CN103068842B - 对胰岛素受体具有高活性的单链胰岛素激动剂 - Google Patents

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Abstract

本文提供对胰岛素受体具有高效力和特异性的单链胰岛素类似物。可使用本文公开的最适大小的连接部分连接人胰岛素A链和B链或其类似物或衍生物，其中B链B25氨基酸的羧基端通过间插连接部分与A链A1氨基酸的氨基端连接。在一个实施方案中，连接部分包含6‑16个单体单元的聚乙二醇，而在备选实施方案中，连接部分包含来源于IGF‑1 C肽并包含长度为至少8个氨基酸而不超过12个氨基酸的非天然氨基酸序列。本文还公开了单链胰岛素类似物的前药和缀合物衍生物。

Description

对胰岛素受体具有高活性的单链胰岛素激动剂
相关申请的交叉引用
本申请要求分别于2010年6月16日和2011年1月17日提交的美国临时专利申请号61/355,366和61/433,500的优先权，其每一份都通过引用以其整体结合到本文中。
通过电子提交材料的引用予以结合
通过引用以其整体予以结合的是随附的同时提交的计算机可读核苷酸/氨基酸序列表，并如下识别：一份2011年1月15日创建的命名为“Seqlist_singleST25”的90 KB ACII(Text)文件。
背景
胰岛素是一种经过验证的疗法，用于治疗幼年型糖尿病和较晚阶段的成人型糖尿病。该肽经生物合成成为低效力(约天然胰岛素的2%-9%)的较大线性前体，称为胰岛素原。胰岛素原通过选择性脱去35个残基连接肽(C肽)而被蛋白水解转化为胰岛素。通过胰岛素“A链” (SEQ ID NO：1)和“B链” (SEQ ID NO：2)链之间的二硫键形成所得的有51个氨基酸的异源双链，其对胰岛素受体具有高效力(nM范围)。天然胰岛素对胰岛素受体具有相对于相关胰岛素样生长因子1受体约100倍的选择性亲和力，但是对于两种不同的胰岛素受体同种型(名为A和B)几乎无选择性。
胰岛素样生长因子1和2是单链线性肽激素，在其A和B链序列中是高度同源的，与天然胰岛素具有约50%同源性。IGF A和B链由“C肽”连接，其中两种IGF的C肽在大小和氨基酸序列上不同，第一个长为12个氨基酸，第二个长为8个氨基酸。人IGF-1为70 aa碱性肽，具有SEQ ID NO: 3所示的蛋白质序列，并与胰岛素原具有43%同源性(Rinderknecht等(1978)J. Biol. Chem. 253:2769-2776)。人IGF-2为67个氨基酸碱性肽，具有SEQ ID NO: 4所示的蛋白质序列。与对A受体同种型的活性相比，IGF对胰岛素B受体同种型的活性少得多。
申请人之前已经鉴定出基于IGF-l的胰岛素肽类似物(其中B链的天然Gln-Phe二肽被Tyr-Leu置换)对胰岛素受体显示高活性(参见PCT/US2009/068713，其公开内容结合到本文中)。这类类似物(本文称为IGFYL类似物肽(analog peptide))比胰岛素更容易合成，并且使得能够开发用于胰岛素和IGF-1受体的共同激动剂类似物和选择性胰岛素受体特异性类似物。此外，可按照本公开内容，将这些胰岛素类似物配制成单链胰岛素激动剂。
之前已制备了包含胰岛素A和B链的单链胰岛素类似物(参见EP 1,193,272和US2007/0129284)。然而，之前公开的单链胰岛素类似物的缺点是，对胰岛素受体的效力低和/或对IGF-1受体的效力相对高。根据以下发现制备本发明的化合物，即可通过插入IGF-l C肽或其类似物作为连接胰岛素B和A肽的连接肽，来制备单链高效力胰岛素激动剂。C肽序列中个别氨基酸的选择性突变产生相对于IGF-1受体对胰岛素有高度选择性的肽。
另外，单链胰岛素激动剂的制剂可能加强胰岛素和胰岛素类似物的二级结构，以改进生物生理稳定性、治疗指数和体内药理学。胰岛素的药理不是葡萄糖敏感的，因此，给予胰岛素可能导致可引起危及生命的低血糖的过度作用。不稳定的药理作用是胰岛素疗法的标志，使得极难以使血糖正常而又不发生低血糖。此外，天然胰岛素具有短的作用持续时间，需要改进以使其适用于基础葡萄糖的控制。单链胰岛素类似物肽适于进一步的结构改进，预期结构改进：通过利用前药化学得到改进的治疗指数；通过连接血浆蛋白质例如白蛋白或其它修饰(包括聚乙二醇化和酰化)延长作用持续时间；通过糖基化提高物理稳定性；通过采用胆固醇或维生素样取代基进行化学修饰而得到优选的组织靶向。使用C肽接头制备单链胰岛素类似物还提供新的结构位置，其中可成功地部署许多的这些化学修饰。这类优化胰岛素激动剂的主要用途可以是用于胰岛素依赖型糖尿病的治疗中。
概述
如本文所公开的，申请人发现了高效力的单链胰岛素类似物。更具体地讲，在一个实施方案中，提供相对于IGF-1受体对胰岛素受体有高选择性的高效力单链胰岛素激动剂多肽。按照一个实施方案，单链胰岛素类似物激动剂包含人胰岛素的B链和A链或其类似物或衍生物，其中B链的羧基端通过连接部分与A链的氨基端连接。在一个实施方案中，B链是氨基酸B26-B30被脱去的C端截短B链(相对于天然胰岛素B链的位置)。在该实施方案中，B链B25氨基酸的羧基端与连接部分的第一末端直接连接，连接部分的第二末端与A链A1氨基酸的氨基端直接连接。在一个其中线性单链胰岛素类似物包含C端截短的B链，而连接部分为肽的实施方案中，连接部分的长度至少为8个氨基酸，但是长度不超过17个氨基酸。在其中线性单链胰岛素类似物包含全长B链，连接部分为肽的实施方案中，连接部分的长度至少为8个氨基酸，但长度不超过12个氨基酸。
按照一个实施方案，连接部分包含
a) 6-16个单体单元的聚乙二醇；
b) 长度为至少8个氨基酸而不超过17个氨基酸并且包含序列X51X52X53X54X55X56X57X58 (SEQ ID NO: 9)的非天然胰岛素或IGF氨基酸序列或其肽模拟物；或
c) 所述聚乙二醇和1-4个氨基酸的缩短氨基酸序列的组合，其中
X51选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸；
X52是酪氨酸以外的任何氨基酸；
X53-X56各自独立地为任何氨基酸；和
X57和X58独立选自精氨酸、鸟氨酸和赖氨酸。连接部分可包含非天然存在的氨基酸以及逆倒位片段，或掺入非肽键例如氮杂肽键(azapeptide bond) (CO被NH取代)或假肽键(例如NH被CH2取代)或酯键(例如缩肽(depsipeptide)，其中一个或多个酰胺(-CONHR-)键被酯(COOR)键置换)。当连接部分包含氨基酸序列时，还预期任何指定的氨基酸还包括规定氨基酸的衍生物，包括对氨基酸的化学修饰，例如酪氨酸残基中的硝基，或酪氨酸残基中的碘，或通过游离羧基向酯基或向酰胺基转化，或通过氨基经酰化向酰胺转化，或通过使羟基酰化以提供酯，或通过使伯胺烷基化以提供仲胺或亲水部分与氨基酸侧链连接。其它衍生物通过氨基酸侧链的氧化或还原来获得。
在一个实施方案中，单链胰岛素类似物包含与B链的N端或与连接部分的氨基酸侧链连接的亲水部分。更具体地讲，在一个实施方案中，单链胰岛素激动剂类似物包含通用结构B-LM-A，其中B表示胰岛素B链，A表示胰岛素A链，LM表示连接B链羧基端与A链氨基端的连接部分，其中连接部分还包含与以下连接的亲水部分：连接部分的氨基酸侧链和/或B链的N端α胺(对于基于胰岛素的B链为B1位，对于基于IGF-1的B链为B2位)或选自A链的A9、A14和A15位或B链的B1、B2、B10、B22、B28或B29位的氨基酸侧链。在一个实施方案中，亲水部分与B链的N端α胺(即采用基于胰岛素的编码方案为胰岛素的B1位或IGF胰岛素激动剂的B2位)连接。在一个实施方案中，亲水部分是聚乙烯链，而在进一步的实施方案中，聚乙烯链与连接部分的氨基酸侧链共价结合。在一个实施方案中，连接部分(LM)包含长度不超过17个氨基酸的氨基酸序列，并包含序列X51X52X53X54X55X56X57X58 (SEQ ID NO: 9)，其中
X51选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸；
X52是酪氨酸以外的任何氨基酸；
X53-X56各自独立地为任何氨基酸；和
X57和X58独立地为精氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、高半胱氨酸、乙酰基-苯丙氨酸或鸟氨酸。在一个实施方案中，连接部分(LM)包含序列X51X52GSSSX57X58 (SEQ ID NO: 29)或X51X52GSSSX57X58APQT (SEQ ID NO: 46)，其中指定为X57或X58的氨基酸还包含与该位置的氨基酸侧链连接的亲水部分。在一个实施方案中，亲水部分是聚乙二醇链。
在一个实施方案中，连接部分包含包含序列GYGSSSX57X58 (SEQ ID NO: 85)或GYGSSSX57X58APQT (SEQ ID NO: 37)的8-17个氨基酸序列或其肽模拟物；
其中
X57和X58独立地为精氨酸、赖氨酸或鸟氨酸。在一个实施方案中，亲水部分与位于包含SEQ ID NO: 37或85的连接部分8位的氨基酸侧链连接。
在一个实施方案中，连接部分包含
1) 6-16个单体单元的线性聚乙二醇链，
2) 长度为至少8个氨基酸而不超过12个氨基酸并且包含序列X51X52X53X54X55X56RR(SEQ ID NO: 10)的氨基酸序列，或
3) 所述聚乙二醇链和氨基酸序列的组合。在进一步的实施方案中，连接部分选自(Y1)k-X51AX53X54X55X56RR(Y2)n (SEQ ID NO: 23)、(Y2)k-GYGSSSX57R (SEQ ID NO: 51)和，
其中
Y1选自X46、X46X47、X46X47X48、X46X47X48X49 (SEQ ID NO: 24)和X46X47X48X49X50 (SEQ IDNO: 13)；和
Y2选自X70、X70X71、X70X71X72和X70X71X72X73 (SEQ ID NO: 15)；
n为0或1；
k为0或1；
m为7-16范围的整数；和
X46-X50和X70-X73各自独立地为任何氨基酸；
X51选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸；
X52是酪氨酸以外的任何氨基酸；
X53-X56各自独立地为任何氨基酸；和
X57为精氨酸、赖氨酸或鸟氨酸。
在另一个实施方案中，连接部分是约为8-16个氨基酸序列长度的相对短的双官能非肽聚合物接头。按照一个实施方案，非肽连接部分是约4-20、8-18、8-16、8-14、8-12、10-14、10-12或11-13个单体的聚乙二醇接头。在一个实施方案中，提供单链胰岛素激动剂，其中B链最后5个羧基氨基酸缺失，且氨基酸B25通过至少6个但不超过20个单体单元、或至少8个但不超过14个单体单元、或至少10个但不超过14个单体单元的聚乙二醇连接部分(LM)与A链的氨基酸A1连接。在一个实施方案中，连接部分是共计有12个单体的聚乙二醇。
在一个实施方案中，单链胰岛素类似物的连接部分是式X-Y的双官能复合体，其中X为非肽接头(例如聚乙二醇)，Y为氨基酸或2-4个氨基酸肽。在一个实施方案中，天然B链羧基端的最后5个氨基酸缺失，且氨基酸B25的羧基端与X直接连接，Y与胰岛素A链的氨基端直接连接。在另一个实施方案中，提供单链胰岛素激动剂，其中天然B链羧基端的最后5个羧基氨基酸缺失，且氨基酸B25通过包含长度为至少8个但少于14个单体单元的聚乙二醇和2-5个氨基酸序列的连接部分与A链的氨基酸A1连接。2-5个氨基酸序列可位于B链和聚乙二醇链之间或位于A链和聚乙二醇链之间。然而，当2-5个氨基酸序列位于B链和聚乙二醇链之间时，氨基酸序列不是YTPKT (SEQ ID NO: 16)或FNKPT (SEQ ID NO: 76)。在一个实施方案中，连接部分包含被1或2个氨基酸分隔开的2个聚乙烯链。在一个实施方案中，1或2个氨基酸独立地为赖氨酸或半胱氨酸。在一个实施方案中，连接部分包含被单个氨基酸分隔开的共计8-12或10-14或12个单体单元的乙二醇的2个聚乙烯链。在一个实施方案中，单个氨基酸是赖氨酸或半胱氨酸。
本发明的单链胰岛素激动剂可包含天然B和A链序列或其当以异源双链彼此连接时具有胰岛素激动剂活性的任何已知的类似物或衍生物。如本文所公开的，这类A链和B链肽可通过本文所述连接部分彼此连接以形成单链胰岛素激动剂。按照一个实施方案，B链包含序列
R22-X25LCGX29X30LVX33X34LX36LVCGX41X42GFX45 (SEQ ID NO: 20)，A链包含序列
GIVX4X5CCX8X9X10CX12LX14X15LX17X18X19CX21-R13 (SEQ ID NO: 22)，其中
X4为谷氨酸或天冬氨酸；
X5为谷氨酰胺或谷氨酸
X8为组氨酸或苯丙氨酸；
X9为丝氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或丙氨酸；
X10为异亮氨酸或丝氨酸；
X12为丝氨酸或天冬氨酸；
X14为酪氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或丙氨酸；
X15为谷氨酰胺、谷氨酸、精氨酸、丙氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或亮氨酸；
X17为谷氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、鸟氨酸或谷氨酰胺；
X18为甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸或苏氨酸；
X19为酪氨酸、4-甲氧基-苯丙氨酸或4-氨基苯丙氨酸；
X21选自丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、缬氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸和甲硫氨酸；
X25为组氨酸或苏氨酸；
X29选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X30选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸和半胱磺酸；
X33选自天冬氨酸和谷氨酸；
X34选自丙氨酸和苏氨酸；
X36为酪氨酸；
X41选自谷氨酸、天冬氨酸或天冬酰胺；
X42选自丙氨酸、鸟氨酸、赖氨酸和精氨酸；
X45为酪氨酸；
R22选自AYRPSE (SEQ ID NO: 14)、FVNQ (SEQ ID NO: 12)、PGPE (SEQ ID NO:11)、三肽甘氨酸-脯氨酸-谷氨酸、三肽缬氨酸-天冬酰胺-谷氨酰胺、二肽脯氨酸-谷氨酸、二肽天冬酰胺-谷氨酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸和N端胺；和
R13为COOH或CONH2。在一个实施方案中，X8、X25和X30各自为组氨酸。
在一个实施方案中，提供单链胰岛素类似物的前药衍生物，其中前药包含通过酰胺或酯键与单链胰岛素类似物的活性部位共价连接的二肽前药元件(U-B) (参见国际申请WO 2009/099763和PCT/US2009/068713，其公开内容结合到本文中)。随后在生理条件下并在不存在酶促活性时脱去二肽，恢复单链胰岛素类似物的完全活性。在一个实施方案中，前药元件包含结构U-B的二肽，其中U为氨基酸或羟酸，B为通过B的羧基部分和单链胰岛素激动剂的胺之间的酰胺键与所述单链胰岛素激动剂连接的N-烷基化氨基酸，其中U、B或U-B与之连接的单链胰岛素激动剂的氨基酸是非编码氨基酸。在一个实施方案中，在生理条件下在PBS中，U-B自单链胰岛素激动剂化学切割的半寿期(t1/2)为至少约1小时-约1周。在一个实施方案中，单链激动剂在A19位处包含4-氨基苯丙氨酸，且二肽前药元件U-B通过B的羧基部分和4-氨基苯丙氨酸的对位胺之间的酰胺键与单链胰岛素激动剂连接。
单链胰岛素激动剂的其它衍生物包括在本公开内容中，包括改进基本单链胰岛素激动剂的溶解度的修饰。在一个实施方案中，通过亲水部分与肽共价连接来提高单链胰岛素激动剂肽的溶解度。在一个实施方案中，亲水部分与B链的N端氨基酸或与位于B链末端的氨基酸(例如存在于B26-30位任一处的赖氨酸)侧链或与结合B链与A链的连接部分连接。在一个实施方案中，亲水部分是白蛋白，包括例如白蛋白，例如人血清白蛋白(HSA)和重组人白蛋白(rHA)。在一个实施方案中，亲水部分是分子量选自约500-约40,000道尔顿的聚乙二醇(PEG)链。在一个实施方案中，聚乙二醇链的分子量选自约500-约5,000道尔顿。在另一个实施方案中，聚乙二醇链的分子量为约10,000-约20,000道尔顿。
酰化或烷基化可延长循环中的单链胰岛素类似物肽及其前药衍生物的半寿期。酰化或烷基化可有利地延迟对胰岛素受体的开始作用时间和/或延长作用持续时间。可在亲水部分所连接的相同氨基酸位置(包括例如在连接部分的8位)或在不同的氨基酸位置处使胰岛素类似物酰化或烷基化。
本公开内容所包括的还有包含单链胰岛素类似物激动剂及其衍生物和药学上可接受的载体的药物组合物。按照一个实施方案，提供药物组合物，其包含优选纯度水平为至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的本文公开的任何单链胰岛素类似物或其衍生物和药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。这类组合物可含有本文公开的单链胰岛素激动剂肽，浓度为至少0.5 mg/ml、1 mg/ml、2 mg/ml、3 mg/ml、4 mg/ml、5 mg/ml、6mg/ml、7 mg/ml、8 mg/ml、9 mg/ml、10 mg/ml、11 mg/ml、12 mg/ml、13 mg/ml、14 mg/ml、15mg/ml、16 mg/ml、17 mg/ml、18 mg/ml、19 mg/ml、20 mg/ml、21 mg/ml、22 mg/ml、23 mg/ml、24 mg/ml、25 mg/ml或更高。在一个实施方案中，药物组合物包含经灭菌和任选保存在各种包装容器内的水溶液。在其它实施方案中，药物组合物包含冻干粉。药物组合物可作为药盒的部分被进一步包装，所述药盒包括将组合物给予患者的一次性装置。可对容器或药盒进行标记以保存在周围的室温下或冰冻温度下。
按照一个实施方案，提供在胰岛素依赖性患者中调节血糖水平的改进方法。所述方法包括以治疗上有效用于控制糖尿病的量将单链胰岛素激动剂肽或其衍生物给予患者的步骤。
附图简述
图1是用于制备人胰岛素的两步合成策略的示意图。实施例1提供了该方法的详情。
图2是比较相对于经纯化的天然胰岛素，合成人胰岛素的胰岛素受体特异性结合的曲线图。通过图1详述的方法产生合成胰岛素，其中A7-B7键是最先形成的二硫键。如曲线图中提供的数据表明，两种分子具有相似的结合活性。
图3是比较天然胰岛素和A19胰岛素类似物(胰岛素(p-NH2-F)19)的相对胰岛素受体结合的曲线图。如曲线图中提供的数据表明，两种分子具有相似的结合活性。
图4是比较天然胰岛素和IGF1(YB16LB17)类似物的相对胰岛素受体结合的曲线图。如曲线图中提供的数据表明，两种分子具有相似的结合活性。
图5是人胰岛素原(A链，SEQ ID NO: 1；B链SEQ ID NO: 2和C链，SEQ ID NO: 92)和胰岛素样生长因子I和II (IGF I；SEQ ID NO: 3和IGF II；SEQ ID NO: 4)氨基酸序列的比对。该比对表明，这3种肽具有高水平的序列同一性(*表示没有对应的氨基酸的空区，短线(-)表示与存在于胰岛素中的相同的氨基酸)。
图6是用于制备IGF1(YB16LB17)(p-NH2-F)A19前药衍生物的合成流程的示意图。具体衍生物是p-NH2-F，其中芳族胺用二肽Aib-Ala酰化，其用作阴性对照，因为这种二肽在生理条件下不切割。
图7是比较IGF1 (YB16LB17) (p-NH2-F)A19和IGF1 (YB16LB17) (p-NH2-F)A19-AibAla的二肽延伸形式的相对胰岛素受体结合的曲线图。该前药的合成见图6，其中二肽AibAla在A19位处结合(即IGF1(YB16LB17)(AibAla)。二肽在生理条件下不易切割，因此活性极低，这表明了在该位点处用二肽酰化的能力使生物活性沉默。这构成了前药(前药形式中活性低)的两种主要成分之一。
图8A-8C提供按照本公开内容制备的二聚体的活性。图8A表示IGF-1单链二聚体的结构，其包含通过B链氨基端侧链之间的二硫键连接在一起的2个单链IGFB16B17类似物肽(IGF-1B链[C0H5Y16L17O22]-A链[O9,14,15N18,21]；SEQ ID NO: 93)。未显示天然胰岛素二硫键(A6-A11、A7-B7、A20-B19)，但在二聚体形式中存在。可通过选择性蛋白水解消化用箭头标示的2个Arg-Gly键，将二硫化物二聚体的单链形式转化成两链形式。图8B是表明胰岛素、单链IGFB16B17类似物肽二聚体和两链IGFB16B17类似物肽二聚体的相对胰岛素受体结合的曲线图。图8C是表明胰岛素和两链IGFB16B17类似物肽二聚体诱导胰岛素受体磷酸化的相对活性的曲线图。
图9A-9C显示IGF A链肽的前药形式：(IGF1A(Ala)6,7,11,20酰胺的(pNH2-F)19上的Aib-Pro的降解。使二肽在PBS (pH 7.4)中于37℃温育预定长度的时间。在开始温育后20分钟(图9A)、81分钟(图9B)和120分钟(图9C)取出等分试样，用0.1% TFA猝灭，通过分析型HPLC测试。a峰(IGF1A(Ala)6,7,11,20(pNH2-F)1酰胺)和b峰(IGF1A(Ala)6,7,11,20(Aib-Pro-pNH-F)19酰胺)用LC-MS鉴定，并通过峰面积的积分量化。数据表明随时间的推移IGF1A(Ala)6,7,11,20(Aib-Pro-pNH-F)19酰胺自发地、非酶促地转化成IGF1A(Ala)6,7,11,20(pNH2-F)1酰胺。
图10A和10B是描述前药Aib,dPro-IGF1YL (通过A19 4-氨基Phe连接的二肽)的体外活性的曲线图。图10A是比较在PBS中温育的天然胰岛素(在4℃下在1小时时测量)和A19IGF前药衍生物(Aib,dPro-IGF1YL)随时间推移(0小时、2.5小时和10.6小时)的相对胰岛素受体结合的曲线图。图10B是比较在20%血浆/PBS中于37℃下温育的天然胰岛素和A19 IGF前药衍生物(Aib,dPro-IGF1YL)随时间推移(0小时、1.5小时和24.8小时)的相对胰岛素受体结合的曲线图。如曲线图中提供的数据表明，随着前药形式转化成活性IGF1YL肽，从A19IGF前药衍生物样品恢复的活性提高。
图11A和11B是描述前药dK,(N-异丁基G)-IGF1YL (通过A19 4-氨基Phe连接的二肽)的体外活性的曲线图。图11A是比较在PBS中温育的天然胰岛素和A19 IGF前药衍生物(IGF1YL：dK,(N-异丁基G)随时间推移(0小时、5小时和52小时)的相对胰岛素受体结合的曲线图。图11B是比较在20%血浆/PBS中于37℃温育的天然胰岛素和A19 IGF前药衍生物(IGF1YL：dK,(N-异丁基G)随时间推移(0小时、3.6小时和24.8小时)的相对胰岛素受体结合的曲线图。如曲线图中提供的数据表明，随着前药形式转化成活性IGF1YL肽，从A19 IGF前药衍生物样品恢复的活性提高。
图12A和12B是描述前药dK(e-乙酰基),Sar)-IGF1YL (通过A19 4-氨基Phe连接的二肽)的体外活性的曲线图。图12A是比较在PBS中温育的天然胰岛素(在4℃下在1小时时测量)和A19 IGF前药衍生物(IGF1YL：dK(e-乙酰基),Sar)随时间推移(0小时、7.2小时和91.6小时)的相对胰岛素受体结合的曲线图。图12B是比较在20%血浆/PBS中于37℃温育的天然胰岛素和A19 IGF前药衍生物(IGF1YL：dK(e-乙酰基),Sar)随时间推移(0小时、9小时和95小时)的相对胰岛素受体结合的曲线图。如曲线图中提供的数据表明，随着前药形式转化成活性IGF1YL肽，从A19 IGF前药衍生物样品恢复的活性提高。
图13是比较天然胰岛素异源双链和IGF-1 A和B链异源双链和其中B链的羧基端与IGF-1 A链的N端直接连接的单链IGF-1类似物的相对胰岛素受体结合的曲线图。
图14是比较天然胰岛素异源双链、IGF-1、IGF-1δ异源双链和其中B链的羧基端通过由序列GYGSSSOR (SEQ ID NO: 65)组成的肽接头与IGF-1 A链的N端连接的单链IGF-1δ单链类似物的相对胰岛素受体结合的曲线图，其中IGF-1δ类似物包含具有下列氨基酸取代的天然IGF-1序列：HA8、OA9、OA14、OA15、QA17、NA21、YB16、LB17、OB22。
图15是描述单链胰岛素类似物对IGF-1受体或者A或B亚型胰岛素受体的相对体外结合活性的柱状图，在单链胰岛素类似物中，天然胰岛素B链的羧基端通过IGF-1 C肽或IGF-1 C肽的各种衍生物与天然胰岛素A链的氨基端连接。在B0C1A0胰岛素类似物命名中，B0和A0命名是指A和B链的胰岛素序列，而C1指IGF-1 C肽。如数据所示，通过IGF-1 C肽连接B链与A链的单链胰岛素类似物是强力的胰岛素激动剂。此外，2位的修饰(例如用丙氨酸取代天然酪氨酸)，或备选地缺失IGF-1 C连接肽的最后4个氨基酸，产生高效力的胰岛素选择性单链胰岛素类似物。
图16是描述式B0C1A0的单链胰岛素类似物对IGF-1受体或者A或B亚型胰岛素受体的相对体外结合活性的柱状图，在单链胰岛素类似物中，连接IGF-1 C肽的天然序列通过1、2、3、4或8位的所示氨基酸取代而被修饰。在B0C1A0胰岛素类似物命名中，B0和A0命名是指A和B链的胰岛素序列，而C1表示IGF-1 C肽。
图17是描述单链B0C1A0胰岛素类似物对A亚型胰岛素的相对体外结合活性和磷酸化活性的柱状图。对天然IGF-1 C肽(010)相对于各种氨基酸取代或缺失的活性进行了比较。在B0C1A0胰岛素类似物命名中，B0和A0命名是指A和B链的胰岛素序列，而C1表示IGF-1 C肽。
图18是描述单链B0C1A0胰岛素类似物对A亚型胰岛素的相对体外结合活性和磷酸化活性的柱状图，其中连接IGF-1 C肽的天然序列通过1、2、3、4或8位的所示氨基酸取代而被修饰。该数据结合图17中提供的数据表明了胰岛素类似物的结合活性和磷酸化活性之间的一致性。
图19是显示使用PEG聚合物作为连接部分的IGF-1 YL单链胰岛素类似物制备的示意图。
图20A和B是描述通过4、8或16个单体PEG连接部分连接的单链胰岛素类似物相对于天然胰岛素异源双链的相对体外结合活性(图20 A)和磷酸化活性(图20 B)的曲线图。
图21A和B是表明单链胰岛素类似物对胰岛素和IGF-1受体的磷酸化活性的曲线图。与天然胰岛素异源双链相比，包含通过4、8或16个单体PEG连接部分连接在一起的全长天然胰岛素B和A链的单链胰岛素类似物具有相对低的胰岛素效力(图21A)，但是，它们具有的活性是没有PEG或其它连接部分的单链胰岛素类似物的10-100倍(参见表16)。然而，当胰岛素B链的最后5个羧基氨基酸(B26-30)缺失(DesV)且剩余B链的羧基端通过8、12或16个单体PEG连接部分与天然胰岛素A链连接时，单链类似物具有与天然胰岛素异源双链至少相当或更大的效力。
图22A-C是表示单链胰岛素类似物对胰岛素受体几乎等效的曲线图。图22A提供比较包含天然胰岛素序列或IGF-1 A和IGF-1 YL B链的单链胰岛素类似物的数据，其中B链的最后5个羧基氨基酸缺失(DesV)且B链通过12个单体PEG连接部分与其相应的胰岛素或IGF-1 A链连接。图22B和C是显示对小鼠进行的比较胰岛素耐量试验的结果的曲线图，其比较MIU-38 [其中B和A链通过PEG连接的单链胰岛素类似物：[B1(H5,H10,Y16,L17)25(Peg12)A1(H8,N18,N21)]，参见图22B]和MIU-35 [其中B和A链通过肽接头连接的单链胰岛素类似物：B1(H5,H10,Y16,L17)25-C1-A1(H8,N18,N21)，参见图22C]，相对于溶媒对照降低和保持低血糖浓度的能力。进行了两个实验，其中以27和90 nmol/kg给予MIU-38和MIU-35。
图23是表示单链基于胰岛素/IGF-1的类似物的各种组氨酸取代的表格。IGF-1 A链8位的组氨酸取代可提高基于IGF的单链胰岛素类似物激动剂的效力。
图24是单链peg连接的类似物对胰岛素和IGF-1受体的活性的比较分析，由通过磷酸化的受体信号转导测量。
图25是表示与包含胰岛素A链的单链类似物相比，包含IGF-1 A链的单链类似物对被特异性胰岛素降解酶(IDE)降解的抗性提高的曲线图。
图26是表示IGF-1、胰岛素和胰岛素/IGF嵌合体诱导体外细胞增殖的相对活性的曲线图。结果表明，与IGF-1单链胰岛素类似物有关的胰岛素活性同与天然IGF-1有关的增殖活性无关联。
图27是单链peg连接的类似物对胰岛素和IGF-1受体的活性的比较分析，由通过磷酸化的受体信号转导测量。对使用不同长度的PEG链接头的单链类似物进行分析以测量不同大小的PEG连接部分如何影响对胰岛素和IGF-1受体的体外活性。图27提供的数据显示PEG12DesV构建体(其中B链的5个羧基端氨基酸已缺失)提供最有效的化合物。
图28A和28B是单链peg/氨基酸连接的类似物对胰岛素和IGF-1受体的体外活性的比较分析，由受体结合和通过磷酸化的受体信号转导测量。图28A显示包含具有插入的单个氨基酸(甘氨酸或赖氨酸)的的PEG12链作为连接DesV B链与天然胰岛素A链的连接部分的单链类似物的体外活性。图28B显示包含含有具有2个插入的赖氨酸残基的PEG12链的连接部分的单链类似物(单链peg/(赖氨酸)2连接的类似物)的体外活性。
图29A-E提供给予各种单链胰岛素类似物的小鼠的体内数据。图29A提供单链peg连接的类似物对胰岛素受体的活性的体外比较分析，由受体结合和通过磷酸化的受体信号转导测量；图29B和29C提供在给予所列举的类似物后8小时内血糖浓度的数据。图29D和29E提供在以两种不同的浓度(27 nmol/kg和90nmol/kg)给予所列举的类似物后有关血糖AUC值的数据。
图30A-30D是显示对小鼠进行的比较胰岛素耐量试验的结果的曲线图，其比较与3种不同的酰化胰岛素类似物相比，人胰岛素降低和保持低血糖浓度的能力。以两种不同的浓度(27 nmol/kg和90nmol/kg)对化合物进行了测试。酰化胰岛素包括MIU-41、MIU-36和MIU-37。MIU-41 [B1(H5,H10,Y16,L17)25a:A1(H8,rEC16-K14,N18,N21)]是两链胰岛素类似物，具有通过与位于A14位的赖氨酸残基连接的γ谷氨酸接头的C16酰化。MIU-36 [B1(C16-K0,H5,H10,Y16,L17)25a:A1(N18,N21)]是两链胰岛素类似物，具有与B链的N端连接的C16酰化)。MIU-37 [B1(H5,H10,Y16,L17,C16rE-K22)25a:A1(N18,N21)]是两链胰岛素类似物，具有通过与位于B22位的赖氨酸残基连接的γ谷氨酸接头的C16酰化。
图31A-31D显示对小鼠进行的比较胰岛素耐量试验的结果，其比较市售酰化胰岛素类似物(Detemir)相对于酰化两链胰岛素类似物MIU-55的活性。MIU-55 [B1(H5,10,Y16,L17,C16rE-K22)25a:A1(N18,N21)]的B链C端5个氨基酸缺失且以B链酰胺结束。在Lys B22的ε-氨基处通过γGlu接头被C16脂肪酸酰化。结果表明，MIU-55的效力约为Detemir的1/3(参见图31A和31B)。数据还表明，胰岛素的酰化形式比非酰化形式较长时间地起作用，并且虽然MIU-55的效力比Detemir低，但是具有与Detemir类似的特征。图31C和31D提供在给予所列举的类似物后有关血糖AUC值的数据。
图32A-32D表示对小鼠进行的比较胰岛素耐量试验的结果，其比较市售酰化胰岛素类似物(Detemir)相对于酰化两链胰岛素类似物MIU-49的活性。MIU-49 [B1(C16-rE,H5,Aib9,H10,E13-K17,Y16)25a:A1(N18,N21)]是两链胰岛素激动剂，其B链的C端5个氨基酸缺失，且在Gly B2的α-氨基处通过γGlu接头被C16脂肪酸酰化。结果表明，MIU-49的效力约为Detemir的1/3 (参见图32A和32B)。数据还表明，胰岛素的酰化形式比非酰化形式较长时间地起作用，并且虽然MIU-49的效力比Detemir低，但是具有与Detemir类似的特征。图32C和32D提供在给予所列举的类似物后有关血糖AUC值的数据。
图33A-33D表示使用C57/Blk小鼠从对Detemir和MIU-56的比较胰岛素耐量试验中得到的结果。MIU-56是胰岛素单链类似物B1(H5,Y16,L17)25a-PEG8-K-PEG4-A1(N18,21)，其包含与连接A链和B链的连接部分(PEG8-K-PEG4)中的单一赖氨酸残基侧链连接的20 kDaPEG。图33A和33B是显示胰岛素耐量试验结果的曲线图，其比较酰化胰岛素类似物Detemir相对于聚乙二醇化单链胰岛素类似物MIU-56降低和保持低血糖水平的能力。图33C和33D分别表示给予Detemir和MIU-56的小鼠中的血糖AUC24小时。
图34A-34F表示使用C57/Blk小鼠从对MIU-56和MIU-57的比较胰岛素耐量试验中获得的结果。MIU-57是胰岛素单链类似物(B1(H5,Y16,L17)25-C1-A1(N18,21)，其包含与B链N端连接的20 kDa PEG。图34A和34B是表示比较MIU-56和MIU-57的胰岛素耐量试验结果的曲线图。图34C和34D分别表示给予MIU-56和MIU-57的小鼠中的血糖AUC24小时。MIU-56和MIU-57的比较胰岛素剂量滴定结果显示对于20 nmol/kg-80 nmol/kg的剂量范围在小鼠中获得类似特征(参见图34E和34F)。制备包含通过20 kDa PEG链头对头连接的两个胰岛素单链类似物(B1(H5,Y16,L17)25-C1-A1(N18,21)的二聚体(MIU 58)。图34G-34J表示使用C57/Blk小鼠由MIU-57和MIU-58的比较胰岛素耐量试验获得的结果。图34G和34H是比较MIU-57 (单体)和MIU-58 (二聚体)的胰岛素耐量试验结果的曲线图。图34I和34J分别表示给予MIU-57和MIU-58的小鼠中的血糖AUC24小时。
图35A-35B提供来自两种聚乙二醇化胰岛素衍生物的比较胰岛素剂量滴定的数据。胰岛素衍生物根据20 kDa PEG的位置而不同，所述20 kDa PEG与MIU-59的N端(图35A)或胰岛素类似物MIU-60的氨基酸B29的侧链连接，其中A1和B1氨基酸被氨基甲酰化(图35B)。
图36A-36D提供来自3种单链胰岛素类似物MIU-67、MIU-68和MIU-69的比较胰岛素剂量滴定的数据，每种单链胰岛素类似物相对于单一聚乙二醇化(20K PEG)天然胰岛素衍生物(MIU-59)，各包含10 kDa的2条PEG链。更具体地讲，对以下单链胰岛素类似物的活性进行了比较：MIU-67 (B1(H5,Y16,L17)25-C1(K8)-A1(N18,21))，其具有2条PEG链(各10K)，一条在N端连接，另一条在连接部分的氨基酸8 (C8位)连接；MIU-68 (B1(H5,Y16,L17,K22)25-C1(K8)-A1(N18,21))，其具有2条PEG链(各10K)，一条在N端连接，另一条在氨基酸B22连接；和MIU-69 (B1(H5,Y16,L17)25-C1(K8)-A1(K14,N18,21))，其具有2条PEG链(各10K)，一条在N端连接，另一条在氨基酸A14连接。以两种剂量(20和80 nmol/kg)给予每种化合物。
图37A和37B. 给予糖尿病小鼠(db/db小鼠)聚乙二醇化胰岛素类似物以比较其相对于市售胰岛素类似物的相对活性。x轴表示所给予的化合物的浓度(即溶媒对照，优泌林(Humulin)为30或90 nmol/kg或60 nmol/kg，Levemir为30、90和240)。具体地讲，对胰岛素类似物Levemir和优泌林与聚乙二醇化胰岛素类似物MIU-59 (具有与其N端连接的单条20kDa PEG的天然胰岛素类似物)和MIU-66 (具有与其N端连接的单条20 kDa PEG及氨基甲酰化的A和B链氨基端的天然胰岛素类似物)进行比较。与Levemir和优泌林相比，MIU-59和MIU-66两者的活性改进(参见图37A在12小时，图37B在24小时)。
图38是在正常小鼠中进行的针对在二肽前药元件被酰化的前药两链胰岛素类似物(MIU-29：[B1(Y16,L17,Y25)29a:A1(aF19-dLys(Ac),NLeu)]相对于其母体胰岛素类似物(MIU-27：[B1(Y16,L17,Y25)29a:A1(aF19-)]的比较胰岛素耐量试验结果的曲线图。前药衍生物MIU-29包含A19位的4-氨基-苯丙氨酸取代，其中二肽dLys(Ac),NLeu在A19残基的4-氨基位处共价连接，且二肽元件的赖氨酸侧链被C14脂肪酸酰化。这种二肽可在生理条件下自主切割，其半寿期约5小时。在离体温育MIU-29 24小时后，将所得化合物(称为“MIU-29c”)给予小鼠，并对其降低血糖的能力与母体化合物相比较。如图38所示，两种化合物几乎相同地进行。
发明详述
定义
为了描述并要求保护本发明，将根据下文给出的定义使用下列术语。
本文所用术语“约”意指大于或小于所述值或值的范围达10%，但无意仅规定任何值或值的范围在这个较宽泛的定义内。各个值或值的范围之前的术语“约”也欲包括所述绝对值或值的范围的实施方案。
本文所用术语“前药”定义为在显示其药理作用前经过化学修饰的任何化合物。
本文所用术语“氨基酸”包括含有氨基和羧基官能团两者的任何分子，其中氨基和羧酸基与同一碳(α碳)连接。α碳任选可具有一个或两个其它的有机取代基。对于本公开内容的目的，未指定其立体化学的氨基酸的命名欲包括氨基酸的L型或D型或外消旋混合物。然而，在其中氨基酸用其三字母代码表示且包括上标数字的情况下，通过在三字母代码和上标数字之前加小写d来指定氨基酸的D型(例如dLys-1)，其中没有小写d的命名(例如Lys-1)欲指氨基酸的天然L型。在该命名中，加上标数字表示氨基酸在胰岛素类似物序列中的位置，其中位于胰岛素类似物序列中的氨基酸通过自N端连续编号的正的上标数字来表示。在N端或通过侧链与胰岛素类似物肽连接的其它氨基酸以0开始编号，且当它们进一步远离胰岛素类似物序列时，以负的整数值递增。例如，与胰岛素类似物的N端连接的二肽前药内的氨基酸位置称为aa-1-aa0-胰岛素类似物，其中aa0表示二肽的羧基端氨基酸，aa-1表示二肽的氨基端氨基酸。
本文所用术语“羟酸”是指经修饰用羟基置换α碳氨基的氨基酸。
本文所用术语“非编码氨基酸”包括不是以下20种氨基酸任一个的L-异构体的任何氨基酸：Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr。
“二肽”是α氨基酸或α羟酸通过肽键与另一氨基酸连接所形成的化合物。
没有任何其它标识的本文所用术语“化学切割”包括导致共价化学键断裂的非酶促反应。
“生物活性多肽”是指能够在体外和/或体内发挥生物作用的多肽。
如本文所用，一般提及肽时欲包括具有经修饰的氨基端和羧基端的肽。例如，标明标准氨基酸的氨基酸序列欲包括N端和C端的标准氨基酸以及N端的相应羟酸和/或经修饰以包含酰胺基代替末端羧酸的相应C端氨基酸。
本文所用“酰化”氨基酸是包含酰基的氨基酸，其对天然存在的氨基酸而言是非天然的，而不论通过哪种方式产生。产生酰化氨基酸和酰化肽的示例性方法是本领域已知的，包括在加入肽中之前使氨基酸酰化或肽合成后进行肽的化学酰化。在一些实施方案中，酰基使肽具有以下的一种或多种：(i)循环中的半寿期延长，(ii)作用开始时间延迟，(iii)作用持续时间延长，(iv)对蛋白酶(例如DPP-IV)的抗性改进，和(v)对IGF和/或胰岛素肽受体的效力提高。
本文所用“烷基化”氨基酸是包含烷基的氨基酸，其对天然存在的氨基酸而言是非天然的，而不论通过哪种方式产生。产生烷基化氨基酸和烷基化肽的示例性方法是本领域已知的，包括在加入肽中之前使氨基酸烷基化或在肽合成后进行肽的化学烷基化。虽不限制于任何特定理论，但认为肽的烷基化可实现与肽的酰化类似(如果不是相同的话)的作用，例如循环中的半寿期延长，作用开始时间延迟，作用持续时间延长，对蛋白酶(例如DPP-IV)的抗性改进，和对IGF和/或胰岛素受体的效力提高。
本文所用术语“药学上可接受的载体”包括任何标准药用载体，例如磷酸缓冲盐溶液、水、乳液例如水包油或油包水乳液和各种类型的润湿剂。该术语还包括美国联邦政府管理机构批准的或列于美国药典的用于动物(包括人)的任何物质。
本文所用术语“药学上可接受的盐”是指保持母体化合物的生物活性并且是非生物学或其它方面不合乎需要的化合物的盐。本文公开的许多化合物能够通过存在的氨基和/或羧基或其类似基团形成酸式盐和/或碱式盐。
药学上可接受的碱加成盐可由无机碱和有机碱制备。仅举例来说，衍生自无机碱的盐包括钠、钾、锂、铵、钙和镁盐。衍生自有机碱的盐包括但不限于伯胺、仲胺和叔胺的盐。
药学上可接受的酸加成盐可由无机酸和有机酸制备。衍生自无机酸的盐包括盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等。衍生自有机酸的盐包括乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、苹果酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等。
本文所用术语“亲水部分”是指易溶于水或易吸收水且哺乳动物物种体内耐受而又无毒性作用(即是生物相容的)的任何化合物。亲水部分的实例包括聚乙二醇(PEG)、聚乳酸、聚乙醇酸、乳酸-乙醇酸共聚物、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚甲基噁唑啉(polymethoxazoline)、聚乙基噁唑啉(polyethoxazoline)、聚甲基丙烯酸羟乙基酯、聚羟丙基甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺和衍生化纤维素例如羟甲基纤维素或羟乙基纤维素及其共聚物以及天然聚合物，包括例如白蛋白、肝素和葡聚糖。
本文所用术语“治疗”包括预防特定病症或病况，或减轻与特定病症或病况有关的症状和/或防止或消除所述症状。例如，本文所用术语“治疗糖尿病”一般可指保持血糖水平接近正常水平，可包括根据指定情形增加或降低血糖水平。
本文所用胰岛素类似物的“有效”量或“治疗有效量”是指无毒但足以提供所需作用的胰岛素类似物的量。例如一种所需效果可为预防或治疗高血糖症。“有效”的量在受试者与受试者间可不同，这取决于个体的年龄和一般健康状况、给药方式等。因此，不可能总是指定确切的“有效量”。然而，任何个别情况下，适当的“有效”量可通过本领域普遍技术人员采用常规实验来确定。
术语“胃肠外”意指不通过消化道而是通过某些其它途径，例如鼻内、吸入、皮下、肌内、脊柱内或静脉内。
在整个申请中，用字母和数字表示具体氨基酸位置的所有指称(例如A5位)是指在相应的天然人胰岛素A链(SEQ ID NO: 1)或B链(SEQ ID NO: 2)的A链(例如A5位)或B链(例如B5位)中该位置上的氨基酸，或者在其任何类似物的相应氨基酸位置上的氨基酸。例如，本文中没有任何其它说明的“B28位”的指称可意指其中SEQ ID NO: 2的第1个氨基酸缺失的胰岛素类似物B链的相应的B27位。同样，添加到天然B链N端的氨基酸以B0开始编号，然后随着氨基酸添加到N端，为递增的负值数字(例如B-1，B-2…)。或者，根据IGF 1的天然C链(SEQ ID NO: 17)编制单链类似物连接部分的氨基酸位置的任何指称。例如，天然C链的9位(或“C9位”)处具有丙氨酸残基。
本文所用术语“天然胰岛素肽”旨在指明包含SEQ ID NO: 1的A链和SEQ ID NO: 2的B链的51个氨基酸异源双链以及包含SEQ ID NO: 1和2的单链胰岛素类似物。本文所用的没有更多说明性语言的术语“胰岛素肽”欲包括包含SEQ ID NO: 1的A链和SEQ ID NO: 2的B链的51个氨基酸异源双链及其单链胰岛素类似物(包括例如已公布的国际申请WO96/34882和美国专利号6,630,348中公开的类似物，两者公开内容通过引用结合到本文中)，包括包含天然A链和/或B链的修饰类似物的异源双链和单链类似物及其衍生物。这类修饰类似物包括：A19、B16或B25位的氨基酸变为4-氨基苯丙氨酸的修饰，或者选自以下位置的一个或多个氨基酸取代：A5、A8、A9、A10、A12、A14、A15、A17、A18、A21、B1、B2、B3、B4、B5、B9、B10、B13、B14、B17、B20、B21、B22、B23、B26、B27、B28、B29和B30，或者B1-4和B26-30位的任一个或全部缺失。本文定义的胰岛素肽还可以是通过非肽部分(例如逆倒位片段(retroinverso fragment))的插入或取代，或者掺入非肽键例如氮杂肽键(CO被NH取代)或假肽键(例如NH被CH2取代)或酯键(例如缩肽，其中一个或多个酰胺(-CONHR-)键被酯(COOR)键置换)而衍生自天然存在的胰岛素的类似物。
“A19胰岛素类似物”是4-氨基苯丙氨酸或4-甲氧基苯丙氨酸取代天然胰岛素A链19位的天然酪氨酸残基的胰岛素肽。
本文所用“IGFB16B17类似物肽”是包含A链和B链异源双链及其单链胰岛素类似物的通用术语，其中A链包含SEQ ID NO: 19的肽序列，B链包含SEQ ID NO: 21的序列，以及其中A链和/或B链的类似物包含1-3个其它氨基酸取代的序列的类似物，前提条件是B链不含SEQID NO: 2的序列，并包含B16位的酪氨酸和B17位的亮氨酸。
“IGF YL类似物”是包含SEQ ID NO: 19的IGF A链和SEQ ID NO: 58的IGF B链的肽。
本文所用术语“单链胰岛素类似物”包括一组结构上相关的蛋白质，其中胰岛素或IGFA和B链或其类似物或衍生物彼此共价连接形成线性多肽链。如本文所公开的，单链胰岛素类似物包含B链的羧基端通过连接部分与A链的氨基端共价连接。
本文所用的没有更多说明性语言的术语“胰岛素A链”欲包括SEQ ID NO: 1的21个氨基酸序列及其功能类似物和衍生物，包括A19胰岛素类似物的A链和本领域技术人员已知的其它类似物，包括SEQ ID NO: 1的序列因在选自以下位置的一个或多个氨基酸插入、缺失或取代而产生的修饰：A4、A5、A8、A9、A10、A12、A14、A15、A17、A18、A21。
本文所用的没有更多说明性语言的术语“胰岛素B链”欲包括SEQ ID NO: 2的30个氨基酸序列以及天然B链的修饰功能类似物，包括B16或B25位的氨基酸变为4-氨基苯丙氨酸的修饰，或者在选自以下的位置的一个或多个氨基酸插入、缺失或取代：B1、B2、B3、B4、B5、B9、B10、B13、B14、B17、B20、B21、B22、B23、B25、B26、B27、B28、B29和B30，或者B1-4和B26-30位的任一个或全部缺失。
本文所用术语“衍生物”欲包括对化合物(例如氨基酸)的化学修饰，包括体外化学修饰，例如通过在多肽的一个或多个位置的侧链上引入基团，例如酪氨酸残基中的硝基或酪氨酸残基中的碘，或通过游离羧基转化为酯基或转化为酰胺基，或通过酰化使氨基转化为酰胺，或通过使羟基酰化得到酯，或通过伯胺烷基化得到仲胺或亲水部分与氨基酸侧链连接。通过多肽中的氨基酸残基侧链的氧化或还原获得其它衍生物。
本文所用的没有更多说明性语言的术语IGF A链欲包括天然IGF 1或IGF 2 (分别为SEQ ID NO: 5和7)的21个氨基酸序列及其本领域技术人员已知的功能类似物，包括SEQID NO: 5和7的序列因在选自以下的位置上的一个或多个氨基酸取代而产生的修饰：A5、A8、A9、A10、A12、A14、A15、A17、A18、A21。
本文所用的没有更多说明性语言的术语“IGF YL B链”欲包括包含SEQ ID NO: 21的氨基酸序列，包括例如SEQ ID NO: 168的序列以及IGF YL B链的类似物及其衍生物，包括B16或B25位的氨基酸变为4-氨基苯丙氨酸的修饰，或者在选自以下的位置的一个或多个氨基酸取代：B1、B2、B3、B4、B5、B9、B10、B13、B14、B17、B20、B21、B22、B23、B26、B27、B28、B29和B30，或者B1-4和B26-30位的任一个或全部缺失。
本文所用术语“同一性”涉及两个或更多个序列间的相似性。将相同残基的数目除以残基总数，将得数乘以100得到百分比而求出同一性。因此，两个完全相同的序列拷贝具有100%同一性，而彼此相比较具有氨基酸缺失、添加或取代的两个序列具有较低程度的同一性。本领域技术人员应了解，可获得若干计算机程序用于确定序列同一性，例如应用算法例如BLAST (基础局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool), Altschul等(1993) J. Mol. Biol. 215:403-410)的计算机程序。
本文所用术语分子对第一受体较之于对第二受体的“选择性”是指以下比率：分子对第二受体的EC50除以分子对第一受体的EC50。例如，对第一受体的EC50为1 nM和对第二受体的EC50为100 nM的分子对第一受体的选择性是对第二受体的选择性的100倍。
本文所用氨基酸“修饰”是指氨基酸的取代或者通过化学基团加入氨基酸和/或从氨基酸中脱去化学基团而引起的氨基酸的衍生化，包括被通常存在于人蛋白质中的20种氨基酸的任一个以及非典型或非天然存在的氨基酸取代。非典型氨基酸的市售来源包括Sigma-Aldrich (Milwaukee，WI)、ChemPep Inc. (Miami，FL)和Genzyme Pharmaceuticals(Cambridge，MA)。非典型氨基酸可购自商品供应商、从头合成或对天然存在的氨基酸进行化学修饰或衍生化。
本文所用氨基酸“取代”是指一个氨基酸残基被不同的氨基酸残基置换。
本文所用术语“保守氨基酸取代”在本文定义为下列5组之一内的交换：
I. 小的脂族无极性或略带极性的残基：
Ala、Ser、Thr、Pro、Gly；
II. 极性带负电荷的残基及其酰胺：
Asp、Asn、Glu、Gln、半胱磺酸和高半胱磺酸；
III. 极性带正电荷的残基：
His、Arg、Lys；鸟氨酸(Orn)
IV. 大的脂族无极性残基：
Met、Leu、Ile、Val、Cys、正亮氨酸(Nle)、高半胱氨酸
V. 大的芳族残基：
Phe、Tyr、Trp、乙酰基苯丙氨酸
本文所用通用术语“聚乙二醇链”或“PEG链”是指环氧乙烷和水的缩合聚合物的混合物，呈支链或直链，用通式H(OCH2CH2)nOH表示，其中n至少为2。“聚乙二醇链”或“PEG链”与数字后缀联用，表明其大致的平均分子量。例如PEG-5,000是指分子量总平均数为约5,000道尔顿的聚乙二醇链。
本文所用术语“聚乙二醇化”等术语是指通过将聚乙二醇链与化合物连接对其天然状态进行修饰的化合物。“聚乙二醇化多肽”是具有与多肽共价连接的PEG链的多肽。
本文所用的“酰化”氨基酸是包含对天然存在的氨基酸而言是非天然的酰基的氨基酸，而不论通过哪种方式产生。产生酰化氨基酸和酰化肽的示例性方法是本领域已知的，包括在加入肽中之前使氨基酸酰化或在肽合成后对肽进行化学酰化。在一些实施方案中，酰基使肽具有以下一个或多个性质：(i)循环中的半寿期延长，(ii)作用开始时间延迟，(iii)作用持续时间延长，(iv)对蛋白酶的抗性改进，和(v)对胰岛素受体的效力增强。
本文所用“烷基化”氨基酸是包含对天然存在的氨基酸而言是非天然的烷基的氨基酸，而不论通过哪种方式产生。产生烷基化氨基酸和烷基化肽的示例性方法是本领域已知的，包括在加入肽中之前使氨基酸烷基化或在肽合成后对肽进行化学烷基化。虽不限制于任何特定理论，但认为肽的烷基化可得到与肽的酰化类似(如果不是相同的话)的作用，例如循环中的半寿期延长，作用开始时间延迟，作用持续时间延长，对蛋白酶的抗性改进，和对胰岛素受体的效力增强。
本文所用“接头”是使两个独立实体彼此结合的键、分子或分子的基团。接头可为两个实体提供最佳间隔或可进一步提供允许两个实体彼此分开的不稳定连接。不稳定连接包括光可切割基团、酸不稳定部分、碱不稳定部分和酶可切割基团。
本文所用“IGF二聚体”是包含两个IGF YL类似物肽(每个自身包含A链和B链)通过接头彼此共价结合的复合体。当没有任何限定性语言地使用时，术语IGF二聚体包括IGF同二聚体和IGF异二聚体两者。IGF同二聚体包含两个相同的亚基，而IGF异二聚体包含两个不同的亚基，但是两个亚基彼此基本上相似。
本文所用术语“C1-Cn烷基”，其中n可为1-6，表示具有1至规定数目的碳原子的支链或直链烷基。典型的C1-C6烷基包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基等。
本文所用术语“C2-Cn烯基”，其中n可为2-6，表示具有2至规定数目的碳原子和至少一个双键的烯属不饱和支链或直链基团。这类基团的实例包括但不限于1-丙烯基、2-丙烯基(-CH2-CH=CH2)、1,3-丁二烯基(-CH=CHCH=CH2)、1-丁烯基(-CH=CHCH2CH3)、己烯基、戊烯基等。
术语“C2-Cn炔基”，其中n可为2-6，是指具有2-n个碳原子和至少一个三键的不饱和支链或直链基团。这类基团的实例包括但不限于1-丙炔基、2-丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、1-戊炔基等。
本文所用术语“芳基”是指具有一个或两个芳族环的单环或二环碳环系统，包括但不限于苯基、萘基、四氢萘基、茚满基、茚基等。通过标明存在的碳的数目来表示芳环的大小和取代基或连接基团的存在情况。例如，术语“(C1-C3烷基)(C6-C10芳基)”是指通过1-3元烷基链与母体部分连接的5-10元芳基。
本文所用术语“杂芳基”是指含有一个或两个芳族环且在芳族环中含有至少一个氮、氧或硫原子的单环或二环环系统。通过标明存在的碳的数目来表示杂芳环的大小和取代基或连接基团的存在情况。例如，术语“(C1-Cn烷基)(C5-C6杂芳基)”是指通过1-“n”元烷基链与母体部分连接的5或6元杂芳基。
本文所用术语“卤素”是指由氟、氯、溴和碘组成的基团的一个或多个成员。
本文所用的没有进一步标识的术语“患者”欲包括任何温血脊椎驯养动物(包括例如但不限于家畜、马、猫、狗和其它宠物)和人。
本文所用术语“分离的”意指已从其自然环境中取出。在一些实施方案中，类似物通过重组方法制备，并将类似物从宿主细胞中分离。
本文所用术语“纯化的”涉及呈基本上不含通常在天然或自然环境中与分子或化合物有关的污染物的形式的分子或化合物的分离，并意指由于与原始组合物的其它组分相分离而提高了纯度。本文使用术语“纯化的多肽”用于描述已与其它化合物相分离的多肽，其它化合物包括但不限于核酸分子、脂质和糖。
“肽模拟物”是指具有不同于既有肽的通用结构的结构、但以类似于既有肽的方式(例如通过模拟该肽的生物活性)起作用的化合物。肽模拟物通常包含天然存在的氨基酸和/或非天然的氨基酸，但还可包含对肽骨架的修饰。例如肽模拟物可包括天然存在的氨基酸的序列，其中具有非肽部分(例如逆倒位片段)插入或取代，或掺入非肽键例如氮杂肽键(CO被NH取代)或假肽键(例如NH被CH2取代)或酯键(例如缩肽，其中一个或多个酰胺(-CONHR-)键被酯(COOR)键置换。或者肽模拟物可不含任何天然存在的氨基酸。
本文所用术语“带电荷的氨基酸”或“带电荷的残基”是指包含在生理pH下在水溶液中带负电荷的(即脱质子化)或带正电荷的(即质子化)的侧链的氨基酸。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸、谷氨酸、半胱磺酸、高半胱磺酸和高谷氨酸，而带正电荷的氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带电荷的氨基酸包括通常存在于人蛋白质的20种氨基酸中的带电荷的氨基酸以及非典型或非天然存在的氨基酸。
本文所用术语“酸性氨基酸”是指包含第二酸性部分(不是氨基酸的α羧酸)的氨基酸，第二酸性部分包括例如侧链羧酸基或磺酸基。
缩写词：
可如下对胰岛素类似物进行缩写：
可用大写A表示A链，用大写B表示B链来标明胰岛素A和B链，其中上标0 (例如A0或B0)可表示碱基序列是胰岛素序列(A链：SEQ ID NO: 1，B链SEQ ID NO: 2)，上标1 (例如A1或B1)可表明碱基序列是IGF-1序列(A链：SEQ ID NO: 5，B链SEQ ID NO: 6)。偏离天然胰岛素和IGF序列的修饰在标示的A链或B链后用括号表示(例如[B1(H5,H10,Y16,L17):A1(H8,N18,N21)])，其中单字母氨基酸缩写词表示取代，数字表示采用天然胰岛素编号的相应A链或B链中取代的位置。A链或B链间的冒号表示两链胰岛素，而短线可表示共价键，因此表示单链类似物。在单链类似物中，A链和B链间可包括连接部分，标识C1是指天然IGF 1 C肽，SEQ ID NO: 17。有关连接部分的标识“C8位”表示位于该位置的氨基酸对应于SEQ ID NO:17的第8氨基酸。
实施方案
如本文所公开的，申请人发现了高效力的单链胰岛素类似物。更具体地讲，申请人发现了可用于共价连接人胰岛素的B链和A链或其类似物或衍生物以形成高效力线性单链胰岛素激动剂的独特连接部分。在一个实施方案中，连接部分将B链的羧基端与A链的氨基端共价结合。
如本文所公开的，可使用最适大小的连接部分连接人胰岛素A链和B链或其类似物或衍生物，其中B链B25氨基酸的羧基端与连接部分的第一末端直接连接，其中连接部分的第二末端通过间插连接部分与A链A1氨基酸的氨基端直接连接。在一个实施方案中，连接部分包含8-17个氨基酸肽，更具体地讲，在一个实施方案中，肽表示IGF-1 C肽的类似物。在另一个实施方案中，连接部分包含相对短的双官能非肽聚合物接头，其约8-16个氨基酸序列的长度。按照一个实施方案，非肽连接部分是约4-20、8-18、8-16、8-14、8-12、10-14、10-12或11-13个单体的聚乙二醇接头。
在一个实施方案中，提供包含通用结构B-LM-A的单链胰岛素激动剂类似物，其中B表示胰岛素B链，A表示胰岛素A链，LM表示连接B链羧基端与A链氨基端的连接部分。胰岛素A链和B链可以是作为异源双链连接在一起时形成功能性胰岛素的任何已知的胰岛素序列，包括本文公开的胰岛素序列。申请人发现了本文所公开的可用来将胰岛素A链和B链连接在一起产生活性单链胰岛素类似物的多个连接部分。按照一个实施方案，连接部分还包含与连接部分的氨基酸侧链连接的亲水部分和/或位于选自A链的A9、A14和A15的位置或位于B链的N端α胺(B1位、B2位)或B10、B22、B28或B29位的氨基酸侧链上的亲水部分。在一个实施方案中，亲水部分是与连接部分的氨基酸连接的和/或位于B链N端α胺上的聚乙烯链。在一个实施方案中，连接部分(LM)包含长度不超过17个氨基酸的氨基酸序列，且包含序列X51X52X53X54X55X56X57X58 (SEQ ID NO: 9)，其中
X51选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸；
X52是酪氨酸以外的任何氨基酸；
X53-X56各自独立地为任何氨基酸；和
X57和X58独立地为精氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、高半胱氨酸、乙酰基-苯丙氨酸或鸟氨酸。在一个实施方案中，连接部分还包含与连接部分的氨基酸侧链连接的亲水部分。在一个实施方案中，连接部分包含序列X51X52GSSSX57X58 (SEQ ID NO: 29)或X51X52GSSSX57X58APQT (SEQ ID NO: 46)，其中X51选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和脯氨酸，X52为丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或脯氨酸，X57或X58独立地为精氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、高半胱氨酸、乙酰基-苯丙氨酸或鸟氨酸，其中亲水部分与连接部分的7或8位(即位于X57或X58位)的氨基酸侧链连接。根据IGF 1的天然C链(SEQ ID NO: 17)中的相应位置来标明连接部分的氨基酸位置。
按照一个实施方案，提供包含人胰岛素的B链和A链或其类似物或衍生物的单链胰岛素激动剂多肽，其中天然B链的最后5个羧基氨基酸(即B26-B30)缺失，且氨基酸B25与A链的氨基酸A1通过间插连接部分连接。在一个实施方案中，连接部分具有以下通用结构：
Y1-Z
其中
Y1选自键、X46、X46X47、X46X47X48、X46X47X48X49 (SEQ ID NO: 24)和X46X47X48X49X50 (SEQID NO: 13)，其中X46、X47、X48、X49和X50的每一个均表示任何氨基酸或其氨基酸类似物或衍生物；和
Z表示长度为至少8个氨基酸而不超过16个氨基酸的氨基酸序列，并包含序列X51X52X53X54X55X56RR(SEQ ID NO: 10)，其中
X51选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸；和
X52-X56各自独立地为任何氨基酸或其氨基酸类似物或衍生物。在一个实施方案中，X52是酪氨酸以外的任何氨基酸。在进一步的实施方案中，X52为任何非芳族氨基酸，而在一个实施方案中，X52为丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或脯氨酸。在进一步的实施方案中，X51选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸；X52是酪氨酸以外的任何氨基酸；和
X53、X54、X55和X56独立选自甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和脯氨酸。在一个进一步的实施方案中，X51选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸；X52选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸，丝氨酸，苏氨酸和脯氨酸；X53不是甘氨酸；X54和X55独立选自甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和脯氨酸，X56为丝氨酸。
在另一个实施方案中，连接部分包含以下通用结构：
Y1-W
其中
Y1选自键、X46、X46X47、X46X47X48和X46X47X48X49 (SEQ ID NO: 24)，其中X46、X47、X48和X49的每一个均表示任何氨基酸或其氨基酸类似物或衍生物，前提条件是Y1不是YTPKT (SEQID NO: 16)或FNKPT (SEQ ID NO: 76)；W表示2-16个单体单元的聚乙二醇。
在一个实施方案中，提供包含A链和氨基酸B26-B30 (相对于天然胰岛素序列)被脱去的C端截短的B链的单链胰岛素类似物，其中所述A链和B链是人胰岛素序列或其类似物或衍生物，此外其中B链B25氨基酸的羧基端与连接部分的第一末端直接连接，连接部分的第二末端与A链A1氨基酸的氨基端直接连接，此外其中，在一个实施方案中，连接部分不含序列YTPKT (SEQ ID NO: 16)或FNKPT (SEQ ID NO: 76)。在一个实施方案中，C端截短的B链包含表示SEQ ID NO: 2的氨基酸5-25的肽的类似物，其中所述类似物因在选自5、9、10、13、14、21、22和25的氨基酸位置处的1、1-2、3-4、4-6或至多8个氨基酸取代而不同于SEQ IDNO: 2的相应氨基酸5-25。在一个实施方案中，C端截短的B链包含表示SEQ ID NO: 2的氨基酸1-25的肽的类似物，其中所述类似物因在选自2、3、4、5、9、10、13、14、21、22和25的氨基酸位置处的1、1-2、3-4、4-6、4-8或至多10个氨基酸取代而不同于SEQ ID NO: 2的相应氨基酸1-25。在一个实施方案中，C端截短的B链包含与SEQ ID NO: 2的相应氨基酸5-25有至少70%、75%、80%、90%或95%序列同一性的肽。在一个实施方案中，A链是SEQ ID NO: 1的类似物，其中类似物因在选自4、5、8、9、10、12、14、15、18和21的氨基酸位置处的1、1-2、3-4、4-8或至多10个氨基酸取代而不同于SEQ ID NO: 1。在一个实施方案中，A链包含与SEQ ID NO:1有至少70%、75%、80%、90%或95%序列同一性的肽。
在一个实施方案中，连接部分包含
a) 6-16个单体单元的聚乙二醇；
b) 长度为至少8个氨基酸而不超过17个氨基酸，且包含序列GYGSSSX57R (SEQ IDNO: 51)或X51X52X53X54X55X56X57X58 (SEQ ID NO: 9)的非天然氨基酸序列或其肽模拟物；或
c) 所述聚乙二醇和1-4个氨基酸的非天然氨基酸序列的组合；
其中
X51选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸；
X52是酪氨酸以外的任何氨基酸；
X53-X56各自独立地为任何氨基酸；和
X57和X58独立地为精氨酸、赖氨酸或鸟氨酸。
在一个实施方案中，提供包含通用结构B-LM-A的单链胰岛素激动剂类似物，其中B表示包含序列X25LCGX29X30LVX33X34LYLVCGDX42GFX45 (SEQ ID NO: 58)的胰岛素B链，A表示包含序列GIVX4X5CCX8X9X10CX12LX14X15LX17X18X19CX21-R13 (SEQ ID NO: 22)的胰岛素A链，LM表示连接B链羧基端与A链氨基端的肽连接部分。在一个实施方案中，连接部分包含长度不超过17个氨基酸的氨基酸序列，且包含序列X51X52X53X54X55X56X57X58 (SEQ ID NO: 9)，其中
X4为谷氨酸或天冬氨酸；
X5为谷氨酰胺或谷氨酸；
X8为组氨酸、苏氨酸或苯丙氨酸；
X9为丝氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或丙氨酸；
X10为异亮氨酸或丝氨酸；
X12为丝氨酸或天冬氨酸；
X14为酪氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或丙氨酸；
X15为谷氨酰胺、谷氨酸、精氨酸、丙氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或亮氨酸；
X17为谷氨酰胺、谷氨酸、精氨酸、天冬氨酸或赖氨酸、鸟氨酸；
X18为甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸或苏氨酸；
X19为酪氨酸、4-甲氧基-苯丙氨酸或4-氨基苯丙氨酸；
X21选自丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、缬氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸和甲硫氨酸；
X25选自组氨酸和苏氨酸；
X29选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X30选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸和半胱磺酸；
X33选自天冬氨酸和谷氨酸；
X34选自丙氨酸和苏氨酸；
X42选自丙氨酸、鸟氨酸和精氨酸；
X45选自酪氨酸、组氨酸、天冬酰胺和苯丙氨酸；
X51选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸；
X52是酪氨酸以外的任何氨基酸；
X53-X56各自独立地为任何氨基酸；和
X57和X58独立地为精氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、高半胱氨酸、乙酰基-苯丙氨酸或鸟氨酸。在一个实施方案中，单链类似物还包含与连接部分的氨基酸侧链或在B链的N端α胺上或与选自A链的A9、A14和A15位或B链的B1、B2、B10、B22、B28或B29位的氨基酸侧链共价连接的亲水部分。在一个实施方案中，亲水部分(例如PEG)与B链的N端α胺连接。在一个实施方案中，相当于B26-B30的1-5个氨基酸从B链羧基端脱去，其余的羧基端氨基酸与连接部分的氨基端直接连接。在一个实施方案中，B链包含序列X25LCGX29X30LVX33X34LYLVCGDX42GFX45 (SEQID NO: 58)，连接部分包含序列(Y1)k-X51X52X53X54X55X56X57X58(Y2)n (SEQ ID NO: 9)，A链包含序列GIVX4ECCX8X9SCDLX14X15LEX18X19CX21-R13 (SEQ ID NO: 19)。
连接部分
肽接头
按照一个实施方案，连接部分是IGF 1 C链序列(GYGSSSRRAPQT；SEQ ID NO: 17)的衍生物。在一个实施方案中，衍生物是因赖氨酸、半胱氨酸、鸟氨酸、高半胱氨酸或乙酰基-苯丙氨酸残基的单个氨基酸取代而不同于SEQ ID NO: 17的肽，而在进一步的实施方案中，赖氨酸、半胱氨酸、鸟氨酸、高半胱氨酸或乙酰基-苯丙氨酸氨基酸被聚乙二醇化。在一个进一步的实施方案中，连接部分是因单个赖氨酸取代而不同于SEQ ID NO: 17的肽。在一个具体实施方案中，取代在SEQ ID NO: 17的8位产生。申请人发现使用IGF 1 C链序列及其类似物作为连接部分可产生具有接近野生型胰岛素活性的单链胰岛素多肽。此外，使用IGF1 C链序列类似物作为连接部分，其中IGF 1 C链序列的2位被修饰或从IGF 1 C链序列缺失羧基端4个氨基酸，产生对胰岛素有选择性(即与IGF-1受体相比，对胰岛素受体具有较高结合和/或活性)的单链胰岛素多肽。在一个实施方案中，单链胰岛素多肽对胰岛素受体的亲和力或活性是对IGF-1受体的5x、10x、20x、30x、40x或50x。
按照一个实施方案，连接部分是IGF 1 C链序列(GYGSSSRRAPQT；SEQ ID NO: 17)的衍生物，并包含因1-3个氨基酸取代或1-2个氨基酸取代而不同于GYGSSSRR (SEQ ID NO:18)或GAGSSSRRAPQT (SEQ ID NO: 36)的非天然序列。在一个实施方案中至少一个氨基酸取代是赖氨酸或半胱氨酸取代，而在一个实施方案中，氨基酸取代是保守氨基酸取代。在一个实施方案中，连接部分是8-17个氨基酸的肽(或肽模拟物)，其包含因1个氨基酸取代包括例如被赖氨酸或半胱氨酸取代而不同于GYGSSSRR (SEQ ID NO: 18)或GAGSSSRRAPQT (SEQID NO: 36)的非天然氨基酸序列。在一个实施方案中，连接部分包含序列GYGSSSRR (SEQID NO: 18)或GAGSSSRRAPQT (SEQ ID NO: 36)。在一个实施方案中，连接部分包含序列GAGSSSRX58APQT (SEQ ID NO: 167)、GYGSSSX57X58APQT (SEQ ID NO: 37)或因单个氨基酸取代而不同于SEQ ID NO: 167的氨基酸，其中X57为精氨酸，X58为精氨酸、鸟氨酸或赖氨酸，而在进一步的实施方案中，聚乙二醇链与所述连接部分8位的氨基酸侧链连接。在另一个实施方案中，连接部分包含序列GX52GSSSRX58APQT (SEQ ID NO: 38)，其中X52为任何非芳族氨基酸，包括例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或脯氨酸，X58表示具有与其侧链共价连接的聚乙烯链的氨基酸。在一个实施方案中，X58为聚乙二醇化赖氨酸。在一个实施方案中，连接部分包含序列GYGSSSRX58 (SEQ ID NO: 45)或GAGSSSRX58APQT (SEQ ID NO: 167)，其中X58表示具有与其侧链共价连接的聚乙烯链的氨基酸。
按照一个实施方案，连接部分是6-18、8-18、8-17、8-12、8-10、13-17或13-15个氨基酸(或其氨基酸类似物或衍生物)的肽或肽模拟物，其中肽连接部分包含两个或更多个相邻的碱性氨基酸残基。按照一个实施方案，连接部分是8-17个非天然氨基酸序列，其包含序列X51X52X53X54X55X56X57X58 (SEQ ID NO: 9)，其中X51、X52、X53、X54、X55和X56独立地为任何氨基酸或其氨基酸类似物或衍生物，X57和X58为碱性氨基酸。按照一个实施方案，连接部分是8-12个非天然氨基酸序列，其包含使全长B链与全长A链连接的序列X51AX53X54X55X56X57X58 (SEQID NO: 70)，其中X51、X53、X54、X55和X56独立地为任何氨基酸或其氨基酸类似物或衍生物，X57和X58为碱性氨基酸。在一个实施方案中，X57和X58之一表示聚乙二醇化赖氨酸残基。在进一步的实施方案中，X57和X58独立选自精氨酸、赖氨酸和鸟氨酸。
在一个实施方案中，连接部分是8-12、8-10、13-17或13-15个氨基酸的肽或肽模拟物，且包含序列X51X52X53X54X55X56X57R (SEQ ID NO: 25)，其中X51、X52、X53、X54和X55独立地为任何氨基酸或其氨基酸类似物或衍生物，X57为精氨酸、赖氨酸或鸟氨酸。在一个实施方案中，X51选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸，X52是酪氨酸以外的任何氨基酸。在一个实施方案中，X52为非芳族氨基酸，而在一个具体实施方案中，X52为丙氨酸或脯氨酸。在一个实施方案中，连接部分在氨基酸的侧链处被聚乙二醇化，而在进一步的实施方案中，在连接部分的8位处的氨基酸被聚乙二醇化。
在另一个实施方案中，连接部分是8-12、8-10、13-17或13-15个氨基酸的肽或肽模拟物，且包含序列X51X52X53X54X55SRR (SEQ ID NO: 26)，其中X51、X52、X53、X54和X55独立地为任何氨基酸或其氨基酸类似物或衍生物。按照一个实施方案，
X51选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸；
X52是酪氨酸以外的任何氨基酸；
X53、X54、X55和X56独立选自甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和脯氨酸。在一个实施方案中，X51和X52独立选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和脯氨酸。
在一个实施方案中，连接部分是长度为8-17个氨基酸的非天然多肽，且包含序列X51X52X53X54X55X56RR(SEQ ID NO: 10)，其中X52为非芳族氨基酸，包括例如丙氨酸。在一个实施方案中，连接部分的长度为8-17个氨基酸，且包含序列X51X52GSSSRR (SEQ ID NO: 27)，其中X51选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸和甲硫氨酸，X52为非芳族氨基酸，包括例如丙氨酸。在一个实施方案中，连接部分的长度为8-17个氨基酸，且包含因单个氨基酸取代而不同于X51X52GSSSRR (SEQ ID NO: 27)的序列，其中氨基酸取代为在其侧链被聚乙二醇化的氨基酸，此外其中X51选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸和甲硫氨酸，X52为非芳族氨基酸，包括例如丙氨酸。
在一个实施方案中，连接部分是8-17个氨基酸序列，其包含序列X51AX53X54X55X56X57R (SEQ ID NO: 28)或其肽模拟物，其中X51、X53、X54、X55、X56和X57独立地为任何氨基酸或其氨基酸类似物或衍生物。在一个实施方案中，X51选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸；X53、X54、X55和X56独立选自甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和脯氨酸，X57为碱性氨基酸，包括例如精氨酸、赖氨酸或鸟氨酸。
在一个实施方案中，连接部分是8-17个氨基酸序列，其包含序列X51X52GSSSX57X58(SEQ ID NO: 29)或X51X52GSSSX57X58APQT (SEQ ID NO: 46)，其中X51选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸，X52为非芳族氨基酸，X57和X58独立选自精氨酸、赖氨酸和鸟氨酸。在一个实施方案中，连接部分还包含与连接部分的氨基酸(包括例如在连接部分8位的氨基酸)侧链连接的聚乙二醇链。在进一步的实施方案中，连接部分是包含序列X51X52GSSSRR (SEQ ID NO: 27)、SEQ ID NO: 27的肽模拟物或因SEQ IDNO: 27的3-8位之一的单个氨基酸而不同于SEQ ID NO: 27的氨基酸序列的8-17个氨基酸序列，其中X51选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸和甲硫氨酸，X52为任何氨基酸，前提条件是如果连接肽长于8个氨基酸，则X52不为酪氨酸。在一个实施方案中，连接部分是由序列X51X52GSSSRR (SEQ ID NO: 27)、SEQ ID NO: 27的肽模拟物或因SEQ IDNO: 27的3-8位之一处的1、2或3个氨基酸取代而不同于SEQ ID NO: 27的氨基酸序列组成的8-17个氨基酸序列，其中X51选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸和甲硫氨酸，X52为任何氨基酸。在一个实施方案中，连接部分是长度为8个氨基酸的肽，且包含序列GYGSSSRR (SEQ ID NO: 18)或因单个氨基酸取代而不同于SEQ ID NO: 18的氨基酸序列或其衍生物。
在一个实施方案中，连接部分长度至少为8个但不超过17个氨基酸，且包含序列(Y1)k-X51X52X53X54X55X56X57X58(Y2) (SEQ ID NO: 9)，其中
X51选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和脯氨酸；
X52为丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或脯氨酸；和
X53-X56各自独立地为任何氨基酸；和
X57和X58独立地为精氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、高半胱氨酸、乙酰基-苯丙氨酸或鸟氨酸；
k为0或1；
Y1选自X46、X46X47、X46X47X48、X46X47X48X49 (SEQ ID NO: 24)和X46X47X48X49X50 (SEQ IDNO: 13)；
Y2选自X70、X70X71、X70X71X72和X70X71X72X73 (SEQ ID NO: 15)；
X46-X50和X70-X73各自独立地为任何氨基酸。在一个实施方案中，连接肽被聚乙二醇化。在一个实施方案中，k为0，Y2为X70X71X72X73 (SEQ ID NO: 15)。在备选实施方案中，k为1，Y2为X70X71X72X73 (SEQ ID NO: 15)。在一个实施方案中
X46为苯丙氨酸或酪氨酸；
X47为天冬酰胺或苏氨酸；
X48为天冬氨酸-赖氨酸二肽、精氨酸-脯氨酸二肽、赖氨酸-脯氨酸二肽或脯氨酸-赖氨酸二肽；和
X49为苏氨酸。在一个实施方案中，X70为丙氨酸，X71为脯氨酸，X72为谷氨酰胺，X73为苏氨酸。在一个实施方案中，k为0，Y2为APQT (SEQ ID NO: 82)。在一个实施方案中，Y1选自F、Y、FN、YT、FD、FE、YD和YE。在一个实施方案中，如果胰岛素B链不是天然胰岛素(SEQ IDNO: 2)或天然IGF-1 (SEQ ID NO: 6)，则Y1为FNKPT (SEQ ID NO: 76)或FNPKT (SEQ IDNO: 81)。
在一个实施方案中，连接部分是由以下序列组成的12个氨基酸序列：序列X51AGSSSRRAPQT (SEQ ID NO: 30)，或因选自SEQ ID NO: 30的3-12位的位置处的1-3个氨基酸取代而不同于SEQ ID NO: 30的氨基酸序列，其中X51选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸和甲硫氨酸，或SEQ ID NO: 30的肽模拟物。在一个实施方案中，连接部分是由以下序列组成的12个氨基酸序列：序列X51AGSSSRRAPQT (SEQ ID NO: 30)，或因选自SEQ ID NO: 30的3-10位的位置处的单个赖氨酸或半胱氨酸氨基酸取代而不同于SEQ IDNO: 30的氨基酸序列，其中X51选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸和甲硫氨酸，或SEQ ID NO: 30的肽模拟物。在一个实施方案中，赖氨酸或半胱氨酸氨基酸取代为聚乙二醇化赖氨酸或半胱氨酸氨基酸。
在另一个实施方案中，连接部分是包含以下序列的8-17个氨基酸序列：序列GX52GSSSRR (SEQ ID NO: 31)，其中X52为任何氨基酸；SEQ ID NO: 31的肽模拟物；或因SEQID NO: 31的1、3、4、5、6、7或8位任一个位置的单个氨基酸取代而不同于SEQ ID NO: 31的类似物，前提条件是如果连接肽长于8个氨基酸，则X52不是酪氨酸。按照一个实施方案，连接部分包含选自以下的8-17个氨基酸序列：GYGSSSRR (SEQ ID NO: 18)、GAGSSSRR (SEQ IDNO: 32)、GAGSSSRRA (SEQ ID NO: 33)、GAGSSSRRAP (SEQ ID NO: 34)、GAGSSSRRAPQ (SEQID NO: 35)、GAGSSSRRAPQT (SEQ ID NO: 36)、PYGSSSRR (SEQ ID NO: 39)、PAGSSSRR(SEQ ID NO: 40)、PAGSSSRRA (SEQ ID NO: 41)、PAGSSSRRAP (SEQ ID NO: 42)、PAGSSSRRAPQ (SEQ ID NO: 43)、PAGSSSRRAPQT (SEQ ID NO: 44)。按照一个实施方案，连接部分包含因单个聚乙二醇化氨基酸(包括例如聚乙二醇化赖氨酸或聚乙二醇化半胱氨酸氨基酸)取代而不同于以下序列的氨基酸序列：GYGSSSRR (SEQ ID NO: 18)、GAGSSSRR(SEQ ID NO: 32)、GAGSSSRRA (SEQ ID NO: 33)、GAGSSSRRAP (SEQ ID NO: 34)、GAGSSSRRAPQ (SEQ ID NO: 35)、GAGSSSRRAPQT (SEQ ID NO: 36)、PYGSSSRR (SEQ ID NO:39)、PAGSSSRR (SEQ ID NO: 40)、PAGSSSRRA (SEQ ID NO: 41)、PAGSSSRRAP (SEQ ID NO:42)、PAGSSSRRAPQ (SEQ ID NO: 43)、PAGSSSRRAPQT (SEQ ID NO: 44)。在一个实施方案中，聚乙二醇化氨基酸位于连接部分的8位。
非肽接头
在一个实施方案中，连接部分是约为8-16个氨基酸序列长的相对短的双官能非肽聚合物接头。按照一个实施方案，非肽连接部分是约4-20、8-18、8-16、8-14、10-14、10-12或11-13个单体的聚乙二醇接头。在一个实施方案中，提供单链胰岛素激动剂，其中天然B链的最后5个羧基氨基酸缺失，氨基酸B25通过共价键与连接部分直接连接。连接部分的第二末端与A链的氨基酸A1共价结合，从而通过连接部分连接B链和A链。在一个实施方案中，连接部分是线性聚乙二醇连接部分，包含至少10个但不超过16个单体单元，而在另一个实施方案中，聚乙二醇连接部分包含至少12个但不超过16个单体单元，而在进一步的实施方案中，聚乙二醇连接部分包含至少10个但不超过14个单体单元。
按照一个实施方案，聚乙二醇连接部分包含以下结构：
其中m为6-18、8-16、10-14或11-13的整数。在一个实施方案中，m为选自10、11、12、13或14的整数。在一个实施方案中，m为12。
在一个实施方案中，提供单链胰岛素激动剂，其中天然B链的最后5个羧基氨基酸缺失，氨基酸B25通过连接部分与A链的氨基酸A1连接，所述连接部分包含至少8个但不超过16个单体单元的聚乙二醇和1-4个氨基酸的氨基酸序列。按照一个实施方案，连接部分包含1-4个氨基酸序列和与所述1-4个氨基酸序列共价结合的长度为至少8个但少于14个单体单元的线性聚乙二醇，前提条件是氨基酸序列不是YTPK (SEQ ID NO: 78)或FNKP (SEQ IDNO: 77)。在另一个实施方案中，提供单链胰岛素激动剂，其中天然B链的最后5个羧基氨基酸缺失，氨基酸B25通过连接部分与A链的氨基酸A1连接，所述连接部分包含长度为至少8个但少于14个单体单元的聚乙二醇和2-5个氨基酸序列。2-5个氨基酸序列可位于B链和聚乙二醇链之间或者位于A链和聚乙二醇链之间。然而，当2-5个氨基酸序列位于B链和聚乙二醇链之间时，氨基酸序列不是YTPKT (SEQ ID NO: 16)或FNKPT (SEQ ID NO: 76)。
在一个实施方案中，连接部分包含通用结构：W1-Z1-Y1
其中
W1和Y1独立地为键、X46、X46X47、X46X47X48、X46X47X48X49 (SEQ ID NO: 24)或X46X47X48X49X50 (SEQ ID NO: 13)，前提条件是W1不是YTPK (SEQ ID NO: 78)或FNKP (SEQID NO: 77)，且Z1表示以下通用结构的聚乙二醇
其中m为6-14范围的整数，且X46、X47、X48、X49和X50的每一个独立地为任何氨基酸。在一个实施方案中，X46、X47、X48、X49和X50独立地为相对于胰岛素或IGF-1的B26-B30位而言的任何非天然氨基酸。在一个实施方案中，X46、X47、X48、X49和X50独立选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸和脯氨酸，而在进一步的实施方案中，X46、X47、X48、X49和X50独立选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。在一个实施方案中，W1为键，Y1为X46、X46X47或X46X47X48 (SEQ ID NO: 24)，其中X46、X47和X48各自为丙氨酸，Z为4-14个单体单元的聚乙二醇。在一个实施方案中，Y1为键，W1为X46、X46X47或X46X47X48 (SEQ ID NO: 24)，其中X46、X47和X48各自为丙氨酸，Z为4-14个单体单元的聚乙二醇。
在一个实施方案中，连接部分包含被1、2、3或4个氨基酸分隔开的2个聚乙烯链。在该实施方案中，连接部分包含以下通用结构：W2-Z2-Y2
其中
W2和Y2独立地为以下通用结构的聚乙二醇
；Z2为键、X46、X46X47或X46X47X48，其中m为3-7范围的整数，X46、X47和X48的每一个独立地为任何氨基酸。在一个实施方案中，Z2为X46或X46X47，而在进一步的实施方案中，X46和X47独立地为Lys或Cys。在一个实施方案中，Z2包含聚乙二醇化Lys或Cys氨基酸。在一个实施方案中，连接部分包含被单个氨基酸分隔开的2个聚乙烯链，所述聚乙烯链表示共计8-12或10-14或12个单体单元的乙二醇。在一个实施方案中，单个氨基酸是赖氨酸或半胱氨酸。在一个实施方案中，Z2为聚乙二醇化赖氨酸。
在一个实施方案中，提供包含A链和C端截短的B链的单链胰岛素类似物，所述C端截短的B链的氨基酸B26-B30 (相对于天然胰岛素序列)被脱去，其中所述A链和B链是人胰岛素序列或其类似物或衍生物，此外其中B链B25氨基酸的羧基端与连接部分的第一末端直接连接，连接部分的第二末端与A链A1氨基酸的氨基端直接连接。在一个实施方案中，截短的B链包含SEQ ID NO: 21的序列，其中B25氨基酸与连接肽的N端直接连接。在该实施方案中，连接部分包含
a) 6-16个单体单元的聚乙二醇；
b) 长度为至少8个氨基酸而不超过17个氨基酸的非天然氨基酸序列，并包含序列(Y1)k-X51AX53X54X55X56X57R(Y2)n (SEQ ID NO: 28)、(Y1)k-X51AX53X54X55X56RR(Y2)n (SEQ IDNO: 23)、(Y1)k-GYGSSSX57X58(Y2)n (SEQ ID NO: 85)、(Y1)k-GAGSSSX57X58(Y2)n (SEQ ID NO:163)、(Y1)k-GYGSSSX57R (SEQ ID NO: 51)或(Y1)k-X51X52GSSSX57X58-(Y2)n (SEQ ID NO:29)；或
c) 所述聚乙二醇和1-4个氨基酸的非天然氨基酸序列的组合；
其中
n为0或1；
k为0或1；
Y1选自X46、X46X47；和
Y2选自X70、X70X71、X70X71X72和X70X71X72X73 (SEQ ID NO: 15)；
X51选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸；
X52为丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或脯氨酸；
X57和X58独立地为精氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、高半胱氨酸、乙酰基-苯丙氨酸或鸟氨酸；和
X46为苯丙氨酸或酪氨酸；
X47为天冬酰胺、谷氨酸、天冬氨酸或苏氨酸；
X70-X73独立地为任何氨基酸，前提条件是如果k为0，则连接肽不含序列YTPKT(SEQ ID NO: 16)或FNKPT (SEQ ID NO: 76)。在一个实施方案中，X57和X58之一与亲水部分连接或被酰化。在一个实施方案中，X57和X58之一被聚乙二醇化。在一个实施方案中，连接部分包含序列(Y1)k-X51AX53X54X55X56RR(Y2)n (SEQ ID NO: 23)或(Y1)k-GYGSSSX57R (SEQ IDNO: 51)，其中
k为0或1；
n为0或1；
X51选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸；
X53-X56各自独立地为任何氨基酸；
X57为赖氨酸、鸟氨酸或精氨酸；
Y1选自X46、X46X47和X46X47X48；
其中
X46为苯丙氨酸或酪氨酸；
X47为天冬酰胺、谷氨酸、天冬氨酸或苏氨酸；
X48为天冬氨酸、精氨酸、赖氨酸或脯氨酸；和
Y2选自A、AP、APQ和APQT (SEQ ID NO: 82)。在一个实施方案中，A链是选自以下的序列的氨基酸序列衍生物：GIVEQCCTSICSLYQLENYCN (SEQ ID NO: 1)、GIVDECCFRSCDLRRLEMYCA (SEQ ID NO: 5)或GIVEECCFRSCDLALLETYCA (SEQ ID NO: 7)，B链包含序列FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT (SEQ ID NO: 2)或其中X26和X27各自为丙氨酸且X42为精氨酸的GPETLCGX26ELVDX27LYLVCGDX42GFYFNKPT-R14(SEQ ID NO: 197)，或其相当于B26、B27、B28、B29和B30的1-5个氨基酸缺失的羧基缩短序列。
胰岛素A链和B链
本发明的单链胰岛素激动剂可包含人胰岛素的天然B链和A链序列(分别为SEQ IDNO: 1和2)或其当以异源双链彼此连接时具有胰岛素激动剂活性的任何已知的类似物或衍生物。这类类似物包括例如具有因一个或多个氨基酸缺失、一个或多个氨基酸取代和/或一个或多个氨基酸插入而不同于人胰岛素的A链和B链的A链和B链但又不破坏胰岛素类似物的胰岛素活性的蛋白质。
胰岛素类似物的一种类型即“单体胰岛素类似物”是本领域众所周知的。它们是人胰岛素的速效类似物，包括例如这样的胰岛素类似物，其中：
(a) B28位的氨基酰基残基被Asp、Lys、Leu、Val或Ala取代，B29位的氨基酰基残基是Lys或Pro；
(b) B27、B28、B29和B30位任一位置的氨基酰基残基缺失或被非天然氨基酸取代。在一个实施方案中，提供包含B28位被Asp取代或28位被Lys取代和B29位被脯氨酸取代的胰岛素类似物。其它单体胰岛素类似物公开于Chance等，美国专利号5,514,646；Chance等，美国专利申请顺序号08/255,297；Brems等，Protein Engineering, 5:527-533 (1992)；Brange等，EPO公布号214,826 (1987年3月18日公布)；以及Brange等，Current Opinion inStructural Biology, 1:934-940 (1991)。这些公开内容通过引用明确结合到本文中用于描述单体胰岛素类似物。
胰岛素类似物还可用酸性形式置换酰胺化氨基酸。例如，Asn可被Asp或Glu置换。同样地，Gln可被Asp或Glu置换。具体地讲，Asn(A18)、Asn(A21)或Asp(B3)或这些残基的任何组合可被Asp或Glu置换。同样地，Gln(A15)或Gln(B4)或两者可被Asp或Glu置换。
如本文所公开的，提供包含人胰岛素的B链和A链或其类似物或衍生物的单链胰岛素激动剂，其中B链的羧基端通过连接部分与A链的氨基端连接。在一个实施方案中，A链是选自以下的氨基酸序列：GIVEQCCTSICSLYQLENYCN (SEQ ID NO: 1)、GIVDECCFRSCDLRRLEMYCA (SEQ ID NO: 5)或GIVEECCFRSCDLALLETYCA (SEQ ID NO: 7)；B链包含序列FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT (SEQ ID NO: 2)、其中X26和X27各自为丙氨酸且X42为精氨酸的GPETLCGX26ELVDX27LYLVCGDX42GFYFNKPT-R14(SEQ ID NO: 197)，或其相当于B26、B27、B28、B29和B30的1-5个氨基酸缺失的羧基缩短序列；和这类序列的类似物，其中每个序列经修饰以包含在相当于选自A5、A8、A9、A10、A14、A15、A17、A18、A21、B1、B2、B3、B4、B5、B9、B10、B13、B14、B20、B22、B23、B26、B27、B28、B29和B30的天然胰岛素位置(参见图5所示的肽比对)的位置处的1-5个氨基酸取代。在一个实施方案中，氨基酸取代是保守氨基酸取代。这些位置的不会不利地影响胰岛素的所需活性的合适氨基酸取代对本领域技术人员而言是已知的，如例如Mayer等，Insulin Structure and Function, Biopolymers.2007;88(5):687-713所证实的一样，其公开内容通过引用结合到本文中。
按照一个实施方案，单链胰岛素类似物肽可包含胰岛素A链和胰岛素B链或其类似物，其中A链包含在天然肽的长度内与GIVEQCCTSICSLYQLENYCN (SEQ ID NO: 1)、GIVDECCFRSCDLRRLEMYCA (SEQ ID NO: 5)或GIVEECCFRSCDLALLETYCA (SEQ ID NO: 7)的至少一个具有至少70%序列同一性(例如70%、75%、80%、85%、90%、95%)的氨基酸序列，B链包含在天然肽的长度内与序列FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT (SEQ ID NO: 2)、其中X26和X27各自为丙氨酸且X42为精氨酸的GPETLCGX26ELVDX27LYLVCGDX42GFYFNKPT-R14(SEQ IDNO: 197)或其相当于B27、B28、B29和B30的1-4个氨基酸缺失的羧基缩短序列的至少一个具有至少60%序列同一性(例如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%)的氨基酸序列，。
可将其它氨基酸序列加至本发明的单链胰岛素激动剂的B链的氨基端或A链的羧基端上。例如，可将一系列带负电荷的氨基酸加至B链的氨基端，包括例如长度为1-12、1-10、1-8或1-6个氨基酸并包含一个或多个带负电荷的氨基酸(包括例如谷氨酸和天冬氨酸)的肽。在一个实施方案中，B链氨基端突出端包含1-6个带电荷的氨基酸。在一个实施方案中，单链胰岛素类似物包含含有序列X60X61X62X63X64X65K (SEQ ID NO: 47)的B链氨基端突出端，其中X60选自甘氨酸、谷氨酸和天冬氨酸，X61、X62、X63、X64和X65独立地为谷氨酸或天冬氨酸。在一个实施方案中，B链氨基端突出端包含序列GX61X62X63X64X65K (SEQ ID NO: 48)或X61X62X63X64X65RK (SEQ ID NO: 49)，其中X61、X62、X63、X64和X65独立地为谷氨酸或天冬氨酸。在一个实施方案中，B链包含序列GEEEEEKGPEHLCGAHLVDALYLVCGDX42GFY (SEQ ID NO: 50)，其中X42选自丙氨酸、赖氨酸、鸟氨酸和精氨酸。按照一个实施方案，所公开的单链胰岛素类似物包含替代A链上的C端羧酸酯的C端酰胺或酯。
高效力单链胰岛素类似物还可根据描述于国际申请PCT/2009/068713的修饰的IGF I和IGF II序列来制备，其公开内容通过引用明确结合到本文中。更具体地讲，在相当于天然胰岛素的B16和B17的位置处天然IGF氨基酸被酪氨酸亮氨酸二肽取代的IGF I和IGFII的类似物对胰岛素受体的效力提高10倍。因此，本文所公开的单链胰岛素类似物可包括IGF I (SEQ ID NO: 5)或IGF II (SEQ ID NO: 7)的A链和IGF I (SEQ ID NO: 6)或IGFII (SEQ ID NO: 8)的B链或天然胰岛素(SEQ ID NO: 2)的B链。另外，本文所公开的单链胰岛素类似物可包括天然胰岛素A链或其类似物和IGF I (SEQ ID NO: 6)或IGF II (SEQ IDNO: 8)的B链以及所述B链的类似物。在一个实施方案中，单链胰岛素类似物包含IGF I(SEQ ID NO: 5) A链或其类似物或衍生物和IGF I (SEQ ID NO: 6)、IGF II (SEQ ID NO:8)或天然胰岛素(SEQ ID NO: 2)的B链或其类似物或衍生物。
单链IGF或胰岛素A链和B链的其它修饰包括例如：A19、B16或B25 (相对于天然胰岛素A链和B链)的一个或多个位置处的氨基酸变为4-氨基苯丙氨酸的修饰，或者在选自以下的位置处的一个或多个氨基酸取代：A5、A8、A9、A10、A14、A15、A17、A18、A21、B1、B2、B3、B4、B5、B9、B10、B13、B14、B20、B21、B22、B23、B26、B27、B28、B29和B30 (相对于胰岛素的天然A链和B链)，或者B1-4和B26-30位的任一个或全部缺失。在一个实施方案中，相对于天然胰岛素序列，选自A5、A8、A9、A10、A14、A15、A17、A18、A21、B1、B2、B3、B4、B5、B9、B10、B13、B14、B20、B21、B22、B23、B26、B27、B28、B29和B30的位置处的取代是保守氨基酸取代。
按照一个实施方案，B链包含序列
R22-X25LCGX29X30LVX33X34LYLVCGX41X42GFX45 (SEQ ID NO: 21)，A链包含序列
GIVX4X5CCX8X9X10CX12LX14X15LX17X18X19CX21-R13 (SEQ ID NO: 22)，其中
X4为谷氨酸或天冬氨酸；
X5为谷氨酰胺或谷氨酸；
X8为组氨酸、苏氨酸或苯丙氨酸；
X9为丝氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或丙氨酸；
X10为异亮氨酸或丝氨酸；
X12为丝氨酸或天冬氨酸；
X14为酪氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或丙氨酸；
X15为谷氨酰胺、谷氨酸、精氨酸、丙氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或亮氨酸；
X17为谷氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、鸟氨酸或谷氨酰胺；
X18为甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸或苏氨酸；
X19为酪氨酸、4-甲氧基-苯丙氨酸或4-氨基苯丙氨酸；
X21选自丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、缬氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸和甲硫氨酸；
X25为组氨酸或苏氨酸；
X29选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X30选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸和半胱磺酸；
X33选自天冬氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸；
X34选自丙氨酸和苏氨酸；
X41选自谷氨酸、天冬氨酸或天冬酰胺；
X42选自丙氨酸、赖氨酸、鸟氨酸和精氨酸；
X45为酪氨酸或苯丙氨酸；
R22选自AYRPSE (SEQ ID NO: 14)、FVNQ (SEQ ID NO: 12)、PGPE (SEQ ID NO:11)、三肽甘氨酸-脯氨酸-谷氨酸、三肽缬氨酸-天冬酰胺-谷氨酰胺、二肽脯氨酸-谷氨酸、二肽天冬酰胺-谷氨酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸和N端胺；和
R13为COOH或CONH2。在一个实施方案中，X8、X25和X30各自为组氨酸。在进一步的实施方案中，单链胰岛素类似物肽包含SEQ ID NO: 19的A链肽序列和/或SEQ ID NO: 20的B链肽序列的类似物，其中A链和B链的类似物各自包含1-3个另外的氨基酸取代。
在一个实施方案中，提供包含结构：IB-LM-IA的单链胰岛素类似物，其中IB包含序列R22-X25LCGX29X30LVX33X34LYLVCGX41X42GFX45 (SEQ ID NO: 21)，LM为本文所公开的将IB与IA共价连接的连接部分，IA包含序列GIVX4X5CCX8X9X10CX12LX14X15LX17X18X19CX21-R13 (SEQ IDNO: 22)，其中
X4为谷氨酸或天冬氨酸；
X5为谷氨酰胺或谷氨酸；
X8为组氨酸或苯丙氨酸；
X9和X14独立选自精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或丙氨酸；
X10为异亮氨酸或丝氨酸；
X12为丝氨酸或天冬氨酸；
X14为酪氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或丙氨酸；
X15为精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或亮氨酸；
X17为谷氨酸或谷氨酰胺；
X18为甲硫氨酸、天冬酰胺或苏氨酸；
X19为酪氨酸、4-甲氧基-苯丙氨酸或4-氨基苯丙氨酸；
X21为丙氨酸、甘氨酸或天冬酰胺；
X25选自组氨酸和苏氨酸；
X29选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X30选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸和半胱磺酸；
X33选自天冬氨酸和谷氨酸；
X34选自丙氨酸和苏氨酸；
X41选自谷氨酸、天冬氨酸或天冬酰胺；
X42选自丙氨酸、赖氨酸、鸟氨酸和精氨酸；
R22选自AYRPSE (SEQ ID NO: 14)、FVNQ (SEQ ID NO: 12)、PGPE (SEQ ID NO:11)、三肽甘氨酸-脯氨酸-谷氨酸、三肽缬氨酸-天冬酰胺-谷氨酰胺、二肽脯氨酸-谷氨酸、二肽天冬酰胺-谷氨酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸和N端胺；和
R13为COOH或CONH2，此外其中在X45标识处的氨基酸与连接部分LM直接结合(即本文所用IB-LM-IA标识欲表示B链羧基端和A链的氨基端在没有任何其它间插氨基酸的情况下与连接部分LM直接连接)。
按照一个实施方案，连接部分LM选自(Y1)k-X51AX53X54X55X56X57R(Y2)n (SEQ ID NO:28)、(Y1)k、(Y1)k-GX52GSSSX57R-(Y2)n (SEQ ID NO: 90)、(Y1)k-GYGSSSX57R(Y2)n (SEQ IDNO: 51)和，
其中
Y1选自X46、X46X47、X46X47X48、X46X47X48X49 (SEQ ID NO: 24)和X46X47X48X49X50 (SEQ IDNO: 13)；和
Y2选自X70、X70X71、X70X71X72和X70X71X72X73 (SEQ ID NO: 15)；
n为0或1；
k为0或1；
m为选自8-16的整数；
X46-X50和X70-X73各自独立地为任何氨基酸；
X51选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸；
X52是酪氨酸以外的任何氨基酸；和
X53、X54、X55和X56独立选自甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和脯氨酸和
X57为精氨酸、赖氨酸或鸟氨酸。按照一个实施方案，n或k的至少一个为1。在一个实施方案中，Y2选自A、AP、APQ和APQT (SEQ ID NO: 82)，Y1选自F、Y、FN、YT、FNK、YTP、FNKP(SEQ ID NO: 77)、FNPK (SEQ ID NO: 79)、YTPK (SEQ ID NO: 78)、YTPKT (SEQ ID NO:16)、YTKPT (SEQ ID NO: 80)、FNKPT (SEQ ID NO: 76)和FNPKT (SEQ ID NO: 81)。在一个实施方案中，连接部分包含选自以下的序列：X51AX53X54X55X56X57R(Y2)n (SEQ ID NO: 28)、(Y1)k-GYGSSSX57R(Y2)n (SEQ ID NO: 51)和(Y1)k-GX52GSSSX57R(Y2)n (SEQ ID NO: 90)，其中X51选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸，X52选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸和脯氨酸，X53不是甘氨酸，X54和X55独立选自甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和脯氨酸，X56为丝氨酸，X57为精氨酸、赖氨酸或鸟氨酸。在一个实施方案中，n为1，k为0，备选地在一个实施方案中，k为1，n为0，而在一个实施方案中，n和k均为1。在一个实施方案中，连接部分是其中m为选自10-14的整数的聚乙二醇。
按照一个实施方案，提供这样的胰岛素类似物，其中胰岛素肽的A链包含序列GIVEQCCX8SICSLYQLX17NX19CX23 (SEQ ID NO: 52)，B链包含序列X25LCGX29X30LVEALYLVCGERGFF (SEQ ID NO: 53)，其中
X8选自苏氨酸和组氨酸；
X17为谷氨酸或谷氨酰胺；
X19为酪氨酸、4-甲氧基-苯丙氨酸或4-氨基苯丙氨酸；
X23为天冬酰胺或甘氨酸；
X25选自组氨酸和苏氨酸；
X29选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X30选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸和半胱磺酸。在进一步的实施方案中，B链包含序列X22VNQX25LCGX29X30LVEALYLVCGERGFFYT-Z1-B1 (SEQ ID NO: 54)，其中
X22选自苯丙氨酸和脱氨基-苯丙氨酸；
X25选自组氨酸和苏氨酸；
X29选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X30选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸和半胱磺酸；
Z1为选自天冬氨酸-赖氨酸、赖氨酸-脯氨酸和脯氨酸-赖氨酸的二肽；和
B1选自苏氨酸、丙氨酸或苏氨酸-精氨酸-精氨酸三肽。
按照一个实施方案，提供包含结构：IB-LM-IA的单链胰岛素类似物，其中IB包含序列X25LCGX29X30LVEALYLVCG ERGFF (SEQ ID NO: 53)，LM为本文所公开的将IB与IA共价连接的连接部分，IA包含序列GIVEQCCX8SICSLYQLENX19CX21 (SEQ ID NO: 55)，其中SEQ ID NO:54的C端苯丙氨酸残基在不存在任何间插氨基酸的情况下与连接部分LM直接共价结合。按照一个实施方案，连接部分LM选自(Y1)k-X51AX53X54X55X56X57R(Y2)n (SEQ ID NO: 28)、(Y1)k-GYGSSSX57R(Y2)n (SEQ ID NO: 51)和，
其中
Y1选自X46、X46X47、X46X47X48、X46X47X48X49 (SEQ ID NO: 24)和X46X47X48X49X50 (SEQ IDNO: 13)；和
Y2选自X70、X70X71、X70X71X72和X70X71X72X73 (SEQ ID NO: 15)；
n为0或1；
k为0或1；
m为7-16范围的整数；
X46-X50和X70-X73各自独立地为任何氨基酸；和
X57为精氨酸、赖氨酸或鸟氨酸。
按照一个实施方案，单链胰岛素类似物包含具有序列R22-HLCGSX30LVEALYLVCGERGFF (SEQ ID NO: 154)或R24-X25LCGX29X30LVX33X34LYLVCGX41X42GFX45 (SEQ ID NO: 21)的B链和具有序列GIVEQCCX8SICSLYQLENX19CX21-R13 (SEQ ID NO: 55)或GIVX4ECCX8X9SCDLX14X15LX17X18X19CX21-R13 (SEQ ID NO: 19)的A链
其中
X4为谷氨酸或天冬氨酸；
X8为组氨酸、苏氨酸或苯丙氨酸；
X9为精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或丙氨酸；
X14为精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或丙氨酸；
X15为谷氨酰胺、谷氨酸、精氨酸、丙氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或亮氨酸；
X17为谷氨酰胺或谷氨酸
X18为甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸或苏氨酸；
X19为酪氨酸、4-甲氧基-苯丙氨酸或4-氨基苯丙氨酸；
X21选自丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、缬氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸和甲硫氨酸；
X22选自苯丙氨酸和脱氨基-苯丙氨酸；
X23为天冬酰胺或甘氨酸；
X25为组氨酸或苏氨酸；
X29选自丙氨酸和甘氨酸；
X30选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸和半胱磺酸；
X33选自天冬氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸；
X34选自丙氨酸和苏氨酸；
X41选自谷氨酸、天冬氨酸或天冬酰胺；
X42选自丙氨酸、赖氨酸、鸟氨酸和精氨酸；
X45为酪氨酸或苯丙氨酸；
R22选自X22VNQ (SEQ ID NO: 84)、三肽缬氨酸-天冬酰胺-谷氨酰胺、二肽天冬酰胺-谷氨酰胺、谷氨酰胺和键；
R24选自AYRPSE (SEQ ID NO: 14)、PGPE (SEQ ID NO: 11)、三肽甘氨酸-脯氨酸-谷氨酸、二肽脯氨酸-谷氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸和键；和
R13为COOH或CONH2。
按照一些实施方案，单链胰岛素类似物包含具有序列R23-R24-X25LCGX29X30LVX33X34LYLVCGX41X42GFX45 (SEQ ID NO: 21)或R23-R22-HLCGSX30LVEALYLVCGERGFF (SEQ ID NO: 154)的B链和具有序列GIVX4ECCX8X9SCDLX14X15LX17X18X19CX21-R13 (SEQ ID NO: 19)的A链
其中
X4为谷氨酸或天冬氨酸；
X8为组氨酸、苏氨酸或苯丙氨酸；
X9为精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或丙氨酸；
X14为精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或丙氨酸；
X15为谷氨酰胺、谷氨酸、精氨酸、丙氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或亮氨酸；
X17为谷氨酰胺或谷氨酸；
X18为甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸或苏氨酸；
X19为酪氨酸、4-甲氧基-苯丙氨酸或4-氨基苯丙氨酸；
X21选自丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、缬氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸和甲硫氨酸；
X22选自苯丙氨酸和脱氨基-苯丙氨酸；
X25为组氨酸或苏氨酸；
X29选自丙氨酸和甘氨酸；
X30选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸和半胱磺酸；
X33选自天冬氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸；
X34选自丙氨酸和苏氨酸；
X41选自谷氨酸、天冬氨酸或天冬酰胺；
X42选自丙氨酸、赖氨酸、鸟氨酸和精氨酸；
X45为酪氨酸或苯丙氨酸；
R22选自X22VNQ (SEQ ID NO: 84)、三肽缬氨酸-天冬酰胺-谷氨酰胺、二肽天冬酰胺-谷氨酰胺、谷氨酰胺和键；
R23为N端胺或X60(X61X62)dX63K (SEQ ID NO: 192)；
其中
X60选自甘氨酸、谷氨酸和天冬氨酸；
X61和X62独立选自谷氨酸和天冬氨酸；
X63选自精氨酸、天冬氨酸和谷氨酸；
d为1-3范围的整数；
R24选自AYRPSE (SEQ ID NO: 14)、PGPE (SEQ ID NO: 11)、三肽甘氨酸-脯氨酸-谷氨酸、二肽脯氨酸-谷氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸和键；和
R13为COOH或CONH2。
按照一些实施方案，A链包含序列GIVEQCCX8SICSLYQLX17NX19CX23 (SEQ ID NO:52)或GIVDECCX8X9SCDLX14X15LX17X18 X19CX21-R13 (SEQ ID NO: 56)，B链包含序列X25LCGX29X30LVX33X34LYLVCGDX42GFX45 (SEQ ID NO: 58)，其中
X8为组氨酸或苯丙氨酸；
X9和X14独立选自精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或丙氨酸；
X15为精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或亮氨酸；
X17为谷氨酸或谷氨酰胺；
X18为甲硫氨酸、天冬酰胺或苏氨酸；
X19为酪氨酸、4-甲氧基-苯丙氨酸或4-氨基苯丙氨酸；
X21为丙氨酸、甘氨酸或天冬酰胺；
X23为天冬酰胺或甘氨酸；
X25选自组氨酸和苏氨酸；
X29选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X30选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸和半胱磺酸；
X33选自天冬氨酸和谷氨酸；
X34选自丙氨酸和苏氨酸；
X42选自丙氨酸、赖氨酸、鸟氨酸和精氨酸；
X45为酪氨酸；和
R13为COOH或CONH2。在一个实施方案中，n和k的至少一个为1。
在进一步的实施方案中，A链包含序列GIVDECCHX9SCDLX14X15LX17X18X19CX21-R13(SEQ ID NO: 56)，B链包含序列X25LCGX29X30LVX33X34LYLVCGDX42GFX45 (SEQ ID NO: 58)，其中
X9和X14独立选自精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或丙氨酸；
X15为精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或亮氨酸；
X17为谷氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、鸟氨酸或谷氨酰胺；
X18为甲硫氨酸、天冬酰胺或苏氨酸；
X19为酪氨酸、4-甲氧基-苯丙氨酸或4-氨基苯丙氨酸；
X21为丙氨酸、甘氨酸或天冬酰胺；
X23为天冬酰胺或甘氨酸；
X25选自组氨酸和苏氨酸；
X29选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X30选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸和半胱磺酸；
X33选自天冬氨酸和谷氨酸；
X34选自丙氨酸和苏氨酸；
X42选自丙氨酸、赖氨酸、鸟氨酸和精氨酸；
X45为酪氨酸或苯丙氨酸，和
R13为COOH或CONH2。在进一步的实施方案中，A链包含序列GIVDECCHX9SCDLX14X15LX17MX19CX21-R13 (SEQ ID NO: 59)，B链包含序列X25LCGAX30LVDALYLVCGDX42GFX45 (SEQ ID NO: 60)，其中
X9、X14和X15独立地为鸟氨酸、赖氨酸或精氨酸；
X17为谷氨酸或谷氨酰胺；
X19为酪氨酸、4-甲氧基-苯丙氨酸或4-氨基苯丙氨酸；
X21为丙氨酸、甘氨酸或天冬酰胺；
X25选自组氨酸和苏氨酸；
X30选自组氨酸，天冬氨酸和谷氨酸；
X42选自丙氨酸、赖氨酸、鸟氨酸和精氨酸；
X45为酪氨酸或苯丙氨酸，和
R13为COOH或CONH2。在一个实施方案中，B链选自HLCGAELVDALYLVCGDX42GFY (SEQID NO: 61)、GPEHLCGAELVDALYLVCGDX42GFY (SEQ ID NO: 62)、GPEHLCGAELVDALYLVCGDX42GFYFNPKT (SEQ ID NO: 63)和GPEHLCGAELVDALYLVCGDX42GFYFNKPT (SEQ ID NO: 64)，其中X42选自鸟氨酸、赖氨酸和精氨酸。在进一步的实施方案中，A链包含序列GIVDECCHX9SCDLX14X15LQMYCN-R13 (SEQ ID NO:66)，其中X9、X14和X15独立地为鸟氨酸、赖氨酸或精氨酸。
按照一个实施方案，连接部分是选自(Y1)k-X51AX53X54X55X56X57R(Y2)n (SEQ ID NO:28)和(Y1)k-GYGSSSX57R (SEQ ID NO: 51)的肽，其中
Y1选自X46、X46X47、X46X47X48、X46X47X48X49 (SEQ ID NO: 24)和X46X47X48X49X50 (SEQ IDNO: 13)；和
Y2选自X70、X70X71、X70X71X72和X70X71X72X73 (SEQ ID NO: 15)，n为0或1，k为0或1，其中n和k的至少一个为1。在一个实施方案中，n为1，Y1选自F、Y、FN、YT、FNK、YTP、FNPK (SEQID NO: 79)、FNKP (SEQ ID NO: 77)、YTPK (SEQ ID NO: 78)、YTPKT (SEQ ID NO: 16)、YTKPT (SEQ ID NO: 80)、FNKPT (SEQ ID NO: 76)和FNPKT (SEQ ID NO: 81)。在另一个实施方案中，Y1选自F、FN、FNK、FNPK (SEQ ID NO: 79)、FNKPT (SEQ ID NO: 76)和FNPKT(SEQ ID NO: 81)。在一个实施方案中，Y2选自A、AP、APQ和APQT (SEQ ID NO: 82)。在进一步的实施方案中，n和k均为1，Y1选自F、Y、FN、YT、FNK、YTP、FNPK (SEQ ID NO: 79)、FNKP(SEQ ID NO: 77)、YTPK (SEQ ID NO: 78)、YTPKT (SEQ ID NO: 16)、YTKPT (SEQ ID NO:80)、FNKPT (SEQ ID NO: 76)和FNPKT (SEQ ID NO: 81)，Y2选自A、AP、APQ和APQT (SEQ IDNO: 82)。
在一个实施方案中，提供包含通式IB-LM-IA的单链胰岛素类似物，其中IB为选自以下的氨基酸序列：HLCGAELVDALYLVCGDX42GFY (SEQ ID NO: 61)、GPEHLCGAELVDALYLVCGDX42GFY (SEQ ID NO: 62)、GPEHLCGAELVDALYLVCGDX42GFYFNPKT(SEQ ID NO: 63)和GPEHLCGAELVDALYLVCGDX42GFYFNKPT (SEQ ID NO: 64)，LM为选自以下的连接部分：GAGSSSX57RAPQT (SEQ ID NO: 66)、GYGSSSX57R (SEQ ID NO: 51)和，IA为氨基酸序列GIVDECCHX9SCDLX14X15LQMYCN-R13 (SEQ ID NO: 66)，其中X9、X14、X15、X42和X57独立地为鸟氨酸、赖氨酸或精氨酸，m为选自10-20范围的整数。在一个进一步的实施方案中，连接部分是GYGSSSOR (SEQ ID NO: 65)。
按照一个实施方案，提供包含结构：IB-LM-IA的单链胰岛素类似物，其中IB包含序列X25LCGX29X30LVX33X34LYLVCGDX42GFX45 (SEQ ID NO: 58)，LM为本文所公开的将IB与IA共价连接的连接部分，IA包含序列GIVEQCCHSICSLYQLENX19CX21-R13 (SEQ ID NO: 68)或GIVDECCX8X9SCDLX14X15LX17X18X19CX21-R13 (SEQ ID NO: 69)，其中SEQ ID NO: 69的C端苯丙氨酸残基在不存在任何间插氨基酸的情况下与连接部分LM直接共价结合。按照一个实施方案，提供包含以下序列的单链胰岛素类似物：X25LCGX29X30LVX33X34LYLVCGDX42GFX45 (SEQ IDNO: 58)-(Y1)k-X51AX53X54X55X56X57X58(Y2)n (SEQ ID NO: 70)-GIVDECCX8X9SCDLX14X15LX17X18X19CX21-R13 (SEQ ID NO: 56)或X25LCGX29X30LVX33X34LYLVCGDX42GFX45(Y1)k (SEQ ID NO: 58)-X51AX53X54X55X56X57X58(Y2)n(SEQ ID NO: 70)-GIVEQCCHSICSLYQLENX19CX21-R13 (SEQ ID NO: 68)，其中X46-X56和X70X71X72X73 (SEQ ID NO: 15)独立地为任何氨基酸，X57和X58独立地为精氨酸、鸟氨酸或赖氨酸，Y1选自X46、X46X47、X46X47X48、X46X47X48X49 (SEQ ID NO: 24)和X46X47X48X49X50 (SEQ IDNO: 13)，Y2选自X70、X70X71、X70X71X72和X70X71X72X73 (SEQ ID NO: 15)，其中n和k独立地为0或1；
X8为组氨酸、苏氨酸或苯丙氨酸；
X9为丝氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或丙氨酸；
X14为酪氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或丙氨酸；
X15为谷氨酰胺、谷氨酸、精氨酸、丙氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或亮氨酸；
X17为谷氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、鸟氨酸或谷氨酰胺；
X18为甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸或苏氨酸；
X19为酪氨酸、4-甲氧基苯丙氨酸或4-氨基-苯丙氨酸；
X21为丙氨酸、甘氨酸或天冬酰胺；
X25为组氨酸或苏氨酸；
X29选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X30选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸和半胱磺酸；
X33选自天冬氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸；
X34选自丙氨酸和苏氨酸；
X42选自丙氨酸、赖氨酸、鸟氨酸和精氨酸；和
X45为酪氨酸或苯丙氨酸。
按照一个实施方案，提供包含结构：IB-LM-IA的单链胰岛素类似物，其中IB包含序列X25LCGX29X30LVX33X34LYLVCGDX42GFX45 (SEQ ID NO: 58)，LM为选自以下的连接部分：(Y1)k-X51AX53X54X55X56RR(Y2)n (SEQ ID NO: 23)、(Y2)k-GYGSSSX57R(Y2)n (SEQ ID NO: 51)和，
其中
Y1选自X46、X46X47、X46X47X48、X46X47X48X49 (SEQ ID NO: 24)和X46X47X48X49X50 (SEQ IDNO: 13)；和
Y2选自X70、X70X71、X70X71X72和X70X71X72X73 (SEQ ID NO: 15)；
n为0或1；
k为0或1；
m为7-16范围的整数；和
X46-X50和X70-X73各自独立地为任何氨基酸；
X51选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸；
X52是酪氨酸以外的任何氨基酸；
X53-X56各自独立地为任何氨基酸；和
X57为精氨酸、赖氨酸或鸟氨酸；和
A链包含序列GIVDECCHX9SCDLX14X15LQMYCN-R13 (SEQ ID NO: 66)，其中X9、X14和X15独立地为鸟氨酸、赖氨酸或精氨酸，R13为COOH或CONH2。
在一个实施方案中，B链选自HLCGAELVDALYLVCGDOGFY (SEQ ID NO: 71)、GPEHLCGAELVDALYLVCGDOGFY (SEQ ID NO: 72)、GPEHLCGAELVDALYLVCGDOGFYFNPKT (SEQID NO: 73)和GPEHLCGAELVDALYLVCGDOGFYFNKPT (SEQ ID NO: 74)，A链为GIVDECCHOSCDLOOLQMX19CN-R13 (SEQ ID NO: 75)，其中X19为酪氨酸、4-甲氧基-苯丙氨酸或4-氨基苯丙氨酸。在一个实施方案中，n和k的至少一个为1。
在一个实施方案中，提供包含以下序列的单链胰岛素类似物：X25LCGX29X30LVX33X34LYLVCGX41X42GFX45X51X52X53X54X55X56X57X58X70X71X72X73GIVX4X5CCX8X9X10CX12LX14X15LEX18X19CX21-R13 (SEQ ID NO: 168)；
X25LCGX29X30LVX33X34LYLVCGX41X42GFX45X51X52GSSSX57X58APQTGIVX4X5CCX8X9X10CX12LX14X15LEX18X19CX21-R13 (SEQ ID NO: 169)；
X25LCGX29X30LVX33X34LYLVCGX41X42GFX45X46X47X48TX51X52GSSSX57X58APQTGIVX4X5CCX8X9X10CX12LX1 4X15LEX18X19CX21-R13 (SEQ ID NO: 170；
X25LCGX29X30LVX33X34LYLVCGX41X42GFX45X46X47X48TX51X52GSSSX57X58GIVX4X5CCX8X9X10CX12LX14X15LEX18X19CX21-R13 (SEQ ID NO: 171)；或
X25LCGX29X30LVX33X34LYLVCGX41X42GFX45GAGSSSRX58APQTGIVX4X5CCX8X9X10CX12LX14X15LEX18X19CX2 1-R13 (SEQ ID NO: 172)；
其中
X4为谷氨酸或天冬氨酸；
X5为谷氨酸或谷氨酰胺
X8为苏氨酸、组氨酸或苯丙氨酸；
X9为丝氨酸、精氨酸、鸟氨酸或丙氨酸；
X10为丝氨酸或异亮氨酸；
X12为丝氨酸或天冬氨酸；
X14为精氨酸、酪氨酸、鸟氨酸或丙氨酸；
X15为谷氨酰胺、精氨酸、丙氨酸、鸟氨酸或亮氨酸；
X18为甲硫氨酸、天冬酰胺或苏氨酸；
X19为酪氨酸、4-甲氧基-苯丙氨酸或4-氨基苯丙氨酸；
X21为丙氨酸、甘氨酸或天冬酰胺；
X25选自组氨酸和苏氨酸；
X29选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X30选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸和半胱磺酸；
X33选自天冬氨酸和谷氨酸；
X34选自丙氨酸和苏氨酸；
X41选自天冬氨酸和谷氨酸；
X42选自丙氨酸、鸟氨酸和精氨酸；
X45选自酪氨酸和苯丙氨酸；
X46为苯丙氨酸或酪氨酸；
X47为天冬酰胺或苏氨酸；
X48为天冬氨酸-赖氨酸二肽、精氨酸-脯氨酸二肽、赖氨酸-脯氨酸二肽或脯氨酸-赖氨酸二肽；
X51选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸；
X52是酪氨酸以外的任何氨基酸；
X53-X56各自独立地为任何氨基酸；和
X57和X58独立地为精氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、高半胱氨酸、乙酰基-苯丙氨酸或鸟氨酸；
X70-X73独立地为任何氨基酸，R13为COOH或CONH2。在一个实施方案中，单链胰岛素还包含与连接部分的氨基酸侧链和/或在选自B链的N端α胺、A链的A9、A14和A15位或B链的B1、B2、B10、B22、B28或B29位的氨基酸侧链的位置处共价连接的聚乙二醇链。在一个实施方案中，聚乙二醇链与连接部分的氨基酸侧链共价连接和/或在B链的N端α胺处(例如基于胰岛素的B链的B1位或基于IGF-1的B链的B2位)共价连接。在一个实施方案中，聚乙二醇链与连接部分8位的氨基酸的侧链共价连接。
单链胰岛素类似物的聚乙二醇化
申请人出乎意料地发现，亲水部分与本文公开的胰岛素单链类似物的共价连接提供起效较慢、持续时间延长和具有活性的基础特征的类似物。在一个实施方案中，本文所公开的单链胰岛素类似物被进一步修饰以包含与位于选自A链的A9、A14和A15的位置上的氨基酸侧链或者在B链的N端α胺上(例如基于胰岛素的B链的B1位或基于IGF-1的B链的B2位)或者在B链的B1、B2、B10、B22、B28或B29位的氨基酸侧链上或者连接A链和B链的连接部分的任何位置上共价连接的亲水部分。在示例性的实施方案中，该亲水部分与在这些位置的任一个上的Lys、Cys、Orn、高半胱氨酸或乙酰基-苯丙氨酸残基共价连接。在一个实施方案中，亲水部分与连接部分的氨基酸侧链共价连接。
示例性的亲水部分包括聚乙二醇(PEG)，例如分子量为约1,000道尔顿-约40,000道尔顿或约20,000道尔顿-约40,000道尔顿的聚乙二醇。其它合适的亲水部分包括聚丙二醇、聚氧乙烯化多元醇(例如POG)、聚氧乙烯化山梨糖醇、聚氧乙烯化葡萄糖、聚氧乙烯化甘油(POG)、聚氧化烯、聚乙二醇丙醛、乙二醇/丙二醇共聚物、单甲氧基聚乙二醇、单(C1-C10)烷氧基或芳氧基聚乙二醇、羧甲基纤维素、聚缩醛、聚乙烯醇(PVa)、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧杂环戊烷、聚-1,3,6-三氧杂环己烷、乙烯/马来酐共聚物、聚(β-氨基酸) (均聚物或无规共聚物)、聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇(propropylene glycol)均聚物(PPG)及其它聚环氧烷烃、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、肠菌酸(colonic acid)或其它多糖聚合物、聚蔗糖(Ficoll)或葡聚糖及其混合物。
按照一些实施方案，亲水部分例如聚乙二醇链的分子量选自约500-约40,000道尔顿。在一个实施方案中，亲水部分例如PEG的分子量选自约500-约5,000道尔顿或约1,000-约5,000道尔顿。在另一个实施方案中，亲水部分例如PEG的分子量为约10,000-约20,000道尔顿。在另外其它的示例性实施方案中，亲水部分例如PEG的分子量为约20,000-约40,000道尔顿。在一个实施方案中，亲水部分例如PEG的分子量为约20,000道尔顿。在一个实施方案中，提供这样的单链胰岛素类似物，其中类似物的一个或多个氨基酸被聚乙二醇化，且共价连接的PEG链的总的分子量约为20,000道尔顿。
在一个实施方案中，葡聚糖用作亲水部分。葡聚糖是主要通过α1-6键连接的葡萄糖亚基的多糖聚合物。可获得许多分子量范围的葡聚糖，例如约1 kD-约100 kD，或从约5、10、15或20 kD到约20、30、40、50、60、70、80或90 kD。
还考虑了线性或支链聚合物。所得的缀合物的制备物基本上可为单分散的或多分散的，且每肽可具有约0.5、0.7、1、1.2、1.5或2个聚合物部分。
在一个实施方案中，亲水部分是聚乙二醇(PEG)链，任选在选自以下的位置上与氨基酸侧链连接：A链的A9、A14和A15位，B链的B1、B2、B10、B22、B28或B29位，在B链的N端α胺上或在连接A链和B链的连接部分的任何位置(包括例如在C8位)上。在一个实施方案中，单链胰岛素类似物包含8-12个氨基酸的肽连接部分，其中连接部分的氨基酸之一具有与其侧链共价结合的聚乙烯链。在一个实施方案中，单链胰岛素类似物包含8-12个氨基酸的肽连接部分，其中连接部分的氨基酸被聚乙二醇化，且在选自A链的A9、A14和A15、B链的B1、B2、B10、B22、B28或B29位的位置上的一个或多个氨基酸也被聚乙二醇化。在一个实施方案中，共价连接的PEG链的总分子量约为20,000道尔顿。
在一个实施方案中，单链胰岛素类似物包含8-12个氨基酸的连接部分，其中连接部分的氨基酸之一具有与其侧链共价结合的20,000道尔顿聚乙烯链。在另一个实施方案中，胰岛素类似物包含8-12个氨基酸的肽连接部分，其中连接部分的氨基酸之一具有与其侧链共价结合的聚乙烯链，且第二PEG链与B链的N端α胺(例如基于胰岛素的B链的B1位或基于IGF-1的B链的B2位)连接或者在B链的B1、B2和B29位的氨基酸侧链上连接。在一个实施方案中，如果2条PEG链与单链胰岛素类似物连接，则每条PEG链的分子量为约10,000道尔顿。在一个实施方案中，如果PEG链与8-12个氨基酸连接部分连接，则PEG链在连接部分的C7或C8位处连接，而在一个实施方案中，PEG链在连接部分的C8位处连接。在一个实施方案中，如果2条PEG链与单链胰岛素类似物连接，其中一条PEG链在C8位处连接，则第二PEG在A9、A14、A15、B1、B2、B10、B22、B28或B29处连接。
亲水部分(例如聚乙二醇)可在用于使蛋白质与活化聚合物分子反应的任何合适条件下与单链胰岛素类似物连接。可采用本领域已知的任何方法，包括通过酰化、还原性烷基化、迈克尔加成、巯基烷基化或通过PEG部分上的反应基(例如醛基、氨基、酯基、巯基、α-卤代乙酰基、马来酰亚胺基或肼基)与目标化合物上的反应基(例如醛基、氨基、酯基、巯基、α-卤代乙酰基、马来酰亚胺基或肼基)的其它化学选择性缀合/连接方法。可用于使水溶性聚合物与一个或多个蛋白质连接的活化基团包括而不限于砜、马来酰亚胺、巯基、硫醇、三氟甲磺酸酯(triflate)、三氟乙基磺酸酯(tresylate)、氮杂环丙烷(azidirine)、氧杂环丙烷和5-吡啶基。如果通过还原性烷基化与肽连接，则所选择的聚合物应具有单个活性醛，使得聚合度受控制。参见例如Kinstler等，Adv. Drug. Delivery Rev. 54：477-485 (2002)；Roberts等，Adv. Drug Delivery Rev. 54：459-476 (2002)；以及Zalipsky等，Adv. DrugDelivery Rev. 16：157-182 (1995)。
在本发明的一个具体方面，具有巯基的单链类似物上的氨基酸残基用亲水部分例如PEG修饰。在一些实施方案中，在迈克尔加成反应中巯基被马来酰亚胺活化的PEG修饰以产生下示包含硫醚键的聚乙二醇化肽：
。
在一些实施方案中，在亲核取代反应中巯基被卤代乙酰基活化的PEG修饰以产生下示包含硫醚键的聚乙二醇化肽：
。
单链胰岛素类似物的酰化
在一些实施方案中，单链胰岛素类似物被修饰以包含酰基。酰基可与单链胰岛素类似物的氨基酸直接共价连接，或通过间隔基与单链胰岛素类似物的氨基酸间接共价连接，其中间隔基位于单链胰岛素类似物的氨基酸和酰基之间。单链胰岛素类似物可在亲水部分连接的相同氨基酸位置上或在不同的氨基酸位置上被酰化。例如，酰化可发生在包括A链或B链的任何氨基酸的任何位置以及连接部分内的位置上，条件是酰化时保持未酰化单链胰岛素类似物所具有的活性。非限制性实例包括在A链A14和A15位、基于胰岛素的B链B1位或基于IGF-1的B链的B2位或者B链B10、B22、B28或B29位或者连接部分的任何位置上的酰化。
在本发明的一个具体方面，单链胰岛素类似物(或其衍生物或缀合物)通过单链胰岛素类似物的氨基酸侧链的胺、羟基或巯基的直接酰化被修饰以包含酰基。在一些实施方案中，单链胰岛素类似物通过氨基酸的侧链胺、羟基或巯基被直接酰化。在一些实施方案中，酰化位于B28或B29位(按照天然胰岛素A链和B链序列的氨基酸编号)。在这个方面，可提供在A链或B链序列中因一个或多个氨基酸取代而被修饰的单链胰岛素类似物，包括例如在A14、A15、B1、B2、B10、B22、B28或B29位(按照天然胰岛素A链和B链序列的氨基酸编号)或连接部分的任何位置用包含侧链胺、羟基或巯基的氨基酸取代。在本发明的一些具体实施方案中，单链胰岛素类似物的直接酰化通过B28或B29位(按照天然胰岛素A链和B链序列的氨基酸编号)的氨基酸的侧链胺、羟基或巯基发生。
在一个实施方案中，单链胰岛素类似物包含下式I的氨基酸：
其中n = 1-4
[式I]
在一些示例性的实施方案中，式I的氨基酸是其中n为4 (Lys)或n为3 (Orn)的氨基酸。
在另一个实施方案中，单链胰岛素类似物包含下式II的氨基酸：
其中n = 1-4
[式II]
在一些示例性的实施方案中，式II的氨基酸是其中n为1 (Ser)的氨基酸。
在又一个实施方案中，包含侧链巯基的单链胰岛素类似物是下式III的氨基酸：
其中n = 1-4
[式III]
在一些示例性的实施方案中，式III的氨基酸是其中n为1 (Cys)的氨基酸。
在又一个实施方案中，单链胰岛素类似物包含含有式I、式II或式III的相同结构的二取代氨基酸，不同之处在于与式I、式II或式III的氨基酸的α碳键合的氢被第二侧链置换。
按照一个实施方案，酰化单链胰岛素类似物在肽和酰基之间包含间隔基。在一些实施方案中，单链胰岛素类似物与间隔基共价结合，间隔基与酰基共价结合。在一些示例性的实施方案中，单链胰岛素类似物通过间隔基的胺、羟基或巯基的酰化而被修饰以包含酰基，所述间隔基与B28或B29位(按照天然胰岛素A链或B链的氨基酸编号)上，或在间隔基部分的任何位置上的氨基酸侧链连接。间隔基与之连接的单链胰岛素类似物的氨基酸可以是包含允许与间隔基连接的部分的任何氨基酸。例如，包含侧链-NH2、-OH或-COOH的氨基酸(例如Lys、Orn、Ser、Asp或Glu)是合适的。
在一些实施方案中，单链胰岛素类似物和酰基之间的间隔基是包含侧链胺、羟基或巯基的氨基酸(或包含含有侧链胺、羟基或巯基的氨基酸的二肽或三肽)。在一些实施方案中，间隔基包含亲水双官能间隔基。在一个具体的实施方案中，间隔基包含氨基聚(烷氧基)羧酸酯。在这个方面，间隔基可包含例如NH2(CH2CH2O)n(CH2)mCOOH，其中m为1-6的任何整数，n为2-12的任何整数，例如8-氨基-3,6-二氧杂辛酸，其可购自PeptidesInternational, Inc. (Louisville，KY)。在一个实施方案中，亲水双官能间隔基包含两个或更多个反应基，例如胺基、羟基、巯基和羧基或其任何组合。在某些实施方案中，亲水双官能间隔基包含羟基和羧酸。在其它实施方案中，亲水双官能间隔基包含胺基和羧酸酯基。在其它实施方案中，亲水双官能间隔基包含巯基和羧酸酯基。
在一些实施方案中，肽单链胰岛素类似物和酰基之间的间隔基是疏水双官能间隔基。疏水双官能间隔基是本领域已知的。参见例如Bioconjugate Techniques, G. T.Hermanson (Academic Press, San Diego, CA, 1996)，其通过引用以其整体予以结合。在某些实施方案中，疏水双官能间隔基包含两个或更多个反应基，例如胺基、羟基、巯基和羧基或其任何组合。在某些实施方案中，疏水双官能间隔基包含羟基和羧酸酯基。在其它实施方案中，疏水双官能间隔基包含胺基和羧酸酯基。在其它实施方案中，疏水双官能间隔基包含巯基和羧酸酯基。包含羧酸酯基和羟基或巯基的合适疏水双官能间隔基是本领域已知的，包括例如8-羟基辛酸和8-巯基辛酸。
按照某些实施方案，双官能间隔基可以是包含长度为3-10个原子的氨基酸骨架的合成或天然存在的氨基酸(例如6-氨基己酸、5-氨基戊酸、7-氨基庚酸和8-氨基辛酸)。或者，间隔基可以是具有长度为3-10个原子(例如6-10个原子)的肽骨架的二肽或三肽间隔基。与单链胰岛素类似物连接的二肽或三肽间隔基的每个氨基酸可独立选自：天然存在的和/或非天然存在的氨基酸，包括例如天然存在的氨基酸(Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr)的任何D或L异构体，或选自以下的非天然存在的氨基酸的任何D或L异构体：β-丙氨酸(β-Ala)、N-α-甲基-丙氨酸(Me-Ala)、氨基丁酸(Abu)、α-氨基丁酸(γ-Abu)、氨基己酸(ε-Ahx)、氨基异丁酸(Aib)、氨基甲基吡唑羧酸、氨基哌啶羧酸、氨基丝氨酸(Ams)、氨基四氢吡喃-4-羧酸、精氨酸N-甲氧基-N-甲基酰胺、β-天冬氨酸(β-Asp)、氮杂环丁烷羧酸、3-(2-苯并噻唑基)丙氨酸、α-叔丁基甘氨酸、2-氨基-5-脲基-正戊酸(瓜氨酸，Cit)、β-环己基丙氨酸(Cha)、乙酰氨基甲基-半胱氨酸、二氨基丁酸(Dab)、二氨基丙酸(Dpr)、二羟基苯丙氨酸(DOPA)、二甲基噻唑烷(DMTA)、γ-谷氨酸(γ-Glu)、高丝氨酸(Hse)、羟脯氨酸(Hyp)、异亮氨酸N-甲氧基-N-甲基酰胺、甲基-异亮氨酸(MeIle)、六氢异烟酸(Isn)、甲基-亮氨酸(MeLeu)、甲基-赖氨酸、二甲基-赖氨酸、三甲基-赖氨酸、亚甲基脯氨酸、甲硫氨酸-亚砜(Met(O))、甲硫氨酸-砜(Met(O2))、正亮氨酸(Nle)、甲基-正亮氨酸(Me-Nle)、正缬氨酸(Nva)、鸟氨酸(Orn)、对氨基苯甲酸(PABA)、青霉胺(Pen)、甲基苯丙氨酸(MePhe)、4-氯苯丙氨酸(Phe(4-Cl))、4-氟苯丙氨酸(Phe(4-F))、4-硝基苯丙氨酸(Phe(4-NO2))、4-氰基苯丙氨酸((Phe(4-CN))、苯基甘氨酸(Phg)、哌啶基丙氨酸、哌啶基甘氨酸、3,4-脱氢脯氨酸、吡咯烷基丙氨酸、肌氨酸(Sar)、硒代半胱氨酸(Sec)、U-苄基-磷酸丝氨酸、4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸(Sta)、4-氨基-5-环己基-3-羟基戊酸(ACHPA)、4-氨基-3-羟基-5-苯基戊酸(AHPPA)、1,2,3,4,-四氢-异喹啉-3-羧酸(Tic)、四氢吡喃甘氨酸、噻吩丙氨酸(Thi)、U-苄基-磷酸酪氨酸、O-磷酸酪氨酸、甲氧基酪氨酸、乙氧基酪氨酸、O-(双-二甲基氨基-膦酰基)-酪氨酸、酪氨酸硫酸四丁胺、甲基-缬氨酸(MeVal)、1-氨基-1-环己烷羧酸(Acx)、氨基戊酸、β-环丙基-丙氨酸(Cpa)、炔丙基甘氨酸(Prg)、烯丙基甘氨酸(Alg)、2-氨基-2-环己基-丙酸(2-Cha)、叔丁基甘氨酸(Tbg)、乙烯基甘氨酸(Vg)、1-氨基-1-环丙烷羧酸(Acp)、1-氨基-1-环戊烷羧酸(Acpe)、烷基化3-巯基丙酸、1-氨基-1-环丁烷羧酸(Acb)。在一些实施方案中，二肽间隔基选自：Ala-Ala、β-Ala-β-Ala、Leu-Leu、Pro-Pro、γ-氨基丁酸-γ-氨基丁酸和γ-Glu-γ-Glu。
肽单链胰岛素类似物可通过长链烷烃的酰化而被修饰以包含酰基。在具体的方面，长链烷烃包含与单链胰岛素类似物的羧基或其活化形式反应的胺基、羟基或巯基(例如十八胺、十四醇和十六烷硫醇)。单链胰岛素类似物的羧基或其活化形式可以是单链胰岛素类似物的氨基酸(例如谷氨酸、天冬氨酸)的侧链的一部分，或可以是肽骨架的一部分。
在某些实施方案中，单链胰岛素类似物通过单链胰岛素类似物连接的间隔基酰化长链烷烃而被修饰以包含酰基。在具体的方面，长链烷烃包含与间隔基的羧基或其活化形式反应的胺基、羟基或巯基。本文描述了包含羧基或其活化形式的合适的间隔基，包括例如双官能间隔基，例如氨基酸、二肽、三肽、亲水双官能间隔基和疏水双官能间隔基。本文所用术语“羧基的活化形式”是指具有通式R(C=O)X的羧基，其中X为离去基团，R为单链胰岛素类似物或间隔基。例如，羧基的活化形式可包括但不限于酰氯、酐和酯。在一些实施方案中，活化羧基是与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)离去基团所成的酯。
有关本发明长链烷烃被肽单链胰岛素类似物或间隔基酰化的这些方面，长链烷烃可为任何大小，并可包含任何长度的碳链。长链烷烃可以是直链或支链的。在某些方面，长链烷烃是C4-C30烷烃。例如长链烷烃可以是C4烷烃、C6烷烃、C8烷烃、C10烷烃、C12烷烃、C14烷烃、C16烷烃、C18烷烃、C20烷烃、C22烷烃、C24烷烃、C26烷烃、C28烷烃或C30烷烃的任一种。在一些实施方案中，长链烷烃包含C8-C20烷烃，例如C14烷烃、C16烷烃或C18烷烃。
在一些实施方案中，单链胰岛素类似物的胺基、羟基或巯基被胆固醇酸(cholesterol acid)酰化。在一个具体的实施方案中，肽通过烷基化脱氨基Cys间隔基即烷基化3-巯基丙酸间隔基与胆固醇酸连接。通过胺、羟基和巯基的肽酰化的合适方法是本领域已知的。参见例如Miller，Biochem Biophys Res Commun 218：377-382 (1996)；Shimohigashi和Stammer，Int J Pept Protein Res 19：54-62 (1982)；Previero等，Biochim Biophys Acta 263：7-13 (1972) (用于通过羟基酰化的方法)；以及San和Silvius，J Pept Res 66：169-180 (2005) (用于通过巯基酰化的方法)；BioconjugateChem. "Chemical Modifications of Proteins: History and Applications" 第1页,2-12 (1990)；Hashimoto等, Pharmacuetical Res. "Synthesis of PalmitoylDerivatives of Insulin and their Biological Activity" 第6卷, 第2期, 第171-176页(1989)。
酰化肽单链胰岛素类似物的酰基可以是任何大小，例如任何长度的碳链，并且可以是直链或支链的。在本发明的一些具体实施方案中，酰基为C4-C30脂肪酸。例如酰基可以是C4脂肪酸、C6脂肪酸、C8脂肪酸、C10脂肪酸、C12脂肪酸、C14脂肪酸、C16脂肪酸、C18脂肪酸、C20脂肪酸、C22脂肪酸、C24脂肪酸、C26脂肪酸、C28脂肪酸或C30脂肪酸的任一种。在一些实施方案中，酰基是C8-C20脂肪酸，例如C14脂肪酸或C16脂肪酸。
在备选实施方案中，酰基是胆汁酸。胆汁酸可以是任何合适的胆汁酸，包括但不限于胆酸、鹅脱氧胆酸、脱氧胆酸、石胆酸、牛磺胆酸、甘氨胆酸和胆固醇酸。
本文所述酰化单链胰岛素类似物可被进一步修饰以包含亲水部分。在一些具体实施方案中，亲水部分可包含聚乙二醇(PEG)链。亲水部分的掺入可通过任何合适的方法完成，例如本文描述的任何方法。在一些实施方案中，酰化单链类似物包含选自Cys、Lys、Orn、homo-Cys或Ac-Phe的氨基酸，且氨基酸的侧链与亲水部分(例如PEG)共价键合。在一个实施方案中，酰基与A14、A15、B1 (对于基于胰岛素的B链)、B2 (对于基于IGF-1的B链)、B10、B22、B28或B29位(按照天然胰岛素A链和B链的氨基酸编号)连接，任选通过包含Cys、Lys、Orn、homo-Cys或Ac-Phe的间隔基。
或者，酰化单链胰岛素类似物包含间隔基，其中间隔基同时被酰化和修饰以包含亲水部分。合适的间隔基的非限制性实例包括包含一个或多个选自以下的氨基酸的间隔基：Cys、Lys、Orn、homo-Cys和Ac-Phe。
单链胰岛素类似物的烷基化
在一些实施方案中，单链胰岛素类似物被修饰以包含烷基。烷基可与单链胰岛素类似物的氨基酸直接共价连接，或通过间隔基与单链胰岛素类似物的氨基酸间接共价连接，其中间隔基位于单链胰岛素类似物的氨基酸和烷基之间。烷基可通过醚、硫醚或氨基键与单链胰岛素类似物连接。例如，单链胰岛素类似物可在亲水部分连接的相同氨基酸位置上或在不同的氨基酸位置上烷基化。烷基化可在单链胰岛素类似物内的任何位置上进行，包括例如在B链的C端区内或在连接部分的位置上，条件是保持胰岛素活性。在本发明的一个具体方面，单链胰岛素类似物通过单链胰岛素类似物的氨基酸侧链的胺、羟基或巯基直接烷基化而被修饰以包含烷基。在一些实施方案中，单链胰岛素类似物通过氨基酸的侧链胺、羟基或巯基被直接烷基化。在本发明的一些具体实施方案中，单链胰岛素类似物的直接烷基化通过在A14、A15、B1 (对于基于胰岛素的B链)、B2 (对于基于IGF-1的B链)、B10、B22、B28或B29位(按照天然胰岛素A链和B链的氨基酸编号)上的氨基酸的侧链胺、羟基或巯基发生。
在一些实施方案中，单链胰岛素类似物的氨基酸包含选自式I、式II和式III的氨基酸，且烷基通过分别包含在式I、式II和式III中的氨基、羟基或巯基连接。在一些示例性的实施方案中，式I的氨基酸是其中n为4 (Lys)或n为3 (Orn)的氨基酸。在一些示例性的实施方案中，式II的氨基酸是其中n为1 (Ser)的氨基酸。在一些示例性的实施方案中，式II的氨基酸是其中n为1 (Cys)的氨基酸。在另外其它的实施方案中，包含侧链胺、羟基或巯基的肽单链胰岛素类似物的氨基酸是包含式I、式II或式III的相同结构的二取代氨基酸，不同之处在于与式I、式II或式III的氨基酸的α碳键合的氢被第二侧链置换。
本发明的一些实施方案中，单链胰岛素类似物在肽和烷基之间包含间隔基。在一些实施方案中，单链胰岛素类似物与间隔基共价结合，所述间隔基与烷基共价结合。在一些示例性的实施方案中，单链胰岛素类似物通过间隔基的胺、羟基或巯基的烷基化而被修饰以包含烷基，其中间隔基与A14、A15、B1 (对于基于胰岛素的B链)、B2 (对于基于IGF-1的B链)、B10、B22、B28或B29位(按照天然胰岛素A链和B链的氨基酸编号)上的氨基酸侧链连接。间隔基与之连接的单链胰岛素类似物的氨基酸可以是包含允许与间隔基连接的部分的任何氨基酸(例如单个α-取代的氨基酸或α,α-二取代氨基酸)。包含侧链-NH2、-OH或-COOH的单链胰岛素类似物的氨基酸(例如Lys、Orn、Ser、Asp或Glu)是合适的。在一些实施方案中，肽单链胰岛素类似物和烷基之间的间隔基为包含侧链胺、羟基或巯基的氨基酸或包含含有侧链胺、羟基或巯基的氨基酸的二肽或三肽。
在其中α胺被烷基化的情况下，间隔基氨基酸可以是任何氨基酸。例如，间隔基氨基酸可以是疏水氨基酸，例如Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Trp、Met、Phe、Tyr。或者，间隔基氨基酸可以是酸性残基，例如Asp和Glu。在示例性的实施方案中，间隔基氨基酸可以是疏水氨基酸，例如Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Trp、Met、Phe、Tyr、6-氨基己酸、5-氨基戊酸、7-氨基庚酸、8-氨基辛酸。或者，间隔基氨基酸可以是酸性残基，例如Asp和Glu，条件是烷基化发生在酸性残基的α胺上。在其中间隔基氨基酸的侧链胺被烷基化的情况下，间隔基氨基酸为包含侧链胺的氨基酸，例如式I的氨基酸(例如Lys或Orn)。在这种情况下，间隔基氨基酸的α胺和侧链胺均可被烷基化，使得肽被二烷基化。本发明的实施方案包括这类二烷基化分子。
如果烷基化通过间隔基氨基酸的羟基发生，则间隔基的氨基酸或氨基酸之一可以是式II的氨基酸。在一个具体的示例性实施方案中，氨基酸是Ser。
如果烷基化通过间隔基氨基酸的巯基发生，则间隔基的氨基酸或氨基酸之一可以是式III的氨基酸。在一个具体的示例性实施方案中，氨基酸是Cys。
在一些实施方案中，间隔基包含亲水双官能间隔基。在一个具体的实施方案中，间隔基包含氨基聚(烷氧基)羧酸酯。在这个方面，间隔基可包含例如NH2(CH2CH2O)n(CH2)mCOOH，其中m为1-6的任何整数，n为2-12的任何整数，例如8-氨基-3,6-二氧杂辛酸，其可购自Peptides International, Inc. (Louisville，KY)。在一些实施方案中，肽单链胰岛素类似物和烷基之间的间隔基是亲水双官能间隔基。在某些实施方案中，亲水双官能间隔基包含两个或更多个反应基，例如胺、羟基、巯基和羧基或其任何组合。在某些实施方案中，亲水双官能间隔基包含羟基和羧酸酯基。在其它实施方案中，亲水双官能间隔基包含胺基和羧酸酯基。在其它实施方案中，亲水双官能间隔基包含巯基和羧酸酯基。
在一些实施方案中，肽单链胰岛素类似物和烷基之间的间隔基是疏水双官能间隔基。在某些实施方案中，疏水双官能间隔基包含两个或更多个反应基，例如胺、羟基、巯基和羧基或其任何组合。在某些实施方案中，疏水双官能间隔基包含羟基和羧酸酯基。在其它实施方案中，疏水双官能间隔基包含胺基和羧酸酯基。在其它实施方案中，疏水双官能间隔基包含巯基和羧酸酯基。包含羧酸酯基和羟基或巯基的合适疏水双官能间隔基是本领域已知的，包括例如8-羟基辛酸和8-巯基辛酸。
间隔基(例如氨基酸、二肽、三肽、亲水双官能间隔基或疏水双官能间隔基)的长度为3-10个原子(例如6-10个原子(例如6、7、8、9或10个原子))。在更具体的实施方案中，间隔基的长度为约3-10个原子(例如6-10个原子)，烷基为C12-C18烷基例如C14烷基、C16烷基，使得间隔基和烷基的总长度为14-28个原子，例如约14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28个原子。在一些实施方案中，间隔基和烷基的长度为17-28 (例如19-26、19-21)个原子。
按照一个实施方案，双官能间隔基是包含长度为3-10个原子的氨基酸骨架的合成或非天然存在的氨基酸(例如6-氨基己酸、5-氨基戊酸、7-氨基庚酸和8-氨基辛酸)。或者，间隔基可以是具有长度为3-10个原子(例如6-10个原子)的肽骨架的二肽或三肽间隔基。与单链胰岛素类似物连接的二肽或三肽间隔基可由天然存在的和/或非天然存在的氨基酸组成，包括例如本文教导的任何氨基酸。在一些实施方案中，间隔基包含总的负电荷，例如包含一个或两个带负电荷的氨基酸。在一些实施方案中，二肽间隔基选自：Ala-Ala、β-Ala-β-Ala、Leu-Leu、Pro-Pro、γ-氨基丁酸-γ-氨基丁酸和γ-Glu-γ-Glu。在一个实施方案中，二肽间隔基是γ-Glu-γ-Glu。
通过胺、羟基和巯基的肽烷基化的合适方法是本领域已知的。例如，可采用威廉逊醚合成在胰岛素肽和烷基之间形成醚键。此外，肽与烷基卤化物的亲核取代反应可产生醚、硫醚或氨基键的任一种。烷基化肽单链胰岛素类似物的烷基可具有任何大小例如任何长度的碳链，且可以是直链或支链的。本发明的一些实施方案中，烷基是C4-C30烷基。例如烷基可以是C4烷基、C6烷基、C8烷基、C10烷基、C12烷基、C14烷基、C16烷基、C18烷基、C20烷基、C22烷基、C24烷基、C26烷基、C28烷基或C30烷基的任一种。在一些实施方案中，烷基是C8-C20烷基，例如C14烷基或C16烷基。
在一些具体的实施方案中，烷基包含胆汁酸的类固醇部分，胆汁酸例如胆酸、鹅脱氧胆酸、脱氧胆酸、石胆酸、牛磺胆酸、甘氨胆酸和胆固醇酸。
在一些实施方案中，单链胰岛素类似物通过使亲核长链烷烃与单链胰岛素类似物反应而被修饰以包含烷基，其中单链胰岛素类似物包含适于亲核取代的离去基团。在具体的方面，长链烷烃的亲核基团包含胺基、羟基或巯基(例如十八胺、十四醇和十六烷硫醇)。单链胰岛素类似物的离去基团可以是氨基酸侧链的一部分或可以是肽骨架的一部分。合适的离去基团包括例如N-羟基琥珀酰亚胺、卤素和磺酸酯。
在某些实施方案中，单链胰岛素类似物通过使亲核长链烷烃与连接至单链胰岛素类似物的间隔基反应而被修饰以包含烷基，其中间隔基包含离去基团。在具体的方面，长链烷烃包含胺基、羟基或巯基。在某些实施方案中，包含离去基团的间隔基可以是本文所述的任何间隔基，例如也包含合适的离去基团的氨基酸、二肽、三肽、亲水双官能间隔基和疏水双官能间隔基。
如果长链烷烃被单链胰岛素类似物或间隔基烷基化，则长链烷烃可具有任何大小，并可包含任何长度的碳链。长链烷烃可以是直链或支链的。在某些方面，长链烷烃是C4-C30烷烃。例如长链烷烃可以是C4烷烃、C6烷烃、C8烷烃、C10烷烃、C12烷烃、C14烷烃、C16烷烃、C18烷烃、C20烷烃、C22烷烃、C24烷烃、C26烷烃、C28烷烃或C30烷烃中的任一种。在一些实施方案中，长链烷烃包含C8-C20烷烃，例如C14烷烃、C16烷烃或C18烷烃。
此外，在一些实施方案中，烷基化可发生在单链胰岛素类似物和胆固醇部分之间。例如胆固醇的羟基可置换长链烷烃上的离去基团以形成胆固醇-胰岛素肽产物。本文所述烷基化单链胰岛素类似物可被进一步修饰以包含亲水部分。在一些具体实施方案中，亲水部分可包含聚乙二醇(PEG)链。亲水部分的掺入可通过任何合适的方法完成，例如本文描述的任何方法。在一些实施方案中，单链胰岛素类似物可包含选自以下的氨基酸：Cys、Lys、Orn、homo-Cys或Ac-Phe，其中氨基酸的侧链与亲水部分(例如PEG)共价键合。在一些实施方案中，烷基与A14、A15、B1 (对于基于胰岛素的B链)、B2 (对于基于IGF-1的B链)、B10、B22、B28或B29位(按照天然胰岛素A链或B链的氨基酸编号)连接，任选通过包含Cys、Lys、Orn、homo-Cys或Ac-Phe的间隔基，间隔基任选还包含与另一个氨基酸的侧链的亲水部分。或者，烷基化单链胰岛素类似物可包含间隔基，其中间隔基同时被烷基化和修饰以包含亲水部分。合适间隔基的非限制性实例包括包含选自以下的一个或多个氨基酸的间隔基：Cys、Lys、Orn、homo-Cys和Ac-Phe。
缀合物
在一些实施方案中，使本文所述的单链胰岛素类似物糖基化、酰胺化、羧化、磷酸化、酯化、N-酰化、通过例如二硫桥环化，或转化成盐(例如酸加成盐、碱加成盐)和/或任选二聚化、多聚化或聚合或缀合。本公开内容还包括其中单链胰岛素类似物与异源部分连接的缀合物。单链胰岛素类似物和异源部分之间的缀合可以通过共价键合、非共价键合(例如静电相互作用、氢键、范德瓦尔斯相互作用、盐桥、疏水相互作用等)或两种类型的键合。可采用各种非共价偶联系统，包括生物素-抗生物素蛋白、配体/受体、酶/底物、核酸/核酸结合蛋白、脂质/脂质结合蛋白、细胞粘附分子配偶体；或彼此有亲和力的任何结合配偶体或其片段。在一些方面，共价键是肽键。单链胰岛素类似物与异源部分的缀合可以是间接或直接缀合，前者可包括接头或间隔基。合适的接头和间隔基是本领域已知的，包括但不限于所描述的任何接头或间隔基。
本文所用术语“异源部分”与术语“缀合物部分”同义，是指不同于与其连接的单链胰岛素类似物的任何分子(化学或生物化学、天然存在的或非编码)。可与单链胰岛素类似物连接的示例性的缀合物部分包括但不限于异源肽或多肽(包括例如血浆蛋白质)、靶向剂、免疫球蛋白或其部分(例如可变区、CDR或Fc区)、诊断标记例如放射性同位素、荧光团或酶标记、聚合物包括水溶性聚合物或其它治疗剂或诊断剂。在一些实施方案中，提供包含单链胰岛素类似物和血浆蛋白质的缀合物，其中血浆蛋白质选自白蛋白、运铁蛋白、血纤蛋白原和球蛋白。在一些实施方案中，缀合物的血浆蛋白质部分是白蛋白或运铁蛋白。在一个实施方案中，异源部分是白蛋白，包括例如白蛋白，例如人血清白蛋白(HSA)和重组人白蛋白(rHA)。在一些实施方案中，缀合物包含单链胰岛素类似物和以下的一种或多种：多肽、核酸分子、抗体或其片段、聚合物、单链胰岛素analoguantum dot、小分子、毒素、诊断剂、糖、氨基酸。
聚合物异源部分
在一些实施方案中，与单链胰岛素类似物缀合的异源部分是聚合物。在一些实施方案中，聚合物选自：聚酰胺、聚碳酸酯、聚亚烷基类(polyalkylenes)及其衍生物包括聚亚烷基二醇、聚环氧烷烃、聚对苯二甲酸亚烷基酯、丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的聚合物包括聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸异丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸异癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂酯)、聚(甲基丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)和聚(丙烯酸十八酯)、聚乙烯聚合物包括聚乙烯醇、聚乙烯醚、聚乙烯酯、聚卤乙烯、聚乙酸乙烯酯和聚乙烯吡咯烷酮、聚乙交酯、聚硅氧烷、聚氨酯及其共聚物、纤维素包括烷基纤维素、羟基烷基纤维素、纤维素醚、纤维素酯、硝基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟基丙基甲基纤维素、羟丁基甲基纤维素、乙酸纤维素、丙酸纤维素、乙酸丁酸纤维素、乙酸纤维素邻苯二甲酸酯、羧乙基纤维素、三乙酸纤维素和硫酸纤维素钠盐、聚丙烯、聚乙烯包括聚(乙二醇)、聚(环氧乙烷)和聚对苯二甲酸亚乙酯和聚苯乙烯。
在一些方面，聚合物是生物可降解聚合物，包括合成的生物可降解聚合物(例如乳酸和乙醇酸的聚合物、聚酐、聚原酸酯、聚氨酯、聚(丁酸)、聚(戊酸)和丙交酯-己内酯共聚物)和天然的生物可降解聚合物(例如藻酸盐及其它多糖，包括葡聚糖和纤维素、胶原、其化学衍生物(化学基团例如烷基、亚烷基的取代、添加、羟基化、氧化及本领域技术人员常规进行的其它修饰)、白蛋白及其它亲水蛋白质(例如玉米醇溶蛋白及其它醇溶谷蛋白和疏水蛋白质))及其任何共聚物或混合物。一般而言，这些物质通过酶促水解或体内暴露于水、通过表面蚀解或骨架蚀解(bulk erosion)而降解。
在一些方面，聚合物是生物粘附聚合物，例如H. S. Sawhney, C. P. Pathak和J.A. Hubbell载于Macromolecules, 1993, 26, 581-587中描述的生物可蚀解水凝胶(其教导结合到本文中)、聚透明质酸、酪蛋白、明胶、明胶蛋白、聚酐、聚丙烯酸、藻酸盐、脱乙酰壳多糖、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸异丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸异癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂酯)、聚(甲基丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)和聚(丙烯酸十八酯)。
在一些实施方案中，聚合物是水溶性聚合物或亲水聚合物。本文在“亲水异源部分”的标题下还进一步描述了亲水聚合物。合适的水溶性聚合物是本领域已知的，包括例如聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基纤维素(HPC；Klucel)、羟丙基甲基纤维素(HPMC；Methocel)、硝基纤维素、羟丙基乙基纤维素、羟丙基丁基纤维素、羟丙基戊基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素(Ethocel)、羟乙基纤维素、各种烷基纤维素和羟基烷基纤维素、各种纤维素醚、乙酸纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钙、乙酸乙烯酯/巴豆酸共聚物、聚羟基烷基甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸羟甲酯、甲基丙烯酸共聚物、聚甲基丙烯酸、聚甲基丙烯酸甲酯、马来酐/甲基乙烯基醚共聚物、聚乙烯醇、聚丙烯酸钠和聚丙烯酸钙、聚丙烯酸、酸式羧基聚合物、羧聚乙烯、羧基乙烯基聚合物、聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物、甲基乙烯基醚-马来酐共聚物、羧基甲基酰胺、甲基丙烯酸钾二乙烯基苯共聚物、聚氧化亚乙基二醇、聚乙二醇及其衍生物、盐和组合。
在一个实施方案中，聚合物是聚亚烷基二醇，包括例如聚乙二醇(PEG)。在一些实施方案中，异源部分是糖。在一些实施方案中，糖是单糖(例如葡萄糖、半乳糖、果糖)、二糖(例如蔗糖、乳糖、麦芽糖)、寡糖(例如棉子糖、水苏糖)、多糖(淀粉、直链淀粉、支链淀粉、纤维素、壳多糖、胼胝质、昆布多糖、木聚糖、甘露聚糖、岩藻多糖、半乳甘露聚糖。
在一些实施方案中，异源部分是脂质。在一些实施方案中，脂质是脂肪酸、类二十烷酸、前列腺素、白三烯、血栓烷、N-酰基乙醇胺)、甘油脂(例如单取代、二取代、三取代甘油)、甘油磷脂(例如磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸)、鞘脂(例如鞘氨醇、神经酰胺)、甾醇脂质(例如类固醇、胆固醇)、异戊烯醇脂质(prenol lipid)、糖脂或聚酮化合物、油、蜡、胆固醇、甾醇、脂溶性维生素、一甘油酯、甘油二酯、甘油三酯、磷脂。
Fc融合异源部分
如上所述，在一些实施方案中，单链胰岛素类似物与免疫球蛋白或其部分(例如可变区、CDR或Fc区)缀合(例如融合)。免疫球蛋白(Ig)的已知类型包括IgG、IgA、IgE、IgD或IgM。Fc区为Ig重链的C端区，负责与实现活性的Fc受体结合，活性例如再循环(其导致半寿期延长)、依赖抗体的细胞毒性(ADCC)和依赖补体的细胞毒性(CDC)。
例如，按照某些定义，人IgG重链Fc区自重链的Cys226延伸至C端。“铰链区”一般自人IgG1的Glu216延伸至Pro230 (可通过比对参与半胱氨酸键合的半胱氨酸，将其它IgG同种型的铰链区与IgG1序列进行比对)。IgG的Fc区包括两个恒定结构域CH2和CH3。人IgG Fc区的CH2结构域常常自氨基酸231延伸至氨基酸341。人IgG Fc区的CH3结构域常常自氨基酸342延伸至447。当提及免疫球蛋白或免疫球蛋白片段或区的氨基酸编号时，全部以Kabat等，1991，Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department ofPublic Health, Bethesda, Md为根据。在一个相关的实施方案中，Fc区可包含CH1除外的免疫球蛋白重链的一个或多个天然或修饰的恒定区，例如IgG和IgA的CH2和CH3区或IgE的CH3和CH4区。
合适的缀合物部分包括免疫球蛋白序列的部分，其包含FcRn结合部位。FcRn，一种补救受体，负责使免疫球蛋白再循环，并将其送回血液循环中。根据X射线晶体学，对与FcRn受体结合的IgG的Fc部分的区域进行了描述(Burmeister等，1994，Nature 372:379)。Fc与FcRn的主要接触区接近CH2和CH3结构域的连接处。Fc-FcRn接触全落入单个Ig重链内。主要接触部位包括CH2结构域的氨基酸残基248、250-257、272、285、288、290-291、308-311和314以及CH3结构域的氨基酸残基385-387、428和433-436。
一些缀合物部分可包括或不包括FcγR结合部位。FcγR负责ADCC和CDC。与FcγR直接接触的Fc区内的位置的实例是氨基酸234-239 (铰链区下部)、氨基酸265-269 (B/C环)、氨基酸297-299 (C'/E环)和氨基酸327-332 (F/G)环(Sondermann等，Nature 406：267-273，2000)。IgE的铰链区下部还参与FcRI结合(Henry等，Biochemistry 36，15568-15578，1997)。参与IgA受体结合的残基描述于Lewis等(J Immunol. 175:6694-701，2005)。参与IgE受体结合的氨基酸残基描述于Sayers等(J Biol Chem. 279(34):35320-5，2004)。
可对免疫球蛋白的Fc区进行氨基酸修饰。这类变体Fc区在Fc区的CH3结构域(残基342-447)包含至少一个氨基酸修饰和/或在Fc区的CH2结构域(残基231-341)包含至少一个氨基酸修饰。被认为对FcRn的亲和力提高重要的突变包括T256A、T307A、E380A和N434A(Shields等，2001，J. Biol. Chem. 276:6591)。其它突变可在不显著降低对FcRn的亲和力的情况下，降低Fc区与FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB和/或FcγRIIIA的结合。例如，Fc区297位的Asn被Ala或另一个氨基酸取代除去高度保守的N-糖基化位点，可导致免疫原性降低，同时Fc区的半寿期延长，以及与FcγRs的结合减少(Routledge等，1995，Transplantation60:847；Friend等，1999，Transplantation 68:1632；Shields等，1995，J. Biol. Chem.276:6591)。已有人对IgG1的233-236位进行减少与FcγRs结合的氨基酸修饰(Ward和Ghetie 1995，Therapeutic Immunology 2:77和Armour等，1999，Eur. J. Immunol. 29:2613)。一些示例性的氨基酸取代描述于美国专利7,355,008和7,381,408，各通过引用以其整体结合到本文中。
亲水异源部分
在一些实施方案中，本文所述单链胰岛素类似物与亲水部分共价键合。亲水部分可在用于使蛋白质与活化聚合物分子反应的任何合适条件下与单链胰岛素类似物连接。可采用本领域已知的任何方法，包括通过酰化、还原性烷基化、迈克尔加成、巯基烷基化或通过亲水部分上的反应基(例如醛基、氨基、酯基、巯基、α-卤代乙酰基、马来酰亚胺基或肼基)与目标化合物上的反应基(例如醛基、氨基、酯基、巯基、α-卤代乙酰基、马来酰亚胺基或肼基)的其它化学选择性缀合/连接方法。可用于使水溶性聚合物与一个或多个蛋白质连接的活化基团包括而不限于砜、马来酰亚胺、巯基、硫醇基、三氟甲磺酸酯、三氟乙基磺酸酯、氮杂环丙烷、氧杂环丙烷、5-吡啶基和α-卤化酰基(例如α-碘乙酸、α-溴乙酸、α-氯乙酸)。如果通过还原性烷基化与肽连接，则所选择的聚合物应具有单个活性醛，使得聚合度受控制。参见例如Kinstler等，Adv. Drug. Delivery Rev. 54：477-485 (2002)；Roberts等，Adv.Drug Delivery Rev. 54：459-476 (2002)；以及Zalipsky等，Adv. Drug Delivery Rev.16：157-182 (1995)。
按照一些实施方案，亲水部分例如聚乙二醇链的分子量选自约500-约40,000道尔顿。在一些实施方案中，聚乙二醇链的分子量选自约500-约5,000道尔顿或约1,000-约5,000道尔顿。在另一个实施方案中，亲水部分例如聚乙二醇链的分子量为约10,000-约20,000道尔顿。在另外其它的示例性实施方案中，亲水部分例如聚乙二醇链的分子量为约20,000-约40,000道尔顿。考虑了直链或支链亲水聚合物。所得的缀合物制备物可基本是单分散的或多分散的，并且每肽可具有约0.5、0.7、1、1.2、1.5或2个聚合物部分。
在一些实施方案中，肽的天然氨基酸被具有适于与亲水部分交联的侧链的氨基酸取代，以促进亲水部分与肽连接。示例性的氨基酸包括Cys、Lys、Orn、homo-Cys或乙酰基苯丙氨酸(Ac-Phe)。在其它实施方案中，将经修饰以包含亲水基团的氨基酸加入肽的N端或C端。在一些实施方案中，缀合物的肽通过肽的氨基酸侧链和亲水部分之间的共价连接而与亲水部分例如PEG缀合。
rPEG异源部分
在一些实施方案中，缀合物包含与辅助肽融合的单链胰岛素类似物，所述辅助肽能够形成类似于化学PEG (例如重组PEG (rPEG)分子)的伸展构象(extendedconformation)，例如描述于国际专利申请公布号WO2009/023270和美国专利申请公布号US2008/0286808的那些。rPEG分子不是聚乙二醇。在一些方面，rPEG分子是包含以下一个或多个的多肽：甘氨酸、丝氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸或脯氨酸。在一些方面，rPEG是均聚物，例如聚甘氨酸、聚丝氨酸、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、聚丙氨酸或聚脯氨酸。在其它实施方案中，rPEG包含重复的两种氨基酸类型，例如聚(Gly-Ser)、聚(Gly-Glu)、聚(Gly-Ala)、聚(Gly-Asp)、聚(Gly-Pro)、聚(Ser-Glu)等。在一些方面，rPEG包含3种不同类型的氨基酸，例如聚(Gly-Ser-Glu)。在具体的方面，rPEG延长单链胰岛素类似物的半寿期。在一些方面，rPEG包含净的正电荷或净的负电荷。在一些方面，rPEG没有二级结构。在一些实施方案中，rPEG的长度大于或等于10个氨基酸，而在一些实施方案中，长度为约40-约50个氨基酸。在一些方面，辅助肽通过肽键或蛋白酶切割位点与本发明肽的N端或C端融合。在一些方面，rPEG包含亲和标签或与大于5 kDa的PEG连接。在一些实施方案中，rPEG赋予本发明的缀合物加大的流体动力学半径、延长的血清半寿期、提高的蛋白酶抗性或溶解度，而在一些方面赋予缀合物降低的免疫原性。
可通过使肽的靶定氨基酸残基与能够与这些靶定氨基酸的选定侧链或N端或C端残基反应的有机衍化剂反应，使缀合物部分通过直接共价连接与单链胰岛素类似物连接。肽或缀合物部分的反应基包括例如醛基、氨基、酯基、巯基、α-卤代乙酰基、马来酰亚胺基或肼基。衍化剂包括例如马来酰亚胺基苯甲酰基磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基缀合)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基缀合)、戊二醛、琥珀酐或本领域已知的其它衍化剂。或者，缀合物部分可通过中间载体例如多糖或多肽载体与肽间接连接。多糖载体的实例包括氨基葡聚糖。合适的多肽载体的实例包括聚赖氨酸、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、其共聚物和这些氨基酸和其他氨基酸(例如丝氨酸)的混合聚合物，以赋予所得加载载体所需的溶解性质。
多聚体
单链胰岛素类似物可以是包含通过接头结合的至少2、3个或更多个肽的二聚体、三聚体或更高级次多聚体的一部分，其中至少一个或两个肽是单链胰岛素类似物。在一个实施方案中，单链胰岛素类似物与是包含A链和B链的异源双链的第二胰岛素多肽或第二单链胰岛素类似物的A链或B链连接。二聚体可以是同二聚体或异二聚体。在一些实施方案中，接头选自双官能巯基交联剂和双官能胺交联剂。在某些实施方案中，接头是PEG，例如5 kDaPEG、20 kDa PEG。在一些实施方案中，接头是二硫键。例如二聚体的每个单体可包含Cys残基(例如位于末端或位于内部的Cys)，且每个Cys残基的硫原子参与二硫键的形成。在本发明的一些方面，单体通过末端氨基酸(例如N端或C端)、通过内部氨基酸或通过至少一个单体的末端氨基酸和至少一个其它单体的内部氨基酸连接。在具体的方面，单体不通过N端氨基酸连接。在一些方面，多聚体的单体以“尾-尾”方向连接在一起，其中每个单体的C端氨基酸连接在一起。在一个实施方案中，二聚体包含两个单链胰岛素类似物，其中两个胰岛素类似物通过存在于每个单链胰岛素类似物的连接部分中的氨基酸的氨基酸侧链彼此连接。缀合物部分可与任何本文所述单链胰岛素类似物共价连接，包括二聚体、三聚体或更高级次多聚体。
按照一个实施方案，提供包含本文公开的IGF YL B链类似物(包括前药及其贮库衍生物)的多聚体。多聚体(例如二聚体)可以是同二聚体或异二聚体，包含选自天然胰岛素、天然IGF-1、天然IGF-II、胰岛素类似物肽和IGF类似物肽的肽。在一些实施方案中，接头选自双官能巯基交联剂和双官能胺交联剂。在某些实施方案中，接头是PEG，例如5 kDaPEG、20 kDa PEG。在一些实施方案中，接头是二硫键。
控释制剂
或者，本文所述的单链胰岛素类似物可被修饰成贮库制剂形式，使得本公开内容的缀合物释放到其所给予的机体的方式，在有关在机体内的时间和部位方面受到控制(参见例如美国专利号4,450,150)。本公开内容的缀合物的贮库制剂形式可以是例如包含本公开内容的缀合物和多孔材料或无孔材料(例如聚合物)的可植入组合物，其中本公开内容的缀合物被材料和/或降解的无孔材料包封或在整个材料和/或降解的无孔材料中扩散。然后将贮库制剂植入机体内有需要的部位，本公开内容的缀合物以预定速率从植入物中释放。
或者，大的贮库聚合物可与自切割二肽元件结合，所述二肽元件与本文所述的单链胰岛素类似物共价结合。在该实施方案中，贮库聚合物将单链胰岛素类似物有效地隔离在其给药部位，直到随后通过非酶促反应以预定速率自单链类似物中切割。使用自切割二肽的胰岛素类似物的贮库制剂描述于PCT/US2009/068713，其公开内容结合到本文中。在一个实施方案中，提供包含二肽前药元件的单链胰岛素类似物，其中二肽前药元件与大的聚合物例如PEG或葡聚糖连接。在一个实施方案中，包含大的贮库聚合物(包括例如PEG)的自切割二肽元件与连接部分的氨基酸(包括例如连接部分C8位的氨基酸)侧链连接。
可制备包含单链类似物的药物组合物，并且将药物组合物配制成具有所需要的体内释放特征。在一些方面，药物组合物是即释、控释、缓释、延长释放、延缓释放、两阶段释放制剂。配制用于控释的肽或缀合物的方法是本领域已知的。参见例如J Pharm 374：46-52(2009)和国际专利申请公布号WO 2008/130158、WO2004/033036、WO2000/032218和WO1999/040942。本发明的组合物还可包含例如胶束或脂质体，或其它一些包封形式，或可以延长释放形式给予以提供延长的贮存和/或递送作用。可按照任何方案给予所公开的药物制剂，包括例如每日(每日1次、每日2次、每日3次、每日4次、每日5次、每日6次)、每隔一天、每隔两天、每隔3天、每隔4天、每隔5天、一周一次、两周一次、每三周一次、每月一次或每两月一次。
单链胰岛素类似物的前药衍生物
本公开内容还包括本文公开的单链胰岛素类似物肽的前药类似物。有利的是，前药制剂改进基础肽的治疗指数，延迟起效，并延长单链胰岛素类似物肽的半寿期。所公开的前药化学可与活性部位胺化学缀合形成酰胺，其在二酮派嗪形成时变回成母体胺，并释放前药元件(参见国际专利申请PCT/US2009/068713，其公开内容明确结合到本文中)。这种新的生物友好的前药化学在生理条件下(例如pH约为7，在37℃下，在水性环境中)自发降解，不依赖于酶促降解。前药类似物的持续时间取决于二肽前药序列的选择，因此可供前药制剂的灵活性所用。
在一个实施方案中，提供在生理条件下非酶促活化半寿期(t1/2)介于1-100小时之间的前药。本文所公开的生理条件欲包括在水性环境中约35-40℃的温度和约7.0-约7.4的pH，更常包括7.2-7.4的pH和36-38℃的温度。在一个实施方案中，能够在生理条件下进行二酮派嗪形成的二肽，通过酰胺或酯键与单链胰岛素类似物共价连接(参见国际申请WO2009/099763和PCT/US2009/068713，其公开内容结合到本文中)。
有利的是，切割速率和前药由此活化，均取决于二肽前药部分的结构和立体化学，还取决于亲核体的强度。本文公开的前药最终可以化学转化成可被胰岛素/IGF受体识别的结构，其中这种化学转化的速度将决定体内生物作用的开始时间和持续时间。本申请公开的前药化学有赖于不依靠其它化学添加剂或酶的分子内化学反应。转化速度受二肽取代基的化学性质及其在生理条件下的切割控制。因为生理pH和温度在明确定义的范围内受严格控制，因此从前药到药物的转化速度可具有高的患者内和患者间再现性。在一个实施方案中，提供单链类似物的前药衍生物，其中单链胰岛素类似物包含8-17个氨基酸的连接部分，其中连接部分的氨基酸之一被聚乙二醇化。作为连接部分的氨基酸聚乙二醇化的备选或除此之外，二肽前药元件的两个氨基酸之一可被聚乙二醇化。作为上述聚乙二醇化位点的备选或与之任选组合，单链胰岛素前药衍生物可在选自A链的A9、A14和A15或B链的B1 (对于基于胰岛素的B链)、B2 (对于基于IGF-1的B链)、B10、B22、B28或B29位的位置上被聚乙二醇化。在一个实施方案中，胰岛素前药在B链的N端α胺上(例如基于胰岛素的B链的B1位或基于IGF-1的B链的B2位)被聚乙二醇化。
如本文所公开的，提供这样的前药，其中单链胰岛素类似物肽延长的半寿期为至少1小时，更常大于20小时但少于100小时，并且通过由固有化学不稳定性驱动的非酶促反应，在生理条件下转化成活性形式。在一个实施方案中，前药的非酶促活化t1/2时间介于1-100小时之间，更常介于12和72小时之间，而在一个实施方案中，t1/2介于24-48小时之间，通过将前药在37℃和pH 7.2下在磷酸缓冲溶液(例如PBS)中温育来测定。在一个实施方案中，前药的半寿期为约1、8、12、20、24、48或72小时。在一个实施方案中，前药的半寿期为约100小时以上，包括长达约168、336、504、672或720小时的半寿期，并且通过由固有化学不稳定性驱动的非酶促反应在生理条件下转化成活性形式。应用式t1/2 = .693/k来计算各种前药的半寿期，其中‘k’是前药降解的一级速率常数。在一个实施方案中，前药的活化发生在酰胺键连接的二肽的切割、二酮派嗪或二酮吗啉和活性单链胰岛素类似物肽形成之后。
在另一个实施方案中，二肽前药元件通过酰胺键与单链胰岛素类似物肽共价结合，且二肽还包含与二肽连接的贮库聚合物。在一个实施方案中，两个或更多个贮库聚合物与单个二肽元件连接。在一个实施方案中，贮库聚合物与包含二肽前药元件的氨基酸之一的侧链连接。选择有生物相容性的和具有足够大小的贮库聚合物，使经二肽的共价连接而修饰的单链胰岛素类似物在给予患者时保持隔离在注射部位和/或无法与其相应受体相互作用。随后二肽经切割释放出单链胰岛素类似物与其预期靶标相互作用。带有二肽元件的贮库制剂可经由单链胰岛素类似物的任何合适的胺基(包括N端胺或单链胰岛素类似物内部天然或合成的氨基酸的带有胺的侧链)通过酰胺键与单链胰岛素类似物连接。在一个实施方案中，带有二肽元件的贮库制剂与存在于单链类似物A19位的4-氨基苯丙氨酸的氨基连接。
按照一个实施方案，贮库聚合物选自本领域技术人员已知的生物相容聚合物。贮库聚合物通常具有选自约20,000-120,000道尔顿范围的大小。在一个实施方案中，贮库聚合物具有选自约40,000-100,000或约40,000-80,000道尔顿范围的大小。在一个实施方案中，贮库聚合物具有约40,000、50,000、60,000、70,000或80,000道尔顿的大小。合适的贮库聚合物包括但不限于葡聚糖、聚丙交酯、聚乙交酯、基于己内酯的聚合物、聚(己内酯)、聚酐、聚胺、聚酯酰胺、聚原酸酯、聚二噁烷酮、聚缩醛、聚缩酮、聚碳酸酯、聚磷酸酯、聚酯、聚对苯二甲酸丁二醇酯、聚原碳酸酯、聚磷腈、琥珀酸酯、聚(苹果酸)、聚(氨基酸)、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚羟基纤维素、多糖、壳多糖、脱乙酰壳多糖、透明质酸及其共聚物、三元共聚物和混合物及生物可降解聚合物及其包括基于己内酯的聚合物、聚己内酯的共聚物和包括聚对苯二甲酸丁二醇酯的共聚物。在一个实施方案中，贮库聚合物选自聚乙二醇、葡聚糖、聚乳酸、聚乙醇酸和乳酸和乙醇酸的共聚物，而在一个具体实施方案中，贮库聚合物是聚乙二醇。在一个实施方案中，贮库聚合物是聚乙二醇，且与二肽元件连接的贮库聚合物的总分子量约为40,000-80,000道尔顿。
已证实由天然或合成的氨基酸组成的特定二肽在生理条件下促进分子内分解以释放活性单链胰岛素类似物。二肽可(通过酰胺键)与存在于单链胰岛素类似物上的氨基或通过肽序列修饰而引入单链胰岛素类似物的氨基连接。在一个实施方案中，选择二肽结构以抵抗被哺乳动物血清中存在的肽酶切割，包括例如二肽基肽酶IV (DPP-IV)。因此，在一个实施方案中，与蛋白酶不存在时进行反应相比，当在血清蛋白酶存在时利用生理条件进行反应时，二肽前药元件自生物活性肽的切割速率基本不提高(例如大于2X)。因此，二肽前药元件自单链胰岛素类似物的切割半寿期(在生理条件下在PBS中)不超过在包含DPP-IV蛋白酶的溶液中二肽前药元件自单链胰岛素类似物的切割半寿期的2、3、4或5倍。在一个实施方案中，包含DPP-IV蛋白酶的溶液是血清，更特别是哺乳动物血清，包括人血清。
按照一个实施方案，二肽前药元件包含结构U-B，其中U为氨基酸或羟酸，B为N-烷基化氨基酸。在一个实施方案中，选择U-B的结构，其中U-B自单链胰岛素类似物的化学切割在PBS中在生理条件下在约1-约720小时内完成至少约90%。在一个实施方案中，U-B自单链胰岛素类似物肽的化学切割半寿期(t1/2)在PBS中在生理条件下为至少约1小时-约1周。在一个实施方案中，U、B或U-B与之连接的单链胰岛素类似物的氨基酸是非编码氨基酸。在一些实施方案中，U和/或B为呈D立体异构体构型的氨基酸。在一些示例性的实施方案中，U为呈D立体异构体构型的氨基酸，B为呈L立体异构体构型的氨基酸。在一些示例性的实施方案中，U为呈L立体异构体构型的氨基酸，B为呈D立体异构体构型的氨基酸。在一些示例性的实施方案中，U为呈D立体异构体构型的氨基酸，B为呈D立体异构体构型的氨基酸。在一个实施方案中B为N-烷基化氨基酸但非脯氨酸。在一个实施方案中，氨基酸B的N-烷基化基团是C1-C18烷基，而在一个实施方案中，N-烷基化基团是C1-C6烷基。在一个实施方案中，U为在α碳上具有二取代的氨基酸。
在一个实施方案中，一个或多个二肽元件通过经选自B链的N端氨基或存在于单链胰岛素类似物中的氨基酸的侧链氨基的一个或多个氨基而形成的酰胺键与单链胰岛素类似物连接。在一个实施方案中，单链胰岛素类似物包含两个二肽元件，其中二肽元件任选被聚乙二醇化、烷基化、酰化或与贮库聚合物连接。按照一个实施方案，二肽突出端通过存在于或接近活性部位的赖氨酸残基的侧链胺与单链胰岛素类似物共价连接。在一个实施方案中，二肽突出端通过合成氨基酸或修饰氨基酸连接，其中合成氨基酸或修饰氨基酸具有适于二肽突出端共价连接的官能团(例如氨基-苯丙氨酸的芳族胺)。按照一个实施方案，一个或多个二肽元件在选自B链的N端氨基或存在于相当于天然胰岛素A19、B16或B25位的位置的4-氨基-苯丙氨酸残基芳族胺的侧链氨基的氨基上与单链胰岛素类似物连接。
二肽前药元件被设计成在生理条件下和在不存在酶促活性时自发切割其与胰岛素类似物的酰胺键。在一个实施方案中，二肽前药元件的N端氨基酸包含C-烷基化氨基酸(例如氨基异丁酸)。在一个实施方案中，二肽前药元件的C端氨基酸包含N-烷基化氨基酸(例如脯氨酸或N-甲基甘氨酸)。在一个实施方案中，二肽包含N端C-烷基化氨基酸后是N-烷基化氨基酸的序列。
申请人发现，对于A链19位的天然酪氨酸可容纳4-氨基苯丙氨酸氨基酸部分的选择性插入，而又不丧失胰岛素肽的效力(参见图3)。随后这个活性部位氨基与本文公开的二肽前药元件的化学酰胺化显著降低胰岛素受体结合活性，因此提供合适的胰岛素前药(参见图7-12，提供IGF1Y16L17 (p-NH2-F)A19类似物的数据，其表明与胰岛素(p-NH2-F)A19相当的活性，参见图4)。申请人发现，可对IGFB16B17类似物肽进行类似修饰以为前药化学提供合适的连接位点。因此，在一个实施方案中，二肽前药元件通过酰胺键与胰岛素(p-NH2-F)A19或IGFB16B17单链胰岛素类似物肽的A19 4-氨基苯丙氨酸的芳族环连接，其中二肽的C端氨基酸包含N-烷基化氨基酸，二肽的N端氨基酸是任何氨基酸。
二肽前药部分也可与胰岛素(p-NH2-F)A19或IGFB16B17单链胰岛素类似物肽的其它位点结合以制备胰岛素(p-NH2-F)A19或IGFB16B17单链胰岛素类似物前药衍生物。按照一个实施方案，提供包含IGFB16B17 B链的IGFB16B17单链胰岛素类似物前药衍生物，所述IGFB16B17 B链具有通过酰胺键与B链的N端氨基、或存在于相当于天然胰岛素的A19、B16或B25或存在于连接部分上的位置的4-氨基-苯丙氨酸残基芳族胺的侧链氨基连接的二肽前药元件。IGFB16B17单链胰岛素类似物前药衍生物可包含天然胰岛素A链或天然IGF-1 A链或本文公开的其任何类似物。在一个实施方案中，二肽包含N端C-烷基化氨基酸及其后的N-烷基化氨基酸。按照一个实施方案，提供单链胰岛素类似物前药衍生物，其中构成类似物的A链和B链分别包含SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2的序列，或可包含SEQ ID NO: 1和/或SEQ ID NO: 2的下述类似物，其中所述类似物包括在A19、B16或B25位上的氨基酸被4-氨基苯丙氨酸的取代和/或相当于天然胰岛素的A5、A8、A9、A10、A14、A15、A17、A18、A19和A21、B1、B2、B3、B4、B5、B9、B10、B13、B14、B20、B22、B23、B26、B27、B28、B29和B30位的位置上的一个或多个氨基酸取代、相对于天然胰岛素的相应B1-4和B26-30位处的任一个或全部缺失。在一个实施方案中，二肽与单链胰岛素类似物B链的N端氨基连接，其中二肽的C端氨基酸包含N-烷基化氨基酸，且二肽的N端氨基酸是任何氨基酸，前提条件是如果二肽的C端氨基酸是脯氨酸，则二肽的N端氨基酸包含C-烷基化氨基酸。
在一个实施方案中，二肽前药元件包含下式X的通用结构：
其中
R1、R2、R4和R8独立选自H、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环基(heterocyclic))、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7、(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)和C1-C12烷基(W)C1-C12烷基，其中W是选自N、S和O的杂原子，或R1和R2与它们所连接的原子一起形成C3-C12环烷基或芳基；或R4和R8与它们所连接的原子一起形成C3-C6环烷基；
R3选自C1-C18烷基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)NH2、(C1-C18烷基)SH、(C0-C4烷基)(C3-C6)环烷基、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7和(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)，或R4和R3与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；
R5为NHR6或OH；
R6为H、C1-C8烷基，或R6和R2与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；和
R7选自H和OH。在一个实施方案中，如果前药元件与单链胰岛素类似物的N端胺连接且R4和R3与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环，则R1和R2的至少一个不是H。
在一个实施方案中，提供式X的前药元件，其中R1选自H和C1-C8烷基；和
R2、R8和R4独立选自H、C1-C8烷基、C2-C8烯基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7和CH2(C5-C9杂芳基)，或R1和R2与它们所连接的原子一起形成C3-C8环烷基环；
R3选自C1-C8烷基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C1-C4烷基)NH2、(C3-C6)环烷基，或R4和R3与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环；
R5为NHR6或OH；
R6为H，或R6和R2与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环；和
R7选自H和OH，R8为H。在一个实施方案中，R3为C1-C8烷基、R4选自H、C1-C6烷基、CH2OH、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7和CH2(C5-C9杂芳基)，或R4和R3与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环。在进一步的实施方案中，R5为NHR6，R8为H。
按照一个实施方案，二肽元件包含具有下式X的通用结构的化合物：
其中
R1、R2、R4和R8独立选自H、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7、(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)和C1-C12烷基(W1)C1-C12烷基，其中W1是选自N、S和O的杂原子，或R1和R2与它们所连接的原子一起形成C3-C12环烷基；或R4和R8与它们所连接的原子一起形成C3-C6环烷基；
R3选自C1-C18烷基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)NH2、(C1-C18烷基)SH、(C0-C4烷基)(C3-C6)环烷基、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7和(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)，或R4和R3与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；
R5为NHR6或OH；
R6为H、C1-C8烷基，或R6和R1与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；和
R7选自H、OH、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH和卤素。
在另一个实施方案中，二肽前药元件包含以下通用结构：
其中
R1和R8独立地为H或C1-C8烷基；
R2和R4独立选自H、C1-C8烷基、C2-C8烯基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2+)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7和CH2(C3-C9杂芳基)，或R1和R2与它们所连接的原子一起形成C3-C12环烷基；
R3选自C1-C8烷基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)SH、(C3-C6)环烷基，或R4和R3与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环；
R5为NHR6或OH；
R6为H、C1-C8烷基，或R6和R2与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环；和
R7选自H、OH、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH和卤素，条件是如果R4和R3与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环，则R1和R2两个均不是H。在一个实施方案中，R7为H或OH。在一个实施方案中，二肽前药元件的第一氨基酸和/或第二氨基酸是呈D立体异构体构型的氨基酸。
在进一步的实施方案中，提供式X的前药元件，其中
R1选自H和C1-C8烷基；和
R2和R4独立选自H、C1-C8烷基、C2-C8烯基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7和CH2(C5-C9杂芳基)，或R1和R2与它们所连接的原子一起形成C3-C8环烷基环；
R3选自C1-C8烷基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C1-C4烷基)NH2、(C3-C6)环烷基，或R4和R3与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环；
R5为NHR6或OH；
R6为H，或R6和R2与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环；
R7选自氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH和卤素，R8为H，前提是如果二肽元件与N端胺连接，且R4和R3与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环，则R1和R2两个均不是H。在一个实施方案中，二肽前药元件的第一氨基酸和/或第二氨基酸是呈D立体异构体构型的氨基酸。
在其它实施方案中，二肽前药元件具有式X的结构，其中
R1和R8独立地为H或C1-C8烷基；
R2和R4独立选自H、C1-C8烷基、C2-C8烯基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2+)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7和CH2(C3-C9杂芳基)，或R1和R2与它们所连接的原子一起形成C3-C12环烷基；
R3为C1-C18烷基；
R5为NHR6；
R6为H或C1-C8烷基；和
R7选自氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH和卤素。
在进一步的实施方案中，二肽前药元件具有式X的结构，其中
R1和R2独立地为C1-C18烷基或(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7；或R1和R2通过(CH2)p连接，其中p为2-9；
R3为C1-C18烷基；
R4和R8各自为氢；
R5为NH2；和
R7选自氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH和卤素。
在进一步的实施方案中，二肽前药元件具有式X的结构，其中
R1和R2独立选自氢、C1-C18烷基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C4烷基)NH2和(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7，或R1和R2通过(CH2)p连接，其中p为2-9；
R3为C1-C18烷基，或R3和R4与它们所连接的原子一起形成4-12杂环；
R4和R8独立选自氢、C1-C8烷基和(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7；
R5为NH2；和
R7选自H、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH和卤素，前提条件是R1和R2两者不为氢，且条件是R4或R8的至少一个为氢。
在另一个实施方案中，二肽前药元件具有式X的结构，其中
R1和R2独立选自氢、C1-C8烷基和(C1-C4烷基)NH2，或R1和R2通过(CH2)p连接，其中p为2-9；
R3为C1-C8烷基，或R3和R4与它们所连接的原子一起形成4-6杂环；
R4选自氢和C1-C8烷基；
R8为氢；和
R5为NH2，前提条件是R1和R2两者不为氢。
在进一步的实施方案中，二肽前药元件具有式X的结构，其中
R1和R2独立选自氢、C1-C8烷基和(C1-C4烷基)NH2；
R3为C1-C6烷基；
R4和R8各自为氢；和
R5为NH2，前提条件是R1和R2两者不为氢。
在另一个实施方案中，二肽前药元件具有式X的结构，其中
R1和R2独立选自氢和C1-C8烷基、(C1-C4烷基)NH2，或R1和R2通过(CH2)p连接，其中p为2-9；
R3为C1-C8烷基；
R4 is (C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7；
R5为NH2；
R7选自氢、C1-C8烷基和(C0-C4烷基)OH；和
R8为氢，前提条件是R1和R2两者不为氢。
在另一个实施方案中，二肽前药元件具有式X的结构，其中
R1选自氢、C1-C8烷基和(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7；
R2为氢；
R3为C1-C18烷基；
R4和R8各自为氢；
R5为NHR6或OH；
R6为H、C1-C8烷基，或R6和R1与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；和
R7选自氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH和卤素，前提条件是如果R1为烷基或(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7，则R1和R6与它们所连接的原子一起形成4-11杂环。
在一个实施方案中，提供包含A链和B链的单链胰岛素类似物，其中B链的羧基端通过连接部分与所述A链的氨基端连接。在一个实施方案中，提供包含结构：IB-LM-IA的单链胰岛素类似物，其中IB包含序列R22-X25LCGX29X30LVX33X34LYLVCGX41X42GFX45 (SEQ ID NO:21)，LM为本文所公开的将IB与IA共价连接的连接部分，IA包含序列GIVX4X5CCX8X9X10CX12LX14X15LX17X18X19CX21-R13 (SEQ ID NO: 22)，其中标为X45的氨基酸为与连接部分LM直接结合的苯丙氨酸或酪氨酸。在一个实施方案中，提供包含结构：IB-LM-IA的单链胰岛素类似物，其中IB包含序列J-R23-R22-X25LCGX29X30LVX33X34LX36LVCGX41X42GFX45(SEQ ID NO: 20)或因选自SEQ ID NO: 20的5、6、9、10、16、18、19和21位的1-3个氨基酸修饰而不同于SEQ ID NO: 20的序列，LM为本文公开的连接部分，IA包含序列GIVX4X5CCX8X9X10CX12LX14X15LX17X18X19CX21-R13 (SEQ ID NO: 22)或因选自SEQ ID NO: 20的5、8、9、10、14、15、17、18和21位的1-3个氨基酸修饰而不同于SEQ ID NO: 19的序列，其中
J为H或包含U-B通用结构的二肽元件，其中U为氨基酸或羟酸，B为通过酰胺键连接的N-烷基化氨基酸；
X4为谷氨酸或天冬氨酸；
X5为谷氨酰胺或谷氨酸
X8为组氨酸、苏氨酸或苯丙氨酸；
X9为丝氨酸、精氨酸、鸟氨酸、赖氨酸或丙氨酸；
X10为异亮氨酸或丝氨酸；
X12为丝氨酸或天冬氨酸
X14为酪氨酸、精氨酸、鸟氨酸、赖氨酸或丙氨酸；
X15为谷氨酰胺、谷氨酸、精氨酸、丙氨酸、鸟氨酸、赖氨酸或亮氨酸；
X17为谷氨酸或谷氨酰胺；
X18为甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸或苏氨酸；
X19为以下通用结构的氨基酸：
其中X选自OH或NHR10，其中R10为H或包含通用结构U-B的二肽元件，其中U为氨基酸或羟酸，B为N-烷基化氨基酸；
X21选自丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、缬氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸和甲硫氨酸；
X25为组氨酸或苏氨酸；
X29选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X30选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸和半胱磺酸；
X33选自天冬氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸；
X34选自丙氨酸和苏氨酸；
X36为以下通用结构的氨基酸
其中X12选自OH和NHR11，其中R11为包含通用结构U-B的二肽元件；
X41选自谷氨酸、天冬氨酸或天冬酰胺；
X42选自丙氨酸、鸟氨酸、赖氨酸和精氨酸；
X45为以下通用结构的氨基酸
其中X13选自H、OH和NHR12，其中R12为H或包含通用结构U-B的二肽元件；
R22选自AYRPSE (SEQ ID NO: 14)、FVNQ (SEQ ID NO: 12)、PGPE (SEQ ID NO:11)、三肽甘氨酸-脯氨酸-谷氨酸、三肽缬氨酸-天冬酰胺-谷氨酰胺、二肽脯氨酸-谷氨酸、二肽天冬酰胺-谷氨酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸和N端胺；
R23为键或包含1-6个带电荷的氨基酸的氨基序列；和
R13为COOH或CONH2。在一个实施方案中，仅J、R10、R11和R12之一为U-B。在一个实施方案中，X12为OH，X13为H或OH，J和/或X为U-B。在一个实施方案中，X12为OH，X13为OH，R23为键，J为H，X为U-B。在进一步的实施方案中，X8、X25和X30各自为组氨酸。在另一个实施方案中，单链胰岛素类似物肽包含SEQ ID NO: 19的A链肽序列和SEQ ID NO: 20的B链肽序列。在一个实施方案中，R23为键或包含氨基序列X60(X61X62)dX63K (SEQ ID NO: 192)，其中X60选自甘氨酸、谷氨酸和天冬氨酸，X61和X62独立选自谷氨酸和天冬氨酸，X63选自精氨酸、天冬氨酸和谷氨酸，d为1-3的整数。
在一个实施方案中，提供这样的单链胰岛素类似物，其中IB包含序列J-R23R22-X25LCGX29X30LVX33X34LX36LVCGX41X42GFX45 (SEQ ID NO: 20)或J-R23R22-X25LCGX29X30LVEALYLVCG ERGFF (SEQ ID NO: 53)，其中IB的B25氨基酸的羧基端与连接部分(LM)的第一末端直接连接，而连接部分的第二末端与IA链的A1氨基酸的氨基端直接连接，此外在一个实施方案中，其中连接部分不含序列YTPKT (SEQ ID NO: 16)或FNKPT (SEQID NO: 76)。在一个实施方案中，提供这样的单链胰岛素类似物，其中IB包含序列J-R23R22-X25LCGX29X30LVX33X34LX36LVCGX41X42GFX45 (SEQ ID NO: 20)、J-R23R22-X25LCGX29X30LVEALYLVCGERGFF (SEQ ID NO: 53)、R23R22-X25LCGX29X30LVX33X34LX36LVCGX41X42GFX45 (SEQ ID NO: 20)或R23R22-X25LCGX29X30LVEALYLVCG ERGFF (SEQ ID NO: 53)，连接部分为以下通用结构的肽接头：(Y1)k-X51AX53X54X55X56X57R(Y2)n (SEQ ID NO: 28)、(Y1)k-X51AX53X54X55X56RR(Y2)n (SEQID NO: 23)、(Y1)k-GYGSSSX57X58(Y2)n (SEQ ID NO: 85)、(Y1)k-GAGSSSX57X58(Y2)n (SEQ IDNO: 163)、(Y1)k-GYGSSSX57R (SEQ ID NO: 51)或(Y1)k-X51X52GSSSX57X58-(Y2)n (SEQ ID NO:29)，其中Y1选自X46和X46X47，前提条件是如果k为0，则连接肽不含序列YTPKT (SEQ ID NO:16)或FNKPT (SEQ ID NO: 76)。
在一个实施方案中，提供包含结构：IB-LM-IA的单链胰岛素类似物，其中IB包含序列J-R23R22-X25LCGX29X30LVEALYLVCG ERGFF (SEQ ID NO: 53)，LM为本文公开的连接部分，IA包含序列GIVEQCCX8SICSLYQLX17NX19CX23 (SEQ ID NO: 52)，其中
X8选自苏氨酸和组氨酸；
X17为谷氨酸或谷氨酰胺；
X19为以下通用结构的氨基酸：
其中X选自OH或NHR10，其中R10为H或包含通用结构U-B的二肽元件，其中U为氨基酸或羟酸，B为N-烷基化氨基酸；
X23为天冬酰胺或甘氨酸；
X25选自组氨酸和苏氨酸；
X29选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X30选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸和半胱磺酸；
R22选自FVNQ (SEQ ID NO: 12)、三肽缬氨酸-天冬酰胺-谷氨酰胺、二肽天冬酰胺-谷氨酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸和N端胺；和
R23为键或包含1-6个带电荷的氨基酸的氨基序列。
在进一步的实施方案中，B链包含序列X22VNQX25LCGX29X30LVEALYLVCGERGFFYT-Z1-B1 (SEQ ID NO: 54)，其中
X22选自苯丙氨酸和脱氨基-苯丙氨酸；
X25选自组氨酸和苏氨酸；
X29选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X30选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸和半胱磺酸；
Z1为选自天冬氨酸-赖氨酸、赖氨酸-脯氨酸和脯氨酸-赖氨酸的二肽；和
B1选自苏氨酸、丙氨酸或苏氨酸-精氨酸-精氨酸三肽。
按照一个实施方案，提供包含结构：IB-LM-IA的单链胰岛素类似物，其中IB包含序列X25LCGX29X30LVEALYLVCG ERGFF (SEQ ID NO: 53)，LM为本文所公开的将IB与IA共价连接的连接部分，IA包含序列GIVEQCCX8SICSLYQLENX19CX21 (SEQ ID NO: 55)，其中SEQ ID NO:53的C端苯丙氨酸残基在不存在任何间插氨基酸的情况下与连接部分LM直接共价结合。
在一个实施方案中，提供包含结构：IB-LM-IA的单链胰岛素类似物，其中IB包含序列J-R23-R22-X25LCGX29X30LVX33X34LYLVCGDX42GFX45 (SEQ ID NO: 58)，LM为本文公开的连接部分，IA包含序列GIVX4ECCX8X9SCDLX14X15LX17X18X19CX21-R13 (SEQ ID NO: 19)，其中
J为H或包含U-B通用结构的二肽元件，其中U为氨基酸或羟酸，B为通过酰胺键连接的N-烷基化氨基酸；
X4为天冬氨酸或谷氨酸；
X8为组氨酸或苯丙氨酸；
X9和X14独立选自精氨酸、鸟氨酸、赖氨酸或丙氨酸；
X15为精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或亮氨酸；
X17为谷氨酸或谷氨酰胺；
X18为甲硫氨酸、天冬酰胺或苏氨酸；
X19为以下通用结构的氨基酸：
其中X选自OH或NHR10，其中R10为H或包含通用结构U-B的二肽元件，其中U为氨基酸或羟酸，B为N-烷基化氨基酸；
X21为丙氨酸、甘氨酸或天冬酰胺；
R22选自共价键、AYRPSE (SEQ ID NO: 14)、甘氨酸-脯氨酸-谷氨酸三肽、脯氨酸-谷氨酸二肽和谷氨酸；
R23为键或包含1-6个带电荷的氨基酸的氨基序列；
X25选自组氨酸和苏氨酸；
X29选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X30选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸和半胱磺酸；
X33选自天冬氨酸和谷氨酸；
X34选自丙氨酸和苏氨酸；
X42选自丙氨酸、赖氨酸鸟氨酸和精氨酸；
X45为以下通用结构的氨基酸
其中X13选自H、OH和NHR12，其中R12为包含通用结构U-B的二肽元件；
和
R13为COOH或CONH2，前提条件是J、X和X13之一或仅一个包含U-B。在一个实施方案中，J为H和X13为OH，X为NH-U-B。
在一个实施方案中，选择二肽前药元件U-B的U和B以抑制U-B二肽被存在于哺乳动物血清中的酶自胰岛素进行酶促切割。在一个实施方案中，选择U和/或B使得在生理条件下在PBS中U-B自胰岛素肽的切割半寿期不超过在包含DPP-IV蛋白酶的溶液中U-B自胰岛素肽切割半寿期的2倍(即在DPP-IV蛋白酶存在和生理条件下U-B自胰岛素前药的切割不以超过相对于不存在酶的相同条件的速率的2倍发生)。在一个实施方案中，U、B或U-B与之连接的胰岛素肽的氨基酸是非编码氨基酸。在一个实施方案中，U和/或B为呈D立体异构体构型的氨基酸。在一些示例性的实施方案中，U为呈D立体异构体构型的氨基酸，B为呈L立体异构体构型的氨基酸。在一些示例性的实施方案中，U为呈L立体异构体构型的氨基酸，B为呈D立体异构体构型的氨基酸。在一些示例性的实施方案中，U为呈D立体异构体构型的氨基酸，B为呈D立体异构体构型的氨基酸。在一个实施方案中，U-B为包含本文所述式X结构的二肽。在一个实施方案中，B为N-烷基化氨基酸但非脯氨酸。
按照一个实施方案，提供包含人胰岛素的B链和A链或其类似物或衍生物的单链胰岛素激动剂多肽，其中B链的羧基端通过连接部分与A链的氨基端连接。在一个实施方案中，连接部分包含6-16个单体单元的聚乙二醇、长度为至少8个氨基酸而不超过12个氨基酸的氨基酸序列(或其肽模拟物)或所述聚乙二醇和氨基酸序列的组合。更具体地讲，在一个实施方案中，连接部分包含氨基酸序列X51X52X53X54X55X56RR(SEQ ID NO: 10)，其中X51选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸；X52是酪氨酸以外的任何氨基酸，包括例如任何非芳族氨基酸；X3-X6各自独立地为任何氨基酸。
在一个实施方案中，单链胰岛素类似物包含结构IB-LM-IA，其中IB包含序列
J-R23R22-X25LCGX29X30LVX33X34LX36LVCGX41X42GFX45 SEQ ID NO: 20)；
LM为选自以下的连接部分：(Y1)k-X51X52X53X54X55X56X57X58(Y2)n (SEQ ID NO: 9)、(Y1)k-X51AX53X54X55X56RR(Y2)n (SEQ ID NO: 23)、(Y1)k-GYGSSSX57X58(Y2)n (SEQ ID NO: 85)和；和
IA包含序列GIVX4X5CCX8X9X10CX12LX14X15LX17X18X19CX21-R13 (SEQ ID NO: 22)，其中
J为H或包含U-B通用结构的二肽，其中U为氨基酸或羟酸，B为通过酰胺键连接的N-烷基化氨基酸；
Y1选自X46、X46X47、X46X47X48、X46X47X48X49 (SEQ ID NO: 24)和X46X47X48X49X50 (SEQ IDNO: 13)；和
Y2选自X70、X70X71、X70X71X72和X70X71X72X73 (SEQ ID NO: 15)，其中
n为0或1；
k为0或1；
m为5-15范围的整数；
X4为谷氨酸或天冬氨酸；
X5为谷氨酰胺或谷氨酸
X8为组氨酸、苏氨酸或苯丙氨酸；
X9为丝氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或丙氨酸；
X10为异亮氨酸或丝氨酸；
X12为丝氨酸或天冬氨酸
X14为酪氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或丙氨酸；
X15为谷氨酰胺、谷氨酸、精氨酸、丙氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或亮氨酸；
X17为谷氨酸或谷氨酰胺；
X18为甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸或苏氨酸；
X19为以下通用结构的氨基酸：
其中X选自OH、OCH3或NHR10，其中R10为H或包含通用结构U-B的二肽元件，其中U为氨基酸或羟酸，B为N-烷基化氨基酸；
X21选自丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、缬氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸和甲硫氨酸；
X25为组氨酸或苏氨酸；
X29选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X30选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸和半胱磺酸；
X33选自天冬氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸；
X34选自丙氨酸和苏氨酸；
X36为以下通用结构的氨基酸
其中X12选自OH和NHR11，其中R11为包含通用结构U-B的二肽元件；
X41选自谷氨酸、天冬氨酸或天冬酰胺；
X42选自丙氨酸、赖氨酸、鸟氨酸和精氨酸；
X45为以下通用结构的氨基酸
其中X13选自H、OH和NHR12，其中R12为H或包含通用结构U-B的二肽元件；
X51选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸；
X52是酪氨酸以外的任何氨基酸；
X46-X56和X70-X73各自独立地为任何氨基酸或其氨基酸类似物或衍生物；
X57和X58独立选自精氨酸、鸟氨酸和赖氨酸。
R22选自AYRPSE (SEQ ID NO: 14)、FVNQ (SEQ ID NO: 12)、PGPE (SEQ ID NO:11)、三肽甘氨酸-脯氨酸-谷氨酸、三肽缬氨酸-天冬酰胺-谷氨酰胺、二肽脯氨酸-谷氨酸、二肽天冬酰胺-谷氨酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸和键；
R23为键或包含1-6个带电荷的氨基酸的氨基序列；和
R13为COOH或CONH2，前提条件是U、B或U-B与之连接的单链胰岛素激动剂的氨基酸为非编码氨基酸。在一个实施方案中，n或k的至少一个为1。
在一个实施方案中，提供包含结构IB-LM-IA的单链胰岛素类似物，其中IB包含序列
R23R22-X25LCGX29X30LVX33X34LYLVCGX41X42GFX45 (SEQ ID NO: 21)；
LM为选自以下的连接部分：(Y1)k-X51X52X53X54X55X56X57X58(Y2)n (SEQ ID NO: 9)、(Y1)k-X51AX53X54X55X56RR(Y2)n (SEQ ID NO: 23)、(Y1)k-GYGSSSX57X58(Y2)n (SEQ ID NO: 85)和；
IA包含序列GIVX4X5CCX8X9X10CX12LX14X15LX17X18X19CX21-R13 (SEQ ID NO: 22)，其中
Y1选自X46、X46X47、X46X47X48、X46X47X48X49 (SEQ ID NO: 24)和X46X47X48X49X50 (SEQ IDNO: 13)；和
Y2选自X70、X70X71、X70X71X72和X70X71X72X73 (SEQ ID NO: 15)，其中
n为0或1；
k为0或1；
m为5-15范围的整数；
X4为谷氨酸或天冬氨酸；
X5为谷氨酰胺或谷氨酸
X8为组氨酸、苏氨酸或苯丙氨酸；
X9为丝氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或丙氨酸；
X10为异亮氨酸或丝氨酸；
X12为丝氨酸或天冬氨酸；
X14为酪氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或丙氨酸；
X15为谷氨酰胺、谷氨酸、精氨酸、丙氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或亮氨酸；
X17为谷氨酸或谷氨酰胺；
X18为甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸或苏氨酸；
X19为以下通用结构的氨基酸：
其中X选自OH或NHR10，其中R10为H或包含通用结构U-B的二肽元件，其中U为氨基酸或羟酸，B为N-烷基化氨基酸；
X21选自丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、缬氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸和甲硫氨酸；
X25为组氨酸或苏氨酸；
X29选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X30选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸和半胱磺酸；
X33选自天冬氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸；
X34选自丙氨酸和苏氨酸；
X45为酪氨酸或苯丙氨酸；
X51选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸；
X52是酪氨酸以外的任何氨基酸；
X46-X56和X70-X73各自独立地为任何氨基酸或其氨基酸类似物或衍生物；
X57和X58独立选自精氨酸、鸟氨酸和赖氨酸；
R22选自AYRPSE (SEQ ID NO: 14)、FVNQ (SEQ ID NO: 12)、PGPE (SEQ ID NO:11)、三肽甘氨酸-脯氨酸-谷氨酸、三肽缬氨酸-天冬酰胺-谷氨酰胺、二肽脯氨酸-谷氨酸、二肽天冬酰胺-谷氨酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸和键；
R23为H或包含1-6个带电荷的氨基酸的氨基序列；和
R13为COOH或CONH2。在一个实施方案中，n或k的至少一个为1。在一个实施方案中，n和k均为1。在进一步的实施方案中，Y2选自A、AP、APQ和APQT，Y1选自F、Y、FN、YT、FNK、YTP、FNPK (SEQ ID NO: 79)、FNKP (SEQ ID NO: 77)、YTPK (SEQ ID NO: 78)、YTPKT (SEQ IDNO: 16)、YTKPT (SEQ ID NO: 80)、FNKPT (SEQ ID NO: 76)和FNPKT (SEQ ID NO: 81)。在一个实施方案中，R23为键，R22选自AYRPSE (SEQ ID NO: 14)、PGPE (SEQ ID NO: 11)、三肽甘氨酸-脯氨酸-谷氨酸、二肽脯氨酸-谷氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸和H。
在一个实施方案中，R23为H或4-7个氨基酸的氨基序列，其中N端氨基酸选自甘氨酸、谷氨酸和天冬氨酸，C端氨基酸为赖氨酸，该序列的其它氨基酸独立选自谷氨酸和天冬氨酸，R22选自AYRPSE (SEQ ID NO: 14)、PGPE (SEQ ID NO: 11)、三肽甘氨酸-脯氨酸-谷氨酸、二肽脯氨酸-谷氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸和H。
在一个实施方案中，U-B包含下式X的结构：
X
其中
R1、R2、R4和R8独立选自H、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7、(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)和C1-C12烷基(W1)C1-C12烷基，其中W1是选自N、S和O的杂原子，或
R1和R2与它们所连接的原子一起形成C3-C12环烷基或芳基；或
R4和R8与它们所连接的原子一起形成C3-C6环烷基；
R3选自C1-C18烷基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)NH2、(C1-C18烷基)SH、(C0-C4烷基)(C3-C6)环烷基、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7和(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)，或R4和R3与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；
R5为NHR6或OH；
R6为H、C1-C8烷基，或R6和R1与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；和
R7选自H、OH、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH和卤素。
在另一个实施方案中，提供包含结构IB-LM-IA的单链胰岛素类似物，其中IB包含序列
J-R22-X25LCGX29X30LVX33X34LYLVCGX41X42GFX45 (SEQ ID NO: 21)；
LM包含序列(Y1)k-GYGSSSGX57R(Y2)n (SEQ ID NO: 91)或(Y1)k-X51AX53X54X55X56X57R(Y2)n (SEQ ID NO: 28)；和
IA包含序列GIVX4X5CCX8X9X10CX12LX14X15LX17X18X19CX21-R13 (SEQ ID NO: 22)，其中
J为H或包含U-B通用结构的二肽，其中U为氨基酸或羟酸，B为通过酰胺键连接的N-烷基化氨基酸；
Y1选自X46、X46X47、X46X47X48、X46X47X48X49 (SEQ ID NO: 24)和X46X47X48X49X50 (SEQ IDNO: 13)；和
Y2选自X70、X70X71、X70X71X72和X70X71X72X73 (SEQ ID NO: 15)，其中
n为0或1；
k为0或1；
X4为谷氨酸或天冬氨酸；
X5为谷氨酰胺或谷氨酸；
X8为组氨酸、苏氨酸或苯丙氨酸；
X9为丝氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或丙氨酸；
X10为异亮氨酸或丝氨酸；
X12为丝氨酸或天冬氨酸；
X14为酪氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或丙氨酸；
X15为谷氨酰胺、谷氨酸、精氨酸、丙氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或亮氨酸；
X17为谷氨酸或谷氨酰胺；
X18为甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸或苏氨酸；
X19为以下通用结构的氨基酸：
其中X选自OH或NHR10，其中R10为H或包含通用结构U-B的二肽元件，其中U为氨基酸或羟酸，B为N-烷基化氨基酸；
X21选自丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、缬氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸和甲硫氨酸；
X25为组氨酸或苏氨酸；
X29选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X30选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸和半胱磺酸；
X33选自天冬氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸；
X34选自丙氨酸和苏氨酸；
X41选自谷氨酸、天冬氨酸或天冬酰胺；
X42选自丙氨酸、赖氨酸、鸟氨酸和精氨酸；
X45为以下通用结构的氨基酸
其中X13选自H、OH和NHR12，其中R12为H或包含通用结构U-B的二肽元件；
X51选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸；
X52是酪氨酸以外的任何氨基酸；
X46-X56和X70-X73各自独立地为任何氨基酸或其氨基酸类似物或衍生物；和
X57为精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或赖氨酸；
R22选自AYRPSE (SEQ ID NO: 14)、FVNQ (SEQ ID NO: 12)、PGPE (SEQ ID NO:11)、三肽甘氨酸-脯氨酸-谷氨酸、三肽缬氨酸-天冬酰胺-谷氨酰胺、二肽脯氨酸-谷氨酸、二肽天冬酰胺-谷氨酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸和键；
R23为键或包含1-6个带电荷的氨基酸的氨基序列；和
R13为COOH或CONH2。在一个实施方案中，k为0，在另一个实施方案中，n为0，而在一个进一步的实施方案中，k和n两者均为0。在一个实施方案中，连接部分是GYGSSSRR (SEQID NO: 18)或GX52GSSSRRAPQT (SEQ ID NO: 83)，其中X52为非芳族氨基酸。
在另一个实施方案中，单链胰岛素类似物包含结构IB-LM-IA，其中IB包含序列
J-R23-R22-X25LCGX29X30LVX33X34LYLVCGX41X42GFX45 (SEQ ID NO: 21)；
LM包含结构：；和
IA包含序列GIVX4X5CCX8X9X10CX12LX14X15LX17X18X19CX21-R13 (SEQ ID NO: 22)，其中
J为H或包含U-B通用结构的二肽元件，其中U为氨基酸或羟酸，B为通过酰胺键连接的N-烷基化氨基酸；
m为5-15范围的整数；
X4为谷氨酸或天冬氨酸；
X5为谷氨酰胺或谷氨酸；
X8为组氨酸、苏氨酸或苯丙氨酸；
X9为丝氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或丙氨酸；
X10为异亮氨酸或丝氨酸；
X12为丝氨酸或天冬氨酸；
X14为酪氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或丙氨酸；
X15为谷氨酰胺、谷氨酸、精氨酸、丙氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或亮氨酸；
X17为谷氨酸或谷氨酰胺；
X18为甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸或苏氨酸；
X19为以下通用结构的氨基酸：
其中X选自OH或NHR10，其中R10为H或包含通用结构U-B的二肽元件，其中U为氨基酸或羟酸，B为N-烷基化氨基酸；
X21选自丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、缬氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸和甲硫氨酸；
X25为组氨酸或苏氨酸；
X29选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X30选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸和半胱磺酸；
X33选自天冬氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸；
X34选自丙氨酸和苏氨酸；
X41选自谷氨酸、天冬氨酸或天冬酰胺；
X42选自丙氨酸、赖氨酸、鸟氨酸和精氨酸；
X45为以下通用结构的氨基酸
其中X13选自H、OH和NHR12，其中R12为H或包含通用结构U-B的二肽元件；
X51选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸；
X52是酪氨酸以外的任何氨基酸；
X46-X56和X70-X73各自独立地为任何氨基酸或其氨基酸类似物或衍生物；
R22选自AYRPSE (SEQ ID NO: 14)、FVNQ (SEQ ID NO: 12)、PGPE (SEQ ID NO:11)、三肽甘氨酸-脯氨酸-谷氨酸、三肽缬氨酸-天冬酰胺-谷氨酰胺、二肽脯氨酸-谷氨酸、二肽天冬酰胺-谷氨酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸和N端胺；
R23为键或X60(X61X62)dX63K (SEQ ID NO: 192)
其中
X60选自甘氨酸、谷氨酸和天冬氨酸；
X61和X62独立选自谷氨酸和天冬氨酸；
X63选自精氨酸天冬氨酸和谷氨酸；
d为1-3范围的整数；和
R13为COOH或CONH2。
在一个实施方案中，单链胰岛素类似物包含结构IB-LM-IA，其中IB包含序列
J-R23-R22-X25LCGX29X30LVX33X34LX36LVCGX41X42GFX45 SEQ ID NO: 20)；
LM包含序列(Y1)k-X51AX53X54X55X56RR(Y2)n (SEQ ID NO: 23)；和
IA包含序列GIVX4X5CCX8X9X10CX12LX14X15LX17X18X19CX21-R13 (SEQ ID NO: 22)，其中n为1，X46、X47、X48、X49和/或X50的至少一个为选自式I、II或III的氨基酸。在一个实施方案中，Y1选自F、Y、FN、YT、FNK、YTP、FNPK (SEQ ID NO: 79)、FNKP (SEQ ID NO: 77)、YTPK(SEQ ID NO: 78)、YTPKT (SEQ ID NO: 16)、YTKPT (SEQ ID NO: 80)、FNKPT (SEQ ID NO:76)和FNPKT (SEQ ID NO: 81)。在另一个实施方案中，Y1选自F、FN、FNK、FNPK (SEQ ID NO:79)、FNKPT (SEQ ID NO: 76)和FNPKT (SEQ ID NO: 81)。在一个实施方案中，Y2选自A、AP、APQ和APQT (SEQ ID NO: 82)。在进一步的实施方案中，n为0。在一个实施方案中，X53、X54、X55和X56各自独立选自甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和脯氨酸。在一个实施方案中，其中IB包含序列J-R23-R22-X25LCGX29X30LVX33X34LX36LVCGX41X42GFX45 (SEQ ID NO: 20)，LM包含选自以下的序列：FX51AX53X54X55X56RR (SEQ ID NO: 94)、FX51AX53X54X55X56RRA (SEQ ID NO:95)、FX51AX53X54X55X56RRAP (SEQ ID NO: 96)、FX51AX53X54X55X56RRAPQ (SEQ ID NO: 97)、FNX51AX53X54X55X56RRAPQT (SEQ ID NO: 98)、FNX51AX53X54X55X56RR (SEQ ID NO: 99)、FNX51AX53X54X55X56RRA (SEQ ID NO: 100)、FNX51AX53X54X55X56RRAP (SEQ ID NO: 101)、FNX51AX53X54X55X56RRAPQ (SEQ ID NO: 102)、FNX51AX53X54X55X56RRAPQT (SEQ ID NO: 103)、FNKX51AX53X54X55X56RR (SEQ ID NO: 104)、FNKX51AX53X54X55X56RRA (SEQ ID NO: 105)、FNKX51AX53X54X55X56RRAP (SEQ ID NO: 106)、FNKX51AX53X54X55X56RRAPQ (SEQ ID NO: 107)、FNKX51AX53X54X55X56RRAPQT (SEQ ID NO: 108)、FNKPX51AX53X54X55X56RR (SEQ ID NO: 109)、FNKPX51AX53X54X55X56RRA (SEQ ID NO: 110)、FNKPX51AX53X54X55X56RRAP (SEQ ID NO: 111)、FNKPX51AX53X54X55X56RRAPQ (SEQ ID NO: 112)、FNKPX51AX53X54X55X56RRAPQT (SEQ ID NO:113)、FNKPTX51AX53X54X55X56RR (SEQ ID NO: 114)、FNKPTX51AX53X54X55X56RRA (SEQ ID NO:115)、FNKPTX51AX53X54X55X56RRAP (SEQ ID NO: 116)、FNKPTX51AX53X54X55X56RRAPQ (SEQ IDNO: 117)、FNKPTX51AX53X54X55X56RRAPQT (SEQ ID NO: 118)、FX51X52GSSSRR (SEQ ID NO:119)、FX51X52GSSSRRA (SEQ ID NO: 120)、FX51X52GSSSRRAP (SEQ ID NO: 121)、FX51X52GSSSRRAPQ (SEQ ID NO: 122)、FNX51X52GSSSRRAPQT (SEQ ID NO: 123)、FNX51X52GSSSRR (SEQ ID NO: 124)、FNX51X52GSSSRRA (SEQ ID NO: 125)、FNX51X52GSSSRRAP(SEQ ID NO: 126)、FNX51X52GSSSRRAPQ (SEQ ID NO: 127)、FNX51X52GSSSRRAPQT (SEQ IDNO: 128)、FNKX51X52GSSSRR (SEQ ID NO: 129)、FNKX51X52GSSSRRA (SEQ ID NO: 130)、FNKX51X52GSSSRRAP (SEQ ID NO: 131)、FNKX51X52GSSSRRAPQ (SEQ ID NO: 132)、FNKX51X52GSSSRRAPQT (SEQ ID NO: 133)、FNKPX51X52GSSSRR (SEQ ID NO: 134)、FNKPX51X52GSSSRRA (SEQ ID NO: 135)、FNKPX51X52GSSSRRAP (SEQ ID NO: 136)、FNKPX51X52GSSSRRAPQ (SEQ ID NO: 137)、FNKPX51X52GSSSRRAPQT (SEQ ID NO: 138)、FNKPTX51X52GSSSRR (SEQ ID NO: 139)、FNKPTX51X52GSSSRRA (SEQ ID NO: 140)、FNKPTX51X52GSSSRRAP (SEQ ID NO: 141)、FNKPTX51X52GSSSRRAPQ (SEQ ID NO: 142)和FNKPTX51X52GSSSRRAPQT (SEQ ID NO: 143)，其中X51选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸，X52是酪氨酸以外的任何氨基酸，X46-X56各自独立地为任何氨基酸或其氨基酸类似物或衍生物。在一个实施方案中，SEQ ID NO: 94-143的连接部分被聚乙二醇化，而在进一步的实施方案中，SEQ ID NO: 94-143的连接部分的精氨酸残基被聚乙二醇化赖氨酸取代。在一个实施方案中，聚乙二醇化赖氨酸位于相对于天然IGF1 C肽(SEQ ID NO: 17)的8位。在一个实施方案中，X52为任何非芳族氨基酸。在一个实施方案中,其中IB包含序列J-R23-R22-X25LCGX29X30LVX33X34LX36LVCGX41X42GFX45 (SEQ ID NO: 20)，LM由以下序列组成：GAGSSSX57X58 (SEQ ID NO: 163)、GAGSSSRX58APQ (SEQ ID NO: 167)、TGYGSSSRR (SEQ ID NO: 18)、TGYGSSSRR(SEQ ID NO: 144)、KTGYGSSSRR(SEQ ID NO:145)、PKTGYGSSSRR(SEQ ID NO: 146)、TPKTGYGSSSRR(SEQ ID NO: 147)、TKPTGYGSSSRR(SEQ ID NO: 148)或SRPAGYGSSSRR(SEQ ID NO: 149)，其中X57和X58独立选自精氨酸、鸟氨酸和赖氨酸。
在一个实施方案中，单链胰岛素类似物包含选自以下的序列：
a) J-R23-R22-X25LCGX29X30LVX33X34LYLVCGX41X42GFX45 (SEQ ID NO: 21)-X51X52GSSSRR (SEQ ID NO: 27)-GIVX4X5CCX8X9X10CX12LX14X15LX17X18X19CX21-R13 (SEQ ID NO:22)；
b) J-R23-R22-X25LCGX29X30LVX33X34LYLVCGX41X42GFX45 (SEQ ID NO: 21)-X46X47X48X49X50X51X52GSSSRR (SEQ ID NO: 86)-GIVX4X5CCX8X9X10CX12LX14X15LX17X18X19CX21-R13(SEQ ID NO: 22)；
c) J-R23-R22-X25LCGX29X30LVX33X34LYLVCGX41X42GFX45 (SEQ ID NO: 21)-X51X52GSSSRR (SEQ ID NO: 27)-APQT (SEQID NO：82)-GIVX4X5CCX8X9X10CX12LX14X15LX17X18X19CX21-R13 (SEQ ID NO: 22)；
d) J-R23-R22-X25LCGX29X30LVX33X34LYLVCGX41X42GFX45 (SEQ ID NO: 21)-X46X47X48X49X50X51X52GSSSRX58APQT (SEQ ID NO: 87)-GIVX4X5CCX8X9X10CX12LX14X15LX17X18X19CX21-R13 (SEQ ID NO: 22)；
e) J-R23-R22-X25LCGX29X30LVEALYLVCGERGFF (SEQ ID NO: 53)-X51X52GSSSX57X58APQT (SEQ ID NO: 46)-GIVEQCCX8SICSLYQLENX19CX21-R13 (SEQ ID NO:55)；
f) J-R23-R22-X25LCGX29X30LVEALYLVCGERGFF (SEQ ID NO: 53)-X51X52GSSSRR (SEQID NO: 27)-GIVEQCCX8SICSLYQLENX19CX21-R13 (SEQ ID NO: 55)；
g) J-R23-R22-X25LCGX29X30LVEALYLVCGERGFF (SEQ ID NO: 53)-X46X47X48X49X50X51X52GSSSRX58APQT (SEQ ID NO: 87)-GIVEQCCX8SICSLYQLENX19CX21-R13 (SEQID NO: 55)；
h) J-R23-R22-X25LCGX29X30LVEALYLVCGERGFF (SEQ ID NO: 53)-X46X47X48X49X50X51X52GSSSRR (SEQ ID NO: 87)-GIVEQCCX8SICSLYQLENX19CX21-R13 (SEQ IDNO: 55)；
i) J-R23-R22-X25LCGX29X30LVX33X34LYLVCGX41X42GFX45 (SEQ ID NO: 21)-GYGSSSRR(SEQ ID NO: 18)-GIVX4X5CCX8X9X10CX12LX14X15LEX18X19CX21-R13 (SEQ ID NO: 152)；
j) J-R23-R22-X25LCGX29X30LVX33X34LYLVCGX41X42GFX45 (SEQ ID NO: 21)-GYGSSSRR(SEQ ID NO: 18)-GIVEQCCX8SICSLYQLENX19CX21-R13 (SEQ ID NO: 55)；和
其中
J为H或包含U-B通用结构的二肽元件，其中U为氨基酸或羟酸，B为通过酰胺键连接的N-烷基化氨基酸；
X4为谷氨酸或天冬氨酸；
X5为谷氨酰胺或谷氨酸；
X8为组氨酸、苏氨酸或苯丙氨酸；
X9为丝氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或丙氨酸；
X10为异亮氨酸或丝氨酸；
X12为丝氨酸或天冬氨酸；
X14为酪氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或丙氨酸；
X15为谷氨酰胺、谷氨酸、精氨酸、丙氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或亮氨酸；
X17为谷氨酸或谷氨酰胺；
X18为甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸或苏氨酸；
X19为以下通用结构的氨基酸：
其中X选自OH或NHR10，其中R10为H或包含通用结构U-B的二肽元件，其中U为氨基酸或羟酸，B为N-烷基化氨基酸；
X21选自丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、缬氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸和甲硫氨酸；
X25为组氨酸或苏氨酸；
X29选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X30选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸和半胱磺酸；
X33选自天冬氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸；
X34选自丙氨酸和苏氨酸；
X41选自谷氨酸、天冬氨酸或天冬酰胺；
X42选自丙氨酸、赖氨酸、鸟氨酸和精氨酸；
X45为以下通用结构的氨基酸
其中X13选自H、OH和NHR12，其中R12为H或包含通用结构U-B的二肽元件；
X46-X50各自独立地为任何氨基酸或其氨基酸类似物或衍生物；
X51选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸；
X52是酪氨酸以外的任何氨基酸；
X57和X58独立地为精氨酸或赖氨酸；
R22选自AYRPSE (SEQ ID NO: 14)、FVNQ (SEQ ID NO: 12)、PGPE (SEQ ID NO:11)、三肽甘氨酸-脯氨酸-谷氨酸、三肽缬氨酸-天冬酰胺-谷氨酰胺、二肽脯氨酸-谷氨酸、二肽天冬酰胺-谷氨酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸和N端胺；
R23为键或包含带电荷的氨基酸(包括例如带负电荷的氨基酸)的1-8个氨基酸序列；和
R13为COOH或CONH2。在一个实施方案中，J为H，X45为苯丙氨酸或酪氨酸。在进一步的实施方案中，R22为键或GX60X61X62X63X64K (SEQ ID NO: 153)，其中X60、X61、X62、X63和X64独立地为谷氨酸或天冬氨酸。在进一步的实施方案中，单链胰岛素类似物包含序列
R23-R22-X25LCGX29X30LVX33X34LYLVCGX41X42GFX45 (SEQ ID NO: 21)-X51X52GSSSRR(SEQ ID NO: 27)-GIVX4X5CCX8X9X10CX12LX14X15LX17X18X19CX21-R13 (SEQ ID NO: 22)，或R23-R22-X25LCGX29X30LVX33X34LYLVCGX41X42GFX45 (SEQ ID NO: 21)-GX52GSSSRX58APQT (SEQ IDNO: 38)-GIVX4X5CCX8X9X10CX12LX14X15LX17X18X19CX21-R13 (SEQ ID NO: 22)
其中
X4为谷氨酸或天冬氨酸；
X5为谷氨酰胺或谷氨酸；
X8为组氨酸、苏氨酸或苯丙氨酸；
X9为丝氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或丙氨酸；
X10为异亮氨酸或丝氨酸；
X12为丝氨酸或天冬氨酸；
X14为酪氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或丙氨酸；
X15为谷氨酰胺、谷氨酸、精氨酸、丙氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或亮氨酸；
X17为谷氨酸或谷氨酰胺；
X18为甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸或苏氨酸；
X19为以下通用结构的氨基酸：
其中X选自OH或NHR10，其中R10为H或包含通用结构U-B的二肽元件，其中U为氨基酸或羟酸，B为N-烷基化氨基酸；
X21选自丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、缬氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸和甲硫氨酸；
X25为组氨酸或苏氨酸；
X29选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X30选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸和半胱磺酸；
X33选自天冬氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸；
X34选自丙氨酸和苏氨酸；
X41选自谷氨酸、天冬氨酸或天冬酰胺；
X42选自丙氨酸、赖氨酸、鸟氨酸和精氨酸；
X45为苯丙氨酸或酪氨酸；
X51选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和脯氨酸；
X52为丙氨酸；
X58为精氨酸或赖氨酸；
R22选自AYRPSE (SEQ ID NO: 14)、FVNQ (SEQ ID NO: 12)、PGPE (SEQ ID NO:11)、三肽甘氨酸-脯氨酸-谷氨酸、三肽缬氨酸-天冬酰胺-谷氨酰胺、二肽脯氨酸-谷氨酸、二肽天冬酰胺-谷氨酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸和N端胺；
R23为键或包含一个或多个带负电荷的氨基酸的1-8个氨基酸序列；和
R13为COOH或CONH2。在一个实施方案中，R23为N端胺；包含X60(X61X62)dX63K (SEQ IDNO: 192)的肽，其中d为1-3范围的整数；或选自以下的肽：GEK、GEEK (SEQ ID NO: 179)、GEEEK (SEQ ID NO: 178)、GEEEEEK (SEQ ID NO: 177)、GEEEEEK (SEQ ID NO: 176)、GEEEEEEEK (SEQ ID NO: 175)、GDK、GDDK (SEQ ID NO: 190)、GDDDK (SEQ ID NO: 189)、GDDDDK (SEQ ID NO: 188)、GDDDDDK (SEQ ID NO: 187)、GDDDDDK (SEQ ID NO: 186)、GERK (SEQ ID NO: 174)、GEERK (SEQ ID NO: 173)、GEEERK (SEQ ID NO: 172)、GEEEEERK(SEQ ID NO: 171)、GEEEEERK (SEQ ID NO: 170)、GEEEEEEERK (SEQ ID NO: 169)、GDRK(SEQ ID NO: 185、GDDRK (SEQ ID NO: 184)、GDDDRK (SEQ ID NO: 183)、GDDDDRK (SEQID NO: 182)、GDDDDDRK (SEQ ID NO: 181)或GDDDDDRK (SEQ ID NO: 180)。按照一个实施方案，二肽元件U-B包含下式X的结构：
X
其中
(a) R1、R2、R4和R8独立选自H、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7、(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)和C1-C12烷基(W1)C1-C12烷基，其中W1是选自N、S和O的杂原子，或
(ii) R1和R2与它们所连接的原子一起形成C3-C12环烷基或芳基；或
(iii) R4和R8与它们所连接的原子一起形成C3-C6环烷基；
(b) R3选自C1-C18烷基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)NH2、(C1-C18烷基)SH、(C0-C4烷基)(C3-C6)环烷基、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7和(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)，或R4和R3与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；
(c) R5为NHR6或OH；
(d) R6为H、C1-C8烷基，或R6和R2与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；和
(e) R7选自H和OH。
按照一个实施方案，二肽元件U-B包含结构：
X
其中
R1、R2、R4和R8独立选自H、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7、(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)和C1-C12烷基(W1)C1-C12烷基，其中W1是选自N、S和O的杂原子，或R1和R2与它们所连接的原子一起形成C3-C12环烷基；或R4和R8与它们所连接的原子一起形成C3-C6环烷基；
R3选自C1-C18烷基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)NH2、(C1-C18烷基)SH、(C0-C4烷基)(C3-C6)环烷基、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7和(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)，或R4和R3与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；
R5为NHR6或OH；
R6为H、C1-C8烷基，或R6和R1与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；和
R7选自氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH和卤素。在一个具体实施方案中，二肽元件包含式X的结构，其中
R1和R2独立地为C1-C18烷基或芳基；
R3为C1-C18烷基，或R3和R4与它们所连接的原子一起形成4-12杂环；
R4和R8独立选自氢、C1-C18烷基和芳基；和
R5为胺或羟基。
在另一个具体实施方案中，二肽元件包含式X的结构，其中
R1选自氢、C1-C18烷基和芳基，或R1和R2通过-(CH2)p-连接，其中p为2-9；
R3为C1-C18烷基，或R3和R4与它们所连接的原子一起形成4-6杂环；
R4和R8独立选自氢、C1-C18烷基和芳基；和
R5为胺或N-取代胺。
在另一个具体实施方案中，二肽元件包含式X的结构，其中
R1和R2独立选自氢、C1-C8烷基和芳基；
R3为C1-C18烷基，或R3和R4与它们所连接的原子一起形成4-6杂环；
R4和R8各自为氢；和
R5选自胺、N-取代胺和羟基。
在一个实施方案中，单链胰岛素类似物的前药形式包含结构IB-LM-IA，其中IB包含序列
J-R23-R22-X25LCGX29X30LVX33X34LX36LVCGX41X42GFX45 (SEQ ID NO: 20)；
LM包含结构：；和
IA包含序列GIVX4X5CCX8X9X10CX12LX14X15LX17X18X19CX21-R13 (SEQ ID NO: 22)，其中m为5-15范围的整数。在进一步的实施方案中，m为7-13范围的整数。
在一个实施方案中，单链胰岛素类似物包含选自以下的序列：
a) J-R23-R22-X25LCGX29X30LVX33X34LYLVCGX41X42GFX45 (SEQ ID NO: 21)-(PEG)8-14-GIVX4X5CCX8X9X10CX12LX14X15LX17X18X19CX21-R13 (SEQ ID NO: 22)
b) J-R23-R22-X25LCGX29X30LVEALYLVCGERGFF (SEQ ID NO: 53)-(PEG)8-14-GIVEQCCX8SICSLYQLENX19CX21-R13 (SEQ ID NO: 55)
c) J-R23-R22-X25LCGX29X30LVEALYLVCGERGFF (SEQ ID NO: 53)-(PEG)8-14-GIVX4X5CCX8X9X10CX12LX14X15LX17X18X19CX21-R13 (SEQ ID NO: 22)；和
d) J-R23-R22-X25LCGX29X30LVX33X34LYLVCGX41X42GFX45 (SEQ ID NO: 21)-(PEG)8-14-GIVEQCCX8SICSLYQLENX19CX21-R13 (SEQ ID NO: 55)
其中
J为H或包含U-B通用结构的二肽元件，其中U为氨基酸或羟酸，B为通过酰胺键连接的N-烷基化氨基酸；
X4为谷氨酸或天冬氨酸；
X5为谷氨酰胺或谷氨酸；
X8为组氨酸、苏氨酸或苯丙氨酸；
X9为丝氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或丙氨酸；
X10为异亮氨酸或丝氨酸；
X12为丝氨酸或天冬氨酸；
X14为酪氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或丙氨酸；
X15为谷氨酰胺、谷氨酸、精氨酸、丙氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或亮氨酸；
X17为谷氨酸或谷氨酰胺；
X18为甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸或苏氨酸；
X19为以下通用结构的氨基酸：
其中X选自OH或NHR10，其中R10为H或包含通用结构U-B的二肽元件，其中U为氨基酸或羟酸，B为N-烷基化氨基酸；
X21选自丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、缬氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸和甲硫氨酸；
X25为组氨酸或苏氨酸；
X29选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X30选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸和半胱磺酸；
X33选自天冬氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸；
X34选自丙氨酸和苏氨酸；
X41选自谷氨酸、天冬氨酸或天冬酰胺；
X42选自丙氨酸、赖氨酸、鸟氨酸和精氨酸；
X45为以下通用结构的氨基酸
其中X13选自H、OH和NHR12，其中R12为H或包含通用结构U-B的二肽元件；
R22选自AYRPSE (SEQ ID NO: 14)、FVNQ (SEQ ID NO: 12)、PGPE (SEQ ID NO:11)、三肽甘氨酸-脯氨酸-谷氨酸、三肽缬氨酸-天冬酰胺-谷氨酰胺、二肽脯氨酸-谷氨酸、二肽天冬酰胺-谷氨酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸和键；
R23为键或G(X60)d(X61)gK (SEQ ID NO: 191)
其中X60、X61独立地为谷氨酸或天冬氨酸；和
d和g独立地为1-6范围的整数；和
R13为COOH或CONH2。本文所用标识“(PEG)n”欲表示具有用在括号外给出的下标数字或数字范围表示的单体数的聚乙二醇。在一个实施方案中，J为H，X45为苯丙氨酸或酪氨酸。在进一步的实施方案中，R23为键或GX60X61X62X63X64K (SEQ ID NO: 193，其中X60、X61、X62、X63和X64独立地为谷氨酸或天冬氨酸。
按照一个实施方案，单链胰岛素类似物的前药形式包含结构IB-LM-IA，其中IB包含序列R22HLCGSX30LVEALYLVCG ERGFF (SEQ ID NO: 154)或X22VNQX25LCGX29X30LVEALYLVCGERGFFYT-Z1-B1 (SEQ ID NO: 54)；
LM为本文公开的连接部分，IA包含序列GIVEQCCX8SICSLYQLENX19CX21-R13 (SEQ IDNO: 55)或GIVX4ECCX8X9SCDLX14X15LX17X18X19CX21-R13 (SEQ ID NO: 19)，其中
X4为谷氨酸或天冬氨酸；
X8为组氨酸、苏氨酸或苯丙氨酸；
X9为精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或丙氨酸；
X14为精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或丙氨酸；
X15为谷氨酰胺、谷氨酸、精氨酸、丙氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或亮氨酸；
X17为谷氨酸或谷氨酰胺；
X18为甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸或苏氨酸；
X19为以下通用结构的氨基酸
；
其中
m1为1-3范围的整数；
R1、R2、R4和R8独立选自H、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7、(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)和C1-C12烷基(W1)C1-C12烷基，其中W1是选自N、S和O的杂原子，或R1和R2与它们所连接的原子一起形成C3-C12环烷基；或R4和R8与它们所连接的原子一起形成C3-C6环烷基；
R3选自C1-C18烷基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)NH2、(C1-C18烷基)SH、(C0-C4烷基)(C3-C6)环烷基、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7和(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)，或R4和R3与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；
R5为NHR6或OH；
R6为H、C1-C8烷基，或R6和R1与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；和
R7选自氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH和卤素；
X21选自丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、缬氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸和甲硫氨酸；
X22选自苯丙氨酸和脱氨基-苯丙氨酸；
X23为天冬酰胺或甘氨酸；
X25为组氨酸或苏氨酸；
X29选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X30选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸和半胱磺酸；
Z1为选自天冬氨酸-赖氨酸、赖氨酸-脯氨酸和脯氨酸-赖氨酸的二肽；和
B1选自苏氨酸、丙氨酸或苏氨酸-精氨酸-精氨酸三肽。
R22选自X22VNQ (SEQ ID NO: 84)、三肽缬氨酸-天冬酰胺-谷氨酰胺、二肽天冬酰胺-谷氨酰胺、谷氨酰胺和N端胺；和
R13为COOH或CONH2。在一个实施方案中，m1为1。按照一个实施方案，单链胰岛素类似物包含结构IB-LM-IA，其中IB包含序列X22VNQX25LCGX29X30LVEALYLVCGERGFFYT-Z1-B1(SEQ ID NO: 54)，LM为本文公开的连接部分，IA包含序列GIVX4ECCX8X9SCDLX14X15LX17X18X19CX21-R13 (SEQ ID NO: 19)。
在一个实施方案中，单链胰岛素类似物包含式：IB-LM-IA的化合物，其中IB表示包含其中X26和X27各自为丙氨酸，X42为精氨酸的序列GPETLCGX26ELVDX27LYLVCGDX42GFYFNKPT-R14(SEQ ID NO: 197)或GPETLCGAELVDALYLVCGDRGFYFNPKT (SEQ ID NO: 89)的IGF YL B链，LM表示本文所述连接部分，IA表示包含序列GIVDECCHRSCDLRRLEMX19CA-R13 (SEQ IDNO: 155)或GIVDECCHOSCDLOOLQMX19CN-R13 (SEQ ID NO: 75)或天然胰岛素序列GIVEQCCTSICSLYQLENX19CN-R13 (SEQ ID NO: 194)的IGF A链，其中
X8为组氨酸或苯丙氨酸；
X19为以下通用结构的氨基酸
其中X选自OH或NHR10，其中R10为包含以下通用结构的二肽：
；
R1选自H和C1-C8烷基；
R2和R4独立选自H、C1-C8烷基、C2-C8烯基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7和CH2(C5-C9杂芳基)，或R1和R2与它们所连接的原子一起形成C3-C6环烷基；
R3选自C1-C8烷基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)SH和(C3-C6)环烷基，或R4和R3与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环；
R5为NHR6或OH；
R6为H，或R6和R2与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环；
R7选自H和OH；和
R8为H；和
R13和R14独立地为COOH或CONH2。本发明还包括本文所述胰岛素类似物A链和B链肽的任何组合通过本文所述连接部分连接在一起作为式IB-LM-IA的单链胰岛素类似物。
二肽前药元件
可选择二肽前药元件的取代基及其与单链胰岛素类似物连接的部位，以提供所需要的本文公开的单链胰岛素类似物的前药类似物的半寿期。例如，如果包含以下结构的二肽前药元件与单链胰岛素类似物B链的N端氨基酸的α氨基连接，则提供在生理条件下在PBS中t1/2为约1小时的化合物：
X
其中
R1和R2独立地为C1-C18烷基或芳基；或R1和R2通过-(CH2)p-连接，其中p为2-9；
R3为C1-C18烷基；
R4和R8各自为氢；和
R5为胺。
在其它实施方案中，在N端连接且t1/2为例如约1小时的前药，包含具有以下结构的二肽前药元件：
其中
R1和R2独立地为C1-C18烷基或(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7；或R1和R2通过-(CH2)p连接，其中p为2-9；
R3为C1-C18烷基；
R4和R8各自为氢；
R5为NH2；
R7选自氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH和卤素；R8为H。
或者，在一个实施方案中，提供单链胰岛素类似物前药衍生物，其中二肽前药与单链胰岛素类似物B链的N端氨基酸的α氨基连接，且在生理条件下在PBS中前药的t1/2介于约6-约24小时之间。在一个实施方案中，提供在生理条件下在PBS中t1/2介于约6-约24小时之间的单链胰岛素类似物前药衍生物，其中前药元件具有式X的结构，和
R1和R2独立选自氢、C1-C18烷基和芳基，或R1和R2通过-(CH2)p-连接，其中p为2-9；
R3为C1-C18烷基，或R3和R4与它们所连接的原子一起形成4-12杂环；
R4和R8独立选自氢、C1-C8烷基和芳基；和
R5为胺，前提条件是R1和R2两者不为氢，且条件是R4或R8之一为氢。
在进一步的实施方案中，提供单链胰岛素类似物前药衍生物，其中二肽前药与单链胰岛素类似物B链的N端氨基酸的α氨基连接，且在生理条件下在PBS中前药的t1/2介于约72-约168小时之间。在一个实施方案中，提供在生理条件下在PBS中t1/2介于约72-约168小时之间的单链胰岛素类似物前药衍生物，其中前药元件具有式X的结构，和
R1选自氢、C1-C8烷基和芳基；
R2为H；
R3为C1-C18烷基；
R4和R8各自为氢；和
R5为胺或N-取代胺或羟基；
前提条件是如果R1为烷基或芳基，则R1和R5与它们所连接的原子一起形成4-11杂环。
在一些实施方案中，具有与单链胰岛素类似物B链肽的N端α氨基酸连接的二肽前药元件，且t1/2例如介于约12-约72小时之间，或在一些实施方案中介于约12-约48小时之间的前药，包含具有以下结构的二肽前药元件：
X
其中R1和R2独立选自氢、C1-C18烷基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C4烷基)NH2和(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7，或R1和R2通过(CH2)p连接，其中p为2-9；
R3为C1-C18烷基，或R3和R4与它们所连接的原子一起形成4-12杂环；
R4和R8独立选自氢、C1-C8烷基和(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7；
R5为NH2；和
R7选自H、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH和卤素；
前提条件是R1和R2两者不为氢，且条件是R4或R8的至少一个为氢。
在一些实施方案中，具有与单链胰岛素类似物B链肽的N端氨基酸连接的二肽前药元件，且t1/2例如介于约12-约72小时之间，或在一些实施方案中介于约12-约48小时之间的前药，包含具有以下结构的二肽前药元件：
X
其中R1和R2独立选自氢、C1-C8烷基和(C1-C4烷基)NH2，或R1和R2通过(CH2)p连接，其中p为2-9；
R3为C1-C8烷基，或R3和R4与它们所连接的原子一起形成4-6杂环；
R4选自氢和C1-C8烷基；和
R5为NH2；
前提条件是R1和R2两者不为氢。
在其它实施方案中，具有与单链胰岛素类似物B链肽的N端氨基酸连接的二肽前药元件，且t1/2例如介于约12-约72小时之间，或在一些实施方案中介于约12-约48小时之间的前药，包含具有以下结构的二肽前药元件：
X
其中
R1和R2独立选自氢、C1-C8烷基和(C1-C4烷基)NH2；
R3为C1-C6烷基；
R4为氢；和
R5为NH2；
前提条件是R1和R2两者不为氢。
在一些实施方案中，具有与单链胰岛素类似物B链肽的N端氨基酸连接的二肽前药元件，且t1/2例如介于约12-约72小时之间，或在一些实施方案中介于约12-约48小时之间的前药，包含具有以下结构的二肽前药元件：
X
其中
R1和R2独立选自氢和C1-C8烷基、(C1-C4烷基)NH2，或R1和R2通过(CH2)p连接，其中p为2-9；
R3为C1-C8烷基；
R4为(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7；
R5为NH2；和
R7选自氢、C1-C8烷基和(C0-C4烷基)OH；
前提条件是R1和R2两者不为氢。
此外，提供具有与单链胰岛素类似物的N端α氨基酸连接的二肽前药元件，且t1/2例如为约72-约168小时的前药，其中二肽前药元件具有以下结构：
X
其中R1选自氢、C1-C8烷基和(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7；
R3为C1-C18烷基；
R4和R8各自为氢；
R5为NHR6或OH；
R6为H、C1-C8烷基，或R6和R1与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；和
R7选自氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH和卤素；
前提条件是如果R1为烷基或(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7，则R1和R5与它们所连接的原子一起形成4-11杂环。
在一些实施方案中，二肽前药元件与单链胰岛素类似物的内部氨基酸的侧链胺连接。在该实施方案中，t1/2例如为约1小时的前药具有以下结构：
其中
R1和R2独立地为C1-C8烷基或(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7；或R1和R2通过-(CH2)p-连接，其中p为2-9；
R3为C1-C18烷基；
R4和R8各自为氢；
R5为NH2；和
R7选自氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH和卤素。
此外，提供t1/2例如介于约6-约24小时之间，具有与内部氨基酸侧链连接的二肽前药元件的前药，其中前药包含具有以下结构的二肽前药元件：
其中R1和R2独立选自氢、C1-C8烷基和(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7，或R1和R2通过-(CH2)p-连接，其中p为2-9；
R3为C1-C18烷基，或R3和R4与它们所连接的原子一起形成4-12杂环；
R4和R8独立地为氢、C1-C18烷基或(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7；
R5为NHR6；
R6为H或C1-C8烷基，或R6和R2与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；和
R7选自氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH和卤素；
前提条件是R1和R2两者不为氢，且条件是R4或R8的至少一个为氢。
此外，提供t1/2为例如约72-约168小时，且具有与单链胰岛素类似物的内部氨基酸侧链连接的二肽前药元件的前药，其中二肽前药元件具有以下结构：
其中R1选自氢、C1-C18烷基和(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7；
R3为C1-C18烷基；
R4和R8各自为氢；
R5为NHR6或OH；
R6为H或C1-C8烷基，或R6和R1与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；和
R7选自氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH和卤素；前提条件是，如果R1和R2两者独立地为烷基或(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7，则R1或R2的任一个通过(CH2)p与R5连接，其中p为2-9。
在一些实施方案中，二肽前药元件与单链胰岛素类似物的内部氨基酸的侧链胺连接，其中内部氨基酸包含以下式V的结构
其中
n为选自1-4的整数。在一些实施方案中，n为3或4，而在一些实施方案中，内部氨基酸是赖氨酸。在一些实施方案中，二肽前药元件与位于单链胰岛素类似物B链的28或29位的氨基酸侧链上的伯胺连接。
在其中式X的二肽前药元件与芳族氨基酸的芳基的氨基取代基连接的实施方案中，可选择前药、前药元件的取代基以提供所需的活化时间。例如，包含式IV结构的氨基酸的本文公开的任何单链胰岛素类似物的前药类似物的半寿期可通过改变R1、R2、R3、R4、R5和R8的取代基来选择：
其中m1为0-3的整数。在一个实施方案中，式V的氨基酸存在于相当于天然胰岛素的A19、B16或B25位的氨基酸上，而在一个具体实例中，式V的氨基酸位于单链胰岛素类似物A19位，m1为1。在一个实施方案中，提供包含式IV的结构且在生理条件下在PBS中t1/2约为1小时的单链胰岛素类似物前药衍生物。在一个实施方案中，在生理条件下在PBS中t1/2约为1小时的单链胰岛素类似物前药衍生物包含式IV的结构，其中，
R1和R2独立地为C1-C18烷基或芳基；
R3为C1-C18烷基，或R3和R4与它们所连接的原子一起形成4-12杂环；
R4和R8独立选自氢、C1-C18烷基和芳基；和
R5为胺或羟基。在一个实施方案中，m1为1。
在一个实施方案中，二肽前药元件通过存在于单链胰岛素类似物的芳族氨基酸的芳基上的胺与单链胰岛素类似物连接，其中t1/2例如约为1小时的前药具有以下肽结构：
其中R1和R2独立地为C1-C18烷基或(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7；
R3为C1-C18烷基，或R3和R4与它们所连接的原子一起形成4-12杂环；
R4和R8独立选自氢、C1-C18烷基和(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7；
R5为NH2或OH；和
R7选自氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH和卤素。
在另一个实施方案中，提供包含式IV结构的单链胰岛素类似物前药衍生物，其中m1为0-3的整数，在生理条件下在PBS中t1/2为约6-约24小时。在一个实施方案中，在生理条件下在PBS中t1/2为约6-约24小时的单链胰岛素类似物前药包含式IV的结构，其中，
R1选自氢、C1-C18烷基和芳基，或R1和R2通过-(CH2)p-连接，其中p为2-9；
R3为C1-C18烷基，或R3和R4与它们所连接的原子一起形成4-6杂环；
R4和R8独立选自氢、C1-C18烷基和芳基；和
R5为胺或N-取代胺。在一个实施方案中，m1为1。
在一个实施方案中，提供具有通过芳族氨基酸连接的二肽前药元件且t1/2为例如约6-约24小时的前药，其中二肽包含以下结构：
其中
R1选自氢、C1-C18烷基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C4烷基)NH2和(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7；
R3为C1-C18烷基，或R3和R4与它们所连接的原子一起形成4-6杂环；
R4和R8独立选自氢、C1-C18烷基和(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7；
R5为NHR6；
R6为H、C1-C8烷基，或R6和R1与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；和
R7选自氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH和卤素。
在另一个实施方案中，提供包含式IV结构的单链胰岛素类似物前药衍生物，其中m1为0-3的整数，且在生理条件下在PBS中t1/2为约72-约168小时。在一个实施方案中，在生理条件下在PBS中t1/2为约72-约168小时的单链胰岛素类似物前药衍生物包含式IV的结构，其中，
R1和R2独立选自氢、C1-C8烷基和芳基；
R3为C1-C18烷基，或R3和R4与它们所连接的原子一起形成4-6杂环；
R4和R8各自为氢；和
R5选自胺、N-取代胺和羟基。在一个实施方案中，m1为1。
在一个实施方案中，提供具有通过芳族氨基酸连接的二肽前药元件且t1/2为例如约72-约168小时的前药，其中二肽包含以下结构：
其中R1和R2独立选自氢、C1-C8烷基、(C1-C4烷基)COOH和(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7，或R1和R5与它们所连接的原子一起形成4-11杂环；
R3为C1-C18烷基，或R3和R4与它们所连接的原子一起形成4-6杂环；
R4为氢或与R3一起形成4-6杂环；
R8为氢；
R5为NHR6或OH；
R6为H或C1-C8烷基，或R6和R1与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；和
R7选自氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH和卤素。
按照一个实施方案，式X的二肽被进一步修饰以包含干扰单链胰岛素类似物与胰岛素或IGF-1受体相互作用的能力的大的聚合物。二肽随后的切割从二肽复合体中释放出单链胰岛素类似物，其中释放的单链胰岛素类似物有完全活性。按照一个实施方案，式X的二肽被进一步修饰以包含干扰结合的单链胰岛素类似物与胰岛素或IGF-1受体相互作用的能力的大的聚合物。按照一个实施方案，单链胰岛素类似物包含下式X通用结构的二肽：
，其中式X的二肽的氨基酸侧链之一被聚乙二醇化或酰化。
在一个实施方案中，提供包含结构IB-LM-IA的单链胰岛素类似物，其中IB包含序列
J-R23-R22-X25LCGX29X30LVX33X34LX36LVCGX41X42GFX45 (SEQ ID NO: 20)；
LM包含本文所述的连接部分；和
IA包含序列GIVX4X5CCX8X9X10CX12LX14X15LEX18X19CX21-R13 (SEQ ID NO: 152)，其中
J为H或式X的二肽元件；
X4为谷氨酸或天冬氨酸；
X5为谷氨酰胺或谷氨酸；
X8为组氨酸、苏氨酸或苯丙氨酸；
X9为丝氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或丙氨酸；
X10为异亮氨酸或丝氨酸；
X12为丝氨酸或天冬氨酸；
X14为酪氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或丙氨酸；
X15为谷氨酰胺、谷氨酸、精氨酸、丙氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或亮氨酸；
X18为甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸或苏氨酸；
X19为以下通用结构的氨基酸：
其中X选自OH或NHR10，其中R10为H或包含式X通用结构的二肽元件；
X21选自丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、缬氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸和甲硫氨酸；
X25为组氨酸或苏氨酸；
X29选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X30选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸和半胱磺酸；
X33选自天冬氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸；
X34选自丙氨酸和苏氨酸；
X41选自谷氨酸、天冬氨酸或天冬酰胺；
X42选自丙氨酸、赖氨酸、鸟氨酸和精氨酸；
X45为以下通用结构的氨基酸
其中X13选自H、OH和NHR12，其中R12为H或包含式X通用结构的二肽元件；
R22选自AYRPSE (SEQ ID NO: 14)、FVNQ (SEQ ID NO: 12)、PGPE (SEQ ID NO:11)、三肽甘氨酸-脯氨酸-谷氨酸、三肽缬氨酸-天冬酰胺-谷氨酰胺、二肽脯氨酸-谷氨酸、二肽天冬酰胺-谷氨酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸和N端胺；
R23为键或G(X60)d(X61)gK (SEQ ID NO: 191)
其中X60、X61独立地为谷氨酸或天冬氨酸；和
d和g独立地为1-6范围的整数；和
R13为COOH或CONH，此外其中式X的二肽被酰化或聚乙二醇化。在一个实施方案中，J包含式X的酰化或聚乙二醇化二肽。
本文公开的单链胰岛素类似物和其前药衍生物可被进一步修饰以改进肽在水溶液中在生理pH下的溶解度，同时通过防止肽的肾清除而延长肽的有效的持续时间。当与血浆蛋白质相比时，肽因为其相对小的分子大小而容易被清除。增加肽分子量大于40 kDa超出肾阈，并显著延长在血浆中的持续时间。因此，在一个实施方案中，肽前药被进一步修饰以包含共价连接的亲水部分。
在一个实施方案中，亲水部分是血浆蛋白质、聚乙二醇链或免疫球蛋白的Fc部分。因此，在一个实施方案中，本文公开的胰岛素类似物被进一步修饰以包含与氨基酸的侧链共价连接的一个或多个亲水基团。
按照一个实施方案，本文公开的胰岛素前药通过使亲水部分与B链的N端氨基酸或位于B链羧基端(包括例如SEQ ID NO: 89的28位)的赖氨酸氨基酸(或其它合适的氨基酸)的侧链连接而被进一步修饰。在一个实施方案中，提供单链胰岛素前药衍生物，其中连接部分的氨基酸之一通过亲水部分与肽接头的侧链连接而被修饰。在一个实施方案中，修饰氨基酸是半胱氨酸、赖氨酸或乙酰基苯丙氨酸。
按照一个实施方案，提供这样的单链胰岛素类似物的前药衍生物，其中式X的二肽元件还包含聚乙二醇、烷基或酰基。在一个实施方案中，一个或多个聚乙二醇链与式X的二肽连接，其中聚乙二醇链的总分子量的范围为约20,000-约80,000道尔顿、或40,000-80,000道尔顿或40,000-60,000道尔顿。在一个实施方案中，分子量为约40,000道尔顿的至少一个聚乙二醇链与式X的二肽连接。在另一个实施方案中，式X的二肽被大小足以结合血清白蛋白的酰基酰化，因此在给药时使IGFB16B17类似物肽失活。酰基可以是直链或支链的，而在一个实施方案中为C16-C30脂肪酸。例如，酰基可以是C16脂肪酸、C18脂肪酸、C20脂肪酸、C22脂肪酸、C24脂肪酸、C26脂肪酸、C28脂肪酸或C30脂肪酸的任一个。在一些实施方案中，酰基是C16-C20脂肪酸，例如C18脂肪酸或C20脂肪酸。
在另一个实施方案中，本文公开的单链胰岛素类似物肽及其前药类似物通过修饰氨基酸加入单链胰岛素类似物肽A链的羧基端或氨基端或B链的氨基端而被进一步修饰，其中所加入的氨基酸被修饰以包含与氨基酸连接的亲水部分。在一个实施方案中，加入C端的氨基酸是修饰的半胱氨酸、赖氨酸或乙酰基苯丙氨酸。在一个实施方案中，亲水部分选自血浆蛋白质、聚乙二醇链和免疫球蛋白的Fc部分。
在一个实施方案中，亲水基团是聚乙二醇链，而在一个实施方案中，两个或更多个聚乙二醇链与单链胰岛素类似物的两个或更多个氨基酸侧链共价连接。按照一个实施方案，亲水部分在相当于A10、B28、B29位、A链的C端或B链的N端(相对于天然胰岛素的位置)的位置处与本文所公开的单链胰岛素类似物的氨基酸侧链共价连接。对于具有多个聚乙二醇链的单链胰岛素类似物及其前药衍生物，聚乙二醇链可在B链的N端氨基酸上连接或与位于B链羧基端的赖氨酸氨基酸的侧链连接，或者通过在肽的C端加入单个氨基酸而连接，其中所加入的氨基酸具有与其侧链连接的聚乙二醇链。按照一个实施方案，提供前药衍生物，其中聚乙二醇链或其它亲水部分与包含二肽前药元件的两个氨基酸之一的侧链连接。在一个实施方案中，二肽前药元件包含赖氨酸(呈D或L立体异构体构型)，其中聚乙二醇链与赖氨酸的侧链胺连接。
按照一个实施方案，本文公开的单链胰岛素类似物肽或其前药衍生物通过氨基酸取代被进一步修饰，其中取代氨基酸包含适于与亲水部分(包括例如聚乙二醇)交联的侧链。例如，在一个实施方案中，相当于天然胰岛素的A5、A8、A9、A10、A12、A14、A15、A17、A18、B1、B2、B3、B4、B5、B13、B14、B17、B21、B22、B26、B27、B28、B29和B30的位置上的天然氨基酸被赖氨酸、半胱氨酸或乙酰基苯丙氨酸残基取代(或将赖氨酸、半胱氨酸或乙酰基苯丙氨酸残基加入C端)以允许聚乙二醇链的共价连接。
在一个实施方案中，单链胰岛素类似物或其前药衍生物具有单个半胱氨酸取代或加入单链胰岛素类似物氨基端或羧基端的单个半胱氨酸残基，或胰岛素前药衍生物的连接部分或二肽元件内的氨基酸被至少一个半胱氨酸残基取代，其中半胱氨酸残基的侧链被巯基反应试剂进一步修饰，巯基反应试剂包括例如马来酰亚胺基、乙烯基砜、2-吡啶基巯基、卤代烷基和卤代酰基。这些巯基反应试剂可含有羧基、酮基、羟基和醚基团以及其它亲水部分例如聚乙二醇单元。在备选实施方案中，单链胰岛素类似物或其前药衍生物具有单个赖氨酸取代或加入单链胰岛素类似物的氨基端或羧基端的单个赖氨酸残基，或胰岛素前药衍生物的连接部分或二肽元件内的氨基酸被赖氨酸取代，且取代赖氨酸残基的侧链使用胺反应试剂进一步修饰，胺反应试剂例如亲水部分例如聚乙二醇的羧酸或醛的活性酯(琥珀酰亚胺基、酐等)。
按照一个实施方案，提供包含任何本文所公开的新的单链胰岛素类似物和药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂的药物组合物，优选所述单链胰岛素类似物的纯度水平为至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。这类组合物可含有本文公开的单链胰岛素类似物，其浓度为至少0.5 mg/ml、1 mg/ml、2 mg/ml、3 mg/ml、4 mg/ml、5 mg/ml、6mg/ml、7 mg/ml、8 mg/ml、9 mg/ml、10 mg/ml、11 mg/ml、12 mg/ml、13 mg/ml、14 mg/ml、15mg/ml、16 mg/ml、17 mg/ml、18 mg/ml、19 mg/ml、20 mg/ml、21 mg/ml、22 mg/ml、23 mg/ml、24 mg/ml、25 mg/ml或更高。在一个实施方案中，药物组合物包含已灭菌的水溶液，任选装在各种包装容器中保存。在其它实施方案中，药物组合物包含冻干粉。可将药物组合物进一步包装作为包括将组合物给予患者的一次性装置的药盒的组成部分。可对容器或药盒作标记用于保存在周围的室温下或在冰冻温度下。
在一个实施方案中，提供包含第一和第二单链胰岛素类似物前药衍生物的混合物的组合物，其中第一和第二单链胰岛素类似物前药衍生物根据前药元件结构而彼此不同。更具体地讲，第一单链胰岛素类似物前药衍生物可包含半寿期大大不同于第二单链胰岛素类似物前药衍生物的二肽前药元件的半寿期的二肽前药元件。因此，选择二肽元件的取代基的不同组合可允许制备这样的组合物，其包含在所需时限内和以特定的时间间隔以受控方式激活的单链胰岛素类似物前药衍生物的混合物。例如，可配制组合物以在餐时释放活性单链胰岛素类似物肽，接着是随后在夜间根据活化时间释放合适剂量的活化单链胰岛素类似物肽。
在另一个实施方案中，药物组合物包含本文公开的单链胰岛素类似物前药衍生物和天然胰岛素或胰岛素的已知生物活性类似物的混合物。在一个实施方案中，混合物可呈连接单链胰岛素类似物和天然胰岛素或胰岛素的已知生物活性类似物的异源双链形式。二聚体可包含与另一个单链胰岛素类似物连接或与二硫键连接A链与B链的胰岛素异源双链连接的单链胰岛素类似物肽。混合物可包含单链胰岛素类似物、天然胰岛素或胰岛素的已知生物活性类似物的一种或多种，呈其本文公开的前药衍生物或其贮库衍生物或其它缀合物形式及其任何组合。
所公开的单链胰岛素类似物及其相应的前药衍生物被视为适于之前描述的有关胰岛素肽的任何用途。因此，本文所述单链胰岛素类似物及其相应的前药衍生物可用于治疗高血糖症，或治疗因高血糖水平产生的其它代谢病。因此，本发明包括包含本文公开的单链胰岛素类似物或其前药衍生物和药学上可接受的载体的药物组合物用于治疗患有高血糖水平的患者。按照一个实施方案，待使用本文所公开的单链胰岛素类似物治疗的患者是驯养动物，而在另一个实施方案中，待治疗的患者是人。
按照本公开内容治疗高血糖症的一种方法包括采用任何标准给药途径将本文公开的单链胰岛素类似物或其贮库制剂或前药衍生物给予患者的步骤，给药途径包括胃肠外，例如静脉内、腹膜内、皮下或肌内、鞘内、透皮、直肠、口服、经鼻或通过吸入。在一个实施方案中，皮下或肌内给予组合物。在一个实施方案中，胃肠外给予组合物，且将单链胰岛素类似物或其前药衍生物预包装在注射器中。
本文公开的单链胰岛素类似物及其贮库制剂或前药衍生物可单独给予或与其它抗糖尿病药组合给予。本领域已知的或在研究中的抗糖尿病药包括天然胰岛素、天然胰高血糖素及其功能类似物；磺酰脲类，例如甲苯磺丁脲(Orinase)、醋磺己脲(Dymelor)、妥拉磺脲(Tolinase)、氯磺丙脲(Diabinese)、格列吡嗪(Glucotrol)、格列本脲(Diabeta、Micronase、Glynase)、格列美脲(Amaryl)或格列齐特(Diamicron)；美格列奈类，例如瑞格列奈(Prandin)或那格列奈(Starlix)；双胍类例如二甲双胍(Glucophage)或苯乙双胍；噻唑烷二酮类例如罗格列酮(Avandia)、吡格列酮(Actos)或曲格列酮(Rezulin)或其它PPARγ抑制剂；抑制糖消化的α葡糖苷酶抑制剂，例如米格列醇(Glyset)、阿卡波糖(Precose/Glucobay)；艾塞那肽(Byetta)或普兰林肽；二肽基肽酶-4 (DP对-4)抑制剂例如维格列汀或西格列汀；SGLT (依赖于钠的葡萄糖转运蛋白1)抑制剂；或FBPase (果糖1,6-二磷酸酶)抑制剂。
可采用本领域技术人员已知的标准药学上可接受的载体和给药途径，配制包含本文公开的单链胰岛素类似物或其贮库制剂或前药衍生物的药物组合物，并给予患者。因此，本公开内容还包括包含一种或多种本文所公开的单链胰岛素类似物(或其前药衍生物)或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体的药物组合物。在一个实施方案中，药物组合物包含在磷酸缓冲系统中pH为约4.0-约7.0、浓度为1mg/ml的单链胰岛素类似物。药物组合物可包含单链胰岛素类似物作为唯一的药物活性成分，或单链胰岛素类似物肽可与一种或多种其它活性剂组合。
本文描述的所有治疗方法、药物组合物、药盒及其它类似实施方案包括单链胰岛素类似物肽或其前药衍生物，包括其所有药学上可接受的盐。
在一个实施方案中，提供具有用于将单链胰岛素类似物组合物给予患者的装置的药盒。药盒还可包括不同的容器，例如小瓶、管、瓶等。优选药盒还可包括使用说明书。按照一个实施方案，药盒的装置是气雾剂分散装置，其中将组合物预先包装在气雾剂装置内。在另一个实施方案中，药盒包括注射器和针，而在一个实施方案中，将单链胰岛素类似物组合物预先包装在注射器中。
本发明的化合物可通过标准合成方法、重组DNA技术、制备肽和融合蛋白的任何其它方法制备。虽然某些非天然氨基酸无法通过标准重组DNA技术表达，但是其制备的技术是本领域已知的。适用时，除标准肽化学反应以外，包括非肽部分的本发明化合物还可通过标准有机化学反应合成。
实施例1
胰岛素A链和B链的合成
采用Boc化学，在4-甲基二苯甲基胺(MBHA)树脂或4-羟基甲基-苯基乙酰氨基甲基(PAM)树脂上合成胰岛素A链和B链。使用HF/对甲酚95:5在0℃下达1小时，将肽从树脂上切割下来。在除去HF且进行醚沉淀后，将肽溶于50%乙酸水溶液，并冻干。或者，采用Fmoc化学合成肽。使用三氟乙酸(TFA)/三异丙基甲硅烷(TIS)/H2O (95:2.5:2.5)在室温下达2小时，将肽从树脂切割下来。通过加入过量的乙醚使肽沉淀，使沉淀在酸性缓冲水溶液中溶解。通过RP-HPLC监测肽的品质，并通过质谱法(ESI或MALDI)证实。
合成在氨基酸7处具有单个游离半胱氨酸，且所有其它半胱氨酸均被保护成为乙酰氨基甲基A-(SH)7(Acm)6,11,20的胰岛素A链。合成在7位具有单个游离半胱氨酸，且另一个半胱氨酸被保护成为乙酰氨基甲基B-(SH)7(Acm)19的胰岛素B链。粗制肽通过常规RP-HPLC纯化。
按照图1所示通用方法，将合成的A链和B链通过其天然二硫键连接彼此连接。相应的B链通过DMF或DMSO中溶解被激活成Cys7-Npys类似物，并在室温下以1:1摩尔比率与2,2’-二巯基双(5-硝基吡啶) (Npys)反应。通过RP-HPLC监测活化，通过ESI-MS证实产物。
通过相应的A-(SH)7(Acm)6,11,20和B-(Npys)7(Acm)19以1:1摩尔比率溶解成10 mg/ml总肽浓度形成第一个B7-A7二硫键。在链结合反应完成时，将混合物稀释成50%乙酸水溶液的浓度。通过加入碘同时形成最后2个二硫键。将40倍摩尔浓度过量的碘加入溶液中，将混合物在室温下再搅拌1小时。通过加入抗坏血酸水溶液终止反应。混合物通过RP-HPLC纯化，通过MALDI-MS证实最终的化合物。如图2和表1中的数据所示，对于胰岛素受体结合，按照该方法制备的合成胰岛素完全比得上纯化的胰岛素。
可采用允许非编码氨基酸掺入蛋白质中的系统，包括例如美国专利号7,045,337和7,083,970教导的系统，来体内合成包含修饰氨基酸(例如A19位的4-氨基苯丙氨酸)的胰岛素肽。
表1：合成胰岛素相对于天然胰岛素的活性
实施例2
胺基(N端和赖氨酸)通过还原性烷基化的聚乙二醇化
a. 合成
将摩尔比率1:2:30的胰岛素(或胰岛素类似物)、mPEG20k-甲醛(Aldyhyde)和NaBH3CN溶于pH 4.1-4.4的乙酸缓冲液中。反应溶液由0.1 N NaCl、0.2 N乙酸和0.1 NNa2CO3组成。胰岛素肽浓度为约0.5 mg/ml。反应在室温下进行6小时。通过RP-HPLC监测反应程度，反应的收率约为50%。
b. 纯化
将反应混合物用0.1% TFA稀释2-5倍，并加到制备型RP-HPLC柱。HPLC条件：C4柱；流速10 ml/分钟；A缓冲液：10% ACN和0.1% TFA的水溶液；B缓冲液：含0.1% TFA的CAN溶液；线性梯度B% 0-40% (0-80分钟)；PEG-胰岛素或类似物以约35%缓冲液B洗脱。在通过硫酸解(sulftolysis)或胰蛋白酶降解进行化学修饰后，通过MALDI-TOF证实所需化合物。
胺基(N端和赖氨酸)通过N-羟基琥珀酰亚胺酰化的聚乙二醇化。
a. 合成
将胰岛素(或胰岛素类似物)连同mPEG20k-NHS一起以1:1的摩尔比率溶于0.1 NN-二(羟乙基)甘氨酸缓冲液(pH 8.0)中。胰岛素肽浓度约为0.5 mg/ml。通过HPLC监测反应进程。在室温下2小时后反应收率为约90%。
b. 纯化
将反应混合物稀释2-5倍，并加载到RP-HPLC中。
HPLC条件：C4柱；流速10 ml/分钟；A缓冲液：含10% ACN和0.1% TFA的水溶液；B缓冲液：含0.1% TFA的ACN溶液；线性梯度B% 0-40% (0-80分钟)；以约35% B收集PEG-胰岛素或类似物。在通过硫酸解或胰蛋白酶降解进行化学修饰后，通过MALDI-TOF证实所需化合物。
苯丙氨酸芳族环上乙酰基的还原胺化聚乙二醇化
a. 合成
将胰岛素(或胰岛素类似物)、mPEG20k-酰肼和NaBH3CN以1:2:20的摩尔比率溶于乙酸缓冲液(pH 4.1-4.4)中。反应溶液由0.1 N NaCl、0.2 N乙酸和0.1 N Na2CO3组成。胰岛素或胰岛素类似物浓度约为0.5 mg/ml。在室温下达24小时。反应过程通过HPLC监测。反应物的转化约为50%。(通过HPLC计算)
b. 纯化
将反应混合物稀释2-5倍，并加载到RP-HPLC中。
HPLC条件：C4柱；流速10 ml/分钟；A缓冲液：含10% ACN和0.1% TFA的水溶液；B缓冲液：含0.1% TFA的ACN溶液；线性梯度B% 0-40% (0-80分钟)；以约35%B收集PEG-胰岛素或PEG-胰岛素类似物。在通过硫酸解或胰蛋白酶降解进行化学修饰后，通过MALDI-TOF验证所需化合物。
实施例3
胰岛素受体结合测定法：
在竞争结合测定法中，利用闪烁亲近技术，测量各种肽对胰岛素或IGF-1受体的亲和力。在Tris-Cl缓冲液(0.05 M Tris-HCl，pH 7.5、0.15 M NaCl、0.1% w/v牛血清白蛋白)中对肽进行系列3倍稀释，并在96孔板(Corning Inc.，Acton，Ma)中与0.05 nM (3-[125I]-碘酪氨酰) A TyrA14胰岛素或(3-[125I]-碘酪氨酰) IGF-1 (Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)混合。各孔中存在1-6微克等分量的由过量表达人胰岛素或IGF-1受体的细胞制备的血浆膜碎片，加入0.25 mg/孔聚乙烯亚胺处理的麦芽凝集素A型闪烁亲近测定珠粒(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)。在800 rpm下振荡5分钟后，将板在室温下温育12小时，用MicroΒ1450液体闪烁计数器(Perkin-Elmer，Wellesley，MA)测量放射活性。用是试验样品最高浓度4倍的浓度过量的“不带放射性的”天然配体，测量各孔的非特异性结合的(NSB)放射活性。在不含竞争剂的孔中检测总的结合放射活性。如下计算百分比特异性结合：%特异性结合= (结合的-NSB/总的结合的-NSB) X 100。通过应用Origin软件(OriginLab，Northampton，MA)，确定IC50值。
实施例4
胰岛素受体磷酸化测定法：
为了测量胰岛素或胰岛素类似物的受体磷酸化，将受体转染的HEK293细胞铺板于96孔组织培养板(Costar #3596，Cambridge，MA)，在补充了100 IU/ml青霉素、100 μg/ml链霉素、10 mM HEPES和0.25%牛生长血清(HyClone SH30541，Logan，UT)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中在37℃，5% CO2和90%湿度下培养16-20小时。在补充了0.5%牛血清白蛋白(Roche Applied Science #100350，Indianapolis，IN)的DMEM中制备系列稀释的胰岛素或胰岛素类似物，加到具有贴壁细胞的孔中。在37℃下在具有5% CO2的潮湿环境中温育15分钟后，在室温下将细胞用5%低聚甲醛固定20分钟，磷酸缓冲盐水(pH 7.4)洗涤2次，用含2%牛血清白蛋白的PBS封闭1小时。然后将板洗涤3次，装入按照生产商的建议在含2%牛血清白蛋白的PBS中复溶的辣根过氧化物酶缀合的抗磷酸酪氨酸抗体(Upstatebiotechnology #16-105，Temecula，CA)。在室温下温育3小时后，将板洗涤4次，将0.1 mlTMB单一溶液底物(Invitrogen，#00-2023，Carlbad，CA)加入各孔中。5分钟后，通过加入0.05 ml 1 N HCl终止显色。在Titertek Multiscan MCC340 (ThermoFisher，Pittsburgh，PA)上测量450 nm处的吸光度。绘制吸光度对肽浓度的剂量反应曲线，通过应用Origin软件(OriginLab，Northampton，MA)确定EC50值。
实施例5
模式二肽切割速率的确定(PBS中)
特异性六肽(HSRGTF-NH2；SEQ ID NO: 156)用作模式肽，可对其进行二肽N端突出端切割速率的研究。制备二肽延伸的模式肽，将Boc保护的肌氨酸和赖氨酸依次加入模式肽结合的树脂以产生肽A (Lys-Sar-HSRGTF-NH2；SEQ ID NO: 157)。通过HF切割肽A，并通过制备型HPLC纯化
使用HPLC的制备型纯化
采用基于二氧化硅的1X 25 cm Vydac C18 (5 μ粒径，300 A°孔径大小)柱上的HPLC分析进行纯化。所用仪器为：Waters Associates 600型泵，注射器717型，UV检测器486型。所有样品使用230 nm的波长。溶剂A含有10% CH3CN /0.1% TFA在蒸馏水中，溶剂B含有0.1% TFA在CH3CN中。使用线性梯度(0-100% B，2小时内)。流速为10 ml/分钟，流分大小为4ml。自约150 mg的粗制肽，得到30 mg纯肽。
将肽A以1 mg/ml的浓度溶于PBS缓冲液中。将该溶液在37℃下温育。在5小时、8小时、24小时、31小时和47小时收集样品用于分析。用等体积的0.1% TFA降低pH使二肽切割猝灭。通过LC-MS定性监测切割速率，通过HPLC进行定量研究。应用Peak SimpleChromatography软件，定量测定前药和母体模式肽的保留时间和相对峰面积。
使用质谱法的分析
采用具有标准ESI离子源的Sciex API-III电喷雾四极质谱仪，获得质谱。采用的电离条件如下：阳离子模式的ESI；离子喷雾电压，3.9 kV；喷孔电压(orifice potential)，60 V。所用喷雾气体和幕气为流速0.9 L/分钟的氮气。以0.5Th/步进和2 msec停留时间，从600-1800 Thompsons记录质谱。将样品(约1mg/mL)溶于含1%乙酸的50%乙腈水溶液中，通过外部注射器泵以5 μL/分钟的速率导入。分析前，按照生产商提供的说明书(MilliporeCorporation，Billerica，MA)，使用含有0.6 µL C4树脂的ZipTip固相提取触头(extraction tip)，使溶解于PBS的肽脱盐。
采用HPLC的分析
采用配备214 nm的UV检测器和150 mmX 4.6 mm C8 Vydac柱的Beckman SystemGold Chromatography系统，进行HPLC分析。流速为1 ml/分钟。溶剂A含有0.1% TFA在蒸馏水中，溶剂B含有0.1% TFA在90% CH3CN中。采用线性梯度(0%-30%B，10分钟内)。收集数据，并应用Peak Simple Chromatography软件进行分析。
测定各个前肽的切割速率。通过其各自的峰面积确定前肽和模式母体肽的浓度。通过对不同时间间隔的前药浓度的对数作图，确定前药的一级解离速率常数。该图的斜率提供速率常数‘k’。应用式t1/2 = .693/k，计算各种前药的切割的半寿期。确定该模式肽HSRGTF-NH2 (SEQ ID NO: 156)的Lys-Sar突出端的半寿期为14.0小时。
实施例6
用全d-同种型模式肽测定的血浆中二肽切割半寿期的速率
使用其它的模式六肽(dHdTdRGdTdF-NH2 SEQ ID NO: 158)测定血浆中二肽切割的速率。使用各个氨基酸的d-异构体以防止前药突出端以外的模式肽被酶促切割。这种模式d-异构体六肽以类似于l-异构体的方式合成。如之前对肽A的报告一样，将肌氨酸和赖氨酸依次加入N端以制备肽B (dLys-dSar-dHdTdRGdTdF-NH2 SEQ ID NO: 159)。
确定各个前肽的切割速率。通过其各自的峰面积求出前肽和模式母体肽的浓度。通过对不同时间间隔的前药浓度的对数作图，确定前药的一级解离速率常数。该图的斜率提供速率常数‘k’。确定该模式肽dHdTdRGdTdF-NH2 (SEQ ID NO: 158)的Lys-Sar突出端的半寿期为18.6小时。
实施例7
采用实施例5描述的方法测定与模式六肽(HSRGTF-NH2；SEQ ID NO: 156)连接的其它二肽的切割速率。这些实验中产生的结果见表2和3。
表2：PBS中与N端对氨基-Phe侧链连接的二肽U-B自模式六肽(HSRGTF-NH2；SEQ IDNO: 156)的切割
表3：PBS中与1 (X)位的组氨酸(或组氨酸类似物)连接的二肽U-B自模式六肽(XSRGTF-NH2；SEQ ID NO: 160)的切割
NH2-U-B-XSRGTF-NH2 (SEQ ID NO: 160)2 2
化合物 U (氨基酸) O (氨基酸) X (氨基酸) t ½
1 F P H 无切割
2 羟基-F P H 无切割
3 G P H 无切割
4 羟基-G P H 无切割
5 A P H 无切割
6 C P H 无切割
7 S P H 无切割
8 P P H 无切割
9 K P H 无切割
10 E P H 无切割
11 脱氢V P H 无切割
12 P d-P H 无切割
13 d-P P H 无切割
14 Aib P H 32小时
15 Aib d-P H 20小时
16 Aib P d-H 16小时
17 环己基- P H 5小时
18 环丙基- P H 10小时
19 N-Me-Aib P H >500小时
20 α,α-二乙基-Gly P H 46小时
21 羟基-Aib P H 61
22 Aib P A 58
23 Aib P N-甲基-His 30小时
24 Aib N-甲基-Gly H 49分钟
25 Aib N-己基-Gly H 10分钟
26 Aib 氮杂环丁烷-2-羧酸 H >500小时
27 G N-甲基-Gly H 104小时
28 羟基-G N-甲基-Gly H 149小时
29 G N-己基-Gly H 70小时
30 dK N-甲基-Gly H 27小时
31 dK N-甲基-Ala H 14小时
32 dK N-甲基-Phe H 57小时
33 K N-甲基-Gly H 14小时
34 F N-甲基-Gly H 29小时
35 S N-甲基-Gly H 17小时
36 P N-甲基-Gly H 181小时
实施例8
具有适于前药构建的结构的胰岛素类似物的鉴定
已知A链的19位是胰岛素活性的重要位点。在该位点允许前药元件连接的修饰因此是所需要的。已合成有关A19位的胰岛素的特定类似物，并对其对胰岛素受体的活性进行了表征。已鉴定出有关A19的两种高活性结构类似物，其中在近似完全活性胰岛素类似物的鉴定中，第二活性部位芳族残基(B24)处类似的结构变化并不成功。
表4和表5表示A19位处对于对胰岛素受体的完全活性的高结构保守性(采用实施例3所述的测定法测定受体结合)。表4表明仅两种在A19具有修饰的胰岛素类似物具有类似于天然胰岛素的受体结合活性。对于4-氨基胰岛素类似物，提供了来自3个独立实验的数据。对同时进行的2个独立实验，标为“活性(测试中)”的一栏比较胰岛素类似物相对于天然胰岛素的结合百分比。标为“活性(0.60 nM)”的一栏是胰岛素类似物相对于采用该测定法获得的胰岛素结合的历史平均值的相对百分比结合。在任一分析中，两种A19胰岛素类似物(4-氨基苯丙氨酸和4-甲氧基苯丙氨酸)显示大致等于天然胰岛素的受体结合。图3表示天然胰岛素和A19胰岛素类似物与胰岛素受体的各自的特异性结合图。表5表示的数据显示，与天然胰岛素具有相当结合活性的两种A19胰岛素类似物(4-氨基和4-甲氧基)同样对胰岛素受体具有相当的活性(采用实施例4所述测定法测定受体活性)。
表4：A19胰岛素类似物的胰岛素受体结合活性
表5：A19胰岛素类似物的胰岛素受体磷酸化活性
实施例9
胰岛素样生长因子(IGF)类似物IGF1 (YB16LB17)
申请人已发现对胰岛素受体具有与天然胰岛素类似的活性的IGF类似物。更具体地讲，IGF类似物(IGF1 (YB16LB17))包含天然IGF A链(SEQ ID NO: 5)和修饰的B链(SEQ IDNO: 6)，其中天然IGF B链(SEQ ID NO: 3)的15和16位的天然谷氨酰胺和苯丙氨酸分别被酪氨酸和亮氨酸残基置换。如图4和下表6所示，IGF1 (YB16LB17)和天然胰岛素的结合活性表明各为胰岛素受体的高效力激动剂。
表6
实施例10
IGF前药类似物
根据A19胰岛素类似物(参见实施例5)的活性，对IGF1 A:B(YB16LB17)类似物进行类似修饰，并对其结合并刺激胰岛素受体活性的能力进行了研究。图6提供通用合成流程，用于制备IGF1 A:B(YB16LB17)，其中天然酪氨酸被4-氨基苯丙氨酸置换[IGF1 A:B(YB16LB17)(p-NH2-F)A19酰胺]；以及制备其二肽延伸类似物[IGF1 A:B(YB16LB17)A19-AibAla 酰胺]，其中包含Aib和Ala的二肽通过与A19 4-氨基苯丙氨酸的酰胺键与肽连接。如图7和表7所示，IGF类似物，IGF1 (YB16LB17) A(p-NH2-F)19与胰岛素受体特异性结合，其中该类似物的二肽延伸的类似物无法特异性结合胰岛素受体。注意，二肽突出端缺乏允许二肽自发切割的适当结构(在二肽的第二位上不存在N-烷基化氨基酸)，因此无法恢复胰岛素受体结合。
还可采用允许非编码氨基酸掺入蛋白质中的系统，包括例如美国专利号7,045,337和7,083,970中教导的系统，体内合成包含修饰氨基酸(例如A19位的4-氨基苯丙氨酸)的IGF A:B(YB16LB17)胰岛素类似物肽。
表7
制备了IGFB16B17类似物肽的其它前药类似物，其中二肽前药元件(丙氨酸-脯氨酸)通过酰胺键与A链的氨基端连接(IGF1(YB16LB17) (AlaPro)A-1,0)。如表8所示，IGF1(YB16LB17)(AlaPro)A-1,0对胰岛素受体的亲和力降低。注意，根据表3的数据，二肽前药元件缺乏允许二肽前药元件自发切割的适当结构，因此检测到的胰岛素受体结合不是前药元件切割的结果。
表8
实施例11
其它IGF胰岛素类似物。
IGF1 (YB16LB17)肽序列的进一步修饰揭示在其对胰岛素和IGF-1受体的效力方面有改变的其它IGF胰岛素类似物。表9提供了这些类似物每一种的结合数据(采用实施例3的测定法)，其中修饰的位置根据在天然胰岛素肽中的相应位置标示(DPI = des B26-30)。例如，本文没有任何更多说明提及的“B28位”可意指SEQ ID NO: 2的第1个氨基酸缺失的胰岛素类似物B链的相应的B27位。因此一般提及“B(Y16)”是指天然IGF-1序列(SEQ ID NO: 3)B链15位的酪氨酸残基的取代。表9中提供了有关胰岛素和IGF类似物的相对受体结合的数据，表10中提供了有关IGF类似物刺激的磷酸化的数据(采用实施例4中的测定法)。
实施例12
IGF1二肽延伸的(p-NH2-F)A19酰胺类似物的二肽半寿期
测量了(pNH2-Phe)酰胺连接的二肽AibPro自各种IGF-1肽上的切割，以测定肽序列或异源双链对二肽切割的影响。表12表示受测肽的结果，数据显示仅IGF1-A链表示用于研究IGF1 B:A (YB16LB17)肽的前药半寿期的良好模型。
表12
母体肽 半寿期(小时)
IGF1A(Ala)6,11,20(pNH2-Phe)A19 2.2
IGF1A(Acm)6,11,20(pNH2-Phe)A19 1.8
IGF1 B:A(S-S)A7,B7(Acm)A6,11,20,B19(pNH2-Phe)A19 1.8
IGF1 B:A(pNH2-Phe)A19 1.6
IGF A链的前药类似物相对于二硫化物结合的A链和B链构建体(IGF1 A:B(YB16LB17))的比较显示，两种化合物具有前药形式的类似半寿期。AibAla类似物不切割，因此不是前药，但用来表示修饰可使胰岛素类似物IGF1 A:B(YB16LB17)(p-NH2-F)A19酰胺失活。因此，确定了仅IGF1A链是用于研究有关IGF1 B:A (YB16LB17)类似物肽的前药半寿期的良好模型。AibAla类似物不切割，因此不是前药，但用来显示修饰可使胰岛素类似物IGF1 A:B(YB16LB17)(p-NH2-F)A19酰胺失活。为简要起见，仅使用在B链不存在情况下的IGF1 A链测定前药半寿期。按实施例5中所述测定各个前肽的半寿期。表13中给出了数据：
表13：IGF1二肽延伸的(p-NH2-F)A19酰胺类似物的二肽半寿期
数据表明，通过改变二肽前药元件上的取代基，前药的半寿期可在2小时到>100小时间变化。
使用IGF1-A(pNH2-F)19基础肽，并改变通过A19位的4-氨基苯丙氨酸连接的二肽前药元件的氨基酸组成，来制备其它的前药类似物肽。在PBS和在20%血浆/PBS (即在血清酶存在时)两者中测量不同构建体的二肽半寿期。表14中给出了结果。结果表明，4种所测肽中的3种不受血清酶影响。
表14：IGF1-A(pNH2-F)19的二肽半寿期
实施例13
IGFB16B17类似物肽随时间推移的受体结合
制备IGFB16B17类似物肽的前药制剂，并采用实施例3的胰岛素受体结合测定法测量其时间推移的降解。如下制备用于该测定法中使用的肽：
二肽-IGF1A类似物
如无规定，则将Boc化学应用于所设计的肽类似物的合成。将所选择的二肽H2N-AA1-AA2-COOH加入IGF1A (Ala)6,7,11,20的(pNH2-Phe)19上。在MBHA树脂上合成IGF-1 A链C端三肽Boc(Fmoc-pNH-Phe)-Ala-Ala。通过用20%哌啶/DMF在室温下处理30分钟除去Fmoc，通过使用3倍过量的氨基酸、PyBop、DIEA和催化量的吡啶，使Fmoc-AA2与A19位的对氨基苄基侧链偶联。其余IGF-1 A链(Ala)6,7,11,20序列的Boc-合成采用Applied Biosystems 430A肽合成仪完成，得到IGF-1 A链(Boc)0(Ala)6,7,11,20(Fmoc-AA2-pNH-Phe)19-MBHA。在从AA2的N端除去Fmoc基团后，使用3倍过量的氨基酸、DEPBT和DIEA使Boc-AA1与胺偶联。通过TFA除去余留在A链上的2个Boc基团，接着HF切割，得到IGF-1 A链(Ala)6,7,11,20(H2N-AA1-AA2-pNH-Phe)19酰胺。在AA1是d-赖氨酸的情况下，进行ε-胺的乙酰化后除去Boc。通过半制备型RP-HPLC纯化二肽-IGF-1 A链类似物，并通过分析型RP-HPLC和MALDI质谱法表征。
二肽-IGF-1 (YL)类似物
按照在上文中的描述，将所选择的二肽H2N-AA1-AA2-COOH加到IGF-1 A链(Acm)6,11,20的(pNH2-Phe)19上，不同的是使用PAM树脂合成IGF-1 A链，以在HF-切割时得到C端酸。在MBHA树脂上合成IGF-1 B链(YB16LB17)(Acm)19，得到C端酰胺。通过在100% DMSO中与DTNP以1:1摩尔比率反应，用Npys修饰CysB7上的游离巯基。采用流程1所示“1+2”两步链结合策略，对经纯化的二肽-IGF-1 A链和IGF-1 B链(YB16LB17)类似物进行装配。在半制备型RP-HPLC中进行中间和最终的纯化，并通过分析型RP-HPLC和MALDI质谱法表征。
将IGFB16B17类似物肽前药在PBS (pH 7.4)中在37℃下温育，在预定的时间间隔取出等分量，用0.1% TFA猝灭进一步的降解，对等分量进行分析型HPLC分析。用LC-MS鉴定代表IGFB16B17类似物肽的前药和活性形式的峰a和峰b，并通过HPLC峰面积的积分量化。图9A-9C表示IGFB16B17类似物肽前药：IGF1A(Ala)6,7,11,20(Aib-Pro-pNH-F)19降解的HPLC分析输出。在开始温育PBS中的前药后20分钟(图9a)、81分钟(图9B)和120分钟(图9C)时取等分量。数据表明，IGF1A(Ala)6,7,11,20(Aib-Pro-pNH-F)19酰胺随时间推移自发地、非酶促地转化为IGF1A(Ala)6,7,11,20(pNH2-F)1酰胺。
还根据采用实施例3的体外测定法测量的化合物与胰岛素受体结合的能力，测量了IGFB16B17类似物肽的前药形式降解成其活性形式。图10A和10B是描述前药Aib,dPro-IGF1YL (通过A19 4-氨基Phe连接的二肽)的体外活性的曲线图。图10A是比较在PBS中温育的天然胰岛素(在4℃下在1小时时测量)和A19 IGF前药衍生物(Aib,dPro-IGF1YL)随时间推移(0小时、2.5小时和10.6小时)的相对胰岛素受体结合的曲线图。图10B是比较在20%血浆/PBS中于37℃温育的天然胰岛素和A19 IGF前药衍生物(Aib,dPro-IGF1YL)随时间推移(0小时、1.5小时和24.8小时)的相对胰岛素受体结合的曲线图。曲线图中提供的数据表明，随着前药形式转化成活性IGF1YL肽，自A19 IGF前药衍生物样品恢复的活性提高。测量了IGFB16B17类似物肽相对于胰岛素受体结合的活性，由于基本IGFB16B17类似物肽具有比天然胰岛素大的活性，相对于胰岛素，大于100%的活性是可能的。
图11A和11B是描述前药dK,(N-异丁基G)-IGF1YL (通过A19 4-氨基Phe连接的二肽)的体外活性的曲线图。图11A是比较在PBS中温育的天然胰岛素(在4℃下在1小时时测量)和A19 IGF前药衍生物(IGF1YL：dK,(N-异丁基G)随时间推移(0小时、5小时和52小时)的相对胰岛素受体结合的曲线图。图11B是比较在20%血浆/PBS中于37℃温育的天然胰岛素和A19 IGF前药衍生物(IGF1YL：dK,(N-异丁基G)随时间推移(0小时、3.6小时和24.8小时)的相对胰岛素受体结合的曲线图。曲线图中提供的数据表明，随着前药形式转化成活性IGF1YL肽，自A19 IGF前药衍生物样品恢复的活性提高。
图12A和12B是描述前药dK(e-乙酰基),Sar)-IGF1YL (通过A19 4-氨基Phe连接的二肽)的体外活性的曲线图。图12A是比较在PBS中温育的天然胰岛素(在4℃下在1小时时测量)和A19 IGF前药衍生物(IGF1YL：dK(e-乙酰基),Sar)随时间推移(0小时，7.2小时和91.6小时)的相对胰岛素受体结合的曲线图。图12B是比较在20%血浆/PBS中于37℃温育的天然胰岛素和A19 IGF前药衍生物(IGF1YL：dK(e-乙酰基),Sar)随时间推移(0小时、9小时和95小时)的相对胰岛素受体结合的曲线图。曲线图中提供的数据表明，随着前药形式转化成活性IGF1YL肽，自A19 IGF前药衍生物样品恢复的活性提高。
实施例14
单链胰岛素类似物的生物合成和纯化
将包含通过IGF-I C链连接的天然胰岛素B链和A链的胰岛素-IGF-I (B0-C1-A0)小基因克隆至表达载体pGAPZα A (购自Invitrogen)中，处在用于重组蛋白质在酵母巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中组成型表达和纯化的GAP启动子(甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的启动子)控制下。将小基因与编码N端肽的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae) α-交配因子前导信号融合，所述前导信号用于将重组蛋白质分泌到培养基中。使用小基因和前导α-交配因子序列之间的Kex2切割位点切割用于分泌具有天然氨基端的小基因的前导序列。在B0C1A0小基因的1 (G1a)、2 (Y2a)、3 (G3a)、4 (S4a)、5 (S5a)、6(S6a)、7 (R7a)、8 (R8a)、10 (P10a)、11 (Q11a)和12 (T12a)位将单一位点丙氨酸突变引入C肽中。
包括B0C1A0的小基因、11个丙氨酸突变体和其它选择的衍生物通过电穿孔转化至酵母巴斯德毕赤酵母中。在极限甲醇平板(minimal methanol plate)中选出阳性转化子，进行各毕赤酵母分离株的基因组制备，通过PCR证实构建体整合至酵母基因组中。在琼脂糖DNA凝胶上观察833碱基对PCR产物。通过相应酵母系的发酵来产生胰岛素类似物。在500 mlBeckman离心管中通过在5 K下离心20分钟使酵母细胞沉淀，保留培养基用于随后的蛋白质纯化。
将生长培养基上清液通过0.2 μm Millipore滤器过滤。将乙腈(ACN)加入上清液中至20%的最终体积。上清液经得自Sigma的用20% ACN水溶液预平衡的AmberliteXAD7HP树脂纯化。树脂然后用30 ml 20% ACN水溶液漂洗2次，用含有0.1% TFA的30% ACN水溶液除去污染物。部分纯化的胰岛素类似物用含有0.1% TFA的54% ACN水溶液从柱上洗脱，并冻干。将冻干样品重新悬浮于0.025M NH3HCO3 pH 8中，并在Luna C18柱(10 μm粒径，300A°孔径)上纯化。使用20-60% ACN水溶液的线性梯度将蛋白质从柱上洗脱。合并MALDI-MS阳性流分，并转移至一次性闪烁管中用于后继冻干。然后将冻干样品重新悬浮于含有0.1% TFA的20%ACN水溶液中，并在Luna C18柱(10 μm粒径，300A°孔径)上纯化。使用含0.1% TFA的18-54%ACN水溶液的线性梯度从柱中洗脱蛋白质。在吸光度280 nm处监测蛋白质洗脱。通过C8分析柱对MALDI-TOF MS阳性流分进行分析以确保纯度。
图15表示单链胰岛素类似物的效力。B0-C1-A0类似物显示对胰岛素受体同种型和IGF-1受体两者同样有效的效力。2位的酪氨酸突变为丙氨酸或通过缺失C9-12使C肽缩短至8个氨基酸提供通过显著降低IGF-1受体活性而选择性提高胰岛素作用的特异性。另参见表15A和15B给出的数据：
表15A
表15B
图16表明C肽中2和3位对IGF-1受体的修饰最敏感，其中胰岛素受体证实相对不受修饰影响。最后，图17和图18将单链胰岛素突变体的体外分析表示为结合亲和力(IC50)和通过酪氨酸磷酸化的生物化学信号转导(EC50)的比率。两个独立的测量显示极其一致，从而证实了这种结构功能分析的体外方法。所有类似物保持单一单位纳摩尔活性，某些特异性类似物证明效力略有提高(低的单一单位纳摩尔)。大多数胰岛素选择性类似物是我们缺失最后4个C肽残基、在C肽2位具有丙氨酸突变或两种改变的组合的类似物。
实施例15
通过Mini-Peg连接的单链胰岛素类似物的合成和表征。
采用两步天然链连接方法，通过固相合成制备一系列单链胰岛素类似物。初始肽为线性构建体，其中N端自CysB19开始，持续直到具有短的线性乙二醇聚合物的AsnA21，乙二醇聚合物用作最后的B链氨基酸C端与A链第一个氨基酸(通常为甘氨酸)的N端的连接。B链的N端(其通常始于最终胰岛素类似物的第一个N端氨基酸，终于B链的氨基酸18，通常为缬氨酸)与单条线性肽进行片段偶联。一旦通过巯基辅助的天然链连接进行偶联，便将该肽通过层析法纯化，转化成正确的二硫化物异构体，并再次通过高效层析法纯化。通过HPLC和MS分析，对所有胰岛素类似物的纯度进行分析。
图19提供合成设计示意图以及使用PEG8作为接头的单个实例。应用相同方法合成较短或较长长度的类似物以及通过使用不止一个以线性方式共价连接的mini-peg作为酰胺所获得的可变长度的类似物。
图20-24提供通过研究在特定位置上经规定长度的mini-peg连接的单链胰岛素类似物所获得的体外实验结果。图20表示使用4、8或16个乙二醇单元的minipeg得到的相对于天然激素活性小于5%的弱效力胰岛素类似物，通过结合或生物化学信号转导测量。与我们之前观察到的其中使用长度变化为8-12个氨基酸的肽将B链的C端与A链的N端偶联的单链胰岛素类似物的效力相比，这些结果不太使人印象深刻(参见图14-18)。
表16和图21表明当使用相同大小的mini-peg接头将缩短的B链的C端与A链的N端偶联时，效力极大地提高。一旦与mini-peg偶联，des-V (缺失氨基酸B26-30)胰岛素类似物与天然激素有竞争性效力，相对于全长B链类似物增加超过10倍。
表16
mini-PEG连接的单链胰岛素类似物对胰岛素和IGF-1受体的磷酸化活性
图22表示两链异源双链天然胰岛素与其中A链和B链主要来源于胰岛素或IGF-1的单链胰岛素类似物的竞争性能。发现所述肽具有相当的生物活性。图23为具有主要基于IGF-1的序列但包括B16,17 YL改变以提高胰岛素受体活性的des-V形式的B链中使用peg-12接头的进一步分析。结果清楚表明，可通过使用A8位的组氨酸，获得极高效力的胰岛素类似物。残余的IGF-1受体活性略大于天然胰岛素。图24显示胰岛素受体活性与IGF-1受体活性有线性相关，这与用两链天然胰岛素结构进行的结构功能分析所知的关系类型一致。
图25显示胰岛素类似物被胰岛素-特异性降解酶(IDE)的切割极强，且在其中A链来源于天然胰岛素序列的胰岛素类似物中易检出。相比之下，其中A链来源于IGF-1的序列的类似物，似乎对蛋白酶解有极高的抗性。对稳定性提高可能产生高的促有丝分裂性的前景进行了研究，在图26中报告了结果。较高胰岛素效力的类似物与增殖增加似乎没有相关性。此外，对蛋白水解稳定性特别重要，对IDE有更大抗性的类似物似乎不具有任何更大的促有丝分裂潜力。
使用PEG链接头对单链类似物进行了比较分析，以测量不同大小的PEG连接部分如何影响对胰岛素和IGF-1受体的体外活性，所述休外活性由通过磷酸化的受体信号转导测量。图27提供的数据显示PEG12DesV构建体(其中B链的5个羧基端氨基酸已缺失)提供最有效力的化合物。
构建包含PEG12和单个氨基酸(甘氨酸或赖氨酸)作为连接部分的单链类似物，连接部分将DesV B链与天然胰岛素A链连接。单链peg/氨基酸连接的类似物对胰岛素和IGF-1受体的体外活性的比较分析显示，peg/氨基酸连接的类似物是有效力的胰岛素受体激动剂，由受体结合和通过磷酸化的受体信号转导测量体外活性(参见图28A)。同样地，将2个赖氨酸残基加至连接部分(单链peg/(赖氨酸)2连接的类似物)，产生有效力的单链peg/氨基酸连接的胰岛素受体激动剂(参见图28B)，由受体结合和通过磷酸化的受体信号转导测量。
图29A-E提供给予多种单链胰岛素类似物的小鼠的数据。图29A提供单链peg连接的类似物对胰岛素受体的活性的体外比较分析，由受体结合和通过磷酸化的受体信号转导测量。还通过将化合物给予小鼠测试了化合物的体内活性。在将肽给予正常小鼠前4小时撤掉食物，研究期间持续撤除。临在给予试验化合物前和给予后1、2、3、6和8、12、16、20和24小时测量葡萄糖。以10 ul/gm体重的体积皮下给予所有胰岛素类似物。图29B和29C提供在给予所列举的类似物后8小时内的血糖浓度数据。图29D和29E提供在给予所列举的类似物后有关血糖AUC值的数据。
小鼠中胰岛素耐量试验(ITT)期间的血糖分析显示，具有胰岛素序列或主要基于IGF-1的序列但包括B16,17 YL的B链的des-V形式中的peg-12接头产生与人胰岛素相当的结果。参见图27。因此与PEG连接部分连接的单链胰岛素在体内起作用。
实施例16
酰化胰岛素类似物
对小鼠进行了比较人胰岛素相对于于3种不同的酰化胰岛素类似物降低和保持低血糖浓度的能力的比较胰岛素耐量试验。对两种不同浓度(27 nmol/kg和90nmol/kg)的化合物进行了测试。酰化胰岛素包括MIU-41 (具有通过与位于A14位的赖氨酸残基连接的γ谷氨酸接头的C16酰化的两链胰岛素类似物)、MIU-36 (具有与B链的N端连接的C16酰化的两链胰岛素类似物)和MIU-37 (具有通过与位于B22位的赖氨酸残基连接的γ谷氨酸接头的C16酰化的两链胰岛素类似物)。与天然胰岛素相比，甚至在8小时后，所有3种酰化胰岛素类似物提供更基础和持续的降低的葡萄糖水平(参见图30A-30D)。
图31A-31D显示对小鼠进行的比较市售酰化胰岛素类似物(Detemir)与酰化两链胰岛素激动剂MIU-55的能力的比较胰岛素耐量试验的结果。MIU-55 [B1(H5,10,Y16,L17,C16rE-K22)25a:A1(N18,N21)]的B链C端5个氨基酸缺失，并通过位于Lys B29的ε-氨基上的γGlu接头被C14脂肪酸(肉豆蔻酸(myristoylic acid))酰化。结果表明，MIU-55的效力约为Detemir的1/3 (参见图31A和图31B)。数据表明胰岛素的酰化形式比非酰化形式较长时间地起作用，并且MIU-55虽然比Detemir较低效，但是具有与Detemir类似的特征。图31C和图31D提供在给予所列举的类似物后有关血糖AUC值的数据。胰岛素耐量试验中Detemir和MIU-49的比较显示类似的结果(参见图32A-32D。MIU-49 [B1(C16-rE0,H5,Aib9,H10,E13-K17,Y16)25a:A1(N18,N21)]是B链C端5个氨基酸缺失的且通过位于Gly B2的α-氨基的γGlu接头被C16脂肪酸酰化的两链胰岛素激动剂。同样，数据显示MIU-49的效力约为Detemir的1/3 (参见图32A和图32B，MIU-49虽然比Detemir较低效，但是具有与Detemir类似的特征。
实施例17
聚乙二醇化胰岛素类似物
制备了各种聚乙二醇化胰岛素类似物，并进行了体外测试。表17显示各个类似物相对于天然胰岛素的活性百分比。
表17. 聚乙二醇化IGF-1和胰岛素类似物
对小鼠进行的比较酰化胰岛素类似物Detemir相对于聚乙二醇化单链胰岛素类似物MIU-56：B1(H5,Y16,L17)25-PEG8-K-PEG4-A1(N18,21)的能力的比较胰岛素耐量试验。该单链类似物包含与连接A链和B链的连接部分(PEG8-K-PEG4)中单个赖氨酸残基的侧链连接的20 kDa PEG。如图33A-33D中所示，聚乙二醇化类似物具有持续作用时间达24小时，其起效是逐步的，足以在避免24小时内持续作用所需要的剂量下动物镇静。图33C和图33D显示分别给予Detemir和MIU-56的小鼠中的血糖AUC24小时。对于另一种聚乙二醇化单链胰岛素类似物MIU-57获得类似结果(参见图34A-34D)。MIU-57是包含与B链的N端胺连接的20 kDaPEG的胰岛素单链类似物(B1(H5,Y16,L17)25-C1-A1(N18,21)。图34A和图34B显示单链胰岛素类似物分别在连接部分处聚乙二醇化(MIU-56)或在B链N端胺处聚乙二醇化(MIU-57)的比较胰岛素剂量滴定结果。图34C和图34D表示分别给予MIU-56和MIU-57的小鼠中的血糖AUC24小时。数据表明这些类似物保持有效，并且相对于天然胰岛素治疗指数提高。MIU-56和MIU-57的比较胰岛素剂量滴定的结果显示，对于20 nmol/kg-80 nmol/kg的剂量范围，在小鼠中获得类似特征(参见图34E和图34F)。
制备包含通过20 kDa PEG链头-头连接的2个胰岛素单链类似物(B1(H5,Y16,L17)25-C1-A1(N18,21)的二聚体(MIU 58)。图34G-34J表示自使用C57/Blk小鼠对MIU-57和MIU-58的比较胰岛素耐量试验获得的结果。图34G和图34H是表示比较MIU-57和MIU-58的胰岛素耐量试验的曲线图。图34I和图34J分别表示给予MIU-57和MIU-58的小鼠的血糖AUC24小时。二聚体比母体化合物低效力，但仍有活性。
图35A和图35B提供来自2种聚乙二醇化天然胰岛素异二聚体的比较胰岛素剂量滴定的数据。类似物包含通过天然二硫键连接的两个天然胰岛素A链和B链序列，并经修饰以具有在B链的N端或在B29位连接的20 kDa PEG (具有A链和B链氨基甲酰化的氨基端)。数据表明，虽然这些化合物在其体外活性方面略有不同(参见表17)，但它们在小鼠中起类似的体内作用。与非聚乙二醇化天然胰岛素相比，两种化合物保持有效，并具有改进的治疗指数(缓慢起效、活性持续达24小时且反应相对平直)。
还构建了具有两个或更多个共价连接的聚乙二醇链的胰岛素类似物，并与具有与其N端连接的单条20 kDa PEG的天然胰岛素类似物进行了比较。更具体地讲，对具有在N端α胺上和在连接部分的氨基酸8 (C8位)上连接的2条PEG链(各10K)的单链胰岛素类似物(B1(H5,Y16,L17)25-C1(K8)-A1(N18,21))、具有在N端α胺上和在氨基酸B22上连接的2条PEG链(各10K)的单链胰岛素类似物(B1(H5,Y16,L17,K22)25-C1(K8)-A1(N18,21))和具有在N端α胺上和在氨基酸A14上连接的2条PEG链(各10K)的单链胰岛素类似物(B1(H5,Y16,L17)25-C1(K8)-A1(K14,N18,21))的活性进行了比较。图36A-36D提供3种聚乙二醇化胰岛素类似物相对于单一聚乙二醇化天然胰岛素衍生物的比较胰岛素剂量滴定的数据。体外活性急剧降低达至少10x。然而，虽然体内数据显示失去一些效力，但双重聚乙二醇化胰岛素类似物仍然有效(特别对于在连接部分上聚乙二醇化的类似物)。更具体地讲，在给药后至少长达8小时的血糖水平降低方面，80 nmol/kg的MIU-67大致相当于所给予的40 nmol/kg MIU-59。因此，可制备具有长度为10 kDa的两条PEG链的胰岛素类似物，其将提供与非聚乙二醇化胰岛素类似物相比改进的治疗指数。此外，在单链类似物连接部分处聚乙二醇化似乎是聚乙二醇化的优选位点。
给予糖尿病小鼠(db/db小鼠)聚乙二醇化胰岛素类似物以比较其对于市售胰岛素类似物的功效。具体地讲，将胰岛素类似物Levemir和优泌林与聚乙二醇化胰岛素类似物MIU-59 (具有与其N端连接的单条20 kDa PEG的天然胰岛素类似物)和MIU-66 (具有与其B链N端连接的单条20 kDa PEG且具有氨基甲酰化的A链的氨基端的天然胰岛素类似物)进行了比较。虽然体外数据(参见表17)表明MIU-66比MIU-59效力低得多，但是MIU-59和MIU-66在体内起类似的作用，且相对于Levemir和优泌林，两者都具有改进的活性(参见图37A和图37B)。
总之，胰岛素类似物的聚乙二醇化，不论使用基于胰岛素或基于IGF的肽骨架，体内均提供更长的作用持续时间，和不存在低血糖的基本特征。
实施例18
胰岛素前药类似物的比较胰岛素耐量
给予正常小鼠胰岛素异二聚体类似物[B1(Y16,L17,Y25)29a:A1(aF19-NH2)]或其前药衍生物。前药衍生物[B1(Y16,L17,Y25)29a:A1(aF19-dLys(Ac),NLeu)]包含在A19位的4-氨基-苯丙氨酸取代，其中二肽dLys(Ac),NLeu在A19残基的4-氨基位处共价连接。这种二肽可在生理条件下自主切割，其半寿期约5小时。在将前药衍生物[B1(Y16,L17,Y25)29a:A1(aF19-dLys(Ac),NLeu)]离体温育24小时后，将所得化合物给予小鼠，并对其降低血糖的能力与母体化合物相比较。如图38所示，两种化合物的表现几乎相同。
实施例19
聚乙二醇化低效力丙氨酸类似物
可通过降低其对胰岛素受体的活性，来延长本文公开的各种胰岛素类似物的作用持续时间。因此，在一个实施方案中，可对本文公开的胰岛素类似物进行修饰以降低其对胰岛素受体的效力，包括被1-8、1-5、1-3、1-2或1个氨基酸取代的修饰。在一个实施方案中，氨基酸取代是选自以下的位置的丙氨酸取代：B5、B10、B24、A1或A8。这些位置的一个或多个上的丙氨酸取代大大降低效力，因此延长对胰岛素受体的作用持续时间。在一个实施方案中，本文公开的胰岛素类似物通过B5、B24、A1或A8位的单个丙氨酸氨基酸取代被进一步修饰。这些化合物可按表18中标示的通过聚乙二醇化被进一步修饰(GE5W = GEEEEEW，一种加到胰岛素类似物的N端以提高溶解度的肽)。
表18
如表19中所示，制备了单链和两链胰岛素类似物，针对对胰岛素和IGF-1受体的活性进行了体外测试，并与其聚乙二醇化衍生物进行了比较。与聚乙二醇化衍生物相比，非聚乙二醇化形式具有较高的活性。此外，使用2个10 kDa PEG链使两链胰岛素类似物二聚乙二醇化，以产生与包含单个20 kDa PEG链的相同类似物大致相似活性的化合物(参见B1(H5,10Y16L17K29)29:A1(H8,N18,21)相对于B1,A14-10KB1(H5,10Y16L17R29)29:A1(H8K14N18,21)和B1(H5,10Y16L17K29)29:A1(H8N18,21)的相对活性)。对于单链类似物B1(H5,10Y16L17K29)29-A1(H8,N18,21)，加入20 kDa产生对胰岛素A型受体具有几乎100倍活性的化合物(B1(H5,10Y16L17K29)29-A1(H8N18,21)。因此，通过制备作为两链或单链类似物的胰岛素类似物，并通过选择PEG链的大小、数目和连接位点，可改进胰岛素类似物的体内效力，且可能改进体内作用持续时间。

Claims (26)

1.一种包含通用结构B-LM-A的单链胰岛素激动剂类似物，其中
B表示由序列X22VNQX25LCGX29X30LVEALYLVCGERGFFYT-Z1-B1 (SEQ ID NO: 54)组成的的胰岛素B链；
A表示由序列GIVEQCCX8SICSLYQLX17NX19CX23 (SEQ ID NO: 52)组成的的胰岛素A链；和
LM表示连接B链羧基端与A链氨基端的连接部分；
此外其中所述连接部分由8个氨基酸序列GX52GSSSRR (SEQ ID NO: 31)组成，其中X52是酪氨酸以外的任何氨基酸，其中
X8为组氨酸或苏氨酸；
X17为谷氨酰胺或谷氨酸；
X19为酪氨酸、4-甲氧基-苯丙氨酸或4-氨基苯丙氨酸；
X22选自苯丙氨酸和脱氨基-苯丙氨酸；
X23为天冬酰胺或甘氨酸；
X25选自组氨酸和苏氨酸；
X29选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X30选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸和半胱磺酸；
Z1为选自天冬氨酸-赖氨酸、赖氨酸-脯氨酸和脯氨酸-赖氨酸的二肽；和
B1选自苏氨酸、丙氨酸或苏氨酸-精氨酸-精氨酸三肽。
2.权利要求1的单链胰岛素激动剂类似物，还包含与连接部分的氨基酸共价连接或在选自A链的A9、A14和A15位或B链的B1、B2、B10、B22、B28或B29位的氨基酸共价连接的聚乙二醇链。
3.权利要求2的单链胰岛素激动剂类似物，其中所述聚乙二醇链在连接部分的C7或C8位上、在B链的N端α胺上、在A链的A14位的氨基酸侧链上或在B链的B1、B2、B22或B29位的氨基酸侧链上与氨基酸的侧链共价连接。
4.权利要求1的单链胰岛素激动剂类似物，其中所述连接部分是GAGSSSRR (SEQ IDNO: 32)。
5.权利要求1-4中任一项的单链胰岛素激动剂类似物，其中A链由序列GIVEQCCTSICSLYQLENYCN (SEQ ID NO: 1)组成，B链由序列FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT (SEQ ID NO: 2)组成。
6.权利要求1-4中任一项的单链胰岛素激动剂类似物，其中第一亲水部分与连接部分的C8位的氨基酸连接，第二亲水部分在选自以下的位置与氨基酸连接：B链的N端α胺、A链的A9、A14和A15位的氨基酸侧链或B链的B1、B2、B10、B22、B28或B29位的氨基酸侧链。
7.权利要求6的单链胰岛素激动剂类似物，其中所述第一和第二亲水部分两者均为聚乙二醇链。
8.权利要求1-4中任一项的单链胰岛素激动剂类似物的前药衍生物，其包含结构U-B，其中
U为氨基酸或羟酸；
B为通过B的羧基部分和单链胰岛素激动剂类似物的胺之间的酰胺键与所述单链胰岛素激动剂类似物连接的N-烷基化氨基酸，其中U、B或U-B与之连接的单链胰岛素激动剂类似物的氨基酸是非编码氨基酸，此外其中U-B在生理条件下在PBS中自单链胰岛素激动剂类似物的化学切割半寿期(t1/2)为1小时-1周。
9.权利要求8的前药衍生物，其中结构U-B的第一氨基酸和/或第二氨基酸为呈D立体异构体构型的氨基酸。
10.权利要求8的前药衍生物，其中U-B包含下式X的结构：
X
其中
R1、R2、R4和R8独立选自H、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7、(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)和C1-C12烷基(W1)C1-C12烷基，其中W1是选自N、S和O的杂原子，或
R1和R2与它们所连接的原子一起形成C3-C12环烷基或芳基；或
R4和R8与它们所连接的原子一起形成C3-C6环烷基；
R3选自C1-C18烷基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)NH2、(C1-C18烷基)SH、(C0-C4烷基)(C3-C6)环烷基、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7和(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)，或R4和R3与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；
R5为NHR6或OH；
R6为H、C1-C8烷基，或R6和R1与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；和
R7选自H、OH、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH和卤素。
11.权利要求10的前药衍生物，其中
R1和R2独立地为C1-C18烷基或芳基；
R3为C1-C18烷基，或R3和R4与它们所连接的原子一起形成4-12杂环；
R4和R8独立选自氢、C1-C18烷基和芳基；和
R5为胺或羟基。
12.权利要求10的前药衍生物，其中
R1选自氢、C1-C18烷基和芳基，或R1和R2通过-(CH2)p-连接，其中p为2-9；
R3为C1-C18烷基，或R3和R4与它们所连接的原子一起形成4-6杂环；
R4和R8独立选自氢、C1-C18烷基和芳基；和
R5为胺或N-取代胺。
13.权利要求10的前药衍生物，其中
R1和R2独立选自氢、C1-C8烷基和芳基；
R3为C1-C18烷基，或R3和R4与它们所连接的原子一起形成4-6杂环；
R4和R8各自为氢；和
R5选自胺、N-取代胺和羟基。
14.权利要求8-13中任一项的前药衍生物，其还包含与结构U-B或连接部分的氨基酸连接的聚乙二醇链。
15.权利要求8-13中任一项的前药衍生物，其中贮库聚合物与结构U-B或连接部分的氨基酸连接。
16.权利要求1-4和权利要求8-13中任一项的单链胰岛素激动剂类似物或其前药衍生物，其中所述单链胰岛素激动剂类似物或其前药衍生物的氨基酸侧链通过烷基胺、酰胺、醚、酯、硫醚或巯基酯键与酰基或烷基共价连接，其中所述酰基或烷基对于天然存在的氨基酸是非天然的。
17.一种包含结构B-LM-A的单链胰岛素激动剂类似物，其中B表示由序列FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT (SEQ ID NO: 2)组成的胰岛素B链；A表示由序列GIVEQCCTSICSLYQLENYCN (SEQ ID NO: 1)组成的胰岛素A链；和LM是由序列GX52GSSSRR(SEQ ID NO: 31)、GAGSSSX57X58 (SEQ ID NO: 163)或GYGSSSRX58 (SEQ ID NO: 45)组成的8个氨基酸连接部分，其中
X52是酪氨酸以外的任何氨基酸；和
X57和X58独立选自精氨酸、赖氨酸和鸟氨酸。
18.权利要求17的单链胰岛素激动剂类似物，其中所述连接部分为GAGSSSRR (SEQ IDNO: 32)。
19.权利要求17或18的单链胰岛素激动剂类似物的前药衍生物，其还包含结构U-B，该结构通过B的羧基部分和单链胰岛素激动剂类似物的胺之间的酰胺键与所述单链胰岛素激动剂类似物连接，其中在生理条件下在PBS中，U-B自单链胰岛素激动剂类似物化学切割的半寿期(t1/2)为1小时-1周，和
U-B包含下式X的结构：
X
其中
R1、R2、R4和R8独立选自H、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7、(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)和C1-C12烷基(W1)C1-C12烷基，其中W1是选自N、S和O的杂原子，或
R1和R2与它们所连接的原子一起形成C3-C12环烷基或芳基；或
R4和R8与它们所连接的原子一起形成C3-C6环烷基；
R3选自C1-C18烷基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)NH2、(C1-C18烷基)SH、(C0-C4烷基)(C3-C6)环烷基、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7和(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)，或R4和R3与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；
R5为NHR6或OH；
R6为H、C1-C8烷基，或R6和R1与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；和
R7选自H、OH、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH和卤素，前提条件是如果R4和R3与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环，则R1和R2两者均不是H。
20.权利要求19的单链胰岛素激动剂类似物，其中所述类似物在选自以下的一个或多个位置上被酰化：B链的N端α胺、A14、A15、B1、B2、B10、B22、B28、B29位上的氨基酸的侧链、连接部分的氨基酸侧链的侧链或二肽U-B的氨基酸的侧链。
21.权利要求19的单链胰岛素激动剂类似物，其中所述类似物在选自以下的一个或多个位置上被聚乙二醇化：B链的N端α胺、在A14、A15、B1、B2、B10、B22、B28、B29位的氨基酸的侧链上、在连接部分的氨基酸侧链上或二肽U-B的氨基酸侧链。
22.一种二聚体或多聚体，其包含权利要求1-21中任一项的单链胰岛素激动剂类似物。
23.一种药物组合物，其包含权利要求1-22中任一项的单链胰岛素激动剂类似物或其前药衍生物和药学上可接受的载体。
24.权利要求23的药物组合物在制备用于治疗糖尿病的药物中的用途。
25.权利要求1-10中任一项的单链胰岛素激动剂类似物在制备用于治疗高血糖症的药物中的用途。
26.权利要求1-10中任一项的单链胰岛素激动剂类似物在制备用于治疗糖尿病的药物中的用途。
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