JP5969469B2 - インスリン受容体に対して高い活性を示す単鎖インスリンアゴニスト - Google Patents

インスリン受容体に対して高い活性を示す単鎖インスリンアゴニスト Download PDF

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Description
インスリンは、子供の頃に始まる糖尿病や後の成人で始まる糖尿病に有効な治療法である。そのペプチドは、プロインスリンと呼ばれる、活性の低い（天然インスリンの約２−９％）、巨大な一本の前駆体として生合成できる。プロインスリンは、３５残基の結合ペプチド（Ｃペプチド）の選択的除去によって、インスリンにタンパク分解的に変換される。結果としてできる、インスリンＡ鎖（配列番号１）とＢ鎖（配列番号２）の間でのジスルフィド結合によって形成されるヘテロ２本鎖は、合計で５１アミノ酸からなるが、インスリン受容体に高い活性を有する（ｎＭのオーダー）。天然インスリンは、関連したインスリン様増殖因子１受容体に比較して、インスリン受容体に対し、約百倍の選択的親和性を有する。しかし、Ａ及びＢと呼ばれる二つの異なったインスリン・アイソフォームに対しては、ほとんど選択性を有しない。
インスリン様増殖因子１及び２は、Ａ鎖及びＢ鎖の配列と高い相同性を有する単鎖直鎖状ペプチドホルモンであって、天然インスリンと約５０％の相同性を有する、ＩＧＦのＡ鎖及びＢ鎖はＣペプチドによって結合している。ここで、二つのＩＧＦのＣペプチドは、大きさと配列に違いがある。最初の方の長さは１２アミノ酸であり、二つ目の方の長さは８アミノ酸である。ヒトＩＧＦ−１は配列番号３に示したタンパク配列を有する７０アミノ酸からなる塩基性のタンパク質であり、プロインスリンと４３％の相同性を有する（Rinderknecht et al. (1978) J. Biol. Chem. 253:2769-2776）。ヒトＩＧＦ−２は、配列番号４に示したタンパク配列を有する６７アミノ酸からなる塩基性のタンパク質である。ＩＧＦは、Ａ型インスリン受容体・アイソフォームより、Ｂ型インスリン受容体・アイソフォームに対して、かなり活性が低いことが証明されている。
出願人は、以前、ＩＧＦ−１系のインスリンペプチド類縁体を同定した。そこでは、Ｂ鎖の天然のGln-PheジペプチドをTyr-Leuと置換されている（PCT/US2009/068713 を参照のこと。当開示を本願に援用する）。そのような類縁体（以後、IGF YL類縁体ペプチドと呼ぶ）は、インスリンより容易に合成でき、インスリンやＩＧＦ−１に対する受容体に対するコアゴニスト類縁体や選択的インスリン受容体特異的類縁体を開発させた。さらに、これらのインスリン類縁体はまた、本開示に従って、単鎖インスリンアゴニストとして処方することができる。
インスリンＡ鎖及びＢ鎖を含む単鎖インスリン類縁体は、これまでにも調製されている（EP 1,193,272 and US 2007/0129284参照）。しかしながら、以前開示された単鎖インスリン類縁体は、インスリン受容体に低い活性しか示さない、および／またはＩＧＦ−１受容体には高い活性を示すという欠点がある。インスリンＢペプチド及びＡペプチドを橋渡しする結合ペプチドとしてＩＧＦ−１Ｃペプチドまたはその類縁体を挿入することによって、単鎖で高活性のインスリンアゴニストを調製することができるという発見に基づいて、本発明の化合物は、調製することができる。Ｃペプチドの配列において、個々のアミノ酸の選択的変異によって、ＩＧＦ−１受容体に比べ、インスリンに高い選択性を有するペプチドを得ることができる。
その上、単鎖インスリンアゴニストの調製は、インスリンやインスリン類縁体の二次構造を促進するようであって、生物物理的安定性、治療範囲、in vivoでの薬理効果の改善をもたらす。インスリンの薬理効果は、グルコース感受性ではなく、インスリンの投与は、生命を脅かす低血糖に繋がる過剰な作用に至ることがある。低血糖を起こさないで血糖値を正常化するのが極端に難しいというように、矛盾する薬理効果は、インスリン治療法の特徴である。その上、天然インスリンは、作用の持続が短く、基礎ブドウ糖をコントロールの使用に適合させるためには、修飾が必要になる。単鎖インスリン類縁体ペプチドは、プロドラッグ化学の利用を通じて改善された治療範囲、アルブミンなどの血漿タンパク質の結合や、ＰＥＧ化やアシル化を含むその他の修飾によって延長された作用期間をもたらすことが予見されるさらなる構造促進、グリコシレーションによる促進された物理的安定性、そして、コレステロールやビタミン様置換基での化学的修飾を使用した好ましい組織ターゲッティングに適している。Ｃペプチドリンカーを用いる単鎖インスリン類縁体の調製はまた、これらの化学的修飾の多くを配置できる、新規な構造的な場所を与えてくれる。そのような最適化したインスリンアゴニストの主要な用途は、インスリン依存的な糖尿病の治療であるだろう。
本明細書で開示するように、本出願人らは、高活性の単鎖インスリン類縁体を発見した。特に、一実施形態では、ＩＧＦ−１受容体に比してインスリン受容体に対する選択性が高い高活性単鎖インスリンアゴニストポリペプチドが提供される。一実施形態によれば、単鎖インスリン類縁体アゴニストは、ヒトインスリンのＢ鎖およびＡ鎖あるいは、それらの類縁体または誘導体を有し、Ｂ鎖のカルボキシ末端は、橋渡し部分を介してＡ鎖のアミノ末端に結合している。一実施形態では、Ｂ鎖は、（天然のインスリンのＢ鎖に対する位置で）アミノ酸Ｂ２６〜Ｂ３０が除去されたＣ末端側が短縮されたＢ鎖である。この実施形態では、Ｂ鎖のＢ２５アミノ酸のカルボキシ末端は、橋渡し部分の第１の端に直接結合し、橋渡し部分の第２の端は、Ａ鎖のＡ１アミノ酸のアミノ末端に直接結合する。直鎖状の単鎖インスリン類縁体がＣ末端側が短縮されたＢ鎖を有し、橋渡し部分がペプチドである一実施形態では、橋渡し部分は、少なくとも８アミノ酸長であるが、１７アミノ酸長以下である。直鎖状の単鎖インスリン類縁体が全長Ｂ鎖を有し、橋渡し部分がペプチドである実施形態では、橋渡し部分は、少なくとも８アミノ酸長であるが、１２アミノ酸長以下である。
一実施形態によれば、橋渡し部分は、
ａ）６〜１６個のモノマー単位からなるポリエチレングリコール
ｂ）配列Ｘ５１Ｘ５２Ｘ５３Ｘ５４Ｘ５５Ｘ５６Ｘ５７Ｘ５８（配列番号９）を有する、少なくとも８アミノ酸長かつ１７アミノ酸長以下の非天然のインスリンまたはＩＧＦアミノ酸配列またはその擬似ペプチド
ｃ）前記ポリエチレングリコールと、１〜４個のアミノ酸からなる短縮されたアミノ酸配列との組み合わせを有し、
Ｘ５１は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニンからなる群から選択され、
Ｘ５２は、チロシン以外のアミノ酸であり、
Ｘ５３からＸ５６は各々独立に、アミノ酸であり、
Ｘ５７およびＸ５８は独立に、アルギニン、オルニチン、リジンからなる群から選択される。橋渡し部分は、非天然のアミノ酸のみならず、逆反転断片を含むものであってもよいし、アザペプチド結合（ＣＯがＮＨで置換）または擬似ペプチド結合（たとえばＮＨがＣＨ２で置換）などの非ペプチド結合あるいはエステル結合（たとえば、１つまたは２つ以上のアミド（−ＣＯＮＨＲ−）結合がエステル（ＣＯＯＲ）結合で置換されたデプシペプチド）の取り込みを含むものであってもよい。橋渡し部分がアミノ酸配列を有する場合、標記のアミノ酸が、標記のアミノ酸の誘導体（たとえばチロシン残基のニトロ基またはチロシン残基のヨウ素などのアミノ酸に対する化学修飾あるいは、遊離カルボン酸基からエステル基またはアミド基への変換あるいは、アミノ基をアシル化によってアミドに変換すること、ヒドロキシ基をアシル化してエステルにすること、あるいは、第１級アミンをアルキル化して第２級アミンにすること、あるいは、親水体をアミノ酸側鎖に結合することなど）も包含することを意図している。アミノ酸側鎖の酸化または還元によって、他の誘導体も得られる。
一実施形態では、単鎖インスリン類縁体は、Ｂ鎖のＮ末端または橋渡し部分のアミノ酸の側鎖に結合した親水体を有する。特に、一実施形態では、単鎖インスリンアゴニスト類縁体は、一般構造Ｂ−ＬＭ−Ａを有し、ＢはインスリンのＢ鎖を表し、ＡはインスリンのＡ鎖を表し、ＬＭは、Ｂ鎖のカルボキシ末端をＡ鎖のアミノ末端に結合している橋渡し部分を表す。この場合、橋渡し部分は、橋渡し部分のアミノ酸の側鎖および／またはＢ鎖のＮ末端のαアミン（インスリン系Ｂ鎖ではＢ１の位置、ＩＧＦ−１系Ｂ鎖ではＢ２の位置）またはＡ鎖のＡ９、Ａ１４、Ａ１５からなる群から選択される位置またはＢ鎖の位置Ｂ１、Ｂ２、Ｂ１０、Ｂ２２、Ｂ２８またはＢ２９におけるアミノ酸の側鎖に結合した親水体をさらに有する。一実施形態では、親水体は、Ｂ鎖のＮ末端のαアミンに結合する（すなわち、インスリンの番号付けのスキームを使用して、インスリンでは位置Ｂ１またはＩＧＦインスリンアゴニストではＢ２の位置）。一実施形態では、親水体はポリエチレン鎖であり、別の実施形態では、ポリエチレン鎖は橋渡し部分のアミノ酸の側鎖に共有結合している。一実施形態では、橋渡し部分（ＬＭ）は、１７アミノ酸長以下のアミノ酸配列を有し、配列Ｘ５１Ｘ５２Ｘ５３Ｘ５４Ｘ５５Ｘ５６Ｘ５７Ｘ５８（配列番号９）を有する。ここで、
Ｘ５１は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニンからなる群から選択され、
Ｘ５２は、チロシン以外のアミノ酸であり、
Ｘ５３からＸ５６は各々独立に、アミノ酸であり、
Ｘ５７およびＸ５８は独立に、アルギニン、リジン、システイン、ホモシステイン、アセチル−フェニルアラニンまたはオルニチンである。一実施形態では、橋渡し部分（ＬＭ）は、配列Ｘ５１Ｘ５２ＧＳＳＳＸ５７Ｘ５８（配列番号２９）またはＸ５１Ｘ５２ＧＳＳＳＸ５７Ｘ５８ＡＰＱＴ（配列番号４６）を有し、Ｘ５７またはＸ５８で記載されるアミノ酸は、その位置でアミノ酸の側鎖に結合した親水体をさらに有する。一実施形態では、親水体はポリエチレングリコール鎖である。
一実施形態では、橋渡し部分は、配列ＧＹＧＳＳＳＸ５７Ｘ５８（配列番号８５）またはＧＹＧＳＳＳＸ５７Ｘ５８ＡＰＱＴ；（配列番号３７）を有する８〜１７個のアミノ酸からなる配列またはその擬似ペプチドを有し、
ここで、
Ｘ５７およびＸ５８は独立に、アルギニン、リジンまたはオルニチンである。一実施形態では、親水体は、配列番号３７または８５を有する橋渡し部分の８番目の位置にあるアミノ酸の側鎖に結合している。
一実施形態では、橋渡し部分は、
１）６〜１６個のモノマー単位からなる直鎖状ポリエチレングリコール鎖
２）配列Ｘ５１Ｘ５２Ｘ５３Ｘ５４Ｘ５５Ｘ５６ＲＲ（配列番号１０）を有する、少なくとも８アミノ酸長かつ１２アミノ酸長以下のアミノ酸配列または
３）前記ポリエチレングリコール鎖とアミノ酸配列との組み合わせを有する。別の実施形態では、橋渡し部分は、（Ｙ１）ｋ−Ｘ５１ＡＸ５３Ｘ５４Ｘ５５Ｘ５６ＲＲ（Ｙ２）ｎ（配列番号２３）、（Ｙ２）ｋ−ＧＹＧＳＳＳＸ５７Ｒ（配列番号５１）、
Figure 0005969469
からなる群から選択され、
ここで、
Ｙ１は、Ｘ４６、Ｘ４６Ｘ４７、Ｘ４６Ｘ４７Ｘ４８、Ｘ４６Ｘ４７Ｘ４８Ｘ４９（配列番号２４）、Ｘ４６Ｘ４７Ｘ４８Ｘ４９Ｘ５０（配列番号１３）群から選択され、
Ｙ２は、Ｘ７０、Ｘ７０Ｘ７１、Ｘ７０Ｘ７１Ｘ７２、Ｘ７０Ｘ７１Ｘ７２Ｘ７３（配列番号１５）の群から選択され、
ｎは０または１であり、
ｋは０または１であり、
ｍは、７〜１６の範囲の整数であり、
Ｘ４６からＸ５０およびＸ７０からＸ７３は各々独立に、アミノ酸であり、
Ｘ５１は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニンからなる群から選択され、
Ｘ５２は、チロシン以外のアミノ酸であり、
Ｘ５３からＸ５６は各々独立に、アミノ酸であり、
Ｘ５７は、アルギニン、リジンまたはオルニチンである。
もうひとつの実施形態では、橋渡し部分は、８〜１６アミノ酸長の配列に近い比較的短い二官能性の非ペプチドポリマーリンカーである。一実施形態によれば、非ペプチドの橋渡し部分は、およそ４から２０、８から１８、８から１６、８から１４、８から１２、１０から１４、１０から１２または１１から１３のモノマーからなるポリエチレングリコールリンカーである。一実施形態では、Ｂ鎖のカルボキシ端の最後の５つのアミノ酸が欠失し、アミノ酸Ｂ２５が、少なくとも６であるが２０以下のモノマー単位または少なくとも８であるが１４以下のモノマー単位または少なくとも１０であるが１４以下のモノマー単位からなるポリエチレングリコール橋渡し部分（ＬＭ）を介してＡ鎖のアミノ酸Ａ１に結合した、単鎖インスリンアゴニストが提供される。一実施形態では、橋渡し部分は、合計１２のモノマーを有するポリエチレングリコールである。
一実施形態では、単鎖インスリン類縁体の橋渡し部分は、式Ｘ−Ｙの二官能性複合体であり、Ｘは非ペプチドリンカー（たとえば、ポリエチレングリコール）であり、Ｙはアミノ酸または２〜４個のアミノ酸からなるペプチドである。一実施形態では、天然のＢ鎖カルボキシ末端の最後の５つのアミノ酸が欠失し、アミノ酸Ｂ２５のカルボキシ末端がＸに直接結合し、ＹはインスリンのＡ鎖のアミノ末端に直接結合する。もうひとつの実施形態では、天然のＢ鎖カルボキシ末端のカルボキシ端の最後の５つのアミノ酸が欠失し、アミノ酸Ｂ２５が、少なくとも８であるが１４未満のモノマー単位の長さのポリエチレングリコールと２〜５個のアミノ酸からなる配列とを有する橋渡し部分を介してＡ鎖のアミノ酸Ａ１に結合した、単鎖インスリンアゴニストが提供される。２〜５個のアミノ酸からなる配列は、Ｂ鎖とポリエチレングリコール鎖との間にあってもよいし、Ａ鎖とポリエチレングリコール鎖との間にあってもよい。しかしながら、この２〜５個のアミノ酸からなる配列がＢ鎖とポリエチレングリコール鎖との間にある場合、アミノ酸配列はＹＴＰＫＴ（配列番号１６）またはＦＮＫＰＴ（配列番号７６）ではない。一実施形態では、橋渡し部分は、１または２個のアミノ酸で分離された２つのポリエチレン鎖を有する。一実施形態では、この１または２個のアミノ酸は独立に、リジンまたはシステインである。一実施形態では、橋渡し部分は、アミノ酸１つ離れて合計８〜１２または１０〜１４または１２モノマー単位のエチレングリコールになる２つのポリエチレン鎖を有する。一実施形態では、このアミノ酸１つがリジンまたはシステインである。
本発明の単鎖インスリンアゴニストは、天然のＢ鎖配列およびＡ鎖配列あるいは、互いにヘテロ二本鎖で結合した場合にインスリンアゴニスト活性を呈する、それらの既知の類縁体または誘導体を有するものであってもよい。本明細書で開示するように、このようなＡ鎖およびＢ鎖ペプチドは、本明細書に記載の橋渡し部分によって互いに結合し、単鎖インスリンアゴニストを形成可能である。一実施形態によれば、Ｂ鎖は、配列Ｒ２２−Ｘ２５ＬＣＧＸ２９Ｘ３０ＬＶＸ３３Ｘ３４ＬＸ３６ＬＶＣＧＸ４１Ｘ４２ＧＦＸ４５（配列番号２０）を有し、Ａ鎖は、配列ＧＩＶＸ４Ｘ５ＣＣＸ８Ｘ９Ｘ１０ＣＸ１２ＬＸ１４Ｘ１５ＬＸ１７Ｘ１８Ｘ１９ＣＸ２１−Ｒ１３（配列番号２２）を有し、ここで、
Ｘ４は、グルタミン酸またはアスパラギン酸であり、
Ｘ５はグルタミンまたはグルタミン酸であり、
Ｘ８は、ヒスチジンまたはフェニルアラニンであり、
Ｘ９は、セリン、アルギニン、リジン、オルニチンまたはアラニンであり、
Ｘ１０は、イソロイシンまたはセリンであり、
Ｘ１２は、セリンまたはアスパラギン酸であり、
Ｘ１４は、チロシン、アルギニン、リジン、オルニチンまたはアラニンであり、
Ｘ１５は、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、アラニン、リジン、オルニチンまたはロイシンであり、
Ｘ１７は、グルタミン酸、アスパラギン酸、アスパラギン、リジン、オルニチンまたはグルタミンであり、
Ｘ１８は、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸またはスレオニンであり、
Ｘ１９は、チロシン、４−メトキシフェニルアラニンまたは４−アミノフェニルアラニンであり、
Ｘ２１は、アラニン、グリシン、セリン、バリン、スレオニン、イソロイシン、ロイシン、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、トリプトファン、チロシン、メチオニンからなる群から選択され、
Ｘ２５は、ヒスチジンまたはスレオニンであり、
Ｘ２９は、アラニン、グリシン、セリンからなる群から選択され、
Ｘ３０は、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸、システイン酸からなる群から選択され、
Ｘ３３は、アスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群から選択され、
Ｘ３４は、アラニンおよびスレオニンからなる群から選択され、
Ｘ３６はチロシンであり、
Ｘ４１は、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアスパラギンからなる群から選択され、
Ｘ４２は、アラニン、オルニチン、リジン、アルギニンからなる群から選択され、
Ｘ４５はチロシンであり、
Ｒ２２は、ＡＹＲＰＳＥ（配列番号１４）、ＦＶＮＱ（配列番号１２）、ＰＧＰＥ（配列番号１１）、トリペプチドであるグリシン−プロリン−グルタミン酸、トリペプチドであるバリン−アスパラギン−グルタミン、ジペプチドであるプロリン−グルタミン酸、ジペプチドであるアスパラギン−グルタミン、グルタミン、グルタミン酸、Ｎ末端のアミンからなる群から選択され、
Ｒ１３は、ＣＯＯＨまたはＣＯＮＨ２である。一実施形態では、Ｘ８、Ｘ２５、Ｘ３０は各々ヒスチジンである。
一実施形態では、プロドラッグが、アミド結合またはエステル結合を介して単鎖インスリン類縁体の活性部位に共有結合したジペプチドプロドラッグ要素（Ｕ−Ｂ）を有する単鎖インスリン類縁体のプロドラッグ誘導体が提供される（開示内容を本明細書に援用する国際特許出願公開公報ＷＯ２００９／０９９７６３およびＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６８７１３を参照のこと）。ジペプチドをあとから生理的条件下で除去し、酵素活性がない状態で、単鎖インスリン類縁体に完全な活性が回復する。一実施形態では、プロドラッグ要素は、構造Ｕ−Ｂのジペプチドを有し、Ｕはアミノ酸またはヒドロキシ酸であり、Ｂは、Ｂのカルボキシル部分と単鎖インスリンアゴニストのアミンとの間のアミド結合を介して前記単鎖インスリンアゴニストに結合したＮアルキル化アミノ酸であり、ここで、Ｕ、ＢまたはＵ−Ｂが結合する単鎖インスリンアゴニストのアミノ酸は、コードされていないアミノ酸である。一実施形態では、単鎖インスリンアゴニストからＵ−Ｂが切断される化学反応による切断の半減期（ｔ１／２）が、ＰＢＳ中にて生理的条件下で少なくとも約１時間から約１週間である。一実施形態では、単鎖アゴニストは、Ａ１９の位置に４−アミノフェニルアラニンを有し、ジペプチドプロドラッグ要素Ｕ−Ｂは、Ｂのカルボキシル部分と４−アミノフェニルアラニンのパラアミンとの間のアミド結合を介して単鎖インスリンアゴニストに結合する。
本開示には、もとになる単鎖インスリンアゴニストの溶解性を改善する修飾などの単鎖インスリンアゴニストの別の誘導体が包含される。一実施形態では、単鎖インスリンアゴニストペプチドの溶解性は、親水体とペプチドとの共有結合によって高められる。一実施形態では、親水体は、Ｂ鎖のＮ末端のアミノ酸またはＢ鎖の末端に位置するアミノ酸の側鎖（たとえば、位置Ｂ２６〜３０のいずれかに存在するリジンなど）またはＢ鎖をＡ鎖に結合する橋渡し部分のいずれかに結合する。一実施形態では、親水体はアルブミンであり、これには、たとえばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）および組換えヒトアルブミン（ｒＨＡ）などのアルブミンを含む。一実施形態では、親水体は、分子量が約５００〜約４０，０００ダルトンの範囲から選択されるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖である。一実施形態では、ポリエチレングリコール鎖は、分子量が約５００〜約５，０００ダルトンの範囲から選択される。もうひとつの実施形態では、ポリエチレングリコール鎖は、分子量が約１０，０００〜約２０，０００ダルトンである。
アシル化またはアルキル化によって、単鎖インスリン類縁体ペプチドおよびそのプロドラッグ誘導体の血中半減期を延ばすことが可能である。アシル化またはアルキル化は、好都合なことに、インスリン受容体での作用開始を遅らせるおよび／または作用時間を延ばす。インスリン類縁体は、親水体が結合するのと同一のアミノ酸位置（たとえば、橋渡し部分の８番目の位置を含む）でアシル化されていてもよいし、アルキル化されていてもよく、異なるアミノ酸位置でアシル化されていてもよいし、アルキル化されていてもよい。
また、単鎖インスリン類縁体アゴニストおよびその誘導体と、薬学的に許容されるキャリアとを含む薬学的組成物も、本開示に包含される。一実施形態によれば、本明細書に開示の単鎖インスリン類縁体またはそれらの誘導体のいずれかを、好ましくは純度レベル少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％で含み、かつ、薬学的に許容される希釈剤、キャリアまたは賦形剤を含む、薬学的組成物が提供される。このような組成物は、本明細書に開示したような単鎖インスリンアゴニストペプチドを、少なくとも０．５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、６ｍｇ／ｍｌ、７ｍｇ／ｍｌ、８ｍｇ／ｍｌ、９ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１１ｍｇ／ｍｌ、１２ｍｇ／ｍｌ、１３ｍｇ／ｍｌ、１４ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、１６ｍｇ／ｍｌ、１７ｍｇ／ｍｌ、１８ｍｇ／ｍｌ、１９ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、２１ｍｇ／ｍｌ、２２ｍｇ／ｍｌ、２３ｍｇ／ｍｌ、２４ｍｇ／ｍｌ、２５ｍｇ／ｍｌまたはこれより高い濃度で含有するものであってもよい。一実施形態では、薬学的組成物は、滅菌され、任意にさまざまな包装容器で保管された水溶液を含む。他の実施形態では、薬学的組成物は、凍結乾燥粉末を含む。薬学的組成物は、組成物を患者に投与するための使い捨ての装置を含むキットの一部として包装されていてもよい。容器またはキットには、室温または冷蔵庫の温度での保存用にラベル表示がなされてもよい。
一実施形態によれば、インスリン依存性患者の血中グルコース濃度を調節する改善された方法が提供される。この方法は、患者に、単鎖インスリンアゴニストペプチドまたはその誘導体を、糖尿病を制御するのに治療的に有効な量で投与する工程を含む。
＜関連出願へのクロスリファレンス＞
本出願は、２０１０年６月１６日にファイルされた米国仮特許出願第６１／３５５，３６６号および２０１１年１月１７日にファイルされた同第６１／４３３，５００号の優先権の利益を主張するものである。この仮特許出願の開示内容全体を、本明細書に明示的に援用する。
＜電子的に提出する資料の援用＞
２０１１年６月１５日に作成した、ファイル名「Seqlist_singleST25」のコンピューター読取り可能な塩基／アミノ酸配列リスト（９０キロバイトのＡＳＣＩＩ（テキスト形式））１つを、本明細書と同時に提出し、その内容全体を本明細書に援用する。
ヒトインスリンを調製するための２段階での合成ストラテジーの概略図である。この手順の詳細については実施例１で説明する。 合成ヒトインスリンと精製された天然のインスリンについて、インスリン受容体の特異的結合を比較したグラフである。この合成インスリンは、図１に詳細を示す方法で合成したものであり、そこではＡ７−Ｂ７結合が最初に形成されるジスルフィドである。グラフに示されたデータから明らかなように、２つの分子は似たような結合活性を有する。 天然のインスリンとＡ１９インスリン類縁体（インスリン（ｐ−ＮＨ２−Ｆ）１９）のインスリン受容体に対する相対結合力を比較したグラフである。グラフに示されたデータから明らかなように、２つの分子は似たような結合活性を有する。 天然のインスリンとＩＧＦ１（ＹＢ１６ＬＢ１７）類縁体のインスリン受容体に対する相対結合力を比較したグラフである。グラフに示されたデータから明らかなように、２つの分子は似たような結合活性を有する。 ヒトプロインスリン（Ａ鎖、配列番号１；Ｂ鎖、配列番号２；Ｃ鎖、配列番号９２）とインスリン様増殖因子ＩおよびＩＩ（ＩＧＦ Ｉ；配列番号３、ＩＧＦ ＩＩ；配列番号４）のアミノ酸配列のアライメントを示す。このアライメントによって、これらの３種類のペプチドが、高いレベルの配列同一性を有することが証明される（＊は対応するアミノ酸のないスペースを示し、ダッシュ（−）はインスリンに存在するものと同じアミノ酸を示す）。 ＩＧＦ１（ＹＢ１６ＬＢ１７）（ｐ−ＮＨ２−Ｆ）Ａ１９プロドラッグ誘導体を調製するのに用いる合成スキームの概略図である。具体的な誘導体はｐ−ＮＨ２−Ｆである。この場合、芳香族アミンはジペプチドＡｉｂ−Ａｌａでアシル化されるが、このジペプチドは生理的条件下で切断されないため、陰性対照として機能する。 ＩＧＦ１（ＹＢ１６ＬＢ１７）（ｐ−ＮＨ２−Ｆ）Ａ１９とＩＧＦ１（ＹＢ１６ＬＢ１７）（ｐ−ＮＨ２−Ｆ）Ａ１９−ＡｉｂＡｌａのジペプチド伸長形のインスリン受容体に対する相対結合力を比較したグラフである。このプロドラッグの合成は図６に示す。この場合、ジペプチドＡｉｂＡｌａは、Ａ１９の位置で結合する（すなわち、ＩＧＦ１（ＹＢ１６ＬＢ１７）（ＡｉｂＡｌａ）。このジペプチドは生理的条件下で容易に切断されないため、活性は極めて低く、このジペプチドを有する部位のアシル化が、生体活性を抑制する能力を持つことが証明される。これは、プロドラッグ形態でのプロドラッグの低活性の２つの主要成分のうちの１つを構成する。 本開示に従って調製したダイマーの活性を示す。図８Ａは、２つの単鎖ＩＧＦＢ１６Ｂ１７類縁体ペプチド（ＩＧＦ−１Ｂ鎖［Ｃ０Ｈ５Ｙ１６Ｌ１７Ｏ２２］−Ａ鎖［Ｏ９，１４，１５Ｎ１８，２１］；配列番号９３）が、Ｂ鎖のアミノ末端の側鎖間のジスルフィド結合によって結合したＩＧＦ−１単鎖ダイマーの構造を示す。天然のインスリンのジスルフィド（Ａ６−Ａ１１、Ａ７−Ｂ７、Ａ２０−Ｂ１９）は図示していないが、ダイマー形態にある。このジスルフィドダイマーの単鎖形態は、矢印で示すような２つのＡｒｇ−Ｇｌｙ結合の選択的なタンパク質消化によって二本鎖形態に変換可能である。 本開示に従って調製したダイマーの活性を示す。図８Ｂは、インスリン、単鎖ＩＧＦＢ１６Ｂ１７類縁体ペプチドダイマー、二本鎖ＩＧＦＢ１６Ｂ１７類縁体ペプチドダイマーのインスリン受容体に対する相対結合力を示すグラフである。 本開示に従って調製したダイマーの活性を示す。図８Ｃは、インスリンと、二本鎖ＩＧＦＢ１６Ｂ１７類縁体ペプチドダイマーのインスリン受容体のリン酸化を誘導するための相対活性を示すグラフである。 ＩＧＦ１Ａ（Ａｌａ）６，７，１１，２０アミドのＩＧＦのＡ鎖ペプチド：（（ｐＮＨ２−Ｆ）１９のＡｉｂ−Ｐｒｏプロドラッグ形態の分解を示す図である。ジペプチドを、ＰＢＳ中、ｐＨ７．４で３７℃にてあらかじめ定められた時間、インキュベートした。インキュベーション開始後、２０分（図９Ａ）、８１分（図９Ｂ）、１２０分（図９Ｃ）の時点で少量を取り、０．１％ＴＦＡで反応を停止し、分析用ＨＰＬＣで調べた。ピークａ（ＩＧＦ１Ａ（Ａｌａ）６，７，１１，２０（ｐＮＨ２−Ｆ）１アミド）およびピークｂ（ＩＧＦ１Ａ（Ａｌａ）６，７，１１，２０（Ａｉｂ−Ｐｒｏ−ｐＮＨ−Ｆ）１９アミド）をＬＣ−ＭＳで同定し、ピーク面積を積分して定量化した。これらのデータは、ＩＧＦ１Ａ（Ａｌａ）６，７，１１，２０（Ａｉｂ−Ｐｒｏ−ｐＮＨ−Ｆ）１９アミドからＩＧＦ１Ａ（Ａｌａ）６，７，１１，２０（ｐＮＨ２−Ｆ）１アミドへの自律的かつ酵素によらない変換を示している。 プロドラッグＡｉｂ，ｄＰｒｏ−ＩＧＦ１ＹＬ（Ａ１９ ４−アミノフェニルアラニンを介して結合したジペプチド）のin vitroでの活性を示すグラフである。図１０Ａは、ＰＢＳ中でインキュベートした、天然のインスリン（４℃で１時間の時点で測定）とＡ１９ ＩＧＦプロドラッグ誘導体（Ａｉｂ，ｄＰｒｏ−ＩＧＦ１ＹＬ）の経時的な（０時間、２．５時間、１０．６時間）インスリン受容体に対する相対結合力を比較したグラフである。グラフに示されたデータから明らかなように、プロドラッグ形態が活性のあるＩＧＦ１ＹＬペプチドに変換されると、増加した活性がＡ１９ＩＧＦプロドラッグ誘導体試料から回復する。 プロドラッグＡｉｂ，ｄＰｒｏ−ＩＧＦ１ＹＬ（Ａ１９ ４−アミノフェニルアラニンを介して結合したジペプチド）のin vitroでの活性を示すグラフである。図１０Ｂは、２０％血漿／ＰＢＳ中、３７℃でインキュベートした、天然のインスリンとＡ１９ ＩＧＦプロドラッグ誘導体（Ａｉｂ，ｄＰｒｏ−ＩＧＦ１ＹＬ）の経時的な（０時間、１．５時間および２４．８時間）インスリン受容体に対する相対結合力を比較したグラフである。グラフに示されたデータから明らかなように、プロドラッグ形態が活性のあるＩＧＦ１ＹＬペプチドに変換されると、増加した活性がＡ１９ＩＧＦプロドラッグ誘導体試料から回復する。 プロドラッグｄＫ，（Ｎ−イソブチルＧ）−ＩＧＦ１ＹＬ（Ａ１９ ４−アミノフェニルアラニンを介して結合したジペプチド）のin vitroでの活性を示すグラフである。図１１Ａは、ＰＢＳ中でインキュベートした、天然のインスリンとＡ１９ ＩＧＦプロドラッグ誘導体（ＩＧＦ１ＹＬ：ｄＫ，（Ｎ−イソブチルＧ）の経時的な（０時間、５時間および５２時間）インスリン受容体に対する相対結合力を比較したグラフである。グラフに示されたデータから明らかなように、プロドラッグ形態が活性のあるＩＧＦ１ＹＬペプチドに変換されると、増加した活性がＡ１９ ＩＧＦプロドラッグ誘導体試料から回復する。 プロドラッグｄＫ，（Ｎ−イソブチルＧ）−ＩＧＦ１ＹＬ（Ａ１９ ４−アミノフェニルアラニンを介して結合したジペプチド）のin vitroでの活性を示すグラフである。図１１Ｂは、２０％血漿／ＰＢＳ中、３７℃でインキュベートした、天然のインスリンとＡ１９ ＩＧＦプロドラッグ誘導体（ＩＧＦ１ＹＬ：ｄＫ，（Ｎ−イソブチルＧ）の経時的な（０時間、３．６時間および２４．８時間）インスリン受容体に対する相対結合力を比較したグラフである。グラフに示されたデータから明らかなように、プロドラッグ形態が活性のあるＩＧＦ１ＹＬペプチドに変換されると、増加した活性がＡ１９ ＩＧＦプロドラッグ誘導体試料から回復する。 プロドラッグｄＫ（ｅ−アセチル），Ｓａｒ）−ＩＧＦ１ＹＬ（Ａ１９ ４−アミノフェニルアラニンを介して結合したジペプチド）のin vitroでの活性を示すグラフである。図１２Ａは、ＰＢＳ中でインキュベートした、天然のインスリン（４℃で１時間の時点で測定）とＡ１９ ＩＧＦプロドラッグ誘導体（ＩＧＦ１ＹＬ：ｄＫ（ｅ−アセチル），Ｓａｒ）の経時的な（０時間、７．２時間および９１．６時間）インスリン受容体に対する相対結合力を比較したグラフである。グラフに示されたデータから明らかなように、プロドラッグ形態が活性のあるＩＧＦ１ＹＬペプチドに変換されると、増加した活性がＡ１９ ＩＧＦプロドラッグ誘導体試料から回復する。 プロドラッグｄＫ（ｅ−アセチル），Ｓａｒ）−ＩＧＦ１ＹＬ（Ａ１９ ４−アミノフェニルアラニンを介して結合したジペプチド）のin vitroでの活性を示すグラフである。図１２Ｂは、２０％血漿／ＰＢＳ中、３７℃にてインキュベートした、天然のインスリンとＡ１９ ＩＧＦプロドラッグ誘導体（ＩＧＦ１ＹＬ：ｄＫ（ｅ−アセチル），Ｓａｒ）の経時的な（０時間、９時間および９５時間）インスリン受容体に対する相対結合力を比較したグラフである。グラフに示されたデータから明らかなように、プロドラッグ形態が活性のあるＩＧＦ１ＹＬペプチドに変換されると、増加した活性がＡ１９ ＩＧＦプロドラッグ誘導体試料から回復する。 天然のインスリンのヘテロ二本鎖、ＩＧＦ−１のＡ鎖およびＢ鎖のヘテロ二本鎖、単鎖ＩＧＦ−１類縁体（Ｂ鎖のカルボキシ末端は、ＩＧＦ−１のＡ鎖のＮ末端に直接結合している）のインスリン受容体に対する相対結合力を比較したグラフである。 天然のインスリンのヘテロ二本鎖、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−１デルタヘテロ二本鎖、単鎖ＩＧＦ−１デルタ単鎖類縁体（Ｂ鎖のカルボキシ末端は配列ＧＹＧＳＳＳＯＲからなるペプチドリンカー（配列番号６５）を介してＩＧＦ−１のＡ鎖のＮ末端に結合）インスリン受容体に対する相対結合力を比較したグラフであり、この場合、ＩＧＦ−１デルタ類縁体は、以下のアミノ酸置換：ＨＡ８、ＯＡ９、ＯＡ１４、ＯＡ１５、ＱＡ１７、ＮＡ２１、ＹＢ１６、ＬＢ１７、ＯＢ２２を含む、天然のＩＧＦ−１配列を有する。 ＩＧＦ−１受容体あるいは、ＡまたはＢサブタイプインスリン受容体に対する単鎖インスリン類縁体の相対的なin vitroでの結合活性を示す棒グラフであり、この場合、天然のインスリンのＢ鎖のカルボキシ末端は、ＩＧＦ−１のＣペプチドまたはＩＧＦ−１のＣペプチドのさまざまな誘導体を介して、天然のインスリンのＡ鎖のアミノ末端に結合している。Ｂ０Ｃ１Ａ０インスリン類縁体の命名法において、Ｂ０およびＡ０の記号はＡ鎖およびＢ鎖のインスリン配列を示すのに対し、Ｃ１はＩＧＦ−１のＣペプチドを示す。このデータによって示されるように、ＩＧＦ−１のＣペプチドを介してＢ鎖をＡ鎖に結合する単鎖インスリン類縁体は、強力なインスリンアゴニストである。さらに、２番目の位置を修飾（たとえば、アラニンを天然のチロシンと置換）あるいはＩＧＦ−１のＣ橋渡しペプチドの最後の４つのアミノ酸を欠失させると、高活性のインスリン選択性単鎖インスリン類縁体が形成される。 ＩＧＦ−１受容体またはＡまたはＢサブタイプのインスリン受容体に対する、Ｂ０Ｃ１Ａ０の単鎖インスリン類縁体のin vitroでの相対結合活性を示す棒グラフである。この場合、ＩＧＦ−１のＣペプチドを結合している天然の配列は、１番目、２番目、３番目、４番目または８番目の位置で標記のアミノ酸置換によって修飾されている。Ｂ０Ｃ１Ａ０インスリン類縁体の命名法において、Ｂ０およびＡ０の記号はＡ鎖およびＢ鎖のインスリン配列を示すのに対し、Ｃ１はＩＧＦ−１のＣペプチドを示す。 Ａサブタイプインスリンでの単鎖Ｂ０Ｃ１Ａ０インスリン類縁体のin vitroでの相対結合活性およびリン酸化活性を示す棒グラフである。さまざまなアミノ酸置換または欠失に対する天然のＩＧＦ−１のＣペプチド（０１０）の活性を比較した。Ｂ０Ｃ１Ａ０インスリン類縁体の命名法において、Ｂ０およびＡ０の記号はＡ鎖およびＢ鎖のインスリン配列を示すのに対し、Ｃ１はＩＧＦ−１のＣペプチドを示す。 Ａサブタイプのインスリンにおける単鎖Ｂ０Ｃ１Ａ０インスリン類縁体のin vitroでの相対結合活性およびリン酸化活性を示す棒グラフである。この場合、ＩＧＦ−１のＣペプチドを結合している天然の配列は、１番目、２番目、３番目、４番目または８番目の位置で標記のアミノ酸置換によって修飾されている。このデータと図１７に示すデータを合わせると、インスリン類縁体の結合活性とリン酸化活性との間の一貫性が証明される。 ＰＥＧポリマーを橋渡し部分として用いる、ＩＧＦ−１ ＹＬ単鎖インスリン類縁体の調製を示す概略図である。 ＡおよびＢは、天然のインスリンのヘテロ二本鎖に比して、４、８または１６のモノマーからなるＰＥＧ橋渡し部分を介して結合した単鎖インスリン類縁体のin vitroでの相対結合活性（図２０Ａ）およびリン酸化活性（図２０Ｂ）を示すグラフである。 ＡおよびＢは、インスリン受容体およびＩＧＦ−１受容体に対する単鎖インスリン類縁体のリン酸化活性を示すグラフである。単鎖インスリン類縁体は、４、８または１６のモノマーからなるＰＥＧ橋渡し部分によって互いに結合した全長天然インスリンＢ鎖およびＡ鎖を有し、天然のインスリンのヘテロ二本鎖と比べるとインスリン活性が比較的低い（図２１Ａ）が、ＰＥＧまたは他の橋渡し部分のない単鎖インスリン類縁体と比較すると、活性は１０〜１００倍大きい（表１６参照）。しかしながら、インスリンのＢ鎖のカルボキシ端の最後の５つのアミノ酸（Ｂ２６〜３０）を欠失させ（ＤｅｓＶ）、残りのＢ鎖のカルボキシ末端を、８、１２または１６のモノマーからなるＰＥＧ橋渡し部分によって天然のインスリンのＡ鎖に結合すると、単鎖類縁体は、天然のインスリンヘテロ二本鎖と比較して、少なくとも同等または高い活性を呈する。 （Ａ）インスリン受容体に対して、単鎖インスリン類縁体がほぼ同じであることを示すグラフである。図２２Ａは、天然のインスリン配列またはＩＧＦ−１ ＡおよびＩＧＦ−１ ＹＬ Ｂ鎖のいずれかを含む単鎖インスリン類縁体を比較したデータである。Ｂ鎖のカルボキシ端の最後の５つのアミノ酸は欠失（ＤｅｓＶ）し、Ｂ鎖は、１２のモノマーからなるＰＥＧ橋渡し部分によって対応するインスリンまたはＩＧＦ−１のＡ鎖に結合している。 （Ｂ）インスリン受容体に対して、単鎖インスリン類縁体がほぼ同じであることを示すグラフである。図２２Ｂは、ＭＩＵ−３８［Ｂ鎖とＡ鎖がＰＥＧ：［Ｂ１（Ｈ５、Ｈ１０、Ｙ１６、Ｌ１７）２５（Ｐｅｇ１２）Ａ１（Ｈ８、Ｎ１８、Ｎ２１）を介して結合した単鎖インスリン類縁体］が、溶媒対照に比して、血中グルコース濃度を下げて低い値に維持する機能を比較する、マウスで実施したインスリン耐性比較試験の結果を示すグラフである。ＭＩＵ−３８を２７ｎｍｏｌ／ｋｇと９０ｎｍｏｌ／ｋｇで投与して、２回の実験を実施した。
（Ｃ）インスリン受容体に対して、単鎖インスリン類縁体がほぼ同じであることを示すグラフである。図２２Ｃは、ＭＩＵ−３５［Ｂ鎖とＡ鎖がペプチドリンカー：Ｂ１（Ｈ５、Ｈ１０、Ｙ１６、Ｌ１７）２５−Ｃ１−Ａ１（Ｈ８、Ｎ１８、Ｎ２１）を介して結合した単鎖インスリン類縁体が、溶媒対照に比して、血中グルコース濃度を下げて低い値に維持する機能を比較する、マウスで実施したインスリン耐性比較試験の結果を示すグラフである。ＭＩＵ−３５を２７ｎｍｏｌ／ｋｇと９０ｎｍｏｌ／ｋｇで投与して、２回の実験を実施した。
単鎖インスリン／ＩＧＦ−１系の類縁体に対するさまざまなヒスチジン置換を示す表である。ＩＧＦ−１Ａ鎖の８番目でのヒスチジンの置換によって、ＩＧＦ系単鎖インスリン類縁体アゴニストの活性を高めることが可能である。 リン酸化による受容体のシグナル伝達を基準に判断できる、インスリン受容体およびＩＧＦ−１受容体の単鎖ＰＥＧ結合類縁体活性の比較分析である。 特定のインスリン分解酵素（ＩＤＥ）によって、インスリンのＡ鎖を有する単鎖類縁体よりもＩＧＦ−１のＡ鎖を有する単鎖類縁体のほうが分解耐性が高いことを示すグラフである。 in vitroでの細胞増殖を誘導する、ＩＧＦ−１、インスリンおよびインスリン／ＩＧＦキメラの相対活性を示すグラフである。これらの結果は、ＩＧＦ−１単鎖インスリン類縁体に関連するインスリン活性が、天然のＩＧＦ−１に関する増殖活性とは相関しないことを示している。 リン酸化による受容体のシグナル伝達を基準に判断できる、インスリン受容体およびＩＧＦ−１受容体に対する単鎖ＰＥＧ結合類縁体活性の比較分析である。異なる大きさのＰＥＧ橋渡し部分が、インスリン受容体およびＩＧＦ−１受容体に対するin vitroでの活性にどのように影響するかを調べるために、異なる長さのＰＥＧ鎖リンカーを用いる単鎖類縁体を分析した。図２７に示すデータは、ＰＥＧ１２ＤｅｓＶコンストラクト（Ｂ鎖のカルボキシ末端側の５つのアミノ酸が欠失）によって、最も強力な化合物が得られることを明らかにしている。 受容体の結合とリン酸化による受容体のシグナル伝達を基準に判断できる、インスリン受容体およびＩＧＦ−１受容体に対する、単鎖ＰＥＧ／アミノ酸結合類縁体のin vitroでの活性の比較分析である。図２８Ａは、１つのアミノ酸（グリシンまたはリジン）がＤｅｓＶのＢ鎖と天然のインスリンのＡ鎖とを結合する橋渡し部分として挿入されたＰＥＧ１２鎖を有する単鎖類縁体のin vitroでの活性を示す。 受容体の結合とリン酸化による受容体のシグナル伝達を基準に判断できる、インスリン受容体およびＩＧＦ−１受容体に対する、単鎖ＰＥＧ／アミノ酸結合類縁体のin vitroでの活性の比較分析である。図２８Ｂは、２つのリジン残基が挿入されたＰＥＧ１２鎖を有する橋渡し部分を有する単鎖類縁体（単鎖ＰＥＧ／（リジン）２結合類縁体）のin vitroでの活性を示す。 さまざまな単鎖インスリン類縁体を投与したマウスのin vivoでのデータを示す。図２９Ａは、受容体の結合とリン酸化による受容体のシグナル伝達を基準に判断できる、インスリン受容体に対する単鎖ＰＥＧ結合類縁体活性のin vitroでの比較分析である。 さまざまな単鎖インスリン類縁体を投与したマウスのin vivoでのデータを示す。図２９Ｂおよび２９Ｃは、標記の類縁体を投与後８時間にわたる血中グルコース濃度のデータである。 さまざまな単鎖インスリン類縁体を投与したマウスのin vivoでのデータを示す。図２９Ｂおよび２９Ｃは、標記の類縁体を投与後８時間にわたる血中グルコース濃度のデータである。 さまざまな単鎖インスリン類縁体を投与したマウスのin vivoでのデータを示す。図２９Ｄおよび図２９Ｅは、２種類の異なる濃度（２７ｎｍｏｌ／ｋｇおよび９０ｎｍｏｌ／ｋｇ）で標記の類縁体を投与後の血中グルコースＡＵＣ値のデータである。 さまざまな単鎖インスリン類縁体を投与したマウスのin vivoでのデータを示す。図２９Ｄおよび２９Ｅは、２種類の異なる濃度（２７ｎｍｏｌ／ｋｇおよび９０ｎｍｏｌ／ｋｇ）で標記の類縁体を投与後の血中グルコースＡＵＣ値のデータである。 Ａ〜Ｄは、３種類の異なるアシル化インスリン類縁体に比して、ヒトインスリンが血中グルコース濃度を下げてこれを低く維持する機能を比較してマウスで実施したインスリン耐性比較試験の結果を示すグラフである。化合物については２種類の異なる濃度で試験した（２７ｎｍｏｌ／ｋｇおよび９０ｎｍｏｌ／ｋｇ）。アシル化インスリンには、ＭＩＵ−４１、ＭＩＵ−３６、ＭＩＵ−３７を含めた。ＭＩＵ−４１［Ｂ１（Ｈ５、Ｈ１０、Ｙ１６、Ｌ１７）２５ａ：Ａ１（Ｈ８，ｒＥＣ１６−Ｋ１４、Ｎ１８、Ｎ２１）］は、Ａ１４の位置にあるリジン残基に結合したγグルタミン酸リンカーを介したＣ１６のアシル化を有する二本鎖インスリン類縁体である。ＭＩＵ−３６［Ｂ１（Ｃ１６−Ｋ０、Ｈ５、Ｈ１０、Ｙ１６、Ｌ１７）２５ａ：Ａ１（Ｎ１８、Ｎ２１）］は、Ｂ鎖のＮ末端に結合したＣ１６アシル化を有する二本鎖インスリン類縁体である）。ＭＩＵ−３７［Ｂ１（Ｈ５、Ｈ１０、Ｙ１６、Ｌ１７、Ｃ１６ｒＥ−Ｋ２２）２５ａ：Ａ１（Ｎ１８、Ｎ２１）］は、Ｂ２２の位置にあるリジン残基に結合したγグルタミン酸リンカーを介したＣ１６のアシル化を有する二本鎖インスリン類縁体である。 Ａ〜Ｄは、アシル化された二本鎖インスリン類縁体ＭＩＵ−５５に比して、市販のアシル化されたインスリン類縁体（Ｄｅｔｅｍｉｒ）の活性を比較してマウスで実施した、インスリン耐性比較試験の結果を示す。ＭＩＵ−５５［Ｂ１（Ｈ５、１０、Ｙ１６、Ｌ１７、Ｃ１６ｒＥ−Ｋ２２）２５ａ：Ａ１（Ｎ１８，Ｎ２１）］は、Ｂ鎖のＣ末端側の５つのアミノ酸が欠失し、Ｂ鎖アミドで終端する。これは、Ｌｙｓ Ｂ２２のε−アミノ基でのγＧｌｕリンカーを介してＣ１６脂肪酸でアシル化される。これらの結果から、ＭＩＵ−５５は、Ｄｅｔｅｍｉｒと比べると強さが約１／３である（図３１Ａおよび図３１Ｂ参照）。また、これらのデータは、インスリンのアシル化形態のほうが、アシル化されていない形態よりも長く作用し、ＭＩＵ−５５は、Ｄｅｔｅｍｉｒほど強力ではないが、Ｄｅｔｅｍｉｒと同様のプロファイルを呈することも示している。図３１Ｃおよび図３１Ｄは、標記の類縁体を投与後の血中グルコースＡＵＣ値のデータである。 Ａ〜Ｄは、アシル化された二本鎖インスリン類縁体ＭＩＵ−４９に比して、市販のアシル化されたインスリン類縁体（Ｄｅｔｅｍｉｒ）の活性を比較してマウスで実施した、インスリン耐性比較試験の結果を示す。ＭＩＵ−４９［Ｂ１（Ｃ１６−ｒＥ，Ｈ５、Ａｉｂ９、Ｈ１０、Ｅ１３−Ｋ１７、Ｙ１６）２５ａ：Ａ１（Ｎ１８、Ｎ２１）］は、Ｂ鎖のＣ末端側の５つのアミノ酸が欠失し、Ｇｌｙ Ｂ２のα−アミノ基でγＧｌｕリンカーを介してＣ１６脂肪酸でアシル化された二本鎖インスリンアゴニストである）。これらの結果から、ＭＩＵ−４９は、Ｄｅｔｅｍｉｒと比べると強さが約１／３であることがわかる（図３２および図３２Ｂ参照）。また、これらのデータは、インスリンのアシル化形態のほうが、アシル化されていない形態よりも長く作用し、ＭＩＵ−４９は、Ｄｅｔｅｍｉｒほど強力ではないが、Ｄｅｔｅｍｉｒと同様のプロファイルを呈することも示している。図３２Ｃおよび図３２Ｄは、標記の類縁体を投与後の血中グルコースＡＵＣ値のデータである。 Ａ〜Ｄは、Ｃ５７／Ｂｌｋマウスを用いるＤｅｔｅｍｉｒおよびＭＩＵ−５６についてのインスリン耐性比較試験で得られた結果を示す。ＭＩＵ−５６は、２０ｋＤａのＰＥＧが、Ａ鎖とＢ鎖とをつなぐ橋渡し部分（ＰＥＧ８−Ｋ−ＰＥＧ４）の単一のリジン残基の側鎖に結合したインスリン単鎖類縁体Ｂ１（Ｈ５、Ｙ１６、Ｌ１７）２５ａ−ＰＥＧ８−Ｋ−ＰＥＧ４−Ａ１（Ｎ１８、２１）である。図３３Ａおよび図３３Ｂは、アシル化インスリン類縁体ＤｅｔｅｍｉｒとＰＥＧ化された単鎖インスリン類縁体ＭＩＵ−５６とについて、血中グルコース濃度を下げてこれを低く維持する機能を比較したインスリン耐性試験の結果を示すグラフである。図３３Ｃおよび図３３Ｄはそれぞれ、ＤｅｔｅｍｉｒおよびＭＩＵ−５６を投与したマウスでの血中グルコースＡＵＣ２４時間を示している。 （Ａ）Ｃ５７／Ｂｌｋマウスを用いるＭＩＵ−５６およびＭＩＵ−５７のインスリン耐性比較試験で得られた結果を示す。ＭＩＵ−５７は、２０ｋＤａのＰＥＧがＢ鎖のＮ末端に結合したインスリン単鎖類縁体（Ｂ１（Ｈ５、Ｙ１６、Ｌ１７）２５−Ｃ１−Ａ１（Ｎ１８、２１）である。図３４Ａおよび図３４Ｂは、ＭＩＵ−５６とＭＩＵ−５７を比較して、インスリン耐性試験の結果を示すグラフである。
（Ｂ）Ｃ５７／Ｂｌｋマウスを用いるＭＩＵ−５６およびＭＩＵ−５７のインスリン耐性比較試験で得られた結果を示す。ＭＩＵ−５７は、２０ｋＤａのＰＥＧがＢ鎖のＮ末端に結合したインスリン単鎖類縁体（Ｂ１（Ｈ５、Ｙ１６、Ｌ１７）２５−Ｃ１−Ａ１（Ｎ１８、２１）である。図３４Ａおよび図３４Ｂは、ＭＩＵ−５６とＭＩＵ−５７を比較して、インスリン耐性試験の結果を示すグラフである。
（Ｃ）Ｃ５７／Ｂｌｋマウスを用いるＭＩＵ−５６およびＭＩＵ−５７のインスリン耐性比較試験で得られた結果を示す。ＭＩＵ−５７は、２０ｋＤａのＰＥＧがＢ鎖のＮ末端に結合したインスリン単鎖類縁体（Ｂ１（Ｈ５、Ｙ１６、Ｌ１７）２５−Ｃ１−Ａ１（Ｎ１８、２１）である。図３４Ｃおよび図３４Ｄはそれぞれ、ＭＩＵ−５６およびＭＩＵ−５７を投与したマウスでの血中グルコースＡＵＣ２４時間を示す。ＭＩＵ−５６およびＭＩＵ−５７のインスリン用量比較滴定の結果から、２０ｎｍｏｌ／ｋｇから８０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量範囲では、マウスで同様のプロファイルが得られることが明らかになる（図３４Ｅおよび図３４Ｆを参照のこと）。２つのインスリン単鎖類縁体（Ｂ１（Ｈ５、Ｙ１６、Ｌ１７）２５−Ｃ１−Ａ１（Ｎ１８、２１）が２０ｋＤａのＰＥＧ鎖を介して端と端で結合したダイマー（ＭＩＵ ５８）を調製した。
（Ｄ）Ｃ５７／Ｂｌｋマウスを用いるＭＩＵ−５６およびＭＩＵ−５７のインスリン耐性比較試験で得られた結果を示す。ＭＩＵ−５７は、２０ｋＤａのＰＥＧがＢ鎖のＮ末端に結合したインスリン単鎖類縁体（Ｂ１（Ｈ５、Ｙ１６、Ｌ１７）２５−Ｃ１−Ａ１（Ｎ１８、２１）である。図３４Ｃおよび図３４Ｄはそれぞれ、ＭＩＵ−５６およびＭＩＵ−５７を投与したマウスでの血中グルコースＡＵＣ２４時間を示す。ＭＩＵ−５６およびＭＩＵ−５７のインスリン用量比較滴定の結果から、２０ｎｍｏｌ／ｋｇから８０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量範囲では、マウスで同様のプロファイルが得られることが明らかになる（図３４Ｅおよび図３４Ｆを参照のこと）。２つのインスリン単鎖類縁体（Ｂ１（Ｈ５、Ｙ１６、Ｌ１７）２５−Ｃ１−Ａ１（Ｎ１８、２１）が２０ｋＤａのＰＥＧ鎖を介して端と端で結合したダイマー（ＭＩＵ ５８）を調製した。
（Ｅ）Ｃ５７／Ｂｌｋマウスを用いるＭＩＵ−５６およびＭＩＵ−５７のインスリン耐性比較試験で得られた結果を示す。ＭＩＵ−５７は、２０ｋＤａのＰＥＧがＢ鎖のＮ末端に結合したインスリン単鎖類縁体（Ｂ１（Ｈ５、Ｙ１６、Ｌ１７）２５−Ｃ１−Ａ１（Ｎ１８、２１）である。図３４Ｃおよび図３４Ｄはそれぞれ、ＭＩＵ−５６およびＭＩＵ−５７を投与したマウスでの血中グルコースＡＵＣ２４時間を示す。ＭＩＵ−５６およびＭＩＵ−５７のインスリン用量比較滴定の結果から、２０ｎｍｏｌ／ｋｇから８０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量範囲では、マウスで同様のプロファイルが得られることが明らかになる（図３４Ｅおよび図３４Ｆを参照のこと）。２つのインスリン単鎖類縁体（Ｂ１（Ｈ５、Ｙ１６、Ｌ１７）２５−Ｃ１−Ａ１（Ｎ１８、２１）が２０ｋＤａのＰＥＧ鎖を介して端と端で結合したダイマー（ＭＩＵ ５８）を調製した。
（Ｆ）Ｃ５７／Ｂｌｋマウスを用いるＭＩＵ−５６およびＭＩＵ−５７のインスリン耐性比較試験で得られた結果を示す。ＭＩＵ−５７は、２０ｋＤａのＰＥＧがＢ鎖のＮ末端に結合したインスリン単鎖類縁体（Ｂ１（Ｈ５、Ｙ１６、Ｌ１７）２５−Ｃ１−Ａ１（Ｎ１８、２１）である。図３４Ｃおよび図３４Ｄはそれぞれ、ＭＩＵ−５６およびＭＩＵ−５７を投与したマウスでの血中グルコースＡＵＣ２４時間を示す。ＭＩＵ−５６およびＭＩＵ−５７のインスリン用量比較滴定の結果から、２０ｎｍｏｌ／ｋｇから８０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量範囲では、マウスで同様のプロファイルが得られることが明らかになる（図３４Ｅおよび図３４Ｆを参照のこと）。２つのインスリン単鎖類縁体（Ｂ１（Ｈ５、Ｙ１６、Ｌ１７）２５−Ｃ１−Ａ１（Ｎ１８、２１）が２０ｋＤａのＰＥＧ鎖を介して端と端で結合したダイマー（ＭＩＵ ５８）を調製した。
（Ｇ）Ｃ５７／Ｂｌｋマウスを用いてＭＩＵ−５７およびＭＩＵ−５８のインスリン耐性比較試験で得られた結果を示す。図３４Ｇおよび図３４Ｈは、ＭＩＵ−５７（モノマー）とＭＩＵ−５８（ダイマー）を比較したインスリン耐性試験の結果を示すグラフである。
（Ｈ）Ｃ５７／Ｂｌｋマウスを用いてＭＩＵ−５７およびＭＩＵ−５８のインスリン耐性比較試験で得られた結果を示す。図３４Ｇおよび図３４Ｈは、ＭＩＵ−５７（モノマー）とＭＩＵ−５８（ダイマー）を比較したインスリン耐性試験の結果を示すグラフである。
（Ｉ）Ｃ５７／Ｂｌｋマウスを用いてＭＩＵ−５７およびＭＩＵ−５８のインスリン耐性比較試験で得られた結果を示す。図３４Ｉおよび図３４Ｊはそれぞれ、ＭＩＵ−５７およびＭＩＵ−５８を投与したマウスでの血中グルコースＡＵＣ２４時間を示している。
（Ｊ）Ｃ５７／Ｂｌｋマウスを用いてＭＩＵ−５７およびＭＩＵ−５８のインスリン耐性比較試験で得られた結果を示す。図３４Ｉおよび図３４Ｊはそれぞれ、ＭＩＵ−５７およびＭＩＵ−５８を投与したマウスでの血中グルコースＡＵＣ２４時間を示している。
Ａ〜Ｂは、２種類のＰＥＧ化インスリン誘導体でのインスリン用量比較滴定のデータである。このインスリン誘導体は、ＭＩＵ−５９のＮ末端（図３５Ａ）またはインスリン類縁体ＭＩＵ−６０のアミノ酸Ｂ２９の側鎖に結合した２０ｋＤａのＰＥＧの配置が異なる。Ａ１およびＢ１のアミノ酸は、カルバミル化されている（図３５Ｂ）。 Ａ〜Ｄは、３種類の単鎖インスリン類縁体すなわち、ＭＩＵ−６７、ＭＩＵ−６８、ＭＩＵ−６９でのインスリン用量比較滴定のデータである。これらの類縁体は各々、単一のＰＥＧ化された（２０Ｋ ＰＥＧ）天然のインスリン誘導体（ＭＩＵ−５９）に比して、各１０ｋＤａの２つのＰＥＧ鎖を有する。特に、一方がＮ末端に、他方が橋渡し部分のアミノ酸８（Ｃ８の位置）に結合した２つのＰＥＧ鎖（各１０Ｋ）を有する単鎖インスリン類縁体ＭＩＵ−６７（Ｂ１（Ｈ５、Ｙ１６、Ｌ１７）２５−Ｃ１（Ｋ８）−Ａ１（Ｎ１８、２１））、一方がＮ末端に、他方がアミノ酸Ｂ２２に結合した２つのＰＥＧ鎖（各１０Ｋ）を有するＭＩＵ−６８（Ｂ１（Ｈ５、Ｙ１６、Ｌ１７、Ｋ２２）２５−Ｃ１（Ｋ８）−Ａ１（Ｎ１８、２１））、一方がＮ末端に、他方がアミノ酸Ａ１４に結合した２つのＰＥＧ鎖（各１０Ｋ）を有するＭＩＵ−６９（Ｂ１（Ｈ５、Ｙ１６、Ｌ１７）２５−Ｃ１（Ｋ８）−Ａ１（Ｋ１４、Ｎ１８、２１））の活性を比較した。それぞれの化合物を２通りの用量で投与した（２０ｎｍｏｌ／ｋｇおよび８０ｎｍｏｌ／ｋｇ）。 ＡおよびＢ 糖尿病マウス（ｄｂ／ｄｂマウス）に、ＰＥＧ化インスリン類縁体を投与して、市販のインスリン類縁体との関連でそれぞれの相対活性を比較した。ｘ軸は、投与した化合物（すなわち、溶媒対照、３０ｎｍｏｌ／ｋｇまたは９０ｎｍｏｌ／ｋｇまたは６０ｎｍｏｌ／ｋｇのHumulinおよび３０、９０および２４０のLevemir）の濃度を示す。特に、インスリン類縁体であるLevemirおよびHumulinを、ＰＥＧ化インスリン類縁体ＭＩＵ−５９（２０ｋＤａのＰＥＧが１つＮ末端に結合している天然のインスリン類縁体）およびＭＩＵ−６６（２０ｋＤａのＰＥＧが１つＮ末端に結合し、Ａ鎖およびＢ鎖のアミノ末端がカルバミル化されている天然のインスリン類縁体と比較した。ＭＩＵ−５９およびＭＩＵ−６６はともに、LevemirおよびHumulinよりも活性が改善された（１２時間の時点については図３７Ａ、２４時間の時点については図３７Ｂを参照のこと）。 ジペプチドプロドラッグ要素アシル化されたプロドラッグ二本鎖インスリン類縁体（ＭＩＵ−２９：［Ｂ１（Ｙ１６、Ｌ１７、Ｙ２５）２９ａ：Ａ１（ａＦ１９−ｄＬｙｓ（Ａｃ），ＮＬｅｕ）］について、その親のインスリン類縁体（ＭＩＵ−２７：［Ｂ１（Ｙ１６、Ｌ１７、Ｙ２５）２９ａ：Ａ１（ａＦ１９−）］との比較で健常マウスにて実施したインスリン耐性比較試験の結果を示すグラフである。プロドラッグ誘導体ＭＩＵ−２９は、Ａ１９の位置が４−アミノ−フェニルアラニン置換で置換されている。この場合、ジペプチドｄＬｙｓ（Ａｃ），ＮＬｅｕが、Ａ１９残基の４−アミノ位置に共有結合し、ジペプチド要素のリジンの側鎖はＣ１４脂肪酸でアシル化されている。このジペプチドは、生理的条件下では、約５時間の半減期で自律的に分裂した。ＭＩＵ−２９を２４時間ex vivoにてインキュベートした後、得られた化合物（「ＭＩＵ−２９ｃ」と表記）をマウスに投与し、血中グルコースを下げる機能を親化合物と比較した。図３８に示すように、２種類の化合物がほぼ同じように機能した。
＝＝定義＝＝
本発明について説明し、権利請求するにあたり、以下に示す定義に従って次のような技術用語を使用する。
本明細書で使用する場合、「約」という表現は、記載された値または値の範囲よりも１０パーセント以内で大きいまたは小さいことを意味するが、この広めに定義された値においてのみ、値または値の範囲を示すことを意図するものではない。「約」という表現を直前に伴う値または値の範囲はいずれも、表記されている値そのものまたは値の範囲そのものの実施形態を包含することもまた、意図している。
本明細書で使用する場合、「プロドラッグ」という用語を、その薬理作用を発揮する前に化学修飾がなされる化合物として定義する。
本明細書で使用する場合、「アミノ酸」という用語は、アミノ官能基とカルボキシ官能基の両方を含む分子を包含し、ここでのアミノ基とカルボキシレート基は同一の炭素（α炭素）に結合している。α炭素は、任意に、１つまたは２つの別の有機置換基を有するものであってもよい。本開示の目的で、異性体の型を明記しない場合のアミノ酸の表示は、アミノ酸のＬ型またはＤ型あるいは、ラセミ混合物を包含することを意図している。しかしながら、アミノ酸を３文字コードで表記し、そこに上付の数字を含む場合、アミノ酸のＤ型については、３文字コードの前に小文字のｄと上付の数字を含めて示してある（たとえば、ｄＬｙｓ−１）のに対し、小文字のｄがない表示（たとえば、Ｌｙｓ−１）は、アミノ酸の天然のＬ型を示すことを意図したものである。この命名法では、上付の数字を含む場合、インスリン類縁体配列におけるアミノ酸の位置を示す。この場合、インスリン類縁体配列内に位置するアミノ酸を、Ｎ末端から起算して連番の正の上付数字で示す。Ｎ末端で、あるいは、側鎖を介してインスリン類縁体ペプチドに結合する追加のアミノ酸には、０で始まり、インスリン類縁体配列からさらに離れるにつれて負の整数値で数字が大きくなるように番号付けされる。たとえば、インスリン類縁体のＮ末端に結合したジペプチドプロドラッグ内のアミノ酸の位置をａａ−１−ａａ０−インスリン類縁体と表記するが、このａａ０はジペプチドのカルボキシ末端のアミノ酸を表し、ａａ−１はジペプチドのアミノ末端のアミノ酸を表す。
本明細書で使用する場合、「ヒドロキシ酸」という用語は、α炭素のアミノ基をヒドロキシ基に入れ換える修飾がなされたアミノ酸を示す。
本明細書で使用する場合、「コードされていないアミノ酸」という表現は、以下の２０種類のアミノ酸すなわち、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、ＴｙｒのいずれのＬ異性体でもないアミノ酸を包含する。
「ジペプチド」は、α−アミノ酸またはα−ヒドロキシ酸が、ペプチド結合を介して別のアミノ酸と結合することで形成される化合物である。
本明細書で使用する場合、「化学反応による切断」という表現は、他に何ら断りがなければ、化学的共有結合の切断につながる酵素によらない反応を包含する。
「生体活性ポリペプチド」とは、in vitroおよび／またはin vivoにて生物学的作用をおよぼすことのできるポリペプチドをいう。
本明細書で使用する場合、一般的にペプチドと言及すると、アミノ末端とカルボキシ末端が修飾されたペプチドを包含することを意図している。たとえば、標準的なアミノ酸を選定しているアミノ酸配列には、Ｎ末端およびＣ末端の標準的なアミノ酸のみならず、Ｎ末端の対応するヒドロキシ酸および／またはＣ末端のカルボン酸に代えてアミド基を含むように修飾された対応するＣ末端のアミノ酸を包含することを意図している。
本明細書で使用する場合、「アシル化された」アミノ酸は、それを製造する手段とは関係なく、天然のアミノ酸に対して非天然のアシル基を含むアミノ酸である。アシル化されたアミノ酸およびアシル化されたペプチドを製造する方法の例は、当分野で知られており、アミノ酸をアシル化した上でペプチドに含ませることや、ペプチド合成後にこのペプチドを化学的にアシル化することを含む。いくつかの実施形態では、アシル基が、ペプチドに、（ｉ）血中半減期を延ばすこと、（ｉｉ）作用開始を遅らせること、（ｉｉｉ）作用時間を延ばすこと、（ｉｖ）ＤＰＰ−ＩＶなどのプロテアーゼに対する耐性を改善すること、（ｖ）ＩＧＦおよび／またはインスリンペプチド受容体における作用を増強することのうちの１つまたは２つ以上をさせる。
本明細書で使用する場合、「アルキル化された」アミノ酸は、それを製造する手段とは関係なく、天然のアミノ酸に対して非天然のアルキル基を含むアミノ酸である。アルキル化されたアミノ酸およびアルキル化されたペプチドを製造する方法の例は、当分野で知られており、アミノ酸をアルキル化した上でペプチドに含ませることや、ペプチド合成後にこのペプチドを化学的にアルキル化することを含む。特定の理論に拘泥することなく、ペプチドのアルキル化によって、ペプチドのアシル化と同一でないにしても似たような作用、たとえば血中半減期を延ばすこと、作用開始を遅らせること、作用時間を延ばすこと、ＤＰＰ−ＩＶなどのプロテアーゼに対する耐性を改善すること、ＩＧＦおよび／またはインスリン受容体における作用を増強することなどが達成されると考えられている。
本明細書で使用する場合、「薬学的に許容されるキャリア」という表現は、リン酸緩衝生理食塩水、水、水中油滴型エマルションまたは油中水滴型エマルションなどのエマルションならびに、さまざまなタイプの湿潤剤といった、標準的な薬学的キャリアを含む。また、この表現は、ヒトをはじめとする動物での用途向けに米国連邦政府の規制当局によって承認された薬剤または米国薬局方に記載された薬剤も包含する。
本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される塩」という表現は、親化合物の生物学的活性を保持し、かつ、生物学的にまたはそれ以外に望ましくない点のない化合物の塩を示す。本明細書に開示する化合物の多くは、アミノ基および／またはカルボキシ基またはこれらに類する基が存在することで、酸性塩および／または塩基性塩を形成可能である。
薬学的に許容される塩基付加塩は、無機塩基および有機塩基から調製可能なものである。無機塩基から誘導される塩としては、単なる一例として、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩があげられる。有機塩基から誘導される塩としては、第１級アミンの塩、第２級アミンの塩、第３級アミンの塩があげられるが、これらに限定されるものではない。
薬学的に許容される酸付加塩を、無機酸および有機酸から調製してもよい。無機酸から誘導される塩としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などがあげられる。有機酸から誘導される塩としては、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエン−スルホン酸、サリチル酸などがあげられる。
本明細書で使用する場合、「親水体」という用語は、容易に水に溶解できるか、容易に水を吸収し、かつ、哺乳類の種に毒性作用なくin vivoで許容される（すなわち生体適合性である）化合物を示す。親水体の例として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸−ポリグリコール酸コポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリメトキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミドならびに、ヒドロキシメチルセルロースまたはヒドロキシエチルセルロースなどの誘導体化セルロース、これらのコポリマーのみならず、たとえば、アルブミン、ヘパリン、デキストランをはじめとする天然のポリマーがあげられる。
本明細書で使用する場合、「治療する」という表現は、特定の障害または状態の予防法あるいは、特定の障害または状態に関連する症状の軽減および／またはこれらの症状を予防または解消することを含む。たとえば、本明細書で使用する場合、「糖尿病を治療する」という表現は、概して、血中グルコース濃度を正常なレベル付近に維持することを示し、個々の状況に応じて血中グルコース濃度を上昇させるか低下させることを含む場合もある。
本明細書で使用する場合、インスリン類縁体の「有効」量または「治療有効量」とは、無毒であるが、望ましい効果を得るのに十分なインスリン類縁体の量をいう。たとえば、ひとつの望ましい効果として、高血糖症を予防または治療できることがあろう。「有効な」量は、個人の年齢や全身状態、投与モードなどに応じて、治療対象者ごとに変わってくる。このため、常に正確な「有効量」を規定できるわけではない。しかしながら、個々の症例における適切な「有効」量については、当業者がルーチンな実験を用いて判断できる。
「非経口」という用語は、消化管を経由せず、鼻腔内、吸入、皮下、筋肉内、脊髄内または静脈内など、他の何らかの経路によることを意味する。
本出願全体をとおして、特定のアミノ酸の位置を文字と数字で参照する場合（たとえば、Ａ５の位置）はいずれも、天然のヒトインスリンのＡ鎖（配列番号１）またはＢ鎖（配列番号２）において、それぞれＡ鎖（たとえばＡ５の位置）またはＢ鎖（たとえばＢ５の位置）の該当位置のアミノ酸あるいは、その任意の類縁体での対応するアミノ酸の位置をいう。たとえば、それ以上詳細に触れることなく本明細書で「Ｂ２８の位置」といえば、配列番号２の最初のアミノ酸が欠失したインスリン類縁体のＢ鎖であれば、対応するＢ２７の位置を意味する。同様に、天然のＢ鎖のＮ末端に付加されたアミノ酸には、Ｂ０で始めて番号が付され、Ｎ末端にアミノ酸が付加されるにつれて数字が大きくなる負の数が続く（たとえば、Ｂ−１、Ｂ−２・・・）。あるいは、単鎖類縁体の橋渡し部分におけるアミノ酸の位置について言及する場合、ＩＧＦ １（配列番号１７）の天然のＣ鎖を基準にされる。たとえば、天然のＣ鎖の９番目の位置（または「Ｃ９の位置」）は、アラニン残基を有する。
本明細書で使用する場合、「天然のインスリンペプチド」という表現は、配列番号１のＡ鎖と配列番号２のＢ鎖とを有する５１のアミノ酸からなるヘテロ二本鎖のみならず、配列番号１および２を有する単鎖インスリン類縁体を示すことを意図する。「インスリンペプチド」という用語は、本明細書で他に何ら説明的な言い回しを伴わずに用いられる場合、配列番号１のＡ鎖と配列番号２のＢ鎖とを有する５１のアミノ酸からなるヘテロ二本鎖のみならず、その単鎖インスリン類縁体（たとえば、国際特許出願公開公報ＷＯ９６／３４８８２および米国特許第６，６３０，３４８号（その開示内容を本明細書に援用する）に開示されたものを含む）を包含することを意図しており、これらには、天然のＡ鎖および／またはＢ鎖の修飾された類縁体を有するヘテロ二本鎖および単鎖類縁体、並びにそれらのヘテロ二本鎖および単鎖誘導体も含む。このような修飾された類縁体として、Ａ１９の位置、Ｂ１６の位置またはＢ２５の位置のアミノ酸の４−アミノフェニルアラニンへの修飾あるいは、Ａ５、Ａ８、Ａ９、Ａ１０、Ａ１２、Ａ１４、Ａ１５、Ａ１７、Ａ１８、Ａ２１、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ９、Ｂ１０、Ｂ１３、Ｂ１４、Ｂ１７、Ｂ２０、Ｂ２１、Ｂ２２、Ｂ２３、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９、Ｂ３０から選択される位置における１つまたは２つ以上のアミノ酸置換あるいは、Ｂ１〜４およびＢ２６〜３０のいずれかまたはすべての欠失があげられる。本明細書で定義するインスリンペプチドは、逆反転断片などの非ペプチド部分の挿入または置換あるいは、アザペプチド結合（ＣＯがＮＨで置換）または擬似ペプチド結合（たとえばＮＨがＣＨ２で置換）などの非ペプチド結合またはエステル結合（たとえば、１つまたは２つ以上のアミド（−ＣＯＮＨＲ−）結合がエステル（ＣＯＯＲ）結合で置換されたデプシペプチド）の取り込みによる天然のインスリン由来の類縁体であってもよい。
「Ａ１９インスリン類縁体」は、天然のインスリンのＡ鎖における１９番目の天然のチロシン残基が４−アミノフェニルアラニンまたは４−メトキシフェニルアラニンで置換されたインスリンペプチドである。
本明細書で使用する場合、「ＩＧＦＢ１６Ｂ１７類縁体ペプチド」は、Ａ鎖／Ｂ鎖ヘテロ二本鎖のみならず、その単鎖インスリン類縁体を含む包括的な表現である。この場合のＡ鎖は配列番号１９のペプチド配列とその類縁体とを含み、Ｂ鎖は配列番号２１の配列とその類縁体とを含み、そのＡ鎖および／またはＢ鎖の類縁体は、さらに１〜３個のアミノ酸置換を有するが、ただし、Ｂ鎖は配列番号２の配列を持たず、Ｂ１６の位置にチロシンと、Ｂ１７の位置にロイシンとを有する。
「ＩＧＦ ＹＬ類縁体」のひとつは、配列番号１９のＩＧＦのＡ鎖と配列番号５８のＩＧＦのＢ鎖とを有するペプチドである。
本明細書で使用する場合、「単鎖インスリン類縁体」という用語は、インスリンまたはＩＧＦのＡ鎖およびＢ鎖またはそれらの類縁体または誘導体が、互いに共有結合で橋渡しされた直鎖状のポリペプチド鎖を形成する、構造的に関連したタンパク質の群を包含する。本明細書で開示する場合、単鎖インスリン類縁体は、橋渡し部分を介した、Ｂ鎖のカルボキシ末端とＡ鎖のアミノ末端との共有結合された橋渡しを有する。
本明細書で使用する「インスリンのＡ鎖」という表現は、他に何ら説明的な言い回しを伴わずに用いられる場合、配列番号１の２１のアミノ酸からなる配列のみならず、その機能的類縁体および誘導体を包含することを意図しており、これには、Ａ１９インスリン類縁体のＡ鎖ならびに、Ａ４、Ａ５、Ａ８、Ａ９、Ａ１０、Ａ１２、Ａ１４、Ａ１５、Ａ１７、Ａ１８、Ａ２１から選択される位置での１つまたは２つ以上のアミノ酸の挿入、欠失または置換による配列番号１の配列の修飾をはじめとする当業者らに知られた他の類縁体を含む。
本明細書で使用する「インスリンのＢ鎖」という表現は、他に何ら説明的な言い回しを伴わずに用いられる場合、配列番号２の３０のアミノ酸からなる配列のみならず、天然のＢ鎖の修飾された機能的類縁体を包含することを意図しており、これには、Ｂ１６の位置またはＢ２５の位置のアミノ酸の４−アミノフェニルアラニンへの修飾あるいは、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ９、Ｂ１０、Ｂ１３、Ｂ１４、Ｂ１７、Ｂ２０、Ｂ２１、Ｂ２２、Ｂ２３、Ｂ２５、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９、Ｂ３０から選択される位置での１つまたは２つ以上のアミノ酸の挿入、欠失または置換あるいは、Ｂ１〜４およびＢ２６〜３０の位置のうちのいずれかまたはすべてにおける欠失も含む。
本明細書で使用する場合、「誘導体」という用語は、たとえば、ポリペプチドの１箇所または２箇所以上の側鎖に基を導入すること（たとえば、チロシン残基へのニトロ基の導入またはチロシン残基へのヨウ素の導入）あるいは、遊離カルボン酸基からエステル基またはアミド基への変換あるいは、アシル化によってアミノ基をアミドに変換することあるいは、ヒドロキシ基をアシル化してエステルにすることまたは第１級アミンをアルキル化して第２級アミンにすることあるいは、アミノ酸側鎖への親水体の結合による、in vitroでの化学修飾をはじめとする化合物（たとえば、アミノ酸）に対する化学修飾を包含することを意図する。他の誘導体は、ポリペプチドにおけるアミノ酸残基の側鎖の酸化または還元によって得られる。
本明細書で使用するＩＧＦのＡ鎖という表現は、他に何ら説明的な言い回しを伴わずに用いられる場合、天然のＩＧＦ １またはＩＧＦ ２（それぞれ配列番号５および７）の２１のアミノ酸からなる配列のみならず、当業者らに知られたそれらの機能的類縁体を包含することを意図しており、これには、Ａ５、Ａ８、Ａ９、Ａ１０、Ａ１２、Ａ１４、Ａ１５、Ａ１７、Ａ１８、Ａ２１から選択される位置における１つまたは２つ以上のアミノ酸置換による配列番号５および７の配列の修飾を含む。
本明細書で使用する「ＩＧＦ ＹＬのＢ鎖」という表現は、他に何ら説明的な言い回しを伴わずに用いられる場合、配列番号２１を有するアミノ酸配列（たとえば配列番号１６８の配列）のみならず、ＩＧＦ ＹＬのＢ鎖の類縁体およびＩＧＦ ＹＬのＢ鎖の誘導体を包含することを意図しており、これには、Ｂ１６の位置またはＢ２５位置のアミノ酸の４−アミノフェニルアラニンへの修飾あるいは、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ９、Ｂ１０、Ｂ１３、Ｂ１４、Ｂ１７、Ｂ２０、Ｂ２１、Ｂ２２、Ｂ２３、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９、Ｂ３０から選択される位置での１つまたは２つ以上のアミノ酸置換あるいは、Ｂ１〜４およびＢ２６〜３０の位置のうちのいずれかまたはすべての欠失を含む。
「同一性」という用語は、本明細書で使用する場合、２つまたは３つ以上の配列間の類似性と関連している。同一性は、同一残基数を残基の総数で割り、その結果に１００を掛けてパーセンテージを得ることで求められる。このため、完全に同じ配列の２つのコピーは同一性が１００％であるのに対し、比較したときにアミノ酸の欠失、付加または置換のある２つの配列の同一性の度合いは、それよりも低くなる。BLAST（Basic Local Alignment Search Tool, Altschul et al. (1993) J. Mol. Biol. 215:403-410）などのアルゴリズムを用いたものなどのいくつかのコンピュータープログラムを利用して配列の同一性を求められることは、当業者にはわかるであろう。
本明細書で使用する場合、第２の受容体と比較した場合の第１の受容体に対する分子の「選択性」という表現は、第２の受容体に対する分子のＥＣ５０を第１の受容体に対する分子のＥＣ５０で割った比を示す。たとえば、第１の受容体に対するＥＣ５０が１ｎＭで、第２の受容体に対するＥＣ５０が１００ｎＭの分子は、第２の受容体と比較した場合の第１の受容体に対する選択性が１００倍である。
本明細書で使用する場合、アミノ酸の「修飾」とは、アミノ酸の置換あるいは、化学基をアミノ酸に付加および／またはアミノ酸から除去することによるアミノ酸の誘導をいい、ヒトタンパク質に一般的に見られる２０種類のアミノ酸のみならず、典型的ではないアミノ酸または非天然のアミノ酸との置換を含む。典型的ではないアミノ酸の商業的な入手先として、Sigma-Aldrich（Milwaukee, WI）、ChemPep Inc.（Miami, FL）、Genzyme Pharmaceuticals（Cambridge, MA）があげられる。典型的ではないアミノ酸については、商業的な提供元から購入してもよいし、天然のアミノ酸から新たに合成あるいは、化学的に修飾または誘導体化してもよい。
本明細書で使用する場合、アミノ酸の「置換」とは、１つのアミノ酸残基が異なるアミノ酸残基と入れ換わることをいう。
本明細書で使用する場合、「保存的なアミノ酸置換」という表現は、本明細書では、以下の５群のうちの１つの範囲内での交換として定義される。
Ｉ．脂肪族、非極性またはわずかに極性の小さな残基
Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ
ＩＩ．極性を有し、負の電荷を持つ残基およびそのアミド
Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、システイン酸、ホモシステイン酸
ＩＩＩ．極性を有し、正の電荷を持つ残基
Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、オルニチン（Ｏｒｎ）
ＩＶ．脂肪族で非極性の大きな残基
Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ホモシステイン
Ｖ．大きな芳香族残基
Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、アセチルフェニルアラニン
本明細書で使用する場合、一般的な用語である「ポリエチレングリコール鎖」または「ＰＥＧ鎖」とは、一般式（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯＨ（式中、ｎは少なくとも２である）で表される、エチレンオキシドと水との縮合ポリマー（分岐状または直鎖状）の混合物をいう。「ポリエチレングリコール鎖」または「ＰＥＧ鎖」は、その概算の平均分子量を示すのに、数字の接尾辞と組み合わせて用いられる。たとえば、ＰＥＧ−５，０００は、総分子量の平均が約５，０００ダルトンのポリエチレングリコール鎖を示す。
本明細書で使用する場合、「ＰＥＧ化」およびこれと同様の用語は、化合物にポリエチレングリコール鎖を結合することで、その天然の状態から修飾された化合物をいう。「ＰＥＧ化ポリペプチド」とは、ポリペプチドに共有結合しているＰＥＧ鎖を有するポリペプチドのことである。
本明細書で使用する場合、「アシル化された」アミノ酸は、それを製造する手段とは関係なく、天然のアミノ酸に対して非天然のアシル基を含むアミノ酸である。アシル化されたアミノ酸およびアシル化されたペプチドを製造する方法の例は、当分野で知られており、アミノ酸をアシル化した上でペプチドに含ませることや、ペプチド合成後にこのペプチドを化学的にアシル化することを含む。いくつかの実施形態では、アシル基が、ペプチドに、（ｉ）血中半減期を延ばすこと、（ｉｉ）作用開始を遅らせること、（ｉｉｉ）作用時間を延ばすこと、（ｉｖ）プロテアーゼに対する耐性を改善すること、（ｖ）インスリン受容体における作用を増強することのうちの１つまたは２つ以上をさせる。
本明細書で使用する場合、「アルキル化された」アミノ酸は、それを製造する手段とは関係なく、天然のアミノ酸に対して非天然のアルキル基を含むアミノ酸である。アルキル化されたアミノ酸およびアルキル化されたペプチドを製造する方法の例は、当分野で知られており、アミノ酸をアルキル化した上でペプチドに含ませることや、ペプチド合成後にこのペプチドを化学的にアルキル化することを含む。特定の理論に拘泥することなく、ペプチドのアルキル化によって、ペプチドのアシル化と同一でないにしても似たような作用、たとえば、血中半減期を延ばすこと、作用開始を遅らせること、作用時間を延ばすこと、プロテアーゼに対する耐性を改善すること、インスリン受容体における作用を増強することなどが達成されると考えられている。
本明細書で使用する場合、「リンカー」とは、２つの別々のものを互いに結合する、結合、分子または分子群である。リンカーは、２つのものの間に最適な間隔を提供するものであってもよいし、あるいは、２つのものを互いに分離できるようにする不安定な結合をさらに提供するものであってもよい。不安定な結合としては、光切断可能な基、酸感受性部分、塩基感受性部分、酵素切断可能な基があげられる。
本明細書で使用する場合、「ＩＧＦダイマー」は、リンカーを介して互いに共有結合している２つのＩＧＦ ＹＬ類縁体ペプチド（各々それ自体がＡ鎖とＢ鎖とを有する）を有する複合体である。ＩＧＦダイマーという用語は、他に何ら限定的な言い回しを伴わずに用いられる場合、ＩＧＦホモダイマーとＩＧＦヘテロダイマーの両方を包含する。ＩＧＦホモダイマーが同一のサブユニットを２つ含むのに対し、ＩＧＦヘテロダイマーは、互いに実質的に同様ではあるが同一ではない２つのサブユニットを含む。
ｎが１〜６であり得る、「Ｃ１〜Ｃｎアルキル」という表現は、本明細書で使用する場合、１個から指定数までの炭素原子を有する分岐状または直鎖状のアルキル基を表す。一般的なＣ１〜Ｃ６アルキル基としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシルなどがあげられるが、これらに限定されるものではない。
ｎが２〜６であり得る、「Ｃ２〜Ｃｎアルケニル」という表現は、本明細書で使用する場合、２個から指定数までの炭素原子と、少なくとも１個の二重結合とを有する、分岐状または直鎖状のオレフィン系不飽和基を表す。このような基の例としては、１−プロペニル、２−プロペニル（−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）、１，３−ブタジエニル、（−ＣＨ＝ＣＨＣＨ＝ＣＨ２）、１−ブテニル（−ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ３）、ヘキセニル、ペンテニルなどがあげられるが、これらに限定されるものではない。
ｎが２〜６であり得る「Ｃ２〜Ｃｎアルキニル」という表現は、２個からｎ個までの炭素原子と、少なくとも１個の三重結合とを有する分岐状または直鎖状の不飽和基を示す。このような基の例としては、１−プロピニル、２−プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、１−ペンチニルなどがあげられるが、これらに限定されるものではない。
本明細書で使用する場合、「アリール」という用語は、フェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、インダニル、インデニルなどであるがこれらに限定されるものではない、１つまたは２つの芳香環を有する単環式または二環式の炭素環系をいう。アリール環の大きさと置換基または結合基の存在については、存在する炭素の数で表示する。たとえば、「（Ｃ１〜Ｃ３アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）」という表現は、Ｃ１〜Ｃ３のアルキル鎖を介して親部分（parent moiety）に結合しているＣ５〜Ｃ１０のアリールを示す。
「ヘテロアリール」という用語は、本明細書で使用する場合、１個または２個の芳香環を含有し、この芳香環に、窒素原子、酸素原子または硫黄原子を少なくとも１個含有する、単環式または二環式の環系を示す。ヘテロアリール環の大きさと、置換基または結合基の存在については、存在する炭素の数で表示する。たとえば、「（Ｃ１〜Ｃｎアルキル）（Ｃ５〜Ｃ６ヘテロアリール）」という表現は、１〜「ｎ」個の炭素からなるアルキル鎖を介して親部分に結合しているＣ５〜Ｃ６のヘテロアリールを示す。
本明細書で使用する場合、「ハロ」という用語は、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素からなる群の１つまたは２つ以上の構成要素を示す。
本明細書で使用する場合、「患者」という用語は、他に指定のないかぎり、飼いならされた温血脊椎動物（たとえば、家畜、ウマ、ネコ、イヌ、その他のペットを含むがこれらに限定されるものではない）、ヒトを包含することを意図している。
「単離された」という表現は、本明細書で使用する場合、それがある本来の環境から取り出されていることを意味する。いくつかの実施形態では、組換え方法によって類縁体を作製し、その類縁体を宿主細胞から単離する。
「精製された」という表現は、本明細書で使用する場合、ある分子または化合物が天然の環境または本来の環境で通常一緒に存在する不純物を実質的に含まない形で、その分子または化合物を単離することに関し、元の組成物の他の成分から分離した結果、純度が増していることを意味する。「精製されたポリペプチド」という表現は、本明細書では、他の化合物から分離されているポリペプチドを説明するのに用いられる。ここで、他の化合物とは、核酸分子、脂質、炭水化物を含むがこれらに限定されるものではない。
「擬似ペプチド」とは、既存のペプチドの一般構造とは構造が異なるが、たとえば、既存のペプチドの生物学的活性を模すなどで、そのペプチドと似たような方法で機能する化合物をいう。擬似ペプチドは一般に、天然のアミノ酸および／または非天然のアミノ酸を有するが、ペプチド骨格への修飾を有するものであってもよい。たとえば、擬似ペプチドは、たとえば逆反転断片などの非ペプチド部分が挿入または置換された、あるいは、アザペプチド結合（ＣＯがＮＨで置換）または擬似ペプチド結合（たとえばＮＨがＣＨ２で置換）などの非ペプチド結合またはエステル結合（たとえば、１つまたは２つ以上のアミド（−ＣＯＮＨＲ−）結合がエステル（ＣＯＯＲ）結合で置換されたデプシペプチド）が取り込まれた、天然のアミノ酸の配列を含むものであってもよい。あるいは、擬似ペプチドは、天然のアミノ酸を持たないものであってもよい。
本明細書で使用する場合、「電荷を持つアミノ酸」または「電荷を持つ残基」という表現は、生理的ｐＨの水溶液中で負の電荷を持つ（すなわち、脱プロトン化された）または正の電荷を持つ（すなわち、プロトン化された）側鎖を有するアミノ酸を示す。たとえば、負の電荷を持つアミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン酸、ホモシステイン酸、ホモグルタミン酸があげられるのに対し、正の電荷を持つアミノ酸としては、アルギニン、リジン、ヒスチジンがあげられる。電荷を持つアミノ酸としては、ヒトタンパク質に一般的に見られる２０種類のアミノ酸のみならず、典型的ではないアミノ酸または非天然のアミノ酸のうち、電荷を持つアミノ酸があげられる。
本明細書で使用する場合、「酸性アミノ酸」という用語は、第２の酸性部分（アミノ酸のαカルボン酸以外）を含むアミノ酸を示し、たとえば、側鎖のカルボン酸基またはスルホン酸基があげられる。
＝＝略記＝＝
インスリン類縁体を以下のように略記する。
インスリンのＡ鎖およびＢ鎖について、Ａ鎖を大文字のＡで、Ｂ鎖を大文字のＢで表記する。上付の０（たとえばＡ０またはＢ０）は基本配列がインスリン配列（Ａ鎖は配列番号１、Ｂ鎖は配列番号２）であることを表し、上付の１（たとえばＡ１またはＢ１）は基本配列がＩＧＦ−１配列（Ａ鎖は配列番号５、Ｂ鎖は配列番号６）であることを表す。天然のインスリンおよびＩＧＦ配列から外れる修飾については、Ａ鎖またはＢ鎖の表示の後ろにカッコで示してある（たとえば、［Ｂ１（Ｈ５、Ｈ１０、Ｙ１６、Ｌ１７）：Ａ１（Ｈ８、Ｎ１８、Ｎ２１）］）。この場合、一文字のアミノ酸の略記が置換を示し、数字は天然のインスリンの番号を用いてＡ鎖またはＢ鎖それぞれの置換の位置を示す。Ａ鎖とＢ鎖との間のコロンは２本鎖インスリンを示すのに対し、ダッシュは共有結合を示し、このため単鎖類縁体である。単鎖類縁体では、Ａ鎖とＢ鎖との間に橋渡し部分が含まれ、Ｃ１の表記は天然のＩＧＦ １のＣペプチド（配列番号１７）であることを示す。橋渡し部分について「Ｃ８の位置」といえば、配列番号１７の８番目のアミノ酸に対応する位置にあるアミノ酸を示す。
＝＝実施形態＝＝
本明細書で開示するように、本出願人らは、高活性の単鎖インスリン類縁体を発見した。特に、本出願人らは、高活性の直鎖状単鎖インスリンアゴニストを形成するために、ヒトインスリンのＢ鎖およびＡ鎖あるいは、それらの類縁体または誘導体を共有結合する、独特な橋渡し部分を発見した。一実施形態では、橋渡し部分は、Ｂ鎖のカルボキシ末端をＡ鎖のアミノ末端に共有結合する。
本明細書で開示するように、最適な大きさの橋渡し部分を用いて、ヒトインスリンのＡ鎖およびＢ鎖あるいは、それらの類縁体または誘導体を結合可能である。この場合、介在する橋渡し部分を通じて、Ｂ鎖のＢ２５アミノ酸のカルボキシ末端は、橋渡し部分の第１の端に直接結合し、橋渡し部分の第２の端は、Ａ鎖のＡ１アミノ酸のアミノ末端に直接結合する。一実施形態では、橋渡し部分は８から１７個のアミノ酸からなるペプチドを有し、特に、一実施形態では、ペプチドは、ＩＧＦ−１のＣペプチドの類縁体を表す。もうひとつの実施形態では、橋渡し部分は、８〜１６アミノ酸長の配列に近い比較的短い二官能性の非ペプチドポリマーリンカーを有する。一実施形態によれば、非ペプチド橋渡し部分は、およそ４から２０、８から１８、８から１６、８から１４、８から１２、１０から１４、１０から１２または１１から１３のモノマーからなるポリエチレングリコールリンカーである。
一実施形態では、一般構造Ｂ−ＬＭ−Ａを有する単鎖インスリンアゴニスト類縁体が提供される。ここで、ＢはインスリンのＢ鎖を表し、ＡはインスリンのＡ鎖を表し、ＬＭは、Ｂ鎖のカルボキシ末端をＡ鎖のアミノ末端に結合している橋渡し部分を表す。インスリンのＡ鎖およびＢ鎖は、本明細書に開示したものを含めて、ヘテロ二本鎖形態として互いに結合すると、機能的インスリンを形成する、既知のどのようなインスリン配列であってもよい。本出願人らは、インスリンのＡ鎖とＢ鎖とを一緒に結合して活性のある単鎖インスリン類縁体を形成するのに使用できる、本明細書に開示したような多岐にわたる橋渡し部分を発見した。一実施形態によれば、橋渡し部分は、橋渡し部分のアミノ酸の側鎖および／またはＡ鎖のＡ９、Ａ１４、Ａ１５からなる群から選択される位置またはＢ鎖のＮ末端のαアミン（位置Ｂ１、Ｂ２）または位置Ｂ１０、Ｂ２２、Ｂ２８またはＢ２９におけるアミノ酸の側鎖に結合した親水体をさらに有する。一実施形態では、親水体は、橋渡し部分のアミノ酸および／またはＢ鎖のＮ末端のαアミンに結合したポリエチレン鎖である。一実施形態では、橋渡し部分（ＬＭ）は、１７アミノ酸長以下で、配列Ｘ５１Ｘ５２Ｘ５３Ｘ５４Ｘ５５Ｘ５６Ｘ５７Ｘ５８（配列番号９）を有するアミノ酸配列を有し、ここで、
Ｘ５１は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニンからなる群から選択され、
Ｘ５２は、チロシン以外のアミノ酸であり、
Ｘ５３からＸ５６は各々独立に、アミノ酸であり、
Ｘ５７およびＸ５８は独立に、アルギニン、リジン、システイン、ホモシステイン、アセチル−フェニルアラニンまたはオルニチンである。一実施形態では、橋渡し部分は、橋渡し部分のアミノ酸の側鎖に結合した親水体をさらに有する。一実施形態では、橋渡し部分は、配列Ｘ５１Ｘ５２ＧＳＳＳＸ５７Ｘ５８（配列番号２９）またはＸ５１Ｘ５２ＧＳＳＳＸ５７Ｘ５８ＡＰＱＴ（配列番号４６）を有し、Ｘ５１は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリンからなる群から選択され、Ｘ５２は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシンまたはプロリンであり、Ｘ５７またはＸ５８は独立に、アルギニン、リジン、システイン、ホモシステイン、アセチル−フェニルアラニンまたはオルニチンであり、親水体は、橋渡し部分の７番目または８番目（すなわち、Ｘ５７またはＸ５８の位置）でアミノ酸の側鎖に結合する。橋渡し部分のアミノ酸の位置は、ＩＧＦ １（配列番号１７）の天然のＣ鎖における対応する位置に基づいて表記される。
一実施形態によれば、ヒトインスリンのＢ鎖およびＡ鎖あるいは、それらの類縁体または誘導体を有する、単鎖インスリンアゴニストポリペプチドが提供される。ここで、天然のＢ鎖におけるカルボキシ端の最後の５つのアミノ酸が欠失し（すなわち、Ｂ２６〜Ｂ３０）、アミノ酸Ｂ２５が介在する橋渡し部分を介してＡ鎖のアミノ酸Ａ１に結合する。一実施形態では、橋渡し部分は、一般構造Ｙ１−Ｚを有する。
ここで、
Ｙ１は、結合、Ｘ４６、Ｘ４６Ｘ４７、Ｘ４６Ｘ４７Ｘ４８、Ｘ４６Ｘ４７Ｘ４８Ｘ４９（配列番号２４）、Ｘ４６Ｘ４７Ｘ４８Ｘ４９Ｘ５０（配列番号１３）からなる群から選択され、Ｘ４６、Ｘ４７、Ｘ４８、Ｘ４９、Ｘ５０は各々、アミノ酸あるいはそのアミノ酸の類縁体または誘導体を表し、
Ｚは、少なくとも８アミノ酸長かつ１６アミノ酸長以下で、配列Ｘ５１Ｘ５２Ｘ５３Ｘ５４Ｘ５５Ｘ５６ＲＲ（配列番号１０）を有するアミノ酸配列を表し、ここで、
Ｘ５１は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニンからなる群から選択され、
Ｘ５２からＸ５６は各々独立に、アミノ酸あるいはそのアミノ酸の類縁体または誘導体である。一実施形態では、Ｘ５２は、チロシン以外のアミノ酸である。別の実施形態では、Ｘ５２は非芳香族アミノ酸であり、一実施形態では、Ｘ５２は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシンまたはプロリンである。別の実施形態では、Ｘ５１は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニンからなる群から選択され、Ｘ５２は、チロシン以外のアミノ酸であり、
Ｘ５３、Ｘ５４、Ｘ５５、Ｘ５６は独立に、グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、プロリンからなる群から選択される。別の一実施形態では、Ｘ５１は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニンからなる群から選択され、Ｘ５２は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、プロリンからなる群から選択され、Ｘ５３はグリシン以外であり、Ｘ５４およびＸ５５は独立に、グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、プロリンからなる群から選択され、Ｘ５６はセリンである。
もうひとつの実施形態では、橋渡し部分は、一般構造Ｙ１−Ｗを有する。
ここで、
Ｙ１は、結合、Ｘ４６、Ｘ４６Ｘ４７、Ｘ４６Ｘ４７Ｘ４８、Ｘ４６Ｘ４７Ｘ４８Ｘ４９（配列番号２４）からなる群から選択され、Ｘ４６、Ｘ４７、Ｘ４８、Ｘ４９は各々、アミノ酸あるいはそのアミノ酸の類縁体または誘導体を表すが、ただし、Ｙ１はＹＴＰＫＴ（配列番号１６）またはＦＮＫＰＴ（配列番号７６）ではなく、Ｗは、２〜１６個のモノマー単位からなるポリエチレングリコールを表す。
一実施形態では、Ａ鎖と、（天然のインスリン配列に対して）アミノ酸Ｂ２６〜Ｂ３０が除去されてＣ末端側が短縮されたＢ鎖とを有する単鎖インスリン類縁体が提供される。ここで、前記Ａ鎖およびＢ鎖は、ヒトインスリン配列あるいは、それらの類縁体または誘導体である。また、Ｂ鎖のＢ２５アミノ酸のカルボキシ末端は、橋渡し部分の第１の端に直接結合し、かつ、橋渡し部分の第２の端は、Ａ鎖のＡ１アミノ酸のアミノ末端に直接結合する。さらに、一実施形態では、橋渡し部分は、配列ＹＴＰＫＴ（配列番号１６）またはＦＮＫＰＴ（配列番号７６）を含まない。一実施形態では、Ｃ末端側が短縮されたＢ鎖は、配列番号２のアミノ酸５−２５を表すペプチドの類縁体を有し、前記類縁体は、５番目、９番目、１０番目、１３番目、１４番目、２１番目、２２番目、２５番目から選択されるアミノ酸の位置における１つ、１つから２つ、３つから４つ、４つから６つまたは最大８つのアミノ酸置換が、配列番号２の対応するアミノ酸５−２５とは異なる。一実施形態では、Ｃ末端側が短縮されたＢ鎖は、配列番号２のアミノ酸１−２５を表すペプチドの類縁体を有し、前記類縁体は、２番目、３番目、４番目、５番目、９番目、１０番目、１３番目、１４番目、２１番目、２２番目、２５番目から選択されるアミノ酸の位置における１つ、１つから２つ、３つから４つ、４つから６つ、４つから８つまたは最大１０のアミノ酸置換が、配列番号２の対応するアミノ酸１−２５とは異なる。一実施形態では、Ｃ末端側が短縮されたＢ鎖は、配列番号２の対応するアミノ酸５−２５との配列同一性が少なくとも７０％、７５％、８０％、９０％または９５％であるペプチドを有する。一実施形態では、Ａ鎖は配列番号１の類縁体であり、この類縁体は、４番目、５番目、８番目、９番目、１０番目、１２番目、１４番目、１５番目、１８番目、２１番目から選択されるアミノ酸の位置における１つ、１つから２つ、３つから４つ、４つから８つまたは最大１０のアミノ酸置換が、配列番号１とは異なる。一実施形態では、Ａ鎖は、配列番号１との配列同一性が少なくとも７０％、７５％、８０％、９０％または９５％であるペプチドを有する。
一実施形態では、橋渡し部分は、
ａ）６〜１６個のモノマー単位からなるポリエチレングリコール
ｂ）少なくとも８アミノ酸長かつ１７アミノ酸長以下で、配列ＧＹＧＳＳＳＸ５７Ｒ（配列番号５１）またはＸ５１Ｘ５２Ｘ５３Ｘ５４Ｘ５５Ｘ５６Ｘ５７Ｘ５８（配列番号９）またはその擬似ペプチドを有する非天然のアミノ酸配列または
ｃ）前記ポリエチレングリコールと、１〜４個のアミノ酸からなる非天然のアミノ酸配列との組み合わせ
を有し、
ここで、
Ｘ５１は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニンからなる群から選択され、
Ｘ５２は、チロシン以外のアミノ酸であり、
Ｘ５３からＸ５６は各々独立に、アミノ酸であり、
Ｘ５７およびＸ５８は独立に、アルギニン、リジンまたはオルニチンである。
一実施形態では、一般構造Ｂ−ＬＭ−Ａを有する単鎖インスリンアゴニスト類縁体が提供され、ここで、Ｂは、配列Ｘ２５ＬＣＧＸ２９Ｘ３０ＬＶＸ３３Ｘ３４ＬＹＬＶＣＧＤＸ４２ＧＦＸ４５（配列番号５８）を有するインスリンのＢ鎖を表し、Ａは、配列ＧＩＶＸ４Ｘ５ＣＣＸ８Ｘ９Ｘ１０ＣＸ１２ＬＸ１４Ｘ１５ＬＸ１７Ｘ１８Ｘ１９ＣＸ２１−Ｒ１３（配列番号２２）を有するインスリンのＡ鎖を表し、ＬＭは、Ｂ鎖のカルボキシ末端をＡ鎖のアミノ末端に結合するペプチド橋渡し部分を表す。一実施形態では、橋渡し部分は、１７アミノ酸長以下で、配列Ｘ５１Ｘ５２Ｘ５３Ｘ５４Ｘ５５Ｘ５６Ｘ５７Ｘ５８（配列番号９）を有するアミノ酸配列を有し、ここで、
Ｘ４は、グルタミン酸またはアスパラギン酸であり、
Ｘ５はグルタミンまたはグルタミン酸であり、
Ｘ８は、ヒスチジン、スレオニンまたはフェニルアラニンであり、
Ｘ９は、セリン、アルギニン、リジン、オルニチンまたはアラニンであり、
Ｘ１０は、イソロイシンまたはセリンであり、
Ｘ１２はセリンまたはアスパラギン酸であり、
Ｘ１４は、チロシン、アルギニン、リジン、オルニチンまたはアラニンであり、
Ｘ１５は、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、アラニン、リジン、オルニチンまたはロイシンであり、
Ｘ１７は、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、アスパラギン酸またはリジン、オルニチンであり、
Ｘ１８は、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸またはスレオニンであり、
Ｘ１９は、チロシン、４−メトキシフェニルアラニンまたは４−アミノフェニルアラニンであり、
Ｘ２１は、アラニン、グリシン、セリン、バリン、スレオニン、イソロイシン、ロイシン、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、トリプトファン、チロシン、メチオニンからなる群から選択され、
Ｘ２５は、ヒスチジンおよびスレオニンからなる群から選択され、
Ｘ２９は、アラニン、グリシン、セリンからなる群から選択され、
Ｘ３０は、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸、システイン酸からなる群から選択され、
Ｘ３３は、アスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群から選択され、
Ｘ３４は、アラニンおよびスレオニンからなる群から選択され、
Ｘ４２は、アラニン、オルニチン、アルギニンからなる群から選択され、
Ｘ４５は、チロシン、ヒスチジン、アスパラギン、フェニルアラニンからなる群から選択され、
Ｘ５１は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニンからなる群から選択され、
Ｘ５２は、チロシン以外のアミノ酸であり、
Ｘ５３からＸ５６は各々独立に、アミノ酸であり、
Ｘ５７およびＸ５８は独立に、アルギニン、リジン、システイン、ホモシステイン、アセチル−フェニルアラニンまたはオルニチンである。一実施形態では、単鎖類縁体は、橋渡し部分のアミノ酸の側鎖またはＢ鎖のＮ末端のαアミンに、あるいは、Ａ鎖のＡ９、Ａ１４、Ａ１５からなる群から選択される位置またはＢ鎖の位置Ｂ１、Ｂ２、Ｂ１０、Ｂ２２、Ｂ２８またはＢ２９におけるアミノ酸の側鎖に共有結合した親水体をさらに有する。一実施形態では、親水体（たとえば、ＰＥＧ）は、Ｂ鎖のＮ末端のαアミンに結合する。一実施形態では、Ｂ２６〜Ｂ３０に対応する１つから５つのアミノ酸はＢ鎖のカルボキシ末端から取り除かれ、残りのカルボキシ末端のアミノ酸が橋渡し部分のアミノ末端に直接結合する。一実施形態では、Ｂ鎖は、配列Ｘ２５ＬＣＧＸ２９Ｘ３０ＬＶＸ３３Ｘ３４ＬＹＬＶＣＧＤＸ４２ＧＦＸ４５（配列番号５８）を有し、橋渡し部分は、配列（Ｙ１）ｋ−Ｘ５１Ｘ５２Ｘ５３Ｘ５４Ｘ５５Ｘ５６Ｘ５７Ｘ５８（Ｙ２）ｎ（配列番号９）を有し、Ａ鎖は、配列ＧＩＶＸ４ＥＣＣＸ８Ｘ９ＳＣＤＬＸ１４Ｘ１５ＬＥＸ１８Ｘ１９ＣＸ２１−Ｒ１３（配列番号１９）を有する。
＜橋渡し部分＞
ペプチドリンカー
一実施形態によれば、橋渡し部分は、ＩＧＦ １のＣ鎖配列（ＧＹＧＳＳＳＲＲＡＰＱＴ；配列番号１７）の誘導体である。一実施形態では、誘導体は、リジン、システイン オルニチン、ホモシステインまたはアセチル−フェニルアラニン残基のアミノ酸置換１つが配列番号１７とは異なるペプチドであり、別の実施形態では、リジン、システイン オルニチン、ホモシステインまたはアセチル−フェニルアラニンアミノ酸は、ＰＥＧ化されている。他の一実施形態では、橋渡し部分は、１つのリジン置換が配列番号１７とは異なるペプチドである。具体的な一実施形態では、置換は配列番号１７の８番目の位置でなされる。本出願人らは、ＩＧＦ １のＣ鎖配列およびその類縁体を橋渡し部分として用いると、活性が野生型のインスリンに近い単鎖インスリンポリペプチドが形成されることを発見した。さらに、ＩＧＦ １のＣ鎖配列の２番目が修飾されるか、カルボキシ末端の４つのアミノ酸がＩＧＦ １のＣ鎖配列から欠失したＩＧＦ １のＣ鎖配列類縁体を橋渡し部分として用いると、インスリンに対して選択性のある（すなわち、インスリン受容体に対する結合および／または活性がＩＧＦ−１受容体に対するよりも高い）単鎖インスリンポリペプチドが形成される。一実施形態では、単鎖インスリンポリペプチドは、インスリン受容体に対する親和性または活性が、ＩＧＦ−１受容体に対するよりも５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍または５０倍高い。
一実施形態によれば、橋渡し部分は、ＩＧＦ １のＣ鎖配列（ＧＹＧＳＳＳＲＲＡＰＱＴ；配列番号１７）の誘導体であり、１から３個のアミノ酸置換または１から２個のアミノ酸置換がＧＹＧＳＳＳＲＲ（配列番号１８）またはＧＡＧＳＳＳＲＲＡＰＱＴ（配列番号３６）とは異なる非天然の配列を有する。一実施形態では、アミノ酸置換のうちの少なくとも１つがリジン置換またはシステイン置換であり、一実施形態では、アミノ酸置換は保存的なアミノ酸置換である。一実施形態では、橋渡し部分は、１つのアミノ酸置換（たとえば、リジンまたはシステインの置換を含む）がＧＹＧＳＳＳＲＲ（配列番号１８）またはＧＡＧＳＳＳＲＲＡＰＱＴ（配列番号３６）とは異なる非天然のアミノ酸配列を有する、８から１７個のアミノ酸からなるペプチド（または擬似ペプチド）である。一実施形態では、橋渡し部分は、配列ＧＹＧＳＳＳＲＲ（配列番号１８）またはＧＡＧＳＳＳＲＲＡＰＱＴ（配列番号３６）を有する。一実施形態では、橋渡し部分は、配列ＧＡＧＳＳＳＲＸ５８ＡＰＱＴ（配列番号１６７）、ＧＹＧＳＳＳＸ５７Ｘ５８ＡＰＱＴ（配列番号３７）または１つのアミノ酸置換が配列番号１６７とは異なるアミノ酸を有し、ここで、Ｘ５７はアルギニンであり、Ｘ５８は、アルギニン、オルニチンまたはリジンであり、別の実施形態では、ポリエチレングリコール鎖は、前記橋渡し部分の８番目の位置でアミノ酸の側鎖に結合している。もうひとつの実施形態では、橋渡し部分は、配列ＧＸ５２ＧＳＳＳＲＸ５８ＡＰＱＴ（配列番号３８）を有し、ここで、Ｘ５２は非芳香族アミノ酸（たとえば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシンまたはプロリンなど）であり、Ｘ５８は、その側鎖に共有結合したポリエチレン鎖を有するアミノ酸を表す。一実施形態では、Ｘ５８は、ＰＥＧ化されたリジンである。一実施形態では、橋渡し部分は、配列ＧＹＧＳＳＳＲＸ５８（配列番号４５）またはＧＡＧＳＳＳＲＸ５８ＡＰＱＴ（配列番号１６７）を有し、ここで、Ｘ５８は、その側鎖に共有結合したポリエチレン鎖を有するアミノ酸を表す。
一実施形態によれば、橋渡し部分は、６〜１８、８〜１８、８〜１７、８〜１２、８〜１０、１３〜１７または１３〜１５のアミノ酸からなるペプチドまたは擬似ペプチド（またはそれらのアミノ酸類縁体または誘導体）であり、ペプチドの橋渡し部分は、２つまたは３つ以上の隣接する塩基性アミノ酸残基を有する。一実施形態によれば、橋渡し部分は、配列Ｘ５１Ｘ５２Ｘ５３Ｘ５４Ｘ５５Ｘ５６Ｘ５７Ｘ５８（配列番号９）を有する、８から１７個の非天然のアミノ酸からなる配列であり、ここで、Ｘ５１、Ｘ５２、Ｘ５３、Ｘ５４、Ｘ５５、Ｘ５６は独立に、アミノ酸あるいはそのアミノ酸の類縁体または誘導体であり、Ｘ５７およびＸ５８は、塩基性アミノ酸である。一実施形態によれば、橋渡し部分は、全長Ｂ鎖を全長Ａ鎖に結合する配列Ｘ５１ＡＸ５３Ｘ５４Ｘ５５Ｘ５６Ｘ５７Ｘ５８（配列番号７０）を有する、８から１２個の非天然のアミノ酸からなる配列であり、ここで、Ｘ５１、Ｘ５３、Ｘ５４、Ｘ５５、Ｘ５６は独立に、アミノ酸あるいはそのアミノ酸の類縁体または誘導体であり、Ｘ５７およびＸ５８は、塩基性アミノ酸である。一実施形態では、Ｘ５７およびＸ５８のうちの一方は、ＰＥＧ化されたリジン残基を表す。別の実施形態では、Ｘ５７およびＸ５８は独立に、アルギニン、リジン、オルニチンからなる群から選択される。
一実施形態では、橋渡し部分は、８〜１２、８〜１０、１３〜１７または１３〜１５のアミノ酸からなり、配列Ｘ５１Ｘ５２Ｘ５３Ｘ５４Ｘ５５Ｘ５６Ｘ５７Ｒ（配列番号２５）を有するペプチドまたは擬似ペプチドであり、ここで、Ｘ５１、Ｘ５２、Ｘ５３、Ｘ５４、Ｘ５５は独立に、アミノ酸あるいはそのアミノ酸の類縁体または誘導体であり、Ｘ５７は、アルギニン、リジンまたはオルニチンである。一実施形態では、Ｘ５１は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニンからなる群から選択されるおよびＸ５２は、チロシン以外のアミノ酸である。一実施形態では、Ｘ５２は非芳香族アミノ酸であり、具体的な一実施形態では、Ｘ５２はアラニンまたはプロリンである。一実施形態では、橋渡し部分はアミノ酸の側鎖でＰＥＧ化され、別の実施形態では、橋渡し部分の８番目の位置にあるアミノ酸がＰＥＧ化されている。
もうひとつの実施形態では、橋渡し部分は、８〜１２、８〜１０、１３〜１７または１３〜１５のアミノ酸からなり、配列Ｘ５１Ｘ５２Ｘ５３Ｘ５４Ｘ５５ＳＲＲ（配列番号２６）を有するペプチドまたは擬似ペプチドであり、ここで、Ｘ５１、Ｘ５２、Ｘ５３、Ｘ５４、Ｘ５５は独立に、アミノ酸あるいはそのアミノ酸の類縁体または誘導体である。一実施形態によれば、
Ｘ５１は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニンからなる群から選択され、
Ｘ５２は、チロシン以外のアミノ酸であり、
Ｘ５３、Ｘ５４、Ｘ５５、Ｘ５６は独立に、グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、プロリンからなる群から選択される。一実施形態では、Ｘ５１およびＸ５２は独立に、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリンからなる群から選択される。
一実施形態では、橋渡し部分は、８〜１７アミノ酸長であり、配列Ｘ５１Ｘ５２Ｘ５３Ｘ５４Ｘ５５Ｘ５６ＲＲ（配列番号１０）を有する非天然のポリペプチドであり、ここで、Ｘ５２は、たとえばアラニンなどの非芳香族アミノ酸である。一実施形態では、橋渡し部分は、８〜１７アミノ酸長であり、配列Ｘ５１Ｘ５２ＧＳＳＳＲＲ（配列番号２７）を有し、ここで、Ｘ５１は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニンからなる群から選択され、Ｘ５２は、非芳香族アミノ酸（たとえば、アラニンなど）である。一実施形態では、橋渡し部分は、８〜１７アミノ酸長であり、Ｘ５１Ｘ５２ＧＳＳＳＲＲ（配列番号２７）とは１つのアミノ酸置換が異なる配列を有する。この場合のアミノ酸置換は、側鎖でＰＥＧ化されたアミノ酸である。また、Ｘ５１は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニンからなる群から選択され、Ｘ５２は、非芳香族アミノ酸（たとえば、アラニンなど）である。
一実施形態では、橋渡し部分は、配列Ｘ５１ＡＸ５３Ｘ５４Ｘ５５Ｘ５６Ｘ５７Ｒ（配列番号２８）またはその擬似ペプチドを有する８から１７個のアミノ酸配列であり、ここで、Ｘ５１、Ｘ５３、Ｘ５４、Ｘ５５、Ｘ５６、Ｘ５７は独立に、アミノ酸あるいはそのアミノ酸の類縁体または誘導体である。一実施形態では、Ｘ５１は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニンからなる群から選択され、Ｘ５３、Ｘ５４、Ｘ５５、Ｘ５６は独立に、グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、プロリンからなる群から選択され、Ｘ５７は、塩基性アミノ酸（たとえば、アルギニン、リジンまたはオルニチンなど）である。
一実施形態では、橋渡し部分は、配列Ｘ５１Ｘ５２ＧＳＳＳＸ５７Ｘ５８（配列番号２９）またはＸ５１Ｘ５２ＧＳＳＳＸ５７Ｘ５８ＡＰＱＴ（配列番号４６）を有する８から１７個のアミノ酸配列であり、ここで、Ｘ５１は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニンからなる群から選択され、Ｘ５２は非芳香族アミノ酸であり、Ｘ５７およびＸ５８は独立に、アルギニン、リジン、オルニチンからなる群から選択される。一実施形態では、橋渡し部分は、たとえば、橋渡し部分の８番目の位置にあるアミノ酸など、橋渡し部分のアミノ酸の側鎖に結合したポリエチレングリコール鎖をさらに有する。別の実施形態では、橋渡し部分は、配列Ｘ５１Ｘ５２ＧＳＳＳＲＲ（配列番号２７）、配列番号２７の擬似ペプチドあるいは、配列番号２７の３〜８番目のいずれか１つの位置で１つのアミノ酸が配列番号２７とは異なるアミノ酸配列を有する８から１７個のアミノ酸配列であり、ここで、Ｘ５１は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニンからなる群から選択され、Ｘ５２はアミノ酸であるが、ただし、橋渡しペプチドがアミノ酸８つより長い場合、Ｘ５２はチロシン以外である。一実施形態では、橋渡し部分は、配列Ｘ５１Ｘ５２ＧＳＳＳＲＲ（配列番号２７）、配列番号２７の擬似ペプチドあるいは、配列番号２７の３〜８番目のいずれか１つの位置で１つ、２つまたは３つのアミノ酸置換が配列番号２７とは異なるアミノ酸配列からなる８から１７個のアミノ酸配列であり、ここで、Ｘ５１は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニンからなる群から選択され、Ｘ５２はアミノ酸である。一実施形態では、橋渡し部分は、８アミノ酸長のペプチドであり、配列ＧＹＧＳＳＳＲＲ（配列番号１８）または１つのアミノ酸置換が配列番号１８とは異なるアミノ酸配列、あるいはその誘導体を有する。
一実施形態では、橋渡し部分は、少なくとも８アミノ酸長であるが１７アミノ酸長以下であり、配列（Ｙ１）ｋ−Ｘ５１Ｘ５２Ｘ５３Ｘ５４Ｘ５５Ｘ５６Ｘ５７Ｘ５８（Ｙ２）（配列番号９）を有し、ここで、
Ｘ５１は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリンからなる群から選択され、
Ｘ５２は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシンまたはプロリンであり、
Ｘ５３からＸ５６は各々独立に、アミノ酸であり、
Ｘ５７およびＸ５８は独立に、アルギニン、リジン、システイン、ホモシステイン、アセチル−フェニルアラニンまたはオルニチンであり、
ｋは０または１であり、
Ｙ１は、Ｘ４６、Ｘ４６Ｘ４７、Ｘ４６Ｘ４７Ｘ４８、Ｘ４６Ｘ４７Ｘ４８Ｘ４９（配列番号２４）、Ｘ４６Ｘ４７Ｘ４８Ｘ４９Ｘ５０（配列番号１３）の群から選択され、
Ｙ２は、Ｘ７０、Ｘ７０Ｘ７１、Ｘ７０Ｘ７１Ｘ７２、Ｘ７０Ｘ７１Ｘ７２Ｘ７３（配列番号１５）の群から選択され、
Ｘ４６からＸ５０およびＸ７０からＸ７３は各々独立に、アミノ酸である。一実施形態では、橋渡しペプチドは、ＰＥＧ化されている。一実施形態では、ｋは０であり、Ｙ２はＸ７０Ｘ７１Ｘ７２Ｘ７３（配列番号１５）である。別の実施形態では、ｋは１であり、Ｙ２はＸ７０Ｘ７１Ｘ７２Ｘ７３（配列番号１５）である。一実施形態では、
Ｘ４６は、フェニルアラニンまたはチロシンであり、
Ｘ４７はアスパラギンまたはスレオニンであり、
Ｘ４８は、アスパラギン酸−リジンジペプチド、アルギニン−プロリンジペプチド、リジン−プロリンジペプチドまたはプロリン−リジンジペプチドであり、
Ｘ４９はスレオニンである。一実施形態では、Ｘ７０はアラニンであり、Ｘ７１はプロリンであり、Ｘ７２はグルタミンであり、Ｘ７３はスレオニンである。一実施形態では、ｋは０であり、Ｙ２はＡＰＱＴ（配列番号８２）である。一実施形態では、Ｙ１は、Ｆ、Ｙ、ＦＮ、ＹＴ、ＦＤ、ＦＥ、ＹＤ、ＹＥからなる群から選択される。一実施形態では、インスリンのＢ鎖が天然のインスリン（配列番号２）または天然のＩＧＦ−１（配列番号６）ではない場合、Ｙ１は、ＦＮＫＰＴ（配列番号７６）またはＦＮＰＫＴ 配列番号８１）である。
一実施形態では、橋渡し部分は、配列Ｘ５１ＡＧＳＳＳＲＲＡＰＱＴ（配列番号３０）あるいは、配列番号３０の３番目〜１２番目の位置から選択される位置で１〜３個のアミノ酸置換が配列番号３０とは異なるアミノ酸配列からなる、１２個のアミノ酸で構成される配列であり、ここで、Ｘ５１は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニンからなる群から選択されるか、配列番号３０の擬似ペプチドである。一実施形態では、橋渡し部分は、配列Ｘ５１ＡＧＳＳＳＲＲＡＰＱＴ（配列番号３０）あるいは、配列番号３０の３番目〜１０番目の位置から選択される位置で１つのリジンまたはシステインのアミノ酸置換が配列番号３０とは異なるアミノ酸配列からなる、１２個のアミノ酸で構成される配列であり、ここで、Ｘ５１は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニンからなる群から選択されるか、配列番号３０の擬似ペプチドである。一実施形態では、リジンまたはシステインのアミノ酸置換は、ＰＥＧ化されたリジンまたはシステインのアミノ酸である。
もうひとつの実施形態では、橋渡し部分は、配列ＧＸ５２ＧＳＳＳＲＲ（配列番号３１）を有する８から１７個のアミノ酸配列であり、ここで、Ｘ５２は、アミノ酸、配列番号３１の擬似ペプチドあるいは、配列番号３１の１番目、３番目、４番目、５番目、６番目、７番目または８番目のいずれかの位置で１つのアミノ酸置換が配列番号３１とは異なる、その類縁体であるが、ただし、橋渡しペプチドがアミノ酸８つより長い場合、Ｘ５２はチロシン以外である。一実施形態によれば、橋渡し部分は、ＧＹＧＳＳＳＲＲ（配列番号１８）、ＧＡＧＳＳＳＲＲ（配列番号３２）、ＧＡＧＳＳＳＲＲＡ（配列番号３３）、ＧＡＧＳＳＳＲＲＡＰ（配列番号３４）、ＧＡＧＳＳＳＲＲＡＰＱ（配列番号３５）、ＧＡＧＳＳＳＲＲＡＰＱＴ（配列番号３６）、ＰＹＧＳＳＳＲＲ（配列番号３９）、ＰＡＧＳＳＳＲＲ（配列番号４０）、ＰＡＧＳＳＳＲＲＡ（配列番号４１）、ＰＡＧＳＳＳＲＲＡＰ（配列番号４２）、ＰＡＧＳＳＳＲＲＡＰＱ（配列番号４３）、ＰＡＧＳＳＳＲＲＡＰＱＴ（配列番号４４）からなる群から選択される、８〜１７個のアミノ酸からなる配列を有する。一実施形態によれば、橋渡し部分は、たとえば、ＰＥＧ化されたリジンまたはＰＥＧ化されたシステインのアミノ酸置換など、１つのＰＥＧ化されたアミノ酸が、ＧＹＧＳＳＳＲＲ（配列番号１８）、ＧＡＧＳＳＳＲＲ（配列番号３２）、ＧＡＧＳＳＳＲＲＡ（配列番号３３）、ＧＡＧＳＳＳＲＲＡＰ（配列番号３４）、ＧＡＧＳＳＳＲＲＡＰＱ（配列番号３５）、ＧＡＧＳＳＳＲＲＡＰＱＴ（配列番号３６）、ＰＹＧＳＳＳＲＲ（配列番号３９）、ＰＡＧＳＳＳＲＲ（配列番号４０）、ＰＡＧＳＳＳＲＲＡ（配列番号４１）、ＰＡＧＳＳＳＲＲＡＰ（配列番号４２）、ＰＡＧＳＳＳＲＲＡＰＱ（配列番号４３）、ＰＡＧＳＳＳＲＲＡＰＱＴ（配列番号４４）とは異なるアミノ酸配列を有する。一実施形態では、ＰＥＧ化されたアミノ酸は、橋渡し部分の８番目の位置にある。
非ペプチドリンカー
一実施形態では、橋渡し部分は、８〜１６アミノ酸長の配列に近い比較的短い二官能性の非ペプチドポリマーリンカーである。一実施形態によれば、非ペプチド橋渡し部分は、およそ４から２０、８から１８、８から１６、８から１４、１０から１４、１０から１２または１１から１３のモノマーからなるポリエチレングリコールリンカーである。一実施形態では、天然のＢ鎖におけるカルボキシ端の最後の５つのアミノ酸が欠失し、アミノ酸Ｂ２５が共有結合で橋渡し部分に直接結合している単鎖インスリンアゴニストが提供される。橋渡し部分の第２の端は、Ａ鎖のアミノ酸Ａ１に共有結合するため、Ｂ鎖とＡ鎖とが橋渡し部分を介して結合する。一実施形態では、橋渡し部分は、少なくとも１０個であるが１６個以下のモノマー単位を有する直鎖状ポリエチレングリコールの橋渡し部分であり、もうひとつの実施形態では、ポリエチレングリコールの橋渡し部分は、少なくとも１２個であるが１６個以下のモノマー単位を有し、別の実施形態では、ポリエチレングリコールの橋渡し部分は、少なくとも１０個であるが１４個以下のモノマー単位を有する。
一実施形態によれば、ポリエチレングリコールの橋渡し部分は、以下の構造を有する。
Figure 0005969469
式中、ｍは、６から１８、８から１６、１０から１４または１１から１３の範囲の整数である。一実施形態では、ｍは、１０、１１、１２、１３または１４から選択される整数である。一実施形態では、ｍは１２である。
一実施形態では、天然のＢ鎖におけるカルボキシ端の最後の５つのアミノ酸が欠失し、アミノ酸Ｂ２５が、少なくとも８個であるが１６個以下のモノマー単位からなるポリエチレングリコールと、１〜４個のアミノ酸からなるアミノ酸配列とを含む橋渡し部分を介してＡ鎖のアミノ酸Ａ１に結合する、単鎖インスリンアゴニストが提供される。一実施形態によれば、橋渡し部分は、１〜４個のアミノ酸からなる配列と、前記１〜４個のアミノ酸からなる配列に共有結合する、少なくとも８アミノ酸長であるが１４アミノ酸長未満のモノマー単位からなる直鎖状ポリエチレングリコールとを有するが、ただし、アミノ酸配列は、ＹＴＰＫ（配列番号７８）またはＦＮＫＰ（配列番号７７）ではない。もうひとつの実施形態では、天然のＢ鎖におけるカルボキシ端の最後の５つのアミノ酸が欠失し、アミノ酸Ｂ２５が、少なくとも８アミノ酸長であるが１４アミノ酸長未満のモノマー単位からなるポリエチレングリコールと、２〜５個のアミノ酸からなる配列とを有する橋渡し部分を介してＡ鎖のアミノ酸Ａ１に結合する、単鎖インスリンアゴニストが提供される。２〜５個のアミノ酸からなる配列は、Ｂ鎖とポリエチレングリコール鎖との間あるいは、Ａ鎖とポリエチレングリコール鎖との間に位置してもよい。しかしながら、２〜５個のアミノ酸からなる配列がＢ鎖とポリエチレングリコール鎖との間に位置する場合、このアミノ酸配列は、ＹＴＰＫＴ（配列番号１６）またはＦＮＫＰＴ（配列番号７６）ではない。
一実施形態では、橋渡し部分は、一般構造Ｗ１−Ｚ１−Ｙ１を有する。
ここで、
Ｗ１およびＹ１は独立に、結合、Ｘ４６、Ｘ４６Ｘ４７、Ｘ４６Ｘ４７Ｘ４８、Ｘ４６Ｘ４７Ｘ４８Ｘ４９（配列番号２４）またはＸ４６Ｘ４７Ｘ４８Ｘ４９Ｘ５０（配列番号１３）であるが、ただし、Ｗ１は、ＹＴＰＫ（配列番号７８）またはＦＮＫＰ（配列番号７７）ではなく、Ｚ１は、以下の一般構造
Figure 0005969469
（ここで、ｍは６〜１４の範囲の整数である）のポリエチレングリコールを表し、Ｘ４６、Ｘ４７、Ｘ４８、Ｘ４９、Ｘ５０は各々独立に、アミノ酸である。一実施形態では、Ｘ４６、Ｘ４７、Ｘ４８、Ｘ４９、Ｘ５０は独立に、インスリンまたはＩＧＦ−１の位置Ｂ２６〜Ｂ３０に対する非天然のアミノ酸である。一実施形態では、Ｘ４６、Ｘ４７、Ｘ４８、Ｘ４９、Ｘ５０は独立に、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、プロリンからなる群から選択され、別の実施形態では、Ｘ４６、Ｘ４７、Ｘ４８、Ｘ４９、Ｘ５０は独立に、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシンからなる群から選択される。一実施形態では、Ｗ１は結合であり、Ｙ１は、Ｘ４６、Ｘ４６Ｘ４７またはＸ４６Ｘ４７Ｘ４８（配列番号２４）であり、Ｘ４６、Ｘ４７、Ｘ４８は各々アラニンであり、Ｚは、４〜１４個のモノマー単位からなるポリエチレングリコールである。一実施形態では、Ｙ１は結合であり、Ｗ１は、Ｘ４６、Ｘ４６Ｘ４７またはＸ４６Ｘ４７Ｘ４８（配列番号２４）であり、Ｘ４６、Ｘ４７、Ｘ４８は各々アラニンであり、Ｚは、４〜１４個のモノマー単位からなるポリエチレングリコールである。
一実施形態では、橋渡し部分は、アミノ酸１つ、２つ、３つまたは４つ離れた２つのポリエチレン鎖を有する。この実施形態では、橋渡し部分は、一般構造Ｗ２−Ｚ２−Ｙ２を有する。
ここで、
Ｗ２およびＹ２は独立に、以下の一般構造
Figure 0005969469
のポリエチレングリコールであり、Ｚ２は、結合、Ｘ４６、Ｘ４６Ｘ４７またはＸ４６Ｘ４７Ｘ４８であり（式中、ｍは、３〜７の範囲の整数である）、Ｘ４６、Ｘ４７、Ｘ４８は各々独立に、アミノ酸である。一実施形態では、Ｚ２は、Ｘ４６またはＸ４６Ｘ４７であり、別の実施形態では、Ｘ４６およびＸ４７は独立に、ＬｙｓまたはＣｙｓである。一実施形態では、Ｚ２は、ＰＥＧ化されたＬｙｓまたはＣｙｓアミノ酸を有する。一実施形態では、橋渡し部分は、エチレングリコールの合計で８〜１２個または１０〜１４個または１２個のモノマー単位を表す２つのポリエチレン鎖を有し、これらの鎖は、アミノ酸１つ離れている。一実施形態では、この１つのアミノ酸はリジンまたはシステインである。一実施形態では、Ｚ２はＰＥＧ化されたリジンである。
一実施形態では、Ａ鎖と、（天然のインスリン配列に対して）アミノ酸Ｂ２６〜Ｂ３０が除去されてＣ末端側が短縮されたＢ鎖とを有する単鎖インスリン類縁体が提供され、ここで、前記Ａ鎖およびＢ鎖は、ヒトインスリン配列あるいは、それらの類縁体または誘導体であり、Ｂ鎖のＢ２５アミノ酸のカルボキシ末端は、橋渡し部分の第１の端に直接結合し、橋渡し部分の第２の端は、Ａ鎖のＡ１アミノ酸のアミノ末端に直接結合する。一実施形態では、短縮されたＢ鎖は配列番号２１の配列を有し、この場合、Ｂ２５アミノ酸は橋渡しペプチドのＮ末端に直接結合する。この実施形態では、橋渡し部分は、
ａ）６〜１６個のモノマー単位からなるポリエチレングリコール
ｂ）少なくとも８アミノ酸長かつ１７アミノ酸長以下で、配列（Ｙ１）ｋ−Ｘ５１ＡＸ５３Ｘ５４Ｘ５５Ｘ５６Ｘ５７Ｒ（Ｙ２）ｎ（配列番号２８）、（Ｙ１）ｋ−Ｘ５１ＡＸ５３Ｘ５４Ｘ５５Ｘ５６ＲＲ（Ｙ２）ｎ（配列番号２３）、（Ｙ１）ｋ−ＧＹＧＳＳＳＸ５７Ｘ５８（Ｙ２）ｎ（配列番号８５）、（Ｙ１）ｋ−ＧＡＧＳＳＳＸ５７Ｘ５８（Ｙ２）ｎ（配列番号１６３）、（Ｙ１）ｋ−ＧＹＧＳＳＳＸ５７Ｒ（配列番号５１）または（Ｙ１）ｋ−Ｘ５１Ｘ５２ＧＳＳＳＸ５７Ｘ５８−（Ｙ２）ｎ（配列番号２９）を有する非天然のアミノ酸配列または
ｃ）前記ポリエチレングリコールと、１〜４個のアミノ酸からなる非天然のアミノ酸配列との組み合わせ
のいずれかを有し、
ここで、
ｎは０または１であり、
ｋは０または１であり、
Ｙ１は、Ｘ４６、Ｘ４６Ｘ４７の群から選択され、
Ｙ２は、Ｘ７０、Ｘ７０Ｘ７１、Ｘ７０Ｘ７１Ｘ７２、Ｘ７０Ｘ７１Ｘ７２Ｘ７３（配列番号１５）の群から選択され、
Ｘ５１は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニンからなる群から選択され、
Ｘ５２は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシンまたはプロリンであり、
Ｘ５７およびＸ５８は独立に、アルギニン、リジン、システイン、ホモシステイン、アセチル−フェニルアラニンまたはオルニチンであり、
Ｘ４６は、フェニルアラニンまたはチロシンであり、
Ｘ４７は、アスパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはスレオニンであり、
Ｘ７０〜Ｘ７３は独立にアミノ酸であるが、ただし、ｋが０である場合、橋渡しペプチドは、配列ＹＴＰＫＴ（配列番号１６）またはＦＮＫＰＴ（配列番号７６）を含まない。一実施形態では、Ｘ５７およびＸ５８のうちの一方は、親水体に結合するかアシル化されている。一実施形態では、Ｘ５７およびＸ５８のうちの一方は、ＰＥＧ化されている。一実施形態では、橋渡し部分は、配列（Ｙ１）ｋ−Ｘ５１ＡＸ５３Ｘ５４Ｘ５５Ｘ５６ＲＲ（Ｙ２）ｎ（配列番号２３）または（Ｙ１）ｋ−ＧＹＧＳＳＳＸ５７Ｒ（配列番号５１）を有し、ここで、
ｋは０または１であり、
ｎは０または１であり、
Ｘ５１は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニンからなる群から選択され、
Ｘ５３からＸ５６は各々独立に、アミノ酸であり、
Ｘ５７は、リジン、オルニチンまたはアルギニンであり、
Ｙ１は、Ｘ４６、Ｘ４６Ｘ４７、Ｘ４６Ｘ４７Ｘ４８の群から選択され、
＜ここで、Ｘ４６は、フェニルアラニンまたはチロシンであり、
Ｘ４７は、アスパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはスレオニンであり、
Ｘ４８は、アスパラギン酸、アルギニン、リジンまたはプロリンである＞
Ｙ２は、Ａ、ＡＰ、ＡＰＱ、ＡＰＱＴ（配列番号８２）からなる群から選択される。一実施形態では、Ａ鎖は、ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ（配列番号１）、ＧＩＶＤＥＣＣＦＲＳＣＤＬＲＲＬＥＭＹＣＡ（配列番号５）またはＧＩＶＥＥＣＣＦＲＳＣＤＬＡＬＬＥＴＹＣＡ（配列番号７）からなる群から選択される配列のアミノ酸配列誘導体であり、Ｂ鎖は、配列ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴ（配列番号２）またはＧＰＥＴＬＣＧＸ２６ＥＬＶＤＸ２７ＬＹＬＶＣＧＤＸ４２ＧＦＹＦＮＫＰＴ−Ｒ１４（配列番号１９７）を有し、ここで、Ｘ２６およびＸ２７は各々アラニンであり、Ｘ４２はアルギニンであるか、そのカルボキシ端が短くなった配列（Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９、Ｂ３０に対応する１〜５個のアミノ酸が欠失している）である。
＜インスリンのＡ鎖およびＢ鎖＞
本発明の単鎖インスリンアゴニストは、ヒトインスリンの天然のＢ鎖配列およびＡ鎖配列（それぞれ配列番号１および２）を有するものであってもよいし、互いに結合してヘテロ二本鎖になるとインスリンアゴニスト活性を呈する、それらの既知の類縁体または誘導体を有するものであってもよい。このような類縁体としては、たとえば、インスリン類縁体のインスリン活性に悪影響をおよぼすことのない１つまたは２つ以上のアミノ酸欠失、１つまたは２つ以上のアミノ酸置換および／または１つまたは２つ以上のアミノ酸挿入がある点でヒトインスリンのＡ鎖およびＢ鎖とは異なる、Ａ鎖およびＢ鎖を有するタンパク質があげられる。
ひとつのタイプのインスリン類縁体である「モノマーインスリン類縁体」が当分野で周知である。これらは、ヒトインスリンのすみやかに作用する類縁体（たとえば、インスリン類縁体）などであり、
（ａ）Ｂ２８の位置のアミノアシル残基が、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、ＶａｌまたはＡｌａで置換され、Ｂ２９の位置のアミノアシル残基がＬｙｓまたはＰｒｏである
（ｂ）Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９、Ｂ３０の位置のアミノアシル残基が欠失するか、非天然のアミノ酸で置換されている。一実施形態では、Ｂ２８の位置で置換されたＡｓｐまたは２８番目で置換されたＬｙｓと、Ｂ２９の位置で置換されたプロリンとを有する、インスリン類縁体が提供される。別のモノマーインスリン類縁体が、Chance, et al.の米国特許第５，５１４，６４６号；Chance, et al.の米国特許出願第０８／２５５，２９７号；Brems, et al., Protein Engineering, 5:527-533 (1992)；Brange, et al.の欧州特許出願公開第２１４，８２６号（１９８７年３月１８日公開）；Brange, et al., Current Opinion in Structural Biology, 1:934-940 (1991)に開示されている。モノマーインスリン類縁体を説明するために、これらの開示内容を本明細書に明示的に援用する。
インスリン類縁体は、アミド化されたアミノ酸から酸性形態への置き換えを含むものであってもよい。たとえば、ＡｓｎをＡｓｐまたはＧｌｕで置き換えてもよい。同様に、ＧｌｎをＡｓｐまたはＧｌｕで置き換えてもよい。特に、Ａｓｎ（Ａ１８）、Ａｓｎ（Ａ２１）またはＡｓｐ（Ｂ３）あるいは、これらの残基の任意の組み合わせを、ＡｓｐまたはＧｌｕで置き換えてもよい。また、Ｇｌｎ（Ａ１５）またはＧｌｎ（Ｂ４）あるいはその両方を、ＡｓｐまたはＧｌｕのいずれかで置き換えてもよい。
本明細書で開示するように、ヒトインスリンのＢ鎖およびＡ鎖あるいは、それらの類縁体または誘導体を有する単鎖インスリンアゴニストが提供され、ここで、Ｂ鎖のカルボキシ末端は、橋渡し部分を介してＡ鎖のアミノ末端に結合する。一実施形態では、Ａ鎖は、ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ（配列番号１）、ＧＩＶＤＥＣＣＦＲＳＣＤＬＲＲＬＥＭＹＣＡ（配列番号５）またはＧＩＶＥＥＣＣＦＲＳＣＤＬＡＬＬＥＴＹＣＡ（配列番号７）からなる群から選択されるアミノ酸配列であり、Ｂ鎖は、配列ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴ（配列番号２）、ＧＰＥＴＬＣＧＸ２６ＥＬＶＤＸ２７ＬＹＬＶＣＧＤＸ４２ＧＦＹＦＮＫＰＴ−Ｒ１４（配列番号１９７）を有し、ここで、Ｘ２６およびＸ２７は各々アラニンであり、Ｘ４２はアルギニンであるか、そのカルボキシ端が短くなった配列（Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９、Ｂ３０に対応する１〜５個のアミノ酸が欠失している）およびこれらの配列の類縁体であり、この場合、各配列は、Ａ５、Ａ８、Ａ９、Ａ１０、Ａ１４、Ａ１５、Ａ１７、Ａ１８、Ａ２１、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ９、Ｂ１０、Ｂ１３、Ｂ１４、Ｂ２０、Ｂ２２、Ｂ２３、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９、Ｂ３０から選択される天然のインスリンの位置に対応する位置（図５に示すペプチドアライメントを参照のこと）で、１〜５個のアミノ酸置換を含むように修飾されている。一実施形態では、アミノ酸置換は保存的なアミノ酸置換である。インスリンの所望の活性に悪影響をおよぼすことのない、これらの位置での好適なアミノ酸置換は当業者らに知られており、たとえば、Mayer, et al., Insulin Structure and Function, Biopolymers. 2007;88(5):687-713（その開示内容を本明細書に援用する）に示されている。
一実施形態によれば、単鎖インスリン類縁体ペプチドは、インスリンのＡ鎖およびインスリンのＢ鎖あるいは、これらの類縁体を含むものであってもよく、ここで、Ａ鎖は、ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ（配列番号１）、ＧＩＶＤＥＣＣＦＲＳＣＤＬＲＲＬＥＭＹＣＡ（配列番号５）またはＧＩＶＥＥＣＣＦＲＳＣＤＬＡＬＬＥＴＹＣＡ（配列番号７）のうちの少なくとも１つとの配列同一性が、天然のペプチドの長さ全体にわたって少なくとも７０％（たとえば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％）であるアミノ酸配列を有し、Ｂ鎖は、配列ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴ（配列番号２）、ＧＰＥＴＬＣＧＸ２６ＥＬＶＤＸ２７ＬＹＬＶＣＧＤＸ４２ＧＦＹＦＮＫＰＴ−Ｒ１４（配列番号１９７）のうちの少なくとも１つとの配列同一性が、天然のペプチドの長さ全体にわたって少なくとも６０％（たとえば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％）であるアミノ酸配列を有する。ここで、Ｘ２６およびＸ２７は各々アラニンであり、Ｘ４２はアルギニンであるか、そのカルボキシ端が短くなった配列（Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９、Ｂ３０に対応する１〜４個のアミノ酸が欠失している）である。
本発明の単鎖インスリンアゴニストのＢ鎖のアミノ末端またはＡ鎖のカルボキシ末端に、別のアミノ酸配列を加えてもよい。たとえば、Ｂ鎖のアミノ末端に、ひとつづきの負の電荷を持つアミノ酸（たとえば、１から１２アミノ酸長、１から１０アミノ酸長、１から８アミノ酸長または１から６アミノ酸長で、グルタミン酸およびアスパラギン酸などの負の電荷を持つアミノ酸を１つまたは２つ以上有するペプチドなど）を加えてもよい。一実施形態では、Ｂ鎖のアミノ末端の伸長部は、１〜６個の電荷を持つアミノ酸を有する。一実施形態では、単鎖インスリン類縁体は、配列Ｘ６０Ｘ６１Ｘ６２Ｘ６３Ｘ６４Ｘ６５Ｋ（配列番号４７）を有するＢ鎖のアミノ末端の伸長部を含み、ここで、Ｘ６０は、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸からなる群から選択され、Ｘ６１、Ｘ６２、Ｘ６３ Ｘ６４、Ｘ６５は独立に、グルタミン酸またはアスパラギン酸である。一実施形態では、Ｂ鎖のアミノ末端の伸長部は、配列ＧＸ６１Ｘ６２Ｘ６３Ｘ６４Ｘ６５Ｋ（配列番号４８）またはＸ６１Ｘ６２Ｘ６３Ｘ６４Ｘ６５ＲＫ（配列番号４９）を有し、ここで、Ｘ６１、Ｘ６２、Ｘ６３ Ｘ６４、Ｘ６５は独立に、グルタミン酸またはアスパラギン酸である。一実施形態では、Ｂ鎖は、配列ＧＥＥＥＥＥＫＧＰＥＨＬＣＧＡＨＬＶＤＡＬＹＬＶＣＧＤＸ４２ＧＦＹ（配列番号５０）を有し、ここで、Ｘ４２は、アラニン リジン、オルニチン、アルギニンからなる群から選択される。一実施形態によれば、ここに開示の単鎖インスリン類縁体は、Ａ鎖のＣ末端のカルボキシレートに代えて、Ｃ末端のアミドまたはエステルを有する。
また、修飾されたＩＧＦ Ｉ配列およびＩＧＦ ＩＩ配列を用いて、国際特許出願ＰＣＴ／２００９／０６８７１３（その開示内容を明示的に本明細書に援用する）に記載されたようにして、高活性単鎖インスリン類縁体を調製してもよい。特に、天然のインスリンのＢ１６およびＢ１７に対応する位置で、天然のＩＧＦアミノ酸に対してチロシンロイシンジペプチドの置換を有するＩＧＦ ＩおよびＩＧＦ ＩＩの類縁体では、インスリン受容体に対する活性が１０倍大きくなる。よって、本明細書に開示の単鎖インスリン類縁体は、ＩＧＦ Ｉ（配列番号５）またはＩＧＦ ＩＩ（配列番号７）のＡ鎖と、ＩＧＦ Ｉ（配列番号６）またはＩＧＦ ＩＩ（配列番号８）のＢ鎖または天然のインスリン（配列番号２）のＢ鎖とを含むものであってもよい。また、本明細書に開示の単鎖インスリン類縁体は、天然のインスリンのＡ鎖またはその類縁体と、ＩＧＦ Ｉ（配列番号６）またはＩＧＦ ＩＩ（配列番号８）のＢ鎖のみならず、前記Ｂ鎖の類縁体を含むものであってもよい。一実施形態では、単鎖インスリン類縁体は、ＩＧＦ Ｉ（配列番号５）Ａ鎖またはその類縁体または誘導体と、ＩＧＦ Ｉ（配列番号６）、ＩＧＦ ＩＩ（配列番号８）または天然のインスリン（配列番号２）のＢ鎖またはその類縁体または誘導体と、を有する。
単鎖ＩＧＦまたはインスリンのＡ鎖およびＢ鎖に対する別の修飾として、たとえば、（天然のインスリンのＡ鎖およびＢ鎖に対して）位置Ａ１９、Ｂ１６またはＢ２５のうちの１箇所または２箇所以上での、４−アミノフェニルアラニンへのアミノ酸の修飾あるいは、（インスリンの天然のＡ鎖およびＢ鎖に対して）Ａ５、Ａ８、Ａ９、Ａ１０、Ａ１４、Ａ１５、Ａ１７、Ａ１８、Ａ２１、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ９、Ｂ１０、Ｂ１３、Ｂ１４、Ｂ２０、Ｂ２１、Ｂ２２、Ｂ２３、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９、Ｂ３０から選択される位置のうちの１つまたは２つ以上のアミノ酸の置換あるいは、位置Ｂ１〜４およびＢ２６〜３０のいずれかまたはすべての位置での欠失があげられる。一実施形態では、Ａ５、Ａ８、Ａ９、Ａ１０、Ａ１４、Ａ１５、Ａ１７、Ａ１８、Ａ２１、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ９、Ｂ１０、Ｂ１３、Ｂ１４、Ｂ２０、Ｂ２１、Ｂ２２、Ｂ２３、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９、Ｂ３０から選択される位置での置換は、天然のインスリン配列に対して保存的なアミノ酸置換である。
一実施形態によれば、Ｂ鎖は、配列Ｒ２２−Ｘ２５ＬＣＧＸ２９Ｘ３０ＬＶＸ３３Ｘ３４ＬＹＬＶＣＧＸ４１Ｘ４２ＧＦＸ４５（配列番号２１）を有し、Ａ鎖は、配列ＧＩＶＸ４Ｘ５ＣＣＸ８Ｘ９Ｘ１０ＣＸ１２ＬＸ１４Ｘ１５ＬＸ１７Ｘ１８Ｘ１９ＣＸ２１−Ｒ１３（配列番号２２）を有し、ここで、
Ｘ４は、グルタミン酸またはアスパラギン酸であり、
Ｘ５はグルタミンまたはグルタミン酸であり、
Ｘ８は、ヒスチジン、スレオニンまたはフェニルアラニンであり、
Ｘ９は、セリン、アルギニン、リジン、オルニチンまたはアラニンであり、
Ｘ１０は、イソロイシンまたはセリンであり、
Ｘ１２はセリンまたはアスパラギン酸であり、
Ｘ１４は、チロシン、アルギニン、リジン、オルニチンまたはアラニンであり、
Ｘ１５は、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、アラニン、リジン、オルニチンまたはロイシンであり、
Ｘ１７は、グルタミン酸、アスパラギン酸、アスパラギン、リジン、オルニチンまたはグルタミンであり、
Ｘ１８は、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸またはスレオニンであり、
Ｘ１９は、チロシン、４−メトキシフェニルアラニンまたは４−アミノフェニルアラニンであり、
Ｘ２１は、アラニン、グリシン、セリン、バリン、スレオニン、イソロイシン、ロイシン、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、トリプトファン、チロシン、メチオニンからなる群から選択され、
Ｘ２５は、ヒスチジンまたはスレオニンであり、
Ｘ２９は、アラニン、グリシン、セリンからなる群から選択され、
Ｘ３０は、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸、システイン酸からなる群から選択され、
Ｘ３３は、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸からなる群から選択され、
Ｘ３４は、アラニンおよびスレオニンからなる群から選択され、
Ｘ４１は、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアスパラギンからなる群から選択され、
Ｘ４２は、アラニン、リジン、オルニチン、アルギニンからなる群から選択され、
Ｘ４５は、チロシンまたはフェニルアラニンであり、
Ｒ２２は、ＡＹＲＰＳＥ（配列番号１４）、ＦＶＮＱ（配列番号１２）、ＰＧＰＥ（配列番号１１）、トリペプチドであるグリシン−プロリン−グルタミン酸、トリペプチドであるバリン−アスパラギン−グルタミン、ジペプチドであるプロリン−グルタミン酸、ジペプチドであるアスパラギン−グルタミン、グルタミン、グルタミン酸、Ｎ末端のアミンからなる群から選択され、
Ｒ１３は、ＣＯＯＨまたはＣＯＮＨ２である。一実施形態では、Ｘ８、Ｘ２５、Ｘ３０は各々ヒスチジンである。別の実施形態では、単鎖インスリン類縁体ペプチドは、配列番号１９のＡ鎖ペプチド配列および／または配列番号２０のＢ鎖ペプチド配列の類縁体を有し、このＡ鎖およびＢ鎖の類縁体は各々、１〜３個のアミノ酸置換をさらに有する。
一実施形態では、構造ＩＢ−ＬＭ−ＩＡを有する単鎖インスリン類縁体が提供され、ここで、ＩＢは、配列Ｒ２２−Ｘ２５ＬＣＧＸ２９Ｘ３０ＬＶＸ３３Ｘ３４ＬＹＬＶＣＧＸ４１Ｘ４２ＧＦＸ４５（配列番号２１）を有し、ＬＭは、ＩＢをＩＡに共有結合的に結合する、本明細書に開示するような橋渡し部分であり、ＩＡは、配列ＧＩＶＸ４Ｘ５ＣＣＸ８Ｘ９Ｘ１０ＣＸ１２ＬＸ１４Ｘ１５ＬＸ１７Ｘ１８Ｘ１９ＣＸ２１−Ｒ１３（配列番号２２）を有し、ここで、
Ｘ４は、グルタミン酸またはアスパラギン酸であり、
Ｘ５は、グルタミンまたはグルタミン酸であり、
Ｘ８は、ヒスチジンまたはフェニルアラニンであり、
Ｘ９およびＸ１４は独立に、アルギニン、リジン、オルニチンまたはアラニンから選択され、
Ｘ１０は、イソロイシンまたはセリンであり、
Ｘ１２は、セリンまたはアスパラギン酸であり、
Ｘ１４は、チロシン、アルギニン、リジン、オルニチンまたはアラニンであり、
Ｘ１５は、アルギニン、リジン、オルニチンまたはロイシンであり、
Ｘ１７は、グルタミン酸またはグルタミンであり、
Ｘ１８は、メチオニン、アスパラギンまたはスレオニンであり、
Ｘ１９は、チロシン、４−メトキシフェニルアラニンまたは４−アミノフェニルアラニンであり、
Ｘ２１は、アラニン、グリシンまたはアスパラギンであり、
Ｘ２５は、ヒスチジンおよびスレオニンからなる群から選択され、
Ｘ２９は、アラニン、グリシン、セリンからなる群から選択され、
Ｘ３０は、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸、システイン酸からなる群から選択され、
Ｘ３３は、アスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群から選択され、
Ｘ３４は、アラニンおよびスレオニンからなる群から選択され、
Ｘ４１は、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアスパラギンからなる群から選択され、
Ｘ４２は、アラニン、リジン、オルニチン、アルギニンからなる群から選択され、
Ｒ２２は、ＡＹＲＰＳＥ（配列番号１４）、ＦＶＮＱ（配列番号１２）、ＰＧＰＥ（配列番号１１）、トリペプチドであるグリシン−プロリン−グルタミン酸、トリペプチドであるバリン−アスパラギン−グルタミン、ジペプチドであるプロリン−グルタミン酸、ジペプチドであるアスパラギン−グルタミン、グルタミン、グルタミン酸、Ｎ末端のアミンからなる群から選択され、
Ｒ１３は、ＣＯＯＨまたはＣＯＮＨ２であり、さらに、記号Ｘ４５のアミノ酸は橋渡し部分ＬＭに直接結合している（すなわち、ＩＢ−ＬＭ−ＩＡという表示を本明細書で使用する場合、これはＢ鎖のカルボキシル末端およびＡ鎖のアミノ末端が、他に介在するアミノ酸なしで橋渡し部分ＬＭに直接結合している状態を示すことを意図している）。
一実施形態によれば、橋渡し部分ＬＭは、（Ｙ１）ｋ−Ｘ５１ＡＸ５３Ｘ５４Ｘ５５Ｘ５６Ｘ５７Ｒ（Ｙ２）ｎ（配列番号２８）、（Ｙ１）ｋ、（Ｙ１）ｋ−ＧＸ５２ＧＳＳＳＸ５７Ｒ−（Ｙ２）ｎ（配列番号９０）、（Ｙ１）ｋ−ＧＹＧＳＳＳＸ５７Ｒ（Ｙ２）ｎ（配列番号５１）、
Figure 0005969469
からなる群から選択され、
Ｙ１は、Ｘ４６、Ｘ４６Ｘ４７、Ｘ４６Ｘ４７Ｘ４８、Ｘ４６Ｘ４７Ｘ４８Ｘ４９（配列番号２４）、Ｘ４６Ｘ４７Ｘ４８Ｘ４９Ｘ５０（配列番号１３）の群から選択され、
Ｙ２は、Ｘ７０、Ｘ７０Ｘ７１、Ｘ７０Ｘ７１Ｘ７２、Ｘ７０Ｘ７１Ｘ７２Ｘ７３（配列番号１５）の群から選択され、
ｎは０または１であり、
ｋは０または１であり、
ｍは、８〜１６から選択される整数であり、
Ｘ４６からＸ５０およびＸ７０からＸ７３は各々独立に、アミノ酸であり、
Ｘ５１は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニンからなる群から選択され、
Ｘ５２は、チロシン以外のアミノ酸であり、
Ｘ５３、Ｘ５４、Ｘ５５、Ｘ５６は独立に、グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、プロリンからなる群から選択され、
Ｘ５７は、アルギニン、リジンまたはオルニチンである。一実施形態によれば、ｎまたはｋのうちの少なくとも一方は１である。一実施形態では、Ｙ２は、Ａ、ＡＰ、ＡＰＱ、ＡＰＱＴ（配列番号８２）からなる群から選択され、Ｙ１は、Ｆ、Ｙ、ＦＮ、ＹＴ、ＦＮＫ、ＹＴＰ、ＦＮＫＰ（配列番号７７）、ＦＮＰＫ（配列番号７９）、ＹＴＰＫ（配列番号７８）、ＹＴＰＫＴ（配列番号１６）、ＹＴＫＰＴ（配列番号８０）、ＦＮＫＰＴ（配列番号７６）、ＦＮＰＫＴ（配列番号８１）からなる群から選択される。一実施形態では、橋渡し部分は、Ｘ５１ＡＸ５３Ｘ５４Ｘ５５Ｘ５６Ｘ５７Ｒ（Ｙ２）ｎ（配列番号２８）、（Ｙ１）ｋ−ＧＹＧＳＳＳＸ５７Ｒ（Ｙ２）ｎ（配列番号５１）、（Ｙ１）ｋ−ＧＸ５２ＧＳＳＳＸ５７Ｒ（Ｙ２）ｎ（配列番号９０）から選択される配列を有し、ここで、Ｘ５１は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニンからなる群から選択され、Ｘ５２は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、プロリンからなる群から選択され、Ｘ５３はグリシン以外であり、Ｘ５４およびＸ５５は独立に、グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、プロリンからなる群から選択され、Ｘ５６はセリンであり、Ｘ５７は、アルギニン、リジンまたはオルニチンである。一実施形態では、ｎは１であり、ｋは０であり、あるいは、一実施形態では、ｋは１であり、ｎは０であり、一実施形態では、ｎとｋがともに１である。一実施形態では、橋渡し部分はポリエチレングリコールであり、ｍは１０〜１４から選択される整数である。
一実施形態によれば、インスリンペプチドのＡ鎖が配列ＧＩＶＥＱＣＣＸ８ＳＩＣＳＬＹＱＬＸ１７ＮＸ１９ＣＸ２３（配列番号５２）を有し、Ｂ鎖が配列Ｘ２５ＬＣＧＸ２９Ｘ３０ＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦ（配列番号５３）を有するインスリン類縁体が提供され、ここで、
Ｘ８は、スレオニンおよびヒスチジンからなる群から選択され、
Ｘ１７は、グルタミン酸またはグルタミンであり、
Ｘ１９は、チロシン、４−メトキシフェニルアラニンまたは４−アミノフェニルアラニンであり、
Ｘ２３は、アスパラギンまたはグリシンであり、
Ｘ２５は、ヒスチジンおよびスレオニンからなる群から選択され、
Ｘ２９は、アラニン、グリシン、セリンからなる群から選択され、
Ｘ３０は、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸、システイン酸からなる群から選択される。別の実施形態では、Ｂ鎖は、配列Ｘ２２ＶＮＱＸ２５ＬＣＧＸ２９Ｘ３０ＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴ−Ｚ１−Ｂ１（配列番号５４）を有し、ここで、
Ｘ２２は、フェニルアラニンおよびデスアミノフェニルアラニンからなる群から選択され、
Ｘ２５は、ヒスチジンおよびスレオニンからなる群から選択され、
Ｘ２９は、アラニン、グリシン、セリンからなる群から選択され、
Ｘ３０は、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸、システイン酸からなる群から選択され、
Ｚ１は、アスパラギン酸−リジン、リジン−プロリン、プロリン−リジンからなる群から選択されるジペプチドであり、
Ｂ１は、スレオニン、アラニンまたはスレオニン−アルギニン−アルギニントリペプチドからなる群から選択される。
一実施形態によれば、構造ＩＢ−ＬＭ−ＩＡを有する単鎖インスリン類縁体が提供され、ここで、ＩＢは、配列Ｘ２５ＬＣＧＸ２９Ｘ３０ＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧ ＥＲＧＦＦ（配列番号５３）を有し、ＬＭは、ＩＢをＩＡに共有結合的に結合する、本明細書に開示するような橋渡し部分であり、ＩＡは、配列ＧＩＶＥＱＣＣＸ８ＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＸ１９ＣＸ２１（配列番号５５）を有し、ここで、配列番号５４のＣ末端のフェニルアラニン残基は、介在するアミノ酸なしで橋渡し部分ＬＭに直接共有結合している。一実施形態によれば、橋渡し部分ＬＭは、（Ｙ１）ｋ−Ｘ５１ＡＸ５３Ｘ５４Ｘ５５Ｘ５６Ｘ５７Ｒ（Ｙ２）ｎ（配列番号２８）、（Ｙ１）ｋ−ＧＹＧＳＳＳＸ５７Ｒ（Ｙ２）ｎ（配列番号５１）、
Figure 0005969469
からなる群から選択され、
ここで、
Ｙ１は、Ｘ４６、Ｘ４６Ｘ４７、Ｘ４６Ｘ４７Ｘ４８、Ｘ４６Ｘ４７Ｘ４８Ｘ４９（配列番号２４）、Ｘ４６Ｘ４７Ｘ４８Ｘ４９Ｘ５０（配列番号１３）の群から選択される、
Ｙ２は、Ｘ７０、Ｘ７０Ｘ７１、Ｘ７０Ｘ７１Ｘ７２、Ｘ７０Ｘ７１Ｘ７２Ｘ７３（配列番号１５）の群から選択され、
ｎは０または１であり、
ｋは０または１であり、
ｍは、７〜１６の範囲の整数であり、
Ｘ４６からＸ５０およびＸ７０からＸ７３は各々独立に、アミノ酸であり、
Ｘ５７は、アルギニン、リジンまたはオルニチンである。
一実施形態によれば、単鎖インスリン類縁体は、配列Ｒ２２−ＨＬＣＧＳＸ３０ＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦ（配列番号１５４）またはＲ２４−Ｘ２５ＬＣＧＸ２９Ｘ３０ＬＶＸ３３Ｘ３４ＬＹＬＶＣＧＸ４１Ｘ４２ＧＦＸ４５（配列番号２１）を有するＢ鎖と、配列ＧＩＶＥＱＣＣＸ８ＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＸ１９ＣＸ２１−Ｒ１３（配列番号５５）またはＧＩＶＸ４ＥＣＣＸ８Ｘ９ＳＣＤＬＸ１４Ｘ１５ＬＸ１７Ｘ１８Ｘ１９ＣＸ２１−Ｒ１３（配列番号１９）を有するＡ鎖とを有し、
ここで、
Ｘ４は、グルタミン酸またはアスパラギン酸であり、
Ｘ８は、ヒスチジン、スレオニンまたはフェニルアラニンであり、
Ｘ９は、アルギニン、リジン、オルニチンまたはアラニンであり、
Ｘ１４は、アルギニン、リジン、オルニチンまたはアラニンであり、
Ｘ１５は、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、アラニン、リジン、オルニチンまたはロイシンであり、
Ｘ１７はグルタミンまたはグルタミン酸であり、
Ｘ１８は、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸またはスレオニンであり、
Ｘ１９は、チロシン、４−メトキシフェニルアラニンまたは４−アミノフェニルアラニンであり、
Ｘ２１は、アラニン、グリシン、セリン、バリン、スレオニン、イソロイシン、ロイシン、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、トリプトファン、チロシン、メチオニンからなる群から選択され、
Ｘ２２は、フェニルアラニンおよびデスアミノフェニルアラニンからなる群から選択され、
Ｘ２３は、アスパラギンまたはグリシンであり、
Ｘ２５は、ヒスチジンまたはスレオニンであり、
Ｘ２９は、アラニンおよびグリシンからなる群から選択され、
Ｘ３０は、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸、システイン酸からなる群から選択され、
Ｘ３３は、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸からなる群から選択され、
Ｘ３４は、アラニンおよびスレオニンからなる群から選択され、
Ｘ４１は、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアスパラギンからなる群から選択され、
Ｘ４２は、アラニン、リジン、オルニチン、アルギニンからなる群から選択され、
Ｘ４５は、チロシンまたはフェニルアラニンであり、
Ｒ２２は、Ｘ２２ＶＮＱ（配列番号８４）、トリペプチドであるバリン−アスパラギン−グルタミン、ジペプチドであるアスパラギン−グルタミン、グルタミン、結合からなる群から選択され、
Ｒ２４は、ＡＹＲＰＳＥ（配列番号１４）、ＰＧＰＥ（配列番号１１）、トリペプチドであるグリシン−プロリン−グルタミン酸、ジペプチドであるプロリン−グルタミン酸、グルタミン、グルタミン酸、結合からなる群から選択され、
Ｒ１３は、ＣＯＯＨまたはＣＯＮＨ２である。
いくつかの実施形態によれば、単鎖インスリン類縁体は、配列Ｒ２３−Ｒ２４−Ｘ２５ＬＣＧＸ２９Ｘ３０ＬＶＸ３３Ｘ３４ＬＹＬＶＣＧＸ４１Ｘ４２ＧＦＸ４５（配列番号２１）またはＲ２３−Ｒ２２−ＨＬＣＧＳＸ３０ＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦ（配列番号１５４）を有するＢ鎖と、配列ＧＩＶＸ４ＥＣＣＸ８Ｘ９ＳＣＤＬＸ１４Ｘ１５ＬＸ１７Ｘ１８Ｘ１９ＣＸ２１−Ｒ１３（配列番号１９）を有するＡ鎖とを有し、
ここで、
Ｘ４は、グルタミン酸またはアスパラギン酸であり、
Ｘ８は、ヒスチジン、スレオニンまたはフェニルアラニンであり、
Ｘ９は、アルギニン、リジン、オルニチンまたはアラニンであり、
Ｘ１４は、アルギニン、リジン、オルニチンまたはアラニンであり、
Ｘ１５は、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、アラニン、リジン、オルニチンまたはロイシンであり、
Ｘ１７は、グルタミンまたはグルタミン酸であり、
Ｘ１８は、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸またはスレオニンであり、
Ｘ１９は、チロシン、４−メトキシフェニルアラニンまたは４−アミノフェニルアラニンであり、
Ｘ２１は、アラニン、グリシン、セリン、バリン、スレオニン、イソロイシン、ロイシン、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、トリプトファン、チロシン、メチオニンからなる群から選択され、
Ｘ２２は、フェニルアラニンおよびデスアミノフェニルアラニンからなる群から選択され、
Ｘ２５は、ヒスチジンまたはスレオニンであり、
Ｘ２９は、アラニンおよびグリシンからなる群から選択され、
Ｘ３０は、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸、システイン酸からなる群から選択され、
Ｘ３３は、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸からなる群から選択され、
Ｘ３４は、アラニンおよびスレオニンからなる群から選択され、
Ｘ４１は、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアスパラギンからなる群から選択され、
Ｘ４２は、アラニン、リジン、オルニチン、アルギニンからなる群から選択され、
Ｘ４５は、チロシンまたはフェニルアラニンであり、
Ｒ２２は、Ｘ２２ＶＮＱ（配列番号８４）、トリペプチドであるバリン−アスパラギン−グルタミン、ジペプチドであるアスパラギン−グルタミン、グルタミン、結合からなる群から選択され、
Ｒ２３は、Ｎ末端のアミンまたはＸ６０（Ｘ６１Ｘ６２）ｄＸ６３Ｋ（配列番号１９２）であり、
ここで、
Ｘ６０は、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸からなる群から選択され、
Ｘ６１およびＸ６２は独立に、グルタミン酸およびアスパラギン酸からなる群から選択され、
Ｘ６３は、アルギニン アスパラギン酸、グルタミン酸からなる群から選択され、
ｄは、１〜３の範囲の整数であり、
Ｒ２４は、ＡＹＲＰＳＥ（配列番号１４）、ＰＧＰＥ（配列番号１１）、トリペプチドであるグリシン−プロリン−グルタミン酸、ジペプチドであるプロリン−グルタミン酸、グルタミン、グルタミン酸、結合からなる群から選択され、
Ｒ１３は、ＣＯＯＨまたはＣＯＮＨ２である。
いくつかの実施形態によれば、Ａ鎖は、配列ＧＩＶＥＱＣＣＸ８ＳＩＣＳＬＹＱＬＸ１７ＮＸ１９ＣＸ２３（配列番号５２）またはＧＩＶＤＥＣＣＸ８Ｘ９ＳＣＤＬＸ１４Ｘ１５ＬＸ１７Ｘ１８ Ｘ１９ＣＸ２１−Ｒ１３（配列番号５６）を有し、Ｂ鎖は、配列Ｘ２５ＬＣＧＸ２９Ｘ３０ＬＶＸ３３Ｘ３４ＬＹＬＶＣＧＤＸ４２ＧＦＸ４５（配列番号５８）を有し、ここで、
Ｘ８は、ヒスチジンまたはフェニルアラニンであり、
Ｘ９およびＸ１４は独立に、アルギニン、リジン、オルニチンまたはアラニンから選択され、
Ｘ１５は、アルギニン、リジン、オルニチンまたはロイシンであり、
Ｘ１７は、グルタミン酸またはグルタミンであり、
Ｘ１８は、メチオニン、アスパラギンまたはスレオニンであり、
Ｘ１９は、チロシン、４−メトキシフェニルアラニンまたは４−アミノフェニルアラニンであり、
Ｘ２１は、アラニン、グリシンまたはアスパラギンであり、
Ｘ２３は、アスパラギンまたはグリシンであり、
Ｘ２５は、ヒスチジンおよびスレオニンからなる群から選択され、
Ｘ２９は、アラニン、グリシン、セリンからなる群から選択され、
Ｘ３０は、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸、システイン酸からなる群から選択され、
Ｘ３３は、アスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群から選択され、
Ｘ３４は、アラニンおよびスレオニンからなる群から選択され、
Ｘ４２は、アラニン、リジン、オルニチン、アルギニンからなる群から選択され、
Ｘ４５はチロシンであり、
Ｒ１３は、ＣＯＯＨまたはＣＯＮＨ２である。一実施形態では、ｎおよびｋのうちの少なくとも一方が１である。
別の実施形態では、Ａ鎖は、配列ＧＩＶＤＥＣＣＨＸ９ＳＣＤＬＸ１４Ｘ１５ＬＸ１７Ｘ１８ Ｘ１９ＣＸ２１−Ｒ１３（配列番号５６）を有し、Ｂ鎖は、配列Ｘ２５ＬＣＧＸ２９Ｘ３０ＬＶＸ３３Ｘ３４ＬＹＬＶＣＧＤＸ４２ＧＦＸ４５（配列番号５８）を有し、ここで、
Ｘ９およびＸ１４は独立に、アルギニン、リジン、オルニチンまたはアラニンから選択され、
Ｘ１５は、アルギニン、リジン、オルニチンまたはロイシンであり、
Ｘ１７は、グルタミン酸、アスパラギン酸、アスパラギン、リジン、オルニチンまたはグルタミンであり、
Ｘ１８は、メチオニン、アスパラギンまたはスレオニンであり、
Ｘ１９は、チロシン、４−メトキシフェニルアラニンまたは４−アミノフェニルアラニンであり、
Ｘ２１は、アラニン、グリシンまたはアスパラギンであり、
Ｘ２３は、アスパラギンまたはグリシンであり、
Ｘ２５は、ヒスチジンおよびスレオニンからなる群から選択され、
Ｘ２９は、アラニン、グリシン、セリンからなる群から選択され、
Ｘ３０は、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸、システイン酸からなる群から選択され、
Ｘ３３は、アスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群から選択され、
Ｘ３４は、アラニンおよびスレオニンからなる群から選択され、
Ｘ４２は、アラニン、リジン、オルニチン、アルギニンからなる群から選択され、
Ｘ４５は、チロシンまたはフェニルアラニンであり、
Ｒ１３は、ＣＯＯＨまたはＣＯＮＨ２である。別の実施形態では、Ａ鎖は、配列ＧＩＶＤＥＣＣＨＸ９ＳＣＤＬＸ１４Ｘ１５ＬＸ１７ＭＸ１９ＣＸ２１−Ｒ１３（配列番号５９）を有し、Ｂ鎖は、配列Ｘ２５ＬＣＧＡＸ３０ＬＶＤＡＬＹＬＶＣＧＤＸ４２ＧＦＸ４５（配列番号６０）を有し、ここで、
Ｘ９、Ｘ１４、Ｘ１５は独立に、オルニチン、リジンまたはアルギニンであり、
Ｘ１７は、グルタミン酸またはグルタミンであり、
Ｘ１９は、チロシン、４−メトキシフェニルアラニンまたは４−アミノフェニルアラニンであり、
Ｘ２１は、アラニン、グリシンまたはアスパラギンであり、
Ｘ２５は、ヒスチジンおよびスレオニンからなる群から選択され、
Ｘ３０は、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸からなる群から選択され、
Ｘ４２は、アラニン、リジン、オルニチン、アルギニンからなる群から選択され、
Ｘ４５は、チロシンまたはフェニルアラニンであり、
Ｒ１３は、ＣＯＯＨまたはＣＯＮＨ２である。一実施形態では、Ｂ鎖は、ＨＬＣＧＡＥＬＶＤＡＬＹＬＶＣＧＤＸ４２ＧＦＹ（配列番号６１）、ＧＰＥＨＬＣＧＡＥＬＶＤＡＬＹＬＶＣＧＤＸ４２ＧＦＹ（配列番号６２）、ＧＰＥＨＬＣＧＡＥＬＶＤＡＬＹＬＶＣＧＤＸ４２ＧＦＹＦＮＰＫＴ（配列番号６３）、ＧＰＥＨＬＣＧＡＥＬＶＤＡＬＹＬＶＣＧＤＸ４２ＧＦＹＦＮＫＰＴ（配列番号６４）からなる群から選択され、ここで、Ｘ４２は、オルニチン、リジン、アルギニンからなる群から選択される。別の実施形態では、Ａ鎖は、配列ＧＩＶＤＥＣＣＨＸ９ＳＣＤＬＸ１４Ｘ１５ＬＱＭＹＣＮ−Ｒ１３（配列番号６６）を有し、ここで、Ｘ９、Ｘ１４、Ｘ１５は独立に、オルニチン、リジンまたはアルギニンである。
一実施形態によれば、橋渡し部分は、（Ｙ１）ｋ−Ｘ５１ＡＸ５３Ｘ５４Ｘ５５Ｘ５６Ｘ５７Ｒ（Ｙ２）ｎ（配列番号２８）および（Ｙ１）ｋ−ＧＹＧＳＳＳＸ５７Ｒ（配列番号５１）からなる群から選択されるペプチドであり、ここで、
Ｙ１は、Ｘ４６、Ｘ４６Ｘ４７、Ｘ４６Ｘ４７Ｘ４８、Ｘ４６Ｘ４７Ｘ４８Ｘ４９（配列番号２４）、Ｘ４６Ｘ４７Ｘ４８Ｘ４９Ｘ５０（配列番号１３）の群から選択され、
Ｙ２は、Ｘ７０、Ｘ７０Ｘ７１、Ｘ７０Ｘ７１Ｘ７２、Ｘ７０Ｘ７１Ｘ７２Ｘ７３（配列番号１５）群から選択され、ｎは０または１であり、ｋは０または１であり、ここで、ｎおよびｋのうちの少なくとも一方が１である。一実施形態では、ｎは１であり、Ｙ１は、Ｆ、Ｙ、ＦＮ、ＹＴ、ＦＮＫ、ＹＴＰ、ＦＮＰＫ（配列番号７９）、ＦＮＫＰ（配列番号７７）、ＹＴＰＫ（配列番号７８）、ＹＴＰＫＴ（配列番号１６）、ＹＴＫＰＴ（配列番号８０）、ＦＮＫＰＴ（配列番号７６）、ＦＮＰＫＴ（配列番号８１）からなる群から選択される。もうひとつの実施形態では、Ｙ１は、Ｆ、ＦＮ、ＦＮＫ、ＦＮＰＫ（配列番号７９）、ＦＮＫＰＴ（配列番号７６）、ＦＮＰＫＴ（配列番号８１）からなる群から選択される。一実施形態では、Ｙ２は、Ａ、ＡＰ、ＡＰＱ、ＡＰＱＴ（配列番号８２）からなる群から選択される。別の実施形態では、ｎおよびｋがともに１であり、Ｙ１は、Ｆ、Ｙ、ＦＮ、ＹＴ、ＦＮＫ、ＹＴＰ、ＦＮＰＫ（配列番号７９）、ＦＮＫＰ（配列番号７７）、ＹＴＰＫ（配列番号７８）、ＹＴＰＫＴ（配列番号１６）、ＹＴＫＰＴ（配列番号８０）、ＦＮＫＰＴ（配列番号７６）、ＦＮＰＫＴ（配列番号８１）からなる群から選択され、Ｙ２は、Ａ、ＡＰ、ＡＰＱ、ＡＰＱＴ（配列番号８２）からなる群から選択される。
一実施形態では、一般式ＩＢ−ＬＭ−ＩＡで表される単鎖インスリン類縁体が提供され、ここで、ＩＢは、ＨＬＣＧＡＥＬＶＤＡＬＹＬＶＣＧＤＸ４２ＧＦＹ（配列番号６１）、ＧＰＥＨＬＣＧＡＥＬＶＤＡＬＹＬＶＣＧＤＸ４２ＧＦＹ（配列番号６２）、ＧＰＥＨＬＣＧＡＥＬＶＤＡＬＹＬＶＣＧＤＸ４２ＧＦＹＦＮＰＫＴ（配列番号６３）、ＧＰＥＨＬＣＧＡＥＬＶＤＡＬＹＬＶＣＧＤＸ４２ＧＦＹＦＮＫＰＴ（配列番号６４）からなる群から選択されるアミノ酸配列であり、ＬＭは、ＧＡＧＳＳＳＸ５７ＲＡＰＱＴ 配列番号６６）、ＧＹＧＳＳＳＸ５７Ｒ（配列番号５１）、
Figure 0005969469
からなる群から選択される橋渡し部分であり、ＩＡは、アミノ酸配列ＧＩＶＤＥＣＣＨＸ９ＳＣＤＬＸ１４Ｘ１５ＬＱＭＹＣＮ−Ｒ１３（配列番号６６）であり、ここで、Ｘ９、Ｘ１４、Ｘ１５ Ｘ４２、Ｘ５７は独立に、オルニチン、リジンまたはアルギニンであり、ｍは１０〜１２の範囲から選択される整数である。他の一実施形態では、橋渡し部分は、ＧＹＧＳＳＳＯＲ（配列番号６５）である。
一実施形態によれば、構造ＩＢ−ＬＭ−ＩＡを有する単鎖インスリン類縁体が提供され、ここで、ＩＢは、配列Ｘ２５ＬＣＧＸ２９Ｘ３０ＬＶＸ３３Ｘ３４ＬＹＬＶＣＧＤＸ４２ＧＦＸ４５（配列番号５８）を有し、ＬＭは、ＩＢをＩＡに共有結合的に結合する、本明細書に開示するような橋渡し部分であり、ＩＡは、配列ＧＩＶＥＱＣＣＨＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＸ１９ＣＸ２１−Ｒ１３（配列番号６８）またはＧＩＶＤＥＣＣＸ８Ｘ９ＳＣＤＬＸ１４Ｘ１５ＬＸ１７Ｘ１８Ｘ１９ＣＸ２１−Ｒ１３（配列番号６９）を有し、ここで、配列番号６９のＣ末端のフェニルアラニン残基は、介在するアミノ酸なしで橋渡し部分ＬＭに直接共有結合している。一実施形態によれば、配列Ｘ２５ＬＣＧＸ２９Ｘ３０ＬＶＸ３３Ｘ３４ＬＹＬＶＣＧＤＸ４２ＧＦＸ４５（配列番号５８）−（Ｙ１）ｋ−Ｘ５１ＡＸ５３Ｘ５４Ｘ５５Ｘ５６Ｘ５７Ｘ５８（Ｙ２）ｎ（配列番号７０）−ＧＩＶＤＥＣＣＸ８Ｘ９ＳＣＤＬＸ１４Ｘ１５ＬＸ１７Ｘ１８ Ｘ１９ＣＸ２１−Ｒ１３（配列番号５６）またはＸ２５ＬＣＧＸ２９Ｘ３０ＬＶＸ３３Ｘ３４ＬＹＬＶＣＧＤＸ４２ＧＦＸ４５（Ｙ１）ｋ（配列番号５８）−Ｘ５１ＡＸ５３Ｘ５４Ｘ５５Ｘ５６Ｘ５７Ｘ５８（Ｙ２）ｎ（配列番号７０）−ＧＩＶＥＱＣＣＨＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＸ１９ＣＸ２１−Ｒ１３（配列番号６８）を有する単鎖インスリン類縁体が提供され、ここで、Ｘ４６からＸ５６およびＸ７０Ｘ７１Ｘ７２Ｘ７３（配列番号１５）は独立にアミノ酸であり、Ｘ５７およびＸ５８は独立に、アルギニン、オルニチンまたはリジンであり、Ｙ１は、Ｘ４６、Ｘ４６Ｘ４７、Ｘ４６Ｘ４７Ｘ４８、Ｘ４６Ｘ４７Ｘ４８Ｘ４９（配列番号２４）、Ｘ４６Ｘ４７Ｘ４８Ｘ４９Ｘ５０（配列番号１３）の群から選択され、Ｙ２は、Ｘ７０、Ｘ７０Ｘ７１、Ｘ７０Ｘ７１Ｘ７２、Ｘ７０Ｘ７１Ｘ７２Ｘ７３（配列番号１５）の群から選択され、ここで、ｎおよびｋは独立に、０または１であり、
Ｘ８は、ヒスチジン、スレオニンまたはフェニルアラニンであり、
Ｘ９は、セリン、アルギニン、リジン、オルニチンまたはアラニンであり、
Ｘ１４は、チロシン、アルギニン、リジン、オルニチンまたはアラニンであり、
Ｘ１５は、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、アラニン、リジン、オルニチンまたはロイシンであり、
Ｘ１７は、グルタミン酸、アスパラギン酸、アスパラギン、リジン、オルニチンまたはグルタミンであり、
Ｘ１８は、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸またはスレオニンであり、
Ｘ１９は、チロシン、４−メトキシフェニルアラニンまたは４−アミノ−フェニルアラニンであり、
Ｘ２１は、アラニン、グリシンまたはアスパラギンであり、
Ｘ２５は、ヒスチジンまたはスレオニンであり、
Ｘ２９は、アラニン、グリシン、セリンからなる群から選択され、
Ｘ３０は、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸、システイン酸からなる群から選択され、
Ｘ３３は、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸からなる群から選択され、
Ｘ３４は、アラニンおよびスレオニンからなる群から選択され、
Ｘ４２は、アラニン、リジン、オルニチン、アルギニンからなる群から選択され、
Ｘ４５は、チロシンまたはフェニルアラニンである。
一実施形態によれば、構造ＩＢ−ＬＭ−ＩＡを有する単鎖インスリン類縁体が提供され、ここで、ＩＢは、配列Ｘ２５ＬＣＧＸ２９Ｘ３０ＬＶＸ３３Ｘ３４ＬＹＬＶＣＧＤＸ４２ＧＦＸ４５（配列番号５８）を有し、ＬＭは、（Ｙ１）ｋ−Ｘ５１ＡＸ５３Ｘ５４Ｘ５５Ｘ５６ＲＲ（Ｙ２）ｎ（配列番号２３）、（Ｙ２）ｋ−ＧＹＧＳＳＳＸ５７Ｒ（Ｙ２）ｎ（配列番号５１）、
Figure 0005969469
からなる群から選択される橋渡し部分であり、
ここで、
Ｙ１は、Ｘ４６、Ｘ４６Ｘ４７、Ｘ４６Ｘ４７Ｘ４８、Ｘ４６Ｘ４７Ｘ４８Ｘ４９（配列番号２４）、Ｘ４６Ｘ４７Ｘ４８Ｘ４９Ｘ５０（配列番号１３）の群から選択され、
Ｙ２は、Ｘ７０、Ｘ７０Ｘ７１、Ｘ７０Ｘ７１Ｘ７２、Ｘ７０Ｘ７１Ｘ７２Ｘ７３（配列番号１５）の群から選択され、
ｎは０または１であり、
ｋは０または１であり、
ｍは、７〜１６の範囲の整数であり、
Ｘ４６からＸ５０およびＸ７０からＸ７３は各々独立に、アミノ酸であり、
Ｘ５１は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニンからなる群から選択され、
Ｘ５２は、チロシン以外のアミノ酸であり、
Ｘ５３からＸ５６は各々独立に、アミノ酸であり、
Ｘ５７は、アルギニン、リジンまたはオルニチンであり、
Ａ鎖は、配列ＧＩＶＤＥＣＣＨＸ９ＳＣＤＬＸ１４Ｘ１５ＬＱＭＹＣＮ−Ｒ１３（配列番号６６）を有し、ここで、Ｘ９、Ｘ１４、Ｘ１５は独立に、オルニチン、リジンまたはアルギニンであり、Ｒ１３は、ＣＯＯＨまたはＣＯＮＨ２である。
一実施形態では、Ｂ鎖は、ＨＬＣＧＡＥＬＶＤＡＬＹＬＶＣＧＤＯＧＦＹ（配列番号７１）、ＧＰＥＨＬＣＧＡＥＬＶＤＡＬＹＬＶＣＧＤＯＧＦＹ（配列番号７２）、ＧＰＥＨＬＣＧＡＥＬＶＤＡＬＹＬＶＣＧＤＯＧＦＹＦＮＰＫＴ（配列番号７３）、ＧＰＥＨＬＣＧＡＥＬＶＤＡＬＹＬＶＣＧＤＯＧＦＹＦＮＫＰＴ（配列番号７４）からなる群から選択され、Ａ鎖は、ＧＩＶＤＥＣＣＨＯＳＣＤＬＯＯＬＱＭＸ１９ＣＮ−Ｒ１３（配列番号７５）であり、ここで、Ｘ１９は、チロシン、４−メトキシフェニルアラニンまたは４−アミノフェニルアラニンである。一実施形態では、ｎおよびｋのうちの少なくとも一方が１である。
一実施形態では、配列Ｘ２５ＬＣＧＸ２９Ｘ３０ＬＶＸ３３Ｘ３４ＬＹＬＶＣＧＸ４１Ｘ４２ＧＦＸ４５Ｘ５１Ｘ５２Ｘ５３Ｘ５４Ｘ５５Ｘ５６Ｘ５７Ｘ５８Ｘ７０Ｘ７１Ｘ７２Ｘ７３ＧＩＶＸ４Ｘ５ＣＣＸ８Ｘ９Ｘ１０ＣＸ１２ＬＸ１４Ｘ１５ＬＥＸ１８Ｘ１９ＣＸ２１−Ｒ１３（配列番号１６８）；
Ｘ２５ＬＣＧＸ２９Ｘ３０ＬＶＸ３３Ｘ３４ＬＹＬＶＣＧＸ４１Ｘ４２ＧＦＸ４５Ｘ５１Ｘ５２ＧＳＳＳＸ５７Ｘ５８ＡＰＱＴＧＩＶＸ４Ｘ５ＣＣＸ８Ｘ９Ｘ１０ＣＸ１２ＬＸ１４Ｘ１５ＬＥＸ１８Ｘ１９ＣＸ２１−Ｒ１３（配列番号１６９）；
Ｘ２５ＬＣＧＸ２９Ｘ３０ＬＶＸ３３Ｘ３４ＬＹＬＶＣＧＸ４１Ｘ４２ＧＦＸ４５Ｘ４６Ｘ４７Ｘ４８ＴＸ５１Ｘ５２ＧＳＳＳＸ５７Ｘ５８ＡＰＱＴＧＩＶＸ４Ｘ５ＣＣＸ８Ｘ９Ｘ１０ＣＸ１２ＬＸ１４Ｘ１５ＬＥＸ１８Ｘ１９ＣＸ２１−Ｒ１３（配列番号１７０；
Ｘ２５ＬＣＧＸ２９Ｘ３０ＬＶＸ３３Ｘ３４ＬＹＬＶＣＧＸ４１Ｘ４２ＧＦＸ４５Ｘ４６Ｘ４７Ｘ４８ＴＸ５１Ｘ５２ＧＳＳＳＸ５７Ｘ５８ＧＩＶＸ４Ｘ５ＣＣＸ８Ｘ９Ｘ１０ＣＸ１２ＬＸ１４Ｘ１５ＬＥＸ１８Ｘ１９ＣＸ２１−Ｒ１３（配列番号１７１）；または
Ｘ２５ＬＣＧＸ２９Ｘ３０ＬＶＸ３３Ｘ３４ＬＹＬＶＣＧＸ４１Ｘ４２ＧＦＸ４５ＧＡＧＳＳＳＲＸ５８ＡＰＱＴＧＩＶＸ４Ｘ５ＣＣＸ８
Ｘ９Ｘ１０ＣＸ１２ＬＸ１４Ｘ１５ＬＥＸ１８Ｘ１９ＣＸ２１−Ｒ１３（配列番号１７２）を有する単鎖インスリン類縁体が提供され、
ここで、
Ｘ４は、グルタミン酸またはアスパラギン酸であり、
Ｘ５はグルタミン酸またはグルタミンであり、
Ｘ８は、スレオニン、ヒスチジンまたはフェニルアラニンであり、
Ｘ９は、セリン、アルギニン、オルニチンまたはアラニンであり、
Ｘ１０は、セリンまたはイソロイシンであり、
Ｘ１２は、セリンまたはアスパラギン酸であり、
Ｘ１４は、アルギニン、チロシン、オルニチンまたはアラニンであり、
Ｘ１５は、グルタミン、アルギニン、アラニン、オルニチンまたはロイシンであり、
Ｘ１８は、メチオニン、アスパラギンまたはスレオニンであり、
Ｘ１９は、チロシン、４−メトキシフェニルアラニンまたは４−アミノフェニルアラニンであり、
Ｘ２１は、アラニン、グリシンまたはアスパラギンであり、
Ｘ２５は、ヒスチジンおよびスレオニンからなる群から選択され、
Ｘ２９は、アラニン、グリシン、セリンからなる群から選択され、
Ｘ３０は、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸、システイン酸からなる群から選択され、
Ｘ３３は、アスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群から選択され、
Ｘ３４は、アラニンおよびスレオニンからなる群から選択され、
Ｘ４１は、アスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群から選択され、
Ｘ４２は、アラニン、オルニチン、アルギニンからなる群から選択され、
Ｘ４５は、チロシンおよびフェニルアラニンからなる群から選択され、
Ｘ４６は、フェニルアラニンまたはチロシンであり、
Ｘ４７はアスパラギンまたはスレオニンであり、
Ｘ４８は、アスパラギン酸−リジンジペプチド、アルギニン−プロリンジペプチド、リジン−プロリンジペプチドまたはプロリン−リジンジペプチドであり、
Ｘ５１は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニンからなる群から選択され、
Ｘ５２は、チロシン以外のアミノ酸であり、
Ｘ５３からＸ５６は各々独立に、アミノ酸であり、
Ｘ５７およびＸ５８は独立に、アルギニン、リジン、システイン、ホモシステイン、アセチル−フェニルアラニンまたはオルニチンであり、
Ｘ７０〜Ｘ７３は独立に、アミノ酸であり、Ｒ１３は、ＣＯＯＨまたはＣＯＮＨ２である。一実施形態では、単鎖インスリンは、橋渡し部分のアミノ酸の側鎖および／またはＢ鎖のＮ末端のαアミン、Ａ鎖のＡ９、Ａ１４、Ａ１５またはＢ鎖のＢ１、Ｂ２、Ｂ１０、Ｂ２２、Ｂ２８またはＢ２９のアミノ酸の側鎖からなる群から選択される位置に共有結合したポリエチレングリコール鎖をさらに有する。一実施形態では、ポリエチレングリコール鎖は、橋渡し部分のアミノ酸の側鎖および／またはＢ鎖のＮ末端のαアミン（たとえば、インスリン系Ｂ鎖であればＢ１の位置、ＩＧＦ−１系Ｂ鎖であればＢ２の位置）に共有結合する。一実施形態では、ポリエチレングリコール鎖は、橋渡し部分の８番目の位置にあるアミノ酸の側鎖に共有結合する。
＜単鎖インスリン類縁体のＰＥＧ化＞
本出願人らは、驚くべきことに、親水体を本明細書に開示のインスリンの単鎖類縁体に共有結合すると、活性の開始が遅く、期間が長く、活性の基本プロファイルを呈する類縁体が提供されることを発見した。一実施形態では、Ａ鎖のＡ９、Ａ１４、Ａ１５からなる群から選択される位置のアミノ酸の側鎖またはＢ鎖のＮ末端のαアミン（たとえば、インスリン系Ｂ鎖であればＢ１の位置、ＩＧＦ−１系Ｂ鎖であればＢ２の位置）またはＢ鎖のＢ１、Ｂ２、Ｂ１０、Ｂ２２、Ｂ２８またはＢ２９の位置でのアミノ酸の側鎖あるいは、Ａ鎖とＢ鎖とを結合する橋渡し部分の任意の位置に共有結合する親水体を含むように、本明細書に開示の単鎖インスリン類縁体をさらに修飾する。例示としての実施形態では、この親水体は、これらの位置のいずれかで、Ｌｙｓ、Ｃｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステインまたはアセチル−フェニルアラニン残基に共有結合する。一実施形態では、親水体は、橋渡し部分のアミノ酸の側鎖に共有結合している。
親水体の例として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、たとえば、分子量約１，０００ダルトン〜約４０，０００ダルトンまたは約２０，０００ダルトン〜約４０，０００ダルトンのポリエチレングリコールがあげられる。別の好適な親水体としては、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチル化ポリオール（ＰＯＧなど）、ポリオキシエチル化ソルビトール、ポリオキシエチル化グルコース、ポリオキシエチル化グリセロール（ＰＯＧ）、ポリオキシアルキレン、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、モノ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルコキシ−またはアリールオキシ−ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、ポリアセタール、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリ（β−アミノ酸）（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、ポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー（ＰＰＧ）および他のポリアルキレンオキシド、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、コロン酸または他の多糖ポリマー、Ｆｉｃｏｌｌまたはデキストランおよびこれらの混合物があげられる。
親水体、たとえば、いくつかの実施形態によればポリエチレングリコール鎖は、分子量が約５００〜約４０，０００ダルトンの範囲から選択される。一実施形態では、親水体、たとえばＰＥＧは、分子量が約５００〜約５，０００ダルトン、または約１，０００〜約５，０００ダルトンの範囲から選択される。もうひとつの実施形態では、親水体、たとえばＰＥＧは、分子量が約１０，０００〜約２０，０００ダルトンである。さらに別の例示としての実施形態では、親水体、たとえばＰＥＧは、分子量が約２０，０００〜約４０，０００ダルトンである。一実施形態では、親水体、たとえばＰＥＧは、分子量が約２０，０００ダルトンである。一実施形態では、類縁体の１つまたは２つ以上のアミノ酸がＰＥＧ化され、共有結合したＰＥＧ鎖の合計分子量が約２０，０００ダルトンである、単鎖インスリン類縁体が提供される。
一実施形態では、デキストランを親水体として使用する。デキストランは、α１〜６結合によって優先的に結合するグルコースサブユニットの多糖ポリマーである。デキストランは、約１ｋＤ〜約１００ｋＤあるいは、約５、約１０、約１５または約２０ｋＤから約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０または約９０ｋＤなど、多くの分子量範囲で入手可能である。
直鎖状または分岐状のポリマーが考えられている。得られる結合体の調製物は、基本的に単分散であっても多分散であってもよく、ペプチド１つあたり約０．５個、０．７個、１個、１．２個、１．５個または２個のポリマー部分を有するものであってもよい。
一実施形態では、親水体は、任意に、Ａ鎖のＡ９、Ａ１４、Ａ１５からなる群から選択される位置、Ｂ鎖の位置Ｂ１、Ｂ２、Ｂ１０、Ｂ２２、Ｂ２８またはＢ２９、Ｂ鎖のＮ末端のαアミンまたはＡ鎖とＢ鎖とを結合する橋渡し部分の任意の位置（たとえば、Ｃ８の位置など）でアミノ酸の側鎖に結合するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖である。一実施形態では、単鎖インスリン類縁体は、８〜１２個のアミノ酸からなるペプチドの橋渡し部分を有し、ここで、橋渡し部分のアミノ酸のうちの１つが、側鎖に共有結合したポリエチレン鎖を有する。一実施形態では、単鎖インスリン類縁体は、８〜１２個のアミノ酸からなるペプチドの橋渡し部分を有し、ここで、橋渡し部分のアミノ酸はＰＥＧ化され、Ａ鎖のＡ９、Ａ１４、Ａ１５からなる群から選択される位置、Ｂ鎖のＢ１、Ｂ２、Ｂ１０、Ｂ２２、Ｂ２８またはＢ２９の位置の１つまたは２つ以上のアミノ酸もＰＥＧ化される。一実施形態では、共有結合したＰＥＧ鎖（単数または複数）の合計分子量は約２０，０００ダルトンである。
一実施形態では、単鎖インスリン類縁体は、８〜１２個のアミノ酸からなる橋渡し部分を有し、この橋渡し部分のアミノ酸のうちの１つは、その側鎖に共有結合した２０，０００ダルトンのポリエチレン鎖を有する。もうひとつの実施形態では、インスリン類縁体は、８〜１２個のアミノ酸からなるペプチドの橋渡し部分を有し、橋渡し部分のアミノ酸のうちの１つは、その側鎖に共有結合したポリエチレン鎖を有する。また、Ｂ鎖のＮ末端のαアミン（たとえば、インスリン系Ｂ鎖であればＢ１の位置またはＩＧＦ−１系Ｂ鎖であればＢ２の位置）あるいは、Ｂ鎖のＢ１、Ｂ２およびＢ２９の位置のアミノ酸の側鎖に、第２のＰＥＧ鎖が結合している。一実施形態では、２つのＰＥＧ鎖が単鎖インスリン類縁体に結合する場合、各ＰＥＧ鎖は、分子量が約１０，０００ダルトンである。一実施形態では、ＰＥＧ鎖が８〜１２個のアミノ酸からなる橋渡し部分に結合する場合、このＰＥＧ鎖は橋渡し部分のＣ７の位置またはＣ８の位置に結合し、一実施形態では、ＰＥＧ鎖は、橋渡し部分のＣ８の位置に結合する。一実施形態では、２つのＰＥＧ鎖が単鎖インスリン類縁体に結合する場合、一方のＰＥＧ鎖がＣ８の位置に結合し、第２のＰＥＧはＡ９、Ａ１４、Ａ１５、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ１０、Ｂ２２、Ｂ２８またはＢ２９に結合する。
ポリエチレングリコールなどの親水体は、タンパク質を活性化ポリマー分子と反応させるのに用いられる任意の好適な条件下で、単鎖インスリン類縁体に結合可能である。標的化合物（アルデヒド基、アミノ基、エステル基、チオール基、α−ハロアセチル基、マレイミド基またはヒドラジノ基など）の反応性基に、ＰＥＧ部分（アルデヒド基、アミノ基、エステル基、チオール基、α−ハロアセチル基、マレイミド基またはヒドラジノ基など）の反応性基を介して結合させる、アシル化、還元的アルキル化、マイケル付加、チオールアルキル化または他の化学選択的結合／ライゲーション方法をはじめとして、当分野で知られたどのような手段を用いてもよい。水溶性ポリマーを１つまたは２つ以上のタンパク質に結合するのに用いられる活性化基として、限定することなく、スルホン、マレイミド、スルフヒドリル、チオール、トリフレート、トレシレート、アジリジン、オキシラン、５−ピリジルがあげられる。還元的アルキル化によってペプチドに結合する場合、重合度を制御できるように、選択するポリマーは、単一の反応性アルデヒドを有するものでなければならない。たとえば、Kinstler et al., Adv. Drug. Delivery Rev. 54: 477-485 (2002)；Roberts et al., Adv. Drug Delivery Rev. 54: 459-476 (2002)；Zalipsky et al., Adv. Drug Delivery Rev. 16: 157-182 (1995)を参照のこと。
本発明の具体的な態様では、チオールを有する単鎖類縁体のアミノ酸残基を、ＰＥＧなどの親水体で修飾する。いくつかの実施形態では、チオールをマイケル付加反応においてマレイミド活性化ＰＥＧで修飾し、以下に示すチオエーテル結合を有するＰＥＧ化ペプチドを得る。
Figure 0005969469
いくつかの実施形態では、チオールを求核置換反応においてハロアセチル活性化ＰＥＧで修飾し、以下に示すチオエーテル結合を有するＰＥＧ化ペプチドを得る。
Figure 0005969469
＜単鎖インスリン類縁体のアシル化＞
いくつかの実施形態では、単鎖インスリン類縁体は、アシル基を含むように修飾される。アシル基は、単鎖インスリン類縁体のアミノ酸に直接共有結合するものであってもよいし、単鎖インスリン類縁体のアミノ酸にスペーサーを介して間接的に共有結合するものであってもよい。ここで、スペーサーは、単鎖インスリン類縁体のアミノ酸とアシル基との間に位置する。単鎖インスリン類縁体は、親水体が結合している同一のアミノ酸の位置でアシル化されていてもよいし、異なるアミノ酸の位置でアシル化されていてもよい。たとえば、アシル化は、アシル化されていない単鎖インスリン類縁体がアシル化時に保持している活性が保たれるという条件で、Ａ鎖またはＢ鎖のアミノ酸のみならず、橋渡し部分内の位置まで含めて、どの位置でなされてもよい。非限定的な例として、Ａ鎖のＡ１４およびＡ１５の位置でのアシル化、インスリン系Ｂ鎖であればＢ１の位置またはＩＧＦ−１系Ｂ鎖であればＢ２の位置でのアシル化またはＢ鎖のＢ１０、Ｂ２２、Ｂ２８またはＢ２９の位置あるいは、橋渡し部分の任意の位置でのアシル化があげられる。
本発明の具体的な一態様では、単鎖インスリン類縁体（またはその誘導体または結合体）は、単鎖インスリン類縁体のアミノ酸の側鎖のアミン、ヒドロキシルまたはチオールを直接アシル化して、アシル基を含むように修飾される。いくつかの実施形態では、単鎖インスリン類縁体は、アミノ酸の側鎖のアミン、ヒドロキシルまたはチオールを介して直接アシル化される。いくつかの実施形態では、アシル化は、（天然のインスリンのＡ鎖配列およびＢ鎖配列のアミノ酸番号で）Ｂ２８の位置またはＢ２９の位置でなされる。この点について、（天然のインスリンのＡ鎖配列およびＢ鎖配列のアミノ酸番号で）たとえばＡ１４、Ａ１５、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ１０、Ｂ２２、Ｂ２８またはＢ２９の位置または橋渡し部分の任意の位置で、側鎖のアミン、ヒドロキシルまたはチオールを有するアミノ酸を用いて、Ａ鎖またはＢ鎖の配列を１つまたは２つ以上のアミノ酸置換で修飾した単鎖インスリン類縁体が提供される。本発明のいくつかの具体的な実施形態では、単鎖インスリン類縁体の直接的なアシル化は、（天然のインスリンのＡ鎖配列およびＢ鎖配列のアミノ酸番号で）Ｂ２８またはＢ２９の位置でのアミノ酸の側鎖のアミン、ヒドロキシルまたはチオールによってなされる。
一実施形態では、単鎖インスリン類縁体は、式Ｉのアミノ酸を有する。
Figure 0005969469
例示としてのいくつかの実施形態では、式Ｉのアミノ酸は、ｎが４（Ｌｙｓ）またはｎが３（Ｏｒｎ）のアミノ酸である。
もうひとつの実施形態では、単鎖インスリン類縁体は、式ＩＩのアミノ酸を有する。
Figure 0005969469
例示としてのいくつかの実施形態では、式ＩＩのアミノ酸は、ｎが１（Ｓｅｒ）のアミノ酸である。
さらにもうひとつの実施形態では、単鎖インスリン類縁体は、側鎖のチオールを有し、式ＩＩＩのアミノ酸である。
Figure 0005969469
例示としてのいくつかの実施形態では、式ＩＩＩのアミノ酸は、ｎが１（Ｃｙｓ）のアミノ酸である。
さらにもうひとつの実施形態では、単鎖インスリン類縁体は、式Ｉ、式ＩＩまたは式ＩＩＩのアミノ酸のα炭素に結合した水素が第２の側鎖で置換されていること以外は、式Ｉ、式ＩＩまたは式ＩＩＩと同一の構造を有する二置換されたアミノ酸を有する。
一実施形態によれば、アシル化された単鎖インスリン類縁体は、ペプチドとアシル基との間にスペーサーを有する。いくつかの実施形態では、単鎖インスリン類縁体は、スペーサーに共有結合し、これがアシル基に共有結合している。例示としてのいくつかの実施形態では、単鎖インスリン類縁体は、スペーサーのアミン、ヒドロキシルまたはチオールのアシル化によって、アシル基を含むように修飾され、このスペーサーは、（天然のインスリンのＡ鎖またはＢ鎖のアミノ酸番号で）Ｂ２８またはＢ２９の位置あるいは、スペーサー部分の任意の位置で、アミノ酸の側鎖に結合している。スペーサーが結合している単鎖インスリン類縁体のアミノ酸は、スペーサーとの結合を可能にする部分を有するものであれば、どのようなアミノ酸であってもよい。たとえば、側鎖に、−ＮＨ２、−ＯＨまたは−ＣＯＯＨを有するアミノ酸（たとえば、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｕなど）が適している。
いくつかの実施形態では、単鎖インスリン類縁体とアシル基との間のスペーサーは、側鎖のアミン、ヒドロキシルまたはチオールを有するアミノ酸（または側鎖のアミン、ヒドロキシルまたはチオールを有するアミノ酸を有するジペプチドまたはトリペプチド）である。いくつかの実施形態では、スペーサーは、親水性の二官能性スペーサーであってもよい。具体的な実施形態では、スペーサーは、アミノポリ（アルキルオキシ）カルボキシレートを有する。この点について、スペーサーは、たとえば、ＮＨ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ（ＣＨ２）ｍＣＯＯＨを含むものであってもよく、式中、ｍは１〜６の任意の整数であり、ｎは２〜１２の任意の整数である。その一例として、Peptides International, Inc.（Louisville, KY）から市販されている８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸がある。一実施形態では、親水性の二官能性スペーサーは、２個または３個以上の反応性基、たとえば、アミン、ヒドロキシル、チオール、カルボキシ基またはこれらの任意の組み合わせを有する。特定の実施形態では、親水性の二官能性スペーサーは、ヒドロキシ基とカルボキシレートとを有する。他の実施形態では、親水性の二官能性スペーサーは、アミン基とカルボキシレートとを有する。他の実施形態では、親水性の二官能性スペーサーは、チオール基とカルボキシレートとを有する。
いくつかの実施形態では、ペプチド単鎖インスリン類縁体とアシル基との間のスペーサーは、疎水性の二官能性スペーサーである。疎水性の二官能性スペーサーは、当分野で知られている。たとえば、Bioconjugate Techniques、G. T. Hermanson(Academic Press, San Diego, CA, 1996)（その内容全体を本明細書に援用する）を参照のこと。特定の実施形態では、疎水性の二官能性スペーサーは、２個または３個以上の反応性基、たとえば、アミン、ヒドロキシル、チオール、カルボキシ基またはこれらの任意の組み合わせを有する。特定の実施形態では、疎水性の二官能性スペーサーは、ヒドロキシ基とカルボキシレートとを有する。他の実施形態では、疎水性の二官能性スペーサーは、アミン基とカルボキシレートとを有する。他の実施形態では、疎水性の二官能性スペーサーは、チオール基とカルボキシレートとを有する。カルボキシレートとヒドロキシ基またはチオール基とを有する好適な疎水性の二官能性スペーサーは、当分野で知られており、たとえば、８−ヒドロキシオクタン酸および８−メルカプトオクタン酸があげられる。
特定の実施形態によれば、二官能性スペーサーは、原子３〜１０個の長さのアミノ酸骨格を有する合成のアミノ酸または天然のアミノ酸であってもよい（たとえば、６−アミノヘキサン酸、５−アミノ吉草酸、７−アミノヘプタン酸、８−アミノオクタン酸など）。あるいは、スペーサーは、原子３〜１０個（たとえば、原子６〜１０個など）の長さのペプチド骨格を有するジペプチドスペーサーまたはトリペプチドスペーサーであってもよい。単鎖インスリン類縁体に結合したジペプチドスペーサーまたはトリペプチドスペーサーのそれぞれのアミノ酸は、独立に、たとえば、天然のアミノ酸（Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ）の任意のＤ異性体またはＬ異性体あるいは、β−アラニン（β−Ａｌａ）、Ｎ−α−メチル−アラニン（Ｍｅ−Ａｌａ）、アミノ酪酸（Ａｂｕ）、α−アミノ酪酸（γ−Ａｂｕ）、アミノヘキサン酸（ε−Ａｈｘ）、アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）、アミノメチルピロールカルボン酸、アミノピペリジンカルボン酸、アミノセリン（Ａｍｓ）、アミノテトラヒドロピラン−４−カルボン酸、アルギニンＮ−メトキシ−Ｎ−メチルアミド、β−アスパラギン酸（β−Ａｓｐ）、アゼチジンカルボン酸、３−（２−ベンゾチアゾリル）アラニン、α−ｔｅｒｔ−ブチルグリシン、２−アミノ−５−ウレイド−ｎ−吉草酸（シトルリン、Ｃｉｔ）、β−シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、アセトアミドメチル−システイン、ジアミノブタン酸（Ｄａｂ）、ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）、ジヒドロキシフェニルアラニン（ＤＯＰＡ）、ジメチルチアゾリジン（ＤＭＴＡ）、γ−グルタミン酸（γ−Ｇｌｕ）、ホモセリン（Ｈｓｅ）、ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）、イソロイシンＮ−メトキシ−Ｎ−メチルアミド、メチル−イソロイシン（ＭｅＩｌｅ）、イソニペコチン酸（Ｉｓｎ）、メチルロイシン（ＭｅＬｅｕ）、メチルリジン、ジメチルリジン、トリメチルリジン、メタノプロリン、メチオニン−スルホキシド（Ｍｅｔ（Ｏ））、メチオニン−スルホン（Ｍｅｔ（Ｏ２））、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、メチル−ノルロイシン（Ｍｅ−Ｎｌｅ）、ノルバリン（Ｎｖａ）、オルニチン（Ｏｒｎ）、パラアミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）、ペニシラミン（Ｐｅｎ）、メチルフェニルアラニン（ＭｅＰｈｅ）、４−クロロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−Ｃｌ））、４−フロオロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−Ｆ））、４−ニトロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−ＮＯ２））、４−シアノフェニルアラニン（（Ｐｈｅ（４−ＣＮ））、フェニルグリシン（Ｐｈｇ）、ピペリジニルアラニン、ピペリジニルグリシン、３，４−デヒドロプロリン、ピロリジニルアラニン、サルコシン（Ｓａｒ）、セレノシステイン（Ｓｅｃ）、Ｕ−ベンジル−ホスホセリン、４−アミノ−３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタン酸（Ｓｔａ）、４−アミノ−５−シクロヘキシル−３−ヒドロキシペンタン酸（ＡＣＨＰＡ）、４−アミノ−３−ヒドロキシ−５−フェニルペンタン酸（ＡＨＰＰＡ）、１，２，３，４−テトラヒドロ−イソキノリン−３−カルボン酸（Ｔｉｃ）、テトラヒドロピラングリシン、チエニルアラニン（Ｔｈｉ）、Ｕ−ベンジル−ホスホチロシン、Ｏ−ホスホチロシン、メトキシチロシン、エトキシチロシン、Ｏ−（ビス−ジメチルアミノ−ホスホノ）−チロシン、硫酸チロシンテトラブチルアミン、メチル−バリン（ＭｅＶａｌ）、１−アミノ−１−シクロヘキサンカルボン酸（Ａｃｘ）、アミノ吉草酸、β−シクロプロピル−アラニン（Ｃｐａ）、プロパギルグリシン（Ｐｒｇ）、アリルグリシン（Ａｌｇ）、２−アミノ−２−シクロヘキシル−プロパン酸（２−Ｃｈａ）、ｔｅｒｔ−ブチルグリシン（Ｔｂｇ）、ビニルグリシン（Ｖｇ）、１−アミノ−１−シクロプロパンカルボン酸（Ａｃｐ）、１−アミノ−１−シクロペンタンカルボン酸（Ａｃｐｅ）、アルキル化された３−メルカプトプロピオン酸、１−アミノ−１−シクロブタンカルボン酸（Ａｃｂ）からなる群から選択される非天然のアミノ酸のＤ異性体またはＬ異性体をはじめとする、天然および／または非天然のアミノ酸からなる群から選択可能である。いくつかの実施形態では、ジペプチドスペーサーは、Ａｌａ−Ａｌａ、β−Ａｌａ−β−Ａｌａ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、Ｐｒｏ−Ｐｒｏ、γ−アミノ酪酸−γ−アミノ酪酸、γ−Ｇｌｕ−γ−Ｇｌｕからなる群から選択される。
ペプチド単鎖インスリン類縁体は、長鎖アルカンのアシル化によってアシル基を含むように修飾されていてもよい。具体的な態様では、長鎖アルカンは、単鎖インスリン類縁体のカルボキシ基またはその活性化形態と反応するアミン、ヒドロキシルまたはチオール基を有する（たとえば、オクタデシルアミン、テトラデカノール、ヘキサデカンチオールなど）。単鎖インスリン類縁体のカルボキシ基またはその活性化形態は、単鎖インスリン類縁体のアミノ酸（たとえば、グルタミン酸、アスパラギン酸など）の側鎖の一部であってもよいし、ペプチド骨格の一部であってもよい。
特定の実施形態では、単鎖インスリン類縁体は、単鎖インスリン類縁体に結合しているスペーサーによる長鎖アルカンのアシル化によって、アシル基を含むように修飾される。具体的な態様では、長鎖アルカンは、スペーサーのカルボキシ基またはその活性化形態と反応するアミン、ヒドロキシルまたはチオール基を有する。カルボキシ基またはその活性化形態を有する好適なスペーサーを本明細書に記載し、一例として、アミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、親水性の二官能性スペーサー、疎水性の二官能性スペーサーなどの二官能性スペーサーがあげられる。本明細書で使用する場合、「カルボキシ基の活性化形態」という表現は、一般式Ｒ（Ｃ＝Ｏ）Ｘのカルボキシ基を示し、式中、Ｘは脱離基であり、Ｒは単鎖インスリン類縁体またはスペーサーである。たとえば、カルボキシ基の活性化形態としては、塩化アシル、無水物、エステルがあげられるが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、活性化したカルボキシ基は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）脱離基を有するエステルである。
長鎖アルカンがペプチド単鎖インスリン類縁体またはスペーサーによってアシル化される本発明の態様に関して、長鎖アルカンは、どのようなサイズであってもよく、どのような炭素鎖長であってもよい。長鎖アルカンは、直鎖状であっても分岐状であってもよい。特定の態様では、長鎖アルカンは、Ｃ４〜Ｃ３０アルカンである。たとえば、長鎖アルカンは、Ｃ４アルカン、Ｃ６アルカン、Ｃ８アルカン、Ｃ１０アルカン、Ｃ１２アルカン、Ｃ１４アルカン、Ｃ１６アルカン、Ｃ１８アルカン、Ｃ２０アルカン、Ｃ２２アルカン、Ｃ２４アルカン、Ｃ２６アルカン、Ｃ２８アルカンまたはＣ３０アルカンのいずれであってもよい。いくつかの実施形態では、長鎖アルカンは、Ｃ８〜Ｃ２０アルカン、たとえばＣ１４アルカン、Ｃ１６アルカンまたはＣ１８アルカンであってもよい。
いくつかの実施形態では、単鎖インスリン類縁体のアミン、ヒドロキシルまたはチオール基は、コレステロール酸でアシル化される。具体的な実施形態では、ペプチドは、アルキル化されたデスアミノシステインスペーサー、すなわちアルキル化された３−メルカプトプロピオン酸スペーサーを介して、コレステロール酸に結合している。 アミン、ヒドロキシル、チオールによってペプチドをアシル化する好適な方法は、当分野で知られている。たとえば、Miller, Biochem Biophys Res Commun 218: 377-382 (1996)；Shimohigashi and Stammer, Int J Pept Protein Res 19: 54-62 (1982)；およびPreviero et al., Biochim Biophys Acta 263: 7-13 (1972)（ヒドロキシルでアシル化する方法）；およびSan and Silvius, J Pept Res 66: 169-180 (2005)（チオールでアシル化する方法）；Bioconjugate Chem. "Chemical Modifications of Proteins: History and Applications" pages 1, 2-12 (1990)；Hashimoto et al., Pharmacuetical Res. "Synthesis of Palmitoyl Derivatives of Insulin and their Biological Activity" Vol. 6, No: 2 pp.171-176 (1989)を参照のこと。
アシル化されたペプチド単鎖インスリン類縁体のアシル基は、どのような炭素鎖長であってもよいなど、どのようなサイズであってもよく、直鎖状であっても分岐状であってもよい。本発明のいくつかの具体的な実施形態では、アシル基は、Ｃ４〜Ｃ３０脂肪酸である。たとえば、アシル基は、Ｃ４脂肪酸、Ｃ６脂肪酸、Ｃ８脂肪酸、Ｃ１０脂肪酸、Ｃ１２脂肪酸、Ｃ１４脂肪酸、Ｃ１６脂肪酸、Ｃ１８脂肪酸、Ｃ２０脂肪酸、Ｃ２２脂肪酸、Ｃ２４脂肪酸、Ｃ２６脂肪酸、Ｃ２８脂肪酸またはＣ３０脂肪酸のいずれであってもよい。いくつかの実施形態では、アシル基は、Ｃ８〜Ｃ２０脂肪酸、たとえば、Ｃ１４脂肪酸またはＣ１６脂肪酸である。
別の実施形態では、アシル基は胆汁酸である。胆汁酸は、好適な胆汁酸であれば、どのようなものであってもよい。一例をあげると、コール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、リトコール酸、タウロコール酸、グリココール酸、コレステロール酸などであるが、これらに限定されるものではない。
本明細書に記載のアシル化された単鎖インスリン類縁体は、親水体を有するようにさらに修飾されていてもよい。いくつかの具体的な実施形態では、親水体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖を有するものであってもよい。親水体の取り込みについては、本明細書に記載の任意の方法など、好適な任意の手段で達成可能である。いくつかの実施形態では、アシル化された単鎖類縁体は、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステインまたはＡｃ−Ｐｈｅからなる群から選択されるアミノ酸を含み、アミノ酸の側鎖は親水体（たとえば、ＰＥＧ）に共有結合している。一実施形態では、アシル基は、（天然のインスリンのＡ鎖およびＢ鎖のアミノ酸番号で）Ａ１４、Ａ１５、Ｂ１（インスリン系Ｂ鎖の場合）、Ｂ２（ＩＧＦ−１系Ｂ鎖の場合）、Ｂ１０、Ｂ２２、Ｂ２８またはＢ２９の位置に、任意に、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステインまたはＡｃ−Ｐｈｅを含むスペーサーを介して結合している。
あるいは、アシル化された単鎖インスリン類縁体はスペーサーを有し、この場合のスペーサーは、アシル化され、なおかつ親水体を含むように修飾される。好適なスペーサーの非限定的な例としては、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステイン、Ａｃ−Ｐｈｅからなる群から選択される１つまたは２つ以上のアミノ酸を有するスペーサーがあげられる。
＜単鎖インスリン類縁体のアルキル化＞
いくつかの実施形態では、単鎖インスリン類縁体は、アルキル基を含むように修飾される。アルキル基は、単鎖インスリン類縁体のアミノ酸に直接的に共有結合してもよいし、単鎖インスリン類縁体のアミノ酸にスペーサーを介して間接的に共有結合してもよく、この場合、スペーサーは、単鎖インスリン類縁体のアミノ酸とアルキル基との間に位置する。アルキル基は、エーテル結合、チオエーテル結合またはアミノ結合などを介して単鎖インスリン類縁体に結合していてもよい。たとえば、単鎖インスリン類縁体は、親水体が結合している同一のアミノ酸の位置でアルキル化されていてもよいし、異なるアミノ酸の位置でアルキル化されていてもよい。アルキル化は、インスリン活性が保たれるという条件で、たとえば、Ｂ鎖のＣ末端領域または橋渡し部分内の位置など、単鎖インスリン類縁体のどの位置でなされてもよい。本発明の具体的な態様では、単鎖インスリン類縁体は、単鎖インスリン類縁体のアミノ酸の側鎖のアミン、ヒドロキシルまたはチオールを直接アルキル化して、アルキル基を含むように修飾される。いくつかの実施形態では、単鎖インスリン類縁体は、アミノ酸の側鎖のアミン、ヒドロキシルまたはチオールを介して直接アルキル化される。本発明のいくつかの具体的な実施形態では、単鎖インスリン類縁体の直接的なアルキル化は、（天然のインスリンのＡ鎖およびＢ鎖のアミノ酸番号）Ａ１４、Ａ１５、Ｂ１（インスリン系Ｂ鎖の場合）、Ｂ２（ＩＧＦ−１系Ｂ鎖の場合）、Ｂ１０、Ｂ２２、Ｂ２８またはＢ２９の位置で、アミノ酸の側鎖のアミン、ヒドロキシルまたはチオールによってなされる。
いくつかの実施形態では、単鎖インスリン類縁体のアミノ酸は、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩから選択されるアミノ酸であってもよく、この場合のアルキル基はそれぞれ、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩのアミノ、ヒドロキシルまたはチオール基を介して結合している。いくつかの例示としての実施形態では、式Ｉのアミノ酸は、ｎが４（Ｌｙｓ）またはｎが３（Ｏｒｎ）のアミノ酸である。いくつかの例示としての実施形態では、式ＩＩのアミノ酸は、ｎが１（Ｓｅｒ）のアミノ酸である。いくつかの例示としての実施形態では、式ＩＩのアミノ酸は、ｎが１（Ｃｙｓ）のアミノ酸である。さらに他の実施形態では、側鎖のアミン、ヒドロキシルまたはチオールを有する、ペプチド単鎖インスリン類縁体のアミノ酸は、式Ｉ、式ＩＩまたは式ＩＩＩのアミノ酸のα炭素に結合した水素が第２の側鎖で置換されていること以外は、式Ｉ、式ＩＩまたは式ＩＩＩと同一の構造を有する二置換されたアミノ酸である。
本発明のいくつかの実施形態では、単鎖インスリン類縁体は、ペプチドとアルキル基との間にスペーサーを有する。いくつかの実施形態では、単鎖インスリン類縁体は、スペーサーに共有結合し、これがアルキル基に共有結合している。例示としてのいくつかの実施形態では、単鎖インスリン類縁体は、スペーサーのアミン、ヒドロキシルまたはチオールのアルキル化によって、アルキル基を含むように修飾され、このスペーサーは、（天然のインスリンのＡ鎖およびＢ鎖のアミノ酸番号で）Ａ１４、Ａ１５、Ｂ１（インスリン系Ｂ鎖の場合）、Ｂ２（ＩＧＦ−１系Ｂ鎖の場合）、Ｂ１０、Ｂ２２、Ｂ２８またはＢ２９の位置で、アミノ酸の側鎖に結合している。スペーサーが結合している単鎖インスリン類縁体のアミノ酸は、スペーサーとの結合を可能にする部分を有するものであれば、どのようなアミノ酸であってもよい（たとえば、α−一置換アミノ酸またはα，α−二置換アミノ酸など）。側鎖に、−ＮＨ２、−ＯＨまたは−ＣＯＯＨを有する単鎖インスリン類縁体のアミノ酸（たとえば、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｕなど）が適している。いくつかの実施形態では、ペプチド単鎖インスリン類縁体とアルキル基との間のスペーサーは、側鎖のアミン、ヒドロキシルまたはチオールを有するアミノ酸あるいは、側鎖のアミン、ヒドロキシルまたはチオールを有するアミノ酸を有するジペプチドまたはトリペプチドである。
αアミンがアルキル化される例では、スペーサーのアミノ酸は、どのようなアミノ酸であってもよい。たとえば、スペーサーのアミノ酸は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒなどの疎水性のアミノ酸であってもよい。あるいは、スペーサーのアミノ酸は、ＡｓｐおよびＧｌｕなどの酸性残基であってもよい。例示としての実施形態では、スペーサーのアミノ酸は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、６−アミノヘキサン酸、５−アミノ吉草酸、７−アミノヘプタン酸、８−アミノオクタン酸などの疎水性のアミノ酸であってもよい。あるいは、スペーサーのアミノ酸は、アルキル化が酸性残基のαアミンで起こるかぎりにおいて、ＡｓｐおよびＧｌｕなどの酸性残基であってもよい。スペーサーのアミノ酸の側鎖のアミンがアルキル化されている例では、スペーサーのアミノ酸は、式Ｉのアミノ酸（たとえば、ＬｙｓまたはＯｒｎなど）といった側鎖のアミンを有するアミノ酸である。この場合、ペプチドがジアルキル化されるように、スペーサーのアミノ酸のαアミンと側鎖のアミンのどちらも、アルキル化が可能である。本発明の実施形態は、このようなジアルキル化された分子を含む。
スペーサーのアミノ酸のヒドロキシ基を介してアルキル化が起こる場合、スペーサーのアミノ酸またはアミノ酸のうちの１つは、式ＩＩのアミノ酸であってもよい。一例としての具体的な実施形態では、アミノ酸はＳｅｒである。
スペーサーのアミノ酸のチオール基を介してアルキル化が起こる場合、スペーサーのアミノ酸またはアミノ酸のうちの１つは、式ＩＩＩのアミノ酸であってもよい。一例としての具体的な実施形態では、アミノ酸はＣｙｓである。
いくつかの実施形態では、スペーサーは、親水性の二官能性スペーサーであってもよい。具体的な実施形態では、スペーサーは、アミノポリ（アルキルオキシ）カルボキシレートを有する。この点について、スペーサーは、たとえば、ＮＨ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ（ＣＨ２）ｍＣＯＯＨを含むものであってもよく、式中、ｍは１〜６の任意の整数であり、ｎは２〜１２の任意の整数である。その一例として、Peptides International, Inc.（Louisville, KY）から市販されている８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸がある。いくつかの実施形態では、ペプチド単鎖インスリン類縁体とアルキル基との間のスペーサーは、親水性の二官能性スペーサーである。特定の実施形態では、親水性の二官能性スペーサーは、２つまたは３つ以上の反応性基、たとえば、アミン、ヒドロキシル、チオール、カルボキシ基またはこれらの任意の組み合わせを有する。特定の実施形態では、親水性の二官能性スペーサーは、ヒドロキシ基とカルボキシレートとを有する。他の実施形態では、親水性の二官能性スペーサーは、アミン基とカルボキシレートとを有する。他の実施形態では、親水性の二官能性スペーサーは、チオール基とカルボキシレートとを有する。
いくつかの実施形態では、ペプチド単鎖インスリン類縁体とアルキル基との間のスペーサーは、疎水性の二官能性スペーサーである。特定の実施形態では、疎水性の二官能性スペーサーは、２つまたは３つ以上の反応性基、たとえば、アミン、ヒドロキシル、チオール、カルボキシ基またはこれらの任意の組み合わせを有する。特定の実施形態では、疎水性の二官能性スペーサーは、ヒドロキシ基とカルボキシレートとを有する。他の実施形態では、疎水性の二官能性スペーサーは、アミン基とカルボキシレートとを有する。他の実施形態では、疎水性の二官能性スペーサーは、チオール基とカルボキシレートとを有する。カルボキシレートとヒドロキシ基またはチオール基とを有する好適な疎水性の二官能性スペーサーは、当分野で知られており、たとえば、８−ヒドロキシオクタン酸および８−メルカプトオクタン酸があげられる。
スペーサー（たとえば、アミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、親水性の二官能性スペーサーまたは疎水性の二官能性スペーサーなど）は、原子３〜１０個（たとえば、原子６〜１０個（原子６個、原子７個、原子８個、原子９個または原子１０個など））の長さである。一層具体的な実施形態では、スペーサーは、原子約３〜約１０個（原子６〜１０個など）の長さであり、アルキルは、スペーサーとアルキル基とを合わせた全長が、原子１４〜２８個、たとえば、原子約１４個、約１５個、約１６個、約１７個、約１８個、約１９個、約２０個、約２１個、約２２個、約２３個、約２４個、約２５個、約２６個、約２７個または約２８個になるように、Ｃ１２〜Ｃ１８のアルキル基、たとえば、Ｃ１４アルキル基、Ｃ１６アルキル基である。いくつかの実施形態では、スペーサーとアルキルとの長さは、原子１７〜２８個（１９〜２６個、１９〜２１個など）の長さである。
一実施形態によれば、二官能性スペーサーは、原子３〜１０個の長さのアミノ酸骨格を有する合成のアミノ酸または非天然のアミノ酸である（たとえば、６−アミノヘキサン酸、５−アミノ吉草酸、７−アミノヘプタン酸、８−アミノオクタン酸など）。あるいは、スペーサーは、原子３〜１０個（原子６〜１０個など）の長さのペプチド骨格を有するジペプチドスペーサーまたはトリペプチドスペーサーであってもよい。単鎖インスリン類縁体に結合するジペプチドスペーサーまたはトリペプチドスペーサーは、たとえば、本明細書にて教示する任意のアミノ酸をはじめとする、天然および／または非天然のアミノ酸からなるものであってもよい。いくつかの実施形態では、スペーサーは、たとえば１つまたは２つの負の電荷を持つアミノ酸を有するなど、全体として負の電荷を有する。いくつかの実施形態では、ジペプチドスペーサーは、Ａｌａ−Ａｌａ、β−Ａｌａ−β−Ａｌａ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、Ｐｒｏ−Ｐｒｏ、γ−アミノ酪酸−γ−アミノ酪酸、γ−Ｇｌｕ−γ−Ｇｌｕからなる群から選択される。一実施形態では、ジペプチドスペーサーは、γ−Ｇｌｕ−γ−Ｇｌｕである。
アミン、ヒドロキシル、チオールを用いてペプチドをアルキル化する好適な方法は、当分野で知られている。たとえば、ウィリアムソンエーテル合成を使用して、インスリンペプチドとアルキル基との間にエーテル結合を形成してもよい。また、ペプチドとハロゲン化アルキルとの求核置換反応では、エーテル結合、チオエーテル結合またはアミノ結合のいずれでも得ることができる。アルキル化されたペプチド単鎖インスリン類縁体のアルキル基は、どのような炭素鎖長であってもよいなど、どのようなサイズであってもよく、直鎖状であっても分岐状であってもよい。本発明のいくつかの実施形態では、アルキル基は、Ｃ４〜Ｃ３０アルキルである。たとえば、アルキル基は、Ｃ４アルキル、Ｃ６アルキル、Ｃ８アルキル、Ｃ１０アルキル、Ｃ１２アルキル、Ｃ１４アルキル、Ｃ１６アルキル、Ｃ１８アルキル、Ｃ２０アルキル、Ｃ２２アルキル、Ｃ２４アルキル、Ｃ２６アルキル、Ｃ２８アルキルまたはＣ３０アルキルのいずれであってもよい。いくつかの実施形態では、アルキル基は、Ｃ８〜Ｃ２０アルキル、たとえば、Ｃ１４アルキルまたはＣ１６アルキルである。
いくつかの具体的な実施形態では、アルキル基は、コール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、リトコール酸、タウロコール酸、グリココール酸、コレステロール酸などの胆汁酸のステロイド部分を有する。
いくつかの実施形態では、単鎖インスリン類縁体は、求核基である長鎖アルカンを単鎖インスリン類縁体と反応させることによってアルキル基を含むように修飾され、この場合の単鎖インスリン類縁体は、求核置換に適した脱離基を有する。具体的な態様では、長鎖アルカンの求核基は、アミン、ヒドロキシルまたはチオール基（たとえば、オクタデシルアミン、テトラデカノール、ヘキサデカンチオールなど）であってもよい。単鎖インスリン類縁体の脱離基は、アミノ酸の側鎖の一部であってもよいし、ペプチド骨格の一部であってもよい。好適な脱離基としては、たとえば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ハロゲン、スルホン酸エステルがあげられる。
特定の実施形態では、単鎖インスリン類縁体は、求核基である長鎖アルカンを、単鎖インスリン類縁体に結合しているスペーサーと反応させることで、アルキル基を含むように修飾され、この場合のスペーサーは、脱離基を有する。具体的な態様では、長鎖アルカンは、アミン、ヒドロキシルまたはチオール基を有する。特定の実施形態では、脱離基を有するスペーサーは、アミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、親水性の二官能性スペーサー、疎水性の二官能性スペーサー（好適な脱離基をさらに有する）など、本明細書で説明するどのようなスペーサーであってもよい。
長鎖アルカンが単鎖インスリン類縁体またはスペーサーによってアルキル化されている場合、長鎖アルカンは、どのようなサイズであってもよく、どのような炭素鎖長であってもよい。長鎖アルカンは、直鎖状であっても分岐状であってもよい。特定の態様では、長鎖アルカンは、Ｃ４〜Ｃ３０アルカンである。たとえば、長鎖アルカンは、Ｃ４アルカン、Ｃ６アルカン、Ｃ８アルカン、Ｃ１０アルカン、Ｃ１２アルカン、Ｃ１４アルカン、Ｃ１６アルカン、Ｃ１８アルカン、Ｃ２０アルカン、Ｃ２２アルカン、Ｃ２４アルカン、Ｃ２６アルカン、Ｃ２８アルカンまたはＣ３０アルカンのいずれであってもよい。いくつかの実施形態では、長鎖アルカンは、Ｃ８〜Ｃ２０アルカン、たとえばＣ１４アルカン、Ｃ１６アルカンまたはＣ１８アルカンであってもよい。
また、いくつかの実施形態では、単鎖インスリン類縁体とコレステロール部分との間で、アルキル化が起こり得る。たとえば、コレステロールのヒドロキシ基は、長鎖アルカンの脱離基を置換して、コレステロール−インスリンペプチド産物を形成することができる。本明細書に記載のアルキル化された単鎖インスリン類縁体は、親水体を有するようにさらに修飾されていてもよい。いくつかの具体的な実施形態では、親水体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖を有するものであってもよい。親水体の取り込みについては、本明細書に記載の任意の方法など、好適な任意の手段で達成可能である。いくつかの実施形態では、単鎖インスリン類縁体は、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステインまたはＡｃ−Ｐｈｅから選択されるアミノ酸を含むものであってもよく、アミノ酸の側鎖は親水体（たとえば、ＰＥＧ）に共有結合している。いくつかの実施形態では、アルキル基は、（天然のインスリンのＡ鎖およびＢ鎖のアミノ酸番号で）Ａ１４、Ａ１５、Ｂ１（インスリン系Ｂ鎖の場合）、Ｂ２（ＩＧＦ−１系Ｂ鎖の場合）、Ｂ１０、Ｂ２２、Ｂ２８またはＢ２９の位置に、任意に、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステインまたはＡｃ−Ｐｈｅを含むスペーサーを介して結合し、任意に、別のアミノ酸の側鎖に結合した親水体をさらに有する。あるいは、アルキル化された単鎖インスリン類縁体は、スペーサーを有するものであってもよく、この場合のスペーサーは、アルキル化され、なおかつ親水体を含むように修飾される。好適なスペーサーの非限定的な例としては、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステイン、Ａｃ−Ｐｈｅからなる群から選択される１つまたは２つ以上のアミノ酸を有するスペーサーがあげられる。
＜結合体＞
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の単鎖インスリン類縁体は、ジスルフィド結合などによって、グリコシル化、アミド化、カルボキシル化、リン酸化、エステル化、Ｎ−アシル化、環化されるか、あるいは、塩（たとえば、酸付加塩、塩基付加塩など）に変換されるおよび／または任意に二量体化、多量体化または重合または結合される。本開示は、単鎖インスリン類縁体が異種部分に結合している結合体も包含する。単鎖インスリン類縁体と異種部分との結合は、共有結合、非共有結合（たとえば、静電相互作用、水素結合、ファンデルワールス相互作用、塩結合、疎水性相互作用など）または両方のタイプの結合によって実施すればよい。ビオチン−アビジン、リガンド／受容体、酵素／基質、核酸／核酸結合タンパク質、脂質／脂質結合タンパク質、細胞接着分子の結合相手あるいは、互いに親和性のある任意の結合相手またはそれらの断片をはじめとして、多岐にわたる非共有結合系を利用できる。いくつかの態様では、共有結合はペプチド結合である。異種部分に対する単鎖インスリン類縁体の結合は、間接的であっても直接的な結合であってもよく、間接的な場合には、リンカーまたはスペーサーが関与してもよい。好適なリンカーおよびスペーサーは、当分野で知られており、本明細書に記載されたリンカーまたはスペーサーを含むが、これらに限定されるものではない。
本明細書で使用する場合、「異種部分」という用語は、「結合体部分」という用語と同義であり、自己が結合する単鎖インスリン類縁体とは異なる（化学的または生化学的、天然またはコードされていない）分子を示す。単鎖インスリン類縁体に結合できる結合体部分の例として、異種ペプチドまたはポリペプチド（血漿タンパク質などを含む）、ターゲットするための薬剤、免疫グロブリンまたはその一部（たとえば、可変領域、ＣＤＲまたはＦｃ領域など）、放射性同位元素、フルオロフォアまたは酵素標識などの診断用標識、水溶性ポリマーをはじめとするポリマーまたは他の治療薬または診断薬があげられるが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、単鎖インスリン類縁体および血漿タンパク質を含む結合体が提供され、ここで、血漿タンパク質は、アルブミン、トランスフェリン、フィブリノーゲン、グロブリンからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、結合体の血漿タンパク質部分は、アルブミンまたはトランスフェリンである。一実施形態では、異種部分は、たとえば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）および組換えヒトアルブミン（ｒＨＡ）などのアルブミンをはじめとする
アルブミンである。いくつかの実施形態における結合体は、単鎖インスリン類縁体と、ポリペプチド、核酸分子、抗体またはその断片、ポリマー、単鎖インスリン類縁体量子ドット、低分子、トキシン、診断薬、炭水化物、アミノ酸のうち１つまたは２つ以上を有する。
＜ポリマーの異種部分＞
いくつかの実施形態では、単鎖インスリン類縁体に結合している異種部分は、ポリマーである。いくつかの実施形態では、ポリマーは、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレンおよびこれらの誘導体（ポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド、ポリアルキレンテレフタレートなど）、アクリル酸エステルおよびメタクリル酸エステルのポリマー（ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチルメタクリレート）、ポリ（ブチルメタクリレート）、ポリ（イソブチルメタクリレート）、ポリ（ヘキシルメタクリレート）、ポリ（イソデシルメタクリレート）、ポリ（ラウリルメタクリレート）、ポリ（フェニルメタクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、ポリ（オクタデシルアクリレート）など）、ポリビニルポリマー（ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ポリビニルハライド、ポリ（ビニルアセテート）、ポリビニルピロリドンなど）、ポリグリコライド、ポリシロキサン、ポリウレタンおよびこれらのコポリマー、セルロース（アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシ−プロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、酢酸セルロース、プロピオン酸セルロース、酢酸酪酸セルロース、酢酸フタル酸セルロース、カルボキシルエチルセルロース、三酢酸セルロース、セルロース硫酸ナトリウム塩など）、ポリプロピレン、ポリエチレン（ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチレンテレフタレート）など）、ポリスチレンからなる群から選択される。
いくつかの態様では、ポリマーは、合成生分解性ポリマー（たとえば、乳酸およびグリコール酸のポリマー、ポリ酸無水物、ポリ（オルト）エステル、ポリウレタン、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）、ポリ（ラクチド−コカプロラクトン）など）、天然の生分解性ポリマー（たとえば、アルギン酸および他の多糖類（デキストランおよびセルロースを含む）、コラーゲン、これらの化学的誘導体（置換、化学基の付加、たとえば、アルキル、アルキレン、ヒドロキシル化、酸化ならびに、当業者によってルーチンになされる他の修飾）、アルブミンおよび他の親水性タンパク質（たとえば、ゼインおよび他のプロラミンおよび疎水性タンパク質など））ならびにこれらのコポリマーまたは混合物をはじめとする、生分解性ポリマーである。通常、これらの物質は、in vivoでの酵素による加水分解または水への曝露によって、あるいは表面が浸食されたり、内部まで一挙に浸食されたりすることで、分解される。
いくつかの態様では、ポリマーは、H. S. Sawhney, C. P. Pathak and J. A. Hubbell in Macromolecules, 1993, 26, 581-587（その教示内容を本明細書に援用する）に記載された生浸食性ハイドロゲル、ポリヒアルロン酸、カゼイン、ゼラチン、グルチン、ポリ酸無水物、ポリアクリル酸、アルギン酸、キトサン、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチルメタクリレート）、ポリ（ブチルメタクリレート）、ポリ（イソブチルメタクリレート）、ポリ（ヘキシルメタクリレート）、ポリ（イソデシルメタクリレート）、ポリ（ラウリルメタクリレート）、ポリ（フェニルメタクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、ポリ（オクタデシルアクリレート）などの生付着性ポリマーである。
いくつかの実施形態では、ポリマーは、水溶性ポリマーまたは親水性ポリマーである。親水性ポリマーについては、本明細書の「親水性の異種部分」でさらに説明する。好適な水溶性ポリマーは当分野で知られており、たとえば、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ；Klucel）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ；Methocel）、ニトロセルロース、ヒドロキシプロピルエチルセルロース、ヒドロキシプロピルブチルセルロース、ヒドロキシプロピルペンチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース（Ethocel）、ヒドロキシエチルセルロース、さまざまなアルキルセルロースおよびヒドロキシアルキルセルロース、さまざまなセルロースエーテル、酢酸セルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルシウムカルボキシメチルセルロース、酢酸ビニル／クロトン酸コポリマー、ポリヒドロキシアルキルメタクリレート、ヒドロキシメチルメタクリレート、メタクリル酸コポリマー、ポリメタクリル酸、ポリメチルメタクリレート、無水マレイン酸／メチルビニルエーテルコポリマー、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸ナトリウムおよびポリアクリル酸カルシウム、ポリアクリル酸、酸性カルボキシポリマー、カルボキシポリメチレン、カルボキシビニルポリマー、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンコポリマー、ポリメチルビニルエーテルコ無水マレイン酸、カルボキシメチルアミド、カリウムメタクリレートジビニルベンゼンコポリマー、ポリオキシエチレングリコール、ポリエチレングリコールならびに、これらの誘導体、塩および組み合わせがあげられる。
一実施形態では、ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などをはじめとするポリアルキレングリコールである。いくつかの実施形態では、異種部分は炭水化物である。いくつかの実施形態では、炭水化物は、単糖（グルコース、ガラクトース、フルクトースなど）、二糖（スクロース、ラクトース、マルトースなど）、オリゴ糖（ラフィノース、スタキオースなど）、多糖（スターチ、アミラーゼ、アミロペクチン、セルロース、キチン、カロース、ラミナリン、キシラン、マンナン、フコイダン、ガラクトマンナンである。
いくつかの実施形態では、異種部分は脂質である。いくつかの実施形態における脂質は、脂肪酸、エイコサノイド、プロスタグランジン、ロイコトリエン、トロンボキサン、Ｎ−アシルエタノールアミン）、グリセロ脂質（一置換グリセロール、二置換グリセロール、三置換グリセロールなど）、グリセロリン脂質（ホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリンなど）、スフィンゴ脂質（スフィンゴシン、セラミドなど）、ステロール脂質（ステロイド、コレステロールなど）、フェノール脂質、糖脂質またはポリケタイド、オイル、ワックス、コレステロール、ステロール、脂溶性ビタミン、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、リン脂質である。
＜Ｆｃ融合異種部分＞
上述したように、いくつかの実施形態では、単鎖インスリン類縁体は、免疫グロブリンまたはその一部（たとえば、可変領域、ＣＤＲまたはＦｃ領域など）に結合する（融合するなど）。周知のタイプの免疫グロブリン（Ｉｇ）には、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤまたはＩｇＭがある。Ｆｃ領域は、Ｉｇ重鎖のＣ末端領域であって、再利用（半減期の延長になる）、抗体依存性細胞介在性細胞障害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）などの作用を行うＦｃ受容体に結合する役割を担う。
たとえば、いくつかの定義によれば、ヒトＩｇＧの重鎖Ｆｃ領域は、重鎖の２２６番目のシステインからＣ末端までの範囲である。「ヒンジ領域」は通常、ヒトＩｇＧ１の２１６番目のグルタミン酸から２３０番目のプロリンまでの範囲である（他のＩｇＧイソタイプのヒンジ領域については、システイン結合に関与するシステインをアラインすることで、ＩｇＧ１配列とアラインすることができる）。ＩｇＧのＦｃ領域は、２つの定常ドメインであるＣＨ２とＣＨ３を有する。ヒトＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインは通常、２３１番目のアミノ酸から３４１番目のアミノ酸までの範囲である。ヒトＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ３ドメインは通常、３４２番目から４４７番目のアミノ酸の範囲である。免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片または領域のアミノ酸番号の表記はいずれも、Kabat et al. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Public Health, Bethesda, Mdに基づいている。関連の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＣＨ１以外に、免疫グロブリン重鎖の１つまたは２つ以上の天然の定常領域または修飾された定常領域（ＩｇＧおよびＩｇＡのＣＨ２領域およびＣＨ３領域あるいは、ＩｇＥのＣＨ３領域およびＣＨ４領域）を有するものであってもよい。
好適な結合体部分は、ＦｃＲｎ結合部位を含む免疫グロブリン配列の一部を有する。サルベージ受容体であるＦｃＲｎは、免疫グロブリンを再利用し、これを血液循環に戻す役割を担う。ＦｃＲｎ受容体に結合するＩｇＧのＦｃ部分の領域は、Ｘ線結晶解析に基づいて説明されている（Burmeister et al. 1994, Nature 372:379）。ＦｃとＦｃＲｎとの主な接触領域は、ＣＨ２とメインとＣＨ３ドメインの接合部付近である。ＦｃとＦｃＲｎとの接点はいずれも、単一のＩｇ重鎖の範囲内にある。主要な接触部位は、ＣＨ２ドメインの２４８番目、２５０番目から２５７番目、２７２番目、２８５番目、２８８番目、２９０番目から２９１番目、３０８番目から３１１番目、３１４番目のアミノ酸残基およびＣＨ３ドメインの３８５番目から３８７番目、４２８番目、４３３番目から４３６番目のアミノ酸残基を含む。
いくつかの結合体部分は、ＦｃγＲ結合部位（単数または複数）を有するものであってもよいし、そうでなくてもよい。ＦｃγＲは、ＡＤＣＣおよびＣＤＣを担う。ＦｃγＲと直接接するＦｃ領域内の位置の例は、２３４番目〜２３９番目のアミノ酸（ヒンジ領域内の下側）、２６５番目〜２６９番目のアミノ酸（Ｂ／Ｃループ）、２９７番目〜２９９番目のアミノ酸（Ｃ’／Ｅループ）、３２７番目〜３３２番目のアミノ酸（Ｆ／Ｇ）ループである（Sondermann et al., Nature 406: 267-273, 2000）。ＩｇＥのヒンジ領域内の下側は、ＦｃＲＩ結合にも関与している（Henry, et al., Biochemistry 36, 15568-15578, 1997）。ＩｇＡ受容体結合に関与する残基が、Lewis et al., (J Immunol. 175:6694-701, 2005)に記載されている。ＩｇＥ受容体結合に関与するアミノ酸残基は、Sayers et al. (J Biol Chem. 279(34):35320-5, 2004)に記載されている。
アミノ酸修飾を、免疫グロブリンのＦｃ領域に対して実施してもよい。このような変異したＦｃ領域は、Ｆｃ領域のＣＨ３ドメイン（３４２番目〜４４７番目の残基）での少なくとも１つのアミノ酸修飾および／またはＦｃ領域のＣＨ２ドメイン（２３１番目〜３４１番目の残基）での少なくとも１つのアミノ酸修飾を有する。ＦｃＲｎに対する親和性を高めると考えられている変異として、Ｔ２５６Ａ、Ｔ３０７Ａ、Ｅ３８０Ａ、Ｎ４３４Ａがあげられる（Shields et al. 2001, J. Biol. Chem. 276:6591）。他の変異が、ＦｃＲｎに対する親和性を有意に低下させることなく、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢおよび／またはＦｃγＲＩＩＩＡへのＦｃ領域の結合を低下させる場合がある。たとえば、Ｆｃ領域の２９７番目のＡｓｎをＡｌａまたは他のアミノ酸で置換すると、高度に保存されたＮ−グリコシル化部位がなくなり、Ｆｃ領域の半減期の延長を伴う免疫原性が低下して、ＦｃγＲに対する結合が低下する場合がある（Routledge et al. 1995, Transplantation 60:847;Friend et al. 1999, Transplantation 68:1632;Shields et al. 1995, J. Biol. Chem. 276:6591）。ＦｃγＲへの結合を低下させるＩｇＧ１の２３３番目〜２３６番目のアミノ酸修飾がなされている（Ward and Ghetie 1995, Therapeutic Immunology 2:77およびArmour et al. 1999, Eur. J. Immunol. 29:2613）。いくつかのアミノ酸置換例が、米国特許第７，３５５，００８号および同第７，３８１，４０８号（各々の全体を本明細書に援用する）に記載されている。
＜親水性の異種部分＞
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の単鎖インスリン類縁体は、親水体に共有結合している。親水体は、タンパク質を活性化ポリマー分子と反応させるのに用いられる任意の好適な条件下で、単鎖インスリン類縁体に結合可能である。標的化合物（たとえば、アルデヒド基、アミノ基、エステル基、チオール基、α−ハロアセチル基、マレイミド基またはヒドラジノ基など）の反応性基に、親水体（たとえば、アルデヒド基、アミノ基、エステル基、チオール基、α−ハロアセチル基、マレイミド基またはヒドラジノ基など）の反応性基を介して結合させる、アシル化、還元的アルキル化、マイケル付加、チオールアルキル化または他の化学選択的結合／ライゲーション方法をはじめとして、当分野で知られたどのような手段を用いてもよい。水溶性ポリマーを１つまたは２つ以上のタンパク質に結合するのに使用可能な活性化基として、限定することなく、スルホン、マレイミド、スルフヒドリル、チオール、トリフレート、トレシレート、アジリジン、オキシラン、５−ピリジル、α−ハロゲン化アシル基（たとえば、α−ヨード酢酸、α−ブロモ酢酸、α−クロロ酢酸など）があげられる。還元的アルキル化によってペプチドに結合する場合、重合度を制御できるように、選択するポリマーは、単一の反応性アルデヒドを有するものでなければならない。たとえば、Kinstler et al., Adv. Drug. Delivery Rev. 54: 477-485 (2002)；Roberts et al., Adv. Drug Delivery Rev. 54: 459-476 (2002)；Zalipsky et al., Adv. Drug Delivery Rev. 16: 157-182 (1995)を参照のこと。
いくつかの実施形態によるポリエチレングリコール鎖などの親水体は、分子量が、約５００〜約４０，０００ダルトンの範囲から選択される。いくつかの実施形態では、ポリエチレングリコール鎖は、分子量が、約５００〜約５，０００ダルトンまたは約１，０００〜約５，０００ダルトンの範囲から選択される。もうひとつの実施形態では、ポリエチレングリコール鎖などの親水体は、分子量が、約１０，０００〜約２０，０００ダルトンである。さらに他の例示としての実施形態では、ポリエチレングリコール鎖などの親水体は、分子量が約２０，０００〜約４０，０００ダルトンである。直鎖状または分岐状の親水性ポリマーが考えられている。得られる結合体の調製物は、基本的に単分散であっても多分散であってもよく、ペプチド１つあたり約０．５個、０．７個、１個、１．２個、１．５個または２個のポリマー部分を有するものであってもよい。
いくつかの実施形態では、ペプチドの天然のアミノ酸を、親水体との架橋に適した側鎖を有するアミノ酸で置換し、ペプチドに対する親水体の結合を容易にする。アミノ酸の例として、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステインまたはアセチルフェニルアラニン（Ａｃ−Ｐｈｅ）があげられる。他の実施形態では、親水基を含むように修飾されたアミノ酸を、Ｎ末端またはＣ末端でペプチドに付加する。いくつかの実施形態では、結合体のペプチドを、ペプチドのアミノ酸の側鎖と親水体との間の共有結合によって、ＰＥＧなどの親水体に結合する。
＜ｒＰＥＧの異種部分＞
いくつかの実施形態では、結合体は、国際特許出願公開公報ＷＯ２００９／０２３２７０および米国特許出願公開公報ＵＳ２００８／０２８６８０８に記載されているような、化学的ＰＥＧ（たとえば、組換えＰＥＧ（ｒＰＥＧ）分子など）に類似の伸長した構造を形成できる補助ペプチドに融合した単鎖インスリン類縁体を有する。ｒＰＥＧ分子は、ポリエチレングリコールではない。いくつかの態様におけるｒＰＥＧ分子は、グリシン、セリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、アラニンまたはプロリンのうちの１つまたは２つ以上を有するポリペプチドである。いくつかの態様では、ｒＰＥＧは、ポリグリシン、ポリセリン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、ポリアラニンまたはポリプロリンなどのホモポリマーである。他の実施形態では、ｒＰＥＧは、ｐｏｌｙ（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）、ｐｏｌｙ（Ｇｌｙ−Ｇｌｕ）、ｐｏｌｙ（Ｇｌｙ−Ａｌａ）、ｐｏｌｙ（Ｇｌｙ−Ａｓｐ）、ｐｏｌｙ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）、ｐｏｌｙ（Ｓｅｒ−Ｇｌｕ）など、２つのアミノ酸の繰り返し構造を含む。いくつかの態様では、ｒＰＥＧは、ｐｏｌｙ（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ）など、３つの異なるアミノ酸を含む。具体的な態様では、ｒＰＥＧは、単鎖インスリン類縁体の半減期を長くする。いくつかの態様では、ｒＰＥＧは、全体として正の電荷または全体として負の電荷を有する。いくつかの態様におけるｒＰＥＧには、二次構造が欠けている。いくつかの実施形態では、ｒＰＥＧは、アミノ酸１０個以上の長さであり、いくつかの実施形態では、アミノ酸約４０〜約５０個の長さである。いくつかの態様における補助ペプチドは、ペプチド結合またはプロテイナーゼ切断部位を介して本発明のペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合される。いくつかの態様におけるｒＰＥＧは、親和性タグを有するか、５ｋＤａよりも大きいＰＥＧに結合する。いくつかの実施形態では、ｒＰＥＧは、本発明の結合体の流体力学半径を大きくし、血清半減期を延ばし、プロテアーゼ耐性を高めるまたは溶解性を高め、いくつかの態様では、結合体の免疫原性を低下させる。
ペプチドの標的にされるアミノ酸残基と、これらの標的にされるアミノ酸の選択された側鎖あるいは、Ｎ末端またはＣ末端の残基と反応できる有機誘導体化剤とを反応させることで、結合体部分を直接的な共有結合によって単鎖インスリン類縁体に結合することが可能である。結合体部分またはペプチドの反応性基として、たとえば、アルデヒド基、アミノ基、エステ基ル、チオール基、α−ハロアセチル基、マレイミド基またはヒドラジノ基があげられる。誘導体化剤として、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介した結合）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を介して）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸または当分野で知られた他の薬剤があげられる。あるいは、多糖キャリアまたはポリペプチドキャリアなどの中間キャリアを使用して、結合体部分をペプチドに間接的に結合することも可能である。多糖キャリアの例として、アミノデキストランがあげられる。好適なポリペプチドキャリアの例として、結合させたキャリアに望ましい溶解特性を与えるための、ポリリジン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、これらのコポリマーならびに、これらのアミノ酸と他のアミノ酸、たとえばセリンの混合ポリマーがあげられる。
＜マルチマー＞
単鎖インスリン類縁体は、リンカーを介して結合した少なくとも２つ、３つまたは４つ以上のペプチドを含むダイマー、トリマーまたはさらに高次のマルチマーの一部であってもよく、ここで、少なくとも一方または両方のペプチドが、単鎖インスリン類縁体である。一実施形態では、単鎖インスリン類縁体は、Ａ鎖とＢ鎖とを有するヘテロ二本鎖または第２の単鎖インスリン類縁体のいずれかである第２のインスリンポリペプチドのＡ鎖またはＢ鎖のいずれかに結合する。ダイマーは、ホモダイマーであってもヘテロダイマーであってもよい。いくつかの実施形態では、リンカーは、二官能性チオールクロスリンカーおよび二官能性アミンクロスリンカーからなる群から選択される。特定の実施形態では、リンカーは、ＰＥＧ、たとえば、５ｋＤａのＰＥＧ、２０ｋＤａのＰＥＧである。いくつかの実施形態では、リンカーは、ジスルフィド結合である。たとえば、ダイマーの各モノマーは、Ｃｙｓ残基（たとえば、末端または末端以外のＣｙｓなど）を含むものであってもよく、各Ｃｙｓ残基の硫黄原子は、ジスルフィド結合の形成に関与する。本発明のいくつかの態様では、末端のアミノ酸（たとえば、Ｎ末端またはＣ末端など）、末端以外のアミノ酸あるいは、少なくとも１個のモノマーの末端のアミノ酸と少なくとも１個の他のモノマーの末端以外のアミノ酸とを介して、モノマー同士が結合する。具体的な態様では、モノマーは、Ｎ末端のアミノ酸を介して結合する。いくつかの態様では、マルチマーのモノマーは、各モノマーのＣ末端のアミノ酸が互いに結合する、「尾と尾」の向きで互いに結合している。一実施形態では、ダイマーは、２つの単鎖インスリン類縁体を含む。この場合、２つのインスリン類縁体は、各単鎖インスリン類縁体の橋渡し部分に存在するアミノ酸のアミノ酸側鎖を介して互いに結合する。結合体部分は、ダイマー、トリマーまたはさらに高次のマルチマーをはじめとして、本明細書に記載のどの単鎖インスリン類縁体と共有結合していてもよい。
一実施形態によれば、本明細書に開示のＩＧＦ ＹＬのＢ鎖類縁体（そのプロドラッグおよびデポー誘導体を含む）を有するマルチマーが提供される。マルチマー（たとえば、ダイマーなど）は、天然のインスリン、天然のＩＧＦ−１、天然のＩＧＦ−ＩＩ、インスリン類縁体ペプチド、ＩＧＦ類縁体ペプチドからなる群から選択されるペプチドを含む、ホモダイマーであってもヘテロダイマーであってもよい。いくつかの実施形態では、リンカーは、二官能性チオールクロスリンカーおよび二官能性アミンクロスリンカーからなる群から選択される。特定の実施形態では、リンカーは、ＰＥＧ、たとえば、５ｋＤａのＰＥＧ、２０ｋＤａのＰＥＧである。いくつかの実施形態では、リンカーは、ジスルフィド結合である。
＜制御放出調製物＞
あるいは、本開示の結合体を、これを投与する対象となる体内に放出する方法が、時間と体内での位置の点で制御されるように、本明細書に記載の単鎖インスリン類縁体をデポーの形態に修飾してもよい（たとえば、米国特許第４，４５０，１５０号を参照のこと）。本開示の結合体のデポー形態は、たとえば、本開示の結合体と多孔性または非多孔性材料（ポリマーなど）を含む移植可能な組成物であってもよく、この場合、本開示の結合体を当該材料によってカプセル化するか、当該材料全体に拡散させるおよび／または非多孔性材料を分解する。このようにした上で、デポーが体内の所望の位置に植込まれ、そのインプラントから、あらかじめ定められた速度で、本開示の結合体が放出されることになる。
あるいは、大きなデポーポリマーを、本明細書で説明するような単鎖インスリン類縁体に共有結合した自己切断するジペプチド要素に結合してもよい。この実施形態では、デポーポリマーは、これが酵素によらない反応によってあらかじめ定められた速度で単鎖類縁体から切断されるまで、単鎖インスリン類縁体を投与部位に効果的につなぎとめる。自己切断ジペプチドを用いたインスリン類縁体のデポー調製物については、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６８７１３に記載されており、その開示内容を本明細書に援用する。一実施形態では、ジペプチドプロドラッグ要素がＰＥＧまたはデキストランなどの大きなポリマーに結合したジペプチドプロドラッグ要素を有する、単鎖インスリン類縁体が提供される。一実施形態では、大きなデポーポリマー（たとえば、ＰＥＧなど）を有する自己切断するジペプチド要素は、橋渡し部分のアミノ酸の側鎖（たとえば、橋渡し部分のＣ８の位置のアミノ酸など）に結合する。
単鎖類縁体を含む薬学的組成物を調製可能であり、これを所望のin vivo放出プロファイルを持つように修飾する。いくつかの態様では、薬学的組成物は、即時放出調製物、制御放出調製物、持続性放出調製物、長時間放出調製物、遅延放出調製物または二相性放出調製物である。制御放出用のペプチドまたは結合体を調製するための方法は、当分野で知られている。たとえば、J Pharm 374: 46-52 (2009)および国際特許出願公開公報ＷＯ２００８／１３０１５８、ＷＯ２００４／０３３０３６；ＷＯ２０００／０３２２１８；ＷＯ１９９９／０４０９４２を参照のこと。
本組成物は、たとえば、ミセルまたはリポソームあるいは、他の何らかのカプセル化形態をさらに含むものであってもよいし、あるいは、保存および／または送達効果を持続するために、長時間放出形態で投与してもよい。ここに開示の薬学的調製物は、たとえば、毎日（１日１回、１日２回、１日３回、１日４回、１日５回、１日６回）、２日に１回、３日に１回、４日に１回、５日に１回、６日に１回、毎週、２週間に１回、３週間に１回、毎月または２か月に１回など、どのような治療計画で投与してもよい。
＜単鎖インスリン類縁体のプロドラッグ誘導体＞
本開示は、本明細書に開示の単鎖インスリン類縁体ペプチドのプロドラッグ類縁体も包含する。好都合なことに、このプロドラッグ調製物は、もとになるペプチドの治療指数を改善し、作用開始を遅らせ、単鎖インスリン類縁体ペプチドの半減期を長くする。開示されたプロドラッグ化合物は、ジケトピペラジンが形成され、プロドラッグ要素が放出されると親のアミンに戻るアミドを形成するよう活性部位のアミンに化学的に結合可能である（開示内容を本明細書に援用する、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６８７１３を参照のこと）。この新規な生物学的に好ましいプロドラッグ化合物は、生理的条件下（たとえばｐＨ約７、３７℃の水性環境中）で自律的に分解し、酵素による分解に左右されない。プロドラッグ類縁体の期間は、ジペプチドプロドラッグ配列の選択によって決まるので、プロドラッグ調製物に柔軟性が得られる。
一実施形態では、生理的条件下で、酵素によらない活性化の半減期（ｔ１／２）が１〜１００時間であるプロドラッグが提供される。本明細書で開示するような生理的条件は、温度約３５〜約４０℃と、ｐＨ約７．０〜約７．４を含むことを意図し、より一般的には、ｐＨ７．２〜７．４、温度３６〜３８℃を含むことを意図している。一実施形態では、生理的条件下でジケトピペラジン形成が生じるジペプチドは、アミド結合またはエステル結合を介して単鎖インスリン類縁体に共有結合している（開示内容を本明細書に援用する国際特許出願公開公報ＷＯ ２００９／０９９７６３およびＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６８７１３を参照のこと）。
好都合なことに、切断速度と、ゆえにプロドラッグの活性化は、ジペプチド前駆部分の構造および立体異性に左右され、求核物質の強さにも左右される。本明細書に開示のプロドラッグは、最終的には、インスリン／ＩＧＦ受容体によって認識可能な構造に化学的に変換されることになるが、この化学変換の速度次第で、in vivoでの生物学的作用の開始タイミングと期間が決まる。本出願に開示したプロドラッグ化合物は、付加的な化学物質すなわち酵素に左右されない、分子内での化学反応を利用している。変換速度は、生理的条件下でのジペプチド置換基の化学的な性質と切断とに制御される。生理的なｐＨおよび温度は、非常に限定された範囲内で厳密に調節されるため、プロドラッグからから薬剤への変換速度は、一人の患者においても、患者間においても、高い再現性を示す。一実施形態では、単鎖インスリン類縁体が８〜１７個のアミノ酸からなる橋渡し部分を有し、橋渡し部分のアミノ酸のうちの１つがＰＥＧ化されている、単鎖類縁体のプロドラッグ誘導体が提供される。橋渡し部分のアミノ酸のＰＥＧ化に代えてまたはこれに加えて、ジペプチドプロドラッグ要素の２つのアミノ酸のうちの一方をＰＥＧ化してもよい。上述したＰＥＧ部位に代えてまたはこれに加えて、単鎖インスリンプロドラッグ誘導体を、Ａ鎖のＡ９、Ａ１４、Ａ１５からなる群から選択される位置またはＢ鎖のＢ１（インスリン系Ｂ鎖の場合）、Ｂ２（ＩＧＦ−１系Ｂ鎖の場合）、Ｂ１０、Ｂ２２、Ｂ２８またはＢ２９の位置でＰＥＧ化してもよい。一実施形態では、インスリンプロドラッグは、Ｂ鎖のＮ末端のαアミン（たとえば、インスリン系Ｂ鎖であればＢ１の位置またはＩＧＦ−１系Ｂ鎖であればＢ２の位置）でＰＥＧ化される。
本明細書で開示するように、単鎖インスリン類縁体ペプチドの半減期が少なくとも１時間、より一般的には２０時間を超えるが１００時間未満であり、酵素によらない、化学的な不安定さによって押し進められた反応によって、生理的条件で活性のある形態に変換されるプロドラッグが提供される。一実施形態では、リン酸バッファー（ＰＢＳなど）にて３７℃、ｐＨ７．２でプロドラッグをインキュベートすることで判断できる、プロドラッグの酵素によらない活性化ｔ１／２時間は１〜１００時間であり、より一般的には、１２〜７２時間であって、一実施形態では、ｔ１／２は２４〜４８時間である。一実施形態では、プロドラッグの半減期は、約１時間、約８時間、約１２時間、約２０時間、約２４時間、約４８時間または約７２時間である。一実施形態では、プロドラッグの半減期は、約１００時間またはそれよりも長く、最大約１６８時間、約３３６時間、約５０４時間、約６７２時間または約７２０時間の半減期を含む。このプロドラッグは、酵素によらない、化学的な不安定さによって押し進められた反応によって、生理的条件で活性のある形態に変換される。さまざまなプロドラッグの半減期が、式ｔ１／２＝０．６９３／ｋを用いて算出される（式中、「ｋ」は、プロドラッグの分解の一次速度定数である）。一実施形態では、プロドラッグの活性化は、アミド結合で結合したジペプチドの切断、ジケトピペラジンまたはジケトモルホリンの形成、活性のある単鎖インスリン類縁体ペプチドの後に生じる。
もうひとつの実施形態では、ジペプチドプロドラッグ要素は、アミド結合を介して単鎖インスリン類縁体ペプチドに共有結合し、このジペプチドが、当該ジペプチドに結合したデポーポリマーをさらに含む。一実施形態では、２つまたは３つ以上のデポーポリマーが、単一のジペプチド要素に結合している。一実施形態では、デポーポリマーは、ジペプチドプロドラッグ要素を有するアミノ酸のうちの１つの側鎖に結合している。デポーポリマーは、生体適合性かつ、ジペプチドの共有結合によって修飾される単鎖インスリン類縁体が、患者への投与時に注射部位でつなぎとめられるおよび／またはその対応する受容体と相互作用できないだけの十分な大きさを持つように選択される。その後、ジペプチドが切断されると、意図した標的と相互作用させるための単鎖インスリン類縁体が放出される。デポーを有するジペプチド要素は、単鎖インスリン類縁体のＮ末端のアミンまたは末端以外の天然または合成アミノ酸のアミンのある側鎖をはじめとする単鎖インスリン類縁体の都合のよいアミン基でのアミド結合を介して単鎖インスリン類縁体に結合可能である。一実施形態では、デポーを有するジペプチド要素は、単鎖類縁体のＡ１９の位置に存在する４−アミノフェニルアラニンのアミノ基に結合する。
一実施形態によれば、デポーポリマーは、当業者に知られた生体適合性ポリマーから選択される。デポーポリマーは一般に、大きさが約２０，０００〜１２０，０００ダルトンの範囲である。一実施形態では、デポーポリマーは、大きさが約４０，０００〜約１００，０００から選択される範囲または約４０，０００〜約８０，０００ダルトンから選択される範囲である。一実施形態では、デポーポリマーは、大きさが、約４０，０００、約５０，０００、約６０，０００、約７０，０００または約８０，０００ダルトンである。好適なデポーポリマーとして、デキストラン、ポリラクチド、ポリグリコライド、カプロラクト系ポリマー、ポリ（カプロラクトン）、ポリ酸無水物、ポリアミン、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリジオキサノン、ポリアセタール、ポリケタール、ポリカーボネート、ポリホスホエステル、ポリエステル、ポリブチレンテレフタレート、ポリオルトカーボネート、ポリホスファゼン、コハク酸塩、ポリ（リンゴ酸）、ポリ（アミノ酸）、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、ポリヒドロキシセルロース、多糖、キチン、キトサン、ヒアルロン酸、コポリマー、ターポリマー、これらの混合物ならびに、生分解性ポリマーおよびそのコポリマー（カプロラクトン系ポリマー、ポリカプロラクトンならびに、ポリブチレンテレフタレートを含むコポリマーなど）があげられるが、これらに限定されるものではない。一実施形態では、デポーポリマーは、ポリエチレングリコール、デキストラン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸とグリコール酸のコポリマーからなる群から選択され、具体的な一実施形態では、デポーポリマーは、ポリエチレングリコールである。一実施形態では、デポーポリマーは、ポリエチレングリコールであり、ジペプチド要素に結合したデポーポリマー（単数または複数）の合計分子量は、約４０，０００〜約８０，０００ダルトンである。
活性のある単鎖インスリン類縁体を放出するための生理的条件下での分子内での分解を容易にする、天然のアミノ酸または合成のアミノ酸からなる特定のジペプチドが、同定されている。ジペプチドは、（アミド結合）を介して単鎖インスリン類縁体に存在するアミノ基あるいは、ペプチド配列の修飾によって単鎖インスリン類縁体に導入されたアミノ基に結合可能である。一実施形態では、ジペプチド構造は、たとえば、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）など、哺乳動物の血清中に存在するペプチダーゼによる切断に耐えるように選択される。したがって、一実施形態では、生理的条件を用いて血清プロテアーゼの存在下で反応を実施すると、プロテアーゼが存在しない反応の場合と比較して、生体活性ペプチドからのジペプチドプロドラッグ要素の切断速度は実質的に（たとえば２倍より大きく）高められない。このように、（ＰＢＳ中にて生理的条件下で）単鎖インスリン類縁体からジペプチドプロドラッグ要素が切断される半減期は、ＤＰＰ−ＩＶプロテアーゼを含む溶液中で単鎖インスリン類縁体からジペプチドプロドラッグ要素が切断される半減期の２倍、３倍、４倍または５倍以下である。一実施形態では、ＤＰＰ−ＩＶプロテアーゼを含む溶液は、血清、特に哺乳動物の血清（ヒト血清を含む）である。
一実施形態によれば、ジペプチドプロドラッグ要素は構造Ｕ−Ｂを有し、ここで、Ｕは、アミノ酸またはヒドロキシ酸であり、Ｂは、Ｎアルキル化アミノ酸である。一実施形態では、ＰＢＳ中にて生理的条件下で単鎖インスリン類縁体からのＵ−Ｂの化学反応による切断が、約１時間から約７２０時間以内に少なくとも約９０％完了する、Ｕ−Ｂの構造が選択される。一実施形態では、単鎖インスリン類縁体ペプチドからのＵ−Ｂの化学反応による切断の半減期（ｔ１／２）は、ＰＢＳ中にて生理的条件下で少なくとも約１時間から約１週間である。一実施形態では、Ｕ、Ｂあるいは、Ｕ−Ｂが結合している単鎖インスリン類縁体のアミノ酸は、コードされていないアミノ酸である。いくつかの実施形態では、Ｕおよび／またはＢは、Ｄ型立体異性体の立体配置をとるアミノ酸である。いくつかの例示としての実施形態では、Ｕは、Ｄ型立体異性体の立体配置をとるアミノ酸であり、Ｂは、Ｌ型立体異性体の立体配置をとるアミノ酸である。いくつかの例示としての実施形態では、Ｕは、Ｌ型立体異性体の立体配置をとるアミノ酸であり、Ｂは、Ｄ型立体異性体の立体配置をとるアミノ酸である。いくつかの例示としての実施形態では、Ｕは、Ｄ型立体異性体の立体配置をとるアミノ酸であり、Ｂは、Ｄ型立体異性体の立体配置をとるアミノ酸である。一実施形態では、ＢはＮアルキル化アミノ酸であるが、プロリンではない。一実施形態では、アミノ酸ＢのＮ−アルキル化された基は、Ｃ１〜Ｃ１８アルキルであり、一実施形態では、Ｎ−アルキル化された基は、Ｃ１〜Ｃ６アルキルである。一実施形態では、Ｕはα炭素で二置換されたアミノ酸である。
一実施形態では、１つまたは２つ以上のジペプチド要素が、単鎖インスリン類縁体に存在するアミノ酸の側鎖のアミノ基またはＢ鎖のＮ末端のアミノ基から選択される１つまたは２つ以上のアミノ基を介して形成されるアミド結合によって単鎖インスリン類縁体に結合する。一実施形態では、単鎖インスリン類縁体は２つのジペプチド要素を有し、このジペプチド要素は、任意に、ＰＥＧ化、アルキル化、アシル化されたデポーポリマーであってもよいし、デポーポリマーに結合していてもよい。一実施形態によれば、ジペプチド伸長部は、活性部位またはその付近にあるリジン残基の側鎖のアミンを介して単鎖インスリン類縁体に共有結合する。一実施形態では、ジペプチド伸長部は、合成アミノ酸または修飾されたアミノ酸を介して結合し、ここで、合成アミノ酸または修飾されたアミノ酸は、ジペプチド伸長部の共有結合に適した官能基を呈する（たとえば、アミノフェニルアラニンの芳香族アミンなど）。一実施形態によれば、１つまたは２つ以上のジペプチド要素が、Ｂ鎖のＮ末端のアミノ基あるいは、天然のインスリンのＡ１９、Ｂ１６またはＢ２５に対応する位置に存在する４−アミノフェニルアラニン残基の芳香族アミンの側鎖のアミノ基 から選択されるアミノ基の単鎖インスリン類縁体に結合する。
ジペプチドプロドラッグ要素は、生理的条件下かつ酵素による活性のない状態で、アミド結合をインスリン類縁体に自律的に切断するように設計される。一実施形態では、ジペプチドプロドラッグ要素のＮ末端のアミノ酸は、Ｃアルキル化されたアミノ酸（たとえば、アミノイソブチル酸）を有する。一実施形態では、ジペプチドプロドラッグ要素のＣ末端のアミノ酸は、Ｎアルキル化アミノ酸を有する（たとえば、プロリンまたはＮ−メチルグリシン）。一実施形態では、ジペプチドは、Ｎ末端のＣアルキル化されたアミノ酸の配列を有し、これにＮアルキル化アミノ酸が続く。
本出願人らは、インスリンペプチドの活性を損なうことなく、４−アミノフェニルアラニンアミノ酸部分をＡ鎖の１９番目の天然のチロシンに選択的に挿入可能である（図３参照）ことを発見した。本明細書に開示のジペプチドプロドラッグ要素を有する活性部位のアミノ基を、後に化学的にアミド化すると、インスリン受容体の結合活性が劇的に低下し、よってインスリンの好適なプロドラッグが提供される（図７〜図１２を参照のこと。データには、インスリン（ｐ−ＮＨ２−Ｆ）Ａ１９に匹敵する活性を持つことが証明されたＩＧＦ１Ｙ１６Ｌ１７（ｐ−ＮＨ２−Ｆ）Ａ１９類縁体を示す。図４参照）。本出願人らは、ＩＧＦＢ１６Ｂ１７類縁体ペプチドに対しても、プロドラッグ化合物の好適な結合部位を提供するために同じように修飾できることを発見した。したがって、一実施形態では、ジペプチドプロドラッグ要素は、アミド結合を介して、インスリン（ｐ−ＮＨ２−Ｆ）Ａ１９またはＩＧＦＢ１６Ｂ１７単鎖インスリン類縁体ペプチドのＡ１９ ４−アミノフェニルアラニンの芳香環に結合する。この場合、ジペプチドのＣ末端のアミノ酸は、Ｎアルキル化アミノ酸を有し、ジペプチドのＮ末端のアミノ酸は任意のアミノ酸である。
また、ジペプチドプロドラッグ部分を、インスリン（ｐ−ＮＨ２−Ｆ）Ａ１９またはＩＧＦＢ１６Ｂ１７単鎖インスリン類縁体ペプチドの別の部位に結合して、インスリン（ｐ−ＮＨ２−Ｆ）Ａ１９またはＩＧＦＢ１６Ｂ１７単鎖インスリン類縁体プロドラッグ誘導体を調製してもよい。一実施形態によれば、アミド結合を介して、Ｂ鎖のＮ末端のアミノ基あるいは、天然のインスリンのＡ１９、Ｂ１６またはＢ２５に対応する位置または橋渡し部分に存在する４−アミノ−フェニルアラニン残基の芳香族アミンの側鎖のアミノ基に、ジペプチドプロドラッグ要素が結合したＩＧＦＢ１６Ｂ１７Ｂ鎖を有するＩＧＦＢ１６Ｂ１７単鎖インスリン類縁体プロドラッグ誘導体が提供される。ＩＧＦＢ１６Ｂ１７単鎖インスリン類縁体プロドラッグ誘導体は、本明細書に開示の天然のインスリンのＡ鎖または天然のＩＧＦ−１ Ａ鎖またはそれらの類縁体を有するものであってもよい。一実施形態では、ジペプチドは、Ｎ末端のＣアルキル化されたアミノ酸を有し、これにＮアルキル化アミノ酸が続いている。一実施形態によれば、類縁体を有するＡ鎖およびＢ鎖が、それぞれ配列番号１および配列番号２の配列を有するか、配列番号１および／または配列番号２の類縁体を有するものであってもよい単鎖インスリン類縁体プロドラッグ誘導体が提供され、ここで、類縁体は、Ａ１９、Ｂ１６またはＢ２５の位置での４−アミノフェニルアラニンへのアミノ酸の置換および／または天然のインスリンのＡ５、Ａ８、Ａ９、Ａ１０、Ａ１４、Ａ１５、Ａ１７、Ａ１８、Ａ１９およびＡ２１、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ９、Ｂ１０、Ｂ１３、Ｂ１４、Ｂ２０、Ｂ２２、Ｂ２３、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９およびＢ３０に対応する位置での１つまたは２つ以上のアミノ酸置換または天然のインスリンのＢ１〜４およびＢ２６〜３０に対応する位置のいずれかまたはすべてにおける欠失を含む。一実施形態では、ジペプチドは、単鎖インスリン類縁体のＢ鎖のＮ末端のアミノ基に結合し、ジペプチドのＣ末端のアミノ酸は、Ｎアルキル化アミノ酸を有し、ジペプチドのＮ末端のアミノ酸はアミノ酸であるが、ただし、ジペプチドのＣ末端のアミノ酸がプロリンである場合、ジペプチドのＮ末端のアミノ酸はＣアルキル化されたアミノ酸を有する。
一実施形態では、ジペプチドプロドラッグ要素は、式Ｘの一般構造を有する。
Figure 0005969469
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ８は独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、Ｃ２〜Ｃ１８アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ１８アルキル）ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ１８アルキル）ＳＨ、（Ｃ２〜Ｃ３アルキル）ＳＣＨ３、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨＣ（ＮＨ２ ＋）ＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ２〜Ｃ５複素環）、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ９ヘテロアリール）、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル（Ｗ）Ｃ１〜Ｃ１２アルキルからなる群から選択され、Ｗは、Ｎ、Ｓ、Ｏからなる群から選択されるヘテロ原子であるか、あるいは、Ｒ１およびＲ２は、これらが結合している原子と一緒になって、Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキルまたはアリールを形成するか、あるいは、Ｒ４およびＲ８は、これらが結合している原子と一緒になって、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキルを形成し、
Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、（Ｃ１〜Ｃ１８アルキル）ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ１８アルキル）ＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ１８アルキル）ＳＨ、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ２〜Ｃ５複素環）、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群から選択されるか、あるいは、Ｒ４およびＲ３は、これらが結合している原子と一緒になって、４員環、５員環または６員環の複素環を形成し、
Ｒ５は、ＮＨＲ６またはＯＨであり、
Ｒ６は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ８アルキルであるか、あるいは、Ｒ６およびＲ２は、これらが結合している原子と一緒になって、４員環、５員環または６員環の複素環を形成し、
Ｒ７は、ＨおよびＯＨからなる群から選択される。一実施形態では、プロドラッグ要素が単鎖インスリン類縁体のＮ末端のアミンに結合し、Ｒ４およびＲ３が、これらが結合している原子と一緒になって、４員環、５員環または６員環の複素環を形成する場合、Ｒ１およびＲ２のうちの少なくとも一方がＨ以外である。
一実施形態では、式Ｘのプロドラッグ要素が提供される。
式中、
Ｒ１は、ＨおよびＣ１〜Ｃ８アルキルからなる群から選択され、
Ｒ２、Ｒ８、Ｒ４は独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＳＨ、（Ｃ２〜Ｃ３アルキル）ＳＣＨ３、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨＣ（ＮＨ２ ＋）ＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７、ＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群から選択されるか、あるいは、Ｒ１およびＲ２は、これらが結合している原子と一緒になって、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル環を形成し、
Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＳＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ３〜Ｃ６）シクロアルキルからなる群から選択されるか、あるいは、Ｒ４およびＲ３が、これらが結合している原子と一緒になって、５員環または６員環の複素環を形成し、
Ｒ５は、ＮＨＲ６またはＯＨであり、
Ｒ６はＨであるか、あるいは、Ｒ６およびＲ２が、これらが結合している原子と一緒になって、５員環または６員環の複素環を形成し、
Ｒ７は、ＨおよびＯＨからなる群から選択され、Ｒ８はＨである。一実施形態では、Ｒ３はＣ１〜Ｃ８アルキルであり、Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ＣＨ２ＯＨ、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７、ＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群から選択されるか、あるいは、Ｒ４およびＲ３は、これらが結合している原子と一緒になって、５員環または６員環の複素環を形成する。別の実施形態では、Ｒ５はＮＨＲ６であり、Ｒ８はＨである。
一実施形態によれば、ジペプチド要素は、以下の式Ｘの一般構造を有する化合物を含む。
Figure 0005969469
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ８は独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、Ｃ２〜Ｃ１８アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ１８アルキル）ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ１８アルキル）ＳＨ、（Ｃ２〜Ｃ３アルキル）ＳＣＨ３、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨＣ（ＮＨ２ ＋）ＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ２〜Ｃ５複素環）、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ９ヘテロアリール）、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル（Ｗ１）Ｃ１〜Ｃ１２アルキルからなる群から選択され、Ｗ１は、Ｎ、Ｓ、Ｏからなる群から選択されるヘテロ原子であるか、あるいは、Ｒ１およびＲ２は、これらが結合している原子と一緒になって、Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキルを形成するか、あるいは、Ｒ４およびＲ８は、これらが結合している原子と一緒になって、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキルを形成し、
Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、（Ｃ１〜Ｃ１８アルキル）ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ１８アルキル）ＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ１８アルキル）ＳＨ、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ２〜Ｃ５複素環）、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群から選択されるか、あるいは、Ｒ４およびＲ３は、これらが結合している原子と一緒になって、４員環、５員環または６員環の複素環を形成し、
Ｒ５は、ＮＨＲ６またはＯＨであり、
Ｒ６は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ８アルキルであるか、あるいは、Ｒ６およびＲ１は、これらが結合している原子と一緒になって、４員環、５員環または６員環の複素環を形成し、
Ｒ７は、Ｈ、ＯＨ、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、Ｃ２〜Ｃ１８アルケニル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＯＨ、ハロからなる群から選択される。
もうひとつの実施形態では、ジペプチドプロドラッグ要素は、以下の一般構造を有する。
Figure 0005969469
式中、
Ｒ１およびＲ８は独立に、ＨまたはＣ１〜Ｃ８アルキルであり、
Ｒ２およびＲ４は独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＳＨ、（Ｃ２〜Ｃ３アルキル）ＳＣＨ３、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨＣ（ＮＨ２＋）ＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ２〜Ｃ５複素環）、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７、ＣＨ２（Ｃ３〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群から選択されるか、あるいは、Ｒ１およびＲ２は、これらが結合している原子と一緒になって、Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキルを形成し、
Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＳＨ、（Ｃ３〜Ｃ６）シクロアルキルからなる群から選択されるか、あるいは、Ｒ４およびＲ３は、これらが結合している原子と一緒になって、５員環または６員環の複素環を形成し、
Ｒ５は、ＮＨＲ６またはＯＨであり、
Ｒ６は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ８アルキルであるか、あるいは、Ｒ６およびＲ２は、これらが結合している原子と一緒になって、５員環または６員環の複素環を形成し、
Ｒ７は、Ｈ、ＯＨ、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、Ｃ２〜Ｃ１８アルケニル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＯＨ、ハロからなる群から選択されるが、ただし、Ｒ４およびＲ３が、これらが結合している原子と一緒になって、５員環または６員環の複素環を形成する場合、Ｒ１およびＲ２は、ともにＨではない。一実施形態では、Ｒ７はＨまたはＯＨである。一実施形態では、ジペプチドプロドラッグ要素の第１のアミノ酸および／または第２のアミノ酸は、Ｄ型立体異性体の立体配置をとるアミノ酸である。
別の実施形態では、式Ｘのプロドラッグ要素が提供され、
式中、
Ｒ１は、ＨおよびＣ１〜Ｃ８アルキルからなる群から選択され、
Ｒ２およびＲ４は独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＳＨ、（Ｃ２〜Ｃ３アルキル）ＳＣＨ３、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨＣ（ＮＨ２ ＋）ＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７、ＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群から選択されるか、あるいは、Ｒ１およびＲ２は、これらが結合している原子と一緒になって、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル環を形成し、
Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＳＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ３〜Ｃ６）シクロアルキルからなる群から選択されるか、あるいは、Ｒ４およびＲ３は、これらが結合している原子と一緒になって、５員環または６員環の複素環を形成し、
Ｒ５は、ＮＨＲ６またはＯＨであり、
Ｒ６はＨであるか、あるいは、Ｒ６およびＲ２は、これらが結合している原子と一緒になって、５員環または６員環の複素環を形成し、
Ｒ７は、水素、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、Ｃ２〜Ｃ１８アルケニル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＯＨ、ハロからなる群から選択され、Ｒ８はＨであるが、ただし、ジペプチド要素がＮ末端のアミンに結合し、Ｒ４およびＲ３が、これらが結合している原子と一緒になって、５員環または６員環の複素環を形成する場合、Ｒ１およびＲ２は、ともにＨではない。一実施形態では、ジペプチドプロドラッグ要素の第１のアミノ酸および／または第２のアミノ酸は、Ｄ型立体異性体の立体配置をとるアミノ酸である。
他の実施形態では、ジペプチドプロドラッグ要素は、式Ｘの構造を有し、
式中、
Ｒ１およびＲ８は独立に、ＨまたはＣ１〜Ｃ８アルキルであり、
Ｒ２およびＲ４は独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＳＨ、（Ｃ２〜Ｃ３アルキル）ＳＣＨ３、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨＣ（ＮＨ２＋）ＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ２〜Ｃ５複素環）、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７、ＣＨ２（Ｃ３〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群から選択されるか、あるいは、Ｒ１およびＲ２は、これらが結合している原子と一緒になって、Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキルを形成し、
Ｒ３はＣ１〜Ｃ１８アルキルであり、
Ｒ５はＮＨＲ６であり、
Ｒ６は、ＨまたはＣ１〜Ｃ８アルキルであり、
Ｒ７は、水素、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、Ｃ２〜Ｃ１８アルケニル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＯＨ、ハロからなる群から選択される。
別の実施形態では、ジペプチドプロドラッグ要素は式Ｘの構造を有し、
式中、
Ｒ１およびＲ２は独立に、Ｃ１〜Ｃ１８アルキルまたは（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７であるか、あるいは、Ｒ１およびＲ２は、−（ＣＨ２）ｐ（式中、ｐは２〜９である）を介して結合し、
Ｒ３はＣ１〜Ｃ１８アルキルであり、
Ｒ４およびＲ８は各々水素であり、
Ｒ５はＮＨ２であり、
Ｒ７は、水素、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、Ｃ２〜Ｃ１８アルケニル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＯＨ、ハロからなる群から選択される。
別の実施形態では、ジペプチドプロドラッグ要素は式Ｘの構造を有し、
式中、
Ｒ１およびＲ２は独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、（Ｃ１〜Ｃ１８アルキル）ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７からなる群から選択されるか、あるいは、Ｒ１およびＲ２は、（ＣＨ２）ｐ（式中、ｐは２〜９である）を介して結合し、
Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ１８アルキルであるか、あるいは、Ｒ３およびＲ４は、これらが結合している原子と一緒になって、４〜１２員環の複素環を形成し、
Ｒ４およびＲ８は独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７からなる群から選択され、
Ｒ５はＮＨ２であり、
Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、Ｃ２〜Ｃ１８アルケニル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＯＨ、ハロからなる群から選択されるが、ただし、Ｒ１およびＲ２はともに水素ではなく、かつ、Ｒ４またはＲ８のうちの少なくとも一方は水素である。
もうひとつの実施形態では、ジペプチドプロドラッグ要素は式Ｘの構造を有し、
式中、
Ｒ１およびＲ２は独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２からなる群から選択されるか、あるいは、Ｒ１およびＲ２は、（ＣＨ２）ｐ（式中、ｐは２〜９である）を介して結合し、
Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ８アルキルであるか、あるいは、Ｒ３およびＲ４は、これらが結合している原子と一緒になって、４〜６員環の複素環を形成し、
Ｒ４は、水素およびＣ１〜Ｃ８アルキルからなる群から選択され、
Ｒ８は水素であり、
Ｒ５はＮＨ２であるが、ただし、Ｒ１およびＲ２はともに水素ではない。
別の実施形態では、ジペプチドプロドラッグ要素は式Ｘの構造を有し、
式中、
Ｒ１およびＲ２は独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２からなる群から選択され、
Ｒ３はＣ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｒ４およびＲ８は各々水素であり、
Ｒ５はＮＨ２であるが、ただし、Ｒ１およびＲ２はともに水素ではない。
もうひとつの実施形態では、ジペプチドプロドラッグ要素は式Ｘの構造を有し、
式中、
Ｒ１およびＲ２は独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２からなる群から選択されるか、あるいは、Ｒ１およびＲ２は、（ＣＨ２）ｐ（式中、ｐは２〜９である）を介して結合し、
Ｒ３はＣ１〜Ｃ８アルキルであり、
Ｒ４は（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７であり、
Ｒ５はＮＨ２であり、
Ｒ７は、水素、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＯＨからなる群から選択され、
Ｒ８は水素であるが、ただし、Ｒ１およびＲ２はともに水素ではない。
もうひとつの実施形態では、ジペプチドプロドラッグ要素は式Ｘの構造を有し、式中、
Ｒ１は、水素、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７からなる群から選択され、
Ｒ２は水素であり、
Ｒ３はＣ１〜Ｃ１８アルキルであり、
Ｒ４およびＲ８は各々水素であり、
Ｒ５は、ＮＨＲ６またはＯＨであり、
Ｒ６は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ８アルキルであるか、あるいは、Ｒ６およびＲ１は、これらが結合している原子と一緒になって、４員環、５員環または６員環の複素環を形成し、
Ｒ７は、水素、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、Ｃ２〜Ｃ１８アルケニル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＯＨ、ハロからなる群から選択されるが、ただし、Ｒ１がアルキルまたは（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７である場合、Ｒ１およびＲ６は、これらが結合している原子と一緒になって、４〜１１員環の複素環を形成する。
一実施形態では、Ａ鎖とＢ鎖とを有し、Ｂ鎖のカルボキシ末端は、橋渡し部分を介して前記Ａ鎖のアミノ末端に結合する、単鎖インスリン類縁体が提供される。一実施形態では、構造ＩＢ−ＬＭ−ＩＡを有する単鎖インスリン類縁体が提供され、ここで、ＩＢは、配列Ｒ２２−Ｘ２５ＬＣＧＸ２９Ｘ３０ＬＶＸ３３Ｘ３４ＬＹＬＶＣＧＸ４１Ｘ４２ＧＦＸ４５（配列番号２１）を有し、ＬＭは、ＩＢをＩＡに共有結合的に結合する、本明細書に開示するような橋渡し部分であり、ＩＡは、配列ＧＩＶＸ４Ｘ５ＣＣＸ８Ｘ９Ｘ１０ＣＸ１２ＬＸ１４Ｘ１５ＬＸ１７Ｘ１８Ｘ１９ＣＸ２１−Ｒ１３（配列番号２２）を有する。この場合、記号Ｘ４５のアミノ酸は、橋渡し部分であるＬＭに直接結合するフェニルアラニンまたはチロシンである。一実施形態では、構造ＩＢ−ＬＭ−ＩＡを有する単鎖インスリン類縁体が提供され、ここで、ＩＢは、配列Ｊ−Ｒ２３−Ｒ２２−Ｘ２５ＬＣＧＸ２９Ｘ３０ＬＶＸ３３Ｘ３４ＬＸ３６ＬＶＣＧＸ４１Ｘ４２ＧＦＸ４５（配列番号２０）または配列番号２０の５番目、６番目、９番目、１０番目、１６番目、１８番目、１９番目、２１番目から選択される位置での１〜３個のアミノ酸修飾が配列番号２０とは異なる配列を有し、ＬＭは、本明細書に開示するような橋渡し部分であり、ＩＡは、配列ＧＩＶＸ４Ｘ５ＣＣＸ８Ｘ９Ｘ１０ＣＸ１２ＬＸ１４Ｘ１５ＬＸ１７Ｘ１８Ｘ１９ＣＸ２１−Ｒ１３（配列番号２２）または配列番号２０の５番目、８番目、９番目、１０番目、１４番目、１５番目、１７番目、１８番目、２１番目から選択される位置での１〜３個のアミノ酸修飾が配列番号１９とは異なる配列を有し、
Ｊは、Ｈまたは一般構造Ｕ−Ｂを有するジペプチド要素であって、Ｕは、アミノ酸またはヒドロキシ酸であり、Ｂは、アミド結合を介して結合するＮアルキル化アミノ酸であり、
Ｘ４は、グルタミン酸またはアスパラギン酸であり、
Ｘ５はグルタミンまたはグルタミン酸であり、
Ｘ８は、ヒスチジン、スレオニンまたはフェニルアラニンであり、
Ｘ９は、セリン、アルギニン、オルニチン、リジンまたはアラニンであり、
Ｘ１０は、イソロイシンまたはセリンであり、
Ｘ１２はセリンまたはアスパラギン酸であり、
Ｘ１４は、チロシン、アルギニン、オルニチン、リジンまたはアラニンであり、
Ｘ１５は、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、アラニン、オルニチン、リジンまたはロイシンであり、
Ｘ１７は、グルタミン酸またはグルタミンであり、
Ｘ１８は、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸またはスレオニンであり、
Ｘ１９は、以下の一般構造
Figure 0005969469
（式中、Ｘは、ＯＨまたはＮＨＲ１０からなる群から選択され、Ｒ１０は、Ｈまたは一般構造Ｕ−Ｂを有するジペプチド要素であって、Ｕは、アミノ酸またはヒドロキシ酸であり、Ｂは、Ｎアルキル化アミノ酸である）を有するアミノ酸であり、
Ｘ２１は、アラニン、グリシン、セリン、バリン、スレオニン、イソロイシン、ロイシン、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、トリプトファン、チロシン、メチオニンからなる群から選択され、
Ｘ２５は、ヒスチジンまたはスレオニンであり、
Ｘ２９は、アラニン、グリシン、セリンからなる群から選択され、
Ｘ３０は、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸、システイン酸からなる群から選択され、
Ｘ３３は、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸からなる群から選択され、
Ｘ３４は、アラニンおよびスレオニンからなる群から選択され、
Ｘ３６は、以下の一般構造
Figure 0005969469
（式中、Ｘ１２は、ＯＨおよびＮＨＲ１１からなる群から選択され、Ｒ１１は、一般構造Ｕ−Ｂを有するジペプチド要素である）を有するアミノ酸であり、
Ｘ４１は、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアスパラギンからなる群から選択され、
Ｘ４２は、アラニン、オルニチン、リジン、アルギニンからなる群から選択され、
Ｘ４５は、以下の一般構造
Figure 0005969469
（式中、Ｘ１３は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨＲ１２からなる群から選択され、Ｒ１２は、Ｈまたは一般構造Ｕ−Ｂを有するジペプチド要素である）を有するアミノ酸であり、
Ｒ２２は、ＡＹＲＰＳＥ（配列番号１４）、ＦＶＮＱ（配列番号１２）、ＰＧＰＥ（配列番号１１）、トリペプチドであるグリシン−プロリン−グルタミン酸、トリペプチドであるバリン−アスパラギン−グルタミン、ジペプチドであるプロリン−グルタミン酸、ジペプチドであるアスパラギン−グルタミン、グルタミン、グルタミン酸、Ｎ末端のアミンからなる群から選択され、
Ｒ２３は、結合であるか、１〜６個の電荷を持つアミノ酸を有するアミノ配列であり、
Ｒ１３は、ＣＯＯＨまたはＣＯＮＨ２である。一実施形態では、Ｊ、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２のうちの１つだけがＵ−Ｂである。一実施形態では、Ｘ１２はＯＨであり、Ｘ１３はＨまたはＯＨであり、Ｊおよび／またはＸはＵ−Ｂである。一実施形態では、Ｘ１２はＯＨであり、Ｘ１３はＯＨであり、Ｒ２３は結合であり、ＪはＨであり、ＸはＵ−Ｂである。別の実施形態では、Ｘ８、Ｘ２５、Ｘ３０は各々ヒスチジンである。もうひとつの実施形態では、単鎖インスリン類縁体ペプチドは、配列番号１９のＡ鎖ペプチド配列と、配列番号２０のＢ鎖ペプチド配列とを有する。一実施形態では、Ｒ２３は結合であるか、あるいは、アミノ配列Ｘ６０（Ｘ６１Ｘ６２）ｄＸ６３Ｋ（配列番号１９２）を有し、ここで、Ｘ６０は、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸からなる群から選択され、Ｘ６１およびＸ６２は独立に、グルタミン酸およびアスパラギン酸からなる群から選択され、Ｘ６３は、アルギニン アスパラギン酸、グルタミン酸からなる群から選択され、ｄは、１〜３の範囲の整数である。
一実施形態では、ＩＢが、配列Ｊ−Ｒ２３Ｒ２２−Ｘ２５ＬＣＧＸ２９Ｘ３０ＬＶＸ３３Ｘ３４ＬＸ３６ＬＶＣＧＸ４１Ｘ４２ＧＦＸ４５（配列番号２０）またはＪ−Ｒ２３Ｒ２２−Ｘ２５ＬＣＧＸ２９Ｘ３０ＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧ ＥＲＧＦＦ（配列番号５３）を有する単鎖インスリン類縁体が提供され、ここで、ＩＢのＢ２５アミノ酸のカルボキシ末端は、橋渡し部分（ＬＭ）の第１の端に直接結合し、橋渡し部分の第２の端はＩＡ鎖のＡ１アミノ酸のアミノ末端に直接結合している。また、一実施形態では、橋渡し部分は、配列ＹＴＰＫＴ（配列番号１６）またはＦＮＫＰＴ（配列番号７６）を含まない。一実施形態では、ＩＢが、配列Ｊ−Ｒ２３Ｒ２２−Ｘ２５ＬＣＧＸ２９Ｘ３０ＬＶＸ３３Ｘ３４ＬＸ３６ＬＶＣＧＸ４１Ｘ４２ＧＦＸ４５（配列番号２０）、Ｊ−Ｒ２３Ｒ２２−Ｘ２５ＬＣＧＸ２９Ｘ３０ＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧ ＥＲＧＦＦ（配列番号５３）、Ｒ２３Ｒ２２−Ｘ２５ＬＣＧＸ２９Ｘ３０ＬＶＸ３３Ｘ３４ＬＸ３６ＬＶＣＧＸ４１Ｘ４２ＧＦＸ４５（配列番号２０）またはＲ２３Ｒ２２−Ｘ２５ＬＣＧＸ２９Ｘ３０ＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧ ＥＲＧＦＦ（配列番号５３）を有し、橋渡し部分が、一般構造（Ｙ１）ｋ−Ｘ５１ＡＸ５３Ｘ５４Ｘ５５Ｘ５６Ｘ５７Ｒ（Ｙ２）ｎ（配列番号２８）、（Ｙ１）ｋ−Ｘ５１ＡＸ５３Ｘ５４Ｘ５５Ｘ５６ＲＲ（Ｙ２）ｎ（配列番号２３）、（Ｙ１）ｋ−ＧＹＧＳＳＳＸ５７Ｘ５８（Ｙ２）ｎ（配列番号８５）、（Ｙ１）ｋ−ＧＡＧＳＳＳＸ５７Ｘ５８（Ｙ２）ｎ（配列番号１６３）、（Ｙ１）ｋ−ＧＹＧＳＳＳＸ５７Ｒ（配列番号５１）または（Ｙ１）ｋ−Ｘ５１Ｘ５２ＧＳＳＳＸ５７Ｘ５８−（Ｙ２）ｎ（配列番号２９）のペプチドリンカーである単鎖インスリン類縁体が提供され、ここで、Ｙ１はＸ４６、Ｘ４６Ｘ４７の群から選択されるが、ただし、ｋが０である場合、橋渡しペプチドは、配列ＹＴＰＫＴ（配列番号１６）またはＦＮＫＰＴ（配列番号７６）を含まない。
一実施形態では、構造ＩＢ−ＬＭ−ＩＡを有する単鎖インスリン類縁体が提供され、ここで、ＩＢは、配列Ｊ−Ｒ２３Ｒ２２−Ｘ２５ＬＣＧＸ２９Ｘ３０ＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧ ＥＲＧＦＦ（配列番号５３）を有し、ＬＭは、本明細書に開示するような橋渡し部分であり、ＩＡは、配列ＧＩＶＥＱＣＣＸ８ＳＩＣＳＬＹＱＬＸ１７ＮＸ１９ＣＸ２３（配列番号５２）を有し、
Ｘ８は、スレオニンおよびヒスチジンからなる群から選択され、
Ｘ１７は、グルタミン酸またはグルタミンであり、
Ｘ１９は、以下の一般構造
Figure 0005969469
（式中、Ｘは、ＯＨまたはＮＨＲ１０からなる群から選択され、Ｒ１０は、Ｈまたは一般構造Ｕ−Ｂを有するジペプチド要素であって、Ｕは、アミノ酸またはヒドロキシ酸であり、Ｂは、Ｎアルキル化アミノ酸である）を有するアミノ酸であり、
Ｘ２３は、アスパラギンまたはグリシンであり、
Ｘ２５は、ヒスチジンおよびスレオニンからなる群から選択され、
Ｘ２９は、アラニン、グリシン、セリンからなる群から選択され、
Ｘ３０は、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸、システイン酸からなる群から選択され、
Ｒ２２は、ＦＶＮＱ（配列番号１２）、トリペプチドであるバリン−アスパラギン−グルタミン、ジペプチドであるアスパラギン−グルタミン、グルタミン、グルタミン酸、Ｎ末端のアミンからなる群から選択され、
Ｒ２３は、結合であるか、１〜６個の電荷を持つアミノ酸を有するアミノ配列である。
別の実施形態では、Ｂ鎖は、配列Ｘ２２ＶＮＱＸ２５ＬＣＧＸ２９Ｘ３０ＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴ−Ｚ１−Ｂ１（配列番号５４）を有し、ここで、
Ｘ２２は、フェニルアラニンおよびデスアミノフェニルアラニンからなる群から選択され、
Ｘ２５は、ヒスチジンおよびスレオニンからなる群から選択され、
Ｘ２９は、アラニン、グリシン、セリンからなる群から選択され、
Ｘ３０は、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸、システイン酸からなる群から選択され、
Ｚ１は、アスパラギン酸−リジン、リジン−プロリン、プロリン−リジンからなる群から選択されるジペプチドであり、
Ｂ１は、スレオニン、アラニンまたはスレオニン−アルギニン−アルギニントリペプチドからなる群から選択される。
一実施形態によれば、構造ＩＢ−ＬＭ−ＩＡを有する単鎖インスリン類縁体が提供され、ここで、ＩＢは、配列Ｘ２５ＬＣＧＸ２９Ｘ３０ＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧ ＥＲＧＦＦ（配列番号５３）を有し、ＬＭは、ＩＢをＩＡに共有結合的に結合する、本明細書に開示するような橋渡し部分であり、ＩＡは、配列ＧＩＶＥＱＣＣＸ８ＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＸ１９ＣＸ２１（配列番号５５）を有し、配列番号５３のＣ末端のフェニルアラニン残基は、介在するアミノ酸なしで、橋渡し部分ＬＭに直接共有結合する。
一実施形態では、構造ＩＢ−ＬＭ−ＩＡを有する単鎖インスリン類縁体が提供され、ここで、ＩＢは、配列Ｊ−Ｒ２３−Ｒ２２−Ｘ２５ＬＣＧＸ２９Ｘ３０ＬＶＸ３３Ｘ３４ＬＹＬＶＣＧＤＸ４２ＧＦＸ４５（配列番号５８）を有し、ＬＭは、本明細書に開示するような橋渡し部分であり、ＩＡは、配列ＧＩＶＸ４ＥＣＣＸ８Ｘ９ＳＣＤＬＸ１４Ｘ１５ＬＸ１７Ｘ１８Ｘ１９ＣＸ２１−Ｒ１３（配列番号１９）を有し、
Ｊは、Ｈまたは一般構造Ｕ−Ｂを有するジペプチド要素であって、Ｕは、アミノ酸またはヒドロキシ酸であり、Ｂは、アミド結合を介して結合するＮアルキル化アミノ酸であり、
Ｘ４は、アスパラギン酸またはグルタミン酸であり、
Ｘ８は、ヒスチジンまたはフェニルアラニンであり、
Ｘ９およびＸ１４は独立に、アルギニン、オルニチン、リジンまたはアラニンから選択され、
Ｘ１５は、アルギニン、リジン、オルニチンまたはロイシンであり、
Ｘ１７は、グルタミン酸またはグルタミンであり、
Ｘ１８は、メチオニン、アスパラギンまたはスレオニンであり、
Ｘ１９は、以下の一般構造
Figure 0005969469
（式中、Ｘは、ＯＨまたはＮＨＲ１０からなる群から選択され、Ｒ１０は、Ｈまたは一般構造Ｕ−Ｂを有するジペプチド要素であって、Ｕは、アミノ酸またはヒドロキシ酸であり、Ｂは、Ｎアルキル化アミノ酸である）を有するアミノ酸であり、
Ｘ２１は、アラニン、グリシンまたはアスパラギンであり、
Ｒ２２は、共有結合、ＡＹＲＰＳＥ（配列番号１４）、グリシン−プロリン−グルタミン酸トリペプチド、プロリン−グルタミン酸ジペプチド、グルタミン酸からなる群から選択され、
Ｒ２３は、結合であるか、１〜６個の電荷を持つアミノ酸を有するアミノ配列であり、
Ｘ２５は、ヒスチジンおよびスレオニンからなる群から選択され、
Ｘ２９は、アラニン、グリシン、セリンからなる群から選択され、
Ｘ３０は、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸、システイン酸からなる群から選択され、
Ｘ３３は、アスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群から選択され、
Ｘ３４は、アラニンおよびスレオニンからなる群から選択され、
Ｘ４２は、アラニン、リジン オルニチン、アルギニンからなる群から選択され、
Ｘ４５は、以下の一般構造
Figure 0005969469
（式中、Ｘ１３は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨＲ１２からなる群から選択され、ここで、Ｒ１２は、一般構造Ｕ−Ｂを有するジペプチド要素である）を有するアミノ酸であり、
Ｒ１３は、ＣＯＯＨまたはＣＯＮＨ２であるが、ただし、Ｊ、Ｘ、Ｘ１３のうちの１つだけがＵ−Ｂを有する。一実施形態では、ＪはＨであり、Ｘ１３はＯＨであり、ＸはＮＨ−Ｕ−Ｂである。
一実施形態では、ジペプチドプロドラッグ要素Ｕ−ＢのＵおよびＢは、Ｕ−Ｂジペプチドが、哺乳類の血清に含まれる酵素によってインスリンペプチドから酵素的に切断されるのを阻害するように選択される。一実施形態では、Ｕおよび／またはＢは、ＰＢＳ中にて生理的条件下でインスリンペプチドからＵ−Ｂが切断される半減期が、ＤＰＰ−ＩＶプロテアーゼを含む溶液中でのインスリンペプチドからＵ−Ｂが切断される半減期の２倍以下になる（すなわち、インスリンプロドラッグからのＵ−Ｂの切断が、ＤＰＰ−ＩＶプロテアーゼの存在下、生理的条件で、酵素のない理想的な状態の２倍を超える速度では起こらない）ように選択される。一実施形態では、Ｕ、ＢまたはＵ−Ｂが結合するインスリンペプチドのアミノ酸は、コードされていないアミノ酸である。一実施形態では、Ｕおよび／またはＢは、Ｄ型立体異性体の立体配置をとるアミノ酸である。いくつかの例示としての実施形態では、Ｕは、Ｄ型立体異性体の立体配置をとるアミノ酸であり、Ｂは、Ｌ型立体異性体の立体配置をとるアミノ酸である。いくつかの例示としての実施形態では、Ｕは、Ｌ型立体異性体の立体配置をとるアミノ酸であり、Ｂは、Ｄ型立体異性体の立体配置をとるアミノ酸である。いくつかの例示としての実施形態では、Ｕは、Ｄ型立体異性体の立体配置をとるアミノ酸であり、Ｂは、Ｄ型立体異性体の立体配置をとるアミノ酸である。一実施形態では、Ｕ−Ｂは、本明細書で定義したような式Ｘの構造を有するジペプチドである。一実施形態では、ＢはＮアルキル化アミノ酸であるが、プロリンではない。
一実施形態によれば、ヒトインスリンのＢ鎖およびＡ鎖あるいは、それらの類縁体または誘導体を有する単鎖インスリンアゴニストポリペプチドが提供される。ここで、Ｂ鎖のカルボキシ末端は、橋渡し部分を介してＡ鎖のアミノ末端に結合する。一実施形態では、橋渡し部分は、６〜１６個のモノマー単位からなるポリエチレングリコール、少なくとも８アミノ酸長かつ１２アミノ酸長以下であるアミノ酸配列（またはその擬似ペプチド）または前記ポリエチレングリコールとアミノ酸配列との組み合わせを有する。特に、一実施形態では、橋渡し部分は、アミノ酸配列Ｘ５１Ｘ５２Ｘ５３Ｘ５４Ｘ５５Ｘ５６ＲＲ（配列番号１０）を有し、ここで、Ｘ５１は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニンからなる群から選択され、Ｘ５２は、たとえば非芳香族アミノ酸などのチロシン以外のアミノ酸であり、Ｘ３からＸ６は各々独立に、アミノ酸である。
一実施形態では、単鎖インスリン類縁体は構造ＩＢ−ＬＭ−ＩＡを有し、ここで、ＩＢは、配列Ｊ−Ｒ２３Ｒ２２−Ｘ２５ＬＣＧＸ２９Ｘ３０ＬＶＸ３３Ｘ３４ＬＸ３６ＬＶＣＧＸ４１Ｘ４２ＧＦＸ４５ 配列番号２０）を有し、
ＬＭは、（Ｙ１）ｋ−Ｘ５１Ｘ５２Ｘ５３Ｘ５４Ｘ５５Ｘ５６Ｘ５７Ｘ５８（Ｙ２）ｎ（配列番号９）、（Ｙ１）ｋ−Ｘ５１ＡＸ５３Ｘ５４Ｘ５５Ｘ５６ＲＲ（Ｙ２）ｎ（配列番号２３）、（Ｙ１）ｋ−ＧＹＧＳＳＳＸ５７Ｘ５８（Ｙ２）ｎ（配列番号８５）、
Figure 0005969469
からなる群から選択される橋渡し部分であり、
ＩＡは、配列ＧＩＶＸ４Ｘ５ＣＣＸ８Ｘ９Ｘ１０ＣＸ１２ＬＸ１４Ｘ１５ＬＸ１７Ｘ１８Ｘ１９ＣＸ２１−Ｒ１３（配列番号２２）を有し、
Ｊは、Ｈであるか、一般構造Ｕ−Ｂを有するジペプチドであって、ここで、Ｕは、アミノ酸またはヒドロキシ酸であり、Ｂは、アミド結合を介して結合するＮアルキル化アミノ酸であり、
Ｙ１は、Ｘ４６、Ｘ４６Ｘ４７、Ｘ４６Ｘ４７Ｘ４８、Ｘ４６Ｘ４７Ｘ４８Ｘ４９（配列番号２４）、Ｘ４６Ｘ４７Ｘ４８Ｘ４９Ｘ５０（配列番号１３）の群から選択され、
Ｙ２は、Ｘ７０、Ｘ７０Ｘ７１、Ｘ７０Ｘ７１Ｘ７２、Ｘ７０Ｘ７１Ｘ７２Ｘ７３（配列番号１５）の群から選択され、
ｎは０または１であり、
ｋは０または１であり、
ｍは、５〜１５の範囲の整数であり、
Ｘ４は、グルタミン酸またはアスパラギン酸であり、
Ｘ５はグルタミンまたはグルタミン酸であり、
Ｘ８は、ヒスチジン、スレオニンまたはフェニルアラニンであり、
Ｘ９は、セリン、アルギニン、リジン、オルニチンまたはアラニンであり、
Ｘ１０は、イソロイシンまたはセリンであり、
Ｘ１２はセリンまたはアスパラギン酸であり、
Ｘ１４は、チロシン、アルギニン、リジン、オルニチンまたはアラニンであり、
Ｘ１５は、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、アラニン、リジン、オルニチンまたはロイシンであり、
Ｘ１７は、グルタミン酸またはグルタミンであり、
Ｘ１８は、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸またはスレオニンであり、
Ｘ１９は、以下の一般構造
Figure 0005969469
（式中、Ｘは、ＯＨ、ＯＣＨ３またはＮＨＲ１０からなる群から選択され、Ｒ１０は、Ｈまたは一般構造Ｕ−Ｂを有するジペプチド要素であって、Ｕは、アミノ酸またはヒドロキシ酸であり、Ｂは、Ｎアルキル化アミノ酸である）を有するアミノ酸であり、
Ｘ２１は、アラニン、グリシン、セリン、バリン、スレオニン、イソロイシン、ロイシン、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、トリプトファン、チロシン、メチオニンからなる群から選択され、
Ｘ２５は、ヒスチジンまたはスレオニンであり、
Ｘ２９は、アラニン、グリシン、セリンからなる群から選択され、
Ｘ３０は、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸、システイン酸からなる群から選択され、
Ｘ３３は、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸からなる群から選択され、
Ｘ３４は、アラニンおよびスレオニンからなる群から選択され、
Ｘ３６は、以下の一般構造
Figure 0005969469
（式中、Ｘ１２は、ＯＨおよびＮＨＲ１１からなる群から選択され、Ｒ１１は、一般構造Ｕ−Ｂを有するジペプチド要素である）を有するアミノ酸であり、
Ｘ４１は、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアスパラギンからなる群から選択され、
Ｘ４２は、アラニン、リジン、オルニチン、アルギニンからなる群から選択され、
Ｘ４５は、以下の一般構造
Figure 0005969469
（式中、Ｘ１３は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨＲ１２からなる群から選択され、ここで、Ｒ１２は、Ｈまたは一般構造Ｕ−Ｂを有するジペプチド要素である）を有するアミノ酸であり、
Ｘ５１は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニンからなる群から選択され、
Ｘ５２は、チロシン以外のアミノ酸であり、
Ｘ４６からＸ５６およびＸ７０からＸ７３は各々独立に、アミノ酸あるいはそのアミノ酸の類縁体または誘導体であり、
Ｘ５７およびＸ５８は独立に、アルギニン、オルニチン、リジンの群から選択される。
Ｒ２２は、ＡＹＲＰＳＥ（配列番号１４）、ＦＶＮＱ（配列番号１２）、ＰＧＰＥ（配列番号１１）、トリペプチドであるグリシン−プロリン−グルタミン酸、トリペプチドであるバリン−アスパラギン−グルタミン、ジペプチドであるプロリン−グルタミン酸、ジペプチドであるアスパラギン−グルタミン、グルタミン、グルタミン酸、結合からなる群から選択され、
Ｒ２３は、結合であるか、１〜６個の電荷を持つアミノ酸を有するアミノ配列であり、
Ｒ１３は、ＣＯＯＨまたはＣＯＮＨ２である。ただし、Ｕ、ＢまたはＵ−Ｂが結合する単鎖インスリンアゴニストのアミノ酸は、コードされていないアミノ酸である。一実施形態では、ｎまたはｋのうちの少なくとも一方は１である。
一実施形態では、構造ＩＢ−ＬＭ−ＩＡを有する単鎖インスリン類縁体が提供され、ここで、ＩＢは、配列Ｒ２３Ｒ２２−Ｘ２５ＬＣＧＸ２９Ｘ３０ＬＶＸ３３Ｘ３４ＬＹＬＶＣＧＸ４１Ｘ４２ＧＦＸ４５（配列番号２１）を有し、
ＬＭは、（Ｙ１）ｋ−Ｘ５１Ｘ５２Ｘ５３Ｘ５４Ｘ５５Ｘ５６Ｘ５７Ｘ５８（Ｙ２）ｎ（配列番号９）、（Ｙ１）ｋ−Ｘ５１ＡＸ５３Ｘ５４Ｘ５５Ｘ５６ＲＲ（Ｙ２）ｎ（配列番号２３）、（Ｙ１）ｋ−ＧＹＧＳＳＳＸ５７Ｘ５８（Ｙ２）ｎ（配列番号８５）、
Figure 0005969469
からなる群から選択される橋渡し部分であり、
ＩＡは、配列ＧＩＶＸ４Ｘ５ＣＣＸ８Ｘ９Ｘ１０ＣＸ１２ＬＸ１４Ｘ１５ＬＸ１７Ｘ１８Ｘ１９ＣＸ２１−Ｒ１３（配列番号２２）を有し、
Ｙ１は、Ｘ４６、Ｘ４６Ｘ４７、Ｘ４６Ｘ４７Ｘ４８、Ｘ４６Ｘ４７Ｘ４８Ｘ４９（配列番号２４）、Ｘ４６Ｘ４７Ｘ４８Ｘ４９Ｘ５０（配列番号１３）群から選択され、
Ｙ２は、Ｘ７０、Ｘ７０Ｘ７１、Ｘ７０Ｘ７１Ｘ７２、Ｘ７０Ｘ７１Ｘ７２Ｘ７３（配列番号１５）の群から選択され、
ｎは０または１であり、
ｋは０または１であり、
ｍは、５〜１５の範囲の整数であり、
Ｘ４は、グルタミン酸またはアスパラギン酸であり、
Ｘ５はグルタミンまたはグルタミン酸であり、
Ｘ８は、ヒスチジン、スレオニンまたはフェニルアラニンであり、
Ｘ９は、セリン、アルギニン、リジン、オルニチンまたはアラニンであり、
Ｘ１０は、イソロイシンまたはセリンであり、
Ｘ１２はセリンまたはアスパラギン酸であり、
Ｘ１４は、チロシン、アルギニン、リジン、オルニチンまたはアラニンであり、
Ｘ１５は、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、アラニン、リジン、オルニチンまたはロイシンであり、
Ｘ１７は、グルタミン酸またはグルタミンであり、
Ｘ１８は、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸またはスレオニンであり、
Ｘ１９は、以下の一般構造
Figure 0005969469
（式中、Ｘは、ＯＨまたはＮＨＲ１０からなる群から選択され、Ｒ１０は、Ｈまたは一般構造Ｕ−Ｂを有するジペプチド要素であって、Ｕは、アミノ酸またはヒドロキシ酸であり、Ｂは、Ｎアルキル化アミノ酸である）を有するアミノ酸であり、
Ｘ２１は、アラニン、グリシン、セリン、バリン、スレオニン、イソロイシン、ロイシン、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、トリプトファン、チロシン、メチオニンからなる群から選択され、
Ｘ２５は、ヒスチジンまたはスレオニンであり、
Ｘ２９は、アラニン、グリシン、セリンからなる群から選択され、
Ｘ３０は、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸、システイン酸からなる群から選択され、
Ｘ３３は、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸からなる群から選択され、
Ｘ３４は、アラニンおよびスレオニンからなる群から選択され、
Ｘ４５は、チロシンまたはフェニルアラニンであり、
Ｘ５１は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニンからなる群から選択され、
Ｘ５２は、チロシン以外のアミノ酸であり、
Ｘ４６からＸ５６およびＸ７０からＸ７３は各々独立に、アミノ酸あるいはそのアミノ酸の類縁体または誘導体であり、
Ｘ５７およびＸ５８は独立に、アルギニン、オルニチン、リジンの群から選択され、
Ｒ２２は、ＡＹＲＰＳＥ（配列番号１４）、ＦＶＮＱ（配列番号１２）、ＰＧＰＥ（配列番号１１）、トリペプチドであるグリシン−プロリン−グルタミン酸、トリペプチドであるバリン−アスパラギン−グルタミン、ジペプチドであるプロリン−グルタミン酸、ジペプチドであるアスパラギン−グルタミン、グルタミン、グルタミン酸、結合からなる群から選択され、
Ｒ２３は、Ｈであるか、あるいは、１〜６個の電荷を持つアミノ酸を有するアミノ配列であり、
Ｒ１３は、ＣＯＯＨまたはＣＯＮＨ２である。一実施形態では、ｎまたはｋのうちの少なくとも一方は１である。一実施形態では、ｎとｋがともに１である。別の実施形態では、Ｙ２は、Ａ、ＡＰ、ＡＰＱ、ＡＰＱＴからなる群から選択され、Ｙ１は、Ｆ、Ｙ、ＦＮ、ＹＴ、ＦＮＫ、ＹＴＰ、ＦＮＰＫ（配列番号７９）、ＦＮＫＰ（配列番号７７）、ＹＴＰＫ（配列番号７８）、ＹＴＰＫＴ（配列番号１６）、ＹＴＫＰＴ（配列番号８０）、ＦＮＫＰＴ（配列番号７６）、ＦＮＰＫＴ（配列番号８１）からなる群から選択される。一実施形態では、Ｒ２３は結合であり、Ｒ２２は、ＡＹＲＰＳＥ（配列番号１４）、ＰＧＰＥ（配列番号１１）、トリペプチドであるグリシン−プロリン−グルタミン酸、ジペプチドであるプロリン−グルタミン酸、グルタミン、グルタミン酸、Ｈからなる群から選択される。
一実施形態では、Ｒ２３はＨであるか、４〜７個のアミノ酸からなるアミノ配列であり、Ｎ末端のアミノ酸は、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸からなる群から選択され、Ｃ末端のアミノ酸はリジンであり、この配列の他のアミノ酸は独立に、グルタミン酸およびアスパラギン酸からなる群から選択され、Ｒ２２は、ＡＹＲＰＳＥ（配列番号１４）、ＰＧＰＥ（配列番号１１）、トリペプチドであるグリシン−プロリン−グルタミン酸、ジペプチドであるプロリン−グルタミン酸、グルタミン、グルタミン酸、Ｈからなる群から選択される。
一実施形態では、Ｕ−Ｂは、以下の式Ｘの構造を有する。
Figure 0005969469
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ８は独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、Ｃ２〜Ｃ１８アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ１８アルキル）ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ１８アルキル）ＳＨ、（Ｃ２〜Ｃ３アルキル）ＳＣＨ３、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨＣ（ＮＨ２ ＋）ＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ２〜Ｃ５複素環）、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ９ヘテロアリール）、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル（Ｗ１）Ｃ１〜Ｃ１２アルキルからなる群から選択され、Ｗ１は、Ｎ、Ｓ、Ｏからなる群から選択されるヘテロ原子であるか、あるいは、
Ｒ１およびＲ２は、これらが結合している原子と一緒になって、Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキルまたはアリールを形成するか、あるいは、
Ｒ４およびＲ８は、これらが結合している原子と一緒になって、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキルを形成し、
Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、（Ｃ１〜Ｃ１８アルキル）ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ１８アルキル）ＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ１８アルキル）ＳＨ、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ２〜Ｃ５複素環）、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群から選択されるか、あるいは、Ｒ４およびＲ３は、これらが結合している原子と一緒になって、４員環、５員環または６員環の複素環を形成し、
Ｒ５は、ＮＨＲ６またはＯＨであり、
Ｒ６は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ８アルキルであるか、あるいは、Ｒ６およびＲ１は、これらが結合している原子と一緒になって、４員環、５員環または６員環の複素環を形成し、
Ｒ７は、Ｈ、ＯＨ、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、Ｃ２〜Ｃ１８アルケニル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＯＨ、ハロからなる群から選択される。
もうひとつの実施形態では、構造ＩＢ−ＬＭ−ＩＡを有する単鎖インスリン類縁体が提供され、ここで、ＩＢは、配列Ｊ−Ｒ２２−Ｘ２５ＬＣＧＸ２９Ｘ３０ＬＶＸ３３Ｘ３４ＬＹＬＶＣＧＸ４１Ｘ４２ＧＦＸ４５（配列番号２１）を有し、
ＬＭは、配列（Ｙ１）ｋ−ＧＹＧＳＳＳＧＸ５７Ｒ（Ｙ２）ｎ（配列番号９１）または（Ｙ１）ｋ−Ｘ５１ＡＸ５３Ｘ５４Ｘ５５Ｘ５６Ｘ５７Ｒ（Ｙ２）ｎ（配列番号２８）を有し、
ＩＡは、配列ＧＩＶＸ４Ｘ５ＣＣＸ８Ｘ９Ｘ１０ＣＸ１２ＬＸ１４Ｘ１５ＬＸ１７Ｘ１８Ｘ１９ＣＸ２１−Ｒ１３（配列番号２２）を有し、
Ｊは、Ｈであるか、一般構造Ｕ−Ｂを有するジペプチドであって、Ｕは、アミノ酸またはヒドロキシ酸であり、Ｂは、アミド結合を介して結合するＮアルキル化アミノ酸であり、
Ｙ１は、Ｘ４６、Ｘ４６Ｘ４７、Ｘ４６Ｘ４７Ｘ４８、Ｘ４６Ｘ４７Ｘ４８Ｘ４９（配列番号２４）、Ｘ４６Ｘ４７Ｘ４８Ｘ４９Ｘ５０（配列番号１３）の群から選択され、
Ｙ２は、Ｘ７０、Ｘ７０Ｘ７１、Ｘ７０Ｘ７１Ｘ７２、Ｘ７０Ｘ７１Ｘ７２Ｘ７３（配列番号１５）の群から選択され、
ｎは０または１であり、
ｋは０または１であり、
Ｘ４は、グルタミン酸またはアスパラギン酸であり、
Ｘ５はグルタミンまたはグルタミン酸であり、
Ｘ８は、ヒスチジン、スレオニンまたはフェニルアラニンであり、
Ｘ９は、セリン、アルギニン、リジン、オルニチンまたはアラニンであり、
Ｘ１０は、イソロイシンまたはセリンであり、
Ｘ１２はセリンまたはアスパラギン酸であり、
Ｘ１４は、チロシン、アルギニン、リジン、オルニチンまたはアラニンであり、
Ｘ１５は、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、アラニン、リジン、オルニチンまたはロイシンであり、
Ｘ１７は、グルタミン酸またはグルタミンであり、
Ｘ１８は、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸またはスレオニンであり、
Ｘ１９は、以下の一般構造
Figure 0005969469
（式中、Ｘは、ＯＨまたはＮＨＲ１０からなる群から選択され、Ｒ１０は、Ｈまたは一般構造Ｕ−Ｂを有するジペプチド要素であって、Ｕは、アミノ酸またはヒドロキシ酸であり、Ｂは、Ｎアルキル化アミノ酸である）を有するアミノ酸であり、
Ｘ２１は、アラニン、グリシン、セリン、バリン、スレオニン、イソロイシン、ロイシン、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、トリプトファン、チロシン、メチオニンからなる群から選択され、
Ｘ２５は、ヒスチジンまたはスレオニンであり、
Ｘ２９は、アラニン、グリシン、セリンからなる群から選択され、
Ｘ３０は、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸、システイン酸からなる群から選択され、
Ｘ３３は、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸からなる群から選択され、
Ｘ３４は、アラニンおよびスレオニンからなる群から選択され、
Ｘ４１は、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアスパラギンからなる群から選択され、
Ｘ４２は、アラニン、リジン、オルニチン、アルギニンからなる群から選択され、
Ｘ４５は、以下の一般構造
Figure 0005969469
（式中、Ｘ１３は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨＲ１２からなる群から選択され、Ｒ１２は、Ｈまたは一般構造Ｕ−Ｂを有するジペプチド要素である）を有するアミノ酸であり、
Ｘ５１は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニンからなる群から選択され、
Ｘ５２は、チロシン以外のアミノ酸であり、
Ｘ４６からＸ５６およびＸ７０からＸ７３は各々独立に、アミノ酸であるか、あるいはそのアミノ酸の類縁体または誘導体であり、
Ｘ５７は、アルギニン、リジン、オルニチンまたはリジンであり、
Ｒ２２は、ＡＹＲＰＳＥ（配列番号１４）、ＦＶＮＱ（配列番号１２）、ＰＧＰＥ（配列番号１１）、トリペプチドであるグリシン−プロリン−グルタミン酸、トリペプチドであるバリン−アスパラギン−グルタミン、ジペプチドであるプロリン−グルタミン酸、ジペプチドであるアスパラギン−グルタミン、グルタミン、グルタミン酸、結合からなる群から選択され、
Ｒ２３は、結合であるか、１〜６個の電荷を持つアミノ酸を有するアミノ配列であり、
Ｒ１３は、ＣＯＯＨまたはＣＯＮＨ２である。一実施形態ではｋが０であり、もうひとつの実施形態ではｎが０であり、別の実施形態では、ｋとｎがともに０である。一実施形態では、橋渡し部分は、ＧＹＧＳＳＳＲＲ（配列番号１８）またはＧＸ５２ＧＳＳＳＲＲＡＰＱＴ（配列番号８３）であり、Ｘ５２は、非芳香族アミノ酸である。
もうひとつの実施形態では、単鎖インスリン類縁体は、構造ＩＢ−ＬＭ−ＩＡを有し、ここで、ＩＢは、配列Ｊ−Ｒ２３−Ｒ２２−Ｘ２５ＬＣＧＸ２９Ｘ３０ＬＶＸ３３Ｘ３４ＬＹＬＶＣＧＸ４１Ｘ４２ＧＦＸ４５（配列番号２１）を有し、
ＬＭは、以下の構造
Figure 0005969469
を有し、
ＩＡは、配列ＧＩＶＸ４Ｘ５ＣＣＸ８Ｘ９Ｘ１０ＣＸ１２ＬＸ１４Ｘ１５ＬＸ１７Ｘ１８Ｘ１９ＣＸ２１−Ｒ１３（配列番号２２）を有し、ここで、
Ｊは、Ｈまたは一般構造Ｕ−Ｂを有するジペプチド要素であって、Ｕは、アミノ酸またはヒドロキシ酸であり、Ｂは、アミド結合を介して結合するＮアルキル化アミノ酸であり、
ｍは、５〜１５の範囲の整数であり、
Ｘ４は、グルタミン酸またはアスパラギン酸であり、
Ｘ５はグルタミンまたはグルタミン酸であり、
Ｘ８は、ヒスチジン、スレオニンまたはフェニルアラニンであり、
Ｘ９は、セリン、アルギニン、リジン、オルニチンまたはアラニンであり、
Ｘ１０は、イソロイシンまたはセリンであり、
Ｘ１２はセリンまたはアスパラギン酸であり、
Ｘ１４は、チロシン、アルギニン、リジン、オルニチンまたはアラニンであり、
Ｘ１５は、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、アラニン、リジン、オルニチンまたはロイシンであり、
Ｘ１７は、グルタミン酸またはグルタミンであり、
Ｘ１８は、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸またはスレオニンであり、
Ｘ１９は、以下の一般構造
Figure 0005969469
（式中、Ｘは、ＯＨまたはＮＨＲ１０からなる群から選択され、Ｒ１０は、Ｈまたは一般構造Ｕ−Ｂを有するジペプチド要素であって、Ｕは、アミノ酸またはヒドロキシ酸であり、Ｂは、Ｎアルキル化アミノ酸である）を有するアミノ酸であり、
Ｘ２１は、アラニン、グリシン、セリン、バリン、スレオニン、イソロイシン、ロイシン、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、トリプトファン、チロシン、メチオニンからなる群から選択され、
Ｘ２５は、ヒスチジンまたはスレオニンであり、
Ｘ２９は、アラニン、グリシン、セリンからなる群から選択され、
Ｘ３０は、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸、システイン酸からなる群から選択され、
Ｘ３３は、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸からなる群から選択され、
Ｘ３４は、アラニンおよびスレオニンからなる群から選択され、
Ｘ４１は、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアスパラギンからなる群から選択され、
Ｘ４２は、アラニン、リジン、オルニチン、アルギニンからなる群から選択され、
Ｘ４５は、以下の一般構造
Figure 0005969469
（式中、Ｘ１３は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨＲ１２からなる群から選択され、Ｒ１２は、Ｈまたは一般構造Ｕ−Ｂを有するジペプチド要素である）を有するアミノ酸であり、
Ｘ５１は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニンからなる群から選択され、
Ｘ５２は、チロシン以外のアミノ酸であり、
Ｘ４６からＸ５６およびＸ７０からＸ７３は各々独立に、アミノ酸あるいはそのアミノ酸の類縁体または誘導体であり、
Ｒ２２は、ＡＹＲＰＳＥ（配列番号１４）、ＦＶＮＱ（配列番号１２）、ＰＧＰＥ（配列番号１１）、トリペプチドであるグリシン−プロリン−グルタミン酸、トリペプチドであるバリン−アスパラギン−グルタミン、ジペプチドであるプロリン−グルタミン酸、ジペプチドであるアスパラギン−グルタミン、グルタミン、グルタミン酸、Ｎ末端のアミンからなる群から選択され、
Ｒ２３は結合であるか、Ｘ６０(Ｘ６１Ｘ６２)ｄＸ６３Ｋ（配列番号１９２）であり、
ここで、
Ｘ６０は、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸からなる群から選択され、
Ｘ６１およびＸ６２は独立に、グルタミン酸およびアスパラギン酸からなる群から選択され、
Ｘ６３は、アルギニン アスパラギン酸、グルタミン酸からなる群から選択され、
ｄは、１〜３の範囲の整数であり、
Ｒ１３は、ＣＯＯＨまたはＣＯＮＨ２である。
一実施形態では、単鎖インスリン類縁体は、構造ＩＢ−ＬＭ−ＩＡを有し、ここで、ＩＢは、配列Ｊ−Ｒ２３−Ｒ２２−Ｘ２５ＬＣＧＸ２９Ｘ３０ＬＶＸ３３Ｘ３４ＬＸ３６ＬＶＣＧＸ４１Ｘ４２ＧＦＸ４５ 配列番号２０）を有し、
ＬＭは、配列（Ｙ１）ｋ−Ｘ５１ＡＸ５３Ｘ５４Ｘ５５Ｘ５６ＲＲ（Ｙ２）ｎ（配列番号２３）を有し、
ＩＡは、配列ＧＩＶＸ４Ｘ５ＣＣＸ８Ｘ９Ｘ１０ＣＸ１２ＬＸ１４Ｘ１５ＬＸ１７Ｘ１８Ｘ１９ＣＸ２１−Ｒ１３（配列番号２２）を有し、ここで、ｎは１であり、Ｘ４６、Ｘ４７、Ｘ４８、Ｘ４９および／またはＸ５０のうちの少なくとも１つが、式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩの群から選択されるアミノ酸である。一実施形態では、Ｙ１は、Ｆ、Ｙ、ＦＮ、ＹＴ、ＦＮＫ、ＹＴＰ、ＦＮＰＫ（配列番号７９）、ＦＮＫＰ（配列番号７７）、ＹＴＰＫ（配列番号７８）、ＹＴＰＫＴ（配列番号１６）、ＹＴＫＰＴ（配列番号８０）、ＦＮＫＰＴ（配列番号７６）、ＦＮＰＫＴ（配列番号８１）からなる群から選択される。もうひとつの実施形態では、Ｙ１は、Ｆ、ＦＮ、ＦＮＫ、ＦＮＰＫ（配列番号７９）、ＦＮＫＰＴ（配列番号７６）、ＦＮＰＫＴ（配列番号８１）からなる群から選択される。一実施形態では、Ｙ２は、Ａ、ＡＰ、ＡＰＱ、ＡＰＱＴ（配列番号８２）からなる群から選択される。別の実施形態では、ｎは０である。一実施形態では、Ｘ５３、Ｘ５４、Ｘ５５、Ｘ５６は各々独立に、グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、プロリンからなる群から選択される。一実施形態では、ＩＢは、配列Ｊ−Ｒ２３−Ｒ２２−Ｘ２５ＬＣＧＸ２９Ｘ３０ＬＶＸ３３Ｘ３４ＬＸ３６ＬＶＣＧＸ４１Ｘ４２ＧＦＸ４５（配列番号２０）を有し、ＬＭは、ＦＸ５１ＡＸ５３Ｘ５４Ｘ５５Ｘ５６ＲＲ（配列番号９４）、ＦＸ５１ＡＸ５３Ｘ５４Ｘ５５Ｘ５６ＲＲＡ（配列番号９５）、ＦＸ５１ＡＸ５３Ｘ５４Ｘ５５Ｘ５６ＲＲＡＰ（配列番号９６）、ＦＸ５１ＡＸ５３Ｘ５４Ｘ５５Ｘ５６ＲＲＡＰＱ（配列番号９７）、ＦＮＸ５１ＡＸ５３Ｘ５４Ｘ５５Ｘ５６ＲＲＡＰＱＴ（配列番号９８）、ＦＮＸ５１ＡＸ５３Ｘ５４Ｘ５５Ｘ５６ＲＲ（配列番号９９）、ＦＮＸ５１ＡＸ５３Ｘ５４Ｘ５５Ｘ５６ＲＲＡ（配列番号１００）、ＦＮＸ５１ＡＸ５３Ｘ５４Ｘ５５Ｘ５６ＲＲＡＰ（配列番号１０１）、ＦＮＸ５１ＡＸ５３Ｘ５４Ｘ５５Ｘ５６ＲＲＡＰＱ（配列番号１０２）、ＦＮＸ５１ＡＸ５３Ｘ５４Ｘ５５Ｘ５６ＲＲＡＰＱＴ（配列番号１０３）、ＦＮＫＸ５１ＡＸ５３Ｘ５４Ｘ５５Ｘ５６ＲＲ（配列番号１０４）、ＦＮＫＸ５１ＡＸ５３Ｘ５４Ｘ５５Ｘ５６ＲＲＡ（配列番号１０５）、ＦＮＫＸ５１ＡＸ５３Ｘ５４Ｘ５５Ｘ５６ＲＲＡＰ（配列番号１０６）、ＦＮＫＸ５１ＡＸ５３Ｘ５４Ｘ５５Ｘ５６ＲＲＡＰＱ（配列番号１０７）、ＦＮＫＸ５１ＡＸ５３Ｘ５４Ｘ５５Ｘ５６ＲＲＡＰＱＴ（配列番号１０８）、ＦＮＫＰＸ５１ＡＸ５３Ｘ５４Ｘ５５Ｘ５６ＲＲ（配列番号１０９）、ＦＮＫＰＸ５１ＡＸ５３Ｘ５４Ｘ５５Ｘ５６ＲＲＡ（配列番号１１０）、ＦＮＫＰＸ５１ＡＸ５３Ｘ５４Ｘ５５Ｘ５６ＲＲＡＰ（配列番号１１１）、ＦＮＫＰＸ５１ＡＸ５３Ｘ５４Ｘ５５Ｘ５６ＲＲＡＰＱ（配列番号１１２）、ＦＮＫＰＸ５１ＡＸ５３Ｘ５４Ｘ５５Ｘ５６ＲＲＡＰＱＴ（配列番号１１３）、ＦＮＫＰＴＸ５１ＡＸ５３Ｘ５４Ｘ５５Ｘ５６ＲＲ（配列番号１１４）、ＦＮＫＰＴＸ５１ＡＸ５３Ｘ５４Ｘ５５Ｘ５６ＲＲＡ（配列番号１１５）、ＦＮＫＰＴＸ５１ＡＸ５３Ｘ５４Ｘ５５Ｘ５６ＲＲＡＰ（配列番号１１６）、ＦＮＫＰＴＸ５１ＡＸ５３Ｘ５４Ｘ５５Ｘ５６ＲＲＡＰＱ（配列番号１１７）、ＦＮＫＰＴＸ５１ＡＸ５３Ｘ５４Ｘ５５Ｘ５６ＲＲＡＰＱＴ（配列番号１１８）、ＦＸ５１Ｘ５２ＧＳＳＳＲＲ（配列番号１１９）、ＦＸ５１Ｘ５２ＧＳＳＳＲＲＡ（配列番号１２０）、ＦＸ５１Ｘ５２ＧＳＳＳＲＲＡＰ（配列番号１２１）、ＦＸ５１Ｘ５２ＧＳＳＳＲＲＡＰＱ（配列番号１２２）、ＦＮＸ５１Ｘ５２ＧＳＳＳＲＲＡＰＱＴ（配列番号１２３）、ＦＮＸ５１Ｘ５２ＧＳＳＳＲＲ（配列番号１２４）、ＦＮＸ５１Ｘ５２ＧＳＳＳＲＲＡ（配列番号１２５）、ＦＮＸ５１Ｘ５２ＧＳＳＳＲＲＡＰ（配列番号１２６）、ＦＮＸ５１Ｘ５２ＧＳＳＳＲＲＡＰＱ（配列番号１２７）、ＦＮＸ５１Ｘ５２ＧＳＳＳＲＲＡＰＱＴ（配列番号１２８）、ＦＮＫＸ５１Ｘ５２ＧＳＳＳＲＲ（配列番号１２９）、ＦＮＫＸ５１Ｘ５２ＧＳＳＳＲＲＡ（配列番号１３０）、ＦＮＫＸ５１Ｘ５２ＧＳＳＳＲＲＡＰ（配列番号１３１）、ＦＮＫＸ５１Ｘ５２ＧＳＳＳＲＲＡＰＱ（配列番号１３２）、ＦＮＫＸ５１Ｘ５２ＧＳＳＳＲＲＡＰＱＴ（配列番号１３３）、ＦＮＫＰＸ５１Ｘ５２ＧＳＳＳＲＲ（配列番号１３４）、ＦＮＫＰＸ５１Ｘ５２ＧＳＳＳＲＲＡ（配列番号１３５）、ＦＮＫＰＸ５１Ｘ５２ＧＳＳＳＲＲＡＰ（配列番号１３６）、ＦＮＫＰＸ５１Ｘ５２ＧＳＳＳＲＲＡＰＱ（配列番号１３７）、ＦＮＫＰＸ５１Ｘ５２ＧＳＳＳＲＲＡＰＱＴ（配列番号１３８）、ＦＮＫＰＴＸ５１Ｘ５２ＧＳＳＳＲＲ（配列番号１３９）、ＦＮＫＰＴＸ５１Ｘ５２ＧＳＳＳＲＲＡ（配列番号１４０）、ＦＮＫＰＴＸ５１Ｘ５２ＧＳＳＳＲＲＡＰ（配列番号１４１）、ＦＮＫＰＴＸ５１Ｘ５２ＧＳＳＳＲＲＡＰＱ（配列番号１４２）、ＦＮＫＰＴＸ５１Ｘ５２ＧＳＳＳＲＲＡＰＱＴ（配列番号１４３）からなる群から選択される配列を有し、ここで、Ｘ５１は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニンからなる群から選択され、Ｘ５２は、チロシン以外のアミノ酸であり、Ｘ４６からＸ５６は各々独立に、アミノ酸あるいはそのアミノ酸の類縁体または誘導体である。一実施形態では、配列番号９４〜１４３の橋渡し部分がＰＥＧ化され、別の実施形態では、配列番号９４〜１４３の橋渡し部分のアルギニン残基がＰＥＧ化されたリジンで置換される。一実施形態では、ＰＥＧ化されたリジンは、天然のＩＧＦ １のＣペプチド（配列番号１７）に対して８番目の位置にある。一実施形態では、Ｘ５２は、非芳香族アミノ酸である。一実施形態では、ＩＢは、配列Ｊ−Ｒ２３−Ｒ２２−Ｘ２５ＬＣＧＸ２９Ｘ３０ＬＶＸ３３Ｘ３４ＬＸ３６ＬＶＣＧＸ４１Ｘ４２ＧＦＸ４５（配列番号２０）を有し、ＬＭは、配列ＧＡＧＳＳＳＸ５７Ｘ５８（配列番号１６３）、ＧＡＧＳＳＳＲＸ５８ＡＰＱ（配列番号１６７）、ＴＧＹＧＳＳＳＲＲ（配列番号１８）、ＴＧＹＧＳＳＳＲＲ（配列番号１４４）、ＫＴＧＹＧＳＳＳＲＲ（配列番号１４５）、ＰＫＴＧＹＧＳＳＳＲＲ（配列番号１４６）、ＴＰＫＴＧＹＧＳＳＳＲＲ（配列番号１４７）、ＴＫＰＴＧＹＧＳＳＳＲＲ（配列番号１４８）またはＳＲＰＡＧＹＧＳＳＳＲＲ（配列番号１４９）からなり、ここで、Ｘ５７およびＸ５８は独立に、アルギニン、オルニチン、リジンから選択される。
一実施形態では、単鎖インスリン類縁体は、
ａ）Ｊ−Ｒ２３−Ｒ２２−Ｘ２５ＬＣＧＸ２９Ｘ３０ＬＶＸ３３Ｘ３４ＬＹＬＶＣＧＸ４１Ｘ４２ＧＦＸ４５（配列番号２１）−Ｘ５１Ｘ５２ＧＳＳＳＲＲ（配列番号２７）−ＧＩＶＸ４Ｘ５ＣＣＸ８Ｘ９Ｘ１０ＣＸ１２ＬＸ１４Ｘ１５ＬＸ１７Ｘ１８Ｘ１９ＣＸ２１−Ｒ１３（配列番号２２）；
ｂ）Ｊ−Ｒ２３−Ｒ２２−Ｘ２５ＬＣＧＸ２９Ｘ３０ＬＶＸ３３Ｘ３４ＬＹＬＶＣＧＸ４１Ｘ４２ＧＦＸ４５（配列番号２１）−Ｘ４６Ｘ４７Ｘ４８Ｘ４９Ｘ５０Ｘ５１Ｘ５２ＧＳＳＳＲＲ（配列番号８６）−ＧＩＶＸ４Ｘ５ＣＣＸ８Ｘ９Ｘ１０ＣＸ１２ＬＸ１４Ｘ１５ＬＸ１７Ｘ１８Ｘ１９ＣＸ２１−Ｒ１３（配列番号２２）；
ｃ）Ｊ−Ｒ２３−Ｒ２２−Ｘ２５ＬＣＧＸ２９Ｘ３０ＬＶＸ３３Ｘ３４ＬＹＬＶＣＧＸ４１Ｘ４２ＧＦＸ４５（配列番号２１）−Ｘ５１Ｘ５２ＧＳＳＳＲＲ（配列番号２７）−ＡＰＱＴ（配列番号８２）−ＧＩＶＸ４Ｘ５ＣＣＸ８Ｘ９Ｘ１０ＣＸ１２ＬＸ１４Ｘ１５ＬＸ１７Ｘ１８Ｘ１９ＣＸ２１−Ｒ１３（配列番号２２）；
ｄ）Ｊ−Ｒ２３−Ｒ２２−Ｘ２５ＬＣＧＸ２９Ｘ３０ＬＶＸ３３Ｘ３４ＬＹＬＶＣＧＸ４１Ｘ４２ＧＦＸ４５（配列番号２１）−Ｘ４６Ｘ４７Ｘ４８Ｘ４９Ｘ５０Ｘ５１Ｘ５２ＧＳＳＳＲＸ５８ＡＰＱＴ（配列番号８７）−ＧＩＶＸ４Ｘ５ＣＣＸ８Ｘ９Ｘ１０ＣＸ１２ＬＸ１４Ｘ１５ＬＸ１７Ｘ１８Ｘ１９ＣＸ２１−Ｒ１３（配列番号２２）；
ｅ）Ｊ−Ｒ２３−Ｒ２２−Ｘ２５ＬＣＧＸ２９Ｘ３０ＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦ（配列番号５３）−Ｘ５１Ｘ５２ＧＳＳＳＸ５７Ｘ５８ＡＰＱＴ（配列番号４６）−ＧＩＶＥＱＣＣＸ８ＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＸ１９ＣＸ２１−Ｒ１３（配列番号５５）；
ｆ）Ｊ−Ｒ２３−Ｒ２２−Ｘ２５ＬＣＧＸ２９Ｘ３０ＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦ（配列番号５３）−Ｘ５１Ｘ５２ＧＳＳＳＲＲ（配列番号２７）−ＧＩＶＥＱＣＣＸ８ＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＸ１９ＣＸ２１−Ｒ１３（配列番号５５）；
ｇ）Ｊ−Ｒ２３−Ｒ２２−Ｘ２５ＬＣＧＸ２９Ｘ３０ＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦ（配列番号５３）−Ｘ４６Ｘ４７Ｘ４８Ｘ４９Ｘ５０Ｘ５１Ｘ５２ＧＳＳＳＲＸ５８ＡＰＱＴ（配列番号８７）−ＧＩＶＥＱＣＣＸ８ＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＸ１９ＣＸ２１−Ｒ１３（配列番号５５）；
ｈ）Ｊ−Ｒ２３−Ｒ２２−Ｘ２５ＬＣＧＸ２９Ｘ３０ＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦ（配列番号５３）−Ｘ４６Ｘ４７Ｘ４８Ｘ４９Ｘ５０Ｘ５１Ｘ５２ＧＳＳＳＲＲ（配列番号８７）−ＧＩＶＥＱＣＣＸ８ＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＸ１９ＣＸ２１−Ｒ１３（配列番号５５）；
ｉ）Ｊ−Ｒ２３−Ｒ２２−Ｘ２５ＬＣＧＸ２９Ｘ３０ＬＶＸ３３Ｘ３４ＬＹＬＶＣＧＸ４１Ｘ４２ＧＦＸ４５（配列番号２１）−ＧＹＧＳＳＳＲＲ（配列番号１８）−ＧＩＶＸ４Ｘ５ＣＣＸ８Ｘ９Ｘ１０ＣＸ１２ＬＸ１４Ｘ１５ＬＥＸ１８Ｘ１９ＣＸ２１−Ｒ１３（配列番号１５２）；
ｊ）Ｊ−Ｒ２３−Ｒ２２−Ｘ２５ＬＣＧＸ２９Ｘ３０ＬＶＸ３３Ｘ３４ＬＹＬＶＣＧＸ４１Ｘ４２ＧＦＸ４５（配列番号２１）−ＧＹＧＳＳＳＲＲ（配列番号１８）−ＧＩＶＥＱＣＣＸ８ＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＸ１９ＣＸ２１−Ｒ１３（配列番号５５）からなる群から選択される配列を有し、
ここで、
Ｊは、Ｈまたは一般構造Ｕ−Ｂを有するジペプチド要素であって、Ｕは、アミノ酸またはヒドロキシ酸であり、Ｂは、アミド結合を介して結合するＮアルキル化アミノ酸であり、
Ｘ４は、グルタミン酸またはアスパラギン酸であり、
Ｘ５はグルタミンまたはグルタミン酸であり、
Ｘ８は、ヒスチジン、スレオニンまたはフェニルアラニンであり、
Ｘ９は、セリン、アルギニン、リジン、オルニチンまたはアラニンであり、
Ｘ１０は、イソロイシンまたはセリンであり、
Ｘ１２はセリンまたはアスパラギン酸であり、
Ｘ１４は、チロシン、アルギニン、リジン、オルニチンまたはアラニンであり、
Ｘ１５は、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、アラニン、リジン、オルニチンまたはロイシンであり、
Ｘ１７は、グルタミン酸またはグルタミンであり、
Ｘ１８は、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸またはスレオニンであり、
Ｘ１９は、以下の一般構造
Figure 0005969469
（式中、Ｘは、ＯＨまたはＮＨＲ１０からなる群から選択され、Ｒ１０は、Ｈまたは一般構造Ｕ−Ｂを有するジペプチド要素であって、Ｕは、アミノ酸またはヒドロキシ酸であり、Ｂは、Ｎアルキル化アミノ酸である）を有するアミノ酸であり、
Ｘ２１は、アラニン、グリシン、セリン、バリン、スレオニン、イソロイシン、ロイシン、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、トリプトファン、チロシン、メチオニンからなる群から選択され、
Ｘ２５は、ヒスチジンまたはスレオニンであり、
Ｘ２９は、アラニン、グリシン、セリンからなる群から選択され、
Ｘ３０は、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸、システイン酸からなる群から選択され、
Ｘ３３は、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸からなる群から選択され、
Ｘ３４は、アラニンおよびスレオニンからなる群から選択され、
Ｘ４１は、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアスパラギンからなる群から選択され、
Ｘ４２は、アラニン、リジン、オルニチン、アルギニンからなる群から選択され、
Ｘ４５は、以下の一般構造
Figure 0005969469
（式中、Ｘ１３は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨＲ１２からなる群から選択され、Ｒ１２は、Ｈまたは一般構造Ｕ−Ｂを有するジペプチド要素である）を有するアミノ酸であり、
Ｘ４６からＸ５０は各々独立に、アミノ酸あるいはそのアミノ酸の類縁体または誘導体であり、
Ｘ５１は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニンからなる群から選択され、
Ｘ５２は、チロシン以外のアミノ酸であり、
Ｘ５７およびＸ５８は独立に、アルギニンまたはリジンであり、
Ｒ２２は、ＡＹＲＰＳＥ（配列番号１４）、ＦＶＮＱ（配列番号１２）、ＰＧＰＥ（配列番号１１）、トリペプチドであるグリシン−プロリン−グルタミン酸、トリペプチドであるバリン−アスパラギン−グルタミン、ジペプチドであるプロリン−グルタミン酸、ジペプチドであるアスパラギン−グルタミン、グルタミン、グルタミン酸、Ｎ末端のアミンからなる群から選択され、
Ｒ２３は結合であるか、たとえば負の電荷を持つアミノ酸などの電荷を持つアミノ酸を有する１〜８個のアミノ酸からなる配列であり、
Ｒ１３は、ＣＯＯＨまたはＣＯＮＨ２である。一実施形態では、ＪはＨであり、Ｘ４５はフェニルアラニンまたはチロシンである。別の実施形態では、Ｒ２２は、結合であるか、ＧＸ６０Ｘ６１Ｘ６２Ｘ６３Ｘ６４Ｋ（配列番号１５３）であり、ここで、Ｘ６０、Ｘ６１、Ｘ６２、Ｘ６３、Ｘ６４は独立に、グルタミン酸またはアスパラギン酸である。別の実施形態では、単鎖インスリン類縁体は、配列Ｒ２３−Ｒ２２−Ｘ２５ＬＣＧＸ２９Ｘ３０ＬＶＸ３３Ｘ３４ＬＹＬＶＣＧＸ４１Ｘ４２ＧＦＸ４５（配列番号２１）−Ｘ５１Ｘ５２ＧＳＳＳＲＲ（配列番号２７）−ＧＩＶＸ４Ｘ５ＣＣＸ８Ｘ９Ｘ１０ＣＸ１２ＬＸ１４Ｘ１５ＬＸ１７Ｘ１８Ｘ１９ＣＸ２１−Ｒ１３（配列番号２２）またはＲ２３−Ｒ２２−Ｘ２５ＬＣＧＸ２９Ｘ３０ＬＶＸ３３Ｘ３４ＬＹＬＶＣＧＸ４１Ｘ４２ＧＦＸ４５（配列番号２１）−ＧＸ５２ＧＳＳＳＲＸ５８ＡＰＱＴ（配列番号３８）−ＧＩＶＸ４Ｘ５ＣＣＸ８Ｘ９Ｘ１０ＣＸ１２ＬＸ１４Ｘ１５ＬＸ１７Ｘ１８Ｘ１９ＣＸ２１−Ｒ１３（配列番号２２）を有し、
ここで、
Ｘ４は、グルタミン酸またはアスパラギン酸であり、
Ｘ５はグルタミンまたはグルタミン酸であり、
Ｘ８は、ヒスチジン、スレオニンまたはフェニルアラニンであり、
Ｘ９は、セリン、アルギニン、リジン、オルニチンまたはアラニンであり、
Ｘ１０は、イソロイシンまたはセリンであり、
Ｘ１２はセリンまたはアスパラギン酸であり、
Ｘ１４は、チロシン、アルギニン、リジン、オルニチンまたはアラニンであり、
Ｘ１５は、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、アラニン、リジン、オルニチンまたはロイシンであり、
Ｘ１７は、グルタミン酸またはグルタミンであり、
Ｘ１８は、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸またはスレオニンであり、
Ｘ１９は、以下の一般構造
Figure 0005969469
（式中、Ｘは、ＯＨまたはＮＨＲ１０からなる群から選択され、Ｒ１０は、Ｈまたは一般構造Ｕ−Ｂを有するジペプチド要素であって、Ｕは、アミノ酸またはヒドロキシ酸であり、Ｂは、Ｎアルキル化アミノ酸である）を有するアミノ酸であり、
Ｘ２１は、アラニン、グリシン、セリン、バリン、スレオニン、イソロイシン、ロイシン、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、トリプトファン、チロシン、メチオニンからなる群から選択され、
Ｘ２５は、ヒスチジンまたはスレオニンであり、
Ｘ２９は、アラニン、グリシン、セリンからなる群から選択され、
Ｘ３０は、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸、システイン酸からなる群から選択され、
Ｘ３３は、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸からなる群から選択され、
Ｘ３４は、アラニンおよびスレオニンからなる群から選択され、
Ｘ４１は、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアスパラギンからなる群から選択され、
Ｘ４２は、アラニン、リジン、オルニチン、アルギニンからなる群から選択され、
Ｘ４５は、フェニルアラニンまたはチロシンであり、
Ｘ５１は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリンからなる群から選択され、
Ｘ５２はアラニンであり、
Ｘ５８は、アルギニンまたはリジンであり、
Ｒ２２は、ＡＹＲＰＳＥ（配列番号１４）、ＦＶＮＱ（配列番号１２）、ＰＧＰＥ（配列番号１１）、トリペプチドであるグリシン−プロリン−グルタミン酸、トリペプチドであるバリン−アスパラギン−グルタミン、ジペプチドであるプロリン−グルタミン酸、ジペプチドであるアスパラギン−グルタミン、グルタミン、グルタミン酸、Ｎ末端のアミンからなる群から選択され、
Ｒ２３は、結合であるか、あるいは、１つまたは２つ以上の負の電荷を持つアミノ酸を有する１〜８個のアミノ酸からなる配列であり、
Ｒ１３は、ＣＯＯＨまたはＣＯＮＨ２である。一実施形態では、Ｒ２３は、Ｎ末端のアミン、Ｘ６０（Ｘ６１Ｘ６２）ｄＸ６３Ｋ（配列番号１９２）を有するペプチド（ここで、ｄは、１〜３の範囲の整数である）またはＧＥＫ、ＧＥＥＫ（配列番号１７９）、ＧＥＥＥＫ（配列番号１７８）、ＧＥＥＥＥＥＫ（配列番号１７７）、ＧＥＥＥＥＥＫ（配列番号１７６）、ＧＥＥＥＥＥＥＥＫ（配列番号１７５）、ＧＤＫ、ＧＤＤＫ（配列番号１９０）、ＧＤＤＤＫ（配列番号１８９）、ＧＤＤＤＤＫ（配列番号１８８）、ＧＤＤＤＤＤＫ（配列番号１８７）、ＧＤＤＤＤＤＫ（配列番号１８６）、ＧＥＲＫ（配列番号１７４）、ＧＥＥＲＫ（配列番号１７３）、ＧＥＥＥＲＫ（配列番号１７２）、ＧＥＥＥＥＥＲＫ（配列番号１７１）、ＧＥＥＥＥＥＲＫ（配列番号１７０）、ＧＥＥＥＥＥＥＥＲＫ（配列番号１６９）、ＧＤＲＫ（配列番号１８５、ＧＤＤＲＫ（配列番号１８４）、ＧＤＤＤＲＫ（配列番号１８３）、ＧＤＤＤＤＲＫ（配列番号１８２）、ＧＤＤＤＤＤＲＫ（配列番号１８１）またはＧＤＤＤＤＤＲＫ（配列番号１８０）からなる群から選択されるペプチドである。一実施形態によれば、ジペプチド要素Ｕ−Ｂは、以下の式Ｘの構造を有する。
Figure 0005969469
式中、
（ａ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ８は独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、Ｃ２〜Ｃ１８アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ１８アルキル）ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ１８アルキル）ＳＨ、（Ｃ２〜Ｃ３アルキル）ＳＣＨ３、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨＣ（ＮＨ２ ＋）ＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ２〜Ｃ５複素環）、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ９ヘテロアリール）、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル（Ｗ１）Ｃ１〜Ｃ１２アルキルからなる群から選択され、Ｗ１は、Ｎ、Ｓ、Ｏからなる群から選択されるヘテロ原子であるか、あるいは、
（ｉｉ）Ｒ１およびＲ２は、これらが結合している原子と一緒になって、Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキルまたはアリールを形成するか、あるいは、
（ｉｉｉ）Ｒ４およびＲ８は、これらが結合している原子と一緒になって、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキルを形成し、
（ｂ）Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、（Ｃ１〜Ｃ１８アルキル）ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ１８アルキル）ＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ１８アルキル）ＳＨ、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ２〜Ｃ５複素環）、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群から選択されるか、あるいは、Ｒ４およびＲ３は、これらが結合している原子と一緒になって、４員環、５員環または６員環の複素環を形成し、
（ｃ）Ｒ５は、ＮＨＲ６またはＯＨであり、
（ｄ）Ｒ６は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ８アルキルであるか、あるいは、Ｒ６およびＲ２は、これらが結合している原子と一緒になって、４員環、５員環または６員環の複素環を形成し、
（ｅ）Ｒ７は、ＨおよびＯＨからなる群から選択される。
一実施形態によれば、ジペプチド要素Ｕ−Ｂは、以下の構造を有する。
Figure 0005969469
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ８は独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、Ｃ２〜Ｃ１８アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ１８アルキル）ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ１８アルキル）ＳＨ、（Ｃ２〜Ｃ３アルキル）ＳＣＨ３、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨＣ（ＮＨ２ ＋）ＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ２〜Ｃ５複素環）、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ９ヘテロアリール）、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル（Ｗ１）Ｃ１〜Ｃ１２アルキルからなる群から選択され、Ｗ１は、Ｎ、Ｓ、Ｏからなる群から選択されるヘテロ原子であるか、あるいは、Ｒ１およびＲ２は、これらが結合している原子と一緒になって、Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキルを形成するか、あるいは、Ｒ４およびＲ８は、これらが結合している原子と一緒になって、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキルを形成し、
Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、（Ｃ１〜Ｃ１８アルキル）ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ１８アルキル）ＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ１８アルキル）ＳＨ、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ２〜Ｃ５複素環）、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群から選択されるか、あるいは、Ｒ４およびＲ３は、これらが結合している原子と一緒になって、４員環、５員環または６員環の複素環を形成し、
Ｒ５は、ＮＨＲ６またはＯＨであり、
Ｒ６は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ８アルキルであるか、あるいは、Ｒ６およびＲ１は、これらが結合している原子と一緒になって、４員環、５員環または６員環の複素環を形成し、
Ｒ７は、水素、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、Ｃ２〜Ｃ１８アルケニル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＯＨ、ハロからなる群から選択される。具体的な一実施形態では、ジペプチド要素は、式Ｘの構造を有し、
式中、
Ｒ１およびＲ２は独立に、Ｃ１〜Ｃ１８アルキルまたはアリールであり、
Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ１８アルキルであるか、あるいは、Ｒ３およびＲ４は、これらが結合している原子と一緒になって、４〜１２員環の複素環を形成し、
Ｒ４およびＲ８は独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、アリールからなる群から選択され、
Ｒ５はアミンまたはヒドロキシルである。
もうひとつの具体的な実施形態では、ジペプチド要素は、式Ｘの構造を有し、
式中、
Ｒ１は、水素、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、アリールからなる群から選択されるか、あるいは、Ｒ１およびＲ２は、−（ＣＨ２）ｐ−（式中、ｐは２〜９である）を介して結合し、
Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ１８アルキルであるか、あるいは、Ｒ３およびＲ４は、これらが結合している原子と一緒になって、４〜６員環の複素環を形成し、
Ｒ４およびＲ８は独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、アリールからなる群から選択され、
Ｒ５は、アミンまたはＮ置換アミンである。
もうひとつの具体的な実施形態では、ジペプチド要素は、式Ｘの構造を有し、
式中
Ｒ１およびＲ２は独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、アリールからなる群から選択され、
Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ１８アルキルであるか、あるいは、Ｒ３およびＲ４は、これらが結合している原子と一緒になって、４〜６員環の複素環を形成し、
Ｒ４およびＲ８は各々水素であり、
Ｒ５は、アミン、Ｎ置換アミン、ヒドロキシルからなる群から選択される。
一実施形態では、単鎖インスリン類縁体のプロドラッグ形態は構造ＩＢ−ＬＭ−ＩＡを有し、ここで、ＩＢは、配列Ｊ−Ｒ２３−Ｒ２２−Ｘ２５ＬＣＧＸ２９Ｘ３０ＬＶＸ３３Ｘ３４ＬＸ３６ＬＶＣＧＸ４１Ｘ４２ＧＦＸ４５（配列番号２０）を有し、
ＬＭは、以下の構造
Figure 0005969469
を有し、
ＩＡは、配列ＧＩＶＸ４Ｘ５ＣＣＸ８Ｘ９Ｘ１０ＣＸ１２ＬＸ１４Ｘ１５ＬＸ１７Ｘ１８Ｘ１９ＣＸ２１−Ｒ１３（配列番号２２）を有し、ｍは５〜１５の範囲の整数である。別の実施形態では、ｍは７〜１３の範囲の整数である。
一実施形態では、単鎖インスリン類縁体は、
ａ）Ｊ−Ｒ２３−Ｒ２２−Ｘ２５ＬＣＧＸ２９Ｘ３０ＬＶＸ３３Ｘ３４ＬＹＬＶＣＧＸ４１Ｘ４２ＧＦＸ４５（配列番号２１）−（ＰＥＧ）８−１４−ＧＩＶＸ４Ｘ５ＣＣＸ８Ｘ９Ｘ１０ＣＸ１２ＬＸ１４Ｘ１５ＬＸ１７Ｘ１８Ｘ１９ＣＸ２１−Ｒ１３（配列番号２２）
ｂ）Ｊ−Ｒ２３−Ｒ２２−Ｘ２５ＬＣＧＸ２９Ｘ３０ＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦ（配列番号５３）−（ＰＥＧ）８−１４−ＧＩＶＥＱＣＣＸ８ＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＸ１９ＣＸ２１−Ｒ１３（配列番号５５）
ｃ）Ｊ−Ｒ２３−Ｒ２２−Ｘ２５ＬＣＧＸ２９Ｘ３０ＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦ（配列番号５３）−（ＰＥＧ）８−１４−ＧＩＶＸ４Ｘ５ＣＣＸ８Ｘ９Ｘ１０ＣＸ１２ＬＸ１４Ｘ１５ＬＸ１７Ｘ１８Ｘ１９ＣＸ２１−Ｒ１３（配列番号２２）、
ｄ）Ｊ−Ｒ２３−Ｒ２２−Ｘ２５ＬＣＧＸ２９Ｘ３０ＬＶＸ３３Ｘ３４ＬＹＬＶＣＧＸ４１Ｘ４２ＧＦＸ４５（配列番号２１）−（ＰＥＧ）８−１４−ＧＩＶＥＱＣＣＸ８ＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＸ１９ＣＸ２１−Ｒ１３（配列番号５５）からなる群から選択される配列を有し、
ここで、
Ｊは、Ｈまたは一般構造Ｕ−Ｂを有するジペプチド要素であって、Ｕは、アミノ酸またはヒドロキシ酸であり、Ｂは、アミド結合を介して結合するＮアルキル化アミノ酸であり、
Ｘ４は、グルタミン酸またはアスパラギン酸であり、
Ｘ５はグルタミンまたはグルタミン酸であり、
Ｘ８は、ヒスチジン、スレオニンまたはフェニルアラニンであり、
Ｘ９は、セリン、アルギニン、リジン、オルニチンまたはアラニンであり、
Ｘ１０は、イソロイシンまたはセリンであり、
Ｘ１２はセリンまたはアスパラギン酸であり、
Ｘ１４は、チロシン、アルギニン、リジン、オルニチンまたはアラニンであり、
Ｘ１５は、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、アラニン、リジン、オルニチンまたはロイシンであり、
Ｘ１７は、グルタミン酸またはグルタミンであり、
Ｘ１８は、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸またはスレオニンであり、
Ｘ１９は、以下の一般構造
Figure 0005969469
（式中、Ｘは、ＯＨまたはＮＨＲ１０からなる群から選択され、Ｒ１０は、Ｈまたは一般構造Ｕ−Ｂを有するジペプチド要素であって、Ｕは、アミノ酸またはヒドロキシ酸であり、Ｂは、Ｎアルキル化アミノ酸である）を有するアミノ酸であり、
Ｘ２１は、アラニン、グリシン、セリン、バリン、スレオニン、イソロイシン、ロイシン、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、トリプトファン、チロシン、メチオニンからなる群から選択され、
Ｘ２５は、ヒスチジンまたはスレオニンであり、
Ｘ２９は、アラニン、グリシン、セリンからなる群から選択され、
Ｘ３０は、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸、システイン酸からなる群から選択され、
Ｘ３３は、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸からなる群から選択され、
Ｘ３４は、アラニンおよびスレオニンからなる群から選択され、
Ｘ４１は、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアスパラギンからなる群から選択され、
Ｘ４２は、アラニン、リジン、オルニチン、アルギニンからなる群から選択され、
Ｘ４５は、以下の一般構造
Figure 0005969469
（式中、Ｘ１３は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨＲ１２からなる群から選択され、Ｒ１２は、Ｈまたは一般構造Ｕ−Ｂを有するジペプチド要素である）を有するアミノ酸であり、
Ｒ２２は、ＡＹＲＰＳＥ（配列番号１４）、ＦＶＮＱ（配列番号１２）、ＰＧＰＥ（配列番号１１）、トリペプチドであるグリシン−プロリン−グルタミン酸、トリペプチドであるバリン−アスパラギン−グルタミン、ジペプチドであるプロリン−グルタミン酸、ジペプチドであるアスパラギン−グルタミン、グルタミン、グルタミン酸、結合からなる群から選択され、
Ｒ２３は、結合であるか、Ｇ（Ｘ６０）ｄ（Ｘ６１）ｇＫ（配列番号１９１）であり、
ここで、Ｘ６０、Ｘ６１は独立に、グルタミン酸またはアスパラギン酸であり、
ｄおよびｇは、独立に１〜６の範囲の整数であり、
Ｒ１３は、ＣＯＯＨまたはＣＯＮＨ２である。本明細書で使用する場合、「（ＰＥＧ）ｎ」の表示は、括弧の外側にある下付きの数字または数字の範囲で表示した数のモノマーを有するポリエチレングリコールを示すことを意図する。一実施形態では、ＪはＨであり、Ｘ４５はフェニルアラニンまたはチロシンである。別の実施形態では、Ｒ２３は結合であるか、ＧＸ６０Ｘ６１Ｘ６２Ｘ６３Ｘ６４Ｋ（配列番号１９３であり、Ｘ６０、Ｘ６１、Ｘ６２、Ｘ６３、Ｘ６４は独立に、グルタミン酸またはアスパラギン酸である。
一実施形態によれば、単鎖インスリン類縁体のプロドラッグ形態は、構造ＩＢ−ＬＭ−ＩＡを有し、ここで、ＩＢは、配列Ｒ２２ＨＬＣＧＳＸ３０ＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧ ＥＲＧＦＦ（配列番号１５４）またはＸ２２ＶＮＱＸ２５ＬＣＧＸ２９Ｘ３０ＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴ−Ｚ１−Ｂ１（配列番号５４）を有し、
ＬＭは、本明細書に開示するような橋渡し部分であり、ＩＡは、配列ＧＩＶＥＱＣＣＸ８ＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＸ１９ＣＸ２１−Ｒ１３（配列番号５５）またはＧＩＶＸ４ＥＣＣＸ８Ｘ９ＳＣＤＬＸ１４Ｘ１５ＬＸ１７Ｘ１８Ｘ１９ＣＸ２１−Ｒ１３（配列番号１９）を有し、ここで、
Ｘ４は、グルタミン酸またはアスパラギン酸であり、
Ｘ８は、ヒスチジン、スレオニンまたはフェニルアラニンであり、
Ｘ９は、アルギニン、リジン、オルニチンまたはアラニンであり、
Ｘ１４は、アルギニン、リジン、オルニチンまたはアラニンであり、
Ｘ１５は、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、アラニン、リジン、オルニチンまたはロイシンであり、
Ｘ１７は、グルタミン酸またはグルタミンであり、
Ｘ１８は、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸またはスレオニンであり、
Ｘ１９は、以下の一般構造
Figure 0005969469
（式中、
ｍ１は１〜３の範囲の整数であり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ８は独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、Ｃ２〜Ｃ１８アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ１８アルキル）ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ１８アルキル）ＳＨ、（Ｃ２〜Ｃ３アルキル）ＳＣＨ３、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨＣ（ＮＨ２ ＋）ＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ２〜Ｃ５複素環）、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ９ヘテロアリール）、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル（Ｗ１）Ｃ１〜Ｃ１２アルキルからなる群から選択され、Ｗ１は、Ｎ、Ｓ、Ｏからなる群から選択されるヘテロ原子であるか、あるいは、Ｒ１およびＲ２は、これらが結合している原子と一緒になって、Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキルを形成するか、あるいは、Ｒ４およびＲ８は、これらが結合している原子と一緒になって、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキルを形成し、
Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、（Ｃ１〜Ｃ１８アルキル）ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ１８アルキル）ＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ１８アルキル）ＳＨ、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ２〜Ｃ５複素環）、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群から選択されるか、あるいは、Ｒ４およびＲ３は、これらが結合している原子と一緒になって、４員環、５員環または６員環の複素環を形成し、
Ｒ５は、ＮＨＲ６またはＯＨであり、
Ｒ６は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ８アルキルであるか、あるいは、Ｒ６およびＲ１は、これらが結合している原子と一緒になって、４員環、５員環または６員環の複素環を形成し、
Ｒ７は、水素、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、Ｃ２〜Ｃ１８アルケニル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＯＨ、ハロからなる群から選択される；
Ｘ２１は、アラニン、グリシン、セリン、バリン、スレオニン、イソロイシン、ロイシン、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、トリプトファン、チロシン、メチオニンからなる群から選択される）を有するアミノ酸であり、
Ｘ２２は、フェニルアラニンおよびデスアミノフェニルアラニンからなる群から選択され、
Ｘ２３は、アスパラギンまたはグリシンであり、
Ｘ２５は、ヒスチジンまたはスレオニンであり、
Ｘ２９は、アラニン、グリシン、セリンからなる群から選択され、
Ｘ３０は、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸、システイン酸からなる群から選択され、
Ｚ１は、アスパラギン酸−リジン、リジン−プロリン、プロリン−リジンからなる群から選択されるジペプチドであり、
Ｂ１は、スレオニン、アラニンまたはスレオニン−アルギニン−アルギニントリペプチドからなる群から選択され、
Ｒ２２は、Ｘ２２ＶＮＱ（配列番号８４）、トリペプチドであるバリン−アスパラギン−グルタミン、ジペプチドであるアスパラギン−グルタミン、グルタミン、Ｎ末端のアミンからなる群から選択され、
Ｒ１３は、ＣＯＯＨまたはＣＯＮＨ２である。一実施形態では、ｍ１は１である。一実施形態によれば、単鎖インスリン類縁体は構造ＩＢ−ＬＭ−ＩＡを有し、ここで、ＩＢは、配列Ｘ２２ＶＮＱＸ２５ＬＣＧＸ２９Ｘ３０ＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴ−Ｚ１−Ｂ１（配列番号５４）を有し、ＬＭは、本明細書に開示するような橋渡し部分であり、ＩＡは、配列ＧＩＶＸ４ＥＣＣＸ８Ｘ９ＳＣＤＬＸ１４Ｘ１５ＬＸ１７Ｘ１８Ｘ１９ＣＸ２１−Ｒ１３（配列番号１９）を有する。
一実施形態では、単鎖インスリン類縁体は、式ＩＢ−ＬＭ−ＩＡの化合物を有し、ここで、ＩＢは、配列ＧＰＥＴＬＣＧＸ２６ＥＬＶＤＸ２７ＬＹＬＶＣＧＤＸ４２ＧＦＹＦＮＫＰＴ−Ｒ１４（配列番号１９７）を有するＩＧＦ ＹＬのＢ鎖を示し、ここで、Ｘ２６およびＸ２７は各々アラニンであり、Ｘ４２は、アルギニンであるか、あるいは、ＧＰＥＴＬＣＧＡＥＬＶＤＡＬＹＬＶＣＧＤＲＧＦＹＦＮＰＫＴ（配列番号８９）であり、ＬＭは、本明細書に開示の橋渡し部分を示し、ＩＡは、配列ＧＩＶＤＥＣＣＨＲＳＣＤＬＲＲＬＥＭＸ１９ＣＡ−Ｒ１３（配列番号１５５）またはＧＩＶＤＥＣＣＨＯＳＣＤＬＯＯＬＱＭＸ１９ＣＮ−Ｒ１３（配列番号７５）または天然のインスリン配列ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＸ１９ＣＮ−Ｒ１３（配列番号１９４）を有するＩＧＦのＡ鎖を示し、ここで、
Ｘ８は、ヒスチジンまたはフェニルアラニンであり、
Ｘ１９は、以下の一般構造
Figure 0005969469
（式中、Ｘは、ＯＨまたはＮＨＲ１０からなる群から選択され、Ｒ１０は、以下の一般構造
Figure 0005969469
＜式中、
Ｒ１は、ＨおよびＣ１〜Ｃ８アルキルからなる群から選択され、
Ｒ２およびＲ４は独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＳＨ、（Ｃ２〜Ｃ３アルキル）ＳＣＨ３、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨＣ（ＮＨ２ ＋）ＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７、ＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群から選択されるか、あるいは、Ｒ１およびＲ２は、これらが結合している原子と一緒になって、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキルを形成し、
Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＳＨ、（Ｃ３〜Ｃ６）シクロアルキルからなる群から選択されるか、あるいは、Ｒ４およびＲ３は、これらが結合している原子と一緒になって、５員環または６員環の複素環を形成し、
Ｒ５は、ＮＨＲ６またはＯＨであり、
Ｒ６はＨであるか、あるいは、Ｒ６およびＲ２は、これらが結合している原子と一緒になって、５員環または６員環の複素環を形成し、
Ｒ７は、ＨおよびＯＨからなる群から選択される、
Ｒ８はＨである＞を有するジペプチドであり、
Ｒ１３およびＲ１４は独立に、ＣＯＯＨまたはＣＯＮＨ２である）を有するアミノ酸である。また、本発明は、本明細書に開示の橋渡し部分によって、式ＩＢ−ＬＭ−ＩＡの単鎖インスリン類縁体として結合した、本明細書に開示のインスリン類縁体のＡ鎖ペプチドとＢ鎖ペプチドとの組み合わせも包含する。
＜ジペプチドプロドラッグ要素＞
ジペプチドプロドラッグ要素の置換基ならびに、単鎖インスリン類縁体への結合部位は、本明細書に開示の単鎖インスリン類縁体のプロドラッグ類縁体の所望の半減期が得られるように選択可能である。たとえば、以下の構造を有するジペプチドプロドラッグ要素が単鎖インスリン類縁体Ｂ鎖のＮ末端のアミノ酸のαアミノ基に結合する場合、ＰＢＳ中にて生理的条件下でｔ１／２が約１時間である化合物が提供される。
Figure 0005969469
（式中、
Ｒ１およびＲ２は独立に、Ｃ１〜Ｃ１８アルキルまたはアリールであるか、あるいは、Ｒ１およびＲ２は、−（ＣＨ２）ｐ−（式中、ｐは２〜９である）を介して結合し、
Ｒ３はＣ１〜Ｃ１８アルキルであり、
Ｒ４およびＲ８は各々水素であり、
Ｒ５はアミンである。）
他の実施形態では、Ｎ末端で結合し、ｔ１／２がたとえば約１時間であるプロドラッグは、以下の構造のジペプチドプロドラッグ要素を有する。
Figure 0005969469
（式中、
Ｒ１およびＲ２は独立に、Ｃ１〜Ｃ１８アルキルまたは（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７であるか、あるいは、Ｒ１およびＲ２は、−（ＣＨ２）ｐ（式中、ｐは２〜９である）を介して結合し、
Ｒ３はＣ１〜Ｃ１８アルキルであり、
Ｒ４およびＲ８は各々水素であり、
Ｒ５はＮＨ２であり、
Ｒ７は、水素、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、Ｃ２〜Ｃ１８アルケニル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＯＨ、ハロからなる群から選択され、
Ｒ８はＨである。）
あるいは、一実施形態では、ジペプチドプロドラッグが単鎖インスリン類縁体Ｂ鎖のＮ末端のアミノ酸のαアミノ基に結合し、プロドラッグのｔ１／２がＰＢＳ中にて生理的条件下で約６〜約２４時間である単鎖インスリン類縁体プロドラッグ誘導体が提供される。一実施形態では、ＰＢＳ中にて生理的条件下でｔ１／２が約６〜約２４時間である単鎖インスリン類縁体プロドラッグ誘導体が提供され、このプロドラッグ要素は、式Ｘの構造を有し、
Ｒ１およびＲ２は独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、アリールからなる群から選択されるか、あるいはＲ１およびＲ２は、−（ＣＨ２）ｐ−（式中、ｐは２〜９である）を介して結合し、
Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ１８アルキルであるか、あるいは、Ｒ３およびＲ４は、これらが結合している原子と一緒になって、４〜１２員環の複素環を形成し、
Ｒ４およびＲ８は独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、アリールからなる群から選択され、
Ｒ５はアミンであるが、ただし、Ｒ１およびＲ２はともに水素ではなく、Ｒ４またはＲ８のうちの一方が水素である。
別の実施形態では、ジペプチドプロドラッグが単鎖インスリン類縁体Ｂ鎖のＮ末端のアミノ酸のαアミノ基に結合し、プロドラッグのｔ１／２がＰＢＳ中にて生理的条件下で約７２〜約１６８時間である単鎖インスリン類縁体プロドラッグ誘導体が提供される。一実施形態では、ＰＢＳ中にて生理的条件下でｔ１／２が約７２〜約１６８時間である単鎖インスリン類縁体プロドラッグ誘導体が提供され、このプロドラッグ要素は式Ｘの構造を有し、
Ｒ１は、水素、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、アリールからなる群から選択され、
Ｒ２はＨであり、
Ｒ３はＣ１〜Ｃ１８アルキルであり、
Ｒ４およびＲ８は各々水素であり、
Ｒ５は、アミンまたはＮ置換アミンまたはヒドロキシルであるが、
ただし、Ｒ１がアルキルまたはアリールである場合、Ｒ１およびＲ５は、これらが結合している原子と一緒になって、４〜１１員環の複素環を形成する。
いくつかの実施形態では、単鎖インスリン類縁体Ｂ鎖ペプチドのＮ末端のαアミノ酸に結合し、ｔ１／２がたとえば、約１２〜約７２時間またはいくつかの実施形態では、約１２〜約４８時間であるジペプチドプロドラッグ要素を有するプロドラッグは、以下の構造のジペプチドプロドラッグ要素を有する。
Figure 0005969469
式中、Ｒ１およびＲ２は独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、（Ｃ１〜Ｃ１８アルキル）ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７からなる群から選択されるか、あるいは、Ｒ１およびＲ２は、（ＣＨ２）ｐ（式中、ｐは２〜９である）を介して結合し、
Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ１８アルキルであるか、あるいは、Ｒ３およびＲ４は、これらが結合している原子と一緒になって、４〜１２員環の複素環を形成し、
Ｒ４およびＲ８は独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７からなる群から選択され、
Ｒ５はＮＨ２であり、
Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、Ｃ２〜Ｃ１８アルケニル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＯＨ、ハロからなる群から選択されるが、
ただし、Ｒ１およびＲ２はともに水素ではなく、かつ、Ｒ４またはＲ８のうちの少なくとも一方は水素である。
いくつかの実施形態では、単鎖インスリン類縁体Ｂ鎖ペプチドのＮ末端のアミノ酸に結合したジペプチドプロドラッグ要素を有し、ｔ１／２がたとえば、約１２〜約７２時間またはいくつかの実施形態では約１２〜約４８時間であるプロドラッグ、以下の構造のジペプチドプロドラッグ要素を有する。
Figure 0005969469
式中、Ｒ１およびＲ２は独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２からなる群から選択されるか、あるいは、Ｒ１およびＲ２は、（ＣＨ２）ｐ（式中、ｐは２〜９である）を介して結合し、
Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ８アルキルであるか、あるいは、Ｒ３およびＲ４は、これらが結合している原子と一緒になって、４〜６員環の複素環を形成し、
Ｒ４は、水素およびＣ１〜Ｃ８アルキルからなる群から選択され、
Ｒ５はＮＨ２であるが、
ただし、Ｒ１およびＲ２はともに水素ではない。
他の実施形態では、単鎖インスリン類縁体Ｂ鎖ペプチドのＮ末端のアミノ酸に結合したジペプチドプロドラッグ要素を有し、ｔ１／２がたとえば、約１２〜約７２時間またはいくつかの実施形態では約１２〜約４８時間であるプロドラッグ、以下の構造のジペプチドプロドラッグ要素を有する。
Figure 0005969469
式中、
Ｒ１およびＲ２は独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２からなる群から選択され、
Ｒ３はＣ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｒ４は水素であり、
Ｒ５はＮＨ２であるが、
ただし、Ｒ１およびＲ２はともに水素ではない。
いくつかの実施形態では、単鎖インスリン類縁体Ｂ鎖ペプチドのＮ末端のアミノ酸に結合したジペプチドプロドラッグ要素を有し、ｔ１／２がたとえば、約１２〜約７２時間またはいくつかの実施形態では約１２〜約４８時間であるプロドラッグ、以下の構造のジペプチドプロドラッグ要素を有する。
Figure 0005969469
式中、
Ｒ１およびＲ２は独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２からなる群から選択されるか、あるいは、Ｒ１およびＲ２は、（ＣＨ２）ｐ（式中、ｐは２〜９である）を介して結合し、
Ｒ３はＣ１〜Ｃ８アルキルであり、
Ｒ４は、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７であり、
Ｒ５はＮＨ２であり、
Ｒ７は、水素、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＯＨからなる群から選択されるが、
ただし、Ｒ１およびＲ２はともに水素ではない。
また、単鎖インスリン類縁体のＮ末端のαアミノ酸に結合したジペプチドプロドラッグ要素を有し、ｔ１／２がたとえば、約７２〜約１６８時間であるプロドラッグが提供され、このジペプチドプロドラッグ要素は、以下の構造を有する。
Figure 0005969469
式中、Ｒ１は、水素、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７からなる群から選択され、
Ｒ３はＣ１〜Ｃ１８アルキルであり、
Ｒ４およびＲ８は各々水素であり、
Ｒ５は、ＮＨＲ６またはＯＨであり、
Ｒ６は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ８アルキルであるか、あるいは、Ｒ６およびＲ１は、これらが結合している原子と一緒になって、４員環、５員環または６員環の複素環を形成し、
Ｒ７は、水素、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、Ｃ２〜Ｃ１８アルケニル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＯＨ、ハロからなる群から選択され、
ただし、Ｒ１がアルキルまたは（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７である場合、Ｒ１およびＲ５は、これらが結合している原子と一緒になって、４〜１１員環の複素環を形成する。
いくつかの実施形態では、ジペプチドプロドラッグ要素は、単鎖インスリン類縁体の末端以外のアミノ酸の側鎖のアミンに結合する。この実施形態では、ｔ１／２がたとえば約１時間のプロドラッグは、以下の構造を有する。
Figure 0005969469
式中、
Ｒ１およびＲ２は独立に、Ｃ１〜Ｃ８アルキルまたは（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７であるか、あるいは、Ｒ１およびＲ２は、−（ＣＨ２）ｐ−（式中、ｐは２〜９である）を介して結合し、
Ｒ３はＣ１〜Ｃ１８アルキルであり、
Ｒ４およびＲ８は各々水素であり、
Ｒ５はＮＨ２であり、
Ｒ７は、水素、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、Ｃ２〜Ｃ１８アルケニル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＯＨ、ハロからなる群から選択される。
さらに、ｔ１／２がたとえば約６〜約２４時間であり、末端以外のアミノ酸の側鎖に結合したジペプチドプロドラッグ要素を有するプロドラッグが提供され、このプロドラッグは、以下の構造のジペプチドプロドラッグ要素を有する。
Figure 0005969469
式中、Ｒ１およびＲ２は独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７からなる群から選択されるか、あるいは、Ｒ１およびＲ２は、−（ＣＨ２）ｐ−（式中、ｐは２〜９である）を介して結合し、
Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ１８アルキルであるか、あるいは、Ｒ３およびＲ４は、これらが結合している原子と一緒になって、４〜１２員環の複素環を形成し、
Ｒ４およびＲ８は独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ１８アルキルまたは（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７であり、
Ｒ５はＮＨＲ６であり、
Ｒ６は、ＨまたはＣ１〜Ｃ８アルキルであり、またはＲ６およびＲ２は、これらが結合している原子と一緒になって、４員環、５員環または６員環の複素環を形成し、
Ｒ７は、水素、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、Ｃ２〜Ｃ１８アルケニル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＯＨ、ハロからなる群から選択される；
ただし、Ｒ１およびＲ２はともに水素ではなく、かつ、Ｒ４またはＲ８のうちの少なくとも一方は水素である。
また、ｔ１／２がたとえば約７２〜約１６８時間であり、単鎖インスリン類縁体の末端以外のアミノ酸の側鎖に結合したジペプチドプロドラッグ要素を有するプロドラッグが提供され、このジペプチドプロドラッグ要素は、以下の構造を有する。
Figure 0005969469
式中、
Ｒ１は、水素、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７からなる群から選択され、
Ｒ３はＣ１〜Ｃ１８アルキルであり、
Ｒ４およびＲ８は各々水素であり、
Ｒ５は、ＮＨＲ６またはＯＨであり、
Ｒ６は、ＨまたはＣ１〜Ｃ８アルキルであるか、あるいは、Ｒ６およびＲ１は、これらが結合している原子と一緒になって、４員環、５員環または６員環の複素環を形成し、
Ｒ７は、水素、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、Ｃ２〜Ｃ１８アルケニル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＯＨ、ハロからなる群から選択されるが、ただし、Ｒ１およびＲ２がともに独立にアルキルまたは（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７である場合、Ｒ１またはＲ２のいずれかが（ＣＨ２）ｐを介してＲ５に結合する（式中、ｐは２〜９である）。
いくつかの実施形態では、ジペプチドプロドラッグ要素は、単鎖インスリン類縁体の末端以外のアミノ酸の側鎖のアミンに結合し、この末端以外のアミノ酸は、以下の式Ｖの構造を有する。
Figure 0005969469
式中、
ｎは、１〜４から選択される整数である。いくつかの実施形態では、ｎは３または４であり、いくつかの実施形態では、末端以外のアミノ酸はリジンである。いくつかの実施形態では、ジペプチドプロドラッグ要素は、単鎖インスリン類縁体のＢ鎖の２８番目または２９番目にあるアミノ酸の側鎖の第１級アミンに結合する。
式Ｘのジペプチドプロドラッグ要素が芳香族アミノ酸のアリール基のアミノ置換基、プロドラッグに結合する実施形態では、プロドラッグ要素の置換基は、所望の活性化時間を得られるように選択可能である。たとえば、以下の式ＩＶの構造のアミノ酸を有する本明細書に開示の単鎖インスリン類縁体のプロドラッグ類縁体の半減期（式中、ｍ１は０から３の整数である）は、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ８の置換基を変えることで選択可能である。
Figure 0005969469
一実施形態では、式Ｖのアミノ酸は、天然のインスリンのＡ１９、Ｂ１６またはＢ２５の位置に対応するアミノ酸に存在し、具体的な一例では、式Ｖのアミノ酸は、単鎖インスリン類縁体のＡ１９の位置にあって、ｍ１は１である。一実施形態では、式ＩＶの構造を有し、ＰＢＳ中にて生理的条件下でｔ１／２が約１時間である単鎖インスリン類縁体プロドラッグ誘導体が提供される。一実施形態では、ＰＢＳ中にて生理的条件下でｔ１／２が約１時間である単鎖インスリン類縁体プロドラッグ誘導体は、式ＩＶの構造を有する。
式中、
Ｒ１およびＲ２は独立に、Ｃ１〜Ｃ１８アルキルまたはアリールであり、
Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ１８アルキルであるか、あるいは、Ｒ３およびＲ４は、これらが結合している原子と一緒になって、４〜１２員環の複素環を形成し、
Ｒ４およびＲ８は独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、アリールからなる群から選択され、
Ｒ５は、アミンまたはヒドロキシルである。一実施形態では、ｍ１は１である。
一実施形態では、ジペプチドプロドラッグ要素は、単鎖インスリン類縁体の芳香族アミノ酸のアリール基に存在するアミンを介して単鎖インスリン類縁体に結合し、このプロドラッグは、ｔ１／２がたとえば約１時間であり、以下のジペプチド構造を有する。
Figure 0005969469
式中、Ｒ１およびＲ２は独立に、Ｃ１〜Ｃ１８アルキルまたは（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７であり、
Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ１８アルキルであるか、あるいは、Ｒ３およびＲ４は、これらが結合している原子と一緒になって、４〜１２員環の複素環を形成し、
Ｒ４およびＲ８は独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７からなる群から選択され、
Ｒ５は、ＮＨ２またはＯＨであり、
Ｒ７は、水素、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、Ｃ２〜Ｃ１８アルケニル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＯＨ、ハロからなる群から選択される。
もうひとつの実施形態では、式ＩＶの構造を有し、ＰＢＳ中にて生理的条件下でｔ１／２が約６〜約２４時間である単鎖インスリン類縁体プロドラッグ誘導体（式中、ｍ１は０〜３の整数である）が提供される。一実施形態では、ＰＢＳ中にて生理的条件下でｔ１／２が約６〜約２４時間である単鎖インスリン類縁体プロドラッグは、式ＩＶの構造を有する。
式中、
Ｒ１は、水素、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、アリールからなる群から選択されるか、あるいは、Ｒ１およびＲ２は、−（ＣＨ２）ｐ−（式中、ｐは２〜９である）を介して結合し、
Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ１８アルキルであるか、あるいは、Ｒ３およびＲ４は、これらが結合している原子と一緒になって、４〜６員環の複素環を形成し、
Ｒ４およびＲ８は独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、アリールからなる群から選択され、
Ｒ５は、アミンまたはＮ置換アミンである。一実施形態では、ｍ１は１である。
一実施形態では、芳香族アミノ酸を介して結合したジペプチドプロドラッグ要素を有し、ｔ１／２がたとえば、約６〜約２４時間であるプロドラッグが提供され、このジペプチドは、以下の構造を有する。
Figure 0005969469
式中、
Ｒ１は、水素、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、（Ｃ１〜Ｃ１８アルキル）ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７からなる群から選択され、
Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ１８アルキルであるか、あるいは、Ｒ３およびＲ４は、これらが結合している原子と一緒になって、４〜６員環の複素環を形成し、
Ｒ４およびＲ８は独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７からなる群から選択され、
Ｒ５はＮＨＲ６であり、
Ｒ６は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ８アルキルであるか、あるいは、Ｒ６およびＲ１は、これらが結合している原子と一緒になって、４員環、５員環または６員環の複素環を形成し、
Ｒ７は、水素、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、Ｃ２〜Ｃ１８アルケニル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＯＨ、ハロからなる群から選択される。
もうひとつの実施形態では、式ＩＶの構造を有し（式中、ｍ１は０〜３の整数である）、ＰＢＳ中にて生理的条件下でｔ１／２が約７２〜約１６８時間である単鎖インスリン類縁体プロドラッグ誘導体が提供される。一実施形態では、ＰＢＳ中にて生理的条件下でｔ１／２が約７２〜約１６８時間である単鎖インスリン類縁体プロドラッグ誘導体は、式ＩＶの構造を有し、
式中、
Ｒ１およびＲ２は独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、アリールからなる群から選択され、
Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ１８アルキルであるか、あるいは、Ｒ３およびＲ４は、これらが結合している原子と一緒になって、４〜６員環の複素環を形成し、
Ｒ４およびＲ８は各々水素であり、
Ｒ５は、アミン、Ｎ置換アミン、ヒドロキシルからなる群から選択される。一実施形態では、ｍ１は１である。
一実施形態では、芳香族アミノ酸を介して結合したジペプチドプロドラッグ要素を有し、ｔ１／２がたとえば、約７２〜約１６８時間であるプロドラッグが提供され、このジペプチドは、以下の構造を有する。
Figure 0005969469
式中、Ｒ１およびＲ２は独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７からなる群から選択されるか、あるいは、Ｒ１およびＲ５は、これらが結合している原子と一緒になって、４〜１１員環の複素環を形成し、
Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ１８アルキルであるか、あるいは、Ｒ３およびＲ４は、これらが結合している原子と一緒になって、４〜６員環の複素環を形成し、
Ｒ４は水素であるか、Ｒ３とともに４〜６員環の複素環を形成し、
Ｒ８は水素であり、
Ｒ５は、ＮＨＲ６またはＯＨであり、
Ｒ６は、ＨまたはＣ１〜Ｃ８アルキルであるか、あるいは、Ｒ６およびＲ１は、これらが結合している原子と一緒になって、４員環、５員環または６員環の複素環を形成し、
Ｒ７は、水素、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、Ｃ２〜Ｃ１８アルケニル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＯＨ、ハロからなる群から選択される。
一実施形態によれば、単鎖インスリン類縁体がインスリン受容体またはＩＧＦ−１受容体と相互作用する機能に干渉する大きなポリマーを含むように、式Ｘのジペプチドをさらに修飾する。その後、ジペプチドを切断すると、ジペプチド複合体から単鎖インスリン類縁体が放出され、この放出された単鎖インスリン類縁体は完全に活性がある。一実施形態によれば、結合した単鎖インスリン類縁体がインスリン受容体またはＩＧＦ−１受容体と相互作用する機能に干渉する大きなポリマーを含むように、式Ｘのジペプチドをさらに修飾する。一実施形態によれば、単鎖インスリン類縁体は、式Ｘの一般構造のジペプチドを有する。
Figure 0005969469
ここで、式Ｘのジペプチドのアミノ酸側鎖のうちの１つが、ＰＥＧ化またはアシル化される。
一実施形態では、構造ＩＢ−ＬＭ−ＩＡを有する単鎖インスリン類縁体が提供され、ここで、ＩＢは、配列Ｊ−Ｒ２３−Ｒ２２−Ｘ２５ＬＣＧＸ２９Ｘ３０ＬＶＸ３３Ｘ３４ＬＸ３６ＬＶＣＧＸ４１Ｘ４２ＧＦＸ４５（配列番号２０）を有し、
ＬＭは、上述したような橋渡し部分を有し、
ＩＡは、配列ＧＩＶＸ４Ｘ５ＣＣＸ８Ｘ９Ｘ１０ＣＸ１２ＬＸ１４Ｘ１５ＬＥＸ１８Ｘ１９ＣＸ２１−Ｒ１３（配列番号１５２）を有し、
ＪはＨであるか、式Ｘのジペプチド要素であり、
Ｘ４は、グルタミン酸またはアスパラギン酸であり、
Ｘ５はグルタミンまたはグルタミン酸であり、
Ｘ８は、ヒスチジン、スレオニンまたはフェニルアラニンであり、
Ｘ９は、セリン、アルギニン、リジン、オルニチンまたはアラニンであり、
Ｘ１０は、イソロイシンまたはセリンであり、
Ｘ１２はセリンまたはアスパラギン酸であり、
Ｘ１４は、チロシン、アルギニン、リジン、オルニチンまたはアラニンであり、
Ｘ１５は、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、アラニン、リジン、オルニチンまたはロイシンであり、
Ｘ１８は、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸またはスレオニンであり、
Ｘ１９は、以下の一般構造
Figure 0005969469
（式中、Ｘは、ＯＨまたはＮＨＲ１０からなる群から選択され、Ｒ１０は、Ｈであるか、式Ｘの一般構造を有するジペプチド要素である）を有するアミノ酸であり、
Ｘ２１は、アラニン、グリシン、セリン、バリン、スレオニン、イソロイシン、ロイシン、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、トリプトファン、チロシン、メチオニンからなる群から選択され、
Ｘ２５は、ヒスチジンまたはスレオニンであり、
Ｘ２９は、アラニン、グリシン、セリンからなる群から選択され、
Ｘ３０は、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸、システイン酸からなる群から選択され、
Ｘ３３は、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸からなる群から選択され、
Ｘ３４は、アラニンおよびスレオニンからなる群から選択され、
Ｘ４１は、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアスパラギンからなる群から選択され、
Ｘ４２は、アラニン、リジン、オルニチン、アルギニンからなる群から選択され、
Ｘ４５は、以下の一般構造
Figure 0005969469
（式中、Ｘ１３は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨＲ１２からなる群から選択され、Ｒ１２は、Ｈであるか、式Ｘの一般構造を有するジペプチド要素である）を有するアミノ酸であり、
Ｒ２２は、ＡＹＲＰＳＥ（配列番号１４）、ＦＶＮＱ（配列番号１２）、ＰＧＰＥ（配列番号１１）、トリペプチドであるグリシン−プロリン−グルタミン酸、トリペプチドであるバリン−アスパラギン−グルタミン、ジペプチドであるプロリン−グルタミン酸、ジペプチドであるアスパラギン−グルタミン、グルタミン、グルタミン酸、Ｎ末端のアミンからなる群から選択され、
Ｒ２３は、結合であるか、あるいは、Ｇ（Ｘ６０）ｄ（Ｘ６１）ｇＫ（配列番号１９１）であり、
ここで、Ｘ６０、Ｘ６１は独立に、グルタミン酸またはアスパラギン酸であり、
ｄおよびｇは独立に１〜６の範囲の整数であり、
Ｒ１３はＣＯＯＨまたはＣＯＮＨであり、さらに式Ｘのジペプチドは、アシル化またはＰＥＧ化される。一実施形態では、Ｊは、アシル化またはＰＥＧ化された式Ｘのジペプチドを有する。
生理的ｐＨでの水溶液に対するペプチドの溶解性を改善しつつ、腎臓によるペプチドの排出を防止してペプチドが有効な時間を長くするために、本明細書に開示の単鎖インスリン類縁体およびそれらのプロドラッグ誘導体をさらに修飾してもよい。ペプチドは、血漿タンパク質と比較すると分子の大きさが比較的小さいため、容易に排出される。ペプチドの分子量を４０ｋＤａよりも大きくすると、腎臓の閾値を超え、血漿中にとどまる時間が有意に長くなる。よって、一実施形態では、共有結合した親水体を含むようにペプチドプロドラッグをさらに修飾する。
一実施形態では、親水体は、血漿タンパク質、ポリエチレングリコール鎖または免疫グロブリンのＦｃ部分である。よって、一実施形態では、アミノ酸の側鎖に共有結合した１つまたは２つ以上の親水基を含むように、本明細書に開示のインスリン類縁体をさらに修飾する。
一実施形態によれば、親水体を、Ｂ鎖のＮ末端のアミノ酸またはＢ鎖のカルボキシ末端（たとえば、配列番号８９の２８番目の位置など）に位置するリジンアミノ酸（または他の好適なアミノ酸）の側鎖のいずれかに結合することで、本明細書に開示のインスリンプロドラッグをさらに修飾する。一実施形態では、親水体をペプチドリンカーの側鎖に結合することで橋渡し部分のアミノ酸のうちの１つが修飾された単鎖インスリンプロドラッグ誘導体が提供される。一実施形態では、修飾されたアミノ酸は、システイン、リジンまたはアセチルフェニルアラニンである。
一実施形態によれば、式Ｘのジペプチド要素が、ポリエチレングリコール、アルキルまたはアシル基をさらに有する、単鎖インスリン類縁体のプロドラッグ誘導体が提供される。一実施形態では、１つまたは２つ以上のポリエチレングリコール鎖が、式Ｘのジペプチドに結合し、ポリエチレングリコール鎖の合計分子量は約２０，０００〜約８０，０００ダルトンまたは４０，０００〜８０，０００ダルトンまたは４０，０００〜６０，０００ダルトンである。一実施形態では、分子量が約４０，０００ダルトンの少なくとも１つのポリエチレングリコール鎖を式Ｘのジペプチドに結合する。もうひとつの実施形態では、血清アルブミンを結合し、投与時にＩＧＦＢ１６Ｂ１７類縁体ペプチドを不活性化するために、式Ｘのジペプチドを十分な大きさのアシル基でアシル化する。アシル基は、直鎖状であっても分岐状であってもよく、一実施形態では、Ｃ１６〜Ｃ３０脂肪酸である。たとえば、アシル基は、Ｃ１６脂肪酸、Ｃ１８脂肪酸、Ｃ２０脂肪酸、Ｃ２２脂肪酸、Ｃ２４脂肪酸、Ｃ２６脂肪酸、Ｃ２８脂肪酸またはＣ３０脂肪酸のいずれであってもよい。いくつかの実施形態では、アシル基は、Ｃ１６〜Ｃ２０脂肪酸であり、たとえば、Ｃ１８脂肪酸またはＣ２０脂肪酸である。
もうひとつの実施形態では、単鎖インスリン類縁体ペプチドのＡ鎖のアミノ末端またはカルボキシ末端あるいはＢ鎖のアミノ末端に、修飾されたアミノ酸を付加して、本明細書に開示の単鎖インスリン類縁体ペプチドおよびそれらのプロドラッグ類縁体をさらに修飾する。この場合、付加されるアミノ酸は、アミノ酸に結合する親水体を有するように修飾される。一実施形態では、Ｃ末端に付加されるアミノ酸は、修飾されたシステイン、リジンまたはアセチルフェニルアラニンである。一実施形態では、親水体は、血漿タンパク質、ポリエチレングリコール鎖、免疫グロブリンのＦｃ部分からなる群から選択される。
一実施形態では、親水基はポリエチレングリコール鎖であり、一実施形態では、２つまたは３つ以上のポリエチレングリコール鎖が、単鎖インスリン類縁体の２つまたは３つ以上のアミノ酸の側鎖に共有結合する。一実施形態によれば、親水体は、（天然のインスリンの位置を基準に）Ａ１０、Ｂ２８、Ｂ２９、Ａ鎖のＣ末端またはＢ鎖のＮ末端に対応する位置で、本明細書に開示の単鎖インスリン類縁体のアミノ酸の側鎖に共有結合する。複数のポリエチレングリコール鎖を有する単鎖インスリン類縁体およびそれらのプロドラッグ誘導体の場合、ポリエチレングリコール鎖は、Ｂ鎖のＮ末端のアミノ酸またはＢ鎖のカルボキシ末端にあるリジンアミノ酸の側鎖に、あるいは、ペプチドのＣ末端に単一のアミノ酸を加えることで結合可能であり、ここで、付加されるアミノ酸は、その側鎖に結合したポリエチレングリコール鎖を有する。一実施形態によれば、ジペプチドプロドラッグ要素を有する、ポリエチレングリコール鎖または他の親水体が２つのアミノ酸のうちの一方の側鎖に結合したプロドラッグ誘導体が提供される。一実施形態では、ジペプチドプロドラッグ要素は、ポリエチレングリコール鎖がリジンの側鎖のアミンに結合した状態で、リジンを有する（Ｄ型またはＬ型の立体異性体の立体配置をとる）。
一実施形態によれば、アミノ酸置換によって、本明細書に開示の単鎖インスリン類縁体ペプチドまたはそれらのプロドラッグ誘導体をさらに修飾する。ここで、置換するアミノ酸は、たとえば、ポリエチレングリコールなどの親水体との架橋に適した側鎖を有する。たとえば、一実施形態では、天然のインスリンのＡ５、Ａ８、Ａ９、Ａ１０、Ａ１２、Ａ１４、Ａ１５、Ａ１７、Ａ１８、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ１３、Ｂ１４、Ｂ１７、Ｂ２１、Ｂ２２、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９、Ｂ３０に対応する位置にある天然のアミノ酸を、リジン、システインまたはアセチルフェニルアラニン残基で置換する（またはリジン、システインまたはアセチルフェニルアラニン残基をＣ末端に付加する）ことで、ポリエチレングリコール鎖の共有結合ができるようにする。
一実施形態では、単鎖インスリン類縁体またはそのプロドラッグ誘導体は、単一のシステイン置換あるいは、単鎖インスリン類縁体のアミノ末端またはカルボキシ末端あるいは、橋渡し部分内のアミノ酸への単一のシステイン残基の付加を有するか、インスリンプロドラッグ誘導体のジペプチド要素が、少なくとも１つのシステイン残基で置換される。この場合のシステイン残基の側鎖は、マレイミド、ビニルスルホン、２−ピリジルチオ、ハロアルキル、ハロアシルなどをはじめとするチオール反応性試薬でさらに修飾される。これらのチオール反応性試薬は、カルボキシ基、ケト基、ヒドロキシ基、エーテル基ならびに、ポリエチレングリコール単位などの他の親水体を含むものであってもよい。別の実施形態では、単鎖インスリン類縁体またはそのプロドラッグ誘導体は、単一のリジン置換あるいは、単鎖インスリン類縁体のアミノ末端またはカルボキシ末端あるいは橋渡し部分内のアミノ酸への単一のリジン残基の付加を有し、あるいは、インスリンプロドラッグ誘導体のジペプチド要素が、リジンで置換され、置換しているリジン残基の側鎖が、ポリエチレングリコールなどの親水体のアルデヒドまたはカルボン酸の活性エステル（スクシンイミド、無水物など）などのアミン反応性試薬を用いてさらに修飾される。
一実施形態によれば、本明細書に開示の新規な単鎖インスリン類縁体のいずれかを、好ましくは純度レベル少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％で含み、かつ、薬学的に許容される希釈剤、キャリアまたは賦形剤を含む、薬学的組成物が提供される。このような組成物は、本明細書に開示したような単鎖インスリン類縁体を、少なくとも０．５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、６ｍｇ／ｍｌ、７ｍｇ／ｍｌ、８ｍｇ／ｍｌ、９ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１１ｍｇ／ｍｌ、１２ｍｇ／ｍｌ、１３ｍｇ／ｍｌ、１４ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、１６ｍｇ／ｍｌ、１７ｍｇ／ｍｌ、１８ｍｇ／ｍｌ、１９ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、２１ｍｇ／ｍｌ、２２ｍｇ／ｍｌ、２３ｍｇ／ｍｌ、２４ｍｇ／ｍｌ、２５ｍｇ／ｍｌまたはこれより高い濃度で含有するものであってもよい。一実施形態では、薬学的組成物は、滅菌され、任意にさまざまな包装容器で保管収容された水溶液を含む。他の実施形態では、薬学的組成物は、凍結乾燥粉末を含む。薬学的組成物は、組成物を患者に投与するための使い捨ての装置を含むキットの一部として包装されていてもよい。容器またはキットには、室温または冷蔵庫の温度での保存用にラベル表示がなされてもよい。
一実施形態では、第１および第２の単鎖インスリン類縁体プロドラッグ誘導体の混合物を含む組成物が提供され、第１および第２の単鎖インスリン類縁体プロドラッグ誘導体は、プロドラッグ要素の構造が互いに異なる。特に、第１の単鎖インスリン類縁体プロドラッグ誘導体は、第２の単鎖インスリン類縁体プロドラッグ誘導体のジペプチドプロドラッグ要素とは半減期が実質的に異なるジペプチドプロドラッグ要素を有するものであってもよい。したがって、ジペプチド要素に異なる組み合わせの置換基を選択することで、所望の時間枠に、指定の時間間隔で、制御された方法で活性化される単鎖インスリン類縁体プロドラッグ誘導体の混合物を含む組成物を調製できる。たとえば、食事時に活性のある単鎖インスリン類縁体ペプチドを放出した後、活性化の時間に基づいて夜間に好適な用量を放出して活性化する単鎖インスリン類縁体ペプチドの組成物を調製できる。
もうひとつの実施形態では、薬学的組成物は、本明細書に開示の単鎖インスリン類縁体プロドラッグ誘導体と、天然のインスリンまたはインスリンの既知の生体活性類縁体との混合物を含む。一実施形態における混合物は、単鎖インスリン類縁体と天然のインスリンまたはインスリンの既知の生体活性類縁体とを結合するヘテロ二本鎖の形であってもよい。ダイマーは、もうひとつの単鎖インスリン類縁体に結合した単鎖インスリン類縁体ペプチドあるいは、Ａ鎖をＢ鎖のインスリンヘテロ二本鎖に結合するジスルフィドを有するものであってもよい。混合物は、単鎖インスリン類縁体、天然のインスリンまたはインスリンの既知の生体活性類縁体のうちの１つまたは２つ以上を、本明細書に開示のそのプロドラッグ誘導体またはそのデポー誘導体または他の結合体形態およびこれらの組み合わせで、有するものであってもよい。
ここに開示の単鎖インスリン類縁体およびそれらの対応するプロドラッグ誘導体は、インスリンペプチドについて説明されているあらゆる用途に適していると思われる。したがって、本明細書に記載の単鎖インスリン類縁体およびそれらの対応するプロドラッグ誘導体を使用して、高血糖症を治療あるいは、血中グルコース濃度が高いことに起因する他の代謝疾患を治療することが可能である。本発明は、本明細書に開示したような単鎖インスリン類縁体またはそのプロドラッグ誘導体と、薬学的に許容されるキャリアとを含む薬学的組成物を、血中グルコース濃度の高い患者の治療に用いることを包含する。一実施形態によれば、本明細書に開示の単鎖インスリン類縁体を用いて治療される患者は、飼いならされた動物であり、別の実施形態では、治療対象となる患者はヒトである
本開示による、高血糖症を治療するひとつの方法は、非経口（静脈内、腹腔内、皮下または筋肉内など）、くも膜下内、経皮、直腸、経口、経鼻または吸入による投与ををはじめとする標準的な投与経路を使用して、本明細書に開示の単鎖インスリン類縁体あるいはそのデポーまたはプロドラッグ誘導体を患者に投与する工程を含む。一実施形態では、組成物を皮下投与または筋肉内投与する。一実施形態では、組成物を非経口投与し、単鎖インスリン類縁体またはそのプロドラッグ誘導体を、あらかじめ注射器に封入しておく。
本明細書に開示の単鎖インスリン類縁体ならびにそのデポーまたはプロドラッグ誘導体は、単独で投与してもよいし、他の抗糖尿病薬との組み合わせで投与してもよいものである。当分野で知られた抗糖尿病薬または研究中の抗糖尿病薬として、天然のインスリン、天然のグルカゴン、これらの機能的類縁体；トルブタミド（Orinase）、アセトヘキサミド（Dymelor）、トラザミド（Tolinase）、クロルプロパミド（Diabinese）、グリピジド（Glucotrol）、グリブリド（Diabeta、Micronase、Glynase）、グリメピリド（Amaryl）またはグリクラジド（Diamicron）などのスルホニル尿素；レパグリニド（Prandin）またはナテグリニド（Starlix）などのメグリチニド；メトホルミン（Glucophage）またはフェンホルミンなどのビグアナイド；ロシグリタゾン（Avandia）、ピオグリタゾン（Actos）またはトログリタゾン（Rezulin）などのチアゾリジンジオンまたは他のＰＰＡＲγ阻害薬；ミグリトール（Glyset）、アカルボース（Precose／Glucobay）；エクセナチド（Byetta）またはプラムリンチドなどの炭水化物の消化を阻害するαグルコシダーゼ阻害薬；ビルダグリプチンまたはシタグリプチンなどのジペプチジルペプチダーゼ−４（ＤＰＰ−４）阻害薬；ＳＧＬＴ（ナトリウム依存性グルコーストランスポーター１）阻害剤；またはＦＢＰａｓｅ（フルクトース１，６−ビスホスファターゼ）阻害薬があげられる。
当業者に知られた標準的な薬学的に許容されるキャリアおよび投与経路を用いて、本明細書に開示の単鎖インスリン類縁体を有する薬学的組成物あるいは、それらのデポーまたはプロドラッグ誘導体を調製し、患者に投与することが可能である。したがって、本開示は、本明細書に開示の単鎖インスリン類縁体（またはそのプロドラッグ誘導体）１種類または２種類以上を、薬学的に許容されるキャリアとの組み合わせで含む薬学的組成物も包含する。一実施形態では、薬学的組成物は、リン酸バッファー系にてｐＨ約４．０〜約７．０で濃度１ｍｇ／ｍｌの単鎖インスリン類縁体を含む。薬学的組成物は、単鎖インスリン類縁体を単独の薬学的に活性のある成分として含むものであってもよいし、あるいは、プロドラッグを１種類または２種類以上の別の活性剤（たとえば活性のある医薬剤など））と組み合わせてもよい。
本明細書に記載の治療方法、薬学的組成物、キット、他の類似の実施形態ではいずれも、単鎖インスリン類縁体ペプチドまたはそれらのプロドラッグ誘導体が、そのすべての薬学的に許容される塩を含むことを企図している。
一実施形態では、単鎖インスリン類縁体組成物を患者に投与するための装置を含むキットが提供される。このキットは、たとえば、バイアル、チューブ、ボトルなどの多岐にわたる容器をさらに含むものであってもよい。好ましくは、キットには、取扱説明書も含む。一実施形態によれば、キットの装置は、エアロゾル用の装置であり、この場合、組成物は、エアロゾル装置の中にあらかじめ封入されている。もうひとつの実施形態では、キットに注射器と針とを含み、一実施形態では、単鎖インスリン類縁体組成物があらかじめ注射器に封入されている。
本発明の化合物は、標準的な合成方法、組換えＤＮＡ技術あるいは、ペプチドおよび融合タンパク質を調製する他の任意の方法で、調製できるものである。非天然のアミノ酸の中には標準的な組換えＤＮＡ技術では発現できないものもあるが、これらを調製するための技術は、当分野で知られている。非ペプチド部分を包含する本発明の化合物を、適切な場合は標準的なペプチド化学反応に加えて、標準的な有機化学反応で合成してもよい。
実施例１
インスリンのＡ鎖およびＢ鎖の合成
Ｂｏｃ法を用いて、インスリンのＡ鎖およびＢ鎖を４−メチルベンズヒドリルアミン（ＭＢＨＡ）樹脂または４−ヒドロキシメチルフェニルアセトアミドメチル（ＰＡＭ）樹脂上で合成した。９５：５のＨＦ／ｐ−クレゾールを使用して０℃で１時間かけて、ペプチドを樹脂から切断した。ＨＦの除去およびエーテル沈殿後、ペプチドを５０％酢酸水溶液に溶解し、凍結乾燥させた。あるいは、Ｆｍｏｃ法を用いてペプチドを合成した。これらのペプチドを、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）／Ｈ２Ｏ（９５：２．５：２．５）を用いて、室温で２時間かけて樹脂から切断した。過剰量のジエチルエーテルを加えてペプチドを沈殿させ、ペレットを酸性バッファーに溶解した。ペプチドの品質をＲＰ−ＨＰＬＣで監視し、質量分析（ＥＳＩまたはＭＡＬＤＩ）によって確認した。
７番目のアミノ酸における１つの遊離システインを用いてインスリンのＡ鎖を合成し、他のすべてのシステインをアセトアミドメチルＡ−（ＳＨ）７（Ａｃｍ）６，１１，２０として保護した。７番目の１つの遊離システインを用いてインスリンのＢ鎖を合成し、その他のシステインをアセトアミドメチルＢ−（ＳＨ）７（Ａｃｍ）１９として保護した。粗ペプチドを従来のＲＰ−ＨＰＬＣで精製した。
合成したＡ鎖とＢ鎖を、図１に概略を示す一般手順に従ってそれらの天然のジスルフィド結合を介して互いに結合した。それぞれのＢ鎖を、ＤＭＦまたはＤＭＳＯに溶解することによってＣｙｓ７−Ｎｐｙｓ類縁体へと活性化し、２，２’−ジチオビス（５−ニトロピリジン）（Ｎｐｙｓ）と１：１のモル比で室温にて反応させた。ＲＰ−ＨＰＬＣで活性化を監視し、生成物をＥＳＩ−ＭＳで確認した。
それぞれのＡ−（ＳＨ）７（Ａｃｍ）６，１１，２０およびＢ−（Ｎｐｙｓ）７（Ａｃｍ）１９を、１：１のモル比で、合計ペプチド濃度１０ｍｇ／ｍｌになるように溶解することによって、第１のＢ７−Ａ７ジスルフィド結合を形成した。鎖の結合反応が完了したら、混合物を濃度５０％酢酸水溶液に希釈した。最後の２つのジスルフィド結合は、ヨウ素を添加して同時に形成した。４０倍モル過剰のヨウ素を溶液に添加し、混合物を室温でさらに１時間撹拌した。アスコルビン酸水溶液を添加して反応を終了させた。混合物をＲＰ−ＨＰＬＣで精製し、最終化合物をＭＡＬＤＩ−ＭＳで確認した。図２および表１のデータに示すように、この手順で調製した合成インスリンは、インスリン受容体結合に関して精製インスリンに十分に匹敵する。
修飾されたアミノ酸（Ａ１９の位置における４−アミノフェニルアラニンなど）を含むインスリンペプチドも、米国特許第７，０４５，３３７号および同第７，０８３，９７０号に教示される系などを含む、コードされていないアミノ酸をタンパク質に取り込めるようにする系を用いて、in vivoにて合成可能である。
Figure 0005969469
実施例２
還元的アルキル化によるアミン基（Ｎ末端およびリジン）のＰＥＧ化
ａ．合成
インスリン（またはインスリン類縁体）、ｍＰＥＧ２０ｋ−アルデヒド、ＮａＢＨ３ＣＮを、モル比１：２：３０で、ｐＨ４．１〜４．４の酢酸バッファーに溶解させた。反応溶液は、０．１ＮのＮａＣｌ、０．２Ｎの酢酸、０．１ＮのＮａ２ＣＯ３で構成した。インスリンペプチド濃度は、およそ０．５ｍｇ／ｍｌであった。反応は、室温で６時間かけて起こる。反応の度合いをＲＰ−ＨＰＬＣで監視したところ、反応収率はおよそ５０％であった。
ｂ．精製
反応混合物を０．１％ＴＦＡで２〜５倍に希釈し、分取ＲＰ−ＨＰＬＣカラムに適用した。ＨＰＬＣ条件：Ｃ４カラム；流速１０ｍｌ／分；Ａバッファー１０％ＡＣＮおよび０．１％ＴＦＡの水溶液；Ｂバッファー０．１％ＴＦＡのＡＣＮ溶液；０〜４０％の直線勾配Ｂ％（０〜８０分間）；ＰＥＧ−インスリンまたは類縁体を、およそ３５％バッファーＢで溶出した。所望の化合物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦで確認し、つづいて亜硫酸分解またはトリプシン分解によって化学修飾した。
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドのアシル化によるアミン基（Ｎ末端およびリジン）のＰＥＧ化
ａ．合成
インスリン（またはインスリン類縁体）と、ｍＰＥＧ２０ｋ−ＮＨＳとを、０．１ＮのBicineバッファー（ｐＨ８．０）に、モル比１：１で溶解させた。インスリンペプチド濃度は、およそ０．５ｍｇ／ｍｌであった。反応の進み具合をＨＰＬＣで監視した。反応収率は、室温にて２時間後におよそ９０％である。
ｂ．精製
反応混合物を２〜５倍に希釈し、ＲＰ−ＨＰＬＣを実施した。
ＨＰＬＣ条件：Ｃ４カラム；流速１０ｍｌ／分；Ａバッファー１０％ＡＣＮおよび０．１％ＴＦＡの水溶液；Ｂバッファー０．１％ＴＦＡのＡＣＮ溶液；０〜４０％の直線勾配Ｂ％（０〜８０分間）；ＰＥＧ−インスリンまたは類縁体を約３５％Ｂで回収した。所望の化合物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦで確認し、つづいて亜硫酸分解またはトリプシン分解によって化学修飾した。
フェニルアラニンの芳香環のアセチル基の還元アミン化ＰＥＧ化
ａ．合成
インスリン（またはインスリン類縁体）、ｍＰＥＧ２０ｋ−ヒドラジド、ＮａＢＨ３ＣＮを、１：２：２０のモル比で酢酸バッファー（ｐＨ４．１〜４．４）に溶解させた。反応溶液は、０．１ＮのＮａＣｌ、０．２Ｎの酢酸および０．１ＮのＮａ２ＣＯ３で構成した。インスリンまたはインスリン類縁体の濃度はおよそ０．５ｍｇ／ｍｌであった。室温にて２４時間。反応プロセスをＨＰＬＣで監視した。反応物の変換はおよそ５０％であった（ＨＰＬＣで計算）。
ｂ．精製
反応混合物を２〜５倍に希釈したＲＰ−ＨＰＬＣを実施した。
ＨＰＬＣ条件：Ｃ４カラム；流速１０ｍｌ／分；Ａバッファー１０％ＡＣＮおよび０．１％ＴＦＡの水溶液；Ｂバッファー０．１％ＴＦＡのＡＣＮ溶液；０〜４０％の直線勾配Ｂ％（０〜８０分間）；ＰＥＧ−インスリンまたはＰＥＧ−インスリン類縁体を、およそ３５％Ｂで回収した。所望の化合物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦで確認し、つづいて亜硫酸分解またはトリプシン分解によって化学修飾した。
実施例３
インスリン受容体結合アッセイ
シンチレーション近接技術を使用して、競合結合アッセイでインスリン受容体またはＩＧＦ−１受容体に対する各ペプチドの親和性を測定した。ペプチドの３倍段階希釈物をＴｒｉｓ−Ｃｌバッファー（０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ｗ／ｖウシ血清アルブミン）で生成し、９６ウェルのプレート（Corning Inc., Acton, MA）で０．０５ｎＭ（３−［１２５Ｉ］−ヨードチロシル）Ａ ＴｙｒＡ１４インスリンまたは（３−［１２５Ｉ］−ヨードチロシル）ＩＧＦ−１（Amersham Biosciences, Piscataway, NJ）と混合した。ヒトインスリンまたはＩＧＦ−１受容体を過発現している細胞から調製した１〜６マイクログラムの形質膜断片を、各ウェルに分注し、０．２５ｍｇ／ウェルのポリエチレンイミン処理コムギ胚芽アグルチニンＡ型シンチレーション近接アッセイビーズ（Amersham Biosciences, Piscataway, NJ）を加えた。８００ｒｐｍで５分振盪後、プレートを室温にて１２時間インキュベートし、MicroBeta1450液体シンチレーションカウンター（Perkin-Elmer, Wellesley, MA）で放射活性を測定した。被検試料の最高濃度よりも４倍濃度過剰の「冷」天然リガンドを用いて非特異的結合（ＮＳＢ）放射活性をウェルで測定した。競合なく、ウェルで全結合放射活性を検出した。以下のようにして特異的結合率を求めた。％特異的結合＝（結合−ＮＳＢ／全結合−ＮＳＢ）×１００。Originソフトウェア（OriginLab, Northampton, MA）を用いてＩＣ５０値を求めた。
実施例４
インスリン受容体リン酸化アッセイ：
インスリンまたはインスリン類縁体の受容体のリン酸化を測定するために、受容体トランスフェクトHEK293細胞を９６ウェルの組織培養プレート（Costar #3596, Cambridge, MA）に播種し、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび０．２５％ウシ増殖血清（HyClone SH30541, Logan, UT）を加えたダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、３７℃、５％ＣＯ２、湿度９０％で１６〜２０時間培養した。インスリンまたはインスリン類縁体の段階希釈物を、０．５％ウシ血清アルブミン（Roche Applied Science No.100350, Indianapolis, IN）を添加したＤＭＥＭ中で調製し、接着した細胞を含むウエルに添加した。５％ＣＯ２の加湿条件下で３７℃で１５分間インキュベートした後、５％パラホルムアルデヒドで細胞を室温にて２０分間固定し、リン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）で２回洗浄し、ＰＢＳ中２％ウシ血清アルブミンで１時間ブロックした。次に、プレートを３回洗浄し、製造者が推奨するとおりに２％ウシ血清アルブミン含有ＰＢＳで再構成したホスホチロシンに対するホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗体（Upstate biotechnology No.16-105, Temecula, CA）で満たした。室温で３時間インキュベートした後、プレートを４回洗浄し、ＴＭＢ単一溶液基質（Invitrogen, No.00-2023, Carlbad, CA）０．１ｍｌを各ウェルに加えた。５分後に、１ＮのＨＣｌを０．０５ｍｌ添加して、発色を停止させた。４５０ｎｍの吸光度をTitertek Multiscan MCC340（ＴhermoFisher, Pittsburgh, PA）で測定した。吸光度に対するペプチド濃度用量反応曲線をプロットし、Originソフトウェア（OriginLab, Northampton, MA）を用いてＥＣ５０値を求めた。
実施例５
モデルジペプチドの切断速度の判定（ＰＢＳ中）
モデルペプチドとして、特異的ヘキサペプチド（ＨＳＲＧＴＦ−ＮＨ２；配列番号１５６）を用いた。このペプチドで、ジペプチドＮ末端の伸長部の切断速度を研究可能であった。このジペプチド伸長モデルペプチドを、Ｂｏｃ保護サルコシンを用いて調製し、モデルペプチド結合樹脂にリジンを連続的に加えてペプチドＡ（Ｌｙｓ−Ｓａｒ−ＨＳＲＧＴＦ−ＮＨ２；配列番号１５７）を合成した。ペプチドＡをＨＦで切断し、分取用ＨＰＬＣで精製した。
ＨＰＬＣによる分画精製
シリカ系の１×２５ｃｍのVydac C18（粒度５μ、細孔径３００Å）カラムにて、ＨＰＬＣ分析を用いて精製を実施した。使用した機器は以下の通りであった：Waters Associatesのモデル６００のポンプ、インジェクターのモデル７１７、ＵＶ検出器のモデル４８６。すべての試料に２３０ｎｍの波長を使用した。溶媒Ａには１０％ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡを蒸留水に入れたもの、溶媒Ｂには０．１％ＴＦＡをＣＨ３ＣＮに入れたものを使用した。直線勾配を用いた（２時間でＢを０〜１００％）。流速を１０ｍｌ／分とし、分画量は４ｍｌとした。約１５０ｍｇの粗ペプチドから、３０ｍｇの純粋なペプチドが得られた。
ペプチドＡを濃度１ｍｇ／ｍｌでＰＢＳバッファーに溶解させた。この溶液を３７℃でインキュベートした。分析用に、５時間、８時間、２４時間、３１時間、４７時間の時点で、試料を回収した。等量の０．１％ＴＦＡでｐＨを下げて、ジペプチドの切断を止めた。切断速度をＬＣ−ＭＳで定性的に監視し、ＨＰＬＣで定量的に研究した。プロドラッグおよび親のモデルペプチドの保持時間と相対ピーク面積を、Peak Simple Chromatographyソフトウェアを用いて定量した。
質量分析による分析
Sciex API-IIIエレクトロスプレー／四重極質量分析計を標準的なＥＳＩのイオン源で用いて、質量スペクトルを得た。使用したイオン化状態は以下のとおりである：陽イオンモードでＥＳＩ；イオンスプレー電圧、３．９ｋＶ；オリフィス電位６０Ｖ。使用したネブライジングガスおよびカーテンガスは窒素で、流速０．９Ｌ／分であった。６００〜１８００トンプソンの１ステップあたり０．５Ｔｈ、滞留時間２ミリ秒で質量スペクトルを記録した。試料（約１ｍｇ／ｍＬ）を１％酢酸とともに５０％アセトニトリル溶液に溶解し、外側のシリンジポンプで５μＬ／分で導入した。
分析前に、製造業者（Millipore Corporation, Billerica, MA）の指示に従って０．６μＬのＣ４樹脂の入ったZipTip固相抽出チップを用いて、ＰＢＳに可溶化したペプチドを脱塩した。
ＨＰＬＣでの分析
２１４ｎｍのＵＶ検出器と１５０ｍｍ×４．６ｍｍのC18 Vydacカラムを備えたBeckman System Gold Chromatographyシステムを使用して、ＨＰＬＣ分析を実施した。流速を１ｍｌ／分とした。溶媒Ａには０．１％ＴＦＡを蒸留水に加えたもの、溶媒Ｂには０．１％ＴＦＡを９０％ＣＨ３ＣＮに加えたものを用いた。直線勾配を用いた（１０分間でＢを０％〜３０％）。データを集め、Peak Simple Chromatographyソフトウェアで分析した。
それぞれのプロペプチドについて、切断速度を求めた。プロペプチドの濃度とモデルの親ペプチドの濃度を、それぞれのピーク面積から求めた。プロドラッグの濃度の対数をさまざまな時間間隔でプロットして、プロドラッグの一次解離速度定数を求めた。このプロットの勾配から速度定数「ｋ」が得られる。式ｔ１／２＝０．６９３／ｋを用いて、さまざまなプロドラッグの切断半減期を計算した。このモデルペプチドＨＳＲＧＴＦ−ＮＨ２（配列番号１５６）に対するＬｙｓ−Ｓａｒ伸長部の半減期を求めたところ、１４．０時間であった。
実施例６
血漿中における、すべてのｄ−アイソフォームモデルペプチドを基準に判断できる、ジペプチドの切断半減期の速度
血漿中でのジペプチド切断速度を求めるために、別のモデルのヘキサペプチド（ｄＨｄＴｄＲＧｄＴｄＦ−ＮＨ２、配列番号１５８）を使用した。プロドラッグ伸長部以外は、モデルペプチドの酵素による切断を防ぐために、各アミノ酸のｄ−異性体を用いた。このモデルのｄ−異性体ヘキサペプチドを、Ｌ異性体と同様の手順で合成した。ペプチドＡの場合に上述したようにしてサルコシンとリジンをＮ末端に連続的に付加し、ペプチドＢ（ｄＬｙｓ−ｄＳａｒ−ｄＨｄＴｄＲＧｄＴｄＦ−ＮＨ２、配列番号１５９）を調製した。
それぞれのプロペプチドについて、切断速度を求めた。プロペプチドの濃度とモデルの親ペプチドの濃度を、それぞれのピーク面積から求めた。プロドラッグの濃度の対数をさまざまな時間間隔でプロットして、プロドラッグの一次解離速度定数を求めた。このプロットの勾配から速度定数「ｋ」が得られる。このモデルペプチドｄＨｄＴｄＲＧｄＴｄＦ−ＮＨ２（配列番号１５８）に対するＬｙｓ−Ｓａｒ伸長部の半減期を求めたところ、１８．６時間であった。
実施例７
実施例５で説明した手順を用いて、モデルのヘキサペプチド（ＨＳＲＧＴＦ−ＮＨ２；配列番号１５６）に結合した別のジペプチドの切断速度を求めた。これらの実験で得られた結果を、表２および表３にあげておく。
表２．モデルペプチド（ＨＳＲＧＴＦ−ＮＨ２；配列番号１５６）からの、Ｎ末端のパラアミノフェニルアラニンの側鎖に結合したジペプチドＵ−Ｂの切断（ＰＢＳ中）
Figure 0005969469
Figure 0005969469
Figure 0005969469
実施例８
プロドラッグ構築に好適な構造を有するインスリン類縁体の同定
Ａ鎖の１９番目は、インスリン活性にとって重要な部位であることが知られる。したがって、プロドラッグ要素の結合を可能にするようにこの部位を修飾することが望ましい。Ａ１９におけるインスリンの特異的類縁体は合成されており、インスリン受容体に対する活性についてもキャラクタライズされている。Ａ１９では、２つの活性が高い構造的な類縁体が同定されている。第２の活性部位の芳香族残基（Ｂ２４）で同様の構造的変化を起こしたが、同じように十分な活性を持つインスリン類縁体の同定には至っていない。
表４および表５は、インスリン受容体に対する十分な活性を得るためにＡ１９の位置で高度に保存される構造を示す（受容体結合については、実施例３で説明したアッセイで判断した）。表４は、Ａ１９が修飾された２つのインスリン類縁体だけが、天然のインスリンと同様の受容体結合活性を有することを示す。４−アミノインスリン類縁体については、３つの別々の実験で得られたデータをあげておく。「活性（試験）」と表示した列は、同時に行った２つの別々の実験において、天然のインスリンに対するインスリン類縁体の結合率を比較したものである。「活性（０．６０ｎＭ）」と表示した列は、このアッセイでインスリンの結合について得られたヒストリカルな平均値に対する、インスリン類縁体の相対的な結合率である。いずれの分析でも、２つのＡ１９インスリン類縁体（４−アミノフェニルアラニンおよび４−メトキシフェニルアラニン）は、天然インスリンとほぼ等価的な受容体結合を示す。図３は、インスリン受容体に対する、天然のインスリンとＡ１９インスリン類縁体のそれぞれの特異的結合を示すグラフである。表５に、天然のインスリンと等価な結合活性を呈する、２つのＡ１９インスリン類縁体（４−アミノおよび４−メトキシ）が、インスリン受容体に対しても等価な活性を示すというデータ（受容体活性については、実施例４で説明したアッセイで判断した）をあげておく。
Figure 0005969469
Figure 0005969469
実施例９
インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）類縁体であるＩＧＦ１（ＹＢ１６ＬＢ１７）
本出願人らは、インスリン受容体に対して天然のインスリンと同様の活性を示すＩＧＦ類縁体を発見した。特に、このＩＧＦ類縁体（ＩＧＦ１（ＹＢ１６ＬＢ１７））は、天然のＩＧＦのＡ鎖（配列番号５）と、修飾されたＢ鎖（配列番号６）を有する。この修飾は、天然のＩＧＦのＢ鎖（配列番号３）の１５番目と１６番目の天然のグルタミンとフェニルアラニンが、それぞれ、チロシンおよびロイシン残基で置換される。図４および以下の表６に示すように、ＩＧＦ１（ＹＢ１６ＬＢ１７）および天然のインスリンの結合活性は、それぞれが、インスリン受容体のきわめて強力なアゴニストであることを示す。
Figure 0005969469
実施例１０
ＩＧＦプロドラッグ類縁体
Ａ１９インスリン類縁体の活性に基づいて（実施例５参照）、ＩＧＦ１ Ａ：Ｂ（ＹＢ１６ＬＢ１７）類縁体をを同様にして修飾し、インスリン受容体活性を結合して刺激する機能を調べた。図６に、天然のチロシンを４−アミノフェニルアラニン［ＩＧＦ１ Ａ：Ｂ（ＹＢ１６ＬＢ１７）（ｐ−ＮＨ２−Ｆ）Ａ１９アミド］に置き換えて、ＩＧＦ１ Ａ：Ｂ（ＹＢ１６ＬＢ１７）を調製し、そのジペプチド伸長類縁体［ＩＧＦ１ Ａ：Ｂ（ＹＢ１６ＬＢ１７）Ａ１９−ＡｉｂＡｌａアミド］を調製するための基本的な合成スキームを示す。ここで、ＡｉｂとＡｌａとを有するジペプチドは、Ａ１９ ４−アミノフェニルアラニンとのアミド結合を介してペプチドに結合する。図７および表７に示すように、ＩＧＦ類縁体、ＩＧＦ１（ＹＢ１６ＬＢ１７）Ａ（ｐ−ＮＨ２−Ｆ）１９は、インスリン受容体に特異的に結合する。この場合、この類縁体のジペプチド伸長類縁体は、インスリン受容体に特異的結合することができない。このジペプチド伸長部は、ジペプチドの自律的な切断を可能とする適切な構造がなく（ジペプチドの２番目にＮ−アルキル化アミノ酸がない）、したがって、インスリン受容体結合の回復がないことに注意されたい。
さらに、修飾されたアミノ酸（Ａ１９の位置ににおける４−アミノフェニルアラニンなど）を含むＩＧＦ Ａ：Ｂ（ＹＢ１６ＬＢ１７）インスリン類縁体ペプチドを、米国特許第７，０４５，３３７号および同第７，０８３，９７０号に教示される系などを含む、コードされていないアミノ酸をタンパク質に取り込めるようにする系を用いて、in vivoにて合成可能である。
Figure 0005969469
ＩＧＦＢ１６Ｂ１７類縁体ペプチドの別のプロドラッグ類縁体が調製され、ここで、ジペプチドプロドラッグ要素（アラニン−プロリン）は、アミド結合を介して、Ａ鎖のアミノ末端に結合された（ＩＧＦ１（ＹＢ１６ＬＢ１７）（ＡｌａＰｒｏ）Ａ−１，０）。表８に示すように、ＩＧＦ１（ＹＢ１６ＬＢ１７）（ＡｌａＰｒｏ）Ａ−１，０では、インスリン受容体に対する親和性が低下した。表３のデータに基づくと、このジペプチドプロドラッグ要素には、そのジペプチドプロドラッグ要素の自律的な切断を可能とする適切な構造がなく、したがって、検出されるインスリン受容体結合は、プロドラッグ要素の切断の結果ではないことに注意されたい。
Figure 0005969469
実施例１１
別のＩＧＦインスリン類縁体
ＩＧＦ１（ＹＢ１６ＬＢ１７）ペプチド配列をさらに修飾することによって、インスリン受容体とＩＧＦ−１受容体に対する活性の異なる別のＩＧＦインスリン類縁体が明らかになった。これらの類縁体それぞれについて、結合データ（実施例３のアッセイを使用）を表９に示す。修飾の位置については、天然のインスリンペプチドにおける対応の位置に基づいて表示される（ＤＰＩ＝ｄｅｓ Ｂ２６〜Ｂ３０）。たとえば、本明細書において、たとえば、それ以上詳細に触れることなく本明細書で「Ｂ２８の位置」といえば、配列番号２の最初のアミノ酸が欠失したインスリン類縁体のＢ２７の位置を意味する。よって、一般的に「Ｂ（Ｙ１６）」というときは、天然のＩＧＦ−１配列（配列番号３）のＢ鎖の１５番目におけるチロシン残基の置換を指す。インスリンとＩＧＦ類縁体の相対的な受容体結合に関するデータを表９に示し、ＩＧＦ類縁体刺激によるリン酸化（実施例４のアッセイを使用）に関するデータを表１０に示す。
Figure 0005969469
Figure 0005969469
Figure 0005969469
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実施例１２
ＩＧＦ１ジペプチド伸長（ｐ−ＮＨ２−Ｆ）Ａ１９アミド類縁体におけるジペプチド半減期
さまざまなＩＧＦ−１ペプチドからの、（ｐＮＨ２−Ｐｈｅ）アミド結合ジペプチドＡｉｂＰｒｏの切断を測定し、ペプチド配列またはヘテロ二本鎖がジペプチド切断に対しておよぼす影響を判定した。試験ペプチドでの結果を表１２に示す。このデータは、ＩＧＦ１−Ａ鎖だけがＩＧＦ１ Ｂ：Ａ（ＹＢ１６ＬＢ１７）ペプチドのプロドラッグ半減期研究のための優れたモデルとなることを示している。
Figure 0005969469
ジスルフィド結合Ａ鎖およびＢ鎖コンストラクト（ＩＧＦ１ Ａ：Ｂ（ＹＢ１６ＬＢ１７））に対する、ＩＧＦ Ａ鎖のプロドラッグ類縁体を比較したところ、この２つの化合物が、プロドラッグ形態で同様の半減期を有することが明らかになったた。ＡｉｂＡｌａ類縁体は切断されず、プロドラッグとはならないが、修飾がインスリン類縁体ＩＧＦ１ Ａ：Ｂ（ＹＢ１６ＬＢ１７）（ｐ−ＮＨ２−Ｆ）Ａ１９アミドを不活性化できることを示すのに役立つことに注意されたい。したがって、ＩＧＦ１Ａ鎖のみが、ＩＧＦ１ Ｂ：Ａ（ＹＢ１６ＬＢ１７）類縁体でのプロドラッグ半減期の研究にとって優れたモデルになると判断された。ＡｉｂＡｌａ類縁体は切断されず、プロドラッグとはならないが、修飾がインスリン類縁体ＩＧＦ１ Ａ：Ｂ（ＹＢ１６ＬＢ１７）（ｐ−ＮＨ２−Ｆ）Ａ１９アミドを不活性化できることを示すのに役立つことに注意されたい。便宜上、プロドラッグ半減期は、Ｂ鎖がない状態で、ＩＧＦ１のＡ鎖のみを用いて判断した。各ペプチドの半減期を実施例５で説明したようにして求めた。データを表１３に示す。
Figure 0005969469
このデータは、ジペプチドプロドラッグ要素の置換基を変えることで、プロドラッグの半減期を２時間から＞１００時間まで変動させることが可能であることを示している。
ＩＧＦ１−Ａ（ｐＮＨ２−Ｆ）１９系ペプチドを使用し、Ａ１９の位置で４−アミノフェニルアラニンを介して結合されるジペプチドプロドラッグ要素のアミノ酸組成を変えることによって、別のプロドラッグ類縁体ペプチドを調製した。異なるコンストラクトについて、ＰＢＳ中と２０％血漿／ＰＢＳ中（すなわち、血清酵素の存在下）で、ジペプチド半減期を測定した。結果を表１４に示す。この結果は、試験した４種類のペプチドのうち３種が、血清酵素によって影響されないことを示す。
Figure 0005969469
実施例１３
ＩＧＦＢ１６Ｂ１７類縁体ペプチドの受容体結合の経時的変化
ＩＧＦＢ１６Ｂ１７類縁体ペプチドのプロドラッグ調製物を調製し、その経時的分解を、実施例３のインスリン受容体結合アッセイを用いて測定した。このアッセイに用いられるペプチドは下記のように調製した。

ジペプチド−ＩＧＦ１Ａ類縁体
特に指定しない場合、設計ペプチド類縁体の合成にはＢｏｃ法を用いた。選択されたジペプチドＨ２Ｎ−ＡＡ１−ＡＡ２−ＣＯＯＨを、ＩＧＦ１Ａ（Ａｌａ）６，７，１１，２０上の（ｐＮＨ２−Ｐｈｅ）１９に加えた。ＩＧＦ−１ Ａ鎖Ｃ−末端トリペプチドＢｏｃ（Ｆｍｏｃ−ｐＮＨ−Ｐｈｅ）−Ａｌａ−Ａｌａを、ＭＢＨＡ樹脂上で合成した。２０％ピペリジン／ＤＭＦで、室温にて３０分間の処理でＦｍｏｃを除去した後、Ｆｍｏｃ−ＡＡ２を、３倍過剰のアミノ酸、ＰｙＢｏｐ、ＤＩＥＡおよび触媒量のピペリジンを用いて、Ａ１９におけるｐ−アミノベンジル側鎖に結合した。残りのＩＧＦ−１ Ａ鎖（Ａｌａ）６，７，１１，２０配列のＢｏｃ合成については、Applied Biosystems 430A Peptide Synthesizerを用いて完了し、ＩＧＦ−１ Ａ鎖（Ｂｏｃ）０（Ａｌａ）６，７，１１，２０（Ｆｍｏｃ−ＡＡ２−ｐＮＨ−Ｐｈｅ）１９−ＭＢＨＡが得られた。ＡＡ２のＮ末端からＦｍｏｃ基を除去した後、３倍過剰のアミノ酸、ＤＥＰＢＴ、ＤＩＥＡを用いて、Ｂｏｃ−ＡＡ１をアミンに結合させた。Ａ鎖に残留する２つのＢｏｃ基をＴＦＡで除去した後、ＨＦ切断したところ、ＩＧＦ−１ Ａ鎖（Ａｌａ）６，７，１１，２０（Ｈ２Ｎ−ＡＡ１−ＡＡ２−ｐＮＨ−Ｐｈｅ）１９アミドが得られた。ＡＡ１がｄ−リジンである場合、ε−アミンに対するアセチル化を、Ｂｏｃ除去の前に実施した。ジペプチドＩＧＦ−１のＡ鎖類縁体を半分取用ＲＰ−ＨＰＬＣで精製し、分析的ＲＰ−ＨＰＬＣとＭＡＬＤＩ質量分析によってキャラクタライズした。
ジペプチド−ＩＧＦ−１（ＹＬ）類縁体
ＨＦ切断によってＣ末端酸が得られるように、ＩＧＦ−１ Ａ鎖の合成にＰＡＭ樹脂を用いたこと以外は、上述した方法で、選択されたジペプチドＨ２Ｎ−ＡＡ１−ＡＡ２−ＣＯＯＨをＩＧＦ−１ Ａ鎖（Ａｃｍ）６，１１，２０の（ｐＮＨ２−Ｐｈｅ）１９に加えた。ＩＧＦ−１ Ｂ鎖（ＹＢ１６ＬＢ１７）（Ａｃｍ）１９をＭＢＨＡ樹脂上で合成し、Ｃ末端アミドを得た。ＣｙｓＢ７の遊離チオールを、１００％ＤＭＳＯ中で１：１モル比でＤＴＮＰとの反応を介してＮｐｙｓによって修飾した。精製ジペプチド−ＩＧＦ−１ Ａ鎖とＩＧＦ−１ Ｂ鎖（ＹＢ１６ＬＢ１７）類縁体を、スキーム１に示される「１＋２」の２段階での鎖の組み合わせ戦略を用いて結合した。中間および最終精製は、半分取用ＲＰ−ＨＰＬＣで実施し、分析ＲＰ−ＨＰＬＣとＭＡＬＤＩ質量分析でキャラクタライズした。
ＩＧＦＢ１６Ｂ１７類縁体ペプチドプロドラッグを、ＰＢＳ中、ｐＨ７．４、３７℃でインキュベートし、指定の時間間隔で分液を採取し、それ以上の分解を０．１％ＴＦＡで停止させ、分液を分析用ＨＰＬＣ分析で調べた。ＩＧＦＢ１６Ｂ１７類縁体ペプチドのプロドラッグと活性型を表すピークａおよびｂを、ＬＣ−ＭＳで特定し、ＨＰＬＣにおけるピーク面積を積分することによって定量した。図９Ａ〜図９Ｃは、ＩＧＦＢ１６Ｂ１７類縁体ペプチドプロドラッグ：ＩＧＦ１Ａ（Ａｌａ）６，７，１１，２０（Ａｉｂ−Ｐｒｏ−ｐＮＨ−Ｆ）１９の分解に関するＨＰＬＣ分析の出力を示す。ＰＢＳ中でのプロドラッグのインキュベーション開始後、２０分（図９Ａ）、８１分（図９Ｂ）、１２０分（図９Ｃ）の時点で少量を取った。これらのデータは、ＩＧＦ１Ａ（Ａｌａ）６，７，１１，２０（Ａｉｂ−Ｐｒｏ−ｐＮＨ−Ｆ）１９アミドからＩＧＦ１Ａ（Ａｌａ）６，７，１１，２０（ｐＮＨ２−Ｆ）１アミドへの自律的かつ酵素によらない変換を示している。
ＩＧＦＢ１６Ｂ１７類縁体ペプチドのプロドラッグ形態が分解されてその活性形態に変換される様子を、実施例３のin vitroアッセイで測定したように、インスリン受容体に対する化合物の結合能力に基づいて測定した。図１０Ａおよび図１０Ｂは、プロドラッグＡｉｂ，ｄＰｒｏ−ＩＧＦ１ＹＬ（Ａ１９ ４−アミノフェニルアラニンを介して結合したジペプチド）のin vitroでの活性を示すグラフである。図１０Ａは、ＰＢＳ中でインキュベートした、天然のインスリン（４℃で１時間の時点で測定）とＡ１９ ＩＧＦプロドラッグ誘導体（Ａｉｂ，ｄＰｒｏ−ＩＧＦ１ＹＬ）の経時的な（０時間、２．５時間、１０．６時間）インスリン受容体に対する相対結合力を比較したグラフである。図１０Ｂは、２０％血漿／ＰＢＳ中、３７℃でインキュベートした、天然のインスリンとＡ１９ ＩＧＦプロドラッグ誘導体（Ａｉｂ，ｄＰｒｏ−ＩＧＦ１ＹＬ）の経時的な（０時間、１．５時間および２４．８時間）インスリン受容体に対する相対結合力を比較したグラフである。グラフに示されたデータから明らかなように、プロドラッグ形態が活性のあるＩＧＦ１ＹＬペプチドに変換されると、増加した活性がＡ１９ＩＧＦプロドラッグ誘導体試料から回復する。インスリン受容体結合に対するＩＧＦＢ１６Ｂ１７類縁体ペプチドの活性を測定した。もとになるＩＧＦＢ１６Ｂ１７類縁体ペプチドのほうが天然のインスリンよりも活性が高いため、インスリンに対する１００％を超える活性が有り得る。
図１１Ａおよび図１１Ｂは、プロドラッグｄＫ，（Ｎ−イソブチルＧ）−ＩＧＦ１ＹＬ（Ａ１９ ４−アミノフェニルアラニンを介して結合したジペプチド）のin vitroでの活性を示すグラフである。図１１Ａは、ＰＢＳ中でインキュベートした、天然のインスリン（４℃で１時間の時点で測定）とＡ１９ ＩＧＦプロドラッグ誘導体（ＩＧＦ１ＹＬ：ｄＫ，（Ｎ−イソブチルＧ）の経時的な（０時間、５時間および５２時間）インスリン受容体に対する相対結合力を比較したグラフである。図１１Ｂは、２０％血漿／ＰＢＳ中、３７℃でインキュベートした、天然のインスリンとＡ１９ ＩＧＦプロドラッグ誘導体（ＩＧＦ１ＹＬ：ｄＫ，（Ｎ−イソブチルＧ）の経時的な（０時間、３．６時間および２４．８時間）インスリン受容体に対する相対結合力を比較したグラフである。グラフに示されたデータから明らかなように、プロドラッグ形態が活性のあるＩＧＦ１ＹＬペプチドに変換されると、増加した活性がＡ１９ ＩＧＦプロドラッグ誘導体試料から回復する。
図１２Ａおよび図１２Ｂは、プロドラッグｄＫ（ｅ−アセチル），Ｓａｒ）−ＩＧＦ１ＹＬ（Ａ１９ ４−アミノフェニルアラニンを介して結合したジペプチド）のin vitroでの活性を示すグラフである。図１２Ａは、ＰＢＳ中でインキュベートした、天然のインスリン（４℃で１時間の時点で測定）とＡ１９ ＩＧＦプロドラッグ誘導体（ＩＧＦ１ＹＬ：ｄＫ（ｅ−アセチル），Ｓａｒ）の経時的な（０時間、７．２時間および９１．６時間）インスリン受容体に対する相対結合力を比較したグラフである。図１２Ｂは、２０％血漿／ＰＢＳ中、３７℃にてインキュベートした、天然のインスリンとＡ１９ ＩＧＦプロドラッグ誘導体（ＩＧＦ１ＹＬ：ｄＫ（ｅ−アセチル），Ｓａｒ）の経時的な（０時間、９時間および９５時間）インスリン受容体に対する相対結合力を比較したグラフである。グラフに示されたデータから明らかなように、プロドラッグ形態が活性のあるＩＧＦ１ＹＬペプチドに変換されると、増加した活性がＡ１９ ＩＧＦプロドラッグ誘導体試料から回復する。
実施例１４
単鎖インスリン類縁体の生合成と精製
ＩＧＦ−Ｃ鎖を介して天然インスリンＢとＡ鎖を含む（Ｂ０−Ｃ１−Ａ０）インスリンＩＧＦ−Ｉミニジーンが、酵母Pichia pastorisで組換えタンパク質の恒常的発現と精製をするため、ｐＧＡＰＺαＡ（Invitorogen社）のＧＡＰプロモーター（グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ））の下にクローン化された。ミニジーンは、培地に組換えタンパク質を分泌させるためのSaccharomyces cerevisiaeα接合因子リーダーシグナルをコードするＮ末端に結合した。ミニジーンとα接合因子リーダー配列の間のＫｅｘ２部位が天然アミノ末端を有するミニジーンの分泌のためのリーダー配列を切断するのに用いられた。単一部位のアラニン変異がＣペプチドの、Ｂ０−Ｃ１−Ａ０ミニジーンの１（Ｇ１Ａ）、２（Ｙ２Ａ）、３（Ｇ３Ａ）、４（Ｓ４Ａ）、５（Ｓ５Ａ）、６（Ｓ６Ａ）、７（Ｒ７Ａ）、８（Ｒ８Ａ）、１０（Ｐ１０Ａ）、１１（Ｑ１１Ａ）、１２（Ｔ１２Ａ）の位置に導入された。
Ｂ０−Ｃ１−Ａ０を含むミニジーンでエレクトロポレーションを用いて酵母Pichia pastorisをトランスフォームした。陽性のトランスフォーマントを最少メタノール培地で選択し、各酵母のクローンからゲノムの単離を行った。酵母ゲノムにコンストラクトが導入されていることはＰＣＲで確認した。８３３塩基対のＰＣＲ産物をアガロースゲルで可視化した。インスリン類縁体を対応する酵母系統で製造した。酵母細胞は５００ｍＬベックマン遠心管で５０００ｒｐｍ、２０分間遠心して、培地をさらなるタンパク質単離に用いた。
増殖培地の上清を０．２μｍのミリポアフィルターでろ過した。アセトニトリル（ＡＣＮ）を上清に加えた（最終濃度２０％）。上清を、予め２０％ＡＣＮで平衡化したAmberlite ＸＡＤ７ＨＰレジン（シグマ社）で精製した。レジンを２０％ＡＣＮ水溶液３０ｍＬで２回洗浄し、０．１％ＴＦＡを含む３０％ＡＣＮ水溶液で挟雑物を除去した。部分的に精製したインスリン類縁体を０．１％ＴＦＡを含む５４％ＡＣＮ水溶液でカラムから溶出し、凍結乾燥した。凍結乾燥したサンプルを０．０２５Ｍ ＮＨ３ＨＣＯ３（ｐＨ８）で再度懸濁し、ＬｕｎａＣ１８カラムで精製した（１０μｍ粒子サイズ、３００オングストローム孔サイズ）。２０−６０％ＡＣＮ水溶液の直線勾配でタンパク質をカラムから溶出した。ＭＡＬＤＩ−ＭＳ陽性フラクションをプールし、次の凍結乾燥のための使い捨てのシンチレーションバイアルに移した。それから凍結乾燥サンプルを０．１％ＴＦＡを含む２０％ＡＣＮ水溶液に再度懸濁し、ＬｕｎａＣ１８カラムで精製した（１０μｍ粒子サイズ、３００オングストローム孔サイズ）。１８−５４％の０．１％ＴＦＡを含むＡＣＮ水溶液の直線勾配でタンパク質をカラムから溶出した。溶出液は、２８０ｍｍの波長でモニターした。純度を確認するため、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ陽性フラクションをＣ８分析カラムで分析した。
図１５は、単鎖インスリン類縁体の活性を示す。Ｂ０−Ｃ１−Ａ０類縁体はインスリン受容体アイソフォームとＩＧＦ−１受容体の両方に同様に効果がある活性を示した。２番目のチロシンからアラニンへの変異またはＣ９−１２の欠失による８アミノ酸へのＣ末端の短縮は、ＩＧＦ−１受容体活性における有意な減少によって、インスリン活性の特異性において、選択的促進を示した。表１５Ａ及び１５Ｂに提示されるデータもまた参照のこと。
Figure 0005969469
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図１６は、Ｃペプチドの２番目と３番目は、修飾に比較的耐性のあることがわかっているインスリン受容体とともに、ＩＧＦ−Ｉ受容体に対し、修飾に感受性が高いことを示す。最終的に、図１７及び図１８は結合親和性率（ＩＣ５０）及びチロシンリン酸化を通ｈ自他生化学的シグナリング（ＩＣ５０）として、単鎖インスリン変異体のin vitro解析を示す。２回の独立した測定の均一性によって、構造−機能解析にin vitroのアプローチが確証された。すべての類縁体は、活性に少し増強されることがわかっている特異的類縁体（１ケタの下のｎＭ）とともに、１ケタ単位のｎＭ活性を維持した。最もインスリンに選択的な類縁体は、Ｃペプチドの最後の４残基を欠失させた、２つのＣ末端にアラニン変異または２つの変化の組み合わせを有する類縁体であった。
実施例１５
ミニＰｅｇに結合した単鎖インスリン類縁体の合成およびキャラクタリゼーション
二段階の天然の鎖ライゲーション法での固相合成によって、一連の単鎖インスリン類縁体を調製した。最初のペプチドは、Ｎ末端がＣｙｓＢ１９で始まり、エチレングリコールの短い直鎖状ポリマーが最後のＢ鎖アミノ酸のＣ末端とＡ鎖の第１のアミノ酸のＮ末端との接続部として機能する、ＡｓｎＡ２１まで続く線形コンストラクトであった（一般にグリシンである）。Ｂ鎖のＮ末端（一般に、最後のインスリン類縁体の第１のＮ末端のアミノ酸で始まり、Ｂ鎖のアミノ酸１８、一般にはバリンで終わる）を、単一の直鎖状ペプチドに断片結合した。チオールによる自然な鎖のライゲーションで結合したら、ペプチドをクロマトグラフィで精製し、正しいジスルフィドアイソマーに変換し、高速クロマトグラフィで再度精製した。すべてのインスリン類縁体の純度をＨＰＬＣおよびＭＳ分析で分析した。
図１９は、ＰＥＧ８をリンカーとして用いる例を１つだけあげた合成設計の概略図である。同じ方法を用いて、これよりも短い類縁体と長い類縁体のみならず、直線的にアミドとして結合した２つ以上のｐｅｇを用いた長さの異なるものを合成した。
図２０〜図２４は、指定位置で規定の長さのミニｐｅｇで結合した単鎖インスリン類縁体の研究で得られたin vitroでの実験結果である。図２０は、４、８、または１６エチレングリコール単位のミニｐｅｇを用いると、結合または生化学シグナル伝達で測定した場合に天然のホルモンに対して活性の低いインスリン類縁体が得られることを示す。これらの結果は、長さが８〜１２アミノ酸のペプチドを用いてＢ鎖のＣ末端をＡ鎖のＮ末端に線形結合した、本発明者らが単一のインスリン類縁体で過去に観察した活性ほど印象的ではなかった（図１４〜図１８参照）。
表１６および図２１は、同じサイズのミニｐｅｇリンカーを用いて、短いＢ鎖のＣ末端をＡ鎖のＮ末端に結合すると、活性が劇的に増えることを示している。ｄｅｓ−Ｖ（アミノ酸Ｂ２６〜３０が欠落）インスリン類縁体は、ミニｐｅｇに結合すると、天然のホルモンに匹敵する強力さになり、その値は全長Ｂ鎖類縁体に比して１０倍を超えて増えた。
Figure 0005969469
図２２は、Ａ鎖およびＢ鎖がインスリンまたはＩＧＦ−１から誘導されたヘテロ二本鎖の天然のインスリンと単鎖インスリン類縁体との性能が匹敵することを示している。ペプチドは、同じような生活性を持つことが明らかになった。図２３は、インスリン受容体活性を高めるために、大きくＩＧＦ−１に基づく配列を有するが、Ｂ１６，１７ＹＬの変化を含む、Ｂ鎖のｄｅｓ−Ｖ形式のＰＥＧ１２リンカーを用いてさらに分析したものである。これらの結果から、Ａ８の位置にヒスチジンを用いて、極めて活性の高いインスリン類縁体を得られることがわかる。残留ＩＧＦ−１受容体活性は、天然のインスリンよりもわずかに高い。図２４は、インスリン受容体活性とＩＧＦ−１受容体活性が比例的に相関することを示しており、これは、二本鎖の天然のインスリン構造で実施された構造機能的な分析で知られている関係と一致する。
図２５は、インスリン特異的な分解酵素（ＩＤＥ）によるインスリン類縁体の切断が、極めてしっかりしたものであり、Ａ鎖が天然のインスリン配列由来のインスリン類縁体で容易に検出できることを示している。対照的に、Ａ鎖がＩＧＦ−１の配列由来の類縁体は、タンパク質分解に対して極めて耐性があるように見える。安定性が増すと、分裂促進性が増すであろうという予測について調査し、結果を図２６に示す。インスリン活性の高い類縁体と増殖の増加との間に相関があるようには見えなかった。さらに、タンパク質分解能に特に重要なことに、ＩＤＥに対する耐性の高い類縁体は、分裂促進的が大きいようには見えなかった。
異なる大きさのＰＥＧ橋渡し部分が、リン酸化による受容体のシグナル伝達を基準に判断できるインスリン受容体およびＩＧＦ−１受容体に対するin vitroでの活性にどのように影響するかを調べるために、ＰＥＧ鎖リンカーを用いて単鎖類縁体の比較分析を実施した。図２７に示すデータは、ＰＥＧ１２ＤｅｓＶコンストラクト（Ｂ鎖のカルボキシ末端側の５つのアミノ酸が欠失）によって、最も強力な化合物が得られることを明らかにしている。
ＰＥＧ１２と、ＤｅｓＶ Ｂ鎖を天然のインスリンのＡ鎖に結合する橋渡し部分として単一のアミノ酸（グリシンまたはリジン）とを有する単鎖類縁体を構築した。受容体の結合とリン酸化による受容体のシグナル伝達を基準に判断できる、インスリン受容体およびＩＧＦ−１受容体に対する、単鎖ＰＥＧ／アミノ酸結合類縁体のｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性の比較分析によって、ＰＥＧ／アミノ酸結合類縁体が強力なインスリン受容体アゴニストであることが明らかになった（図２８Ａ参照）。同様に、２つのリジン残基を橋渡し部分に加えると（単鎖ＰＥＧ／（リジン）２−結合類縁体）、受容体の結合とリン酸化による受容体のシグナル伝達を基準に判断できる、強力な単鎖ＰＥＧ／アミノ酸結合インスリン受容体アゴニストが形成された（図２８Ｂ参照）。
図２９Ａ〜図２９Ｅは、さまざまな単鎖インスリン類縁体を投与したマウスでのデータを示す。図２９Ａは、受容体の結合とリン酸化による受容体のシグナル伝達を基準に判断できる、インスリン受容体に対する単鎖ＰＥＧ結合類縁体活性のin vitroでの比較分析である。化合物をマウスに投与して、in vivoでの化合物の活性を試験した。健常マウスにはペプチドを投与する４時間前に食餌を与えるのをやめ、研究中はそのまま控えておいた。被験化合物の投与の直前と、投与の１、２、３、６および８、１２、１６、２０および２４時間後にグルコースを測定した。インスリン類縁体はいずれも、体重１ｇあたり１０μｌの量で皮下投与した。図２９Ｂおよび２９Ｃは、標記の類縁体を投与後８時間にわたる血中グルコース濃度のデータである。図２９Ｄおよび図２９Ｅは、標記の類縁体を投与後の血中グルコースＡＵＣ値のデータである。
マウスにおけるインスリン耐性試験（ＩＴＴ）時の血中グルコースの分析から、インスリン配列または大幅にＩＧＦ−１に基づく配列のいずれかを有するが、Ｂ１６，１７ＹＬを含むＢ鎖のｄｅｓ−Ｖ形態のＰＥＧ１２リンカーでは、ヒトインスリンに匹敵する結果が得られた。図２７参照。よって、ＰＥＧ橋渡し部分に結合した単鎖インスリンは、in vivoで機能する。
実施例１６
アシル化インスリン類縁体
３種類の異なるアシル化インスリン類縁体に比して、ヒトインスリンが血中グルコース濃度を下げてこれを低く維持する機能を比較してマウスで、インスリン耐性比較試験を実施した。化合物については２種類の異なる濃度で試験した（２７ｎｍｏｌ／ｋｇおよび９０ｎｍｏｌ／ｋｇ）。アシル化インスリンには、ＭＩＵ−４１（Ａ１４の位置にあるリジン残基に結合したγグルタミン酸リンカーを介したＣ１６のアシル化を有する二本鎖インスリン類縁体）、ＭＩＵ−３６（Ｂ鎖のＮ末端に結合したＣ１６アシル化を有する二本鎖インスリン類縁体）、ＭＩＵ−３７（Ｂ２２の位置にあるリジン残基に結合したγグルタミン酸リンカーを介したＣ１６のアシル化を有する二本鎖インスリン類縁体）を含めた。これらの３種類のアシル化されたインスリン類縁体ではいずれも、８時間後にすら天然のインスリンよりも基線に近い低いグルコースレベルとなった（図３０Ａ〜図３０Ｄ）参照。
図３１Ａ〜図３１Ｄは、アシル化された二本鎖インスリンアゴニストＭＩＵ−５５に比して、市販のアシル化されたインスリン類縁体（Ｄｅｔｅｍｉｒ）の機能を比較してマウスで実施した、インスリン耐性比較試験の結果を示す。ＭＩＵ−５５［Ｂ１（Ｈ５、１０、Ｙ１６、Ｌ１７、Ｃ１６ｒＥ−Ｋ２２）２５ａ：Ａ１（Ｎ１８，Ｎ２１）］は、Ｂ鎖のＣ末端側の５つのアミノ酸が欠失し、Ｌｙｓ Ｂ２９のε−アミノ基のγＧｌｕリンカーを介してＣ１４脂肪酸（ミリストイル酸）でアシル化される。これらの結果から、ＭＩＵ−５５は、Ｄｅｔｅｍｉｒと比べると強さが約１／３である（図３１Ａおよび図３１Ｂ参照）。また、これらのデータは、インスリンのアシル化形態のほうが、アシル化されていない形態よりも長く作用し、ＭＩＵ−５５は、Ｄｅｔｅｍｉｒほど強力ではないが、Ｄｅｔｅｍｉｒと同様のプロファイルを呈することも示している。図３１Ｃおよび図３１Ｄは、標記の類縁体を投与後の血中グルコースＡＵＣ値のデータである。インスリン耐性試験におけるＤｅｔｅｍｉｒとＭＩＵ−４９との比較によって、同様の結果が明らかになった（図３２Ａ〜図３２Ｄ参照）。ＭＩＵ−４９［Ｂ１（Ｃ１６−ｒＥ，Ｈ５、Ａｉｂ９、Ｈ１０、E１３−Ｋ１７、Ｙ１６）２５ａ：Ａ１（Ｎ１８、Ｎ２１）］は、Ｂ鎖のＣ末端側の５つのアミノ酸が欠失し、Ｇｌｙ Ｂ２のα−アミノ基でγＧｌｕリンカーを介してＣ１６脂肪酸でアシル化された二本鎖インスリンアゴニストである。繰り返すが、これらのデータから、ＭＩＵ−４９は、Ｄｅｔｅｍｉｒと比べると強さが約１／３であり（図３２および図３２Ｂ参照）、ＭＩＵ−４９はＤｅｔｅｍｉｒほど強くはないが、Ｄｅｔｅｍｉｒと同様のプロファイルを呈することがわかる。
実施例１７
ＰＥＧ化インスリン類縁体
さまざまなＰＥＧ化インスリン類縁体を調製し、in vitroで試験した。表１７は、各類縁体の天然のインスリンに対する活性（％）を示す。
Figure 0005969469
アシル化インスリン類縁体ＤｅｔｅｍｉｒとＰＥＧ化された単鎖インスリン類縁体ＭＩＵ−５６：Ｂ１（Ｈ５，Ｙ１６，Ｌ１７）２５−ＰＥＧ８−Ｋ−ＰＥＧ４−Ａ１（Ｎ１８，２１）の機能を比較して、マウスでインスリン耐性比較試験を実施した。この単鎖類縁体は、Ａ鎖とＢ鎖を結合する橋渡し部分（ＰＥＧ８−Ｋ−ＰＥＧ４）で単一のリジン残基の側鎖に結合した２０ｋＤａのＰＥＧを有する。図３３Ａ〜図３３Ｄに示すように、ＰＥＧ化された類縁体は、２４時間の持続時間に必要な用量で、２４時間の作用時間が長くなり、作用開始もゆっくりで動物を平静状態に保つのには十分であった。図３３Ｃおよび図３３Ｄはそれぞれ、ＤｅｔｅｍｉｒおよびＭＩＵ−５６を投与したマウスでの血中グルコースＡＵＣ２４時間を示している。別のＰＥＧ化された単鎖インスリン類縁体であるＭＩＵ−５７でも同様の結果が得られた（図３４Ａ〜図３４Ｄ参照）。ＭＩＵ−５７は、２０ｋＤａのＰＥＧがＢ鎖のＮ末端のアミンに結合したインスリン単鎖類縁体（Ｂ１（Ｈ５、Ｙ１６、Ｌ１７）２５−Ｃ１−Ａ１（Ｎ１８、２１）である。図３４Ａおよび図３４Ｂは、橋渡し部分でＰＥＧ化された（ＭＩＵ−５６）またはＢ鎖のＮ末端のアミンでＰＥＧ化された（ＭＩＵ−５７）単鎖インスリン類縁体のインスリン用量比較滴定の結果を示す。図３４Ｃおよび図３４Ｄはそれぞれ、ＭＩＵ−５６およびＭＩＵ−５７を投与したマウスでの血中グルコースＡＵＣ２４時間を示す。このデータから、これらの類縁体が強力なままで、天然のインスリンよりも治療指数が改善されることがわかる。ＭＩＵ−５６およびＭＩＵ−５７のインスリン用量比較滴定の結果から、２０ｎｍｏｌ／ｋｇから８０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量範囲では、マウスで同様のプロファイルが得られることが明らかになる（図３４Ｅおよび図３４Ｆを参照のこと）。
２つのインスリン単鎖類縁体（Ｂ１（Ｈ５、Ｙ１６、Ｌ１７）２５−Ｃ１−Ａ１（Ｎ１８、２１）が２０ｋＤａのＰＥＧ鎖を介して端と端で結合したダイマー（ＭＩＵ ５８）を調製した。図３４Ｇ〜図３４Ｊは、Ｃ５７／Ｂｌｋマウスを用いてＭＩＵ−５７およびＭＩＵ−５８のインスリン耐性比較試験で得られた結果を示す。図３４Ｇおよび図３４Ｈは、ＭＩＵ−５７とＭＩＵ−５８を比較したインスリン耐性試験の結果を示すグラフである。図３４Ｉおよび図３４Ｊはそれぞれ、ＭＩＵ−５７およびＭＩＵ−５８を投与したマウスでの血中グルコースＡＵＣ２４時間を示している。ダイマーは親化合物より強力ではないが、依然として活性を維持している。
図３５Ａおよび図３５Ｂは、ＰＥＧ化された２種類の天然のインスリンヘテロダイマーでのインスリン用量比較滴定のデータである。類縁体は、天然のジスルフィド結合を介して結合し、Ｂ鎖のＮ末端で結合した２０ｋＤａのＰＥＧまたはＢ２９の位置（Ａ鎖およびＢ鎖のアミノ末端をカルバミル化しておく）のいずれかを持つように修飾された２つの天然のインスリンＡ鎖およびＢ鎖配列を有する。データは、これらの化合物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ活での活性がわずかに異なり（表１７参照）、マウスのin vivoでは同じように作用することを示している。どちらの化合物も強力なままであり、ＰＥＧ化されていない天然のインスリンに比して治療指数を改善した（作用開始がゆっくりで、活性が２４時間持続し、応答が比較的平坦である）。
２つまたは３つ以上の共有結合したポリエチレングリコール鎖を有するインスリン類縁体を構築し、単一の２０ｋＤａ ＰＥＧがＮ末端に結合した天然のインスリン類縁体と比較した。特に、２つのＰＥＧ鎖（各１０Ｋ）がＮ末端のαアミンと橋渡し部分の８番目のアミノ酸（Ｃ８の位置）に結合した単鎖インスリン類縁体（Ｂ１（Ｈ５，Ｙ１６，Ｌ１７）２５−Ｃ１（Ｋ８）−Ａ１（Ｎ１８，２１））、２つのＰＥＧ鎖（各１０Ｋ）がＮ末端のαアミンとアミノ酸Ｂ２２に結合した単鎖インスリン類縁体（Ｂ１（Ｈ５，Ｙ１６，Ｌ１７，Ｋ２２）２５−Ｃ１（Ｋ８）−Ａ１（Ｎ１８，２１））、２つのＰＥＧ鎖（各１０Ｋ）がＮ末端のαアミンとアミノ酸Ａ１４に結合した単鎖インスリン類縁体（Ｂ１（Ｈ５，Ｙ１６，Ｌ１７）２５−Ｃ１（Ｋ８）−Ａ１（Ｋ１４、Ｎ１８，２１））の活性を比較した。図３６Ａ〜図３６Ｄは、単一ＰＥＧ化された天然のインスリン誘導体に対する、これらの３つのＰＥＧ化インスリン類縁体でのインスリン用量比較滴定のデータである。in vitroでの活性は、少なくとも１０分の１に、劇的に低下する。しかしながら、ｉｎ ｖｉｖｏでのデータは、いくらかの活性が失われることを示しているが、二重ＰＥＧ化インスリン類縁体は、依然として有効である（特に橋渡し部分でＰＥＧ化された類縁体）ことがわかる。特に、８０ｎｍｏｌ／ｋｇのＭＩＵ−６７は、投与後少なくとも最大８時間後までは、血中グルコース濃度の低下という点で、４０ｎｍｏｌ／ｋｇで投与したＭＩＵ−５９とほぼ同じである。よって、ＰＥＧ化されていないインスリン類縁体よりも治療指数を改善する、長さ１０ｋＤａの２つのＰＥＧ鎖を有するインスリン類縁体を調製することが可能である。また、単鎖類縁体の橋渡し部分でのＰＥＧ化は、好ましいＰＥＧ化部位であるように見える。
糖尿病マウス（ｄｂ／ｄｂ マウス）に、ＰＥＧ化インスリン類縁体を投与して、市販のインスリン類縁体と効力を比較した。特に、インスリン類縁体LevemirおよびHumulinを、ＰＥＧ化インスリン類縁体ＭＩＵ−５９（２０ｋＤａのＰＥＧが１つＮ末端に結合している天然のインスリン類縁体）およびＭＩＵ−６６（２０ｋＤａのＰＥＧが１つＢ鎖のＮ末端に結合し、Ａ鎖のアミノ末端がカルバミル化された天然のインスリン類縁体）と比較した。in vitroでのデータ（表１７参照）では、ＭＩＵ−６６のほうがＭＩＵ−５９より弱いことが示されたが、ＭＩＵ−５９およびＭＩＵ−６６はin vivoで同じように作用し、どちらもLevemirおよびHumulinに比して活性が改善された（図３７Ａおよび図３７Ｂ参照）。
まとめると、インスリン類縁体のＰＥＧ化は、インスリン系またはＩＧＦ系のどちらのペプチド骨格を用いても、in vivoで、作用時間を延ばし、低血糖症のない基底のプロファイルを提供する。
実施例１８
インスリンプロドラッグ類縁体のインスリン耐性の比較
健常なマウスに、インスリンヘテロダイマー類縁体［Ｂ１（Ｙ１６，Ｌ１７，Ｙ２５）２９ａ：Ａ１（ａＦ１９−ＮＨ２）］、またはそのプロドラッグ誘導体を投与した。プロドラッグ誘導体［Ｂ１（Ｙ１６，Ｌ１７，Ｙ２５）２９ａ ：Ａ１（ａＦ１９−ｄＬｙｓ（Ａｃ），ＮＬｅｕ）］は、Ａ１９の位置で４−アミノフェニルアラニン置換を有し、ジペプチドｄＬｙｓ（Ａｃ），ＮＬｅｕが、Ａ１９残基の４−アミノ位置で共有結合している。このジペプチドは、生理的条件下で自律的に切断し、半減期はおよそ ５時間である。プロドラッグ誘導体［Ｂ１（Ｙ１６，Ｌ１７，Ｙ２５）２９ａ：Ａ１（ａＦ１９−ｄＬｙｓ（Ａｃ），ＮＬｅｕ）］を２４時間ex vivoでインキュベーション後、得られた化合物をマウスに投与し、血中グルコースを下げる機能を親化合物と比較した。図３８に示すように、２種類の化合物がほぼ同じように機能した。
実施例１９
ＰＥＧ化低活性アラニン類縁体
インスリン受容体に対する活性を下げることで、本明細書に開示のさまざまなインスリン類縁体の作用時間を延ばすことが可能である。よって、一実施形態では、本明細書に開示のインスリン類縁体を修飾し、インスリン受容体に対する活性を下げることが可能である。この修飾には、１から８、１から５、１から３、１から２または１つのアミノ酸置換を含む。一実施形態では、アミノ酸置換は、Ｂ５、Ｂ１０、Ｂ２４、Ａ１またはＡ８からなる群から選択される位置でのアラニン置換である。これらの位置の１つまたは２つ以上でのアラニン置換によって、インスリン受容体に対する活性が実質的に低下して、作用時間が長くなる。一実施形態では、Ｂ５、Ｂ２４、Ａ１またはＡ８の位置での単一のアラニンアミノ酸置換によって本明細書に開示のインスリン類縁体をさらに修飾することが可能である。これらの化合物は、表１８に示すようなＰＥＧ化でさらに修飾可能である（ＧＥ５Ｗ＝ＧＥＥＥＥＥＷ、インスリン類縁体のＮ末端にペプチドを付加して溶解性を高めてある）。
Figure 0005969469
表１９に示すように、単鎖および二本鎖インスリン類縁体を調製し、in vitroでインスリン受容体およびＩＧＦ−１受容体に対する活性を試験し、ＰＥＧ化された誘導体と比較した。ＰＥＧ化されていない形態は、ＰＥＧ化された誘導体よりも活性が高かった。さらに、２つの１０ｋＤａ ＰＥＧ鎖を用いて二本鎖インスリン類縁体を脱ＰＥＧ化すると、単一の２０ｋＤａ ＰＥＧ鎖を有する同じ類縁体に対して活性が類似の化合物が得られる（Ｂ１，Ａ１４−１０K Ｂ１（Ｈ５，１０Ｙ１６Ｌ１７Ｒ２９）２９：Ａ１（Ｈ８Ｋ１４Ｎ１８，２１）およびＢ１（Ｈ５，１０Ｙ１６Ｌ１７Ｋ２９）２９ ：Ａ１（Ｈ８Ｎ１８，２１に対するＢ１（Ｈ５，１０Ｙ１６Ｌ１７Ｋ２９）２９：Ａ１（Ｈ８，Ｎ１８，２１）の相対活性を参照のこと）。単鎖類縁体Ｂ１（Ｈ５，１０Ｙ１６Ｌ１７Ｋ２９）２９−Ａ１（Ｈ８，Ｎ１８，２１）では、２０ｋＤａを付加すると、インスリンＡ型受容体に対する活性がほぼ１００倍の化合物（Ｂ１（Ｈ５，１０Ｙ１６Ｌ１７Ｋ２９）２９−Ａ１（Ｈ８Ｎ１８，２１）が得られる。よって、二本鎖または単鎖類縁体としてインスリン類縁体を調製し、ＰＥＧ鎖を結合する大きさ、数、部位を選択することで、インスリン類縁体のin vivoでの活性を調節し、おそらくはin vivoでの作用時間も調節できる。
Figure 0005969469

Claims (14)

  1. 一般構造Ｂ−ＬＭ−Ａを有する単鎖インスリンアゴニスト類縁体であって、
    Ｂは、配列Ｒ 22 −Ｘ25ＬＣＧＸ29Ｘ30ＬＶＸ33Ｘ34ＬＹＬＶＣＧＤＸ 41 Ｘ42ＧＦＸ45（配列番号２１）を有するインスリンのＢ鎖であり、
    Ａは、配列ＧＩＶＸ4Ｘ5ＣＣＸ8Ｘ9Ｘ10ＣＸ12ＬＸ14Ｘ15ＬＸ17Ｘ18Ｘ19ＣＸ21−Ｒ13（配列番号２２）を有するインスリンのＡ鎖であり、
    ＬＭは、前記Ｂ鎖のカルボキシ末端と前記Ａ鎖のアミノ末端とを結合する橋渡し部分であり、
    Ｒ13は、ＣＯＯＨまたはＣＯＮＨ2であり、
    Ｘ4は、グルタミン酸またはアスパラギン酸であり、
    Ｘ5は、グルタミンまたはグルタミン酸であり、
    Ｘ8は、ヒスチジン、スレオニン、またはフェニルアラニンであり、
    Ｘ9は、セリン、アルギニン、リジン、オルニチン、またはアラニンであり、
    Ｘ10は、イソロイシンまたはセリンであり、
    Ｘ12は、セリンまたはアスパラギン酸であり、
    Ｘ14は、チロシン、アルギニン、リジン、オルニチン、またはアラニンであり、
    Ｘ15は、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、アラニン、リジン、オルニチン、またはロイシンであり、
    Ｘ17は、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、アスパラギン酸、リジン、またはオルニチンであり、
    Ｘ18は、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、またはスレオニンであり、
    Ｘ19は、チロシン、４−メトキシフェニルアラニン、または４−アミノフェニルアラニンであり、
    Ｘ21は、アラニン、グリシン、セリン、バリン、スレオニン、イソロイシン、ロイシン、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、トリプトファン、チロシン、およびメチオニンからなる群から選択され、
    Ｘ25は、ヒスチジンおよびスレオニンからなる群から選択され、
    Ｘ29は、アラニン、グリシン、およびセリンからなる群から選択され、
    Ｘ30は、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸、およびシステイン酸からなる群から選択され、
    Ｘ33は、アスパラギン酸、グルタミン、およびグルタミン酸からなる群から選択され、
    Ｘ34は、アラニンおよびスレオニンからなる群から選択され、
    Ｘ41は、アスパラギン酸、アスパラギン、およびグルタミン酸からなる群から選択され、
    Ｘ42は、アラニン、リジン、オルニチン、およびアルギニンからなる群から選択され、
    Ｘ45は、チロシン、ヒスチジン、アスパラギン、およびフェニルアラニンからなる群から選択され、
    ここでさらに、前記橋渡し部分は、ＧＸ 52 ＧＳＳＳＲＲ（Ｘ52は、チロシン以外のアミノ酸である）（配列番号３１）からなるか、または配列番号３１において１番目、３番目、４番目、５番目、６番目、７番目、または８番目のいずれかの位置における１つのアミノ酸置換を有する配列であり、
    Ｒ22は、ＡＹＲＰＳＥ（配列番号１４）、ＦＶＮＱ（配列番号１２）、ＰＧＰＥ（配列番号１１）、トリペプチドであるグリシン−プロリン−グルタミン酸、トリペプチドであるバリン−アスパラギン−グルタミン、ジペプチドであるプロリン−グルタミン酸、ジペプチドであるアスパラギン−グルタミン、グルタミン、グルタミン酸、およびＮ末端アミンからなる群から選択される。
  2. 前記橋渡し部分は、配列ＧＸ52ＧＳＳＳＲＲ（配列番号３１）からなる８個のアミノ酸の配列（ここで、Ｘ52はチロシン以外のアミノ酸である）である、請求項１に記載のインスリン類縁体。
  3. 前記橋渡し部分のアミノ酸、前記Ａ鎖のＡ９、Ａ１４、およびＡ１５からなる群から選択される位置におけるアミノ酸、または、前記Ｂ鎖の位置Ｂ１、Ｂ２、Ｂ１０、Ｂ２２、Ｂ２８、もしくはＢ２９におけるアミノ酸のいずれかに共有結合している親水体を含む、請求項１または２に記載のインスリン類縁体。
  4. 前記親水体はポリエチレングリコール鎖であって、
    前記ポリエチレングリコール鎖は、前記橋渡し部分のＣ７もしくはＣ８の位置におけるアミノ酸の側鎖、前記Ｂ鎖のＮ末端のαアミン、前記Ａ鎖のＡ１４の位置におけるアミノ酸の側鎖、または、前記Ｂ鎖のＢ１、Ｂ２、Ｂ２２、もしくはＢ２９の位置におけるアミノ酸の側鎖に共有結合している、請求項３に記載のインスリン類縁体。
  5. Ｘ52はアラニンである、請求項１に記載のインスリン類縁体。
  6. 前記Ａ鎖は、配列ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ（配列番号１）を有し、
    前記Ｂ鎖は、配列ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴ（配列番号２）を有する、
    請求項１に記載のインスリン類縁体。
  7. 前記橋渡し部分は、ＧＡＧＳＳＳＲＲ（配列番号３２）である、請求項１または請求項６に記載のインスリン類縁体。
  8. 前記Ａ鎖は、配列ＧＩＶＤＥＣＣＸ8ＲＳＣＤＬＹＱＬＥＮＸ19ＣＮ−Ｒ13（配列番号１９５）、または配列ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ（配列番号１）を有し、
    前記Ｂ鎖は、配列ＧＰＥＸ25ＬＣＧＳＨＬＶＤＡＬＹＬＶＣＧＤＸ42ＧＦＸ45（配列番号１９６）、または配列ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴ（配列番号２）を有し、ここで、
    Ｘ8は、スレオニン、ヒスチジンまたはフェニルアラニンであり、
    Ｘ19は、チロシン、４−メトキシフェニルアラニンまたは４−アミノフェニルアラニンであり、
    Ｘ25は、ヒスチジンまたはスレオニンであり、
    Ｘ42は、アラニン、オルニチンまたはアルギニンであり、
    Ｘ45は、チロシン、ヒスチジン、アスパラギンまたはフェニルアラニンであり、
    Ｒ13は、ＣＯＯＨまたはＣＯＮＨ2である、
    請求項１または請求項５に記載のインスリン類縁体。
  9. 請求項１〜８のいずれか１項に記載の単鎖インスリン類縁体のプロドラッグ誘導体であって、
    構造Ｕ−Ｚを有し、ここで、
    Ｕは、アミノ酸またはヒドロキシ酸であり、
    Ｚは、前記単鎖インスリン類縁体のアミンとＺのカルボキシル部分との間のアミド結合を介して前記単鎖インスリン類縁体に結合したＮアルキル化アミノ酸であり、
    Ｕ−Ｚは、以下の式Ｘの構造を有するプロドラッグ誘導体。
    Figure 0005969469
    （式中、Ｒ 1 およびＲ 2 は独立に、水素、Ｃ 1 〜Ｃ 8 アルキル、およびアリールからなる群から選択され、
    Ｒ 3 は、Ｃ 1 〜Ｃ 18 アルキルであるか、あるいは、Ｒ 3 とＲ 4 は、これらが結合している原子と一緒になって、４〜６員環の複素環を形成し、
    Ｒ 4 およびＲ 8 は各々水素であり、
    Ｒ 5 は、アミン、Ｎ置換アミン、およびヒドロキシルからなる群から選択される。）
  10. 前記構造Ｕ−Ｚのアミノ酸または前記橋渡し部分に結合した、ポリエチレングリコール鎖をさらに有するか、または、
    前記構造Ｕ−Ｚのアミノ酸または前記橋渡し部分に結合した、デポーポリマーをさらに有する、
    請求項９に記載のプロドラッグ。
  11. 前記単鎖インスリンアゴニストのアミノ酸側鎖が、アルキルアミン結合、アミド結合、エーテル結合、エステル結合、チオエーテル結合、またはチオエステル結合を介してアシル基またはアルキル基に共有結合し、
    前記アシル基またはアルキル基は、天然のアミノ酸に対して非天然である、請求項１に記載の単鎖インスリンアゴニスト類縁体。
  12. 請求項１に記載の単鎖インスリンアゴニストを有する、ダイマーまたはマルチマー。
  13. 請求項１に記載の単鎖インスリンアゴニストと、薬学的に許容されるキャリアとを含む、薬学的組成物。
  14. 糖尿病の治療剤である、請求項１３に記載の薬学的組成物。
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