CN107530405A - 含有葡萄糖调节的构象转换器的胰岛素类似物 - Google Patents

含有葡萄糖调节的构象转换器的胰岛素类似物 Download PDF

Info

Publication number
CN107530405A
CN107530405A CN201680027352.3A CN201680027352A CN107530405A CN 107530405 A CN107530405 A CN 107530405A CN 201680027352 A CN201680027352 A CN 201680027352A CN 107530405 A CN107530405 A CN 107530405A
Authority
CN
China
Prior art keywords
phe
xaa
insulin
insulin analog
acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201680027352.3A
Other languages
English (en)
Inventor
M.维斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Case Western Reserve University
Original Assignee
Case Western Reserve University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Case Western Reserve University filed Critical Case Western Reserve University
Publication of CN107530405A publication Critical patent/CN107530405A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/62—Insulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/62—Insulins
    • C07K14/622—Insulins at least 1 amino acid in D-form
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

双链胰岛素类似物含有(i)在其N末端处或附近通过单体葡萄糖结合元件修饰的A链，和(ii)在其C末端处或其附近通过元件修饰的B链，所述元件可逆结合至单体葡萄糖结合元件，使得该连接可被葡萄糖置换。所述单体葡萄糖结合元件可以是苯基硼酸衍生物(任选卤代)。B链可以通过含二醇的元件修饰，所述含二醇的元件衍生自单糖、二糖或寡糖、非糖含二醇的部分或含有α‑羟基羧酸酯的部分。所述类似物可以通过胰蛋白酶介导的半合成来制造。制剂在具有或不具有锌离子(摩尔比为0.0‑3.0个离子/胰岛素类似物单体)的pH 7.0‑8.0的可溶性溶液中，可以强度为U‑10至U‑1000。可以用皮下、腹膜内或口服施用生理有效量的胰岛素类似物来治疗患有糖尿病的患者。

Description

含有葡萄糖调节的构象转换器的胰岛素类似物
关于联邦资助的研究或开发的声明
本发明在美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的合作协议下，由政府支持完成，资助编号为DK040949。美国政府享有本发明的某些权利。
发明背景
本发明涉及多肽激素类似物，其含有葡萄糖-构象转换器，因此显示出激素去组装的葡萄糖-反应性速率或与同源细胞受体的葡萄糖-反应性结合。描述了关于通过皮下、腹膜内或静脉内注射治疗患有1型或2型糖尿病的患者和非人类哺乳动物的胰岛素的应用。本发明的胰岛素类似物还可以表现出其它增强的药物性质，诸如增加的热力学稳定性，增强的对高于室温的热纤颤的抗性，降低的促有丝分裂性和/或改变的药代动力学和药效学性质。更具体地，本发明涉及下述胰岛素类似物，其赋予快速作用(相对于其规则可溶性形式的野生型胰岛素)、中间作用(与本领域已知的NPH胰岛素制剂相当)或延长的作用(与本领域已知的基础胰岛素相当，示例性地如地特胰岛素和甘精胰岛素)，使得与以低于生理范围的浓度(< 80 mg/dl；低血糖)溶解于含有葡萄糖的溶液中时相比，以高于生理范围的浓度(> 140mg/dl；高血糖)溶解于含有葡萄糖的溶液中时，所述类似物对胰岛素受体的亲和力更高。
非标准蛋白(包括治疗剂和疫苗)的工程改造可以具有广泛的医疗和社会益处。天然存在的蛋白——如通常在人类、其它哺乳动物、脊椎生物、无脊椎生物或真核细胞的基因组中编码的那样——可以进化成在细胞背景下最佳地发挥功能，但对于治疗应用可能是次佳的。这样的蛋白的类似物可以表现出改善的生物物理、生物化学或生物学性质。蛋白类似物的益处是实现增强的活性(诸如新陈代谢的代谢调节，导致在高血糖条件下血糖浓度的降低)，和减少的不利作用(诸如低血糖的诱导或其恶化)。胰岛素提供了治疗性蛋白的一个实例。野生型人胰岛素和在其它哺乳动物基因组中编码的胰岛素分子结合位于多个器官和多种类型的细胞的胰岛素受体（无论是通过RNA剪接的替代方式或通过翻译后糖基化的替代模式生成的受体同种型）。医疗益处的一个实例是非标准设计可溶性胰岛素类似物，其对靶细胞表面上的胰岛素受体的固有亲和力，和因此其生物学效力，将取决于血流中葡萄糖的浓度。
胰岛素分子含有两条链，含有21个残基的A链，和含有30个残基的B链。成熟激素衍生自更长的单链前体，称为胰岛素原，如图1中所概述。胰岛素分子中的特异性残基通过氨基酸类型(通常以标准的三字母代码表示；例如Lys和Ala表示赖氨酸和丙氨酸)和上标所述链(A或B)以及在所述链中的位置表示。例如，人胰岛素的B链的位置14的丙氨酸通过AlaB14表示；且同样地，赖脯胰岛素(Humalog®的活性组分，Eli Lilly and Co.)的位置B28的的赖氨酸通过LysB28表示。虽然该激素作为Zn2+-稳定的六聚体储存在胰腺β-细胞中，但其作为无Zn2+的单体在血液中起作用。施用胰岛素已长期被确定为糖尿病的治疗方法。在患有糖尿病的患者中常规胰岛素替代疗法的主要目的是严格控制血糖浓度以防止其偏离高于或低于健康人对象的正常范围特征。偏离高于正常范围与微血管疾病(包括视网膜病变、失明和肾衰竭相关)的长期风险增加相关。糖尿病患者的低血糖是胰岛素替代治疗中的常见并发症，并且当严重时可导致严重的发病(包括精神状态改变、意识丧失、癫痫发作和死亡)。事实上，对这种并发症的恐惧对于患者(和医师)获得血糖浓度(即在正常范围内或恰好高于正常范围的偏离)的严格控制的努力构成重大障碍，并且在具有长期确立的2型糖尿病的患者中，这种努力(“严格控制”)可导致死亡率上升。除了上述严重低血糖的后果(被称为神经低糖作用(neuroglycopenic effects))之外，轻度低血糖可能激活反调节机制，包括交感神经系统的过度活化，导致转为焦虑和发抖(被称为肾上腺素能的症状)。然而，糖尿病患者可能不会表现这种警示体征（称为低血糖无意识的状况）。缺乏轻度低血糖症状增加严重低血糖的风险及其相关发病率和死亡率。多发性和复发性低血糖发作也与慢性认知下降(具有长期存在的糖尿病的患者中的痴呆患病率增加的基础的提议机制)相关。因此，迫切需要新的糖尿病治疗技术，其降低低血糖的风险，同时防止血糖浓度高于正常范围的向上偏离。
已经开发了多种技术来努力减轻用胰岛素治疗的患者中的低血糖的威胁。所有这些努力的基础是关于低血糖症状教育患者(以及他或她的家庭成员)且在认识到这些症状之后，迫切需要摄取富含葡萄糖、蔗糖或其它快速消化形式的碳水化合物的食物或液体；所述食物或液体的一个实例由补充有蔗糖(蔗糖(cain sugar))的橙汁提供。这种基线方法已经通过开发特定的糖尿病导向产品来扩展，所述糖尿病导向产品诸如可以通过口腔、咽喉、胃和小肠的粘膜快速吸收的形式的包含含有葡萄糖的乳液的可挤压管。同样已经开发了适于快速溶解和皮下注射的形式的作为粉末提供的反调节激素胰高血糖素的制备物，作为严重低血糖的紧急治疗。胰岛素泵已经连接至连续的葡萄糖监测器，使得胰岛素的皮下注射停止，并且当遇到组织葡萄糖浓度的低血糖读数时发出警报。这种基于装置的方法已经导致了闭环系统的实验测试，其中泵和监视器与基于计算机的算法组合为“人造胰腺”。
三十多年来，存在对于开发葡萄糖反应性材料的兴趣，所述葡萄糖反应性材料用于与胰岛素类似物或修饰的胰岛素分子共同施用，使得激素从皮下贮库释放的速率取决于组织葡萄糖浓度。这种系统通常含有葡萄糖反应性聚合物、凝胶或其它包封材料；并且还可需要含有能够使得激素与上述材料结合的修饰的胰岛素衍生物。在皮下注射部位的组织液中的葡萄糖的环境浓度的增加可以通过激素的竞争性替代或聚合物、凝胶或其它包封材料的性质的物理化学变化来替代结合的胰岛素或胰岛素衍生物。这种系统的目的是为包封或凝胶涂覆的皮下贮库提供内在的自动调节特征，使得当葡萄糖的环境浓度在正常范围内或低于正常范围时，通过胰岛素的延迟释放减轻低血糖的风险。迄今为止，没有这样的葡萄糖反应系统在临床上使用。
最近的技术利用修饰的胰岛素分子的结构，其任选地与载体分子结合，使得修饰的胰岛素分子和载体之间的复合物是可溶的并且可进入血流。该概念不同于葡萄糖反应贮库，在所述贮库中随着游离激素进入血流，而聚合物、凝胶或其它包封材料保留在皮下贮库中。该方法的一个实施方案是本领域已知的，其中A链在其N-末端处或其附近被修饰(利用残基A1的α-氨基或经由在位置A2、A3、A4或A5处取代的赖氨酸的ε-氨基)以含有“亲和配体”(定义为糖部分)，B链在其N-末端处或其附近被修饰(利用残基B1的α-氨基或经由在位置B2、B3、B4或B5处取代的赖氨酸的ε-氨基)以含有“单价葡萄糖结合剂”。在本说明书中，大量示例或设想的葡萄糖结合剂(单体凝集素结构域、DNA适体或肽适体)将它们的位置限制在如上所定义的B链的N-末端区段。在没有外源葡萄糖或其它外源性糖的情况下，A1连接的亲和配体和B1连接的葡萄糖结合剂之间的分子内相互作用被设想为“闭合”激素的结构，从而损害其活性。仅报道了这类分子设计的适度的葡萄糖反应性质(Zion等人, 2012)。
通过亲和配体在残基A1处或其附近修饰且同时通过大的葡萄糖结合剂(即，其大小与胰岛素A或B链的大小相比相似或更大)在残基B1处或其附近修饰的胰岛素类似物的次优性质可能对于这类分子设计是内在的。实际上，这种设计的理由依赖于在残基A1和B1的α-氨基之间含有短的化学交联的胰岛素类似物的低活性，但是忽略了在这些残基之间含有长度类似于或超过胰岛素A或B链的长度的肽接头的胰岛素类似物的天然或增强的活性。因此，推定的“闭合”形式的上述胰岛素类似物实际上不能在构象中被充分地限制，以提供受体结合的显著损害(相对于在外源葡萄糖存在的情况下的修饰的胰岛素)，并因此提供有用的或最佳的葡萄糖依赖性生物活性。上述类别的胰岛素类似物的处方也忽略了活性的显著降低，而不考虑游离葡萄糖浓度可能在通过其它脂肪族或非脂肪族氨基酸(例如赖氨酸)取代残基A2或A3(IleA2或ValA3)后升高；预期这些类似物具有可忽略的生物活性，因此不像本领域长期已知的那样有用。胰岛素类似物与胰岛素受体的结合也将通过取代位置A1的赖氨酸被损害，但程度较小。上述类别的胰岛素类似物中也被忽略的是替代类型的葡萄糖调节的构象转换器的潜在优点，其可能不仅影响该类似物对胰岛素受体的亲和力，而且还影响胰岛素自组装的程度及其去组装速率，这可能与皮下贮库的葡萄糖调节的药代动力学性质有关。
令人惊讶地，我们已经发现，基本上不同类别的分子设计可以最佳地提供胰岛素分子的闭合和开放状态之间的葡萄糖依赖性构象转换，而没有上述缺点。因此，本发明的类似物在B链的C-末端处或其附近，而不是在A链的N末端处或其附近，含有一种或多种糖修饰(图3A和3B)。此外，本发明的类似物避免了在残基B1处或其附近的庞大葡萄糖结合剂，并且可选地在残基A1处或其附近采用小的化学实体(苯基硼酸衍生物；PBA)。因此，通过在B链的C-末端处或其附近的糖修饰(或具有相似官能团的非糖类似物)和在A链的N末端处或其附近的小化学实体之间的相互作用(非共价或共价，但可逆)栓系的本发明的闭合状态与之前公开的不同，且不相关。本发明的闭合状态利用胰岛素分子中的保护性铰链，其打开以接合胰岛素受体。在本领域中已知其中短共价系链将B链的C-末端连接至A链的N末端的微型胰岛素原或单链胰岛素类似物表现出非常低或不可检测的活性(图2)。在A链的N末端处或其附近连接的PBA部分的小尺寸及其与B链的C末端处或其附近的同源PBA结合元件的可逆结合将提供靠近胰岛素的经典的二聚化表面的构象转换器，且因此使得胰岛素组装和去组装的葡萄糖调节成为可能。本发明的本质不取决于B链的修饰的具体分子实施方案，因为PBA(和作为氟-苯基硼酸的PBA衍生物)表现出与(a)不同糖类(单糖单元的数量和组成不同)的二醇官能团以及(b)呈现模拟在单糖中发现的那些的二醇官能团(或作为替代的PBA结合官能团的α-羟基羧酸酯)的非糖有机化合物的可逆共价键合(图3B)。
本发明的胰岛素类似物(其生物利用度(通过皮下贮库中的六聚体去组装的葡萄糖调节的速率调节)和/或生物效力(通过对胰岛素受体的葡萄糖依赖性亲和力调节)在高血糖症状下将比低血糖状态下更强)可提高胰岛素替代疗法的一般安全性、疗效、简便性和便利性。这样的胰岛素类似物制剂将与多种装置(诸如胰岛素小瓶、胰岛素笔和胰岛素泵)相容，并且可与本领域已知赋予快速、中等或长期的胰岛素作用的胰岛素分子的修饰相整合。此外，在B链的C末端和A链的N末端之间工程改造的胰岛素分子中的本葡萄糖调节的构象转换器可以与其它葡萄糖反应技术(诸如闭环系统或葡萄糖反应性聚合物)组合以优化其综合性质。因此，我们设想本发明的产品将有益于西方社会和发展中国家的1型或2型糖尿病患者。
发明概述
因此，本发明的一个方面是提供胰岛素类似物，其提供与胰岛素受体的葡萄糖反应性结合，且因此提供葡萄糖调节的生物活性。本发明的类似物含有两个基本元件。第一元件是在位置A1的甘氨酸(GlyA1)的α-氨基或任选地在作为在位置A1良好耐受的氨基酸取代的D-赖氨酸(D-LysA1)的ε-氨基或作为在位置A4的取代的L-赖氨酸(L-LysA4)的ε-氨基处的苯基硼酸衍生物(包括间隔物元件)。可选地，可以在A链的N末端附近，即在A链的前5个氨基酸内，发现该修饰。苯基硼酸部分(图4)可以在其芳香环内通过氢原子取代为卤素原子诸如氟、氯、溴或碘来修饰(图5)；所述间隔物元件可以含有1-16个碳原子的线性酰基链(图6)。第二元件是在B链多肽的一个C末端或B链多肽的C末端附近处，即在位置B27、B28、B29、B30的一个或多个处，或如连接至含有一个残基(B31)或两个残基(B31-B32)的B链的肽延伸的N-连接或O-连接的单糖、二糖或寡糖。可选地，可以在B27-B30中的任一个处取代非标准的含二醇的氨基酸，诸如L-DOPA或D-DOPA。O-连接的糖的实例是丝氨酸或苏氨酸的衍生物；N-连接的糖的实例是天冬酰胺或谷氨酰胺的衍生物。单糖的实例是葡萄糖、甘露糖和N-乙酰基-半乳糖。本发明的胰岛素类似物的总体结构以示意性形式显示于图3A和3B中。而在该方案中，可预期连接至A链的一般单体葡萄糖结合元件需要连接至B链的同源葡萄糖或糖部分(图3A)，作为苯基硼酸的单体葡萄糖结合元件的特定分子实施方案缓解这种对含二醇部分(或作为替代的PBA结合官能团的含有α-羟基羧酸酯基团的加合物)的广泛分子多样性的要求，无论是糖还是非糖试剂(图3B)。因此，在这样的实施方案中，N-连接或O-连接的糖可以被相似分子量的任何有机部分(或含有作为替代的PBA结合官能团的α-羟基羧酸酯基团的加合物)取代，所述相似分子量的任何有机部分含有模拟单糖的二醇官能团的二醇官能团，因此赋予可逆的PBA结合活性。这样的含有非糖二醇的有机化合物跨越宽范围的化学类别，包括酸类、醇类、含有芳族和非芳族支架的硫醇试剂；含有α-羟基羧酸酯基团的加合物可以提供替代的PBA结合官能团。这样的含二醇和含α-羟基羧酸酯的加合物通常表现出80至600道尔顿的分子量，且通常含有3-30个碳原子。除了上述N-连接和O-连接的糖衍生物外，方便的与B链的连接模式还跨越宽范围的连接；这些另外的连接模式包括(i)赖氨酸、鸟氨酸、二氨基丁酸、二氨基丙酸(具有主链手性L或D)的侧链氨基官能团和(ii)半胱氨酸或高半胱氨酸(具有主链手性L或D)的侧链硫醇官能团。
本发明的类似物可以任选地含有与残基B1(连同间隔物元件)连接的另外的苯基硼酸基团(或其卤素衍生物)，作为旨在提供胰岛素类似物与皮下贮库中的表面凝集素的葡萄糖敏感结合的机制。此外，本发明的类似物可以任选地含有本领域已知的赋予快速作用的取代(诸如AspB28，在门冬胰岛素(Novolog®的活性组分)中发现的取代；[LysB28,ProB29]，在赖脯胰岛素(Humalog®的活性组分)中发现的成对取代；GluB29或组合[LysB3,GluB29]，因为后者在谷赖胰岛素(Apridra®的活性组分)中发现，或者位置B24处的与胰岛素六聚体的加速去组装相关的修饰(例如，通过环己烷基苯丙氨酸或通过在芳环内含有单个卤素取代基的苯基丙氨酸的衍生物取代PheB24)。可选地，本发明的类似物可以任选地含有本领域已知赋予延长作用的修饰，诸如通过酰基链或酰基-谷氨酸加合物修饰LysB29的ε-氨基，其分别如地特胰岛素(Levemir®的活性组分)和胰岛素德谷胰岛素(Tresiba®的活性组分)所示；或含有设计用于将等电点(pI)偏离至接近中性的碱性氨基酸取代或碱性链延伸，如甘精胰岛素(Lantus®的活性组分)的ArgB31-ArgB32延伸所例示。设计用于展现这种偏离的pI的本发明的类似物也可以含有AsnA21的取代，诸如通过甘氨酸、丙氨酸或丝氨酸取代。本发明的类似物可以任选地还含有与对胰岛素受体的增加的亲和力和/或增加的热力学稳定性相关的ThrA8的非β-支链氨基酸取代，其可以引入以减轻初始两个以上设计元件(在A链的N末端处或其附近的苯基硼酸衍生物和在B链的C末端处或其附近的一种或多种糖衍生物)对受体结合亲合力和/或热力学稳定性的有害影响。本领域已知的这种A8取代的实例是HisA8、LysA8、ArgA8和GluA8。
通过本发明实现的两种葡萄糖反应机制——胰岛素六聚体去组装的葡萄糖依赖性速率和与胰岛素受体结合的葡萄糖依赖性强度——可以在一些分子实施方案中共存，而其它可以仅表现出一种性质或另一种性质。另外的其它实施方案可以在不平等的性质中表现出两种性质的组合。预期任一机制将赋予患者益处，因为皮下贮库中的胰岛素六聚体去组装的葡萄糖依赖性速率在低血糖条件下将降低激素的生物利用度，而葡萄糖依赖性受体结合在低血糖条件下将降低已经在血流中的激素的效力。预期这两种保护益处将是非依赖性的，或者甚至可以协同作用，以降低低血糖发作的风险或严重程度。
本发明的一个方面也是已经开发和证明了一种创新的制造方法，以制备在A链的N末端处或其附近由单体葡萄糖结合元件修饰且在B链的C末端处或其附近通过含糖或二醇的部分修饰的胰岛素类似物；后者还可以含有α-羟基羧酸酯基团作为替代的PBA结合官能团。这种制造方法利用预先修饰的胰岛素片段和预先修饰的合成肽的胰蛋白酶介导的半合成，因此简化了最终产物的纯化。胰岛素片段是胰岛素或单链胰岛素前体的脱-五肽[B23-B30]片段。合成肽含有N-末端甘氨酸，且长度为6、7、8、9或10个残基。所述肽可以在固相合成过程中或作为合成后修饰的结果直接并入N-或O-连接的糖(图3A)。后一种方法容易扩展至通过含二醇部分衍生化碱性侧链或硫醇侧链，所述含二醇部分待与通过苯基硼酸修饰的A链组合使用，如图3B中所示。
本发明的胰岛素类似物可以表现出范围4.0-6.0内的等电点(pI)，且由此适用于pH范围6.8-7.8内的药物制剂；可选地，本发明的类似物可以表现出范围6.8-7.8内的等电点，且由此适用于pH范围4.0-4.2内的药物制剂。本领域已知后一种条件导致皮下贮库中的这种pI偏离的胰岛素类似物的等电沉淀作为延长作用的机制。这种pI偏离的胰岛素类似物的实例由甘精胰岛素提供，其中B链的碱性双残基延伸(ArgB31-ArgB32)将pI偏离至近中性，因此使得能够延长来自皮下贮库的药代动力学吸收。通常，可以通过加入碱性或酸性链延长，通过用中性或酸性残基取代碱性残基，且通过用中性或碱性残基取代酸性残基来修饰胰岛素类似物的pI；在该上下文中，我们将酸性残基定义为天冬氨酸和谷氨酸，且我们将碱性残基定义为精氨酸、赖氨酸，在一些情况下，组氨酸。我们关于在中性pH的侧链的净电荷进一步定义“中性”残基。
本发明的一个另外方面是胰岛素类似物对胰岛素受体(同种型IR-A和IR-B)的绝对体外亲和力相对于野生型人胰岛素在5-100％的范围内，且因此不太可能在激素-受体复合物中表现出延长的停留时间；这种延长的停留时间据信与哺乳动物的增加致癌风险或培养物中的癌细胞系的更快速生长有关。本发明的又一个另外方面是胰岛素类似物对1型胰岛素样生长因子受体(IGF-1R)的绝对体外亲和力相对于野生型人胰岛素在5-100％的范围内，且因此不太可能在激素/IGF-1R复合物中表现出延长的停留时间或介导超过由野生型人胰岛素介导的IGF-1R相关的有丝分裂发生。
本发明的胰岛素类似物由两条含有A链和B链中的修饰的新型组合的多肽链组成，使得该类似物在不存在葡萄糖或其它外源性糖的情况下表现出在B链的C-末端处或其附近的(a)一个或多个糖部分或(b)一个或多个非糖含二醇部分至在A链的N末端处或其附近的单糖葡萄糖结合部分(任选地衍生自苯基硼酸)之间的可逆的相互作用（共价或非共价地）。实例由通过葡萄糖、甘露糖或N-乙酰基-半乳糖的ThrB27和/或ThrB30的O-连接的衍生物提供，并且可以可选地由类似物(含有丝氨酸对ThrB27和/或ThrB30的取代的胰岛素类似物的O-连接的衍生物)提供。当在位置B26、B27、B28、B29、B30或在B链(B31或B31-B32)的长度长达两个残基的C末端延伸内被取代时，通过Asn或Gln的N-连接的修饰提供单糖修饰的其它实例。使用C-末端延伸的B链可以在B31和/或B32处使用酸性残基来增强溶解度和减弱与促有丝分裂IGF-1R受体的交叉结合。此外，通过这样的延伸肽促进在B30处含有糖基化残基的B链片段(如在胰蛋白酶介导的半合成中使用)的固相肽合成，使得树脂结合的C-末端残基未被糖基化。
本发明的一个另外方面是N-连接或O-连接的糖部分可以由相似分子量的任何有机部分替代，所述相似分子量的任何有机部分含有二醇官能团(或作为替代的PBA-结合官能团的α-羟基羧酸酯基团)，赋予与在A链的N-末端处或其附近连接的PBA或PBA衍生物的可逆结合。在一些实施方案中，所述二醇可以是3-26个碳原子长。此外或可选地，二醇的分子量可以在90和570之间。这种非糖含二醇元件的实例由有机酸(诸如葡糖酸、苏糖酸、甘油酸、半乳糖酸和二羟基肉桂酸)、含硫醇的化合物(诸如1-硫代甘油和1,2,3-丁三醇4-巯基)和氨基化合物(诸如(±)-3-氨基-1,2-丙二醇、(±)-3-氨基-1,2-丙二醇和葡糖胺)提供。含硫醇的部分1-硫代-β-D-葡萄糖也可用于在合适修饰的B链中与半胱氨酸或高半胱氨酸的二硫键上。容易从商业来源获得且原则上适于与合成肽连接的另外试剂在表1中给出；这种连接可以需要活化化合物或其衍生化以提供适当的“化学手柄”。该表格不是详尽的，并且意在提供设想在本发明的范围内的各种分子实体(含二醇的化合物或含有α - 羟基羧酸酯基的那些)的说明性概览。
虽然我们不希望被理论所限制，但我们设想这两种设计要素在不存在外源性葡萄糖的情况下形成可逆的相互作用，使得激素的结构被稳定在闭合且较不活跃的构象中。本领域中已知，通过化学系链或短插入肽(或者甚至通过GlyA1和残基B28、B29或B30之间的直接肽键)闭合残基B30和A1之间的距离导致栓系的或单链胰岛素类似物对胰岛素受体的亲和力的显著损失。与胰岛素受体的胞外域的“微受体”片段结合的胰岛素的最近的共晶结构使这些发现合理化，因为结合的激素表现出胰岛素的α-螺旋核心的B24-B27区段的部分分离。本领域中进一步已知，残基GlyA1和ThrB30的天然接近反映了B链C末端β-链(残基B24-B28)相对于中心B链α-螺旋(残基B9-B19)的定位，使得胰岛素单体的闭合形式能够二聚化，进而能够组装六聚体。虽然不受理论所限制，我们设想通过在A链的N末端处或其附近连接的PBA元件和在B链的C末端处或其附近连接的互补的PBA结合元件对该闭合构象的稳定化有利于二聚化并延缓皮下贮库中的胰岛素六聚体组装的速率。虽然不受理论所限制，我们进一步设想外源葡萄糖分子(或其它游离糖)与在A链的N末端处或其附近的苯基硼酸部分的结合会阻止后者与在B链的C末端处或其附近的O-或N-连接的糖的相互作用，因此促进B24-B27区段的部分分离，以促进(a)皮下贮库中的胰岛素六聚体和二聚体的解离和/或(b)修饰的胰岛素与血液中和靶组织处的胰岛素受体的结合。
附图的几个视角的简述
图1A是包括A链和B链以及显示具有侧翼二元切割位点(实心圆)和C-肽(空心圆)的连接区的人胰岛素原序列(SEQ ID NO:1)的示意图。
图1B是胰岛素原的结构模型，所述胰岛素原由胰岛素样部分和无序的连接肽(虚线)组成。
图1C是包括A链(SEQ ID NO:2)和B链(SEQ ID NO:3)且显示B链中残基B27和B30位置的人胰岛素序列的示意图。
图2是微型胰岛素原(单链胰岛素)的圆柱状模型，其中肽键连接LysB29和GlyA1；ThrB30已缺失。这种类似物在本领域中已知不具有可检测的活性。
图3A是胰岛素分子(顶部)和与本发明相关的修饰的示意图。A链由更短的水平圆柱体表示，B链由更长的水平圆柱体表示。野生型胰岛素的典型二硫键由黑线表示(参见右下方的框)。A链通过在其N-末端处或附近(分别为红杯和黑色波浪线；参见左下方的框)和任选地在B链的α-氨基(括号中的红色星号)的单体葡萄糖结合部分和间隔物修饰。B链在其C-末端(或绿色三角形)处或附近通过一个或多个糖加合物修饰，其可以连接至丝氨酸或苏氨酸的侧链氧原子(O-连接的糖)或连接至天冬酰胺或谷氨酰胺的侧链氮原子(N-连接糖)。所述糖可以是单糖、二糖或寡糖。
图3B是图3A中所示方案的修饰的示意图，其中单体葡萄糖结合元件是苯基硼酸(具有任选的卤化)，而B链中的匹配元件可以是含二醇部分，无论是糖类还是衍生自广泛分子多样性的非糖含二醇化合物，无论是芳族还是非芳族的，且无论含有氨基、羧酸酯基还是硫醇基以便于连接至合成的B链衍生肽中的氨基酸侧链。
图4是苯基硼酸的分子结构的示意图。
图5是卤素修饰的苯基硼酸的分子结构的示意图，在这种情况下，其中芳环中的氢原子已被硼酸部分邻位的氟原子替代。苯环的卤素修饰在本领域中已知调节硼酸基团的pKa。
图6是显示苯基硼酸部分如何结合糖内的二醇的反应方案的示意图。类似的可逆反应方案涉及含有二醇或三醇官能团的广泛类别的非糖化学实体。
图7是经由作为肽键的单个羰基(中间的箭头)的PBA部分(左)和GlyA1(右)之间的最简单的连接的分子结构的示意图。指示苯基的任选的氟衍生物。在我们的实例的说明性研究中采用这种化学法。我们设想，PBA部分可以通过任选的1-12个碳的酰基接头与残基A1分离。
图8A是如通过EDTA钴-螯合测定法探测的在25℃下在pH 7.4下在存在或不存在葡萄糖(25mM)的情况下野生型人胰岛素的解离速率的对照研究的结果的图。在添加大量过量的EDTA后，R6-状态特异性d-d光谱带的衰减速率中没有观察到差异。
图8B是显示本发明的代表性类似物(其中GlyA1通过氟-苯基硼酸衍生化(SEQ IDNO:51)且ThrB30含有O-连接的甘露糖基修饰；表2)中的六聚体去组装的葡萄糖调节的解离速率的图。该类似物含有赖氨酸胰岛素(Humalog)的配对的LysB28-ProB29取代和B链的GluB31-GluB32 C-末端延伸(SEQ ID NO:16)。
图8C是显示缺乏残基A1(或其别处)的PBA修饰、但否则与小图B中描述的类似物相同、包括具有连接至ThrB30的O-连接的甘露糖的类似物的对照钴-螯合研究的结果的图。在25mM葡萄糖存在或不存在的情况下，这种对照类似物在去组装速率方面表现出很小的差异或没有差异；曲线之间的小差异可以是实验性误差，或者可以代表在高血糖条件(即与对糖尿病患者有利的情况相反)下去组装的小的不利的延迟。
图9提供在大鼠糖尿病模型中静脉内推注注射后所选胰岛素类似物的效力的大鼠研究的一对图。该数据提供了本发明的胰岛素类似物(菱形；含有LysB28和ProB29连同C-末端延伸GluB31和GluB32的变体B链中的甘露糖-ThrB30与连接至GlyA1的α-氨基的氟—PBA的组合的N=6次研究)相对于在A1缺乏PBA修饰的类似类似物（圆；N=5）和赖脯胰岛素(N = 5的正方形；赖脯胰岛素是Humalog的活性组分)的生物活性的比较。在小图A中，数据相对于绝对血糖浓度(垂直轴，以mg/dl计)绘制，而在小图B中，数据相对于血糖浓度的初始值(定义为1.0)绘制。该研究在雄性Lewis大鼠中进行，所述雄性Lewis大鼠通过链脲霉素以对应于20-μg蛋白/300克大鼠的剂量使得患糖尿病。
发明详述
本发明涉及一种胰岛素类似物，其通过皮下贮库中的胰岛素六聚体去组装的葡萄糖依赖性速率和/或与血流中和靶组织处的胰岛素受体的葡萄糖依赖性结合提供增强的体内血糖控制。制备六种新型胰岛素类似物，如表2中所列。各自采用氟-苯基硼酸作为葡萄糖传感元件。氟-PBA部分和GlyA1的α-氨基之间的化学键如图7中所示；在PheB1的α-氨基处同时具有氟-PBA加合物的类似物中采用相应的键(未显示)。
两种类似物含有一种这样的加合物(在A链的α-氨基；表2A)，且三种类似物含有两种这样的加合物(在A链和B链两者的α-氨基处；表2B) 。下面提供了通过活性剂FPA试剂衍生化胰岛素片段的方案。这些类似物在人胰岛素中的天然存在的苏氨酸位置(残基B27和/或B30)处含有O-连接的α-D-吡喃甘露糖苷(甘露糖-Oβ-Thr)或α-D-吡喃葡萄糖苷(葡萄糖-Oβ-Thr)。在每种情况下通过质谱法验证预测的分子量。含有甘露糖的胰岛素类似物表现出与WT胰岛素类似的钴R6六聚体组装性质(但具有不同的去组装动力学；下述)，如图8中所示。含有甘露糖的胰岛素类似物在IV推注注射至通过链脲佐霉素使得有糖尿病的雄性Lewis大鼠后表现出生物学活性，与赖脯胰岛素(Humalog® (Eli Lilly)的活性组分)类似，如图9中所示。
为了证明本发明的代表性类似物保持对胰岛素受体的高亲和力，通过体外竞争替代闪烁邻近测定(下文)测量这种亲和力。标准对照样品由OrnB29-胰岛素提供，所述OrnB29-胰岛素的活性与野生型胰岛素的活性不能区分。观察到在[Glu, Glu]-延伸的赖脯胰岛素B链(即，具有取代LysB28和ProB29以及C末端延伸GluB31和GluB32)的背景下含有O-连接的甘露糖-ThrB30的胰岛素类似物的亲和力(i)在与GlyA1的α-氨基连接的氟-PBA加合物存在的情况下，范围50-75％(相对于OrnB29-胰岛素)中，和(ii)在与GlyA1和PheB1两者的α-氨基连接的氟-PBA加合物存在的情况下，范围10-30％(相对于OrnB29-胰岛素)中。我们将这些适度的亲和力降低归因于如本领域已知的A1和B1加合物的不利影响。我们和其他人先前已经公开了赖脯胰岛素取代(LysB28和ProB29)和C-末端延伸GluB31和GluB32对另外多种胰岛素类似物对分离的胰岛素受体的亲和力具有可忽略的影响；O-连接的甘露糖基部分对ThrB30的修饰同样被良好地耐受。
使用光谱测定法研究去组装的葡萄糖反应速率，其中在作为R6六聚体的苯酚存在的情况下获得钴(Co2+)-取代的胰岛素六聚体的可见吸收光谱。该测定法(如Richard, J.P.等人(“Self-association properties of monomeric insulin analogs underformulation conditions.”Pharm. Res. 15:1434-41; 1998.中所述))利用了金属离子的R状态特异性的四面体配位，其产生蓝色吸收谱带。
该谱带由钴离子的未填充的d壳电子产生，并且是四面体配位环境的特定特征。加入大量过量的螯合剂乙二胺四乙酸(EDTA)导致金属离子(在无色八面体复合物中)的进行性螯合，所以提供了六聚体去组装动力学的快速且方便的探测。在存在或不存在浓度为25mM的葡萄糖的情况下，野生型胰岛素表现出与R状态特异性d-d信号相同的速率损失(图8A)。相比之下，表2A中列出的类似物(甘露糖-ThrB30-LysB28-ProB29-GluB31-GluB32)在高血糖条件下表现出显著的去组装加速(图8B)。在存在B链中的甘露糖加合物、但不存在A链的N末端处的PBA加合物的情况下，这种葡萄糖调节的去组装不存在(图8C)。
本发明的特征在于当血糖浓度在正常范围内或低于正常范围时，所要求保护的胰岛素类似物相对于野生型胰岛素表现出对胰岛素受体的低亲和力。虽然不希望被理论所限制，但我们设想这种亲和力的降低是在B链的C末端处或其附近的糖修饰和在其N末端处或其附近连接至A链的苯基硼酸衍生物之间的可逆相互作用的结果。这种共价、但可逆的相互作用将“闭合”B链C末端β-链(残基B24-B28)的构象，因此阻碍与胰岛素受体的结合，其需要该β-链从胰岛素分子的α-螺旋核心的部分分离。本发明的一个特征在于，当血糖浓度高于正常范围时，所要求保护的胰岛素类似物的血糖功效恢复到与野生型胰岛素类似的水平，这是由于通过溶液中过量的外源葡萄糖从一个或多个B链连接的糖部分竞争性替代A链连接的苯基硼酸衍生物。我们设想，在浓度> 200 mg/ml的葡萄糖存在的情况下，在范围5-100％内的受体结合亲和力将足以在具有糖尿病的动物中赋予这种天然或近似天然的血糖效力。本发明的另外特征是这些修饰也可能降低胰岛素在室温或高于室温下经历纤颤的倾向，并且减弱胰岛素的促有丝分裂性(从癌症风险和癌症生长的角度看不期望的独特的信号传导途径)。
还设想，通过非限制性实例，胰岛素类似物可以用衍生自动物胰岛素(诸如猪、牛、马和犬胰岛素)的A和B链序列制备，只要A链在其N末端处或其附近通过苯基硼酸衍生物修饰，并且在B链的C末端处或其附近的一个或多个氨基酸侧链通过O-连接或N-连接的单糖、二糖或寡糖修饰。衍生自人胰岛素或动物胰岛素的这样的变体B链可以任选地含有C-端二肽延伸(各自残基位置表示为B31和B32)，其中这些C-端延伸的残基中的至少一个是含有O-连接或N-链接的糖的修饰的氨基酸。另外或可选地，本发明的胰岛素类似物可以含有残基B3的缺失；或者可以与缺失位置B28的脯氨酸(例如，如Humalog中的[LysB28, ProB29]；或AspB28或GluB28与位置B29的赖氨酸或脯氨酸组合)或含有位置B29的谷氨酸的变体B链组合。在位置A13，亮氨酸可以任选地被色氨酸取代，且在位置A14，酪氨酸可以任选地被谷氨酸取代。
进一步设想，本发明的胰岛素类似物可以衍生自（在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Sacharomyces cerevisciae)或其它酵母表达物种或菌株中的）酵母生物合成中前体多肽的Lys-定向的蛋白水解。可以通过工程改造的tRNA合成酶和正交无义抑制，将这样的菌株工程改造，以在位置B24插入卤素修饰的苯丙氨酸。本发明的胰岛素类似物的B-结构域可以任选地含有非标准取代，诸如在位置B20和/或B23的D-氨基酸(旨在增加热力学稳定性、受体结合亲和力和对纤颤的抗性)。在位置B24的卤素修饰可以在PheB24的2-环位置(即，邻-F-PheB24、邻Cl-PheB24或邻-Br-PheB24)。任选地，类似物可以在TyrB16和/或TyrB26 (3-单碘-Tyr或[3,5]-二碘-Tyr)的芳族环内含有碘取代；旨在增加热力学稳定性和受体-结合活性)。还设想，ThrB27、ThrB30或在C结构域中的一个或多个丝氨酸残基可以单独或组合地被单糖加合物修饰；实例由O-连接的N-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖苷(称为GalNAc-Oβ-Ser或GalNAc-Oβ-Thr)、O-连接的α-D-吡喃甘露糖苷(甘露糖-Oβ-Ser或甘露糖-Oβ-Thr)和/或α-D-吡喃葡萄糖苷(葡萄糖-Oβ-Ser或葡萄糖-Oβ-Thr)提供。
此外，考虑到人胰岛素和动物胰岛素之间的相似性，以及过去在患有糖尿病的患者中使用动物胰岛素，还设想可以在胰岛素的序列中引入其它小的修饰，尤其是被认为“保守”的那些取代。例如，可以在具有类似侧链的氨基酸组中进行氨基酸的额外取代而不偏离本发明。这些包括中性疏水性氨基酸：丙氨酸(Ala或A)、缬氨酸(Val或V)、亮氨酸(Leu或L)、异亮氨酸(Iie或I)、脯氨酸(Pro或P)、色氨酸(Trp或W)、苯丙氨酸(Phe或F)和蛋氨酸(Met或M)。同样，中性极性氨基酸可以在其以下的组中互相取代：甘氨酸(Gly或G)、丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、酪氨酸(Tyr或Y)、半胱氨酸(Cys或C)、谷氨酰胺(Glu或Q)和天冬酰胺(Asn或N)。酸性氨基酸是天冬氨酸(Asp或D)和谷氨酸(Glu或E)。碱性氨基酸取代(包括赖氨酸(Lys或K)、精氨酸(Arg或R)和组氨酸(His或H))的引入对于维持这类类似物的增加的净负电荷不是优选的。除非另行指出或由上下文显而易见，本文中提到的氨基酸应认为是L-氨基酸。标准氨基酸也可以被属于同一化学种类的非标准氨基酸取代。
本发明的胰岛素类似物包括(但不限于)如下类似物，其变体B链符合下文SEQ IDNO 7-50中给出的多肽序列，且其变体A链符合SEQ ID NO 51-53中给出的多肽序列。应当理解，本发明的变体B链还可以包括残基B1的缺失，残基B1和B2的缺失，或残基B1-B3的缺失，使得新C-末端α-氨基可以任选地被苯基硼酸衍生物修饰。出于比较目的，提供人胰岛素原的氨基酸序列作为SEQ ID NO:1。出于比较目的，提供人A链的氨基酸序列作为SEQ ID NO:2。出于比较目的，提供本领域已知的人B链和B链类似物的序列作为SEQ ID NO:3-6。
出于比较目的，如SEQ ID NO:1提供人胰岛素原的氨基酸序列。
SEQ ID NO:1 (人胰岛素原)
如SEQ ID NO:2提供人胰岛素的A链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:2 (人A链)
如SEQ ID NO:3提供人胰岛素的B链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3 (人B链)
如SEQ ID NO:4提供餐时胰岛素类似物KP-胰岛素的“KP” B链的氨基酸序列含有取代ProB28→Lys和LysB29→Pro。
SEQ ID NO:4
如SEQ ID NO:5提供餐时胰岛素类似物KP-胰岛素的延长的“KP” B链的32-残基氨基酸序列。
SEQ ID NO:5
在SEQ ID NO:6中提供经修饰以在位置B29含有鸟氨酸的变体B链的30-残基氨基酸序列。
SEQ ID NO:6
在SEQ ID NO:7中提供通过对残基B27的O-连接的糖基化修饰、同时保留ProB28的变体B链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:7
其中Xaa1是PheB1的天然α-氨基或任选地通过肽键或任选的酰基接头连接至PheB1的α-氨基的苯基硼酸部分或苯基硼酸部分的卤素衍生物；其中Xaa2是苯丙氨酸、五氟-Phe、2-氯-Phe、2-溴-Phe、4-氯-Phe、2-甲基-Phe或环己烷基丙氨酸；其中Xaa3是选自α-D-吡喃甘露糖苷、α-D-吡喃葡萄糖苷或N-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖苷的Oβ-ThrB27-连接或Oβ-SerB27-连接的单糖吡喃糖苷，或其中Xaa3是含有上述单糖亚基中的一种或多种的Oβ-ThrB27-连接或Oβ-SerB27-连接的二糖；其中Xaa4是赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、二氨基丁酸、二氨基丙酸、正亮氨酸、氨基丁酸、氨基丙酸、丙氨酸或谷氨酸；且其中Xaa5-Xaa6表示B链的任选的一个或两个残基的延伸，其中Xaa5(如果选择存在)可以是Glu、Gln、Gly、Ala或Ser，且其中Xaa5-Xaa6(如果选择存在)得自相同组的氨基酸，使得至少一个延伸位置是谷氨酸。
在SEQ ID NO:8中提供通过对残基B27的O-连接的糖基化修饰、且在位置B29可替代放置脯氨酸的变体B链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:8
其中Xaa1是PheB1的天然α-氨基或任选地通过肽键或任选的酰基接头连接至PheB1的α-氨基的苯基硼酸部分或苯基硼酸部分的卤素衍生物；其中Xaa2是苯丙氨酸、五氟-Phe、2-氯-Phe、2-溴-Phe、4-氯-Phe、2-甲基-Phe或环己烷基丙氨酸；其中Xaa3是选自α-D-吡喃甘露糖苷、α-D-吡喃葡萄糖苷或N-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖苷的Oβ-ThrB27-连接或Oβ-SerB27-连接的单糖吡喃糖苷，或其中Xaa3是含有上述单糖亚基中的一种或多种的Oβ-ThrB27-连接或Oβ-SerB27-连接的二糖；其中Xaa4是赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、二氨基丁酸、二氨基丙酸、丙氨酸、天冬氨酸或谷氨酸；且其中Xaa5-Xaa6表示B链的任选的一个或两个残基的延伸，其中Xaa5(如果选择存在)可以是Glu、Gln、Gly、Ala或Ser，且其中Xaa5-Xaa6(如果选择存在)得自相同组的氨基酸，使得至少一个延伸位置是谷氨酸。
在SEQ ID NO:9中提供通过对残基B27的N-连接的糖基化修饰、同时保留ProB28的变体B链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:9
其中Xaa1是PheB1的天然α-氨基或任选地通过肽键或任选的酰基接头连接至PheB1的α-氨基的苯基硼酸部分或苯基硼酸部分的卤素衍生物；其中Xaa2是苯丙氨酸、五氟-Phe、2-氯-Phe、2-溴-Phe、4-氯-Phe、2-甲基-Phe或环己烷基丙氨酸；其中Xaa3是选自α-D-吡喃甘露糖苷、α-D-吡喃葡萄糖苷或N-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖苷的Nβ-AsnB27-连接或Nγ-GlnB27-连接的单糖吡喃糖苷，或其中Xaa3是含有上述单糖亚基中的一种或多种的Nβ-AsnB27-连接或Nγ-GlnB27-连接的二糖；其中Xaa4是赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、二氨基丁酸、二氨基丙酸、正亮氨酸、氨基丁酸、氨基丙酸、丙氨酸或谷氨酸；且其中Xaa5-Xaa6表示B链的任选的一个或两个残基的延伸，其中Xaa5(如果选择存在)可以是Glu、Gln、Gly、Ala或Ser，且其中Xaa5-Xaa6(如果选择存在)得自相同组的氨基酸，使得至少一个延伸位置是谷氨酸。
在SEQ ID NO:10中提供通过对残基B27的N-连接的糖基化修饰、且在位置B29可替代放置脯氨酸的变体B链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:10
其中Xaa1是PheB1的天然α-氨基或任选地通过肽键或任选的酰基接头连接至PheB1的α-氨基的苯基硼酸部分或苯基硼酸部分的卤素衍生物；其中Xaa2是苯丙氨酸、五氟-Phe、2-氯-Phe、2-溴-Phe、4-氯-Phe、2-甲基-Phe或环己烷基丙氨酸；其中Xaa3是选自α-D-吡喃甘露糖苷、α-D-吡喃葡萄糖苷或N-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖苷的Nβ-AsnB27-连接或Nγ-GlnB27-连接的单糖吡喃糖苷，或其中Xaa3是含有上述单糖亚基中的一种或多种的Nβ-AsnB27-连接或Nγ-GlnB27-连接的二糖；其中Xaa4是赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、二氨基丁酸、二氨基丙酸、丙氨酸、天冬氨酸或谷氨酸；且其中Xaa5-Xaa6表示B链的任选的一个或两个残基的延伸，其中Xaa5(如果选择存在)可以是Glu、Gln、Gly、Ala或Ser，且其中Xaa5-Xaa6(如果选择存在)得自相同组的氨基酸，使得至少一个延伸位置是谷氨酸。
在SEQ ID NO:11中提供通过对位置B27的碱性残基的含二醇试剂修饰、同时保留ProB28的变体B链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:11
其中Xaa1是PheB1的天然α-氨基或任选地通过肽键或任选的酰基接头连接至PheB1的α-氨基的苯基硼酸部分或苯基硼酸部分的卤素衍生物；其中Xaa2是苯丙氨酸、五氟-Phe、2-氯-Phe、2-溴-Phe、4-氯-Phe、2-甲基-Phe或环己烷基丙氨酸；其中Xaa3是其侧链氨基连接至含二醇试剂的赖氨酸、鸟氨酸、二氨基丁酸或二氨基丙酸的D或L立体异构体的衍生物；其中Xaa4是精氨酸、丙氨酸或谷氨酸；且其中Xaa5-Xaa6表示B链的任选的一个或两个残基的延伸，其中Xaa5(如果选择存在)可以是Glu、Gln、Gly、Ala或Ser，且其中Xaa5-Xaa6(如果选择存在)得自相同组的氨基酸，使得至少一个延伸位置是谷氨酸。
在SEQ ID NO:12中提供通过对位置B27的碱性残基的含二醇试剂修饰、且在位置B29可替代放置脯氨酸的变体B链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:12
其中Xaa1是PheB1的天然α-氨基或任选地通过肽键或任选的酰基接头连接至PheB1的α-氨基的苯基硼酸部分或苯基硼酸部分的卤素衍生物；其中Xaa2是苯丙氨酸、五氟-Phe、2-氯-Phe、2-溴-Phe、4-氯-Phe、2-甲基-Phe或环己烷基丙氨酸；其中Xaa3是其侧链氨基连接至含二醇试剂的赖氨酸、鸟氨酸、二氨基丁酸或二氨基丙酸的D或L立体异构体的衍生物；其中Xaa4是精氨酸、丙氨酸、天冬氨酸或谷氨酸；且其中Xaa5-Xaa6表示B链的任选的一个或两个残基的延伸，其中Xaa5(如果选择存在)可以是Glu、Gln、Gly、Ala或Ser，且其中Xaa5-Xaa6(如果选择存在)得自相同组的氨基酸，使得至少一个延伸位置是谷氨酸。
在SEQ ID NO:13中提供通过对位置B27的含硫残基的含二醇试剂修饰、同时保留ProB28的变体B链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:13
其中Xaa1是PheB1的天然α-氨基或任选地通过肽键或任选的酰基接头连接至PheB1的α-氨基的苯基硼酸部分或苯基硼酸部分的卤素衍生物；其中Xaa2是苯丙氨酸、五氟-Phe、2-氯-Phe、2-溴-Phe、4-氯-Phe、2-甲基-Phe或环己烷基丙氨酸；其中Xaa3是其侧链硫原子连接至含二醇试剂的半胱氨酸或高半胱氨酸的D或L立体异构体的衍生物；其中Xaa4是精氨酸、二氨基丁酸、二氨基丙酸、正亮氨酸、氨基丁酸、氨基丙酸、丙氨酸或谷氨酸；且其中Xaa5-Xaa6表示B链的任选的一个或两个残基的延伸，其中Xaa5(如果选择存在)可以是Glu、Gln、Gly、Ala或Ser，且其中Xaa5-Xaa6(如果选择存在)得自相同组的氨基酸，使得至少一个延伸位置是谷氨酸。
在SEQ ID NO:14中提供通过对位置B27的含硫残基的含二醇试剂修饰、且在位置B29可替代放置脯氨酸的变体B链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:14
其中Xaa1是PheB1的天然α-氨基或任选地通过肽键或任选的酰基接头连接至PheB1的α-氨基的苯基硼酸部分或苯基硼酸部分的卤素衍生物；其中Xaa2是苯丙氨酸、五氟-Phe、2-氯-Phe、2-溴-Phe、4-氯-Phe、2-甲基-Phe或环己烷基丙氨酸；其中Xaa3是其侧链硫原子连接至含二醇试剂的半胱氨酸或高半胱氨酸的D或L立体异构体的衍生物；其中Xaa4是精氨酸、鸟氨酸、二氨基丁酸、二氨基丙酸、丙氨酸、天冬氨酸或谷氨酸；且其中Xaa5-Xaa6表示B链的任选的一个或两个残基的延伸，其中Xaa5(如果选择存在)可以是Glu、Gln、Gly、Ala或Ser，且其中Xaa5-Xaa6(如果选择存在)得自相同组的氨基酸，使得至少一个延伸位置是谷氨酸。
在SEQ ID NO:15中提供通过对残基B30的O-连接的糖基化修饰、同时保留ProB28的变体B链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:15
其中Xaa1是PheB1的天然α-氨基或任选地通过肽键或任选的酰基接头连接至PheB1的α-氨基的苯基硼酸部分或苯基硼酸部分的卤素衍生物；其中Xaa2是苯丙氨酸、五氟-Phe、2-氯-Phe、2-溴-Phe、4-氯-Phe、2-甲基-Phe或环己烷基丙氨酸；其中Xaa3是赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、二氨基丁酸、二氨基丙酸、正亮氨酸、氨基丁酸、氨基丙酸、丙氨酸或谷氨酸；Xaa4是选自α-D-吡喃甘露糖苷、α-D-吡喃葡萄糖苷或N-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖苷的Oβ-ThrB30-连接或Oβ-SerB30-连接的单糖吡喃糖苷，或其中Xaa4是含有上述单糖亚基中的一种或多种的Oβ-ThrB30-连接或Oβ-SerB30-连接的二糖；且其中Xaa5-Xaa6表示B链的任选的一个或两个残基的延伸，其中Xaa5(如果选择存在)可以是Glu、Gln、Gly、Ala或Ser，且其中Xaa5-Xaa6(如果选择存在)得自相同组的氨基酸，使得至少一个延伸位置是谷氨酸。
在SEQ ID NO:16中提供通过对残基B30的O-连接的糖基化修饰、且在位置B29可替代放置脯氨酸的变体B链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:16
其中Xaa1是PheB1的天然α-氨基或任选地通过肽键或任选的酰基接头连接至PheB1的α-氨基的苯基硼酸部分或苯基硼酸部分的卤素衍生物；其中Xaa2是苯丙氨酸、五氟-Phe、2-氯-Phe、2-溴-Phe、4-氯-Phe、2-甲基-Phe或环己烷基丙氨酸；其中Xaa3是赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、二氨基丁酸、二氨基丙酸、丙氨酸、天冬氨酸或谷氨酸；Xaa4是选自α-D-吡喃甘露糖苷、α-D-吡喃葡萄糖苷或N-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖苷的Oβ-ThrB30-连接或Oβ-SerB30-连接的单糖吡喃糖苷，或其中Xaa4是含有上述单糖亚基中的一种或多种的Oβ-ThrB30-连接或Oβ-SerB30-连接的二糖；且其中Xaa5-Xaa6表示B链的任选的一个或两个残基的延伸，其中Xaa5(如果选择存在)可以是Glu、Gln、Gly、Ala或Ser，且其中Xaa5-Xaa6(如果选择存在)得自相同组的氨基酸，使得至少一个延伸位置是谷氨酸。
在SEQ ID NO:17中提供通过对残基B30的N-连接的糖基化修饰、同时保留ProB28的变体B链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:17
其中Xaa1是PheB1的天然α-氨基或任选地通过肽键或任选的酰基接头连接至PheB1的α-氨基的苯基硼酸部分或苯基硼酸部分的卤素衍生物；其中Xaa2是苯丙氨酸、五氟-Phe、2-氯-Phe、2-溴-Phe、4-氯-Phe、2-甲基-Phe或环己烷基丙氨酸；其中Xaa3是赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、二氨基丁酸、二氨基丙酸、正亮氨酸、氨基丁酸、氨基丙酸、丙氨酸或谷氨酸；其中Xaa4是选自α-D-吡喃甘露糖苷、α-D-吡喃葡萄糖苷或N-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖苷的Nβ-AsnB30-连接或Nγ-GlnB30-连接的单糖吡喃糖苷，或其中Xaa4是含有上述单糖亚基中的一种或多种的Nβ-AsnB30-连接或Nγ-GlnB30-连接的二糖；且其中Xaa5-Xaa6表示B链的任选的一个或两个残基的延伸，其中Xaa5(如果选择存在)可以是Glu、Gln、Gly、Ala或Ser，且其中Xaa5-Xaa6(如果选择存在)得自相同组的氨基酸，使得至少一个延伸位置是谷氨酸。
在SEQ ID NO:18中提供通过对残基B30的N-连接的糖基化修饰、且在位置B29可替代放置脯氨酸的变体B链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:18
其中Xaa1是PheB1的天然α-氨基或任选地通过肽键或任选的酰基接头连接至PheB1的α-氨基的苯基硼酸部分或苯基硼酸部分的卤素衍生物；其中Xaa2是苯丙氨酸、五氟-Phe、2-氯-Phe、2-溴-Phe、4-氯-Phe、2-甲基-Phe或环己烷基丙氨酸；其中Xaa3是赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、二氨基丁酸、二氨基丙酸、丙氨酸、天冬氨酸或谷氨酸；其中Xaa4是选自α-D-吡喃甘露糖苷、α-D-吡喃葡萄糖苷或N-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖苷的Nβ-AsnB30-连接或Nγ-GlnB30-连接的单糖吡喃糖苷，或其中Xaa4是含有上述单糖亚基中的一种或多种的Nβ-AsnB30-连接或Nγ-GlnB30-连接的二糖；且其中Xaa5-Xaa6表示B链的任选的一个或两个残基的延伸，其中Xaa5(如果选择存在)可以是Glu、Gln、Gly、Ala或Ser，且其中Xaa5-Xaa6(如果选择存在)得自相同组的氨基酸，使得至少一个延伸位置是谷氨酸。
在SEQ ID NO:19中提供通过对位置B30的碱性残基的含二醇试剂修饰、同时保留ProB28的变体B链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:19
其中Xaa1是PheB1的天然α-氨基或任选地通过肽键或任选的酰基接头连接至PheB1的α-氨基的苯基硼酸部分或苯基硼酸部分的卤素衍生物；其中Xaa2是苯丙氨酸、五氟-Phe、2-氯-Phe、2-溴-Phe、4-氯-Phe、2-甲基-Phe或环己烷基丙氨酸；其中Xaa3是丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸或谷氨酸；其中Xaa4是其侧链氨基连接至含二醇试剂的赖氨酸、鸟氨酸、二氨基丁酸或二氨基丙酸的D或L立体异构体的衍生物；且其中Xaa5-Xaa6表示B链的任选的一个或两个残基的延伸，其中Xaa5(如果选择存在)可以是Glu、Gln、Gly、Ala或Ser，且其中Xaa5-Xaa6(如果选择存在)得自相同组的氨基酸，使得至少一个延伸位置是谷氨酸。
在SEQ ID NO:20中提供通过对位置B30的碱性残基的含二醇试剂修饰、且在位置B29可替代放置脯氨酸的变体B链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:20
其中Xaa1是PheB1的天然α-氨基或任选地通过肽键或任选的酰基接头连接至PheB1的α-氨基的苯基硼酸部分或苯基硼酸部分的卤素衍生物；其中Xaa2是苯丙氨酸、五氟-Phe、2-氯-Phe、2-溴-Phe、4-氯-Phe、2-甲基-Phe或环己烷基丙氨酸；其中Xaa3是丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸或谷氨酸；其中Xaa4是其侧链氨基连接至含二醇试剂的赖氨酸、鸟氨酸、二氨基丁酸或二氨基丙酸的D或L立体异构体的衍生物；且其中Xaa5-Xaa6表示B链的任选的一个或两个残基的延伸，其中Xaa5(如果选择存在)可以是Glu、Gln、Gly、Ala或Ser，且其中Xaa5-Xaa6(如果选择存在)得自相同组的氨基酸，使得至少一个延伸位置是谷氨酸。
在SEQ ID NO:21中提供通过对位置B30的含硫残基的含二醇试剂修饰、同时保留ProB28的变体B链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:21
其中Xaa1是PheB1的天然α-氨基或任选地通过肽键或任选的酰基接头连接至PheB1的α-氨基的苯基硼酸部分或苯基硼酸部分的卤素衍生物；其中Xaa2是苯丙氨酸、五氟-Phe、2-氯-Phe、2-溴-Phe、4-氯-Phe、2-甲基-Phe或环己烷基丙氨酸；其中Xaa3是丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸或谷氨酸；其中Xaa4是其侧链硫原子连接至含二醇试剂的半胱氨酸或高半胱氨酸的D或L立体异构体的衍生物；且其中Xaa5-Xaa6表示B链的任选的一个或两个残基的延伸，其中Xaa5(如果选择存在)可以是Glu、Gln、Gly、Ala或Ser，且其中Xaa5-Xaa6(如果选择存在)得自相同组的氨基酸，使得至少一个延伸位置是谷氨酸。
在SEQ ID NO:22中提供通过对位置B30的含硫残基的含二醇试剂修饰、且在位置B29可替代放置脯氨酸的变体B链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:22
其中Xaa1是PheB1的天然α-氨基或任选地通过肽键或任选的酰基接头连接至PheB1的α-氨基的苯基硼酸部分或苯基硼酸部分的卤素衍生物；其中Xaa2是苯丙氨酸、五氟-Phe、2-氯-Phe、2-溴-Phe、4-氯-Phe、2-甲基-Phe或环己烷基丙氨酸；其中Xaa3是丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸或谷氨酸；其中Xaa4是其侧链硫原子连接至含二醇试剂的半胱氨酸或高半胱氨酸的D或L立体异构体的衍生物；且其中Xaa5-Xaa6表示B链的任选的一个或两个残基的延伸，其中Xaa5(如果选择存在)可以是Glu、Gln、Gly、Ala或Ser，且其中Xaa5-Xaa6(如果选择存在)得自相同组的氨基酸，使得至少一个延伸位置是谷氨酸。
在SEQ ID NO:23中提供通过对残基B31的O-连接的糖基化修饰、同时保留ProB28的变体B链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:23
其中Xaa1是PheB1的天然α-氨基或任选地通过肽键或任选的酰基接头连接至PheB1的α-氨基的苯基硼酸部分或苯基硼酸部分的卤素衍生物；其中Xaa2是苯丙氨酸、五氟-Phe、2-氯-Phe、2-溴-Phe、4-氯-Phe、2-甲基-Phe或环己烷基丙氨酸；其中Xaa3是赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、二氨基丁酸、二氨基丙酸、正亮氨酸、氨基丁酸、氨基丙酸、丙氨酸或谷氨酸；其中Xaa4是选自α-D-吡喃甘露糖苷、α-D-吡喃葡萄糖苷或N-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖苷的Oβ-ThrB31-连接或Oβ-SerB31-连接的单糖吡喃糖苷，或其中Xaa4是含有上述单糖亚基中的一种或多种的Oβ-ThrB31-连接或Oβ-SerB31-连接的二糖；且其中Xaa5表示Glu、Gln、Gly、Ala或Ser。
在SEQ ID NO:24中提供通过对残基B31的O-连接的糖基化修饰、且在位置B29可替代放置脯氨酸的变体B链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:24
其中Xaa1是PheB1的天然α-氨基或任选地通过肽键或任选的酰基接头连接至PheB1的α-氨基的苯基硼酸部分或苯基硼酸部分的卤素衍生物；其中Xaa2是苯丙氨酸、五氟-Phe、2-氯-Phe、2-溴-Phe、4-氯-Phe、2-甲基-Phe或环己烷基丙氨酸；其中Xaa3是赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、二氨基丁酸、二氨基丙酸、丙氨酸、天冬氨酸或谷氨酸；其中Xaa4是选自α-D-吡喃甘露糖苷、α-D-吡喃葡萄糖苷或N-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖苷的Nβ-AsnB31-连接或Nγ-GlnB31-连接的单糖吡喃糖苷，或其中Xaa4是含有上述单糖亚基中的一种或多种的Nβ-AsnB31-连接或Nγ-GlnB31-连接的二糖；且Xaa5是Glu、Gln、Gly、Ala或Ser。
在SEQ ID NO:25中提供通过对残基B31的N-连接的糖基化修饰、同时保留ProB28的变体B链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:25
其中Xaa1是PheB1的天然α-氨基或任选地通过肽键或任选的酰基接头连接至PheB1的α-氨基的苯基硼酸部分或苯基硼酸部分的卤素衍生物；其中Xaa2是苯丙氨酸、五氟-Phe、2-氯-Phe、2-溴-Phe、4-氯-Phe、2-甲基-Phe或环己烷基丙氨酸；其中Xaa3是赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、二氨基丁酸、二氨基丙酸、正亮氨酸、氨基丁酸、氨基丙酸、丙氨酸或谷氨酸；其中Xaa4是选自α-D-吡喃甘露糖苷、α-D-吡喃葡萄糖苷或N-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖苷的Nβ-AsnB31-连接或Nγ-GlnB31-连接的单糖吡喃糖苷，或其中Xaa4是含有上述单糖亚基中的一种或多种的Nβ-AsnB31-连接或Nγ-GlnB31-连接的二糖；且其中Xaa5是Glu、Gln、Gly、Ala或Ser。
在SEQ ID NO:26中提供通过对残基B31的N-连接的糖基化修饰、且在位置B29可替代放置脯氨酸的变体B链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:26
其中Xaa1是PheB1的天然α-氨基或任选地通过肽键或任选的酰基接头连接至PheB1的α-氨基的苯基硼酸部分或苯基硼酸部分的卤素衍生物；其中Xaa2是苯丙氨酸、五氟-Phe、2-氯-Phe、2-溴-Phe、4-氯-Phe、2-甲基-Phe或环己烷基丙氨酸；其中Xaa3是赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、二氨基丁酸、二氨基丙酸、正亮氨酸、氨基丁酸、氨基丙酸、丙氨酸或谷氨酸；其中Xaa4是选自α-D-吡喃甘露糖苷、α-D-吡喃葡萄糖苷或N-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖苷的Nβ-AsnB31-连接或Nγ-GlnB31-连接的单糖吡喃糖苷，或其中Xaa4是含有上述单糖亚基中的一种或多种的Nβ-AsnB31-连接或Nγ-GlnB31-连接的二糖；且其中Xaa5是Glu、Gln、Gly、Ala或Ser。
在SEQ ID NO:27中提供通过对残基B31的含二醇试剂修饰、同时保留ProB28的变体B链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:27
其中Xaa1是PheB1的天然α-氨基或任选地通过肽键或任选的酰基接头连接至PheB1的α-氨基的苯基硼酸部分或苯基硼酸部分的卤素衍生物；其中Xaa2是苯丙氨酸、五氟-Phe、2-氯-Phe、2-溴-Phe、4-氯-Phe、2-甲基-Phe或环己烷基丙氨酸；其中Xaa3是赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、二氨基丁酸、二氨基丙酸、正亮氨酸、氨基丁酸、氨基丙酸、丙氨酸或谷氨酸；其中Xaa4是丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸或谷氨酸；其中Xaa5是其侧链氨基连接至含二醇试剂的赖氨酸、鸟氨酸、二氨基丁酸或二氨基丙酸的D或L立体异构体的衍生物；且其中Xaa5(如果选择存在)任选地是Glu、Gln、Gly、Ala或Ser。
在SEQ ID NO:28中提供通过对残基B31的含二醇试剂修饰、且在位置B29可替代放置脯氨酸的变体B链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:28
其中Xaa1是PheB1的天然α-氨基或任选地通过肽键或任选的酰基接头连接至PheB1的α-氨基的苯基硼酸部分或苯基硼酸部分的卤素衍生物；其中Xaa2是苯丙氨酸、五氟-Phe、2-氯-Phe、2-溴-Phe、4-氯-Phe、2-甲基-Phe或环己烷基丙氨酸；其中Xaa3是丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸或谷氨酸；其中Xaa4是丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸或谷氨酸；其中Xaa5是其侧链氨基连接至含二醇试剂的赖氨酸、鸟氨酸、二氨基丁酸或二氨基丙酸的D或L立体异构体的衍生物；且其中Xaa5(如果选择存在)任选地是Glu、Gln、Gly、Ala或Ser。
在SEQ ID NO:29中提供通过对位置B32的碱性残基的含二醇试剂修饰、同时保留ProB28的变体B链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:29
其中Xaa1是PheB1的天然α-氨基或任选地通过肽键或任选的酰基接头连接至PheB1的α-氨基的苯基硼酸部分或苯基硼酸部分的卤素衍生物；其中Xaa2是苯丙氨酸、五氟-Phe、2-氯-Phe、2-溴-Phe、4-氯-Phe、2-甲基-Phe或环己烷基丙氨酸；其中Xaa3是精氨酸、正亮氨酸、氨基丁酸、氨基丙酸、丙氨酸或谷氨酸；其中Xaa4是丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸或谷氨酸；且其中Xaa5是其侧链氨基连接至含二醇试剂的赖氨酸、鸟氨酸、二氨基丁酸或二氨基丙酸的D或L立体异构体的衍生物。
在SEQ ID NO:30中提供通过对残基B32的含二醇试剂修饰、且在位置B29可替代放置脯氨酸的变体B链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:30
其中Xaa1是PheB1的天然α-氨基或任选地通过肽键或任选的酰基接头连接至PheB1的α-氨基的苯基硼酸部分或苯基硼酸部分的卤素衍生物；其中Xaa2是苯丙氨酸、五氟-Phe、2-氯-Phe、2-溴-Phe、4-氯-Phe、2-甲基-Phe或环己烷基丙氨酸；其中Xaa3是丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸或谷氨酸；其中Xaa4是丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸或谷氨酸；且其中Xaa5是其侧链氨基连接至含二醇试剂的赖氨酸、鸟氨酸、二氨基丁酸或二氨基丙酸的D或L立体异构体的衍生物。
在SEQ ID NO:31中提供通过对位置B32的含硫残基的含二醇试剂修饰、同时保留ProB28的变体B链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:31
其中Xaa1是PheB1的天然α-氨基或任选地通过肽键或任选的酰基接头连接至PheB1的α-氨基的苯基硼酸部分或苯基硼酸部分的卤素衍生物；其中Xaa2是苯丙氨酸、五氟-Phe、2-氯-Phe、2-溴-Phe、4-氯-Phe、2-甲基-Phe或环己烷基丙氨酸；其中Xaa3是赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、二氨基丁酸、二氨基丙酸、正亮氨酸、氨基丁酸、氨基丙酸、丙氨酸或谷氨酸；其中Xaa4是丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸或谷氨酸；且其中Xaa5是其侧链硫原子连接至含二醇试剂的半胱氨酸或高半胱氨酸的D或L立体异构体的衍生物。
在SEQ ID NO:32中提供通过对位置B32的含硫残基的含二醇试剂修饰、且在位置B29可替代放置脯氨酸的变体B链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:32
其中Xaa1是PheB1的天然α-氨基或任选地通过肽键或任选的酰基接头连接至PheB1的α-氨基的苯基硼酸部分或苯基硼酸部分的卤素衍生物；其中Xaa2是苯丙氨酸、五氟-Phe、2-氯-Phe、2-溴-Phe、4-氯-Phe、2-甲基-Phe或环己烷基丙氨酸；其中Xaa3是丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸或谷氨酸；其中Xaa4是丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸或谷氨酸；且其中Xaa5是其侧链硫原子连接至含二醇试剂的半胱氨酸或高半胱氨酸的D或L立体异构体的衍生物。
在SEQ ID NO:33中给出通过对位置B29的碱性残基的含二醇试剂修饰的变体B链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:33
其中Xaa1是PheB1的天然α-氨基或任选地通过肽键或任选的酰基接头连接至PheB1的α-氨基的苯基硼酸部分或苯基硼酸部分的卤素衍生物；其中Xaa2是苯丙氨酸、五氟-Phe、2-氯-Phe、2-溴-Phe、4-氯-Phe、2-甲基-Phe或环己烷基丙氨酸；其中Xaa3是脯氨酸、丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸或谷氨酸；其中Xaa4是其侧链氨基连接至含二醇试剂的赖氨酸、鸟氨酸、二氨基丁酸或二氨基丙酸的D或L立体异构体的衍生物；且其中Xaa5-Xaa6表示B链的任选的一个或两个残基的延伸，其中Xaa5(如果选择存在)可以是Glu、Gln、Gly、Ala或Ser，且其中Xaa5-Xaa6(如果选择存在)得自相同组的氨基酸，使得至少一个延伸位置是谷氨酸。
在SEQ ID NO:34中给出通过对位置B29的碱性残基的含二醇试剂修饰的变体脱-B30 B链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:34
其中Xaa1是PheB1的天然α-氨基或任选地通过肽键或任选的酰基接头连接至PheB1的α-氨基的苯基硼酸部分或苯基硼酸部分的卤素衍生物；其中Xaa2是苯丙氨酸、五氟-Phe、2-氯-Phe、2-溴-Phe、4-氯-Phe、2-甲基-Phe或环己烷基丙氨酸；其中Xaa3是脯氨酸、丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸或谷氨酸；且其中Xaa4是其侧链氨基连接至含二醇试剂的赖氨酸、鸟氨酸、二氨基丁酸或二氨基丙酸的D或L立体异构体的衍生物。
在SEQ ID NO:35中提供通过对位置B29的含硫残基的含二醇试剂修饰的变体B链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:35
其中Xaa1是PheB1的天然α-氨基或任选地通过肽键或任选的酰基接头连接至PheB1的α-氨基的苯基硼酸部分或苯基硼酸部分的卤素衍生物；其中Xaa2是苯丙氨酸、五氟-Phe、2-氯-Phe、2-溴-Phe、4-氯-Phe、2-甲基-Phe或环己烷基丙氨酸；其中Xaa3是脯氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、二氨基丁酸、二氨基丙酸、正亮氨酸、氨基丁酸、氨基丙酸、丙氨酸、天冬氨酸或谷氨酸；其中Xaa4是其侧链硫原子连接至含二醇试剂的半胱氨酸或高半胱氨酸的D或L立体异构体的衍生物；且其中Xaa5-Xaa6表示B链的任选的一个或两个残基的延伸，其中Xaa5(如果选择存在)可以是Glu、Gln、Gly、Ala或Ser，且其中Xaa5-Xaa6(如果选择存在)得自相同组的氨基酸，使得至少一个延伸位置是谷氨酸。
在SEQ ID NO:36中提供通过对位置B29的含硫残基的含二醇试剂修饰的变体脱-B30 B链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:36
其中Xaa1是PheB1的天然α-氨基或任选地通过肽键或任选的酰基接头连接至PheB1的α-氨基的苯基硼酸部分或苯基硼酸部分的卤素衍生物；其中Xaa2是苯丙氨酸、五氟-Phe、2-氯-Phe、2-溴-Phe、4-氯-Phe、2-甲基-Phe或环己烷基丙氨酸；其中Xaa3是脯氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、二氨基丁酸、二氨基丙酸、正亮氨酸、氨基丁酸、氨基丙酸、丙氨酸、天冬氨酸或谷氨酸；且其中Xaa4是其侧链硫原子连接至含二醇试剂的半胱氨酸或高半胱氨酸的D或L立体异构体的衍生物。
在SEQ ID NO:37中提供通过对位置B28的含硫残基的含二醇试剂修饰的变体B链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:37
其中Xaa1是PheB1的天然α-氨基或任选地通过肽键或任选的酰基接头连接至PheB1的α-氨基的苯基硼酸部分或苯基硼酸部分的卤素衍生物；其中Xaa2是苯丙氨酸、五氟-Phe、2-氯-Phe、2-溴-Phe、4-氯-Phe、2-甲基-Phe或环己烷基丙氨酸；其中Xaa3是其侧链硫原子连接至含二醇试剂的半胱氨酸或高半胱氨酸的D或L立体异构体的衍生物；其中Xaa4是赖氨酸、脯氨酸、精氨酸、丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、正亮氨酸、氨基丁酸、氨基丙酸、鸟氨酸、二氨基丁酸或二氨基丙酸；且其中Xaa5-Xaa6表示B链的任选的一个或两个残基的延伸，其中Xaa5(如果选择存在)可以是Glu、Gln、Gly、Ala或Ser，且其中Xaa5-Xaa6(如果选择存在)得自相同组的氨基酸，使得至少一个延伸位置是谷氨酸。
在SEQ ID NO:38中提供通过对位置B28的含硫残基的含二醇试剂修饰的变体脱-B30 B链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:38
其中Xaa1是PheB1的天然α-氨基或任选地通过肽键或任选的酰基接头连接至PheB1的α-氨基的苯基硼酸部分或苯基硼酸部分的卤素衍生物；其中Xaa2是苯丙氨酸、五氟-Phe、2-氯-Phe、2-溴-Phe、4-氯-Phe、2-甲基-Phe或环己烷基丙氨酸；其中Xaa3是其侧链硫原子连接至含二醇试剂的半胱氨酸或高半胱氨酸的D或L立体异构体的衍生物；且其中Xaa4是赖氨酸、脯氨酸、精氨酸、丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、正亮氨酸、氨基丁酸、氨基丙酸、鸟氨酸、二氨基丁酸或二氨基丙酸。
在SEQ ID NO:39中提供通过对位置B28的含硫残基的含二醇试剂修饰的变体脱-[B29, B30] B链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:39
其中Xaa1是PheB1的天然α-氨基或任选地通过肽键或任选的酰基接头连接至PheB1的α-氨基的苯基硼酸部分或苯基硼酸部分的卤素衍生物；其中Xaa2是苯丙氨酸、五氟-Phe、2-氯-Phe、2-溴-Phe、4-氯-Phe、2-甲基-Phe或环己烷基丙氨酸；且其中Xaa3是其侧链硫原子连接至含二醇试剂的半胱氨酸或高半胱氨酸的D或L立体异构体的衍生物。
在SEQ ID NO:40中提供通过对位置B28的碱性残基的含二醇试剂修饰的变体B链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:40
其中Xaa1是PheB1的天然α-氨基或任选地通过肽键或任选的酰基接头连接至PheB1的α-氨基的苯基硼酸部分或苯基硼酸部分的卤素衍生物；其中Xaa2是苯丙氨酸、五氟-Phe、2-氯-Phe、2-溴-Phe、4-氯-Phe、2-甲基-Phe或环己烷基丙氨酸；其中Xaa3是其侧链氨基连接至含二醇试剂的赖氨酸、鸟氨酸、二氨基丁酸或二氨基丙酸的D或L立体异构体的衍生物；且其中Xaa5-Xaa6表示B链的任选的一个或两个残基的延伸，其中Xaa5(如果选择存在)可以是Glu、Gln、Gly、Ala或Ser，且其中Xaa5-Xaa6(如果选择存在)得自相同组的氨基酸，使得至少一个延伸位置是谷氨酸。
在SEQ ID NO:41中提供通过对位置B28的碱性残基的含二醇试剂修饰的变体脱-B30 B链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:41
其中Xaa1是PheB1的天然α-氨基或任选地通过肽键或任选的酰基接头连接至PheB1的α-氨基的苯基硼酸部分或苯基硼酸部分的卤素衍生物；其中Xaa2是苯丙氨酸、五氟-Phe、2-氯-Phe、2-溴-Phe、4-氯-Phe、2-甲基-Phe或环己烷基丙氨酸；其中Xaa3是其侧链氨基连接至含二醇试剂的赖氨酸、鸟氨酸、二氨基丁酸或二氨基丙酸的D或L立体异构体的衍生物；且其中Xaa4是赖氨酸、脯氨酸、精氨酸、丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、正亮氨酸、氨基丁酸、氨基丙酸、鸟氨酸、二氨基丁酸或二氨基丙酸。
在SEQ ID NO:42中提供通过对位置B28的碱性残基的含二醇试剂修饰的变体脱-[B29, B30] B链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:42
其中Xaa1是PheB1的天然α-氨基或任选地通过肽键或任选的酰基接头连接至PheB1的α-氨基的苯基硼酸部分或苯基硼酸部分的卤素衍生物；其中Xaa2是苯丙氨酸、五氟-Phe、2-氯-Phe、2-溴-Phe、4-氯-Phe、2-甲基-Phe或环己烷基丙氨酸；且其中Xaa3是其侧链氨基连接至含二醇试剂的赖氨酸、鸟氨酸、二氨基丁酸或二氨基丙酸的D或L立体异构体的衍生物。
在SEQ ID NO:43中给出通过对位置B29的碱性残基的含二醇试剂修饰的变体B链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:43
其中Xaa1是PheB1的天然α-氨基或任选地通过肽键或任选的酰基接头连接至PheB1的α-氨基的苯基硼酸部分或苯基硼酸部分的卤素衍生物；其中Xaa2是苯丙氨酸、五氟-Phe、2-氯-Phe、2-溴-Phe、4-氯-Phe、2-甲基-Phe或环己烷基丙氨酸；其中Xaa3是脯氨酸、丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸或谷氨酸；其中Xaa4是其侧链氨基连接至含二醇试剂的赖氨酸、鸟氨酸、二氨基丁酸或二氨基丙酸的D或L立体异构体的衍生物；且其中Xaa5-Xaa6表示B链的任选的一个或两个残基的延伸，其中Xaa5(如果选择存在)可以是Glu、Gln、Gly、Ala或Ser，且其中Xaa5-Xaa6(如果选择存在)得自相同组的氨基酸，使得至少一个延伸位置是谷氨酸。
在SEQ ID NO:44中给出通过对位置B29的碱性残基的含二醇试剂修饰的变体脱-B30 B链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:44
其中Xaa1是PheB1的天然α-氨基或任选地通过肽键或任选的酰基接头连接至PheB1的α-氨基的苯基硼酸部分或苯基硼酸部分的卤素衍生物；其中Xaa2是苯丙氨酸、五氟-Phe、2-氯-Phe、2-溴-Phe、4-氯-Phe、2-甲基-Phe或环己烷基丙氨酸；其中Xaa3是脯氨酸、丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸或谷氨酸；且其中Xaa4是其侧链氨基连接至含二醇试剂的赖氨酸、鸟氨酸、二氨基丁酸或二氨基丙酸的D或L立体异构体的衍生物。
在SEQ ID NO:45中提供通过对位置B29的含硫残基的含二醇试剂修饰、同时保留ProB28的变体B链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:45
其中Xaa1是PheB1的天然α-氨基或任选地通过肽键或任选的酰基接头连接至PheB1的α-氨基的苯基硼酸部分或苯基硼酸部分的卤素衍生物；其中Xaa2是苯丙氨酸、五氟-Phe、2-氯-Phe、2-溴-Phe、4-氯-Phe、2-甲基-Phe或环己烷基丙氨酸；其中Xaa3是赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、二氨基丁酸、二氨基丙酸、正亮氨酸、氨基丁酸、氨基丙酸、丙氨酸或谷氨酸；其中Xaa3是丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸或谷氨酸；其中Xaa4是其侧链硫原子连接至含二醇试剂的半胱氨酸或高半胱氨酸的D或L立体异构体的衍生物；且其中Xaa5-Xaa6表示B链的任选的一个或两个残基的延伸，其中Xaa5(如果选择存在)可以是Glu、Gln、Gly、Ala或Ser，且其中Xaa5-Xaa6(如果选择存在)得自相同组的氨基酸，使得至少一个延伸位置是谷氨酸。
在SEQ ID NO:46中提供通过对位置B29的含硫残基的含二醇试剂修饰的变体脱-B30 B链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:46
其中Xaa1是PheB1的天然α-氨基或任选地通过肽键或任选的酰基接头连接至PheB1的α-氨基的苯基硼酸部分或苯基硼酸部分的卤素衍生物；其中Xaa2是苯丙氨酸、五氟-Phe、2-氯-Phe、2-溴-Phe、4-氯-Phe、2-甲基-Phe或环己烷基丙氨酸；其中Xaa3是赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、二氨基丁酸、二氨基丙酸、正亮氨酸、氨基丁酸、氨基丙酸、丙氨酸或谷氨酸；其中Xaa3是丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸或谷氨酸；且其中Xaa4是其侧链硫原子连接至含二醇试剂的半胱氨酸或高半胱氨酸的D或L立体异构体的衍生物。
在SEQ ID NO:47中提供通过对残基B28的O-连接的糖基化修饰的变体B链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:47
其中Xaa1是PheB1的天然α-氨基或任选地通过肽键或任选的酰基接头连接至PheB1的α-氨基的苯基硼酸部分或苯基硼酸部分的卤素衍生物；其中Xaa2是苯丙氨酸、五氟-Phe、2-氯-Phe、2-溴-Phe、4-氯-Phe、2-甲基-Phe或环己烷基丙氨酸；其中Xaa3是选自α-D-吡喃甘露糖苷、α-D-吡喃葡萄糖苷或N-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖苷的Oβ-ThrB28-连接或Oβ-SerB28-连接的单糖吡喃糖苷，或其中Xaa3是含有上述单糖亚基中的一种或多种的Oβ-ThrB28-连接或Oβ-SerB28-连接的二糖；其中Xaa4是精氨酸、鸟氨酸、二氨基丁酸、二氨基丙酸、脯氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺或谷氨酸；且其中Xaa5-Xaa6表示B链的任选的一个或两个残基的延伸，其中Xaa5(如果选择存在)可以是Glu、Gln、Gly、Ala或Ser，且其中Xaa5-Xaa6(如果选择存在)得自相同组的氨基酸，使得至少一个延伸位置是谷氨酸。
在SEQ ID NO:48中提供通过对残基B28的N-连接的糖基化修饰的变体B链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:48
其中Xaa1是PheB1的天然α-氨基或任选地通过肽键或任选的酰基接头连接至PheB1的α-氨基的苯基硼酸部分或苯基硼酸部分的卤素衍生物；其中Xaa2是苯丙氨酸、五氟-Phe、2-氯-Phe、2-溴-Phe、4-氯-Phe、2-甲基-Phe或环己烷基丙氨酸；其中Xaa3是选自α-D-吡喃甘露糖苷、α-D-吡喃葡萄糖苷或N-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖苷的Nβ-AsnB28-连接或Nγ-GlnB28-连接的单糖吡喃糖苷，或其中Xaa3是含有上述单糖亚基中的一种或多种的Nβ-AsnB28-连接或Nγ-GlnB28-连接的二糖；其中Xaa4是精氨酸、鸟氨酸、二氨基丁酸、二氨基丙酸、脯氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺或谷氨酸；且其中Xaa5-Xaa6表示B链的任选的一个或两个残基的延伸，其中Xaa5(如果选择存在)可以是Glu、Gln、Gly、Ala或Ser，且其中Xaa5-Xaa6(如果选择存在)得自相同组的氨基酸，使得至少一个延伸位置是谷氨酸。
在SEQ ID NO:49中提供通过对残基B29的O-连接的糖基化修饰的变体B链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:49
其中Xaa1是PheB1的天然α-氨基或任选地通过肽键或任选的酰基接头连接至PheB1的α-氨基的苯基硼酸部分或苯基硼酸部分的卤素衍生物；其中Xaa2是苯丙氨酸、五氟-Phe、2-氯-Phe、2-溴-Phe、4-氯-Phe、2-甲基-Phe或环己烷基丙氨酸；其中Xaa3是精氨酸、鸟氨酸、二氨基丁酸、二氨基丙酸、脯氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺或谷氨酸；其中Xaa4是选自α-D-吡喃甘露糖苷、α-D-吡喃葡萄糖苷或N-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖苷的Oβ-ThrB29-连接或Oβ-SerB29-连接的单糖吡喃糖苷，或其中Xaa3是含有上述单糖亚基中的一种或多种的Oβ-ThrB29-连接或Oβ-SerB29-连接的二糖；且其中Xaa5-Xaa6表示B链的任选的一个或两个残基的延伸，其中Xaa5(如果选择存在)可以是Glu、Gln、Gly、Ala或Ser，且其中Xaa5-Xaa6(如果选择存在)得自相同组的氨基酸，使得至少一个延伸位置是谷氨酸。
在SEQ ID NO:50中提供通过对残基B29的N-连接的糖基化修饰的变体B链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:50
其中Xaa1是PheB1的天然α-氨基或任选地通过肽键或任选的酰基接头连接至PheB1的α-氨基的苯基硼酸部分或苯基硼酸部分的卤素衍生物；其中Xaa2是苯丙氨酸、五氟-Phe、2-氯-Phe、2-溴-Phe、4-氯-Phe、2-甲基-Phe或环己烷基丙氨酸；其中Xaa3是精氨酸、鸟氨酸、二氨基丁酸、二氨基丙酸、脯氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺或谷氨酸；其中Xaa4是选自α-D-吡喃甘露糖苷、α-D-吡喃葡萄糖苷或N-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖苷的Nβ-AsnB29-连接或Nγ-GlnB29-连接的单糖吡喃糖苷，或其中Xaa3是含有上述单糖亚基中的一种或多种的Nβ-AsnB29-连接或Nγ-GlnB29-连接的二糖；且其中Xaa5-Xaa6表示B链的任选的一个或两个残基的延伸，其中Xaa5(如果选择存在)可以是Glu、Gln、Gly、Ala或Ser，且其中Xaa5-Xaa6(如果选择存在)得自相同组的氨基酸，使得至少一个延伸位置是谷氨酸。
SEQ ID NO:51提供了通过对GlyA1的α-氨基的苯基硼酸修饰的人胰岛素的变体A链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:51
其中Xaa1是通过肽键或任选的酰基接头连接至GlyA1的α-氨基的苯基硼酸部分或苯基硼酸部分的卤素衍生物；其中Xaa2是苏氨酸、丙氨酸、组氨酸、谷氨酰胺、精氨酸或谷氨酸；其中Xaa3是Leu或Trp；其中Xaa4是酪氨酸、丙氨酸或谷氨酸；其中Xaa5是谷氨酸、谷氨酰胺或精氨酸；且其中Xaa6是天冬酰胺、天冬氨酸、丙氨酸或甘氨酸。
SEQ ID NO:52提供了通过对位置A4的碱性残基的侧链氨基的苯基硼酸修饰的人胰岛素的变体A链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:52
其中Xaa1是连接至赖氨酸、鸟氨酸、二氨基丁酸或二氨基丙酸的侧链氨基的苯基硼酸部分或苯基硼酸部分的卤素衍生物；其中Xaa2是苏氨酸、丙氨酸、组氨酸、谷氨酰胺、精氨酸或谷氨酸；其中Xaa3是Leu或Trp；其中Xaa4是酪氨酸、丙氨酸或谷氨酸；其中Xaa5是谷氨酸、谷氨酰胺或精氨酸；且其中Xaa6是天冬酰胺、天冬氨酸、丙氨酸或甘氨酸。
SEQ ID NO:53提供了人胰岛素的变体A链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:53
其中Xaa1是碱性残基，其选自D-赖氨酸、L-赖氨酸、D-鸟氨酸、L-鸟氨酸、D-二氨基丙酸、L-二氨基丙酸，其侧链氨基通过苯基硼酸部分、任选地包括卤素修饰衍生化，且任选地经由酰基接头连接；其中Xaa2是苏氨酸、丙氨酸、组氨酸、谷氨酰胺、精氨酸或谷氨酸；其中Xaa3是Leu或Trp；其中Xaa4是酪氨酸、丙氨酸或谷氨酸；其中Xaa5是谷氨酸、谷氨酰胺或精氨酸；且其中Xaa6是天冬酰胺、天冬氨酸、丙氨酸或甘氨酸。
通过胰蛋白酶介导的半合成制备含有α-D-甘露吡喃糖苷、α-D-吡喃葡萄糖苷和/或N-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖苷作为苏氨酸的Oβ-连接的加合物的胰岛素类似物。用于半合成的方案采用人胰岛素的脱-八肽[B23-B30]片段或胰岛素类似物连同含有N-末端甘氨酸(八肽、九肽或十肽)和在ThrB27和/或ThrB30的单糖加合物的合成肽。脱-八肽[B23-B30]片段含有野生型胰岛素的三种天然二硫键；包括通过高效液相色谱法纯化片段、肽和产物的方案是所述的修改方案(Mirmira, R.G.,和Tager, H.S., 1989. J. Biol. Chem. 264:6349-6354.)这种方案采用(i)含有单糖吡喃糖苷加合物的合成肽(SEQ ID NO:53-65)和(ii)截短的类似物脱-三肽[B1-B3]-脱-八肽[B23-B30]-胰岛素，或者在[HisA4, HisA8,GlyA21]-胰岛素类似物，[HisA4, HisA8, GlyA21]-脱-三肽[B1-B3]-脱-八肽[B23-B30]-胰岛素的情况下，或者在GlnB13-胰岛素类似物、GlnB13-脱-三肽[B1-B3]-脱-八肽[B23-B30]-胰岛素的情况下，或者在HisA8-胰岛素类似物的情况下，引用下述文献来证明本领域普通技术人员将理解本文所述的测试和测定方法。
苯基硼酸的NHS活化：
为了制备其中GlyA1的α-氨基被FPA修饰的胰岛素类似物，用三个步骤开发方案。
(i) 步骤1：PBA试剂的活化。
使用N-羟基琥珀酰胺(NHS) (Sigma Aldrich, St. Louis, MO)实现将4-羧基-3-氟-苯基硼酸频哪醇酯(PBA；购自Combi-Blocks, San Diego, CA)活化为能够偶联的种类。我们如下说明该步骤。为此，将PBA (300 mg, 1.126 mmol)溶解于4.4 mL乙酸乙酯中，并在4℃下培育20分钟。向该反应混合物中加入131 mg (1.14 mmol) NHS和247 mg (1.86mmol)二环己基碳二亚胺(DCC) (Sigma Aldrich, St. Louis, MO)。将溶液在室温下搅拌过夜。在Eppendorf®微量离心机中以13,500rpm离心5分钟来除去N, N’-二环己基脲副产物。真空除去溶剂。通过从丙酮和正己烷中重结晶来纯化PBA-N-羟基琥珀酰亚胺酯。产物在乙腈中制成30 mg/ml。
(ii) 步骤2：活化的PBA与胰岛素片段的N-末端的偶联。
将Des[B23-B30]-八肽胰岛素(DOI)(在100 μl 0.1 M碳酸钠中的5mg，pH7.6)与100μl乙腈中的PBA的NHS-酯(30 mg/ml)合并。将溶液在25℃下搅拌2小时。反应停止在其中存在单一和双衍生的DOI分子的阶段；这些通过反相高效液相色谱(HPLC)分离并单独纯化。使用具有Higgins Analytical® Proto 300 C4柱(10μm, 250x20 mm)的Waters® 2535四级梯度色谱系统。使用双缓冲液流动相用于纯化：0.1％三氟乙酸水溶液(TFA；缓冲液A)和0.1％ TFA/乙腈(缓冲液B)，梯度为5-95％缓冲液B，历时40分钟。使用Waters 2489 UV/Vis检测器通过在215和280 nm处的紫外吸收来监测蛋白洗脱时间。分别在18分钟和19.5分钟洗脱单和双偶联分子。使用Applied Biosystems® 4700蛋白质组学分析仪通过MALDI-TOF质谱法证实蛋白产物的鉴定。使用α-氰基-4-羟基肉桂酸(α-CHCA)(Sigma-Aldrich, St.Louis, MO)于50％乙腈(0.1％ TFA)中的饱和溶液作为基质。质量显示在激光解吸后与酸酐形成相关的两个羟基的损失，如先前报道的那样(Hoeg-Jensen, 等人). (Mass ofSingle-Coupled DOI: 4997, Mass of Double-Coupled DOI: 5127)。发现该反应在与B链偶联之前将PBA与A链的N-末端偶联。在室温下在1x PBS pH 7.4中用50 mM二硫苏糖醇(DTT)还原1小时后，证实单偶联类似物的鉴定。将蛋白使用Millipore® C18 ZipTip®移液管吸头脱盐，并洗脱至5μLα-CHCA基质中。用MALDI-TOF质谱证实单个多肽链的质量(质量PBA偶联的A链：2515，质量B链：2488)。使用Labconco® Freezezone 6®冻干机冻干样品。
(iii) 步骤3：胰蛋白酶介导的半合成。
通过如上所述的胰蛋白酶介导的半合成制备所需的胰岛素类似物。
为了评估与胰岛素类似物六聚体的去组装有关的动力学性质，如Richards,J.P., 等人(“Self-association properties of monomeric insulin analogs underformulation conditions.” Pharm. Res. 15:1434-41; 1998.)所述采用视觉吸收光谱。简而言之，视觉吸收光谱提供了一种方便的探针来监测酚稳定的R6 Co2+ -取代的胰岛素六聚体的形成和去组装。为此，在不存在葡萄糖或存在25mM葡萄糖的情况下，在含有50 mMTris-HCl (pH 7.4)、50 mM苯酚、0.2 mM CoCl2和2 mM NaSCN的缓冲液中制备0.6mM的胰岛素类似物。在每种情况下样品pH为7.4，并且在研究之前将样品在室温下培育过夜以确保达到构象平衡。获得光谱(400-750nm)以监测四面体Co2+配位，其在574nm处或附近具有特征d-d吸收谱带。为了确定从六聚体释放Co2+的速率，通过加入EDTA储备溶液(50mM，pH7.4)的等分试样至最终EDTA浓度2 mM(即超过钴离子的总浓度)，在33℃(以模拟皮下温度)开始金属离子螯合。以数秒至数小时的时间标度监测574-nm吸收谱带的衰减。收集解离后吸收光谱(400-750nm)以证实d-d吸收谱带的完全衰减。将动力学数据拟合至单指数衰减函数，以确定解离速率(或相当于Co2+配位变体胰岛素R6六聚体的半衰期)。
啮齿动物测定 - 通过用链脲霉素(STZ)处理使雄性Lewis大鼠(平均体重~300 g)患有糖尿病，如所述(35)。为了测试胰岛素类似物相对于OrnB29-胰岛素或NleB29-胰岛素的体内效力，在由16mg甘油、1.6mg间甲酚、0.65mg苯酚和3.8mg磷酸钠组成的缓冲液(pH 7.4)中构成含有胰岛素类似物的蛋白溶液。将胰岛素类似物以10μg/100μl缓冲液/300g大鼠的剂量静脉内(IV)注射到尾静脉中。在接下来的几小时内，使用临床血糖计(EasyMax VoiceBlood Glucose Meter)通过连续测量来监测所产生的血糖浓度变化。将胰岛素类似物各自通过反相HPLC重新纯化，干燥至粉末，以相同的最大蛋白浓度溶解在稀释液中，并通过分析型C4反相HPLC重新定量；使用上述缓冲液进行稀释。
在时间t = 0，IV注射大鼠。在时间t = 0和第一个小时每10分钟，第二个小时每20分钟，第三个小时每30分钟，其后最多达360分钟每小时，从尾部的夹钳的尖头获得血液。虽然高亲和力天然类似物的研究大小有限(N = 5只大鼠)，但以更大能力评估了碘-TyrB26修饰的影响。因此，在六个月内以四个日期重复3-I-TyrB26-NleB29-胰岛素的研究(相对于NleB29-胰岛素)，以避免周与周之间可能影响大鼠集落的环境的混杂变量。从大集落(50只大鼠)随机获得在每个日期研究的大鼠(N = 4或5)。基线时的平均血糖水平在每组和每个日期相似；在每个日期都观察到类似的个体趋势。使用下述计算胰岛素作用在降低血糖浓度中的效力：(a)在第一小时内的浓度变化(d[葡萄糖]/dt)；(b)葡萄糖时间依赖性和从起始血糖浓度至最终浓度的近水平线之间的积分面积；和(c)在第一个0-80分钟内相同曲线的积分面积相对于80-360分钟间隔中观察到的积分面积(后者表示胰岛素作用的延迟“尾”)。通过梯形近似估计线性上高血糖基线下和代表观察到的血糖浓度的曲线上的面积，并表示为AOC。使用Student’s t-检验进行统计学显著性的评估。
我们的体外胰岛素受体结合测定法采用溶解的具有C-末端链霉抗生物素蛋白结合蛋白标签的胰岛素受体(同种型B)，其通过依次麦胚凝集素(WGA)和Streptactin-亲和色谱法从稳定转染的表达胰岛素受体同种型的293PEAK细胞系的去垢剂裂解物纯化。在96-孔板(Costar)中制备100 µl结合缓冲液(100 mM HEPES (pH 7.8), 100 mM NaCl, 10 mMMgSO4, 0.025% (v/v) Tween 20和0.5% (w/v)牛血清白蛋白)中的胰岛素类似物的系列稀释(11次稀释，每次5倍，最大最终浓度为2μM)。该测定通过向孔中加入100μl结合缓冲液来起始，并补充有(i)WGA闪烁-邻近测定(SPA)珠粒(Perkin Elmer)，(ii)溶解的受体和(iii)作为放射性标记的示踪剂的125I-TyrA14-胰岛素。[125I]-标记的配体的最终浓度为7.5 pM，且调节添加的受体的量，使得在没有竞争剂的情况下标记的配体结合的程度为总添加计数的< 15%，以避免配体-耗尽假象。将板在轻轻振荡下在室温下培育24小时，离心，并在12检测器Trilux闪烁计数器(Perkin Elmer/Wallac)中计数5分钟/孔。为了获得类似物解离常数，通过非线性回归分析竞争结合数据。

Claims (48)

1.一种胰岛素类似物，其含有在A链N-末端处或其附近的通过单体葡萄糖结合部分的修饰和变体B链，所述变体B链在其C-末端处或其附近含有含二醇的修饰或α-羟基羧酸酯修饰。
2.权利要求1的胰岛素类似物，其中所述含二醇的修饰通过含有硫醇基或含有氨基的D-氨基酸的侧链缀合。
3.权利要求2的胰岛素类似物，其中所述D-氨基酸是D-半胱氨酸、D-高半胱氨酸、D-赖氨酸、D-鸟氨酸、D-二氨基丁酸或D-二氨基丙酸。
4.权利要求1至3中任一项的胰岛素类似物，其中所述单体葡萄糖结合部分包含苯基硼酸或卤素修饰的苯基硼酸衍生物。
5.权利要求1至4中任一项的胰岛素类似物，其中所述单体葡萄糖结合部分通过间隔物元件与胰岛素A链缀合，所述间隔物元件任选为具有0至16个碳原子的酰基。
6.权利要求1至5中任一项的胰岛素类似物，其中所述单体葡萄糖结合部分与α-氨基官能团连接。
7.权利要求6的胰岛素类似物，其中所述单体葡萄糖结合部分与在位置A1处取代的D-赖氨酸、D-鸟氨酸、D-二氨基丁酸或D-二氨基丙酸的侧链氨基官能团连接。
8.权利要求6的胰岛素类似物，其中所述单体葡萄糖结合部分与在位置A4处取代的L-赖氨酸、L-鸟氨酸、L-二氨基丁酸或L-二氨基丙酸的侧链氨基官能团连接。
9.权利要求7的胰岛素类似物，其中所述单体葡萄糖结合部分同时与A4取代基的侧链氨基官能团连接，所述A4取代基取自L-赖氨酸、L-鸟氨酸、L-二氨基丁酸和L-二氨基丙酸。
10.权利要求1至7中任一项的胰岛素类似物，其中
所述单体葡萄糖结合部分同时与残基B1的α-氨基官能团连接，或
所述胰岛素具有残基B1的缺失，且所述单体葡萄糖结合部分同时与残基B2的α-氨基官能团连接，或
所述胰岛素具有残基B1和B2的缺失，且所述单体葡萄糖结合部分同时与残基B3的α-氨基官能团连接，或
所述胰岛素具有残基B1-B3的缺失，且所述单体葡萄糖结合部分同时与残基B4的α-氨基官能团连接。
11.权利要求1的胰岛素类似物，其B链符合SEQ ID NO:7-50中的任一个，且其A链符合SEQ ID NO:51-53中的任一个。
12.权利要求11的胰岛素类似物，其B链符合SEQ ID NO:7-20中的任一个，且其A链符合SEQ ID NO:51-53中的任一个。
13.权利要求11的胰岛素类似物，其中所述B链包含SEQ ID NO:16，且其中所述A链包含SEQ ID NO:51。
14.权利要求1至13中任一项的胰岛素类似物，其在B24位还含有环己烷基丙氨酸。
15.权利要求14的胰岛素类似物，其还含有位置B24的苯丙氨酸的修饰，其选自2-氟-Phe、2-溴-Phe、2-氯-Phe、3-氟-Phe、3-溴-Phe、3-氯-Phe、4-氟-Phe、4-溴-Phe、4-氯-Phe和五氟-Phe。
16.权利要求1至13中任一项的胰岛素类似物，其具有在位置B26通过3-单碘-Tyr或(3,5)-二碘-Tyr进行的酪氨酸修饰。
17.权利要求1至13中任一项的胰岛素类似物，其在位置B13具有谷氨酰胺。
18.权利要求1至17中任一项的胰岛素类似物，其中所述含二醇的修饰是单糖、二糖或寡糖。
19.权利要求1的胰岛素类似物，其中所述含二醇的修饰连接至Ser、Thr、Asn、Gln、Cys或高半胱氨酸的侧链。
20.权利要求19的胰岛素类似物，其中所述含二醇的修饰通过B链的侧链或ThrB27、ThrB30或两个残基延伸内的氨基酸连接。
21.权利要求20的胰岛素类似物，其中所述含二醇的修饰不通过B链的C-末端氨基酸连接。
22.权利要求18的胰岛素类似物，其中所述含二醇的修饰是选自葡萄糖、甘露糖和N-乙酰基-半乳糖的单糖。
23.权利要求18的胰岛素类似物，其中所述含二醇的修饰是选自葡萄糖-葡萄糖、甘露糖-甘露糖、葡萄糖-甘露糖和甘露糖-葡萄糖的二糖。
24.权利要求18的胰岛素类似物，其中所述含二醇的修饰是支链寡糖。
25.权利要求1-17中任一项的胰岛素类似物，其中所述含二醇的修饰选自1,3-苯二甲醇、甘露醇、果糖、山梨醇、Tris碱、Fmoc-3,4-二羟基-L-苯丙氨酸、乙酸2-(乙酰氧基甲基)-4-碘丁酯、1(1R,2S,3R,5R)-3-氨基-5-(羟基甲基)-1,2-环戊二醇盐酸盐、2-(N-Fmoc-4-氨基丁基)-1,3-丙二醇、2-(4-氨基丁基)-1,3-丙二醇、3-氨基-1-,2-丙二醇、2-氨基丙烷-1,3-二醇、3-巯基丙烷-1,2-二醇、2-氨基-4-戊烷-1,3-二醇、N-乙酰基-D-半乳糖胺、N-乙酰基奎诺糠胺(quinovosamine)、allopumiliotoxin 267A、氨基莽草酸、阿托伐他汀、β-D-半乳糖吡喃糖基胺、咖啡醇、格拉非宁、甘油醛、甘油酸、甘油3-磷酸酯、单硬脂酸甘油酯、氢溴酸、1,2,3,4-四氢异喹啉-6,7-二醇、D-鞘氨醇、环己烷-1,2-二醇、胞嘧啶二醇、4,5-二羟基-2,3-戊二酮、二羟基苯乙二醇、二硫赤藓醇、二硫苏糖醇、羟丙哌嗪、二羟丙茶碱、弗伐戈林(flavagline) FL3、夫洛非宁、(3S,4R)-4-甲基-5-己烯-1,3-二醇、(3S,4R)-4-甲基-5-己烯-2,3-二醇、1,3-丁二醇、赤藓醇、水杨酸羟肟酸、儿茶酚、顺式-1,2-环戊二醇、环己烷-1,2-二醇、1,2-二羟基苯、二羟基苯乙二醇、2,2,4,4-四甲基-1,3-环丁二醇、丁基硼酸、异山梨酯、N,N-二甲基鞘氨醇、鞘氨醇(2-氨基-4-十八碳烯-1,3-二醇)、酒石酸、愈创甘油醚、5β-雄甾烷-3α,17α-二醇-11-酮-17β-羧酸3-(β-D-葡糖苷酸)和(1S-顺)-3-溴-3,5-环己二烯-1,2-二醇。
26.权利要求18的胰岛素类似物，其中所述二醇具有90-570的分子量。
27.一种药物组合物，其包含有效量的权利要求1至26中任一项的胰岛素类似物和药学上可接受的载体或赋形剂，其任选地配制用于皮下注射。
28.一种治疗患者的方法，其包括向需要治疗的患者施用权利要求27的药物组合物。
29.权利要求27的制剂，其中所述制剂含有0.00至0.50锌离子/胰岛素类似物单体的摩尔比的锌离子，且其中所述制剂的pH在pH 7.0和pH 8.0之间。
30.权利要求27的制剂，其中所述制剂含有0.00至0.50锌离子/胰岛素类似物单体的摩尔比的锌离子，且其中所述制剂的pH在pH 3.0和pH 4.2之间。
31.根据权利要求28所述的治疗患者的方法，其中所述胰岛素类似物制剂以U-5至U-15的强度配制。
32.根据权利要求28所述的治疗患者的方法，其中所述胰岛素类似物制剂以U-40至U-60的强度配制。
33.根据权利要求28所述的治疗患者的方法，其中所述胰岛素类似物制剂以U-100或更高的强度配制。
34.根据权利要求33所述的治疗患者的方法，其中所述胰岛素类似物制剂以U-500或更高的强度配制。
35.根据权利要求31-34中任一项所述的治疗患者的方法，其中施用途径是通过皮下注射。
36.根据权利要求31-34中任一项所述的治疗患者的方法，其中施用途径是通过腹膜内注射。
37.根据权利要求31-34中任一项所述的治疗患者的方法，其中施用途径是通过静脉内注射。
38.根据权利要求31-34中任一项所述的治疗患者的方法，其中施用途径是通过吸入肺。
39.根据权利要求31-34中任一项所述的治疗患者的方法，其中施用途径是经鼻。
40.根据权利要求31-34中任一项所述的治疗患者的方法，其中施用途径是肠胃外的。
41.根据权利要求31-34中任一项所述的治疗患者的方法，其中给药途径由胰岛素泵控制。
42.权利要求39的治疗患者的方法，其中所述胰岛素泵通过与连续葡萄糖监测器耦合的基于计算机的算法部分或全部调节。
43.制备权利要求1-26中任一项的胰岛素类似物的方法，所述方法包括胰蛋白酶介导的半合成，其中，
(a)将A链修饰(即，通过单体葡萄糖结合部分)引入胰岛素或胰岛素类似物的脱-八肽[B23-B30]片段内，且
(b)将互补的B链修饰(赋予与所述单体葡萄糖结合部分的可逆结合)引入长度为6-10个氨基酸残基的合成肽中，其N-末端残基是甘氨酸，并且在修饰后不含胰蛋白酶切割位点。
44.权利要求43的方法，其中所述胰岛素或胰岛素类似物的脱-八肽[B23-B30]片段通过母体胰岛素或胰岛素类似物的胰蛋白酶消化而获得。
45.权利要求43的方法，其中胰岛素或胰岛素类似物的脱-八肽[B23-B30]片段通过单链多肽(诸如胰岛素原、胰岛素原类似物或相应的微型胰岛素原，所述微型胰岛素原含有缩短的C结构域或不存在C结构域)的胰蛋白酶消化获得，所述单链多肽在大肠杆菌、酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母或其它用于重组蛋白表达的微生物系统中表达。
46.权利要求43的方法，其中胰岛素或胰岛素类似物的脱-八肽[B23-B30]片段通过单链多肽(诸如胰岛素原、胰岛素原类似物或相应的微型胰岛素原，所述微型胰岛素原含有缩短的C结构域或不存在C结构域)的胰蛋白酶消化获得，所述单链多肽通过固相化学肽合成、任选地包括天然片段连接步骤来制备。
47.一种胰岛素类似物，其含有在A链N-末端处或其附近的通过单体葡萄糖结合部分的修饰和变体B链，所述变体B链在其C-末端处或其附近含有含二醇的氨基酸。
48.权利要求47的胰岛素类似物，其中所述含二醇的氨基酸是L-DOPA或D-DOPA。
CN201680027352.3A 2015-03-13 2016-03-14 含有葡萄糖调节的构象转换器的胰岛素类似物 Pending CN107530405A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562133251P 2015-03-13 2015-03-13
US201562132704P 2015-03-13 2015-03-13
US62/133251 2015-03-13
US62/132704 2015-03-13
PCT/US2016/022390 WO2016149222A2 (en) 2015-03-13 2016-03-14 Insulin analogues containing a glucose-regulated conformational switch

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107530405A true CN107530405A (zh) 2018-01-02

Family

ID=56920354

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201680027352.3A Pending CN107530405A (zh) 2015-03-13 2016-03-14 含有葡萄糖调节的构象转换器的胰岛素类似物

Country Status (11)

Country Link
US (1) US10584156B2 (zh)
EP (1) EP3270949A4 (zh)
JP (2) JP6914844B2 (zh)
KR (1) KR20170125853A (zh)
CN (1) CN107530405A (zh)
AU (1) AU2016233430B2 (zh)
BR (1) BR112017019515A2 (zh)
CA (1) CA2979055A1 (zh)
HK (1) HK1247836A1 (zh)
IL (1) IL254459B (zh)
WO (1) WO2016149222A2 (zh)

Families Citing this family (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017070617A1 (en) * 2015-10-21 2017-04-27 Case Western Reserve University Diol-modified insulin analogues containing a glucose-regulated conformational switch
WO2018187147A1 (en) * 2017-04-03 2018-10-11 Amidebio, Llc Glucose-responsive insulin analogs and methods of use thereof
WO2019092125A1 (en) 2017-11-09 2019-05-16 Novo Nordisk A/S Glucose-sensitive albumin-binding derivatives
US11541122B2 (en) 2018-09-19 2023-01-03 Ziylo Limited Glucose sensitive insulins and uses thereof
US20220288213A1 (en) * 2019-07-31 2022-09-15 Thermalin Inc. Insulin analogues with glucose regulated conformational switch
KR20200056361A (ko) 2020-05-04 2020-05-22 김용원 발판보드에 설치하는 발전기
KR20200060307A (ko) 2020-05-06 2020-05-29 김용원 자전거와 리어 캐리어에 설치하는 발전장치들
KR20200060308A (ko) 2020-05-07 2020-05-29 김용원 수상보드에 설치하는 발전기
KR20200060309A (ko) 2020-05-08 2020-05-29 김용원 헬스차량에 설치하는 발전기
KR20200062092A (ko) 2020-05-11 2020-06-03 김용원 수차와 공기 컴프레서를 이용한 공기 터빈구조 발전기와 바퀴구조 발전기를 합한 발전기
KR20200061324A (ko) 2020-05-11 2020-06-02 김용원 보트에 설치하는 발전기
KR20200068614A (ko) 2020-05-26 2020-06-15 김용원 펠티어소자를 이용한 공기, 물 컨디션너 조절장치 내에 설치한 발전기
KR20200083393A (ko) 2020-06-16 2020-07-08 김용원 "공기 터빈구조 발전기"와 "바퀴구조를 합한 발전기"를 "발열소자를 이용한 발전기"와 적용 양방향 모터(양방향 프로펠러)를 양방향공기추진기(Propullor)와 결합 장착한 드론
KR20200088241A (ko) 2020-06-30 2020-07-22 김용원 역방향 모터(양방향 프로펠러)의 추진에 맞는 관성을 이기는 팬이 없는 양방향공기추진기(Propullor)를 장착한 드론
KR20200108392A (ko) 2020-08-31 2020-09-18 김용원 전동 오토바이 모터의 정격에 맞는 오토바이바퀴에 회전자와 물받이 고정자 발전기를 설치한 오토바이에 모터가 장착된 항공기 공기추진기(Propulsor)와 장착한 드론의 프로퓰러(Propullor)를 장착하는 제조기술)
US20230399373A1 (en) * 2020-10-22 2023-12-14 The Trustees Of Indiana University Molecular designs of glucose-responsive and glucose-cleavable insulin analogues
KR20210018367A (ko) 2021-01-26 2021-02-17 김용원 전동 오토바이에 설치한 모터가 장착된 항공기 공기추진기와 장착한 프로퓰러(Propullor)로 구성한 오토에어크라프트(Autoaircraft)
KR20210029730A (ko) 2021-02-22 2021-03-16 김용원 산사태에 대비, 대응하는 에어 레이어들 블록들이 형성된 거대장비들(에어 레이어들 블록들)
KR20210040852A (ko) 2021-03-24 2021-04-14 김용원 전동에어버스
KR20210043513A (ko) 2021-03-26 2021-04-21 김용원 전동에어버스에 설치하는 연기(분연), 재 포집장치
KR20210045369A (ko) 2021-03-31 2021-04-26 김용원 전기 에어 카
KR20210049046A (ko) 2021-04-13 2021-05-04 김용원 전기에어버스를 강풍, 태풍에 구조하는 보조날개와 보조출입문 장치
KR20210055643A (ko) 2021-04-27 2021-05-17 김용원 모터가 장착된 회전축에 다량의 회전자바퀴와 다량의 고정자바퀴발전기를 설치한 전동보드
CN117337299A (zh) * 2021-05-03 2024-01-02 印地安纳大学理事会 葡萄糖响应性胰岛素类似物葡萄糖传感器的分子设计
KR20210072739A (ko) 2021-05-27 2021-06-17 김용원 의료용 전동보드
KR20210080293A (ko) 2021-06-11 2021-06-30 김용원 바퀴 사이 발전기 케이스
KR20220016234A (ko) 2022-01-14 2022-02-08 김용원 공기추진기(공기펌프와 공기터빈)를 장착한 3륜 자전거
WO2023144240A1 (en) 2022-01-26 2023-08-03 Novo Nordisk Research Centre Oxford Limited Glucose sensitive insulin derivatives and uses thereof
KR20220038026A (ko) 2022-02-24 2022-03-25 김용원 4합 공기터빈 : 공기터빈 축에 1. 인너 팬들의 인너 실린더와 2. 아웃터 팬들의 아웃터 실린더와 3. 양쪽 1. 인너 실린더들과 2. 아웃터 실린더들의 사이에 아웃터 팬들에 덕트팬들과 덕트흡입구와 4 1. 인너 실린더들과 2. 아웃터 실린더들의 사이에 아웃터 팬들의 3. 덕트팬들에 블레이드와 블레이드 외부 형틀
KR20220056159A (ko) 2022-04-04 2022-05-04 김용원 물탱크 내의 스팀집 슈퍼히터에 전력공급한 스팀공급으로 스팀터빈을 구동하는 것과 슈퍼히터로 스팀을 공급하는 스팀청소기에 발전기들을 설치하는 것과 공기터빈의 흡입구들의 공기필터들 설치와 펠티에소자를 이용한 냉온 공기배출과 얼음제조기 시스템
KR20220056835A (ko) 2022-04-18 2022-05-06 김용원 공기추진기(공기펌프와 여러 공기터빈들)들을 장착한 수상 자전거
KR20220076421A (ko) 2022-05-11 2022-06-08 김용원 공기추진기(공기펌프와 공기터빈들)들을 장착한 페달자전차
KR20220080053A (ko) 2022-05-27 2022-06-14 김용원 다중 에어 레이어 튜브보트

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001092334A1 (en) * 2000-06-02 2001-12-06 Novo Nordisk A/S Glucose dependent release of insulin from glucose sensing insulin derivatives
CN103068842A (zh) * 2010-06-16 2013-04-24 印第安纳大学研究及科技有限公司 对胰岛素受体具有高活性的单链胰岛素激动剂
CN104168911A (zh) * 2012-01-20 2014-11-26 卡斯西部储备大学 谷氨酸-稳定的胰岛素类似物

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003048195A2 (en) 2001-12-02 2003-06-12 Novo Nordisk A/S Glucose dependant release of insulin from glucose sensing insulin derivatives
WO2010107520A1 (en) * 2009-03-20 2010-09-23 Smartcells, Inc. Soluble non-depot insulin conjugates and uses thereof
DK2877200T3 (da) 2012-07-17 2019-08-12 Univ Case Western Reserve O-bundne carbonhydratmodificerede insulinanaloger
US9624287B2 (en) * 2012-07-17 2017-04-18 Case Western Reserve University O-linked carbohydrate-modified insulin analogues
WO2014093696A2 (en) 2012-12-12 2014-06-19 Massachusetts Institute Of Technology Insulin derivatives for diabetes treatment
EP2932607A1 (en) 2012-12-14 2015-10-21 Andrew LLC System and method for cyclostationarity-based intermodulation identification
AR095986A1 (es) * 2013-04-03 2015-11-25 Sanofi Sa Proteínas modificadas que regulan glucosa en sangre con perfil alterado de actividad farmacológica y preparación de las mismas

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001092334A1 (en) * 2000-06-02 2001-12-06 Novo Nordisk A/S Glucose dependent release of insulin from glucose sensing insulin derivatives
CN103068842A (zh) * 2010-06-16 2013-04-24 印第安纳大学研究及科技有限公司 对胰岛素受体具有高活性的单链胰岛素激动剂
CN104168911A (zh) * 2012-01-20 2014-11-26 卡斯西部储备大学 谷氨酸-稳定的胰岛素类似物

Also Published As

Publication number Publication date
US10584156B2 (en) 2020-03-10
CA2979055A1 (en) 2016-09-22
KR20170125853A (ko) 2017-11-15
WO2016149222A3 (en) 2016-11-03
BR112017019515A2 (pt) 2018-04-24
IL254459B (en) 2021-01-31
JP2021178833A (ja) 2021-11-18
AU2016233430B2 (en) 2020-06-04
JP2018513843A (ja) 2018-05-31
AU2016233430A1 (en) 2017-10-05
WO2016149222A2 (en) 2016-09-22
HK1247836A1 (zh) 2018-10-05
EP3270949A2 (en) 2018-01-24
IL254459A0 (en) 2017-11-30
US20180057559A1 (en) 2018-03-01
JP6914844B2 (ja) 2021-08-04
EP3270949A4 (en) 2018-11-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107530405A (zh) 含有葡萄糖调节的构象转换器的胰岛素类似物
US10800827B2 (en) Insulin receptor partial agonists
CN103403019B (zh) 具有增强的作用持续时间的工程化多肽
CN104662038B (zh) 胰高血糖素类似物
ES2674581T3 (es) Análogo de exendina-4 pegilado con polietilenglicol o derivado del mismo, método de preparación del mismo y composición farmacéutica para evitar o tratar diabetes, que contiene el mismo como principio activo
US9758563B2 (en) Insulin analogues with chlorinated amino acids and nucleic acids encoding the same
US9388228B2 (en) Halogen-stabilized insulin
ES2831848T3 (es) Análogo de insulina humana A22K, desB27, B29R, desB30, acilado en la posición épsilon de la lisina 22
CN102171245A (zh) 卤素稳定型胰岛素
JP2021177779A (ja) 新規インスリン誘導体及びその医学的使用
US10745458B2 (en) Non-standard insulin analogues
US9200053B2 (en) Insulin analogues containing penta-fluoro-Phenylalanine at position B24
US10689430B2 (en) Insulin receptor partial agonists
CN104010652A (zh) 超浓缩的速效胰岛素类似物制剂
WO2017070617A1 (en) Diol-modified insulin analogues containing a glucose-regulated conformational switch
CA3158701A1 (en) Biotin moiety-conjugated polypeptide and pharmaceutical composition for oral administration comprising the same
WO2018210919A1 (en) Glp-1 compositions and uses thereof
Wetzler et al. 8.1 The role of natural peptides in the body
NZ624493B2 (en) Ultra-concentrated rapid-acting insulin analogue formulations

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20180102

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication