 제1항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 디코이 단위가 서열번호 47-90, 104-172, 184-193, 224-239, 255-260, 또는 265-266에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 여기서 각 X_L은 독립적으로 아미노산 링커인 것인, ACE2 단백질 디코이.
87. 제86항에 있어서, 위치 88의 아미노산이 A, F, I, L, M, P 또는 V로부터 선택되고, 여기서 위치 넘버링은 서열번호 47-90, 104-172, 184-187, 189-192 또는 224-239 중 어느 하나에 따른 것인, ACE2 단백질 디코이.
88. 제86항 또는 제87항에 있어서, 위치 137의 아미노산이 F, D, E, G, K, N, P, Q, R, S, 또는 T로부터 선택되고, 여기서 위치 넘버링은 서열번호 47-90, 104-172, 184-187, 189-192 또는 224-239 중 어느 하나에 따른 것인, ACE2 단백질 디코이.
89. 제86항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 위치 11의 아미노산이 시스테인이면, 위치 6의 아미노산이 L, 및/또는 위치 126의 아미노산이 L, 및/또는 위치 124의 아미노산이 S이며; 여기서 위치 넘버링은 서열번호 47-90, 104-172, 184-187, 189-192 또는 224-239 중 어느 하나에 따른 것인, ACE2 단백질 디코이.
90. 제86항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 위치 8, 9, 10, 91, 94, 98, 102, 105, 106, 109, 112, 113, 123, 127, 128, 131, 132, 134, 138, 139, 141, 142, 145, 146 또는 149의 아미노산 중 4개 이하가 치환되고, 여기서 위치 넘버링은 서열번호 47-90, 104-172, 184-187, 189-192 또는 224-239 중 어느 하나에 따른 것인, ACE2 단백질 디코이.
91. 제86항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 위치 8, 9, 10, 91, 94, 98, 102, 105, 106, 109, 112, 113, 123, 127, 128, 131, 132, 134, 138, 139, 141, 142, 145, 146 또는 149의 아미노산 중 3개 이하가 치환되고, 여기서 위치 넘버링은 서열번호 47-90, 104-172, 184-187, 189-192 또는 224-239 중 어느 하나에 따른 것인, ACE2 단백질 디코이.
92. 제86항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 위치 8, 9, 10, 91, 94, 98, 102, 105, 106, 109, 112, 113, 123, 127, 128, 131, 132, 134, 138, 139, 141, 142, 145, 146 또는 149의 아미노산 중 2개 이하가 치환되고, 여기서 위치 넘버링은 서열번호 47-90, 104-172, 184-187, 189-192 또는 224-239 중 어느 하나에 따른 것인, ACE2 단백질 디코이.
93. 제86항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 위치 8, 9, 10, 91, 94, 98, 102, 105, 106, 109, 112, 113, 123, 127, 128, 131, 132, 134, 138, 139, 141, 142, 145, 146 또는 149의 아미노산 중 1개 이하가 치환되고, 여기서 위치 넘버링은 서열번호 47-90, 104-172, 184-187, 189-192 또는 224-239 중 어느 하나에 따른 것인, ACE2 단백질 디코이.
94. 제86항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 위치 8, 9, 10, 91, 94, 98, 102, 105, 106, 109, 112, 113, 123, 127, 128, 131, 132, 134, 138, 139, 141, 142, 145, 146 또는 149의 아미노산 전부가 치환되지 않고, 여기서 위치 넘버링은 서열번호 47-90, 104-172, 184-187, 189-192 또는 224-239 중 어느 하나에 따른 것인, ACE2 단백질 디코이.
95. 제1항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ACE2 단백질 디코이는 100-800개 아미노산, 100-500개 아미노산, 또는 100-400개 아미노산, 또는 100-350개 아미노산, 또는 100-300개 아미노산, 또는 100-250개 아미노산, 또는 100-200개 아미노산, 또는 150-500개 아미노산, 또는 150-400개 아미노산, 또는 150-350개 아미노산, 또는 150-300개 아미노산, 또는 150-250개 아미노산, 또는 150-200개 아미노산으로 이루어지는 것인, ACE2 단백질 디코이.
96. 제1항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 각 디코이 단위가 100-800개 아미노산, 100-500개 아미노산, 또는 100-400개 아미노산, 또는 100-350개 아미노산, 또는 100-300개 아미노산, 또는 100-250개 아미노산, 또는 100-200개 아미노산, 또는 150-500개 아미노산, 또는 150-400개 아미노산, 또는 150-350개 아미노산, 또는 150-300개 아미노산, 또는 150-250개 아미노산, 또는 150-200개 아미노산으로 이루어지는 것인, ACE2 단백질 디코이.
97. 제1항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ACE2 단백질 디코이가 ACE2(서열번호 1)에 대해 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 또는 35% 이하의 서열 동일성을 갖는 것인, ACE2 단백질 디코이.
98. 제1항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 각 디코이 단위가 ACE2(서열번호 1)에 대해 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 또는 35% 이하의 서열 동일성을 갖는 것인, ACE2 단백질 디코이.
99. 제1항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 코로나바이러스가 SARS-CoV-2인, ACE2 단백질 디코이.
100. 제1항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 ACE2에 대한 코로나바이러스의 결합을 50% 초과, 60% 초과, 70% 초과, 80% 초과, 또는 90% 초과로 차단하는, ACE2 단백질 디코이.
101. 제1항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포 내로 코로나바이러스의 진입을 저해하거나 방지하는, ACE2 단백질 디코이.
102. 제1항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포의 코로나바이러스의 바이러스 감염성을 감소시키는 ACE2 단백질 디코이.
103. 제1항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 생물층 간섭계에서 결정된 것으로서, 상기 코로나바이러스 스파이크 단백질에 대해 약 20 nm 미만, 또는 약 15 nM 미만의 Kd를 갖는, ACE2 단백질 디코이.
104. 제1항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 생물층 간섭계에서 결정된 것으로서, 상기 코로나바이러스 스파이크 단백질에 대해 약 5 nM 미만의 Kd를 갖는, ACE2 단백질 디코이.
105. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, ACE2와 상기 스파이크 단백질의 상호작용을 50, 40, 30, 20, 10, 또는 5 nM 이하의 IC₅₀으로 저해하는 ACE2 단백질 디코이.
106. 제1항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 디코이 단위가 0-4개의 시스테인 아미노산 또는 0-2개의 시스테인 아미노산을 포함하는 것인 ACE2 단백질 디코이.
107. 제1항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 1-4개의 아미노산이 시스테인으로 치환된 것인, ACE2 단백질 디코이.
108. 제1항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 디코이 단위가 하나의 시스테인 아미노산을 포함하는 것인, ACE2 단백질 디코이.
109. 제106항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시스테인 아미노산이 알킬화된 것인 ACE2 단백질 디코이.
110. 제106항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시스테인이 H1, H2, 및 H3의 단백질 폴딩 및 결합-적격 제시를 용이하게 하는 하나 이상의 구조적 도메인에 있는 것인, ACE2 단백질 디코이.
111. 제1항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ACE2 단백질 디코이가 안정화 화합물에 연결된 것인, ACE2 단백질 디코이.
112. 제111항에 있어서, 상기 안정화 화합물이 항체의 Fc 영역인, ACE2 단백질 디코이.
113. 제112항에 있어서, 상기 Fc 영역이 상기 ACE2 단백질 디코이와의 해독 융합체인 ACE2 단백질.
114. 제1항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ACE2 단백질 디코이가 ACE2 단백질 디코이의 시스테인에서 안정화 화합물에 연결된 것인, ACE2 단백질 디코이.
115. 제107항 또는 제114항에 있어서, 상기 안정화 화합물이 PEG 분자인, ACE2 단백질 디코이.
116. 제115항에 있어서, 상기 PEG 분자가 상기 단백질의 시스테인에서 상기 ACE2 단백질 디코이에 연결된 것인, ACE2 단백질 디코이.
117. 제116항에 있어서, 상기 PEG 분자가 말레이드 기를 통해 상기 단백질의 시스테인에서 상기 ACE2 단백질 디코이에 연결된 것인, ACE2 단백질 디코이.
118. 제1항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ACE2 단백질 디코이가 1, 2, 3, 4개 이상의 디코이 단위를 포함하는 것인, ACE2 단백질 디코이.
119. 제118항에 있어서, 상기 ACE2 단백질 디코이가 2개 이상의 디코이 단위를 포함하고, 제1 디코이 단위의 C 말단이 제2 디코이 단위의 N 말단에 연결된 것인, ACE2 단백질 디코이.
120. 제118항 또는 제119항에 있어서, 상기 ACE2 단백질 디코이는 2개 이상의 디코이 단위를 포함하고 상기 2개 이상의 디코이 단위는 상이한 것인, ACE2 단백질 디코이.
121. 제118항 또는 제119항에 있어서, 상기 ACE2 단백질 디코이가 2개 이상의 디코이 단위를 포함하고 상기 2개 이상의 디코이 단위가 동일한 것인, ACE2 단백질 디코이.
122. 제118항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ACE2 단백질 디코이가 2개 이상의 디코이 단위를 포함하고, 상기 ACE2 단백질 디코이가 서열번호 91-95, 194-197, 223 또는 261-263에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인, ACE2 단백질 디코이.
123. 제122항에 있어서, 상기 ACE2 단백질 디코이가 환형화된 것인, ACE2 단백질 디코이.
124. 제1항 내지 제123항 중 어느 한 항의 ACE2 단백질 디코이 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물.
125. 제1항 내지 제123항 중 어느 한 항에 제시된 ACE2 단백질 디코이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
126. 제125항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
127. 제126항의 벡터를 포함하는 단리된 숙주 세포.
128. 제1항 내지 제123항 중 어느 한 항의 ACE2 단백질 디코이를 발현하는 단리된 숙주 세포.
129. ACE2 단백질 디코이를 발현시키기에 적합한 조건 하에 제127항 또는 제128항의 숙주 세포를 인큐베이션하는 것을 포함하는 ACE2 단백질 디코이를 생산하는 방법.
130. 제129항에 있어서, 상기 ACE2 단백질 디코이를 단리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
131. 코로나바이러스 감염을 예방하는 방법으로서, 제1항 내지 제123항 중 어느 한 항의 ACE2 단백질 디코이 또는 제124항의 약제학적 조성물을 코로나바이러스 감염 예방을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
132. 코로나바이러스 감염의 적어도 하나의 증상을 예방, 치료 또는 호전시키는 방법으로서, 제1항 내지 제123항 중 어느 한 항의 ACE2 단백질 디코이 또는 제124항의 약제학적 조성물을 코로나바이러스 감염의 적어도 하나의 증상의 예방, 치료 또는 호전을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
133. 코로나바이러스 감염의 적어도 하나의 증상을 예방, 치료 또는 호전시키는 방법으로서, 제1항 내지 제123항 중 어느 한 항의 ACE2 단백질 디코이를 암호화하는 핵산을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
134. 제132항 또는 제133항에 있어서, 상기 적어도 하나의 증상 또는 징후가 폐의 염증, 폐포 손상, 바이러스 부하, 발열, 기침, 호흡 부족, 폐렴, 설사, 기관 부전 및 패혈성 쇼크로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
135. 제131항 내지 제134항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물 또는 ACE2 단백질 디코이 또는 ACE2 단백질 디코이를 암호화하는 핵산은 이를 필요로 하는 상기 대상체에게 예방적으로 또는 치료적으로 투여되는 것인 방법.
136. 제131항 내지 제134항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물 또는 ACE2 단백질 디코이 또는 ACE2 단백질 디코이를 암호화하는 핵산이 제2 치료제와 조합으로 투여되는 것인 방법.
137. 제136항에 있어서, 상기 제2 치료제가 항염증 약물(예컨대, 코르티코스테로이드 및 비스테로이드성 항염증 약물), 항바이러스 약물, 항생제, 항산화제와 같은 식이 보충제, 및 코로나바이러스 감염을 치료하기 위한 임의의 다른 완화 요법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
138. 제136항 또는 제137항에 있어서, 상기 제2 치료제가 사이토카인 방출 증후군을 치료하는 데 사용된 약물인 방법.
139. 제123항, 제124항, 제131항, 제132항 또는 제134항 내지 제138항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물 또는 상기 ACE2 단백질 디코이가 전신 투여되는 것인 방법.
140. 제123항, 제124항, 제131항, 제132항 또는 제134항 내지 제138항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물 또는 상기 ACE2 단백질 디코이가 국소적으로 투여되는 것인 방법.
141. 제140항에 있어서, 상기 약제학적 조성물 또는 상기 ACE2 단백질 디코이가 흡입을 통해 폐로 투여되는 것인 방법.
142. 제131항 내지 제141항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 감염이 SARS-CoV-2에 의해 유발되는 것인 방법.
143. 생물학적 샘플을 제1항 내지 제122항 중 어느 한 항의 ACE2 단백질 디코이와 접촉시키는 단계 및 상기 생물학적 샘플에서 코로나바이러스 스파이크 단백질을 검출하는 단계를 포함하는, 생물학적 샘플에서 코로나바이러스 스파이크 단백질 SARS-CoV-2-S를 검출하는 방법.
144. 코로나바이러스 ACE2-결합 스파이크 단백질 SARS-CoV-2-S에 특이적으로 결합하는 ACE2 단백질 디코이로서, 상기 ACE2 단백질 디코이는 서열번호 47-95, 104-172, 184-197, 223-239, 255-263, 또는 264-265에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 각각의 X_L은 독립적으로 아미노산 링커인 것인 ACE2 단백질 디코이.

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