ES2831848T3 - Análogo de insulina humana A22K, desB27, B29R, desB30, acilado en la posición épsilon de la lisina 22 - Google Patents

Análogo de insulina humana A22K, desB27, B29R, desB30, acilado en la posición épsilon de la lisina 22 Download PDF

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Abstract

Un derivado de insulina, cuyo derivado de insulina es un análogo acilado de insulina humana, cuyo análogo es [A22K, desB27, B29R, desB30] con relación a la insulina humana; y cuyo análogo de insulina se derivatiza por acilación del grupo épsilon amino del residuo de lisina en la posición A22 con un grupo de Fórmula II [Acil]-[Enlazador]- en donde el grupo enlazador es una cadena de aminoácidos compuesta de 1 a 10 residuos de aminoácidos seleccionados de -gGlu- y -OEG-; en donde gGlu representa un residuo de ácido gamma glutámico; OEG representa el residuo de ácido 8-amino-3,6-dioxaoctanoico (es decir, un grupo de la fórmula -NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-); cuyos residuos de aminoácidos pueden estar presentes en cualquier orden; y cuya cadena de aminoácidos comprende al menos un residuo de gGlu; y en donde el grupo acilo es un residuo de un ácido α,ω-dicarboxílico seleccionado de ácido 1,14-tetradecanedioico; ácido 1,15-pentadecanedioico; y ácido 1,16-hexadecanedioico; cuyo análogo acilado, puede comprender además las sustituciones A14E y/o B3E, o B3Q.

Description

DESCRIPCIÓN
Análogo de insulina humana A22K, desB27, B29R, desB30, acilado en la posición épsilon de la lisina 22 Campo técnico
La presente invención se encuentra en los campos terapéuticos de los fármacos para afecciones médicas relacionadas con la diabetes. Más específicamente, la invención se refiere a nuevos derivados acilados de análogos de insulina humana. La invención proporciona además composiciones farmacéuticas que comprenden tales análogos de insulina derivatizados, y se refiere al uso de tales derivados para el tratamiento o prevención de afecciones médicas relacionadas con la diabetes.
Antecedentes de la invención
La terapia con insulina para el tratamiento de la diabetes se ha usado durante décadas. La terapia con insulina suele implicar la administración de varias inyecciones de insulina al día. Dicha terapia normalmente implica la administración de una inyección basal de acción prolongada una o dos veces al día, y una inyección de una insulina de acción rápida a la hora de la comida (es decir, uso prandial). Una de las mejoras clave en el tratamiento la terapia con insulina fue la introducción de análogos de insulina de acción rápida. Sin embargo, incluso con los análogos de insulina de acción rápida, los niveles máximos de insulina típicamente no ocurren hasta 50 a 70 minutos después de la inyección. Por lo tanto, las inyecciones de insulina no replican el perfil de acción-tiempo natural de la insulina. En particular, el pico natural de la liberación de insulina de la primera fase en una persona sin diabetes da lugar a un aumento de los niveles de insulina en sangre a los pocos minutos de la entrada de glucosa a partir de una comida en la sangre. Por el contrario, la insulina inyectada se introduce en la sangre lentamente, con niveles máximos de insulina que ocurren dentro de 80 y 100 minutos después de la inyección de insulina humana normal.
Debido a que los análogos de insulina de acción rápida no imitan adecuadamente la liberación de primera fase de la insulina, los diabéticos que utilizan la terapia de insulina continúan teniendo niveles inadecuados de insulina presentes al inicio de una comida y demasiada insulina presente entre comidas. Este retraso en la administración de insulina puede provocar hiperglucemia poco después del inicio de la comida.
La insulina posee propiedades de autoasociación y su concentración representa un factor importante de autoasociación. A altas concentraciones, especialmente en formulaciones farmacéuticas, la insulina se autoasociará en dímero, hexámero, dodecámero y cristal. Sin embargo, la forma fisiológicamente activa de la insulina es el monómero, que se une al receptor de insulina y desencadena una respuesta biológica.
La rapidez de la acción de la insulina depende de la rapidez con la que se absorba la insulina del tejido subcutáneo. Cuando la insulina humana regular se inyecta por vía subcutánea, la formulación se compone principalmente de hexámeros que contienen dos iones de zinc. Debido a su tamaño, la insulina hexamérica tiene una menor velocidad de difusión y, por consiguiente, la velocidad de absorción es más lenta que la de especies más pequeñas.
Dentro del hexámero hay dos átomos de zinc que estabilizan la molécula ante la degradación química y física. Después de la inyección, se produce un equilibrio dinámico impulsado por la concentración en el tejido subcutáneo, lo que hace que los hexámeros se disocien en dímeros y luego en monómeros. Históricamente, estas formulaciones de insulina humana regular requieren aproximadamente 120 minutos para alcanzar los niveles de concentración plasmática máxima. Preparaciones de zinc-insulina, que se absorben más rápidamente que la insulina humana regular, se han comercializado, por ejemplo, insulina aspart e insulina lispro.
Las formulaciones de insulina que no contiene zinc permitirían una absorción subcutánea más rápida, pero para las insulinas en general, la estabilidad química y física de las formulaciones que no contienen zinc es un desafío.
Se han sugerido varios derivados de la insulina para diferentes usos.
El documento WO 1998042749 describe cristales de insulina que no contienen zinc para la administración pulmonar. El documento US 6960561 describe preparaciones de insulina que no contiene zinc y baja en zinc que tienen una estabilidad mejorada.
El documento WO 2007/096431 describe ciertos derivados de insulina humana, que incluyen análogos i.a. en la posición A22 que contienen un residuo de lisina acilado, en la posición B29 que contienen un residuo de arginina, y que son desB30, cuyos derivados son solubles a valores de pH fisiológicos y tienen un perfil de acción prolongado, y están destinados para su uso como insulinas de acción prolongada.
El documento WO 2009/022013 describe ciertos análogos de insulina acilados, que incluyen análogos i.a. en la posición A22 que contienen un residuo de lisina acilado, en la posición B29 que contienen un residuo de arginina, y que son desB30, que poseen mayores afinidades de unión al receptor de insulina, y están destinados para su uso como insulinas de acción prolongada.
El documento WO 2009/112583 describe ciertos análogos de insulina, que incluyen análogos que en la posición A22 contienen un residuo de lisina, en la posición B29 que contienen un residuo de arginina, y que son desB30, que muestran una estabilidad de proteasa mejorada. Los análogos del documento WO 2009/112583 no son acilados.
El documento WO 2011/161124 describe ciertos análogos de insulina acilados que contienen enlaces disulfuro adicionales para mejorar la estabilidad, que incluyen análogos i.a. en la posición A22 que contienen un residuo de lisina, en la posición B29 que contienen un residuo de arginina, y que son desB30,
El documento WO 2012/171994 describe cierto derivado de insulina que comprende dos o más sustituciones, que incluyen análogos i.a. en la posición A22 que contienen un residuo de lisina acilado, en la posición B29 que contienen un residuo de arginina, y que son desB30, para una actividad in vivo prolongada.
El documento WO 2013 063572 describe formulaciones de análogos de insulina de acción rápida ultraconcentradas opcionalmente desprovistas de zinc.
Steensgaard y otros (2013), Bioquímica, 52:295-309 describe insulina degludec que es el análogo desB30 de la insulina humana que está acilado en la posición B29 con un grupo de acilación que consiste en un diácido hexadecanoico y un gGlu. La insulina degludec tiene un perfil de acción prolongada.
Además, la acilación de péptidos y proteínas con porciones de unión a albúmina se ha usado para prolongar la duración de la acción de los péptidos y las proteínas.
Sin embargo, los derivados de insulina de acuerdo con la presente invención no se han informado, y su uso como derivados de insulina de acción rápida para uso prandial nunca se ha sugerido.
Objetivos de la invención
Es un objetivo de la invención proporcionar análogos de insulina que tengan un perfil prandial después de la administración subcutánea.
Otro objetivo de la invención es proporcionar análogos de insulina que sean químicamente estables en la formulación.
Un tercer objetivo de la invención es proporcionar análogos de insulina que sean químicamente estables en formulación sin zinc añadido.
Un cuarto objetivo de la invención es proporcionar análogos de insulina que sean físicamente estables en formulación.
Un quinto objetivo de la invención es proporcionar análogos de insulina que sean físicamente estables en formulación sin zinc añadido.
Un sexto objetivo de la invención es proporcionar análogos de insulina que sean química y físicamente estables en formulación.
Un séptimo objetivo de la invención es proporcionar análogos de insulina que sean química y físicamente estables en formulación sin zinc añadido.
Un octavo objetivo de la invención es proporcionar análogos de insulina que sean hepatopreferentes con relación a las insulinas prandiales comercializadas actualmente después de la administración subcutánea.
Un noveno objetivo de la invención es proporcionar análogos de insulina que sean hepatoselectivos con relación a las insulinas prandiales comercializadas actualmente después de la administración subcutánea.
Un décimo objetivo de la invención es proporcionar análogos de insulina que sean menos propensos a inducir hipoglucemia con relación a las insulinas prandiales comercializadas actualmente después de la administración subcutánea prandial.
Un undécimo objetivo de la invención es proporcionar análogos de insulina que sean menos propensos a inducir el aumento de peso con relación a las insulinas prandiales comercializadas actualmente después de la administración subcutánea prandial.
Un duodécimo objetivo de la invención es proporcionar análogos de insulina que sean menos propensos a inducir hipoglucemia y aumento de peso con relación a las insulinas prandiales comercializadas actualmente después de la administración subcutánea prandial.
Los objetivos adicionales de esta invención se basan en combinaciones de uno o más de los objetivos mencionados anteriormente, y en particular sobre la provisión de análogos de insulina que muestren un perfil prandial después de la administración subcutánea, mientras que son químicamente estables en formulaciones, y en particular en formulaciones que no contienen zinc añadido.
Resumen de la invención
Descubrimos que los derivados de insulina acilados A22K de la presente invención tienen propiedades significativamente mejoradas con relación a derivados de insulina similares de la técnica anterior. En particular, descubrimos que los derivados de insulina de la invención, en formulaciones que no contienen iones de zinc añadidos y cuando se comparan con derivados similares de la técnica anterior, se asocian con un tamaño menor de agregados moleculares. Se conoce que las especies más pequeñas se difunden más rápidamente que las más grandes, por lo que se espera una absorción más rápida. El tamaño de estos agregados moleculares puede, por ejemplo, medirse como se describe en la presente descripción mediante Dispersión de Rayos X de Ángulo Pequeño (SAXS) y mediante la realización de series de diluciones con SEC-HPLC (HPLc de exclusión de tamaño) como se describe en la sección de ejemplos.
Además, descubrimos que los derivados de insulina de la invención, con relación a derivados similares de la técnica anterior, en formulaciones que no contienen iones de zinc añadidos, se absorben más rápidamente después de la administración subcutánea en cerdos, demostrando de esta manera una posible utilidad clínica como insulinas para uso prandial. Descubrimos que los derivados de insulina de la invención, con relación a derivados similares de la técnica anterior, en formulaciones que no contienen iones de zinc añadidos se asocian con menos “retraso” después de la administración subcutánea en cerdos. Por menos retraso se entiende que el depósito subcutáneo de insulina inyectada se absorbe más rápidamente que los análogos similares de la técnica anterior, de manera que el tiempo medio de residencia (MRT) después de la administración subcutánea es más corto para los derivados de insulina de la invención cuando se compara con derivados acilados similares de la técnica anterior.
Las formulaciones que no contienen zinc permiten una absorción subcutánea más rápida, pero para las insulinas en general, la estabilidad química y física de las formulaciones que no contienen zinc es un reto, y hasta ahora solo se ha demostrado que es posible con insulina glulisina (Apidra®; B3K, insulina humana B29E), y solo en presencia de surfactantes cuando se dispensan en viales.
Ahora hemos descubierto que un subconjunto de los derivados de insulina acilada A22K de la invención, con sustituciones en la posición B3, muy inesperadamente y sin precedentes, es tanto química como físicamente estable en formulaciones sin iones de zinc añadidos y sin surfactantes añadidos.
Una ventaja del uso de derivados de insulina acilados como terapia de insulina prandial es lograr concentraciones plasmáticas de insulina más altas que las que se alcanzan con el tratamiento con insulinas prandiales no aciladas, como insulina aspart, insulina lispro o insulina glulisina.
Los derivados de insulina acilados A22K de acuerdo con la invención tienen un perfil de acción en el tiempo de tipo prandial después de la administración subcutánea.
Los derivados de insulina acilados A22K con ácido tetradecanedioico, ácido pentadecanedioico, o aglutinantes de albúmina basados en ácido hexadecanedioico de acuerdo con la invención demostraron conferir afinidades muy altas de unión al receptor de insulina, afinidades que se reducen en presencia de 1,5 % de albúmina sérica humana (HSA).
Los derivados de insulina acilados A22K de acuerdo con la invención no tienen solubilidad reducida a concentraciones fisiológicas de sal.
En consecuencia, en su primer aspecto, la invención proporciona nuevos derivados de insulina, cuyos derivados de insulina son derivados acilados de análogos de insulina humana, cuyos análogos son [A22K, desB27, B29R, desB30] con relación a insulina humana; y cuyo análogo de insulina se derivatiza por acilación del grupo épsilon amino del residuo de lisina en la posición a 22 con un grupo de la Fórmula II
[Acil]-[Enlazador]-
en donde el grupo Enlazador es una cadena de aminoácidos compuesta de 1 a 10 residuos de aminoácidos seleccionados de -gGlu- y -OEG-; en donde gGlu representa un residuo de ácido gamma glutámico; OEG representa el residuo de ácido 8-amino-3,6-dioxaoctanoico (es decir, un grupo de la fórmula -NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-); cuyos residuos de aminoácidos pueden estar presentes en cualquier orden; y cuya cadena de aminoácidos comprende al menos un residuo gGlu; y
en donde el grupo acilo es un residuo de un ácido a,u>-dicarboxílico seleccionado del ácido 1,14-tetradecanedioico; ácido 1,15-pentadecanedioico; y el ácido 1,16-hexadecanodioico;
cuyo análogo acilado, puede comprender adicionalmente las sustituciones A14E, y/o B3E o B3Q.
En otro primer aspecto, la invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden el derivado de insulina de la invención y uno o más excipientes aceptables farmacéuticamente.
En otro aspecto, la invención se refiere al uso del derivado de insulina de la invención como un medicamento.
En otro aspecto más, la invención proporciona métodos para el tratamiento, la prevención o el alivio de enfermedades, trastornos o afecciones que se relacionan con la diabetes, diabetes tipo 1, diabetes tipo 2, alteraciones de la tolerancia a la glucosa, hiperglucemia, dislipidemia, obesidad, síndrome metabólico (síndrome metabólico X, síndrome de resistencia a la insulina) hipertensión, trastornos cognitivos, aterosclerosis, infarto del miocardio, derrame cerebral, trastornos cardiovasculares, enfermedad coronaria, síndrome inflamatorio intestinal, dispepsia o úlceras gástricas, cuyo método comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva del derivado de insulina de la invención a un sujeto que lo necesita.
Otros objetivos de la invención serán evidentes para la persona experta en la técnica a partir de la siguiente descripción detallada y ejemplos.
Descripción detallada de la invención
Derivados de insulina
En su primer aspecto, la presente invención proporciona nuevos derivados de insulina, cuyo derivado de insulina es un análogo acilado de insulina humana, cuyo análogo es [A22K, desB27, B29R, desB30] con relación a la insulina humana;
y cuyo análogo de insulina se derivatiza por acilación del grupo épsilon amino del residuo de lisina en la posición A22 con un grupo de Fórmula II
[Acil]-[Enlazador]-
en donde el grupo Enlazador es una cadena de aminoácidos compuesta de 1 a 10 residuos de aminoácidos seleccionados de -gGlu- y -OEG-; en donde gGlu representa un residuo de ácido gamma glutámico; OEG representa el residuo de ácido 8-amino-3,6-dioxaoctanoico (es decir, un grupo de la fórmula -NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-); cuyos residuos de aminoácidos pueden estar presentes en cualquier orden; y cuya cadena de aminoácidos comprende al menos un residuo gGlu; y
en donde el grupo acilo es un residuo de un ácido a,u>-dicarboxílico seleccionado del ácido 1,14-tetradecanedioico; ácido 1,15-pentadecanedioico; y el ácido 1,16-decanoico, cuyo análogo acilado puede comprender además las sustituciones A14E, y/o B3E o b 3q .
En una modalidad, el análogo de la insulina humana es [A14E, A22K, B3E, desB27, B29R, desB30]; [A14E, A22K, desB27, B29R, desB30]; [A22K, B3E, desB27, B29R, desB30]; [A22K, B3Q; desB27, B29R, desB30]; o [A22K, desB27, B29R, desB30]; con relación a insulina humana; y cuyo análogo de insulina está acilado en el grupo épsilon amino del residuo de lisina en la posición A22,
En otra modalidad, el análogo de insulina humana es [A22K, desB27, B29R, desB30], con relación a insulina humana; y cuyo análogo de insulina está acilado en el grupo épsilon amino del residuo de lisina en la posición A22,
En una tercera modalidad, el análogo de insulina humana es [A22K, B3E, desB27, B29R, desB30], con relación a la insulina humana; y cuyo análogo de insulina está acilado en el grupo épsilon amino del residuo de lisina en la posición A22,
En una cuarta modalidad, el análogo de insulina humana es [A22K, B3Q, desB27, B29R, desB30], con relación a la insulina humana; y cuyo análogo de insulina está acilado en el grupo épsilon amino del residuo de lisina en la posición A22,
En una quinta modalidad, el análogo de insulina humana es [A14E, A22K, desB27, B29R, desB30], con relación a la insulina humana; y cuyo análogo de insulina está acilado en el grupo épsilon amino del residuo de lisina en la posición A22,
En una sexta modalidad, el análogo de insulina humana es [A14E, A22K, B3E, desB27, B29R, desB30], con relación a la insulina humana; y cuyo análogo de insulina está acilado en el grupo épsilon amino del residuo de lisina en la posición A22,
Como se describió anteriormente, el análogo de insulina se derivatiza mediante acilación del grupo épsilon amino del residuo de lisina en la posición A22 con un grupo de Fórmula II, como se describió anteriormente, es decir, un sustituyente que contiene un grupo acilo unido a un grupo enlazador.
En el contexto de esta invención, el grupo enlazador de acuerdo con la Fórmula II es una cadena de aminoácidos compuesta de 1 a 10 residuos de aminoácidos seleccionados de -gGlu- y -OEG-.
En una modalidad, el grupo enlazador de acuerdo con la Fórmula II es una cadena de aminoácidos compuesta de 1 a 7 residuos de aminoácidos seleccionados de -gGlu- y -OEG-, que comprende de 1 a 4 residuos de gGlu y de 0 a 3 residuos de OEG.
En otra modalidad, el grupo enlazador de acuerdo con la Fórmula II se selecciona de -gGlu-; -2xgGlu-; -3xgGlu-; -4xgGlu-; -gGlu-2xOEG-; -gGlu-3x(OEG-gGlu)-; -4xgGlu-2xOEG-; -2xOEG-; y -2xOEG-gGlu-.
En una tercera modalidad, el grupo enlazador de acuerdo con la Fórmula II es -gGlu-.
En una cuarta modalidad, el grupo enlazador de acuerdo con la Fórmula II es -2xgGlu-.
En una quinta modalidad, el grupo enlazador de acuerdo con la Fórmula II es -3xgGlu-.
En una sexta modalidad, el grupo enlazador de acuerdo con la Fórmula II es -4xgGlu-.
En una séptima modalidad, el grupo enlazador de acuerdo con la Fórmula II es -gGlu-2xOEG-.
En una octava modalidad, el grupo enlazador de acuerdo con la Fórmula II es -gGlu-3x(OEG-gGlu)-.
En una novena modalidad, el grupo enlazador de acuerdo con la Fórmula II es -4xgGlu-2xOEG-.
En una décima modalidad, el grupo enlazador de acuerdo con la Fórmula II es -2xOEG-.
En una un undécima modalidad, el grupo enlazador de acuerdo con la Fórmula II es -2xOEG-gGlu-.
En el contexto de esta invención, el grupo acilo de acuerdo con la Fórmula II se deriva del ácido 1,14-tetradecanedioico; el ácido 1,15-pentadecanedioico; o el ácido 1,16-hexadecanedioico.
En una modalidad, el grupo acilo de acuerdo con la Fórmula II se deriva del ácido 1,14-tetradecanedioico (es decir, 1,14-tetradecanedioil).
En otra modalidad, el grupo acilo de acuerdo con la Fórmula II se deriva del ácido 1,15-pentadecanedioico (es decir, 1, 15-pentadecanedioil).
En una tercera modalidad, el grupo acilo de acuerdo con la Fórmula II se deriva del ácido 1,16-hexadecanedioico (es decir, 1,16-hexadecanedioil).
En otra modalidad, el grupo de Fórmula II, como se describió anteriormente, es tetradecanedioil-gGlu-; tetradecanedioil-2xgGlu-; tetradecanedioil-3xgGlu-; tetradecanedioil-4xgGlu-; tetradecanedioil-gGlu-2xOEG-; tetradecanedioil-4xgGlu-2xOEG-; tetradecanedioil-2xOEG-; pentadecanedioil-4xgGlu; hexadecanedioil-4xgGlu-; hexadecanedioil-gGlu-2xOEG-; o hexadecanedioil-3x(gGlu-OEG)-gGlu-.
En otra modalidad, el grupo de Fórmula II es tetradecanedioil-gGlu-.
En una tercera modalidad, el grupo de Fórmula II es tetradecanedioil-2xgGlu-.
En una cuarta modalidad, el grupo de Fórmula II es tetradecanedioil-3xgGlu-.
En una quinta modalidad, el grupo de Fórmula II es tetradecanedioil-4xgGlu-.
En una sexta modalidad, el grupo de Fórmula II es tetradecanedioil-gGlu-2xOEG-.
En una séptima modalidad, el grupo de Fórmula II es tetradecanedioil-2xOEG-.
En una octava modalidad, el grupo de Fórmula II es tetradecanedioil-4xgGlu-2xOEG-.
En una novena modalidad, el grupo de Fórmula II es pentadecanedioil-4xgGlu-.
En una décima modalidad, el grupo de Fórmula II es hexadecanedioil-4xgGlu-.
En una un undécima modalidad, el grupo de Fórmula II es hexadecanedioil-gGlu-2xOEG-.
En una duodécima modalidad, el grupo de Fórmula II es hexadecanedioil-3x(gGlu-OEG)-gGlu-.
El derivado de insulina de la invención puede ser en particular uno seleccionado del grupo que consiste en insulina humana A22K(W(eps)-tetradecanedioil-4xgGlu), desB27, B29R, desB30;
insulina humana A22K(W(eps)-tetradecanedioil-4xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30;
insulina humana A14E, A22K(W(eps)-tetradecanedioil-4xgGlu), desB27, B29R, desB30;
insulina humana A22K(W(eps)-hexadecanedioil-4xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30;
insulina humana A22K(W(eps)-hexadecanedioil-gGlu-2xOEG), B3E, desB27, B29R, desB30;
insulina humana A22K(W(eps)-hexadecanedioil-3x(gGlu-OEG)-gGlu), B3E, desB27, B29R, desB30;
insulina humana A22K(W(eps)-tetradecanedioil-4xgGlu), B3Q, desB27, B29R, desB30;
insulina humana A22K(W(eps)-hexadecanedioil-gGlu-2xOEG), B3Q, desB27, B29R, desB30;
insulina humana A22K(W(eps)-hexadecanedioil-3x(gGlu-OEG)-gGlu), B3Q, desB27, B29R, desB30;
insulina humana A22K(W(eps)-tetradecanedioil-2xgGlu), desB27, B29R, desB30;
insulina humana A22K(W(eps)-hexadecanedioil-4xgGlu), desB27, B29R, desB30;
insulina humana A22K(W(eps)-hexadecanedioil-gGlu-2xOEG), desB27, B29R, desB30;
insulina humana A22K(W(eps)-hexadecanedioil-3x(gGlu-OEG)-gGlu), desB27, B29R, desB30;
insulina humana A22K(W(eps)-tetradecanedioil-gGlu), desB27, B29R, desB30;
insulina humana A22K(W(eps)-tetradecanedioil-gGlu-2xOEG), B3E, desB27, B29R, desB30;
insulina humana A22K(W(eps)-tetradecanedioil-gGlu-2xOEG), B3Q, desB27, B29R, desB30;
insulina humana A22K(W(eps)-tetradecanedioil-2xOEG), desB27, B29R, desB30;
insulina humana A22K(W(eps)-hexadecanedioil-4xgGlu), B3Q, desB27, B29R, desB30;
insulina humana A22K(W(eps)-pentadecanedioil-4xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30;
insulina humana A22K(W(eps)-tetradecanedioil-4xgGlu-2xOEG), desB27, B29R, desB30;
insulina humana A22K(W(eps)-tetradecanedioil-4xgGlu-2xOEG), B3E, desB27, B29R, desB30;
insulina humana A14E, A22K(W(eps)-tetradecanedioil-gGlu-2xOEG), B3E, desB27, B29R, desB30;
insulina humana A14E, A22K(W(eps)-tetradecanedioil-4xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30;
insulina humana A22K(W(eps)-tetradecanedioil-2xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30;
insulina humana A22K(W(eps)-tetradecanedioil-gGlu), B3E, desB27, B29R, desB30; y
insulina humana A22K(W(eps)-tetradecanedioil-3xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30,
Características preferidas de los compuestos de la invención
La presente invención puede caracterizarse adicionalmente por referencia a una o más de las siguientes características: 1. Un análogo acilado de insulina humana, cuyo análogo es [A22K, desB27, B29R, desB30]; y cuyo análogo de insulina está sustituido opcionalmente con A14E, y/o B3E, o B3Q; y cuyo análogo de insulina está acilado en el grupo épsilon amino del residuo de lisina en la posición A22 con un grupo de Fórmula II
[Acil]-[Enlazador]-en donde el grupo enlazador es una cadena de aminoácidos compuesta de 1 a 10 residuos de aminoácidos seleccionados de -gGlu- y -OEG-; en donde
gGlu representa un residuo de ácido gamma glutámico; y
OEG representa el residuo de ácido 8-amino-3,6-dioxaoctanoico (es decir, un grupo de la fórmula -NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-);
cuyos residuos de aminoácidos pueden estar presentes en cualquier orden; y
cuya cadena de aminoácidos comprende al menos un residuo de gGlu; y
en donde el grupo acilo es un residuo de un ácido a,u>-dicarboxílico seleccionado de
ácido 1,14-tetradecanedioico;
ácido 1,15-pentadecanedioico; y
ácido 1,16-hexadecanedioico.
2. El análogo acilado de insulina humana de acuerdo con la cláusula 1, cuyo análogo es [A22K, desB27, B29R, desB30] con relación a la insulina humana; y cuyo análogo de insulina está sustituido con B3E o B3Q; y cuyo análogo de insulina está acilado en el grupo épsilon amino del residuo de lisina en la posición A22,
3. El análogo acilado de insulina humana de acuerdo con la cláusula 1, cuyo análogo es [A22K, B3E, desB27, B29R, desB30] con relación a la insulina humana; y cuyo análogo de insulina está acilado en el grupo épsilon amino del residuo de lisina en la posición A22,
4. El análogo acilado de insulina humana de acuerdo con la cláusula 1, cuyo análogo es [A22K, B3Q, desB27, B29R, desB30] con relación a la insulina humana; y cuyo análogo de insulina está acilado en el grupo épsilon amino del residuo de lisina en la posición A22,
5. El análogo acilado de insulina humana de acuerdo con la cláusula 1, cuyo análogo es [A14E, A22K, desB27, B29R, desB30] con relación a la insulina humana; y cuyo análogo de insulina está acilado en el grupo épsilon amino del residuo de lisina en la posición A22,
6. El análogo acilado de insulina humana de acuerdo con la cláusula 1, cuyo análogo es [A14E, A22K, desB27, B29R, desB30] con relación a la insulina humana; y cuyo análogo de insulina está sustituido con B3E o B3Q; y cuyo análogo de insulina está acilado en el grupo épsilon amino del residuo de lisina en la posición A22,
7. El análogo acilado de insulina humana de acuerdo con la cláusula 1, cuyo análogo es [A14E, A22K, B3E, desB27, B29R, desB30] con relación a la insulina humana; y cuyo análogo de insulina está acilado en el grupo épsilon amino del residuo de lisina en la posición A22,
8. El análogo acilado de insulina humana de acuerdo con la cláusula 7, en donde el grupo acilo es un grupo diácido derivado de ácido 1,14-tetradecanedioico; ácido 1,15-pentadecanedioico; o ácido 1,16-hexadecanedioico. 9. El análogo acilado de insulina humana de acuerdo con la cláusula 7, en donde el grupo acilo es un grupo diácido derivado de ácido 1,14-tetradecanedioico o ácido 1,16-hexadecanedioico.
10. El análogo acilado de insulina humana de acuerdo con la cláusula 7, en donde el grupo acilo es un grupo diácido derivado de ácido 1,14-tetradecanedioico.
11. El análogo acilado de insulina humana de acuerdo con la cláusula 7, en donde el grupo acilo es un grupo diácido derivado de ácido 1,16-hexadecanedioico.
12. El análogo acilado de insulina humana de acuerdo con la cláusula 7, en donde el grupo acilo es un grupo diácido derivado de ácido 1,15-pentadecanedioico.
13. El análogo acilado de insulina humana de acuerdo con la cláusula 7, en donde el grupo enlazador comprende 1-10 residuos de gGlu.
14. El análogo acilado de insulina humana de acuerdo con la cláusula 7, en donde el grupo enlazador comprende 1-8 residuos de gGlu.
15. El análogo acilado de insulina humana de acuerdo con la cláusula 7, en donde el grupo enlazador comprende residuos de 1-6 gGlu.
16. El análogo acilado de insulina humana de acuerdo con la cláusula 7, en donde el grupo enlazador comprende 1-4 residuos de gGlu.
17. El análogo acilado de insulina humana de acuerdo con la cláusula 7, en donde el grupo enlazador comprende 1-3 residuos de gGlu.
18. El análogo acilado de insulina humana de acuerdo con la cláusula 7, en donde el grupo enlazador comprende 1-2 residuos de gGlu.
19. El análogo acilado de insulina humana de acuerdo con la cláusula 7, en donde el grupo enlazador comprende un residuo de gGlu.
20. El análogo acilado de insulina humana de acuerdo con la cláusula 7, en donde el grupo enlazador comprende dos residuos de gGlu.
21. El análogo acilado de insulina humana de acuerdo con la cláusula 7, en donde el grupo enlazador comprende tres residuos de gGlu.
22. El análogo acilado de insulina humana de acuerdo con la cláusula 7, en donde el grupo enlazador comprende cuatro residuos de gGlu.
23. El análogo acilado de insulina humana de acuerdo con la cláusula 7, en donde el grupo enlazador comprende 1-6 residuos de OEG.
24. El análogo acilado de insulina humana de acuerdo con la cláusula 7, en donde el grupo enlazador comprende 1-4 residuos de OEG.
25. El análogo acilado de insulina humana de acuerdo con la cláusula 7, en donde el grupo enlazador comprende 1-3 residuos de OEG.
26. El análogo acilado de insulina humana de acuerdo con la cláusula 7, en donde el grupo enlazador comprende un residuo de OEG.
27. El análogo acilado de insulina humana de acuerdo con la cláusula 7, en donde el grupo enlazador comprende dos residuos de OEG.
28. El análogo acilado de insulina humana de acuerdo con la cláusula 7, en donde el grupo enlazador comprende tres residuos de OEG.
29. El análogo acilado de insulina humana de acuerdo con la cláusula 7, en donde el grupo enlazador no comprende residuos de OEG.
30. El análogo acilado de insulina humana de acuerdo con la cláusula 7, en donde el grupo enlazador se selecciona de -gGlu-; -2xgGlu-; -3xgGlu-; -gGlu-3x(OEG-Glu)-; -4xgGlu-; -2xOEG-; -4xgGlu-2xOEG-;-2xOEG-gGlu-; y -gGlu-2xOEG-.
31. El análogo acilado de insulina humana de acuerdo con la cláusula 7, en donde el grupo enlazador se selecciona de -gGlu; -gGlu-3x(OEG-gGlu)-; y -gGlu-2xOEG-.
32. El análogo acilado de insulina humana de acuerdo con la cláusula 7, en donde el grupo enlazador se selecciona de -gGlu-; -2xgGlu-; y -4xgGlu-.
33. El análogo acilado de la insulina humana de acuerdo con la cláusula 7, en donde el grupo de la Fórmula II [Acil]-[Enlazador]- es tetradecanedioil-gGlu-; tetradecanedioil-2xgGlu-; tetradecanedioil-3xgGlu-; tetradecanedioil-4xgGlu-; tetradecanedioil-gGlu-2xOEG-; tetradecanedioil-2xOEG-; tetradecanedioil-4xgGlu-2xOEG-; hexadecanedioil-4xgGlu-; hexadecanedioil-gGlu-2xOEG-; o hexadecanedioil-3x(gGlu-OEG)-gGlu-.
34. El análogo acilado de insulina humana de acuerdo con la cláusula 7, en donde el grupo de la Fórmula II [Acil]-[Enlazador]- es tetradecanedioil-gGlu-; tetradecanedioil-2xgGlu-; tetradecanedioil-4xgGlu-; tetradecanedioil-gGlu-2xOEG-; o tetradecanedioil-2xOEG-; hexadecanedioil-4xgGlu-; hexadecanedioil-gGlu-2xOEG-; o hexadecanedioil-3x(gGlu-OEG)-gGlu-.
DEFINICIONES
Nomenclatura
En la presente descripción, la denominación de las insulinas se hace de acuerdo con los siguientes principios:
El término "análogo" se usa frecuentemente para la proteína de insulina o péptido en cuestión antes de que se someta a una posterior modificación química (derivatización), y en particular acilación. El producto resultante de una modificación química de este tipo (derivatización) se suele denominar “derivado” o “análogo acilado”. Sin embargo, en el contexto de esta solicitud, el término “análogo” designa análogos de insulina humana así como también derivados (los acilados) de tales análogos de insulina humana.
Los nombres se dan como análogos, derivados y modificaciones (acilaciones) con relación a la insulina humana. Para la nomenclatura de la porción acilo (es decir, el grupo [Acil]-[Enlazador]- de la fórmula II), en algunos casos la nomenclatura se realiza de acuerdo con la nomenclatura IUPAC, y en otros casos la nomenclatura se realiza como nomenclatura de péptidos.
Como ejemplo, la porción acilo de la siguiente estructura (Quím. 1):
Figure imgf000010_0001
puede denominarse “tetradecanedioil-4xgGlu”, “tetradecanedioil-4xyGlu” o, “1,14-tetradecanedioil-4xgGlu” o similares, en donde yGlu (y gGlu) es una notación abreviada del aminoácido ácido gamma glutámico en la configuración L, y “4x” significa que el residuo siguiente se repite 4 veces.
De manera similar, la porción acilo de la siguiente estructura (Quím. 2):
Figure imgf000010_0002
puede por ejemplo denominarse “hexadecanedioil-(gGlu-OEG)3-gGlu)”, “hexadecanedioil-(gGlu-OEG)3-gGlu)”, “hexadecanedioil-3x(gGlu-OEG)-gGlu)”, “1,16-hexadecanedioil-(gGlu-OEG)3-gGlu)”, “1,16-hexadecanedioil-(gGlu-OEG)3-gGlu)”, “1,16-hexadecanedioil-3x(gGlu-OEG)-gGlu)”, “hexadecanedioil-(YGlu-OEG)3-YGlu)”, “hexadecanedioil-(YGlu-OEG)3-yGlu)”, o “hexadecanedioil-3x(YGlu-OEG)-YGlu)”;
en donde la porción de la siguiente estructura (Quím. 3):
Figure imgf000010_0003
puede denominarse por ejemplo tetradecanedioil, 1,14-tetradecanedioil o (notación abreviada) diácido C14, Se aplican notaciones similares para residuos similares con 15 y 16 átomos de carbono, pentadecanedioil, diácido C15 y hexadecanedioil, diácido C16, respectivamente.
YGlu (y gGlu) es una notación abreviada para el aminoácido ácido gamma glutámico en la configuración L.
OEG es una notación abreviada para el residuo de aminoácido ácido 8-amino-3,6-dioxa-octanoico, NH2(CH2)2O(CH2)2OCH2CO2H.
“2x” y “3x” significa que los residuos siguientes se repiten respectivamente 2 y 3 veces.
Por ejemplo, el derivado de insulina del Ejemplo 1 se denomina “insulina humana A22K(W(eps)-tetradecanedioil-4xgGlu), desB27, B29R, desB30” para indicar que la cadena A, que contiene 21 residuos de aminoácidos en la insulina humana, se ha extendido por 1 aminoácido (posición A22), con una lisina (K), que se modifica aún más mediante acilación en el nitrógeno épsilon en el residuo de lisina de A22, denotado SN (o Nla posición B27, T en la insulina humana, se ha eliminado, el aminoácido en la posición B29, K en la insulina humana, se ha sustituido por arginina, R, el aminoácido en la posición B30, treonina, T en la insulina humana, se ha eliminado. Los asteriscos en las fórmulas a continuación indican que el residuo en cuestión es diferente (es decir, sustituido) en comparación con la insulina humana.
A lo largo de esta solicitud, se dan tanto las fórmulas como los nombres de las insulinas preferidas de la invención.
Además, las insulinas de la invención también se denominan de acuerdo con la nomenclatura IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC). De acuerdo con esta nomenclatura, al derivado de insulina del Ejemplo 1 se le asigna el siguiente nombre: N{Alfa}([ArgB29],des-ThrB27,ThrB30-Insulina(humana)-(A)-peptidil)-N{Epsilon} [(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butanoil]amino]butanoil]-amino]butanoil]amino]butanoil]Lys,(B)-péptido.
Se debe señalar que las fórmulas pueden escribirse con el residuo de lisina (que se modifica por acilación) ya sea que se muestre con el residuo de lisina expandido (como se muestra por ejemplo en el ejemplo 23) o se muestra con el residuo de lisina contraído (como se muestra por ejemplo en el ejemplo 1). En todos los casos, el grupo acilo se une al nitrógeno épsilon del residuo de lisina.
En aras de la integridad, puede mencionarse que la deleción del residuo en la posición B27 (desB27) resulta en el movimiento (formal) de los residuos de aminoácidos restantes hacia el extremo N-terminal por un residuo. En consecuencia, dicho análogo puede denominarse además B27P, B28R, desB29-30, ya que el residuo en la posición B28 es una prolina y el residuo en la posición B29 es una arginina (ver por ejemplo el compuesto del Ejemplo 1). Esto se debe a que al eliminar B27, el siguiente aminoácido en la secuencia luego cambia de lugar y, por lo tanto, el aminoácido en la posición B28 (prolina) cambia a la posición B27,
Estabilidad física
El término "estabilidad física" de la preparación de insulina como se usa en la presente descripción se refiere a la tendencia de la proteína a formar agregados de la proteína inactivos biológicamente y/o insolubles como resultado de la exposición de la proteína a estrés termomecánico y/o la interacción con interfaces y superficies que son desestabilizantes, tales como las superficies e interfaces hidrófobas. La estabilidad física de las preparaciones acuosas de proteínas se evalúa por medio de inspección visual y/o mediciones de la turbidez después de exponer la preparación vertida en contenedores adecuados (por ejemplo, cartuchos o viales) a estrés mecánico/físico (por ejemplo, agitación) a temperaturas diferentes durante diversos periodos de tiempo. La inspección visual de las preparaciones se realiza en una luz nítida enfocada con un fondo oscuro. Una preparación se clasifica como inestable físicamente con respecto a la agregación de proteínas, cuando muestra una turbidez visual a la luz del día. Alternativamente, la turbidez de la preparación puede evaluarse mediante mediciones simples de la turbidez bien conocidas por los expertos en la técnica. La estabilidad física de las composiciones acuosas de proteínas puede evaluarse, además, mediante el uso de un agente o sonda espectroscópica del estado conformacional de la proteína. La sonda es preferentemente una molécula pequeña que se une preferentemente a un confórmero no nativo de la proteína. Un ejemplo de una sonda espectroscópica molecular pequeña de estructura proteica es la Tioflavina T. La Tioflavina T es un colorante fluorescente que se ha usado ampliamente para la detección de fibrillas amiloides. En presencia de fibrillas, y tal vez también de otras configuraciones de proteínas, la Tioflavina T da lugar a un nuevo máximo de excitación a aproximadamente 450 nm y una emisión potenciada a aproximadamente 482 nm cuando se une a una forma de proteína fibrilar. La tioflavina T sin unir es esencialmente no fluorescente a esas longitudes de onda.
Estabilidad química
El término “estabilidad química” de la preparación de proteína como se usa en la presente descripción se refiere a cambios en la estructura covalente de la proteína que conducen a la formación de productos de degradación química con una posible menor potencia biológica y/o un aumento potencial de las propiedades inmunogénicas en comparación con la estructura de la proteína nativa. Pueden formarse diversos productos de degradación química en dependencia del tipo y la naturaleza de la proteína nativa y del entorno al que se expone la proteína. Cantidades crecientes de productos de degradación química se observan frecuentemente durante el almacenamiento y uso de la preparación de proteínas. La mayoría de las proteínas son propensas a la desamidación, un proceso en el que se hidroliza el grupo amida de la cadena lateral en los residuos glutaminilo o asparaginilo para formar un ácido carboxílico libre o residuos de asparaginilo para formar un derivado IsoAsp. Otras rutas de degradación involucran la formación de productos de alto peso molecular donde dos o más moléculas de proteína se unen covalentemente entre sí mediante transamidación y/o interacciones disulfuro que conducen a la formación de productos de degradación de dímeros, oligómeros y polímeros unidos covalentemente (Stability of Protein Pharmaceuticals, Ahern.T.J. & M.C., Plenum Press, Nueva York, 1992). La oxidación (de, por ejemplo, residuos de metionina) puede mencionarse como otra variante de la degradación química. La estabilidad química de la preparación de proteína puede evaluarse mediante la medición de la cantidad de productos de degradación química en diversos puntos temporales después de la exposición a diferentes condiciones ambientales (a menudo la formación de productos de degradación puede acelerarse, por ejemplo, mediante el aumento de la temperatura). La cantidad de cada producto de degradación individual a menudo se determina por separación de los productos de degradación en dependencia del tamaño de la molécula, hidrofobicidad y/o la carga mediante el uso de diversas técnicas de cromatografía (por ejemplo, SEC-HPLC y/o RP-HPLC). Dado que los productos HMWP son potencialmente inmunogénicos y no biológicamente activos, niveles bajos de HMWP son ventajosos.
Métodos de Síntesis
Los derivados de insulina de la invención pueden obtenerse mediante métodos convencionales para la preparación de insulina, análogos de insulina y derivados de insulina, y en particular, mediante los métodos descritos en los ejemplos de trabajo.
En una modalidad, el derivado de insulina de la invención se obtiene por acilación del grupo épsilon amino del residuo de lisina en la posición A22 con un grupo de Fórmula II que es tetradecanedioil-4xgGlu.
En otra modalidad, el derivado de insulina de la invención se obtiene por acilación del grupo épsilon amino del residuo de lisina en la posición A22 a pH alto, y en particular a un pH en el intervalo de 9,5 a 13, con un grupo de Fórmula II que es tetradecanedioil-4xgGlu.
Más particularmente, el derivado de insulina de la invención se obtiene por acilación del grupo épsilon amino del residuo de lisina en la posición A22 con el compuesto 5-(2,5-dioxo-pirrolidin-1-il) éster del ácido (S)-2-((S)-4-Carboxi-4-{(S)-4-carboxi-4-[(S)-4-carboxi-4-(13-carboxi-tridecanoilamino)-butirilamino]-butirilamino}-butirilamino)-pentanedioico (o alternativamente denominado tetradecanedioil-4xgGlu-OSu) (Quim.4).
En otra modalidad, el derivado de insulina de la invención se obtiene por acilación del grupo épsilon amino del residuo de lisina en la posición A22 con el compuesto ácido 14-[[(1S)-1-carboxi-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2,5-dioxopirrolidin-1-il)oxi-2-oxoetoxi]etoxi]etolamino]-2-oxoetoxi]etoxi]etilamino]-4-oxobutil]amino]-14-oxotetradecanoico (o alternativamente designado tetradecanedioil-gGlu-2xOEG-OSu) (Quim.5).
Características preferidas para la síntesis de los compuestos de la invención
Para la síntesis de los derivados de insulina de acuerdo con la presente invención, se hace referencia a una o más de las siguientes características:
1. El compuesto 5-(2,5-dioxo-pirrolidin-1-il) éster del ácido (S)-2-((S)-4-carboxi-4-{(S)-4-carboxi-4-[(S)-4-carboxi-4-(13-carboxi-tridecanoilamino)-butirilamino]-butirilamino}-butirilamino)-pentanedioico (o alternativamente designado tetradecanedioil-4xgGlu-OSu) (Quim.4), para su uso en un proceso de acilación como intermediario en la síntesis del derivado de insulina de la invención.
2. El compuesto ácido 14-[[(1S)-1-carboxi-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2,5-dioxopirrolidin-1-il)oxi-2-oxoetoxi]etoxi]etilamino]-2-oxoetoxi]etoxi]etilamino]-4-oxobutil]amino]-14-oxotetradecanoico (o alternativamente designado tetradecanedioil-gGlu-2xOEG-OSu) (Quim.5), para su uso en un proceso de acilación como intermediario en la síntesis del derivado de insulina de la invención.
3. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las cláusulas 1-2 para su uso como un compuesto intermediario en la síntesis de un derivado de insulina, cuyo derivado de insulina es un análogo acilado de insulina humana, cuyo análogo contiene la mutación A22K con relación a la insulina humana, y posición en la cual está acilado un compuesto de cualquiera de las cláusulas 1-2,
4. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las cláusulas 1-2 para su uso como un compuesto intermediario en la síntesis de un derivado de insulina, cuyo derivado de insulina es un análogo acilado de insulina humana, cuyo análogo es [A22K, desB27, B29R, desB30] con relación a la insulina humana, y cuyo análogo está acilado en la posición A22K con un compuesto de cualquiera de las cláusulas 1-2,
5. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las cláusulas 1-2 para su uso como un compuesto intermediario en la síntesis de un derivado de insulina, cuyo derivado de insulina es un análogo acilado de insulina humana, cuyo análogo es [A22K, desB27, B29R, desB30] con relación a la insulina, y cuyo análogo acilado puede comprender adicionalmente las sustituciones A14E, y/o B3E, B3Q, y cuyo análogo está acilado en la posición A22K con un compuesto de cualquiera de las cláusulas 1-2,
6. El compuesto de acuerdo con la cláusula 1 para su uso como un compuesto intermediario en la síntesis de
insulina humana A22K(W(eps)-tetradecanedioil-4xgGlu), desB27, B29R, desB30;
insulina humana A22K(W(eps)-tetradecanedioil-4xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30;
insulina humana A14E, A22K(W(eps)-tetradecanedioil-4xgGlu), desB27, B29R, desB30;
insulina humana A22K(W(eps)-tetradecanedioil-4xgGlu), B3Q, desB27, B29R, desB30;
insulina humana A22K(W(eps)-tetradecanedioil-4xgGlu-2xOEG), desB27, B29R, desB30;
insulina humana A22K(W(eps)-tetradecanedioil-4xgGlu-2xOEG), B3E, desB27, B29R, desB30; o
insulina humana A14E, A22K(W(eps)-tetradecanedioil-4xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30;
Actividad biológica
En otro aspecto, la invención proporciona nuevos derivados de insulina para su uso como medicamentos, o para su uso en la elaboración de medicamentos o composiciones farmacéuticas.
Los derivados de insulina de la invención se encuentra como derivados de insulina de acción corta y rápida que se consideran adecuados para el uso prandial.
Todos los derivados de insulina de la invención poseen afinidades al receptor de insulina adecuadas para activar el receptor de insulina para dar la respuesta glucémica necesaria, es decir, ser capaz de disminuir la glucosa en sangre en animales y humanos.
Se encuentra que los derivados de insulina de la invención tienen un receptor de insulina (IR) equilibrado con la relación de afinidad del receptor del factor de crecimiento tipo insulina 1 (IGF-1R) (IR / IGF-1R).
En un aspecto, la insulina acilada A22K de la invención tiene una relación IR/IGF-1R de más de 0,3; de más de 0,4; de más de 0,5; de más de 0,6; de más de 0,7; de más de 0,8; de más de 0,9; de más de 1; de más de 1,5; o de más de 2,
En otro aspecto, el análogo de insulina acilada A22K es un compuesto de la invención, en donde el grupo acilo de Fórmula II es derivado del ácido 1,14-tetradecanedioico, y cuyo análogo de insulina acilada tiene un tiempo de residencia medio (MRT) de menos de 250 minutos; menos de 200 minutos; menos de 175 minutos; menos de 150 minutos; menos de 125 minutos; tras la inyección subcutánea de una formulación del análogo de insulina acilada de la invención de 600 pM (aproximadamente), que contiene 1,6 % (p/vol, aproximadamente) de glicerol y 30 mM de fenol/cresol, de pH 7,4, en cerdos.
En otra modalidad, el análogo de insulina acilada A22K es un compuesto de la invención, en donde el grupo acilo de Fórmula II es derivado del ácido 1,16-hexadecanedioico, y cuyo análogo de insulina acilada tiene un tiempo de residencia medio (MRT) de menos de 700 minutos; menos de 600 minutos; menos de 500 minutos; menos de 400 minutos; menos de 300 minutos; tras la inyección subcutánea de una formulación del análogo de insulina acilada de la invención de 600 pM (aproximadamente), que contiene 1,6 % (p/vol, aproximadamente) de glicerol y 30 mM de fenol/m-cresol, de pH 7,4, en cerdos.
En un aspecto adicional, la invención se refiere al uso médico del análogo de insulina acilado de la invención, y en particular al uso de tales derivados de insulina para el tratamiento, la prevención o el alivio de enfermedades, trastornos o afecciones que se relacionan con la diabetes, diabetes tipo 1, diabetes tipo 2, alteración de la tolerancia a la glucosa, hiperglucemia, dislipidemia, obesidad, síndrome metabólico (síndrome metabólico X, síndrome de resistencia a la insulina) hipertensión, trastornos cognitivos, aterosclerosis, infarto del miocardio, infarto cerebral, trastornos cardiovasculares, enfermedad coronaria, síndrome inflamatorio intestinal, dispepsia o úlceras gástricas, cuyo método comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva del derivado de insulina a un sujeto que lo necesita.
En otra modalidad, la invención se refiere al uso de tales derivados de insulina para el tratamiento, prevención o alivio de enfermedades, trastornos o afecciones que se relacionan con la diabetes, diabetes tipo 1, diabetes tipo 2, o alteración de la tolerancia a la glucosa, cuyo método comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva del derivado de insulina a un sujeto que lo necesita.
En una tercera modalidad, la invención se refiere al uso de tales derivados de insulina para el tratamiento, prevención o alivio de enfermedades, trastornos o afecciones relacionados con la diabetes, y en particular diabetes tipo 1 o diabetes tipo 2,
Composiciones farmacéuticas
La presente invención se refiere a análogos de insulina acilados útiles como medicamentos.
Por lo tanto, en otro aspecto, la invención proporciona nuevas composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de un derivado de insulina de acuerdo con la presente invención.
La composición farmacéutica de acuerdo con la invención comprende opcionalmente uno o más vehículos y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables.
La composición farmacéutica de la presente invención puede comprender además otros excipientes comúnmente usados en composiciones farmacéuticas, por ejemplo, conservadores, agentes quelantes, agentes de tonicidad, potenciadores de la absorción, estabilizadores, antioxidantes, polímeros, surfactantes, iones metálicos, vehículos oleaginosos y proteínas (por ejemplo, albúmina sérica humana, gelatina o proteínas).
En una modalidad de la invención la composición farmacéutica de la invención es una preparación acuosa, es decir, la preparación que comprende agua. Tal composición es típicamente una solución o una suspensión. En otra modalidad de la invención, la composición farmacéutica es una solución acuosa.
El término “preparación acuosa” se define como una preparación que comprende al menos 50 % p/p de agua. Igualmente, el término “solución acuosa” se define como una solución que comprende al menos 50 % p/p de agua, y el término “suspensión acuosa” se define como una suspensión que comprende al menos 50 % p/p de agua. Las suspensiones acuosas pueden contener los compuestos activos en la mezcla con excipientes adecuados para la fabricación de suspensiones acuosas.
En una modalidad de la invención, la preparación de insulina comprende una solución acuosa de un derivado de insulina de la presente invención, en donde dicho compuesto de insulina está presente en una concentración de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 20,0 mM; más particularmente de aproximadamente 0,2 mM a aproximadamente 4,0 mM; de aproximadamente 0,3 mM a aproximadamente 2,5 mM; de aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 2,5 mM; de aproximadamente 0,6 mM a aproximadamente 2,0 mM; o de aproximadamente 0,,6 mM a aproximadamente 1,2 mM.
En otra modalidad de la invención, la preparación de insulina comprende una solución acuosa de un derivado de insulina de la presente invención, en donde dicho compuesto de insulina está presente en una concentración de aproximadamente 0,1 mM; de aproximadamente 0,3 mM; de aproximadamente 0,4 mM; de aproximadamente 0,6 mM; de aproximadamente 0,9 mM; de aproximadamente 1,2 mM; de aproximadamente 1,5 mM; o de aproximadamente 1,8 mM.
La composición farmacéutica de la presente invención puede comprender además un sistema tampón. El tampón se selecciona típicamente del grupo que consiste en, pero no se limita a, acetato de sodio, carbonato de sodio, fosfato dihidrógeno de sodio, fosfato hidrógeno de disodio, fosfato de sodio, y tris(hidroximetil)-aminometano, bicina, tricina, ácido málico, glicilglicina, etilendiamina, ácido succínico, ácido maléico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido aspártico o sus mezclas. Cada uno de estos tampones específicos constituye una modalidad alternativa de la invención.
En una modalidad, el tampón es un tampón de fosfato. En otra modalidad, la concentración de dicho tampón de fosfato está en el intervalo de aproximadamente 0,1 mM a 20 mM, en otra modalidad adicional la concentración de dicho tampón de fosfato está en el intervalo de 0,1 mM a aproximadamente 10 mM, o de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 8 mM, de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 8 mM, o de aproximadamente 2 mM a aproximadamente 8 mM, o de 6 mM a aproximadamente 8 mM.
El pH de la composición farmacéutica inyectable de la invención está en el intervalo de 3 a 8,5, Preferentemente, la composición farmacéutica inyectable de acuerdo con la invención tiene un pH en el intervalo de aproximadamente 6,8 a aproximadamente 7,8.
En una modalidad el pH está en el intervalo de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 7,8, o de 7,2 a 7,6,
Las preparaciones de insulina de la presente invención pueden comprender además un agente de tonicidad. El agente de tonicidad puede seleccionarse del grupo que consiste en una sal (por ejemplo, cloruro de sodio), un azúcar o azúcar alcohólico, un aminoácido (por ejemplo, L-glicina, L-histidina, arginina, lisina, isoleucina, ácido aspártico, triptófano, treonina), un alditol (por ejemplo, glicerol (glicerina), 1,2-propanodiol (propilenglicol), 1,3-propanodiol, 1,3-butanodiol) polietilenglicol (por ejemplo, PEG400) o sus mezclas. Puede usarse cualquier azúcar tal como mono-, di-, o polisacáridos, o glucanos solubles en agua, que incluyen por ejemplo, fructosa, glucosa, manosa, sorbosa, xilosa, maltosa, lactosa, sacarosa, trehalosa, dextrano, pululano, dextrina, ciclodextrina, almidón soluble, hidroxietil almidón y carboximetilcelulosa de Na. En una modalidad el aditivo de azúcar es sacarosa. Los azúcares alcohólicos incluyen, por ejemplo, manitol, sorbitol, inositol, galactitol, dulcitol, xilitol y arabitol. En una modalidad, el azúcar alcohólico aditivo es manitol. Los azúcares o azúcares alcohólicos mencionados anteriormente pueden usarse individualmente o en combinación. Cada uno de estos agentes de tonicidad específicos o mezclas de estos constituyen una modalidad alternativa de la invención.
En una modalidad de la invención, el glicerol y/o manitol y/o cloruro de sodio puede estar presente en una cantidad correspondiente a una concentración de 0 a 250 mM, de 0 a 200 mM, o de 0 a 100 mM.
Las preparaciones de insulina de la presente invención pueden comprender además un conservador farmacéuticamente aceptable. El conservador puede estar presente en una cantidad suficiente para obtener un efecto de conservación. La cantidad de conservador en una composición farmacéutica de la invención puede determinarse a partir de, por ejemplo, la literatura en el campo y/o la(s) cantidad(es) conocida(s) de conservador en, por ejemplo, productos comerciales. Cada uno de estos conservadores específicos o mezclas de estos constituyen una modalidad alternativa de la invención. El uso de un conservador en preparaciones farmacéuticas se describe, por ejemplo en Remington: The Science and Practice o f Pharmacy, 19ta edición, 1995,
En una modalidad, la composición farmacéutica inyectable comprende al menos un compuesto fenólico como agente conservador.
En otra modalidad el compuesto fenólico para su uso de acuerdo con la invención puede estar presente en hasta aproximadamente 6 mg/ml en la composición farmacéutica inyectable final, en particular de hasta aproximadamente 4 mg/ml de composición farmacéutica inyectable final.
En otra modalidad el compuesto fenólico para su uso de acuerdo con la invención puede estar presente en una cantidad de hasta aproximadamente 4,0 mg/ml de la composición farmacéutica inyectable final; en particular de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 4,0 mg/ml; o de aproximadamente 0,6 mg/ml a aproximadamente 4,0 mg/ml.
En otra modalidad el conservador es fenol.
En otra modalidad, la composición farmacéutica inyectable comprende una mezcla de fenol y m-cresol como agente conservador.
En otra modalidad, la composición farmacéutica inyectable comprende aproximadamente 16 mM de fenol (1,5 mg/ml) y aproximadamente 16 mM de m-cresol (1,72 mg/mL).
La composición farmacéutica de la presente invención puede comprender además un agente quelante. El uso de un agente quelante en composiciones farmacéuticas se conoce bien por los expertos. Por conveniencia se hace referencia a Remington: The Science and Practice o f Pharmacy, 19ta edición, 1995,
La composición farmacéutica de la presente invención puede comprender además un potenciador de la absorción. El grupo de potenciadores de la absorción puede incluir, pero no se limita a, compuestos nicotínicos. El término compuesto nicotínico incluye nicotinamida, ácido nicotínico, niacina, niacina amida y vitamina B3 y/o sales de los mismos y/o cualquier combinación de los mismos.
En una modalidad, el compuesto nicotínico es nicotinamida, y/o ácido nicotínico, y/o una sal del mismo. En otra modalidad el compuesto nicotínico es nicotinamida. El compuesto nicotínico para su uso de acuerdo con la invención puede ser en particular N-metil nicotinamida, N,N-dietilnicotinamida, N-etilnicotinamida, N,N-dimetilnicotinamida, N-propil nicotinamida o N-butil nicotinamida.
En otra modalidad, el compuesto nicotínico está presente en la cantidad de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 200 mM; en particular en la cantidad de aproximadamente 20 mM a aproximadamente 200 mM; en la cantidad de aproximadamente 100 mM a aproximadamente 170 mM; o en la cantidad de aproximadamente 130 mM a aproximadamente 170 mM, tal como aproximadamente 130 mM, aproximadamente 140 mM, aproximadamente 150 mM, aproximadamente 160 mM, o aproximadamente 170 mM.
La composición farmacéutica de la presente invención puede comprender además un estabilizador. El término “estabilizador” como se usa en la presente descripción se refiere a productos químicos añadidos a preparaciones farmacéuticas que contienen polipéptidos para estabilizar el péptido, es decir, para aumentar la vida útil y/o el tiempo en uso de tales preparaciones. Por conveniencia se hace referencia a Remington: The Science and Practice o f Pharmacy, 19ta edición, 1995,
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden comprender además una cantidad de una base de aminoácido suficiente para disminuir la formación de agregados por el polipéptido o proteína durante el almacenamiento de la composición. Por "base de aminoácido" se entiende un aminoácido o una combinación de aminoácidos, donde cualquier aminoácido dado está presente en su forma de base libre o en su forma de sal. Los aminoácidos pueden en particular ser arginina, lisina, ácido aspártico, ácido glutámico, aminoguanidina, ornitina o W-monoetil L-arginina, etionina o buthionina, o S-metil-L cisteína. En una modalidad de la invención la base de aminoácido puede estar presente en una cantidad correspondiente a una concentración de 1 a 100 mM; de 1 a 50 mM; o de 1 a 30 mM.
En una modalidad, la composición farmacéutica de la presente invención puede comprender además un surfactante. El término “surfactante” como se usa en la presente descripción se refiere a cualesquiera moléculas o iones que comprenden una parte soluble en agua (hidrófila) y una parte soluble en grasa (lipófila). Los surfactantes se acumulan preferentemente en las interfaces, en las que la parte hidrofílica se orienta hacia el agua (fase hidrofílica) y la parte lipofílica hacia la fase oleosa o hidrofóbica (es decir, vidrio, aire, aceite, etcétera). La concentración a la que los surfactantes comienzan a formar micelas se conoce como la concentración micelar crítica o CMC. Además, los surfactantes reducen la tensión superficial de un líquido. Los surfactantes también se conocen como compuestos anfipáticos. El uso de un surfactante en preparaciones farmacéuticas se conoce bien por los expertos. Por conveniencia se hace referencia a Remington: The Science and Practice o f Pharmacy, 19ta edición, 1995,
La invención se refiere además a un método para la preparación de tales preparaciones de insulina. Las preparaciones de insulina de esta invención pueden prepararse mediante el uso de cualquiera de un número de métodos reconocidos. Por ejemplo, las preparaciones pueden prepararse mezclando una solución acuosa de excipientes con una solución acuosa del derivado de insulina, después de lo cual el pH se ajusta a un nivel deseado y la mezcla se compone hasta el volumen final con agua, seguido de filtración estéril.
Composiciones Farmacéuticas que no contienen zinc.
Las preparaciones de insulina tradicionalmente comprenden zinc añadido como, por ejemplo, sal de cloruro o acetato para obtener una estabilidad aceptable de la preparación farmacéutica. Sin embargo, se ha descubierto sorprendentemente que ciertos derivados de insulina de la invención, mientras se mantiene una estabilidad química y física suficiente, pueden formularse en composiciones farmacéuticas sin la adición de zinc, lo que proporciona un inicio de acción más rápido que análogos de insulina comparables que necesitan iones Zn2+ para mantener suficiente estabilidad química y física. Las formulaciones que no contienen zinc se absorben más rápidamente del tejido subcutáneo, lo que permite el uso prandial.
Con respecto a esto es necesario mencionar que una composición farmacéutica de insulina que no contiene zinc es realmente difícil de obtener, trazas de zinc, en una mayor o menor medida, pueden estar presentes en los excipientes usados convencionalmente para la fabricación de composiciones farmacéuticas, y en particular en los materiales de goma usados en recipientes médicos.
Por lo tanto, en un aspecto, la invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un derivado de insulina de la invención, formulado como una composición baja en zinc, es decir, sin adición separada de zinc a la preparación. Tales composiciones farmacéuticas se denominan generalmente como “composiciones sin zinc”, aunque de hecho pueden considerarse “composiciones bajas en zinc”.
Sin embargo, siempre que se puedan proporcionar excipientes sin zinc, los derivados de insulina de la presente invención de hecho permiten la preparación de composiciones farmacéuticas sin zinc. Por lo tanto, en otro aspecto, la invención proporciona composiciones farmacéuticas que no contienen zinc que comprenden el derivado de insulina de la invención y uno o más excipientes o diluyentes aceptables farmacéuticamente, desprovistos de zinc.
Ahora descubrimos que un subconjunto de los derivados de insulina acilados A22K de la invención, al tener una sustitución en la posición B3, mejora la estabilidad tanto química como física en composiciones farmacéuticas formuladas sin iones de zinc añadidos y sin surfactantes añadidos. Por lo tanto, en un aspecto adicional, la invención proporciona una composición farmacéutica baja en zinc o sin zinc como se describió anteriormente, que comprende un derivado de insulina de la invención que contiene una sustitución adicional en la posición B3 (es decir, B3E o B3Q), y uno o más excipientes o diluyentes farmacéuticamente aceptables, en los cuales a la composición farmacéutica, sin embargo, no se ha agregado surfactante.
En una modalidad, la invención proporciona una composición farmacéutica formulada como una composición baja en zinc, sin iones de zinc añadidos, que comprende un derivado de insulina y uno o más excipientes o diluyentes farmacéuticamente aceptables, en donde el derivado de insulina es un análogo acilado de insulina humana, cuyo análogo es
[A22K, B3E o B3Q, desB27, B29R, desB30] con relación a la insulina humana;
y cuyo análogo de insulina se derivatiza por acilación del grupo épsilon amino del residuo de lisina en la posición A22 con un grupo de Fórmula II
[Acil]-[Enlazador]
en donde el grupo enlazador es una cadena de aminoácidos compuesta de 1 a 10 residuos de aminoácidos seleccionados de -gGlu- y -OEG-; en donde
gGlu representa un residuo de ácido gamma glutámico;
OEG representa el residuo de ácido 8-amino-3,6-dioxaoctanoico (es decir, un grupo de la fórmula -NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-);
cuyos residuos de aminoácidos pueden estar presentes en cualquier orden; y
cuya cadena de aminoácidos comprende al menos un residuo de gGlu; y
en donde el grupo acilo es un residuo de un ácido a,u>-dicarboxílico seleccionado de
ácido 1,14-tetradecanedioico;
ácido 1,15-pentadecanedioico; y
ácido 1,16-hexadecanedioico;
cuyo análogo acilado, puede comprender adicionalmente las sustitución A14E.
En otra modalidad, la sustitución adicional en la posición B3 es B3E.
En una tercera modalidad, la sustitución adicional en la posición B3 es B3Q.
En una cuarta modalidad la invención proporciona una composición farmacéutica, formulada como una composición baja en zinc, sin iones de zinc añadidos, que comprende un análogo acilado de insulina humana seleccionado de: insulina humana A22K(W(eps)-tetradecanedioil-4xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30;
insulina humana A22K(W(eps)-hexadecanedioil-4xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30;
insulina humana A22K(W(eps)-hexadecanedioil-gGlu-2xOEG), B3E, desB27, B29R, desB30;
insulina humana A22K(W(eps)-hexadecanedioil-3x(gGlu-OEG)-gGlu), B3E, desB27, B29R, desB30;
insulina humana A22K(W(eps)-tetradecanedioil-gGlu-2xOEG), B3E, desB27, B29R, desB30;
insulina humana A22K(W(eps)-pentadecanedioil-4xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30;
insulina humana A22K(W(eps)-tetradecanedioil-4xgGlu), B3Q, desB27, B29R, desB30;
insulina humana A22K(W(eps)-hexadecanedioil-gGlu-2xOEG), B3Q, desB27, B29R, desB30;
insulina humana A22K(W(eps)-hexadecanedioil-3x(gGlu-OEG)-gGlu), B3Q, desB27, B29R, desB30;
insulina humana A22K(W(eps)-tetradecanedioil-gGlu-2xOEG), B3Q, desB27, B29R, desB30;
insulina humana A22K(W(eps)-hexadecanedioil-4xgGlu), B3Q, desB27, B29R, desB30;
insulina humana A14E, A22K(W(eps)-tetradecanedioil-4xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30;
insulina humana A14E, A22K(W(eps)-tetradecanedioil-gGlu-2xOEG), B3E, desB27, B29R, desB30;
insulina humana A22K(W(eps)-tetradecanedioil-2xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30;
insulina humana A22K(W(eps)-tetradecanedioil-3xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30;
insulina humana A22K(W(eps)-tetradecanedioil-4xgGlu-2xOEG), B3E, desB27, B29R, desB30; e
insulina humana A22K(W(eps)-tetradecanedioil-gGlu), B3E, desB27, B29R, desB30,
En otra modalidad más, la invención proporciona una composición farmacéutica baja en zinc como se describió anteriormente, en donde los iones de zinc pueden estar presentes en una cantidad correspondiente a una concentración de menos de 0,2 iones Zn2+ por cada 6 moléculas de insulina; de menos de 0,15 iones Zn2+ por cada 6 moléculas de insulina; de menos de 0,12 iones Zn2+ por cada 6 moléculas de insulina; 0,1 iones Zn2+ por cada 6 moléculas de insulina; de menos de 0,09 iones Zn2+ por cada 6 moléculas de insulina; de menos de 0,08 iones Zn2+ por cada 6 moléculas de insulina; de menos de 0,07 iones Zn2+ por cada 6 moléculas de insulina; de menos de 0,06 iones Zn2+ por cada 6 moléculas de insulina; de menos de 0,05 iones Zn2+ por cada 6 moléculas de insulina; de menos de 0,04 iones Zn2+ por cada 6 moléculas de insulina; de menos de 0,03 iones Zn2+ por cada 6 moléculas de insulina; de menos de 0,02 iones Zn2+ por cada 6 moléculas de insulina; o de menos de 0,01 iones Zn2+ por cada 6 moléculas de insulina.
En una modalidad adicional, la invención proporciona una composición farmacéutica baja en zinc o que no contiene zinc como se describió anteriormente, formulada como una composición inyectable. La composición farmacéutica de esta invención puede obtenerse mediante el uso de métodos convencionales conocidos en la técnica. Por ejemplo, los componentes pueden mezclarse juntos en forma de soluciones acuosas, después de lo cual el pH se ajusta a un nivel deseado y la mezcla se compone hasta el volumen final con agua, seguido de filtración estéril.
La administración parenteral puede realizarse por inyección subcutánea, intramuscular, intraperitoneal o intravenosa por medio de una jeringa, opcionalmente una pluma de inyección. Alternativamente, la administración parenteral puede realizarse por medio de una bomba de infusión. Como una opción adicional, las preparaciones de insulina que contienen el compuesto de insulina de la invención pueden adaptarse, además, a la administración transdérmica, por ejemplo, mediante inyección sin aguja o desde un parche de microagujas, opcionalmente un parche iontoforético, o administración transmucosal, por ejemplo, bucal.
Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención pueden administrarse a un paciente que necesite dicho tratamiento en varios sitios, por ejemplo, en sitios tópicos, por ejemplo, sitios de la piel y las mucosas, en sitios que eluden la absorción, por ejemplo, administración en una arteria, en una vena, en el corazón y en sitios que implican absorción, por ejemplo, administración en la piel, debajo de la piel, en un músculo o en el abdomen.
En una modalidad, las preparaciones de insulina de esta invención son adecuadas para su aplicación en dispositivos tipo pluma usados para la terapia con insulina por inyección.
La composición farmacéutica de la invención puede usarse en el tratamiento de la diabetes por administración parenteral.
En otra modalidad, las preparaciones de insulina de la presente invención pueden prepararse además para su uso en varios dispositivos médicos que normalmente se usan para la administración de insulina, que incluyen terapia de infusión de insulina subcutánea continua mediante el uso de bombas, y/o para su aplicación en terapia de insulina basal.
Se recomienda que un médico seleccione la dosificación de las composiciones que comprenden el derivado de esta invención que debe administrarse al paciente. Se contempla actualmente que el derivado de insulina de acuerdo con la invención debe estar presente en la composición farmacéutica final en una concentración de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 20,0 mM; más particularmente de aproximadamente 0,2 mM a aproximadamente 4,0 mM; de aproximadamente 0,3 mM a aproximadamente 2,5 mM; de aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 2,5 mM; de aproximadamente 0,6 mM a aproximadamente 2,0 mM; o de aproximadamente 0,6 mM a aproximadamente 1,2 mM.
Características preferidas de la composición farmacéutica de la invención
La presente invención puede caracterizarse adicionalmente por referencia a una o más de las siguientes características:
1. Una composición farmacéutica que comprende el análogo acilado de insulina humana de la invención, y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.
2. La composición farmacéutica de acuerdo con la cláusula 1, formulada como una composición baja en zinc, sin iones de zinc añadidos.
3. La composición farmacéutica de acuerdo con la cláusula 1, formulada como una composición baja en zinc, sin iones de zinc añadidos, que comprende un análogo acilado de insulina humana que contiene una sustitución en la posición B3,
4. La composición farmacéutica de acuerdo con la cláusula 1, formulada como una composición baja en zinc, sin iones de zinc añadidos, que comprende un análogo acilado de insulina humana que contiene la sustitución de B3E o B3Q.
5. La composición farmacéutica de acuerdo con la cláusula 1, formulada como una composición baja en zinc, sin iones de zinc añadidos, que comprende un análogo acilado de insulina humana que contiene la sustitución de B3E.
6. La composición farmacéutica de acuerdo con la cláusula 1, formulada como una composición baja en zinc, sin iones de zinc añadidos, que comprende un análogo acilado de insulina humana que contiene la sustitución B3Q.
7. La composición farmacéutica de acuerdo con la cláusula 1, formulada como una composición baja en zinc, sin iones de zinc añadidos, que comprende un análogo acilado de insulina humana seleccionado de:
insulina humana A22K(W(eps)-tetradecanedioil-4xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30;
insulina humana A22K(W(eps)-hexadecanedioil-4xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30;
insulina humana A22K(w(eps)-hexadecanedioil-gGlu-2xOEG), B3E, desB27, B29R, desB30;
insulina humana A22K(W(eps)-hexadecanedioil-3x(gGlu-OEG)-gGlu), B3E, desB27, B29R, desB30;
insulina humana A22K(W(eps)-tetradecanedioil-gGlu-2xOEG), B3E, desB27, B29R, desB30;
insulina humana A22K(W(eps)-pentadecanedioil-4xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30;
insulina humana A22K(W(eps)-tetradecanedioil-4xgGlu-2xOEG), B3E, desB27, B29R, desB30;
insulina humana A14E, A22K(W(eps)-tetradecanedioil-gGlu-2xOEG), B3E, desB27, B29R, desB30;
insulina humana A14E, A22K(W(eps)-tetradecanedioil-4xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30;
insulina humana A22K(W(eps)-tetradecanedioil-2xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30;
insulina humana A22K(W(eps)-tetradecanedioil-gGlu), B3E, desB27, B29R, desB30; y
insulina humana A22K(W(eps)-tetradecanedioil-3xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30,
8. La composición farmacéutica de acuerdo con la cláusula 1, formulada como una composición baja en zinc, sin iones de zinc añadidos, que comprende un análogo acilado de insulina humana seleccionada de:
insulina humana A22K(W(eps)-tetradecanedioil-4xgGlu), B3Q, desB27, B29R, desB30;
insulina humana A22K(W(eps)-hexadecanedioil-gGlu-2xOEG), B3Q, desB27, B29R, desB30;
insulina humana A22K(W(eps)-hexadecanedioil-3x(gGlu-OEG)-gGlu), B3Q, desB27, B29R, desB30;
insulina humana A22K(W(eps)-tetradecanedioil-gGlu-2xOEG), B3Q, desB27, B29R, desB30; e
insulina humana A22K(W(eps)-hexadecanedioil-4xgGlu), B3Q, desB27, B29R, desB30,
9. La composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las cláusulas 7-8, que comprende menos de 0,2 Zn2+ iones por cada 6 moléculas de insulina.
10. La composición farmacéutica baja en zinc de acuerdo con cualquiera de las cláusulas 7-8, en donde no se ha añadido surfactante.
11. La composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las cláusulas 7-8, que comprende un compuesto nicotínico.
12. La composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las cláusulas 7-8, que comprende un compuesto nicotínico, fenilalanina, y/o una sal de esta, en una concentración total de aproximadamente 20 mM a aproximadamente 170 mM.
13. La composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las cláusulas 7-8, que comprende un compuesto nicotínico, fenilalanina, y/o una sal de esta, en una concentración total de aproximadamente 130 mM a aproximadamente 170 mM.
14. La composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las cláusulas 7-8, que comprende un excipiente, diluyente y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable.
Métodos de terapia
La presente invención se refiere a fármacos para uso terapéutico. Más específicamente la invención se refiere al uso de los derivados acilados de análogos de insulina humana de la invención para el tratamiento o prevención de afecciones médicas relacionadas con la diabetes.
Por lo tanto, en otro aspecto, la invención proporciona un método para el tratamiento o alivio de una enfermedad o trastorno o afección de un cuerpo de animal vivo, que incluye un ser humano, cuya enfermedad, trastorno o afección puede seleccionarse de una enfermedad, trastorno o afección que se relaciona con diabetes, diabetes tipo 1, diabetes tipo 2, alteración de la tolerancia a la glucosa, hiperglucemia, dislipidemia, obesidad, síndrome metabólico (síndrome metabólico X, síndrome de resistencia a la insulina), hipertensión, trastornos cognitivos, aterosclerosis, infarto del miocardio, derrame cerebral, trastornos cardiovasculares, enfermedad coronaria, síndrome de intestino inflamatorio, dispepsia, o úlceras gástricas, cuyo método comprende la etapa de administrar una cantidad terapéuticamente efectiva del análogo acilado de insulina humana de la invención a un sujeto que lo necesita.
En otra modalidad, la invención proporciona un método para el tratamiento o alivio de una enfermedad o trastorno o afección de un cuerpo de animal vivo, que incluye un ser humano, cuya enfermedad, trastorno o afección puede seleccionarse de una enfermedad, trastorno o afección que se relaciona con diabetes, diabetes tipo 1, diabetes tipo 2, alteración de la tolerancia a la glucosa, hiperglucemia, dislipidemia, obesidad, síndrome metabólico (síndrome metabólico X, síndrome de resistencia a la insulina), hipertensión, desórdenes cognitivos, aterosclerosis, infarto del miocardio, derrame cerebral, desórdenes cardiovasculares, enfermedad coronaria, síndrome inflamatorio intestinal, dispepsia, o úlceras gástricas, cuyo método comprende la etapa de administrar una cantidad terapéuticamente efectiva del análogo acilado de insulina humana de la invención a un sujeto que lo necesita.
En una tercera modalidad, la invención proporciona un método para el tratamiento o alivio de una enfermedad o trastorno o afección de un cuerpo de animal vivo, que incluye un ser humano, cuya enfermedad, trastorno o afección puede seleccionarse de una enfermedad, trastorno o afección relacionada con la diabetes, diabetes tipo 1, diabetes tipo 2, alteración de la tolerancia a la glucosa, hiperglucemia, dislipidemia, obesidad, o síndrome metabólico (síndrome metabólico X, síndrome de resistencia a la insulina).
En una cuarta modalidad la invención proporciona un método para el tratamiento o alivio de una enfermedad o trastorno o afección de un cuerpo de animal vivo, que incluye un ser humano, cuya enfermedad, trastorno o afección puede seleccionarse de una enfermedad, trastorno o afección con relación a la diabetes, en particular diabetes tipo 1, o diabetes tipo 2,
Breve descripción de las figuras
La presente invención se ilustra adicionalmente con referencia a las figuras adjuntas, en donde:
La Figura 1 muestra el perfil PK (farmacocinético) (concentraciones de insulina vs. tiempo) del derivado de insulina del Ejemplo 1 formulado con 0 zinc por cada 6 moléculas de insulina (1 nmol/kg) en comparación con el perfil de NovoRapid®/NovoLog® (insulina aspart, formulación comercial, 3 zinc por cada 6 moléculas de insulina (0,5 y 1 nmol/kg);
La Figura 2 muestra los mismos datos que en la Figura 1, pero solo se muestran las primeras 2 horas;
La Figura 3a muestra los mismos datos que la Figura 1, pero solo muestra los datos de la insulina del Ejemplo 1 formulada con 0 zinc por cada 6 moléculas de insulina (1 nmol/kg) en comparación con el perfil de NovoRapid®/NovoLog® (insulina aspart, formulación comercial, 3 zinc por cada 6 moléculas de insulina (1 nmol/kg);
La Figura 3b muestra los cambios resultantes en la glucosa plasmática que se originan a partir de los perfiles de insulina en la Figura 3a;
Las Figuras 4a y 4b muestran el perfil PK (farmacocinético) (concentraciones de insulina vs. tiempo) de la insulina del Ejemplo 2 formulada con 0 zinc por cada 6 moléculas de insulina (1 nmol/kg) en comparación con el perfil de NovoRapid®/NovoLog® (insulina aspart, formulación comercial, 3 zinc por cada 6 moléculas de insulina (0,5 y 1 nmol/kg), y los cambios resultantes en la glucosa plasmática, respectivamente;
Las Figuras 5a y 5b muestran los mismos datos que las Figuras 4a y 4b, pero solo muestran los datos de la insulina del Ejemplo 2 formulada con 0 zinc por cada 6 moléculas de insulina (1 nmol/kg) en comparación con el perfil de NovoRapid®/NovoLog® (insulina aspart, formulación comercial, 3 zinc por cada 6 moléculas de insulina (1 nmol/kg), y los cambios resultantes en la glucosa plasmática, respectivamente;
Las Figuras 6 y 7 muestran el perfil PK (farmacocinético) (concentraciones de insulina vs. tiempo) de la insulina del Ejemplo 11 formulada con 0 zinc por cada 6 moléculas de insulina (1 nmol/kg), y los cambios resultantes en la glucosa plasmática, respectivamente;
Las Figuras 8 y 9 muestran el perfil PK (farmacocinético) (concentraciones de insulina vs. tiempo) de la insulina del Ejemplo 44 formulada con 0 zinc por cada 6 moléculas de insulina (1 nmol/kg), y los cambios resultantes en la glucosa plasmática, respectivamente (1 nmol/kg);
Las Figuras 10 y 11 muestran el perfil PK (farmacocinético) (concentraciones de insulina vs. tiempo) de una insulina de la técnica anterior, insulina humana A22K(W(eps)-hexadecanedioil-gGlu-2xOEG), B29R, desB30 (documentos WO 2009/022013, Ejemplo 45) formulada con 0 zinc por cada 6 moléculas de insulina (1 nmol/kg), y los cambios resultantes en la glucosa plasmática, respectivamente (1 nmol/kg);
Las Figuras 12 y 13 muestran el perfil PK (farmacocinético) (concentraciones de insulina vs. tiempo) de un análogo del ácido tetradecanodioico representativo de la técnica anterior (documento WO 2009/022013, Ejemplo 45), mostrado en las Figuras 10 y 11, formulado con 0 zinc por cada 6 moléculas de insulina (72 nmol/animal), y los cambios resultantes en la glucosa plasmática, respectivamente;
Las figuras 14A, 14B y 14C muestran gráficos de fluorescencia frente a tiempo, a partir de los cuales el tiempo de retraso puede estimarse como la intersección entre la aproximación lineal de la zona de retraso y la zona de fibrilación; La Figura 15 muestra el perfil PK/PD del derivado de insulina del Ejemplo 2 después de la inyección subcutánea en ratas Zucker obesas en ausencia/presencia de 170 mM de nicotinamida;
Las Figuras 16-17 muestran el perfil PK/PD del derivado de insulina del Ejemplo 7 después de la inyección subcutánea en ratas Zucker obesas en ausencia/presencia de 170 mM de nicotinamida;
Las Figuras 18-19 muestran el perfil PK/PD del derivado de insulina del Ejemplo 7 después de la inyección subcutánea en ratas Zucker obesas en ausencia/presencia de 170 mM de nicotinamida; y
Las Figuras 20-21 muestran el perfil PK/PD del derivado de insulina del Ejemplo 4 después de la inyección subcutánea en ratas Zucker obesas en ausencia/presencia de 170 mM de nicotinamida;
Ejemplos
La invención se ilustra a continuación mediante los siguientes ejemplos.
Purificación y expresión de análogos de insulina
Expresión de análogos de insulina
El análogo de insulina, es decir, los análogos de insulina no acilados de dos cadenas, para su uso de acuerdo con la invención se producen de manera recombinante mediante la expresión de una secuencia de ADN que codifica el análogo de insulina en cuestión en una célula hospedera adecuada mediante técnicas conocidas, por ejemplo, como se describe en el documento US 6500645, El análogo de insulina se expresa directamente o como una molécula precursora, que puede tener una extensión N-terminal en la cadena B y/o un péptido de conexión (péptido C) entre la cadena B y la cadena A. Esta extensión N-terminal y el péptido C se escinden in vitro mediante una proteasa adecuada, por ejemplo, proteasa de Achromobacterlyticus (ALP) o tripsina, y por lo tanto tendrá un sitio de escisión al lado de la posición B1 y A1, respectivamente. Las extensiones N-terminal y los péptidos C del tipo adecuado para su uso de acuerdo con esta invención se describen, por ejemplo, en los documentos US 5395922, EP 765395 y WO 9828429,
La secuencia de polinucleótidos que codifican el precursor del análogo de insulina para usar de acuerdo con la invención se preparan sintéticamente por métodos establecidos, por ejemplo el método de fosforamidita descrito por Beaucage y otros. (1981) Tetrahedron Letters 22 1859-1869, o el método descrito por Matthes y otros. (1984) EMBO Journal 3 801-805, De acuerdo con el método de fosforamidita, los oligonucleótidos se sintetizan, por ejemplo, en un sintetizador automático de ADN, se purifican, se duplican, y se ligan para formar el constructo de ADN sintético. Una manera actualmente preferida de preparar el constructo de ADN es mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
El método recombinante típicamente usará un vector capaz de replicarse en el microorganismo o célula hospedera seleccionados, y que porta una secuencia de polinucleótidos que codifica el precursor análogo de insulina para su uso de acuerdo con la presente invención. El vector recombinante puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido, un elemento extracromosómico, un minicromosoma, o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para asegurar la autorreplicación. Alternativamente, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en una célula hospedera, se integra en el genoma y se replica junto con el(los) cromosoma(s) a los cuales se ha integrado. Además, puede usarse un vector único o plásmido, o dos o más vectores o plásmidos, que juntos contienen el ADN total que se introduce en el genoma de la célula hospedera, o un transposón. El vector puede ser un plásmido lineal o un plásmido circular cerrado, y contendrá preferentemente un(los) elemento(s) que permita(n) la integración estable del vector en el genoma de la célula hospedera o la replicación autónoma del vector en la célula independientemente del genoma.
El vector de expresión recombinante puede ser capaz de replicarse en levadura. Los ejemplos de secuencias que permiten que el vector se replique en levadura son los genes de replicación REP 1-3 del plásmido 2 pm de levadura y el origen de replicación.
Los vectores pueden contener uno o más marcadores de selección que permiten la selección fácil de las células transformadas. Un marcador de selección es un gen cuyo producto proporciona resistencia a biocidas o resistencia viral, resistencia a metales pesados, prototrofías a los auxótrofos, y similares. Ejemplos de marcadores de selección bacterianos son los genes dal del Bacillus subtilis o Bacillus Iicheniformis, o los marcadores que confieren resistencia a antibióticos tales como ampicilina, kanamicina, cloranfenicol o tetraciclina. Los marcadores seleccionables para usar en una célula hospedera fúngica filamentosa incluyen amdS (acetamidasa), argB (ornitina carbamoiltransferasa), pyrG (orotidina-5'-fosfato descarboxilasa) y trpC (antranilato sintasa). Los marcadores adecuados para las células hospederas de levadura son ADE2, HIS3, l Eu 2, LYS2, MET3, TRP1, y URA3. Un marcador de selección muy adecuado para levadura es el gen TPI de Schizosaccharomyces pompe (Russell (1985) Gene 40 125-130).
En el vector, la secuencia de polinucleótido se conecta operativamente a una secuencia promotora adecuada. El promotor puede ser cualquier secuencia de ácido nucleico que muestre actividad transcripcional en la célula hospedero de elección, incluidos promotores mutantes, truncados, e híbridos, y puede obtenerse a partir de genes que codifican polipéptidos extracelulares o intracelulares ya sean homólogos o heterólogos con respecto a la célula hospedero.
Los ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción en una célula hospedadora bacteriana son los promotores obtenidos del operon lac de E. coli, el gen de agarasa (dagA) de Streptomyces coelicolor, gen levansucrase (sacB) de Bacillus subtilis, gen alfa amylasa (amyL) de Bacillus licheniformis, gen de amilasa maltogénica (amyM) de Bacillus stearothermophilus, gen alfa amilasa (amyQ) de Bacillus amyloliquefaciens, y el gen penicillinasa (penP) de Bacillus licheniformis. Los ejemplos de promotores adecuados para la localización de la transcripción en una célula hospedero fúngica filamentosa son promotores obtenidos de los genes TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, neutral alfa-amilasa de Aspergillus niger, y la alfa amilasa ácido-estable de Aspergillus niger. Ejemplos de promotores útiles en células hospederas de levadura son los promotores de Ma1, TPI, ADH, TDH3 o PGK de Saccharomyces cerevisiae.
La secuencia de polinucleótidos que codifica la cadena principal del péptido de insulina para usar de acuerdo con la invención típicamente se conectará operativamente a un terminador adecuado. En levadura, un terminador adecuado es el terminador TPI (Alber y otros. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1419-434).
Los procedimientos que se usan para combinar la secuencia de polinucleótidos que codifica el análogo de insulina para su uso de acuerdo con invención, el promotor y el terminador, respectivamente, y para insertarlos en vectores adecuados que contienen la información necesaria para la replicación en el hospedero seleccionado, son bien conocidos por los expertos en la técnica. Se debe entender que el vector puede construirse ya sea mediante la preparación, primero, de un constructo de ADN que contiene la secuencia de ADN completa que codifica las cadenas principales de insulina para su uso de acuerdo con la invención, y subsecuentemente la inserción de este fragmento en un vector de expresión adecuado, o mediante la inserción secuencial de fragmentos de ADN que contienen información genética para los elementos individuales (tales como la señal y el propéptido (extensión N-terminal de la cadena B), péptido C, cadenas A- y B-), seguido de ligado.
El vector que comprende la secuencia de polinucleótidos de este análogo de insulina para usar de acuerdo con la invención, se introduce en la célula hospedera, de manera que el vector se mantiene como un integrante cromosómico o como un vector extracromosómico autorreplicativo. El término "célula hospedera" abarca cualquier progenie de una célula parental que no es idéntica a la célula parental debido a mutaciones que ocurren durante la replicación. La célula hospedero puede ser un microorganismo unicelular, por ejemplo un procarionte, o un microorganismo no unicelular, por ejemplo un eucarionte. Las células unicelulares útiles son células bacterianas como bacterias gram positivas, incluidas, pero no limitadas a, células de Bacillus, células de Streptomyces, o una bacteria gram negativa como E. coli y Pseudomonas sp. Las células eucariotas pueden ser células de mamíferos, insectos, plantas u hongos.
La célula hospedera puede ser, en particular, una célula de levadura. El organismo de levadura puede ser cualquier organismo de levadura adecuado que, al cultivarse, secrete la cadena principal del péptido de insulina o su precursor al medio de cultivo. Los ejemplos de organismos de levadura adecuados incluyen cepas seleccionadas de Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces kluyveri, Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces uvarum, Kluyveromyces lactis, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia kluyveri, Yarrowia lipolytica, Candida sp., Candida utilis, Candida cacaoi, Geotrichum sp., y Geotrichum fermentans.
La transformación de las células de levadura puede realizarse, por ejemplo, mediante formación de protoplastos seguido por transformación por métodos conocidos. El medio usado para cultivar las células puede ser cualquier medio convencional adecuado para cultivar organismos de levadura.
Purificación de análogos de insulina
Los análogos de insulina o sus precursores que se secretan se recuperan del medio mediante procedimientos convencionales que incluyen la separación de las células de levadura del medio por centrifugación, por filtración o atrapamiento o adsorción del análogo de insulina o su precursor en una matriz de intercambio iónico o en una matriz de absorción de fase reversa, con la precipitación de los componentes protéicos del sobrenadante o por filtración por medio de una sal, por ejemplo sulfato de amonio, seguido de purificación mediante una variedad de procedimientos cromatográficos, por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, etcétera
La purificación y digestión de las cadenas principales de los péptidos de insulina de esta invención se lleva a cabo de la siguiente manera:
El precursor análogo de insulina de cadena simple, que puede contener una extensión N-terminal de la cadena B, y un péptido C modificado entre la cadena B y la cadena A, se purifica y se concentra a partir del sobrenadante del cultivo de levadura mediante intercambio catiónico (Kjeldsen y otros (1998) Prot. Expr. Pur. 14309-316).
El precursor del análogo de insulina de cadena simple se madura en dos cadenas peptídicas de insulina mediante digestión con la proteasa específica de lisina inmovilizada (ALP) (Kristensen y otros. (1997) J. Biol. Chem. 20 12978­ 12983) o mediante el uso de tripsina para escindir la extensión N-terminal de la cadena B, si está presente, y el péptido C.
Digestión con tripsina
El eluato de la etapa de cromatografía de intercambio catiónico que contiene el precursor análogo de insulina se diluye con agua hasta una concentración de etanol de 15-20 %. La glicina se agrega hasta una concentración de 50 mM y el pH se ajusta a 9,0-9,5 con NaOH. La tripsina se agrega en una proporción de 1:300 (p:p) y se permite que ocurra la digestión a 4 grados. La digestión se monitorea mediante análisis cada 20 minutos hasta que se completa la digestión. La digestión termina con adición de ácido cítrico 1 M en una proporción de 3:100 (v:v).
La reacción de digestión se analiza mediante cromatografía líquida analítica (LC) en un sistema Waters Acquity Ultra-Performance Liquid Chromatography mediante el uso de una columna C18 y el peso molecular se confirma por espectrometría de masa MALDI-TOF (MS) (Bruker Daltonics Autoflex II TOF/TOF).
El análogo de insulina de dos cadenas se purifica mediante HPLC de fase reversa (sistema Waters 600) en una columna C18 mediante el uso de un gradiente de acetonitrilo. El análogo de insulina deseado, por ejemplo, insulina humana A22K, desB27, B29R, desB30, o insulina humana A22K, B3E, desB27, B29R, desB30, o insulina humana A22K, B3Q, desB27, B29R, desB30 se recupera mediante liofilización.
La pureza se determina mediante LC analítica en un sistema Waters Acquity Cromatografía Líquida de Alta Resolución mediante el uso de una columna C18, y el peso molecular se confirma por espectrometría de masas MALDI-TOF MS. Abreviaturas
ALP - proteasa de Achromobactor lyticus
Péptido C - péptido conector
HPLC - Cromatografía líquida de alta resolución
IR - receptor de insulina
IGF-1R - Receptor del factor de crecimiento 1 similar a la insulina
LC - cromatografía líquida
MALDI-TOF - Tiempo de vuelo de ionización por desorción láser asistida por matriz
MS - espectrometría de masas
PCR - Reacción en cadena de la polimerasa
PD - farmacodinámica (efecto de reducción de la glucosa en sangre/plasma)
PG - glucosa plasmática
PK - farmacocinética (concentraciones de insulina en sangre/plasma con respecto a perfiles de tiempo) tBu es terc-butilo;
DCM es diclorometano;
DIC es diisopropilcarbodiimida;
DIPEA = DIEA es W,W-Diisopropiletilamina;
DMF es W,W-dimetilformamida;
DMSO es dimetilsulfóxido;
EtOAc es acetato de etilo;
Fmoc es 9-fluorenilmetiloxicarbonilo;
yGlu (gGlu) es gamma L-glutamil;
HCl es ácido clorhídrico;
HOBt es 1-hidroxibenzotriazol;
NMP es W-metil-2-pirrolidona;
MeCN es acetonitrilo;
OEG es [2-(2-aminoetoxi)etoxi]etilcarbonilo;
Su es succinimidil-1-il = 2,5-dioxo-pirrolidin-1-ilo;
OSu es succinimidil-1-iloxi = 2,5-dioxo-pirrolidin-1-iloxi;
RPC es cromatografía de fase reversa;
RT es temperatura ambiente;
TCTU es tetrafluoroborato de O-(6-cloro-benzotriazol-1-il)-W,W,W'W-tetrametiluronio;
TFA es ácido trifluoroacético
THF es tetrahidrofurano
TNBS es ácido 2,4,6-trinitrobencenosulfónico;
TRIS es Tris(hidroximetil)aminometano; y
TSTU es tetrafluoroborato de 0-(W-succinimidil)-1,1,3,3-tetrametiluronio
Observaciones generales
Los siguientes ejemplos y procedimientos generales se refieren a compuestos intermediarios y productos finales identificados en la especificación y en los esquemas de síntesis. La preparación de los compuestos de la presente invención se describe en detalle mediante el uso de los siguientes ejemplos, pero las reacciones químicas descritas se describen en términos de su aplicabilidad general a la preparación de compuestos de la invención.
Ocasionalmente, la reacción puede no ser aplicable como se describe a cada compuesto incluido dentro del alcance descrito de la invención. Los compuestos para los cuales esto ocurre serán fácilmente reconocidos por los expertos en la técnica. En estos casos, las reacciones pueden realizarse satisfactoriamente mediante modificaciones convencionales conocidas por los expertos en la técnica, es decir, mediante la protección adecuada de los grupos interferentes, cambiando a otros reactivos convencionales, o mediante la modificación rutinaria de las condiciones de reacción.
Alternativamente, otras reacciones descritas en la presente descripción o de otra manera convencionales serán aplicables a la preparación de los compuestos correspondientes de la invención. En todos los métodos preparativos, todos los materiales de partida se conocen o pueden prepararse fácilmente a partir de materiales de partida conocidos. Todas las temperaturas se establecen en grados Celsius y, a menos que se indique lo contrario, todas las partes y porcentajes son por peso cuando se refieren a rendimientos y todas las partes son por volumen cuando se refieren a solventes y eluyentes.
Los compuestos de la invención pueden purificarse mediante el empleo de uno o más de los siguientes procedimientos que son típicos dentro de la técnica. Estos procedimientos pueden, si es necesario, modificarse con respecto a gradientes, pH, sales, concentraciones, flujo, columnas, etcétera En dependencia de factores tales como el perfil de impureza, la solubilidad de las insulinas en cuestión, etcétera, estas modificaciones pueden reconocerse fácilmente y hacerse por un experto en la técnica.
Después de HPLC ácida o el desalado, los compuestos se aíslan mediante liofilización de las fracciones puras. Después de HPLC neutra o cromatografía de intercambio aniónico, los compuestos se desalan, se precipitan a pH isoeléctrico o se purifican mediante HPLC ácida.
Procedimientos típicos de purificación
Sistema RP-HPLC:
El sistema Gilson consta de lo siguiente: Manipulador de líquidos Modelo 215, Bomba Modelo 322-H2 y Detector UV Modelo 155 (UV 215 nm y 280 nm).
Sistema de intercambio aniónico y desalado:
El sistema Ákta Explorer consta de lo siguiente: Bomba modelo P-900, detector UV modelo UV-900 (UV 214, 254 y 280 nm), detector de pH y conductividad modelo pH/C-900, colector de fracciones modelo Frac-950,
RP-HPLC ácido:
Columna: Phenomenex Gemini, 5 pM 5 u C18 110 A, 30x250 mm
Flujo: 20 ml/min
Tampón A: TFA al 0,1 % en agua
Tampón B: TFA al 0,1 % en acetonitrilo.
RP-HPLC neutra:
Columna: Phenomenex Gemini, 5 pM 5 u C18 110 A, 30x250 mm
Flujo: 20 ml/min
Tampón A: 10 mM Tris, 15 mM (NH4)2SÜ4, pH = 7,3, 20 % de acetonitrilo en miliQ
Tampón B: 20 % miliQ en acetonitrilo
Cromatografía de intercambio aniónico:
Columna-material: Poros50HQ o Source30Q
Flujo: dependiente de la columna
Tampón A: 15 mM Tris, 25 mM NH4ÜAc, 50 % EtOH, pH = 7,5,
Tampón B: 15 mM Tris, 500 mM NH4OAc, 50 % EtOH, pH = 7,5,
Desalado:
Columna: HiPrep 26/10
Flujo: 20 ml/min
Tampón A: TFA al 0,1 % en agua
Tampón B: TFA al 0,1 % en acetonitrilo
Los reactivos de acilación se sintetizaron en solución (ver a continuación) o en fase sólida como se describe en, por ejemplo, el documento WO 2009/115469,
Procedimiento general para la síntesis en fase sólida de reactivos de acilación
de la Fórmula general III
[Acil]-[Enlazador]-Act
en donde los grupos Acilo y Enlazador son como se definió anteriormente, y Act es el grupo que sale de un éster activo, tal como W-hidroxisuccinimida (OSu), o 1-hidroxibenzotriazol, y
en donde los ácidos carboxílicos dentro de las porciones de Acilo y Enlazador de la porción de acilo se protegen como ésteres de ferc-butilo.
Los compuestos de la Fórmula general III pueden sintetizarse sobre un soporte sólido mediante el uso de procedimientos en la técnica de síntesis de péptidos de fase sólida conocidos por el experto.
Uno de estos procedimientos comprende la unión de un aminoácido protegido con Fmoc a una resina de poliestireno 2-clorotritil cloruro. La unión puede lograrse mediante el uso del aminoácido libre N-protegido en presencia de una amina terciaria, como trietilamina o N,N-diisopropiletilamina (ver referencias a continuación). El extremo C-terminal (que se une a la resina) de este aminoácido está en el extremo de la secuencia sintética que se acopla a las insulinas parentales de la invención.
Después de la unión del aminoácido Fmoc a la resina, el grupo Fmoc se desprotege mediante el uso, por ejemplo, de aminas secundarias, como piperidina o dietilamina, seguido por el acoplamiento de otro aminoácido (o el mismo) protegido por Fmoc y seguido de desprotección. La secuencia sintética se termina mediante el acoplamiento de diácidos grasos protegidos con monoterc-butilo (a, o), como ésteres monoterc-butil del ácido hexadecanodioico, pentadecanedioico o tetradecanoico.
La escisión de los compuestos a partir de la resina se logra mediante el uso de ácido diluido como TFA/DCM al 0,5-5 % (ácido trifluoroacético en diclorometano), ácido acético (por ejemplo, 10 % en DCM, o HOAc/triflouro-etanol/DCM 1:1:8), o hecafluoroisopropanol en DCM (ver por ejemplo F.Z. Dorwald: Organic Synthesis on Solid Phase; Wiley-VCH 2000, ISBN 3-527-29950-5; N. Sewald & H.-D. Jakubke: Peptides: Chemistry and Biology, Wiley-VCH, 2002, ISBN 3­ 527-30405-3; o The Combinatorial Cheemistry Catalog, 1999, Novabiochem AG, y las referencias ahí citadas). Esto asegura que los ésteres de terc-butilo presentes en los compuestos como grupos protectores de ácido carboxílico no estén desprotegidos.
Finalmente, el grupo carboxi C-terminal (liberado de la resina) se activa, por ejemplo, como el éster de N-hidroxisuccinimida (OSu). Este éster activado se desprotege, por ejemplo, mediante el uso de TFA puro, y se usa ya sea directamente o después de la purificación (cristalización) como reactivo de acoplamiento en unión a las insulinas parentales de la invención. Este procedimiento se ilustra a continuación.
Ejemplo que ilustra un procedimiento general para la síntesis de reactivo de acilación en fase sólida:
Síntesis de tetradecanedioil-4xgGlu-OSu (Quím.4)
Figure imgf000026_0001
La resina de 2-clorotritilo con malla de 100-200, 1,5 mmol/g (15,79 g, 23,69 mmol) se dejó hinchar en diclorometano seco (150 ml) durante 20 minutos. Se añadió una solución de Fmoc-Glu-OtBu (6,72 g, 15,79 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (10,46 ml, 60,01 mmol) en diclorometano seco (120 ml) a la resina y la mezcla se agitó durante 16 horas. La resina se filtró y trató con una solución de N,N-diisopropiletilamina (5,5 mL, 31,59 mmol) en una mezcla de metanol/diclorometano (9:1, 150 mL, 5 min). Luego la resina se lavó con N,N-dimetilformamida (2 x 150 ml), diclorometano (2 x 150 ml) y N,N-dimetilformamida (2 x 150 ml).
El grupo Fmoc se eliminó mediante tratamiento con piperidina al 20 % en N,N-dimetilformamida (2 x 150 mL, 1 x 5 min, 1 x 20 min). La resina se lavó con N,N-dimetilformamida (2 x 150 ml), 2-propanol (2 x 150 ml), diclorometano (2 x 150 ml) y N,N-dimetilformamida (2 x 150 ml). Se añadió a la resina una solución de Fmoc-Glu-OtBu (10,08 g, 23,69 mmol), tetrafluoroborato O-(6-cloro-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio (TCTU, 8,42 g, 23,69 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (7,43 mL, 42,64 mmol) en N,N-dimetilformamida (120 ml) y la mezcla se agitó durante 16 horas. La resina se filtró y trató con una solución de N,N-diisopropiletilamina (5,5 mL, 31,59 mmol) en una mezcla de metanol/diclorometano (9:1, 150 mL, 5 min). Luego la resina se lavó con N,N-dimetilformamida (2 x 150 ml), diclorometano (2 x 150 ml) y N,N-dimetilformamida (2 x 150 ml).
El grupo Fmoc se eliminó mediante tratamiento con piperidina al 20 % en N,N-dimetilformamida (2 x 150 mL, 1 x 5 min, 1 x 20 min). La resina se lavó con N,N-dimetilformamida (2 x 150 ml), 2-propanol (2 x 150 ml), diclorometano (2 x 150 ml) y N,N-dimetilformamida (2 x 150 ml). Se añadió a la resina una solución de Fmoc-Glu-OtBu (10,08 g, 23,69 mmol), tetrafluoroborato O-(6-cloro-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio (TCTU, 8,42 g, 23,69 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (7,43 mL, 42,64 mmol) en N,N-dimetilformamida (120 ml) y la mezcla se agitó durante 16 horas. La resina se filtró y trató con una solución de N,N-diisopropiletilamina (5,5 mL, 31,59 mmol) en una mezcla de metanol/diclorometano (9:1, 150 mL, 5 min). Luego la resina se lavó con N,N-dimetilformamida (2 x 150 ml), diclorometano (2 x 150 ml) y N,N-dimetilformamida (2 x 150 ml).
El grupo Fmoc se eliminó mediante tratamiento con piperidina al 20 % en N,N-dimetilformamida (2 x 150 mL, 1 x 5 min, 1 x 20 min). La resina se lavó con N,N-dimetilformamida (2 x 150 ml), 2-propanol (2 x 150 ml), diclorometano (2 x 150 ml) y N,N-dimetilformamida (2 x 150 ml). Se añadió a la resina una solución de Fmoc-Glu-OtBu (10,08 g, 23,69 mmol), tetrafluoroborato O-(6-cloro-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio (TCTU, 8,42 g, 23,69 mmol) y N,N diisopropiletilamina (7,43 mL, 42,64 mmol) en W,W-dimetilformamida (120 ml) y la mezcla se agitó durante 16 horas. La resina se filtró y trató con una solución de W,W-diisopropiletilamina (5,5 mL, 31,59 mmol) en una mezcla de metanol/diclorometano (9:1, 150 mL, 5 min). Luego la resina se lavó con W,W-dimetilformamida (2 x 150 ml), diclorometano (2 x 150 ml) y W,W-dimetilformamida (2 x 150 ml).
El grupo Fmoc se eliminó mediante tratamiento con piperidina al 20 % en W,W-dimetilformamida (2 x 150 mL, 1 x 5 min, 1 x 20 min). La resina se lavó con W,W-dimetilformamida (2 x 150 ml), 2-propanol (2 x 150 ml), diclorometano (2 x 150 ml) y W,W-dimetilformamida (2 x 150 ml). Se añadió a la resina una solución de ácido tetradecanedioico monoterc-butil éster (7,45 g, 23,69 mmol), tetrafluoroborato de O-(6-cloro-benzotriazol-1-il)-W,W,W,W-tetrametiluronio (TCTU, 8,42 g, 23,69 mmol) y W,W-diisopropiletilamina (7,43 ml, 42,64 mmol) en la mezcla de W,W-dimetilformamida (40 ml) y diclorometano (80 ml) y la mezcla se agitó durante 16 horas. La resina se filtró y lavó con diclorometano (2 x 150 ml), W,W-dimetilformamida (2 x 150 ml), metanol (2 x 150 ml) y diclorometano (10 x 150 ml).
El producto se escindió de la resina mediante tratamiento con trifluoroetanol (150 ml) durante una noche. La resina se filtró y lavó con diclorometano (3 x 100 ml). El solvente se eliminó a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna en gel de sílice (elución en gradiente de diclorometano/metanol 100:0 a 95:5) lo que dio el compuesto del título como un sólido blanco.
El producto se secó al vacío para producir ácido (S)-2-((S)-4-ferc-Butoxicarbonil-4-{(S)-4-ferc-butoxicarbonil-4-[(S)-4-ferc-butoxicarbonil-4-(13-ferc-butoxicarbonil-tridecanoilamino)-butirilamino]-butirilamino}-butirilamino)-pentanedioico 1-ferc-butil éster.
Rendimiento: 14,77 g (89 %).
Espectro 1H NMR (300 MHz, CDCla, ÓH): 7,22 (d, J=7,7 Hz, 1 H); 6,97 (d, J=7,9 Hz, 1 H); 6,72 (d, J=7,9 Hz, 1 H); 6,41 (d, J=7,9 Hz, 1 H); 4,59-4,43 (m, 4 H); 2,49-2,13 (m, 16 H); 2,06-1,72 (m, 4 H); 1,70-1,52 (m, 4 H); 1,52-1,38 (m, 45 H); 1,35-1,21 (m, 16 H).
Pureza por LC-MS: 100 % (ELSD).
LC-MS Rt (Sunfire 4,6 mm x 100 mm, acetonitrilo/agua 50:50 a 100:0 FA al 0,1 %): 7,39 min.
LC-MS m/z: 1055,0 (M+H)+.
El tetradecanedioil-4xgGlu-OH ferc-butil protegido obtenido (ácido (S)-2-((S)-4-ferc-Butoxicarbonil-4-{(S)-4-fercbutoxicarbonil-4-[(S)-4-ferc-butoxicarbonil-4-(13-ferc-butoxicarbonil-tridecanoilamino)-butirilamino]-butirilamino}-butirilamino)-pentanedioico 1-ferc-butil éster) fue disuelto en tetrahidrofurano.-butil éster) fue disuelto en tetrahidrofurano. Se añadió DIPEA seguido de TSTU disuelto en acetonitrilo. La mezcla de reacción se agitó durante 3 h y luego se evaporó al vacío, se volvió a disolver en acetato de etilo, se lavó con HCl 0,1 M (aq), se secó sobre MgSO4, se filtró y se evaporó al vacío. LC-MS (electropulverización): m/z = 1174,7 (M+Na+). Cálculo: 1175,4, El compuesto protegido y activado con OSu se disolvió en 10 ml de TFA y se agitó a temperatura ambiente durante la noche. Se añadió éter dietílico y el precipitado formado se filtró y se secó en vacío durante la noche para obtener ácido (S)-2-((S)-4-carboxi-4-{(S)-4-carboxi-4-[(S)-4-carboxi-4-(13-carboxi-tridecanoilamino)-butirilamino]-butirilamino}-butirilamino)-pentanedioico 5-(2,5-dioxo-pirrolidin-1-il) éster (tetradecanedioil-4xgGlu-OSu). LC-MS (electropulverización): m/z = 872,2 (M+H+). Cálculo: 871,9,
Ejemplo que ilustra un procedimiento general para la síntesis de reactivo de acilación en fase sólida:
ácido 13-(ÍS)-1-terc-Butox¡carbon¡l-3-r2-í2-(r2-í2-carbox¡metox¡-etox¡)-et¡lcarbamo¡l1-metox¡}-etoxi)-et¡lcarbamo¡l1-prop¡lcarbamoil}-tr¡decano¡co terc-butil éster
La resina de 2-clorotritilo con malla de 100-200, 1,7 mmol/g (79,8 g, 135,6 mmol) se dejó hinchar en diclorometano seco (450 ml) durante 20 minutos. Se añadió una solución de ácido {2-[2-(9H-fluoren-9-ilmetox¡carbon¡lam¡no)-etox¡]-etoxi}-acético (Fmoc-OEG-OH, 34,9 g, 90,4 mmol) y N,N-di¡soprop¡let¡lam¡na (59,9 mL, 343,6 mmol) en diclorometano seco (100 ml) a la resina y la mezcla se agitó durante 4 horas. La resina se filtró y trató con una solución de N,N-diisopropiletilamina (31,5 mL, 180,8 mmol) en una mezcla de metanol/diclorometano (4:1, 150 mL, 2 x 5 min). Luego la resina se lavó con N,N-dimet¡lformamida (2 x 300 ml), diclorometano (2 x 300 ml) y N,N-dimet¡lformamida (3 x 300 ml). El grupo Fmoc se eliminó mediante tratamiento con piperidina al 20 % en dimetilformamida (1 x 5 min, 1 x 30 min, 1 x 30 min, 2 x 300 ml). La resina se lavó con N,N-dimetilformamida (3 x 300 ml), 2-propanol (2 x 300 ml) y diclorometano (350 ml, 2 x 300 ml).
Se añadió solución de ácido {2-[2-(9H-fluoren-9-¡lmetoxicarbon¡lam¡no)-etox¡]-etox¡}-acét¡co (Fmoc-OEG-OH, 52,3 g, 135.6 mmol), tetrafluoroborato de O-(6-cloro-benzotriazol-1-¡l)-N,N,N',N'-tetramet¡luron¡o (TCTU, 48,2 g, 135,6 mmol) y N,N-diisoprop¡let¡lam¡na (42,5 mL, 244,1 mmol) en N,N-dimetilformamida (250 ml) a la resina y la mezcla se agitó durante 2 horas. Dado que la prueba de ninhidrina seguía siendo positiva, la resina se filtró y se trató con las mismas cantidades de reactivos durante otros 30 minutos. La resina se filtró y se lavó con N,N-dimetilformamida (2 x 300 ml), diclorometano (2 x 300 ml) y N,N-dimetilformamida (3 x 300 ml). El grupo Fmoc se eliminó mediante tratamiento con piperidina al 20 % en dimetilformamida (1 x 5 min, 1 x 30 min, 1 x 30 min, 2 x 300 ml). La resina se lavó con N,N-dimetilformamida (3 x 300 ml), 2-propanol (2 x 300 ml) y diclorometano (350 ml, 2 x 300 ml).
Se añadió solución de ácido (S)-2-(9H-fluoren-9-ilmetox¡carbon¡lamino)-pentanod¡o¡co 1 -terc-butil éster (Fmoc-LGlu-OtBu, 57,7 g, 135,6 mmol), tetrafluoroborato de O-(6-cloro-benzotriazol-1-il)-N,N,N ',N '-tetrametiluronio (t Ct U, 48,2 g, 135.6 mmol) y N,N-di¡sopropilet¡lam¡na (42,5 mL, 244,1 mmol) en N,N-dimetilformamida (250 ml) a la resina y la mezcla se agitó durante 1 hora. La resina se filtró y se lavó con N,N-dimetilformamida (2 x 300 ml), diclorometano (2 x 300 ml) y N,N-dimetilformamida (2 x 300 ml). El grupo Fmoc se eliminó mediante tratamiento con piperidina al 20 % en dimetilformamida (1 x 5 min, 1 x 30 min, 1 x 30 min, 2 x 300 ml). La resina se lavó con N,N-dimetilformamida (3 x 300 ml), 2-propanol (2 x 300 ml) y diclorometano (350 ml, 2 x 300 ml).
Se añadió a la resina una solución de ácido tetradecanedioico mono-terc-butil éster (C14(OtBu)-OH, 42,7 g, 135,6 mmol), tetrafluoroborato de O-(6-cloro-benzotriazol-1-il)-N,N,N ,N '-tetrametiluronio (Tc Tu , 48,2 g, 135,6 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (42,5 mL, 244,1 mmol) en la mezcla diclorometano/N,N-dimet¡lformam¡da (4:1,300 mL) y la mezcla se agitó durante 1,5 horas. La resina se filtró y lavó con N,N-dimetilformamida (6 x 300 ml), diclorometano (4 x 300 ml), metanol (4 x 300 ml) y diclorometano (7 x 600 ml). El producto se escindió de la resina mediante tratamiento con 2,2,2-trifluoroetanol (600 ml) durante 18 horas. La resina se filtró y se lavó con diclorometano (4 x 300 ml), con la mezcla diclorometano/2-propanol (1:1,4 x 300 ml), 2-propanol (2 x 300 ml) y diclorometano (6 x 300 ml). Las soluciones se combinaron; el solvente evaporado y el producto crudo se purificó por cromatografía en columna (Silicagel 60A, 0,060-0,200 mm; eluyente: diclorometano/metanol 1:0-9:1).
Ácido 13-{(S)-1-terc-Butox¡carbon¡l-3-[2-(2-{[2-(2-carbox¡metox¡-etox¡)-et¡lcarbamo¡l]-metoxi}-etox¡)-et¡lcarbamo¡l]-propilcarbamoil}-tr¡decano¡co terc-butil éster puro fue secado con vacío y se obtuvo un aceite naranja.
Rendimiento: 55,2 g (77 %).
RF (S¡O2, diclorometano/metanol 9:1): 0,35,
Espectro 1H NMR (300 MHz, CDCla, ÓH): 7,37 (bs, 1 H); 7,02 (bs, 1 H); 6,53 (d, J=7,9 Hz, 1 H); 4,54-4,38 (m, 1 H); 4,17 (s, 2 H); 4,02 (s, 2 H); 3,82-3,40 (m, 16 H); 2,37-2,12 (m, 7 H); 2,02-1,82 (m, 1 H); 1,71-1,51 (m, 4 H); 1,47 (s, 9 H); 1,43 (s, 9 H); 1,25 (bs, 16 H).
Pureza LC-MS: 100 %.
LC-MS Rt (Sunfire 4,6 mm x 100 mm, acetonitrilo/agua 70:30 a 100:0 FA al 0,1 %): 3,93 min.
LC-MS m/z: 791,0 (M+H)+.
Ácido 13-{(S)-1-terc-butox¡carbon¡l-3-[2-(2-{[2-[2-carbox¡metox¡-etox¡)-et¡lcarbamo¡l]-metoxi}-etox¡)-et¡lcarbamo¡l]-propilcarbamoil}- terc-butil éster (tetradecanedioil-gGlu-2xOEG-OH, 8,89 g, 11,3 mmol)) se disolvió en 100 ml de acetonitrilo, y se añadió a la solución agitada TSTU (4,07 g, 13,5 mmol) y DIPEA (2,35 mL, 13,5 mmol) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente por 1 hora. El solvente se evaporó y el residuo se disolvió en diclorometano y se lavó dos veces con HCl 0,05 M.
La fase orgánica se se secó (MgSO4) y se evaporó al vacío. Esto generó 9,98 g (100 %) de ácido 13-((S)-1-terc-Butox¡carbon¡l-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-d¡oxo-p¡rrol¡d¡n-1-¡lox¡carbon¡lmetoxi)-etox¡]-et¡lcarbamo¡l}-metox¡)-etox¡]-etilcarbamoil}-propilcarbamoil)-tridecanoico terc-butil éster como un aceite.
El ácido 13-((S)-1-terc-butoxicarbonil-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-dioxo-pirrolidin-1-iloxicarbonilmetoxi)-etoxi]-etilcarbamoil}-metoxi)-etoxi]-etilcarbamoil}-propilcarbamoil)-tridecanoico terc-butil éster (4g) fue disuelto en ácido trifluoroacético (10 ml) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente por 1 hora y se evaporó al vacío. El residuo se disolvió en diclorometano (10 ml) y evaporó al vacío. La adición de éter dietílico frío (10 ml) dio lugar a la precipitación de un sólido blanco graso. Esto se aisló por decantación y se se secó al vacío. Esto proporcionó 3,4 g (cuant.) de ácido 14-[[(1S)-1-carboxi-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2,5-dioxopirrolidin-1-il)oxi-2-oxoetoxi]etoxi]etilamino]-2-oxoetoxi]etoxi]etilamino]-4-oxobutil]amino]-14-oxotetradecanoico (tetradecanedioil-gGlu-2xOEG-OSu), que se almacenó a -18 °C.
LC-MS (electropulverización): m/z = 775,33; cálculo: 774,8.
Acilación y purificación de derivados de insulina
Un procedimiento general (A) para la acilación y purificación de los derivados de insulina de la invención se describe en el Ejemplo 1, a continuación. Este procedimiento también se ha aplicado a la síntesis de los compuestos de los Ejemplos 2-25, a continuación. La purificación mediante el uso de otros métodos (como se describió anteriormente) también se ha realizado para algunos de estos derivados.
Ejemplo 1; Procedimiento general (A)
Insulina humana A22K(Meps)-tetradecanedioil-4xgGlu), desB27, B29R, desB30;
Nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC): N{Alfa}([ArgB29],des-ThrB27,ThrB30-Insulina(humana)-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[(4S)-4-carboxi-4-[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]Lys,(B)-péptido.
Figure imgf000029_0001
La insulina humana A22K, desB27, B29R, desB30 (2,0 g) se disolvieron en 40 ml de Na2CO30,1 M (aq), y el pH se ajustó a 11,2 con NaOH 1 M (aq). El tetradecanedioil-4xgGlu-OSu (0,454 g) se disolvió en 2 ml de DMF y se añadió gota a gota a la solución de insulina mientras se mantenía el pH a una constante de 11,2 con NaOH 1 M (aq). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 30 min, luego se neutralizó a pH = 7,5 usando HCl 0,1 M (aq) y se diluyó con agua EtOH/milliQ 1:1,
La insulina resultante se purificó mediante cromatografía de intercambio aniónico en una columna Poros50HQ de 74 ml, eluyendo con acetato de amonio de 25 a 500 mM en Tris 15 mM, etanol 50v/v %, pH 7,5 (ácido acético). La desalación de fracciones puras se realizó en una columna de fase reversa con elución con un gradiente de acetonitrilo en agua miliQ que contenía ácido trifluoroacético al 0,1 %. La insulina pura resultante se liofilizó. LC-MS (electropulverización): m/z = 1629,98 (M+4)/4. Cálculo: 1630,65,
El reactivo de acilación, tetradecanedioil-4xgGlu-OSu, se sintetizó como se describió anteriormente.
Ejemplo 2; Procedimiento general (A)
Insulina humana A22K(Meps)-tetradecanedioil-4xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30;
Nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC): N{Alfa}([GluB3,ArgB29],des-ThrB27,ThrB30-Insulina(humana)-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[(4S)-4-carboxi-4-[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]Lys,(B)-péptido.
Figure imgf000030_0001
Este análogo se preparó de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 1.
LC-MS (electropulverización): m/z = 1633,9 (M+4H+). Cálculo: 1634,4
Ejemplo 3; Procedimiento general (A)
Insulina humana A22K(Meps)-tetradecanedioil-4xgGlu), desB27, B29R, desB30;
Nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC): N{Alfa}([GluA14,ArgB29].des-ThrB27,ThrB30-Insulina(humana)-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[(4S)-4-carboxi-4-[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]Lys,(B)-péptido.
Figure imgf000030_0002
LC-MS (electropulverización): m/z = 1622,2 (M+4)/4. Cálculo: 1622,1
Ejemplo 4; Procedimiento general (A)
Insulina humana A22K(Meps)-hexadecanedioil-4xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30;
Nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC): N{Alfa}([GluB3.ArgB29].des-ThrB27.ThrB30-Insulina(humana)-(A)-peptidil)-N{Épsilon}[(4S)-4-carboxi-4-[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-(15-carboxypentadecanoilamino)butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]Lys,(B)-péptido.
Figure imgf000031_0001
LC-MS (electropulverización): m/z = 1641,2 (M+4H+). Cálculo: 1641,4,
Ejemplo 5; Procedimiento general (A)
Insulina humana A22K(Meps)-hexadecanedio¡l-gGlu-2xOEG), B3E, desB27, B29R, desB30;
Nombre IUPAC (OpenÉye, estilo IUPAC): N{Alfa}([GluB3,ArgB29],des-ThrB27,ThrB30-Insulina(humana)-(A)-peptidil)-N{Épsilon}[2-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(15-carboxipentadecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-amino]etoxi]etoxi]acetil]Lys,(B)-péptido.
Figure imgf000031_0002
LC-MS (electropulverización): m/z = 1616,6 (M+4)/4. Cálculo: 1617,1
Ejemplo 6; Procedimiento general (A)
Insulina humana A22K(Meps)-hexadecanedioil-3x(gGlu-OEG)-gGlu), B3E, desB27, B29R, desB30;
Nombre IUPAC (OpenÉye, estilo IUPAC): N{Alfa}([GluB3,ArgB29],des-ThrB27,ThrB30-Insulina(humana)-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[(4S)-4-carboxi-4-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(15-carboxipentadecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]butanoil]-amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]butanoil]Lys,(B)-péptido.
Figure imgf000032_0001
LC-MS (electropulverización): m/z = 1749,9 (M+4)/4. Cálculo: 1750,3
Ejemplo 7; Procedimiento general (A)
Insulina humana A22K(Meps)-tetradecanedioil-4xgGlu), B3Q, desB27, B29R, desB30;
Nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC): N{Alfa}([GlnB3,ArgB29].des-ThrB27.ThrB30-Insulina(humana)-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[(4S)-4-carboxi-4-[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]Lys,(B)-péptido.
Figure imgf000032_0002
LC-MS (electropulverización): m/z = 1634,2 (M+4)/4. Cálculo: 1633,1
Ejemplo 8; Procedimiento general (A)
Insulina humana A22K(Meps)-hexadecanedioil-gGlu-2xOEG), B3Q, desB27, B29R, desB30;
Nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC): N{Alfa}([GlnB3,ArgB29],des-ThrB27,ThrB30-Insul¡na(humana)-(A)-pept¡d¡l)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(15-carboxipentadecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]-etoxi]etoxi]acetil]Lys,(B)-péptido.
Figure imgf000033_0001
LC-MS (electropulverización): m/z = 1616,6 (M+4)/4. Cálculo: 1615,8.
Ejemplo 9; Procedimiento general (A)
Insulina humana A22K(Meps)-hexadecaned¡o¡l-3x(gGlu-OEG)-gGlu). B3Q, desB27, B29R, desB30;
Nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC): N{Alfa}([GlnB3,ArgB29].des-ThrB27.ThrB30-Insulina(humana)-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[(4S)-4-carboxi-4-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(15-carboxipentadecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]butanoil]-amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]butanoil]Lys,(B)-péptido.
Figure imgf000033_0002
LC-MS (electropulverización): m/z = 1749,8 (M+4)/4. Cálculo: 1748,5
Ejemplo 10; Procedimiento general (A)
Insulina humana A22K(Meps)-tetradecanedioil-2xgGlu), desB27, B29R, desB30;
Nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC): N{Alfa}([ArgB29],des-ThrB27,ThrB30-Insulina(humana)-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[(4S)-4-carboxi-4-[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butanoil]amino]butanoil]Lys,(B)-péptido.
Figure imgf000034_0001
LC-MS (electropulverización): m/z = 1565,6 (M+4)/4. Cálculo: 1566,1
Ejemplo 11; Procedimiento general (A)
Insulina humana A22K(Meps)-hexadecanedioil-4xgGlu), desB27, B29R, desB30;
Nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC): N{Alfa}([ArgB29],des-ThrB27,ThrB30-Insulina(humana)-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[(4S)-4-carboxi-4-[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-(15-carboxypentadecanoilamino)butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]Lys,(B)-péptido.
Figure imgf000034_0002
LC-MS (electropulverización): m/z = 1637,4 (M+4)/4. Cálculo: 1636,6
Ejemplo 12; Procedimiento general (A)
Insulina humana A22K(Meps)-hexadecanedioil-gGlu-2xOEG), desB27, B29R, desB30;
Nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC): N{Alfa}([ArgB29],des-ThrB27,ThrB30-Insulina(humana)-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(15-carboxipentadecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]-etoxi]etoxi]acetil]Lys,(B)-péptido.
Figure imgf000034_0003
LC-MS (electropulverización): m/z = 1613,2 (M+4)/4. Cálculo: 1613,4
Ejemplo 13; Procedimiento general (A)
Insulina humana A22K(Meps)-hexadecanedioil-3x(gGlu-OEG)-gGlu), desB27, B29R, desB30;
Nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC): N{Alfa}([ArgB29],des-ThrB27.ThrB30-Insulina(humana)-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[(4S)-4-carboxi-4-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(15-carboxipentadecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]butanoil]-amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]butanoil]Lys,(B)-péptido.
Figure imgf000035_0001
LC-MS (electropulverización): m/z = 1746,4 (M+4)/4. Cálculo: 1746,5
Ejemplo 14; Procedimiento general (A)
Insulina humana A22K(Meps)-tetradecanedioil-gGlu), desB27, B29R, desB30;
Nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC): N{Alfa}([ArgB29],des-ThrB27,ThrB30-Insulina(humana)-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butanoil]Lys,(B)-péptido.
Figure imgf000035_0002
LC-MS (electropulverización): m/z = 1533,2 (M+4)/4. Cálculo: 1533,8
Ejemplo 15; Procedimiento general (A)
Insulina humana A22K(Meps)-tetradecanedioil-gGlu-2xOEG), B3E, desB27, B29R, desB30;
Nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC): N{Alfa}([GluB3,ArgB29],des-ThrB27,ThrB30-Insul¡na(humana)-(A)-pept¡d¡l)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]-etoxi]etoxi]acetil]Lys,(B)-péptido.
Figure imgf000036_0001
LC-MS (electropulverización): m/z = 1610,7 (M+4)/4. Cálculo: 1610,1
E j e m p l o 1 6 ; P r o c e d i m i e n t o g e n e r a l ( A )
Insulina humana A22K(Meps)-tetradecanedio¡l-gGlu-2xOEG). B3Q, desB27, B29R, desB30;
Nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC): N{Alfa}([GlnB3,ArgB29].des-ThrB27.ThrB30-Insulina(humana)-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]-etoxi]etoxi]acetil]Lys,(B)-péptido.
Figure imgf000036_0002
LC-MS (electropulverización): m/z = 1609,7 (M+4)/4. Cálculo: 1609,9
E j e m p l o 1 7 ; P r o c e d i m i e n t o g e n e r a l ( A )
Insulina humana A22K(Meps)-tetradecanedioil-2xOEG), desB27, B29R, desB30;
Nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC): N{Alfa}([ArgB29],des-ThrB27,ThrB30-Insulina(humana)-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]-etoxi]etoxi]acetil]Lys,(B)-péptido.
Figure imgf000037_0001
LC-MS (electropulverización): m/z = 1606,3 (M+4)/4. Cálculo: 1606,4
Ejemplo 18; Procedimiento general (A)
Insulina humana A22K(Meps)-hexadecanedio¡l-4xgGlu). B3Q, desB27, B29R, desB30;
Nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC): N{Alfa}([GlnB3.ArgB29].des-ThrB27.ThrB30-Insulina(humana)-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-(15-carboxipentadecanoilamino)butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]Lys,(B)-péptido.
Figure imgf000037_0002
LC-MS (electropulverización): m/z = 1640,9 (M+4)/4. Cálculo: 1641,1
Ejemplo 19; Procedimiento general (A)
Insulina humana A22K(Meps)-pentadecanedioil-4xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30;
Nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC): N{Alfa}([GluB3.ArgB29].des-ThrB27.ThrB30-Insulina(humana)-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[(4S)-4-carboxi-4-[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-(14-carboxitetradecanoilamino)butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]Lys,(B)-péptido.
Figure imgf000038_0001
LC-MS (electropulverización): m/z = 1637,63 (M+4)/4. Cálculo: 1636,76
Ejemplo 20; Procedimiento general (A)
Insulina humana A22K(Meps)-tetradecanedio¡l-4xgGlu-2xOEG), desB27, B29R, desB30;
Nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC): N{Alfa}([ArgB29],des-ThrB27,ThrB30-Insulina(humana)-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]-etoxi]acetil]Lys,(B)-péptido.
Figure imgf000038_0002
LC-MS (electropulverización): m/z = 1703,0 (M+4)/4. Cálculo: 1703,2
Ejemplo 21; Procedimiento general (A)
Insulina humana A22K(Meps)-tetradecanedioil-4xgGlu-2xOEG), B3E, desB27, B29R, desB30;
Nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC): N{Alfa}([GluB3,ArgB29],des-ThrB27,ThrB30-Insulina(humana)-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-(13 carboxitridecanoilamino)butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]-etoxi]acetil]Lys,(B)-péptido.
Figure imgf000039_0001
LC-MS (electropulverización): m/z = 1706,6 (M+4)/4. Cálculo: 1707,0
Ejemplo 22; Procedimiento general (A)
Insulina humana A14E, A22K(Meps)-tetradecanedioil-gGlu-2xOEG), B3E, desB27, B29R, desB30;
Nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC): N{Alfa}([GluA14,GluB3,ArgB29],des-ThrB27,ThrB30-Insulina(humana)-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-amino]etoxi]etoxi]acetil]Lys,(B)-péptido.
Figure imgf000039_0002
LC-MS (electropulverización): m/z = 1601,9 (M+4)/4. Cálculo: 1601,6
Ejemplo 23; Procedimiento general (A)
Insulina humana A14E, A22K(Meps)-tetradecanedioil-4xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30;
Nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC): N{Alfa}([GluA14,GluB3,ArgB29],des-ThrB27,ThrB30-Insulina(humana)-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]Lys,(B)-péptido.
Figure imgf000040_0001
LC-MS (electropulverización): m/z = 1625,9 (M+4)/4. Cálculo: 1625,8
Ejemplo 24; Procedimiento general (A)
Insulina humana A22K(Meps)-tetradecanedio¡l-2xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30;
Nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC): N{Alfa}([GluB3,ArgB29],des-ThrB27,ThrB30-Insulina(humana)-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[(4S)-4-carboxi-4-[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butanoil]amino]butanoil]Lys,(B)-péptido.
Figure imgf000040_0002
LC-MS (electropulverización): m/z = 1537,7 (M+4)/4. Cálculo: 1537,5
Ejemplo 25; Procedimiento general (A)
Insulina humana A22K(Meps)-tetradecanedioil-gGlu), B3E, desB27, B29R, desB30;
Nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC): N{Alfa}([GluB3,ArgB29],des-ThrB27,ThrB30-Insulina(humana)-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)-butanoi¡]Lys,(B)-péptido.
Figure imgf000041_0001
LC-MS (electropulverización): m/z = 1537,7 (M+4)/4. Cálculo: 1537,5
Ejemplo 26; Procedimiento general (A)
Insulina humana A22K(W(eps)-tetradecanedioil-3xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30;
Nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC): N{Alfa}([GluB3,ArgB29],des-ThrB27,ThrB30-Insulina(humana)-(A)-peptidil)-N{Epsilon}[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]Lys,(B)-péptido.
Figure imgf000041_0002
Este análogo se preparó de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 1,
Ejemplo 27; Afinidad por el receptor de insulina de derivados de insulina seleccionados de la invención, medido en receptores solubilizados
La afinidad de unión relativa de los análogos de insulina de la invención por el receptor de insulina humana (IR) se determina mediante unión competitiva en un ensayo de proximidad de centelleo (SPA) (de acuerdo con Glendorf T y otros (2008) Biochemistry 474743-4751).
En resumen, series de dilución de un estándar de insulina humana y el análogo de insulina a ensayar se realizó en placas Optiplates de 96 pocillos (Perkin-Elmer Life Sciences) seguido por la adición de [125I-A14Y]-insulina humana, anticuerpo de ratón anti-IR 83-7, IR-A humano solubilizado (semipurificado por cromatografía de aglutinina de germen de trigo de células de riñón de bebé hámster (BHK) que sobreexpresan el holorreceptor IR-A), y perlas de ensayo de proximidad de centelleo (SPA) (perlas de poliviniltolueno SPA anti-ratón, GE Healthcare) en tampón de unión que consiste en HEPES 100 mM (pH 7,8), NaCl 10 mM, MgSO4, 10 mM, y Tween 200,025 % (v/v). Las placas se incuban con agitación suave durante 22-24 h a 22 °C, se centrifugan a 2000 rpm durante 2 minutos y se cuentan en un TopCount NXT (Perkin-Elmer Life Sciences).
Los datos del SPA se analizan de acuerdo con el modelo logístico de cuatro parámetros (Volund A (1978) Biometrics 34 357-365), y las afinidades de unión de los análogos se calculan con relación a la del estándar de insulina humana medida dentro de la misma placa.
Se usa además un ensayo relacionado en donde el tampón de unión contiene HSA al 1,5 % (p/v) (Sigma A1887) para imitar más condiciones fisiológicas.
Las afinidades por los receptores de insulina y otros datos in vitro de análogos de insulina seleccionados de la invención se presentan en la Tabla 1, a continuación.
Ejemplo 28; Afinidades por el receptor de insulina y el receptor del factor de crecim iento-tipo 1 sim ilar a la insulina, de los derivados de insulina seleccionados de la invención, medidas en receptores asociados a la membrana
El IR humano asociado a membrana y el IGF-1R se purifican a partir de células BHK transfectadas de manera estable con el vector pZem219B que contiene el inserto de IR-A, IR-B o IGF-IR humano. Las células BHK se cosechan y homogeneizan en tampón frío (25 mM HEPES pH 7,4, 25 mM de CaCl2 y 1 mM de MgCh, 250 mg/l de bacitracina, 0,1 mM de Pefablock). Los homogeneizados se superponen en un colchón de sacarosa al 41 % (p/v) y se centrifugan durante 75 minutos a 95 000 g a 4 °C. Las membranas plasmáticas se colectan, diluyen 1:5 con tampón (como se indica arriba) y se centrifugan de nuevo durante 45 minutos a 40 000 g a 4 °C. Los gránulos se resuspenden en un volumen mínimo de tampón y se extraen a través de una aguja (tamaño 23) tres veces antes de su almacenamiento a -80 °C hasta su uso.
La afinidad de unión relativa para cualquiera de los IR-A, IR-B o IGF-1 R humano asociados a membranas se determina mediante unión por competencia en una configuración de SPA. Los ensayos IR se realizan por duplicado en placas OptiPlate de 96 pocillos (Perkin-Elmer Life Sciences). La proteína de la membrana se incuba con una agitación suave durante 150 minutos a 25 °C con 50 pM [125I-A14Y] de insulina humana en un volumen total de 200 pL de tampón de ensayo (50 mM HEPES, 150 mM de NaCl, 5 mM de MgSO4, Tritón X-100 al 0,01 %, HSA al 0,1 % (p/v) (Sigma A18874), Inhibidores completos de proteasa (sin EDTA), 50 pg de microesferas PVT recubiertas con aglutinado de germen de trigo (WGA) (GE Healthcare) y concentraciones crecientes de ligando. Los ensayos se terminan mediante centrifugación de la placa a 2000 rpm durante 2 minutos y la radiactividad unida se cuantifica contando con un TopCount NXT (Perkin-Elmer Life Sciences).
Los ensayos de IGF-1R se llevan a cabo esencialmente como para los ensayos de unión a IR excepto que se emplearon IGF-1R asociado a membrana y IGF-1 humano 50 pM [125I-Tyr31]. Los datos del SPA se analizan de acuerdo con el modelo logístico de cuatro parámetros (Volund A (1978) Biometrics 34 357-365), y las afinidades de unión de los análogos se calculan con relación a la del estándar de insulina humana medida dentro de la misma placa.
Los datos de unión a IR (A isoforma) e IGF-1R de análogos de insulina seleccionados de la invención se dan en la Tabla 1, a continuación.
Tabla 1
Figure imgf000043_0001
Ejemplo 29; Equilibrio monómero-dímero analizado por dilución SEC-HPLC
Se realizaron una serie de diluciones con SEC-HPLC (HPLC de exclusión por tamaño) para evaluar el equilibrio monómero-dímero de insulina que no contiene zinc. Al inyectar un volumen variable (2,5-80 pl) de 0,6 mM del análogo de insulina para probarse en una columna Superose 12 10/300 GL, y eluyendo con NaCl 140 mM, Tris 10 mM pH 7,7 con una velocidad de flujo de 0,8 ml/min, la muestra se diluye prácticamente de manera proporcional al volumen de inyección. Con base en el cambio en el tiempo de retención como función de la dilución, se calcularon dos parámetros: aumento del peso molecular (aumento Mw) y pendiente R.
La pendiente R se derivó como la pendiente de un gráfico de tiempo de retención frente a log(volumen de inyección), mientras que el aumento de Mw se calculó mediante un conjunto de muestras de referencia como el aumento de peso molecular aparente entre el volumen de inyección más bajo y el más alto. Ambos parámetros reflejan la tendencia del análogo de insulina a disociarse en respuesta a la dilución y, por lo tanto, el potencial para obtener una disociación rápida a los monómeros tras la inyección sc.
Los resultados de estas determinaciones y los de los análogos de insulina de la técnica anterior se presentan en las Tablas 2-4, a continuación.
Tabla 2
Figure imgf000044_0003
Tabla 3
Figure imgf000044_0001
Los números de ejemplo dados son análogos acilados A22K sin deleción del residuo B27Thr (desB27) conocidos y descritos en la técnica anterior (por ejemplo, el documento WO 2009/022013).
Tabla 4
Figure imgf000044_0002
Los números de ejemplo dados son análogos acilados A22K sin deleción del residuo B27Thr (desB27) conocidos y descritos en la técnica anterior (por ejemplo, el documento WO 2007/096431).
Conclusión
Puede concluirse que las insulinas aciladas A22K de la invención, que son análogos desB27, son mucho más propensas a disociarse en respuesta a la dilución, y por lo tanto son mucho más utilizables para la administración de bolos prandiales que análogos acilados A22K similares (sin deleción del residuo B27Thr) de la técnica anterior. Además, puede concluirse que las insulinas de la invención en este ensayo se asemejan a la insulina aspart (comercialmente disponible como NovoRapid® o NovoLog® (Novo Nordisk A/S), usada como insulina prandial) más que la insulina humana (también usada como insulina prandial, pero con un perfil de acción más lento que el de la insulina aspart) que subraya las propiedades mejoradas de los derivados de la invención con relación a los de la técnica anterior.
Los análogos de la invención tienen todos una pendiente-R menos negativa -0,13 a -0,02 (Tabla 2) que por lo tanto se parece a la insulina aspart (pendiente de R -0,04; véase la Tabla 3) mucho más que la insulina humana (pendiente-R -0,65; ver la Tabla 3). Al contrario, todos los análogos similares analizados de la técnica anterior tienen una pendiente R similar a la de la insulina humana (-0,52 a -0,78; Tablas 3 y 4). En consecuencia, todos los análogos de la invención mostraron menos aumento de Mw que los de la técnica anterior (hasta 10,7 % frente a 53-83 %, respectivamente (ver Tablas 2, 3 y 4).
Estos datos indican que los compuestos de la invención son más monoméricos que los análogos similares de la técnica anterior. Con respecto a esto, los compuestos de la invención se asemejan a la insulina aspart, mientras que los análogos similares de la técnica anterior se asemejan a la insulina humana.
Ejemplo 30; Autoasociación medida mediante dispersión de rayos X de ángulo pequeño (SAXS)
Se utilizaron los datos de SAXS para calcular el estado de autoasociación de los análogos de insulina que se probarán después de la inyección subcutánea. Los datos de SAXS se recogieron de formulaciones que no contienen Zn que contenían 0,6 mM de análogo de insulina a analizar y 140 mM de NaCl a pH 7,4, Para cada análogo, las cantidades relativas de monómero, dímero y especies más grandes se calcularon utilizando el hecho de que un perfil de dispersión SAXS tiene una contribución de intensidad de todos los componentes individuales en una mezcla multicomponente. Mediante el uso de intensidades (factores de forma) de cada componente, es posible estimar la contribución de la fracción de volumen de cada componente de la mezcla. Se utiliza un sistema de ecuaciones lineales que utiliza el algoritmo de mínimos cuadrados no negativos o sin restricciones para minimizar la discrepancia entre las curvas de dispersión experimentales y calculadas. Los factores de forma se calculan a partir de estructuras cristalinas de un monómero, dímero, hexámero, etcétera. Las fracciones de volumen se expresan en porcentajes (%).
El peso molecular medio se aproxima utilizando una muestra de referencia con concentración conocida y suponiendo que la relación de las masas moleculares es idéntica a la relación de la intensidad dispersa en ángulo cero, I(0), normalizada con respecto a las concentraciones medidas.
Los resultados obtenidos de los derivados de la invención y de los derivados de la técnica anterior se muestran en las Tablas 5, 6 y 7, a continuación.
Tabla 5
Figure imgf000045_0001
Tabla 6
Figure imgf000046_0001
Tabla 7
Figure imgf000046_0002
Con estos estudios puede concluirse que los derivados de la invención, en condiciones que imitan las condiciones en el tejido subcutáneo después de la inyección, son mucho más propensos a disociarse en monómeros y por lo tanto se absorberán mucho más rápidamente después de la inyección subcutánea que los análogos de la técnica anterior. El contenido monomérico varía de 63-83 % para los análogos de la invención, frente a 0-48 % para los análogos de la técnica anterior. Puede concluirse además que para los análogos de la técnica anterior, las especies moleculares más grandes observadas son tanto de mayor tamaño (Rg y Dmáx) como también encontradas en cantidades mayores (42-62% frente a 1-22% para los análogos de la invención). Esto subraya la utilidad de los análogos para el uso prandial en comparación con los análogos de la técnica anterior.
Ejemplo 31; Preparación de preparaciones farmacéuticas
Las preparaciones farmacéuticas de la presente invención pueden formularse como una solución acuosa. El medio acuoso se hace isotónico, por ejemplo, con cloruro de sodio o glicerol. Además, el medio acuoso puede contener tampones y conservantes. El valor de pH de la preparación se ajusta al valor deseado y puede estar entre aproximadamente 3 a aproximadamente 8,5, entre aproximadamente 3 y aproximadamente 5, o aproximadamente 6,5, o aproximadamente 7,4, o aproximadamente 7,5, en dependencia del punto isoeléctrico, pI, del análogo de insulina en cuestión.
Preparación de formulaciones de insulina que no contiene zinc
Los análogos de insulina que no contiene zinc se disolvieron en solución acuosa, que en la formulación final contenía al análogo de insulina 0,6 mM, 16 mM de m-cresol, 16 mM de fenol, 7 mM de fosfato disódico, cantidades apropiadas de nicotinamida y glicerol, y el pH se ajustó a 7,3-7,5 (medido a temperatura ambiente) mediante el uso de ácido clorhídrico 1 N/NaOH 1 N. El agua se añadió al volumen final y la solución se filtró estérilmente a través de un filtro de 0,2 pm. La formulación se llenó en viales de 2 ml y se selló con tapones de cierre.
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Ejemplo 32; Ensayos de fibrilación con ThT para la evaluación de la estabilidad física de las formulaciones de proteínas
La estabilidad física baja de un péptido puede conducir a la formación de fibrillas amiloides, que se observan como estructuras macromoleculares similares a hilo en la muestra, bien ordenadas, que eventualmente resultan en la formación de gel. La tioflavina T (ThT) tiene una firma de fluorescencia distinta cuando se une a las fibrillas [Naiki y otros (1989) Anal. Biochem. 177, 244-249; LeVine (1999) Methods. Enzymol. 309, 274-284].
La formación de un intermediario parcialmente plegado del péptido se sugiere como un mecanismo de iniciación general para la fibrilación. Algunos de esos intermediarios se nuclean para formar una plantilla sobre la cual los intermediarios posteriores pueden ensamblarse y se procede a la fibrilación. El tiempo de retraso corresponde al intervalo en el cual se construye la masa crítica de núcleos y la velocidad constante aparente es la velocidad con la que se forma la propia fibrilla (Figura 1).
Preparación de la muestra
Las muestras se prepararon poco antes de cada ensayo. Las muestras de cada composición se mezclaron con una solución acuosa de ThT (0,1 mM ThT) en una relación volumétrica de 990:10 y se transfirieron a una placa de microtitulación de 96 pocillos (Packard Opti-PlateTM-96, poliestireno blanco). Usualmente, se colocaron cuatro u ocho réplicas de cada muestra (que corresponden a una condición de prueba) en una columna de pocillos. La placa se selló con Scotch 15 Pad (Qiagen).
Incubación y medición de fluorescencia
La incubación a una temperatura dada, la agitación y la medición de la emisión de fluorescencia de ThT se realizó en un lector de placas de fluorescencia Fluoroskan Ascent FL o un lector de placas Varioskan (Thermo Labsystems). La temperatura se ajustó a 37 °C. La agitación orbital se ajustó a 960 rpm con una amplitud de 1 mm en todos los datos presentados. La medición de la fluorescencia se realizó mediante el uso de excitación a través de un filtro de 444 nm y la medición de la emisión a través de un filtro de 485 nm. Cada serie se inició incubando la placa a la temperatura del ensayo durante 10 minutos. La placa se midió cada 20 minutos durante un máximo de 45 horas. Entre cada medición, la placa se agitó y se calentó como se describió.
Manejo de los datos
Los gráficos de fluorescencia frente a tiempo se generaron en Microsoft Excel y el tiempo de retraso se estimó como la intersección entre la aproximación lineal de la zona de retraso y la zona de fibrilación como se ilustra en las figuras 14A, 14B y 14C (ilustraciones 1A, 1B y 1C, respectivamente). Un aumento del tiempo de retraso corresponde a una mayor estabilidad física. Los puntos de datos fueron típicamente un promedio de cuatro u ocho muestras.
Los resultados obtenidos para los análogos acilados de A22K en el caso de la invención, y de análogos acilados de A22K similares de la técnica anterior sin deleción del residuo de B27Thr (desB27), se muestran en la Tabla 8, a continuación.
Tabla 8
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Se concluye que los análogos de insulina acilados A22K de la invención muestran una estabilidad mejor o similar hacia la fibrilación (es decir, tienen una estabilidad física aumentada) en la formulación sin zinc tanto con nicotinamida como sin nicotinamida añadida que análogos similares de la técnica anterior. Esto es muy sorprendente ya que los datos de dilución de SAXS y SEC-HPLC indican que los análogos de insulina de la invención son de menor tamaño (es decir, compuestos de monómeros y dímeros) que el experto en la materia esperaría que condujera a una menor estabilidad física.
Ejemplo 33; Análisis de la estabilidad química de la insulina
Cromatografía de exclusión por tamaño
Formulaciones utilizadas: Véase el ejemplo 31
La determinación cuantitativa de proteína de alto peso molecular (HMWP) y análogo de insulina monómero se realizó en la columna Waters Acquity BEH200 SEC (150 x 2,4 mm, núm. de pieza 186005225) con un eluyente que contenía acetonitrilo al 55 % (v/v), TFA al 0,05 % a una velocidad de flujo de 0,2 ml/min y una temperatura de columna de 40 °C. La detección se realizó con un detector de absorbancia ajustable (Waters Acquity TUV) a 215 nm. El volumen de inyección fue de 1,5 pl tanto de las formulaciones de análogos de insulina de 600 pM como de un patrón de insulina humana de 600 pM. Cada preparación análoga se incubó a 5, 25 y 37 °C en viales de 2 ml. En momentos definidos, se midieron el HMWP y el contenido de las preparaciones. Los resultados se muestran en la Tabla 5, a continuación.
Se concluye que la formación de proteínas de alto peso molecular (HMWP) mediante almacenamiento en la formulación sin zinc a 37 °C es mucho menor para los derivados de insulina de la invención (formación de hasta 6,8 % HMWP después de 8 semanas de almacenamiento para las insulinas de la invención de los Ejemplos 2, 4 y 7, respectivamente), mientras que un derivado de insulina similar de la técnica anterior resulta en la formación de 29,1 % HMWP). Además, se concluye que los derivados de insulina de la invención forman bajos niveles de HMWP en formulación sin zinc y en presencia de nicotinamida cuando se almacenan a 37 °C.
Cromatografía de fase reversa (UPLC)
La determinación de las impurezas relacionadas con la insulina se realizó en un sistema UPLC mediante el uso de una columna Phenomenex Kinetex C18, tamaño de 2,1 x 150 mm, tamaño de partícula de 1,7 pm, y tamaño de poro de 100 A (Núm. de pieza de Phenomenex 00F-4475-AN), con una velocidadde flujo de 0,3 ml/min a 50 °C y con detección UV a 215 nm. La elución se realizó con una fase móvil que consistía en lo siguiente: A: 10 % (v/v) de acetonitrilo, 0,09 M de fosfato de hidrógeno di-amonio, pH 3,6, y B: 80 % (v/v) de acetonitrilo. Gradiente: cambio lineal de 0-7 min del 15 % B al 26 % B, cambio lineal de 7-34 min a 40 % B, cambio lineal de 34-36 min a 80 % B para lavado de columna, antes de volver a las condiciones iniciales a 39 min 15 % B. La cantidad de impurezas se determinó como área de absorbancia medida en por ciento del área de absorbancia total determinada después de la elución de los conservadores. Cada preparación análoga se incubó a 5, 25 y 37 °C en viales de 2 ml. En momentos definidos se midieron las impurezas relacionadas con la insulina de las preparaciones. Los resultados se muestran en la Tabla 10, a continuación.
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Se concluye que los derivados de insulina de la invención son mucho más estables en la formulación que no contiene zinc que un análogo acilado de A22K similar de la técnica anterior. Los análogos de la técnica anterior son tan inestables que menos del 5 % (correspondiente a una pérdida de pureza de 84 % de puntos) del derivado está intacto después de 8 semanas de almacenamiento a 37 °C. Los análogos de insulina de la invención (representados por los compuestos de los Ejemplos 2, 4 y 7) tienen menos de 7,7, 5,5 y 15 % de pérdida de pureza, respectivamente, después de 8 semanas de almacenamiento a 37 °C. Además, se concluye que los derivados de insulina de la invención son estables en la formulación que no contiene zinc con nicotinamida añadida.
Ejemplo 34; Perfiles PK/PD subcutáneos en cerdos LYD
Los derivados de insulina de la invención pueden probarse mediante administración subcutánea a cerdos, por ejemplo, comparando con insulina aspart (NovoRapid) en la formulación comercial o comparando con análogos de insulina acilada A22K similares de la técnica anterior de acuerdo con este protocolo. Los derivados pueden analizarse para determinar los parámetros farmacocinéticos y/o farmacodinámicos.
Métodos generales usados
Ecografía y marcado de la zona de inyección
Durante la anestesia para la colocación de catéteres intravenosos permanentes, los cerdos se examinan mediante ecografía con el modelo de escáner ecográfico Esaote "MyLabFive" y una sonda lineal "LA435 6-18 MHz". El cuello medio entre la oreja y la escápula, en el lado derecho o izquierdo (opuesto al catéter), una zona de 2 x 2 cm sin músculo subyacente (apta para inyección subcutánea) se identifica y se marca con un tatuaje.
Calendario de alimentación
Los cerdos ayunan (no desayunan) antes del experimento.
Los cerdos están en sus corrales normales durante todo el experimento y no están anestesiados. Los cerdos ayunan hasta que se haya recogido la muestra de sangre a las 12 horas, pero con libre acceso al agua. Después de la muestra de sangre de 12 horas, los cerdos reciben alimentos y manzanas.
Dosificación
El Penfill se monta en un NovoPen®4, Se utiliza una aguja nueva para cada cerdo. Se utiliza un tapón de aguja para asegurar la penetración s.c. máxima a 5 mm por debajo de la epidermis. El volumen de dosis (volumen de u I) se calcula y se anota para cada cerdo.
Volumen de dosis (U) = ((Peso x dosis nmol/kg) / concentración nmol/ml) x 100 U/ml
El cerdo se dosifica en la parte subcutánea lateralmente en el lado derecho o izquierdo (opuesto al catéter) del cuello y la aguja se mantiene en la parte subcutánea durante un mínimo de 10 segundos después de la inyección para asegurar la deposición del compuesto.
Tratamiento de la hipoglucemia
Después de la administración subcutánea de la dosis, la solución de glucosa debe estar lista para la inyección i.v. para prevenir la hipoglucemia, es decir, 4-5 jeringas (20 ml) se llenan con glucosa estéril al 20 %, lista para usar. El diagnóstico de la hipoglucemia se basa en los síntomas clínicos y en las mediciones de la glucosa en sangre en un glucómetro (medidor Glucocard X).
El tratamiento consiste en una inyección intravenosa lenta de 50-100 ml de glucosa al 20 % (10-20 g de glucosa). La glucosa se administra en fracciones a lo largo de 5-10 minutos hasta el efecto.
Muestra de sangre
La permeabilidad de los catéteres yugulares se comprueba antes del experimento con NaCl estéril al 0,9 % sin añadir 10 IU/ml de heparina.
Antes y después de la administración de la dosis, se extraerán muestras de sangre en el establo de un catéter venoso central a los siguientes puntos temporales:
Predosis (-10, 0), 3, 6, 9, 12, 15, 20, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 180, 240, 300, 360, 420, 480, 540, 600 y 720 minutos. Las muestras se toman con una llave de paso de 3 vías. Se extraen y desechan 4-5 ml de sangre residual antes de tomar la muestra.
Las muestras de sangre de 0,8 ml se recogen en tubos recubiertos con EDTA para análisis de glucosa e insulina. Después de cada muestra de sangre, el catéter se purgó con 5 ml como mínimo de NaCl al 0,9 % estéril y 10 IU/ml de heparina.
El tubo se inclina suavemente un mínimo de 10 veces para garantizar una mezcla suficiente de sangre y anticoagulante (EDTA) y después de un minuto se coloca en hielo húmedo. Los tubos se centrifugan durante 10 min a 3000 rpm y 4 °C en el plazo de 1 hora después de la obtención de las muestras. Las muestras se almacenan en hielo húmedo hasta el pipeteo.
Se requiere una técnica aséptica para evitar el crecimiento bacteriano en el catéter con mayor riesgo de coagulación. Cierre de los catéteres después del experimento
Si no se ha realizado la extracción de muestras de sangre utilizando una técnica aséptica, se puede administrar lentamente un único tratamiento intravenoso con 1 ml por cada 10 kg de Pentrexyl® (1 g de ampicilina disuelta en 10 ml de NaCl al 0,9 %) a través del catéter que se ha usado para la extracción de muestras de sangre. Después de este tratamiento, el catéter se lava con 10 ml de NaCl al 0,9 %.
Los catéteres se lavan con 5 ml de NaCl estéril al 0,9 % con heparina (10 IU/ml). Los catéteres se cierran con un nuevo conector luer-lock con membrana de inyección de látex y se inyectan 1,0 ml de TauroLockHep500 a través de la membrana como bloqueo del catéter.
Análisis de muestras de sangre
Glucosa plasmática: 10 ul de plasma se pipetean en 500 ul de solución tampón para medir la concentración de glucosa en plasma en el analizador automático BIOSEN.
Insulina plasmática: 1 x 50 pl de plasma se pipetean en tubos Micronic® de 0,65 ml (configuración ELISA/LOCI/SPA) para su análisis, utilizando ELISA o LC-MS.
El plasma se conserva congelado a -20 °C.
Ejemplo 35; Perfil PK/PD subcutáneo del derivado de insulina del Ejemplo 1 en cerdos LYD
Después del procedimiento general anterior, se obtuvieron los siguientes perfiles de PK y PD para el derivado de insulina del Ejemplo 1.
Formulaciones utilizadas
Derivado de insulina del Ejemplo 1, pH=7,4; 609 pM; 1,6 % (p/vol) de glicerol; 30 mM de fenol (0 Zn/hexámero). Insulina aspart, formulación comercial, 600 pM; 1,6 % (p/vol) de glicerol; fosfato 7 mM; cloruro de sodio 10 mM; acetato de zinc 300 pM; fenol 16 mM; cresol 16 mM.
Los resultados de estas determinaciones se presentan en las Figuras 1-4 adjuntas y en la Tabla 11, a continuación. Tabla 11
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b T12 tomado como media armónica±pseudoSD
c Biodisponibilidad calculada en función de los datos i.v. (no mostrados)
Conclusión
Se concluye que el derivado de insulina del Ejemplo 1 en una formulación que no contiene zinc tiene un perfil PK/PD muy similar a la formulación comercial de insulina aspart (NovoRapid®). Además, el tiempo de retención medio de este derivado de insulina fue de 165 minutos. Puede concluirse que el derivado de insulina del Ejemplo 1 es útil como una insulina de acción rápida (prandial).
Ejemplo 36; Perfil PK/PD subcutáneo del derivado de insulina del Ejemplo 2 en cerdos LYD
Después del procedimiento general anterior, se obtuvieron los siguientes perfiles de PK y PD para el derivado de insulina del Ejemplo 2,
Formulaciones utilizadas
Derivado de insulina del Ejemplo 2, pH=7,367; 607 pM; 1,6 % (p/vol) de glicerol; 30 mM de fenol (0 Zn/hexamero). Insulina aspart, formulación comercial, 600 pM; 1,6 % (p/vol) de glicerol; fosfato 7 mM; cloruro de sodio 10 mM; acetato de zinc 300 pM; fenol 16 mM; m-cresol 16 mM.
Los resultados de estas determinaciones se presentan en las Fig. 4-5 adjuntas y en la Tabla 12, a continuación. Tabla 12
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Conclusión
Se concluye que el derivado de insulina del Ejemplo 2 en una formulación sin zinc tiene un perfil PK/PD muy similar a la insulina aspart. Además, el tiempo de retención promedio de este derivado de insulina fue de 111 minutos, no significativamente diferente al de NovoRapid® (insulina aspart). Puede concluirse que el derivado de insulina del Ejemplo 2 es útil como una insulina de acción rápida (prandial).
Ejemplo 37; Perfil PK/PD subcutáneo del derivado de insulina del Ejemplo 11 en cerdos LYD
Después del procedimiento general anterior, se obtuvieron los siguientes perfiles de PK y PD para el derivado de insulina del Ejemplo 11.
Formulaciones utilizadas
Derivado de insulina del Ejemplo 11, pH=7,44; 689 pM; 1,6 % (p/vol) de glicerol; 30 mM de fenol (0 Zn/hexamero). Los resultados de estas determinaciones se presentan en las Fig. 6-7 adjuntas y en la Tabla 13, a continuación.
Las Figuras 6 y 7 muestran el perfil PK (farmacocinético) (concentraciones de insulina vs. tiempo) de la insulina del Ejemplo 11 formulado con 0 zinc por cada 6 moléculas de insulina (1 nmol/kg), y los cambios resultantes en la glucosa plasmática, respectivamente; 1 nmol/kg
Tabla 13
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Se concluye que el derivado de insulina del Ejemplo 11 en una formulación sin zinc tiene un perfil PK adecuado para su uso como insulina prandial. Además, el tiempo de retención medio de este derivado de insulina fue 334 minutos, significativamente más corto que el perfil obtenido para el derivado similar de insulina que contiene (también) ácido 1,16-hexadecanedioico de la técnica anterior, insulina humana A22K(W(eps)-hexadecanedioil-gGlu-2xOEG), B29R, desB30 (Documento WO 2009/022013, Ejemplo 45, (MRT = 1287 minutos), ver más adelante). Puede concluirse que el derivado de insulina del Ejemplo 11 es útil como una insulina de acción rápida (prandial).
Ejemplo 38; Perfil PK/PD subcutáneo del derivado de insulina del Ejemplo 4 en cerdos LYD
Después del procedimiento general anterior, se obtuvieron los siguientes perfiles de PK y PD para el derivado de insulina del Ejemplo 4,
Formulación utilizada
Derivado de insulina del Ejemplo 4, pH=7,43; 621 pM; 1,8 % (p/vol) de glicerol; 16 mM de fenol, 16 mM m-cresol, 10 mM de cloruro de sodio (0 Zn/hexamero).
Los resultados de estas determinaciones se presentan en las Figuras 8-9 adjuntas y en la Tabla 14, a continuación.
Tabla 14
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Se concluye que el derivado de insulina del Ejemplo 4 en una formulación sin zinc tiene un perfil PK adecuado para su uso como insulina prandial. Además, el tiempo de retención medio de este derivado de insulina fue 160 minutos, significativamente más corto que el perfil obtenido para el derivado similar de insulina que contiene ácido 1,16-hexadecanedioico de la técnica anterior, insulina humana A22K(N(eps)-hexadecanedioil-gGlu-2xOEG), B29R, desB30 (Documento WO 2009/022013, Ejemplo 45, (MRT = 1287 minutos), ver más adelante.) Puede concluirse que el derivado de insulina del Ejemplo 4 es útil como una insulina de acción rápida (prandial).
Ejemplo 39; Perfil PK/p D subcutáneo del derivado de insulina de la técnica anterior en cerdos LYD Después del procedimiento general anterior, los siguientes perfiles de PK y PD se obtuvieron para el derivado de insulina de la técnica anterior, insulina humana A22K(W(eps)-hexadecanedioil-gGlu-2xOEG), B29R, desB30 (Documento WO 2009/022013, Ejemplo 45).
Formulaciones utilizadas
El compuesto del Documento WO 2009/022013, Ejemplo 45, 588 pM; 1,6 % (p/vol) de glicerol; 30 mM de fenol; 7 mM de tris, pH=7,4 (0 Zn/hexámero), 1 nmol/kg.
Los resultados de estas determinaciones se presentan en las Figuras 10 y 11 adjuntas y en la Tabla 15, a continuación.
Las Figuras 10 y 11 muestran respectivamente el perfil PK (farmacocinético) (concentraciones de insulina vs. tiempo) de un derivado de insulina de la técnica anterior, es decir, insulina humana A22K(W(eps)-hexadecanedioil-gGlu-2xOEG), B29R, desB30 (Documento WO 2009/022013, Ejemplo 45), formulado con 0 moléculas de zinc por cada 6 moléculas de insulina (1/mol/kg), y los cambios resultantes en la glucosa plasmática, respectivamente (1 nmol/kg).
Tabla 15
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Se concluye que el derivado de insulina de la técnica anterior, el documento WO 2009/022013, Ejemplo 45, en una formulación sin zinc se asocia con una cola prolongada, que posiblemente se origina a partir de una absorción retardada de una parte del depósito subcutáneo. La concentración plasmática de esta insulina en el punto temporal de 24 horas (1440 minutos) es de 98 pM. Además, el efecto de reducción de la glucosa en sangre se prolonga para durar al menos 8 horas (480 minutos). El tiempo medio de residencia fue de 1287 minutos, casi 1 día. Esto hace que esta insulina de la técnica anterior sea inadecuada para el uso prandial.
Ejemplo 40; Perfil PK/PD subcutáneo de un análogo cercano de un derivado insulina de la técnica anterior en cerdos LYD
Después del procedimiento general anterior, los siguientes perfiles de PK y PD se obtuvieron para el análogo diácido C14 de insulina humana A22K(W(eps)-tetradecanedioil-gGlu-2xOEG), b29R, desB30, representativa de la técnica anterior como se describió en el documento WO 2009/022013 (ver en particular el Ejemplo 45 (insulina humana A22K(W(eps)-hexadecanedioil-gGlu-2xOEG), B29R, desB30)).
Formulaciones utilizadas
Insulina humana A22K(W(eps)-tetradecanedioil-gGlu-2xOEG), B29R, desB30 (el análogo de 1,14-tetradecanedioil (C14 diácido) del análogo de 1,16-hexadecanedioil (C16 diácido) del documento WO 2009/022013, Ejemplo 45), 588 pM; 1,6 % (w/vol) de glicerol, 30 mM de fenol, 7 mM de tris, pH = 7,4 (0 Zn/hexámero).
Los resultados de estas determinaciones se presentan en la Figura 9 adjunta y en la Tabla 16, a continuación.
Las Figuras 12 y 13 muestran respectivamente el perfil PK (farmacocinético) (concentraciones de insulina vs. tiempo) de un derivado de insulina de la técnica anterior, es decir, insulina humana A22K(W(eps)-hexadecanedioil-gGlu-2xOEG), B29R, desB30 (Documento WO 2009/022013, Ejemplo 45), formulado con 0 moléculas de zinc por cada 6 moléculas de insulina (1/mol/kg), y los cambios resultantes en la glucosa plasmática, respectivamente (72 nmol/animal).
Tabla 16
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Conclusión
Se concluye que el derivado de insulina C14 diacídico de la técnica anterior, documento WO 2009/022013, Ejemplo 45, en una formulación que no contiene zinc se asocia con un retraso prolongado, que posiblemente se origina a partir de una absorción retardada de una parte del depósito subcutáneo. La concentración plasmática de esta insulina en el punto temporal de 10 horas (600 minutos) es de 24 pM. El tiempo de retención medio (MRT) de este análogo diácido C14 de la técnica anterior se encontró que era de 271 minutos. Los resultados correspondientes obtenidos con los análogos diácido C14 de los Ejemplos 1 y 2 de la presente invención fueron 165 y 111 minutos, respectivamente. Además, el efecto de reducción de la glucosa en sangre se prolonga para durar al menos 11 horas (660 minutos). Esto hace que esta insulina de la técnica anterior sea inadecuada para el uso prandial.
Ejemplo 41; Perfil PK/PD subcutáneo del derivado de insulina del Ejemplo 2 en ratas Zucker obesas, comparación de perfiles con y sin 170 mM de nicotinamida en la formulación
Después del procedimiento general anterior, se obtuvieron los siguientes perfiles de PK y PD para el derivado de insulina del Ejemplo 2,
Formulación utilizada
Derivado de insulina del Ejemplo 2, pH=7,43; 621 pM; 1,8 % (p/vol) de glicerol; 16 mM de fenol, 16 mM m-cresol, 10 mM de cloruro de sodio (0 Zn/hexámero), con y sin 170 mM de nicotiamida.
Las ratas recibieron una dosis de 40 nmol/kg
Los resultados de estas determinaciones se presentan en la Figura 15 adjunta.
Se concluye que la inclusión de 170 mM de nicotinamida en la formulación sin zinc de la insulina del Ejemplo 2, dosificada por vía subcutánea a ratas Zucker, resulta en un perfil PK que es incluso de acción más rápida, con un Tmáx más temprano. Por lo tanto, se muestra que la inclusión de nicotinamida en la formulación de insulina del Ejemplo 2 de la invención resulta en una formulación de insulina que es aún más adecuada para el uso prandial.
Ejemplo 42; Perfil PK/PD subcutáneo del derivado de insulina del Ejemplo 7 en ratas Zucker obesas, comparación de perfiles con y sin 170 mM de nicotinamida en la formulación
Después del procedimiento general anterior, se obtuvieron los siguientes perfiles de PK y PD para el derivado de insulina del Ejemplo 7.
Formulaciones utilizadas:
Derivado de insulina del Ejemplo 7, pH=7,39; 604 |jM; 1,6 % (p/vol) de glicerol; 16 mM de fenol, 16 mM m-cresol, 7 mM de fosfato de sodio, 10 mM de cloruro de sodio (0 Zn/hexámero), 170 mM de nicotiamida.
Derivado de insulina del Ejemplo 7, pH=7,39; 599 j M; 1,6 % (p/vol) de glicerol; 16 mM de fenol, 16 mM m-cresol, 7 mM de fosfato de sodio, 10 mM de cloruro de sodio (0 Zn/hexámero).
Las ratas recibieron una dosis de 40 nmol/kg
Los resultados de estas determinaciones se presentan en las Figuras 16 y 17 adjuntas.
Se concluye que la inclusión de 170 mM de nicotinamida en la formulación sin zinc de la insulina del Ejemplo 7, dosificada por vía subcutánea a ratas Zucker, resulta en un perfil PK que es incluso de acción más rápida, con un Tmáx más temprano. Por lo tanto, se muestra que la inclusión de nicotinamida en la formulación de insulina del Ejemplo 7 de la invención resulta en una formulación de insulina que es aún más adecuada para el uso prandial.
Ejemplo 43; Perfil PK/PD subcutáneo del derivado de insulina del Ejemplo 16 en ratas Zucker obesas, comparación de perfiles con y sin 170 mM de nicotinamida en la formulación
Después del procedimiento general anterior, se obtuvieron los siguientes perfiles de PK y PD para el derivado de insulina del Ejemplo 16.
Formulaciones utilizadas
Derivado de insulina del Ejemplo 16, pH=7,44; 599 j M; 1,6 % (p/vol) de glicerol; 16 mM de fenol, 16 mM m-cresol, 7 mM de fosfato de sodio, 10 mM de cloruro de sodio (0 Zn/hexámero), 170 mM de nicotiamida.
Derivado de insulina del Ejemplo 16, pH = 7,40; 581 j M; 1,6 % (p/vol) de glicerol; 16 mM de fenol, 16 mM m-cresol, 7 mM de fosfato de sodio, 10 mM de cloruro de sodio (0 Zn/hexámero).
Las ratas recibieron una dosis de 40 nmol/kg
Los resultados de estas determinaciones se presentan en las Figuras 18 y 19 adjuntas.
Se concluye que la inclusión de 170 mM de nicotinamida en la formulación sin zinc de la insulina del Ejemplo 16, dosificada por vía subcutánea a ratas Zucker, resulta en un perfil PK que es incluso de acción más rápida, con un Tmáx más temprano. Por lo tanto, se muestra que la inclusión de nicotinamida en la formulación de insulina del Ejemplo 16 de la invención resulta en una formulación de insulina que es aún más adecuada para el uso prandial.
Ejemplo 44; Perfil PK/PD subcutáneo del derivado de insulina del Ejemplo 4 en cerdos LYD, comparación de perfiles con y sin 170 pM de nicotinamida en la formulación
Después del procedimiento general anterior, se obtuvieron los siguientes perfiles de PK y PD para el derivado de insulina del Ejemplo 4.
Formulación utilizada
Derivado de insulina del Ejemplo 4, pH = 7,42; 0,604 mM; 16 mM de fenol; 16 mM m-cresol; 2 % (p/vol) glicerol; 7 mM de fosfato (0 Zn/hexámero).
Derivado de insulina del Ejemplo 4, pH = 7,43; 0,605 mM; 170 mM de nicotiamida; 16 mM de fenol; 16 mM m-cresol; 0,6 % (p/vol) glicerol; 7 mM de fosfato.
Los cerdos recibieron una dosis de 1 nmol/kg.
Los resultados de estas determinaciones se presentan en la Figura 20 adjunta.
Se concluye que la inclusión de 170 pM de nicotinamida en la formulación que no contiene zinc de la insulina del Ejemplo 4, dosificada por vía subcutánea a cerdos, resulta en un perfil PK que es incluso de acción más rápida, con un Tmáx anterior. Por lo tanto, se muestra que la inclusión de nicotinamida en la formulación de insulina del Ejemplo 4 de la invención resulta en una formulación de insulina que es aún más adecuada para el uso prandial.
Ejemplo 45; Perfil PK/PD subcutáneo del derivado de insulina del Ejemplo 2 en cerdos LYD, comparación de perfiles con y sin 170 pM de nicotinamida en la formulación
Después del procedimiento general anterior, se obtuvieron los siguientes perfiles de PK y PD para el derivado de insulina del Ejemplo 2.
Formulación utilizada
Derivado de insulina del Ejemplo 2, pH=7,4; 608 pM; 2 % (p/vol) de glicerol; 16 mM de fenol, 16 mM m-cresol, 7 mM de fosfato de sodio (0 Zn/hexámero).
Derivado de insulina del Ejemplo 2, pH=7,4; 614 pM; 170 pM de nicotiamida, 0,6 % (p/vol) de glicerol; 16 mM de fenol, 16 mM m-cresol, 7 mM de fosfato de sodio (0 Zn/hexámero).
Los cerdos recibieron una dosis de 1 nmol/kg.
Los resultados de estas determinaciones se presentan en la Figura 21 adjunta.
Se concluye que la inclusión de 170 pM de nicotinamida en la formulación que no contiene zinc de la insulina del Ejemplo 2, dosificada por vía subcutánea a cerdos, resulta en un perfil PK que es incluso de acción más rápida, con un Tmáx anterior. Por lo tanto, se muestra que la inclusión de nicotinamida en la formulación de insulina del Ejemplo 2 de la invención resulta en una formulación de insulina que es aún más adecuada para el uso prandial.

Claims (25)

  1. REIVINDICACIONES
    I. Un derivado de insulina, cuyo derivado de insulina es un análogo acilado de insulina humana, cuyo análogo es [A22K, desB27, B29R, desB30] con relación a la insulina humana;
    y cuyo análogo de insulina se derivatiza por acilación del grupo épsilon amino del residuo de lisina en la posición A22 con un grupo de Fórmula II
    [Acil]-[Enlazador]-en donde el grupo enlazador es una cadena de aminoácidos compuesta de 1 a 10 residuos de aminoácidos seleccionados de -gGlu- y -OEG-; en donde
    gGlu representa un residuo de ácido gamma glutámico;
    OEG representa el residuo de ácido 8-amino-3,6-dioxaoctanoico (es decir, un grupo de la fórmula -NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-);
    cuyos residuos de aminoácidos pueden estar presentes en cualquier orden; y
    cuya cadena de aminoácidos comprende al menos un residuo de gGlu; y
    en donde el grupo acilo es un residuo de un ácido a,u>-dicarboxílico seleccionado de
    ácido 1,14-tetradecanedioico;
    ácido 1,15-pentadecanedioico; y
    ácido 1,16-hexadecanedioico;
    cuyo análogo acilado, puede comprender además las sustituciones A14E y/o B3E, o B3Q.
  2. 2 El derivado de insulina de acuerdo con la reivindicación 1, cuyo análogo acilado comprende adicionalmente la sustitución de B3E o B3Q.
  3. 3. El derivado de insulina de acuerdo con la reivindicación 1, cuyo análogo acilado comprende adicionalmente la sustitución A14E.
  4. 4 El derivado de insulina de acuerdo con la reivindicación 1, cuyo análogo acilado comprende adicionalmente las sustituciones A14E y B3E.
  5. 5. El derivado de insulina de acuerdo con la reivindicación 1, cuyo análogo acilado comprende adicionalmente la sustitución de B3E.
  6. 6. El derivado de insulina de acuerdo con la reivindicación 1, cuyo análogo acilado comprende adicionalmente la sustitución B3Q.
  7. 7. El derivado de insulina de acuerdo con la reivindicación 1, cuyo análogo es [A14E, A22K, B3E, desB27, B29R, desB30]; [A14E, A22K, desB27, B29R, desB30]; [A22K, B3E, desB27, B29R, desB30]; [A22K, B3Q, desB27, B29R, desB30]; o [A22K, desB27, B29R, desB30], desB30]; con relación a la insulina humana; y cuyo análogo está acilado en el grupo épsilon amino del residuo de lisina en la posición A22.
  8. 8. El derivado de insulina de acuerdo con la reivindicación 7, cuyo análogo es [A14E, A22K, desB27, B29R, desB30]; [A22K, B3E, desB27, B29R, desB30]; [A22K, B3Q, desB27, B29R, desB30]; o [A22K, desB27, B29R, desB30]; con relación a la insulina humana; y cuyo análogo está acilado en el grupo épsilon amino del residuo de lisina en la posición A22.
  9. 9. El derivado de insulina de acuerdo con la reivindicación 7, cuyo análogo es [A22K, B3E, desB27, B29R, desB30]; con relación a la insulina humana; y cuyo análogo está acilado en el grupo épsilon amino del residuo de lisina en la posición A22.
  10. 10. El derivado de insulina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde el grupo enlazador se selecciona de -gGlu-; -2xgGlu-; -3xgGlu-; -4xgGlu-; -gGlu-2xOEG-; -gGlu-3x(OEG-gGlu)-; -4xgGlu-2xOEG-; -2xOEG-; y -2xOEG-gGlu-.
  11. I I . El derivado de insulina de acuerdo con la reivindicación 10, en donde el grupo enlazador se selecciona de -gGlu-; -2xgGlu-; -4xgGlu-; -gGlu-2xOEG-; -gGlu-3x(OEG-gGlu)-; -2xOEG-; y -2xOEG-gGlu-.
  12. 12. El derivado de insulina de acuerdo con la reivindicación 10, en donde el grupo enlazador es -4xgGlu-.
  13. 13. El derivado de insulina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en donde el grupo Acilo es un grupo diácido derivado del ácido 1,14-tetradecanedioico; ácido 1,15-pentadecanedioico; o ácido 1,16-hexadecanedioico.
  14. 14 El derivado de insulina de acuerdo con la reivindicación 13, en donde el grupo acilo es un ácido 1,14-tetradecanedioico.
  15. 15. El derivado de insulina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en donde el grupo de Fórmula II (es decir, [Acil]-[Enlazador]-) es tetradecanedioil-gGlu-; tetradecanedioil-2xgGlu-; tetradecanedioil-3xgGlu-; tetradecanedioil-4xgGlu-; tetradecanedioil-gGlu-2xOEG-; tetradecanedioil-4xgGlu-2xOEG-; tetradecanedioil-2xOEG-; pentadecanedioil-4xgGlu-; hexadecanedioil-4xgGlu-; hexadecanedioil-gGlu-2xOEG-; o hexadecanedioil-3x(gGlu-OEG)-gGlu-.
  16. 16. El derivado de insulina de acuerdo con la reivindicación 15, en donde el grupo de Fórmula II (es decir, [Acil]-[Enlazador]-) es tetradecanedioil-4xgGlu-.
  17. 17. El derivado de insulina de acuerdo con la reivindicación 1, que es
    insulina humana A22K(W(eps)-tetradecanedioil-4xgGlu), desB27, B29R, desB30;
    insulina humana A22K(w(eps)-tetradecanedioil-4xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30;
    insulina humana A14E, A22K(w(eps)-tetradecanedioil-4xgGlu), desB27, B29R, desB30;
    insulina humana A22K(W(eps)-hexadecanedioil-4xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30;
    insulina humana A22K(w(eps)-hexadecanedioil-gGlu-2xOEG), B3E, desB27, B29R, desB30;
    insulina humana A22K(w(eps)-hexadecanedioil-3x(gGlu-OEG)-gGlu), B3E, desB27, B29R, desB30; insulina humana A22K(w(eps)-tetradecanedioil-4xgGlu), B3Q, desB27, B29R, desB30;
    insulina humana A22K(w(eps)-hexadecanedioil-gGlu-2xOEG), B3Q, desB27, B29R, desB30;
    insulina humana A22K(w(eps)-hexadecanedioil-3x(gGlu-OEG)-gGlu), B3Q, desB27, B29R, desB30; insulina humana A22K(w(eps)-tetradecanedioil-2xgGlu), desB27, B29R, desB30;
    insulina humana A22K(w(eps)-hexadecanedioil-4xgGlu), desB27, B29R, desB30;
    insulina humana A22K(w(eps)-hexadecanedioil-gGlu-2xOEG), desB27, B29R, desB30;
    insulina humana A22K(w(eps)-hexadecanedioil-3x(gGlu-OEG)-gGlu), desB27, B29R, desB30;
    insulina humana A22K(w(eps)-tetradecanedioil-gGlu), desB27, B29R, desB30;
    insulina humana A22K(w(eps)-tetradecanedioil-gGlu-2xOEG), B3E, desB27, B29R, desB30;
    insulina humana A22K(w(eps)-tetradecanedioil-gGlu-2xOEG), B3Q, desB27, B29R, desB30;
    insulina humana A22K(w(eps)-tetradecanedioil-2xOEG), desB27, B29R, desB30;
    insulina humana A22K(w(eps)-hexadecanedioil-4xgGlu), B3Q, desB27, B29R, desB30;
    insulina humana A22K(w(eps)-pentadecanedioil-4xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30;
    insulina humana A22K(w(eps)-tetradecanedioil-4xgGlu-2xOEG), desB27, B29R, desB30;
    insulina humana A22K(w(eps)-tetradecanedioil-4xgGlu-2xOEG), B3E, desB27, B29R, desB30;
    insulina humana A14E, A22K(w(eps)-tetradecanedioil-gGlu-2xOEG), B3E, desB27, B29R, desB30; insulina humana A14E, A22K(w(eps)-tetradecanedioil-4xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30;
    insulina humana A22K(W(eps)-tetradecanedioil-2xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30;
    insulina humana A22K(w(eps)-tetradecanedioil-2xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30; o
    insulina humana A22K(w(eps)-tetradecanedioil-3xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30,
  18. 18. El derivado de insulina de acuerdo con la reivindicación 1, que es insulina humana A22K(W(eps)-tetradecanedioil-4xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30,
  19. 19. Una composición farmacéutica que comprende un derivado de insulina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-18, y uno o más excipientes o diluentes farmacéuticamente aceptables.
  20. 20. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 19, formulada como una composición baja en zinc, sin iones de zinc añadidos.
  21. 21. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 19, formulada como una composición baja en zinc, sin iones de zinc añadidos, y que comprende un análogo acilado de insulina humana seleccionado de: insulina humana A22K(W(eps)-tetradecanedioil-4xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30;
    insulina humana A22K(w(eps)-hexadecanedioil-4xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30;
    insulina humana A22K(w(eps)-hexadecanedioil-gGlu-2xOEG), B3E, desB27, B29R, desB30;
    insulina humana A22K(w(eps)-hexadecanedioil-3x(gGlu-OEG)-gGlu), B3E, desB27, B29R, desB30; insulina humana A22K(w(eps)-tetradecanedioil-gGlu-2xOEG), B3E, desB27, B29R, desB30;
    insulina humana A22K(w(eps)-pentadecanedioil-4xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30;
    insulina humana A22K(w(eps)-tetradecanedioil-4xgGlu), B3Q, desB27, B29R, desB30;
    insulina humana A22K(w(eps)-hexadecanedioil-gGlu-2xOEG), B3Q, desB27, B29R, desB30;
    insulina humana A22K(w(eps)-hexadecanedioil-3x(gGlu-OEG)-gGlu), B3Q, desB27, B29R, desB30; insulina humana A22K(w(eps)-tetradecanedioil-gGlu-2xOEG), B3Q, desB27, B29R, desB30;
    insulina humana A22K(w(eps)-hexadecanedioil-4xgGlu), B3Q, desB27, B29R, desB30;
    insulina humana A22K(w(eps)-tetradecanedioil-4xgGlu-2xOEG), desB27, B29R, desB30;
    insulina humana A22K(w(eps)-tetradecanedioil-4xgGlu-2xOEG), B3E, desB27, B29R, desB30;
    insulina humana A14E, A22K(w(eps)-tetradecanedioil-gGlu-2xOEG), B3E, desB27, B29R, desB30; insulina humana A14E, A22K(w(eps)-tetradecanedioil-4xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30;
    insulina humana A22K(W(eps)-tetradecanedioil-2xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30;
    insulina humana A22K(w(eps)-tetradecanedioil-gGlu), B3E, desB27, B29R, desB30; y
    insulina humana A22K(w(eps)-tetradecanedioil-3xgGlu), B3E, desB27, B29R, desB30,
  22. 22. La composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 20-21, formulada como una composición baja en zinc, que comprende menos de 0,2 iones de Zn2+ por cada 6 moléculas de insulina.
  23. 23. La composición farmacéutica baja en zinc de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 20-21, en donde no se ha añadido surfactante.
  24. 24. La composición farmacéutica baja en zinc de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 20-21, que comprende un compuesto nicotínico, y en particular nicotinamida.
  25. 25. Un derivado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-18, para su uso como un medicamento. 26 El uso de un derivado de insulina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-18, para usar en el tratamiento o la prevención de la diabetes, diabetes tipo 1, diabetes tipo 2, alteración de la tolerancia a la glucosa, hiperglucemia, dislipidemia, obesidad, síndrome metabólico (síndrome metabólico X, síndrome de resistencia a la insulina) hipertensión, trastornos cognitivos, aterosclerosis, infarto del miocardio, derrame cerebral, trastornos cardiovasculares, enfermedad coronaria, síndrome inflamatorio intestinal, dispepsia o úlceras gástricas.
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