KR20240013778A - 신규한 아실화된 인슐린 유사체 - Google Patents
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Abstract
본원은 신규한 아실화된 인슐린 유사체를 제공하며, 구체적으로는 상기 아실화된 인슐린 유사체를 제조하는데 사용될 수 있는 측쇄 화합물, 아실화된 인슐린 유사체 및 이의 약학 조성물, 약학적 용도, 투여 방법 및 제조 방법을 제공한다. 아실화된 인슐린 유사체는 당뇨병 치료에 사용될 수 있다. 이는 주간 제제(weekly preparation) 또는 지속형 인슐린 제제로서의 효과가 있으며, 주 1회 또는 그 미만의 빈도로 치료에 사용할 수 있어 당뇨병 환자의 순응도를 높일 수 있다.
Description
본 발명은 바이오약학 분야에 관한 것이다. 특히, 이는 신규한 아실화된 인슐린 유사체에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 이는 아실화된 인슐린 유사체를 제조하는데 사용될 수 있는 측쇄 화합물, 아실화된 인슐린 유사체, 이의 약학 조성물, 약학적 용도, 투여 방법 및 제조 방법에 관한 것이다.
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2021년 5월 24일에 중국 특허청에 출원된 중국 특허 출원 번호 202110570030.6의 우선권 및 이익을 주장하며, 이는 그 전체 내용이 본원에 참고로 인용된다.
I형 및 II형 당뇨병 모두의 치료는 소위 강력한 인슐린 요법에 점점 더 의존하고 있다. 이 요법 하에, 환자는, 기초 인슐린 요구량을 충족하기 위해 하루 1 또는 2회 지속형(long-acting) 인슐린 주사를 사용함을 포함하는, 매일 여러 번 인슐린 주사로 치료되고, 식사-관련 인슐린 요구량을 충족하기 위해 다량의 속효성(fast-acting) 인슐린으로 보충된다.
많은 당뇨병 환자들은 매일, 매주, 매월, 매년 2-4회씩 등 인슐린 주사가 필요하다. 환자의 순응도(compliance)가 좋지 않고, 장기간 피하 주사를 하면 피부가 어느 정도 손상을 받고, 매일 대량 주사를 할 때의 불편함은 지속형 인슐린 유사체를 사용하면 줄일 수 있으므로, 적어도 주 1회 주사할 수 있는 인슐린 유사체에 대한 필요성이 존재한다.
CN105636979는 새로운 인슐린 유사체의 유도체를 개시하지만, 그의 작용 시간은 여전히 이상적이지 않으며, 주 1회 또는 그보다 더 적은 빈도로 투여되는 기본 인슐린 제제가 여전히 시급히 필요하다.
본 발명의 목적은 종래 기술의 하나 이상의 단점을 극복 또는 개선하거나 유용한 대안을 제공하는 것이다.
본 발명의 제1 측면에서, 하기 화학식 (I)에 나타낸 구조를 갖는 신규한 측쇄 화합물이 본원에 제공된다:
W-X-Y-Z-R (I)
상기 식에서,
W는 10 내지 20개의 탄소 원자를 갖는 지방산 또는 지방 이산이고, 상기 구조는 -CO(CH2)nCOOH이고, n은 10 내지 20의 정수이고;
X는 카복실산기를 함유하는 디아미노 화합물이고, 이때 상기 카복실산기를 연결하는 탄소 원자는 키랄 탄소 또는 비키랄(achiral) 탄소일 수 있고, X는 하기 화학식 (a1), (a2) 또는 (a3)에 나타낸 구조를 갖고:
[상기 식에서, s는 2 내지 20의 정수이고, 일부 실시양태에서, s는 2 내지 10이고, 다른 실시양태에서, s는 2 내지 8이고, 또 다른 실시양태에서, s는 4임],
X의 아미노기 중 하나는 W의 아실기 중 하나와 연결되어 아미드 결합을 형성하고;
Y는 -A(CH2)mB-이고, 이때 m은 1 내지 10의 정수이고, 일부 실시양태에서, m은 1 내지 6의 정수이고, 일부 실시양태에서, m은 2이고, A 및 B는 부재하거나 -CO-이고;
Z는 -(OEG)p이고, p는 1 내지 3의 정수이고, 일부 실시양태에서, p는 2이고, 상기 OEG 구조는 이고; 또는 n은 또한 4 내지 30의 정수일 수도 있다.
R은 이탈기이고, 일부 실시양태에서, R은 활성화된 에스테르기이고;
W, X, Y 및 Z 사이의 연결기는 아미드 펩티드 결합 또는 펩티드 결합이다.
또한, 본 발명의 측쇄 화합물은 하기 구조식을 가질 수 있다:
상기 식에서,
n은 14 내지 20의 정수이고, s는 2 내지 4의 정수이고, m은 1 내지 4의 정수이고, p는 2이고,
R은 하기 기로부터 선택된다:
.
본 발명의 일부 실시양태에서, n은 14 내지 20의 정수이고, s는 2 내지 4의 정수이고, m은 2이고, p는 2이고,
R은 이다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 측쇄 화합물은 하기 구조식을 갖는다:
상기 식에서, n은 16-18의 정수이고,
R은 이다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 본 발명의 측쇄 화합물은 하기 화합물 중 어느 하나로부터 선택된다:
상기 식에서,
R은 이다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 측쇄 화합물은 하기 구조식 중 어느 하나를 갖는다:
상기 식에서,
R은 이다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 측쇄 화합물은 하기 구조식 중 어느 하나를 갖는다:
상기 식에서,
R은 이다.
본 발명의 제2 측면에서, 본 발명의 측쇄 화합물과 인간 인슐린 유사체(analog) 사이의 아실화 반응에 의해 수득되는 신규한 아실화된 인슐린 유사체가 제공되며, 그 구조는 하기 화학식 (II)에 도시된다:
W-X-Y-Z-M (II)
상기 식에서,
W는 10 내지 20개의 탄소 원자를 갖는 지방산 또는 지방 이산이고, 상기 구조는 -CO(CH2)nCOOH이고, n은 10 내지 20의 정수이고;
X는 카복실산기를 함유하는 디아미노 화합물이고, 이때 상기 카복실산기를 연결하는 탄소 원자는 키랄 탄소 또는 비키랄 탄소일 수 있고, X는 하기 화학식 (a1), (a2) 또는 (a3)에 나타낸 구조를 갖고:
[상기 식에서, s는 2 내지 20이고, 일부 실시양태에서, s는 2 내지 10이고, 다른 실시양태에서, s는 2 내지 8의 정수임],
X의 아미노기 중 하나는 W의 아실기 중 하나와 연결되어 아미드 결합을 형성하고;
Y는 -A(CH2)mB-이고, 이때 m은 1 내지 10의 정수이고, 일부 실시양태에서, m은 바람직하게는 1 내지 6의 정수이고, A 및 B는 부재하거나 -CO-이고;
Z는 -(OEG)p이고, p는 1 내지 3의 정수이고, 일부 실시양태에서, p는 2이고, 상기 OEG 구조는 이고; 다른 실시양태에서, p는 4 내지 30의 정수일 수 있다.
W, X, Y 및 Z 사이의 연결기는 아미드(펩티드) 결합이고;
M은 인간 인슐린 유사체이다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 아실화된 인슐린 유사체는 하기 구조의 측쇄 화합물을 갖는다:
상기 식에서,
n은 14 내지 20의 정수이고, s는 2 내지 8의 정수이고, m은 1 내지 6의 정수의 정수이고, p는 1 내지 3의 정수이다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 아실화된 인슐린 유사체는 하기 구조의 측쇄 화합물을 갖는다:
상기 식에서,
n은 14 내지 20의 정수이고, s는 2 내지 8의 정수이고, m은 1 내지 6의 정수이고, p는 1 내지 3의 정수이다.
본 발명의 아실화된 인슐린 유사체는 본 발명의 측쇄 화합물과 인간 인슐린 유사체의 아실화 반응에 의해 수득되며, 이때 상기 인간 인슐린 유사체는 A쇄 및 B쇄를 갖고, 상기 A쇄의 아미노산 서열은 서열 번호 1에 표시된 것이고, 상기 B쇄의 아미노산 서열은 서열 번호 2 또는 서열 번호 3에 표시된 것이고, 상기 인간 인슐린 유사체는 B29 위치의 라이신 잔기의 ε 질소를 통해 아미드 결합으로 상기 측쇄 화합물과 연결된다.
A쇄: GIVEQCCTSICSLEQLENYCN (서열 번호 1)
B쇄: FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYTPK (서열 번호 NO.2)
B쇄: FVNQHLCGSHLVEALHLVCGERGFHYTPK (서열 번호 NO.3)
본 발명의 일부 실시양태에서, 본 발명의 아실화된 인슐린 유사체는 하기 구조를 갖는다:
A14E, B16E, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)nCO-NHC(COOH)(CH2)SCH2NH-CO(CH2)mCO-(OEG)p), desB30 인간 인슐린 유사체, 또는
A14E, B16H, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)nCO-NHC(COOH)(CH2)SCH2NH-CO(CH2)mCO-(OEG)p), desB30 인간 인슐린 유사체
상기 구조에서,
n은 14 내지 20의 정수이고, s는 2 내지 8의 정수이고, m은 1 내지 6의 정수이고, p는 2이고; -NHC(COOH)(CH2)SCH2NH-에서 카복실기를 연결하는 C 원자는 D 형태, L 형태 또는 라세미 형태일 수 있다는 점에 유의해야 한다.
본 발명의 일부 실시양태에서, n은 14 내지 18의 정수이고, s는 3 내지 4의 정수이고, m은 2 내지 4의 정수이고, p는 2이다.
또한, 본 발명의 아실화된 인슐린 유사체는 하기 화합물 중 어느 하나로부터 선택된다:
A14E, B16E, B25H, 29K(N(ε)-COOH(CH2)18CO-Lys-CO(CH2)2CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체,
A14E, B16E, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)18CO-L-Lys-CO(CH2)2CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체,
A14E, B16E, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)18CO-D-Lys-CO(CH2)2CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체,
A14E, B16E, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)16CO-Lys-CO(CH2)2CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체,
A14E, B16E, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)16CO-D-Lys-CO(CH2)2CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체,
A14E, B16E, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)16CO-L-Lys-CO(CH2)2CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체,
A14E, B16E, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)14CO-Lys-CO(CH2)2CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체,
A14E, B16E, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)14CO-D-Lys-CO(CH2)2CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체,
A14E, B16E, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)14CO-L-Lys-CO(CH2)2CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체,
A14E, B16E, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)18CO-L-Dab-CO(CH2)2CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체,
A14E, B16E, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)16CO-L-Dab-CO(CH2)2CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체,
A14E, B16E, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)14CO-L-Dab-CO(CH2)2CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체,
A14E, B16E, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)18CO-L-Lys-CO(CH2)3CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체,
A14E, B16E, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)16CO-L-Lys-CO(CH2)3CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체,
A14E, B16E, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)18CO-L-Dab-CO(CH2)3CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체,
A14E, B16E, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)18CO-L-Lys-CO(CH2)4CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체,
A14E, B16E, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)18CO-L-Dab-CO(CH2)4CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체,
A14E, B16E, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)16CO-L-Dab-CO(CH2)4CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체,
A14E, B16H, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)18CO-Lys-CO(CH2)2CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체,
A14E, B16H, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)18CO-L-Lys-CO(CH2)2CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체,
A14E, B16H, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)18CO-D-Lys-CO(CH2)2CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체,
A14E, B16H, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)16CO-Lys-CO(CH2)2CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체,
A14E, B16H, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)16CO-D-Lys-CO(CH2)2CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체,
A14E, B16H, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)16CO-L-Lys-CO(CH2)2CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체,
A14E, B16H, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)14CO-Lys-CO(CH2)2CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체,
A14E, B16H, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)14CO-D-Lys-CO(CH2)2CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체,
A14E, B16H, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)14CO-L-Lys-CO(CH2)2CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체,
A14E, B16H, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)18CO-L-Dab-CO(CH2)2CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체,
A14E, B16H, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)16CO-L-Dab-CO(CH2)2CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체,
A14E, B16E, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)14CO-L-Dab-CO(CH2)2CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체,
A14E, B16H, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)18CO-L-Lys-CO(CH2)3CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체,
A14E, B16H, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)16CO-L-Lys-CO(CH2)3CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체,
A14E, B16H, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)18CO-L-Dab-CO(CH2)3CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체,
A14E, B16H, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)18CO-L-Lys-CO(CH2)4CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체,
A14E, B16H, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)18CO-L-Dab-CO(CH2)4CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체,
A14E, B16H, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)16CO-L-Dab-CO(CH2)4CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체;
"-Lys-"는 비키랄 리신을 통한 연결을 의미하고, "-L-Lys-"는 L 키랄 리신을 통한 연결을 의미하고, "-D-Lys-"는 D 키랄 리신을 통한 연결을 의미하고;
"Dab"은 2,4-디아미노부티르산을 의미하고, "-L-Dab-"은 L 키랄 Dab을 통한 연결을 의미하고, "-D-Dab-"는 D 키랄 리신을 통한 연결을 의미한다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 아실화된 인슐린 유사체는 하기 화합물 중 어느 하나로부터 선택된다:
A14E, B16E, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)18CO-Lys-CO(CH2)2CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체,
A14E, B16E, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)18CO-L-Lys-CO(CH2)2CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체,
A14E, B16H, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)18CO-Lys-CO(CH2)2CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체;
A14E, B16H, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)18CO-L-Lys-CO(CH2)2CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 아실화된 인슐린 유사체는 하기 화합물 중 어느 하나로부터 선택될 수 있다:
A14E, B16E, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)18CO-L-Lys-CO(CH2)2CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체,
A14E, B16H, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)18CO-L-Lys-CO(CH2)2CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체.
여기서, A14E, B16E, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)18CO-L-Lys-CO(CH2)2CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체는 하기 화학식에 나타낸 구조를 갖는다:
.
A14E, B16H, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)18CO-L-Lys-CO(CH2)2CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체는 하기 화학식에 나타낸 구조를 갖는다:
.
본 발명의 제3 측면은, 본 발명의 측쇄 화합물 및 아실화된 인슐린 유사체를 포함하는 약학 조성물을 제안한다.
본 발명의 제4 측면은, 대상체(subject)의 당뇨병을 치료 또는 예방하기 위한 약제의 제조에서의, 본 발명의 측쇄 화합물, 아실화된 인슐린 유사체 및 약학 조성물의 용도를 제안하고;
이때 상기 당뇨병은 I형 및 II형 당뇨병을 의미한다.
본 발명의 제5 측면은, 치료 유효량의 본 발명의 측쇄 화합물, 아실화된 인슐린 유사체 및 약학 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체의 당뇨병을 치료 또는 예방하는 방법을 제안하고;
이때 상기 당뇨병은 I형 및 II형 당뇨병을 의미한다.
본 발명의 제6 측면은, 대상체의 당뇨병을 치료 또는 예방하는 데 사용하기 위한 본 발명의 측쇄 화합물, 아실화된 인슐린 유사체 및 약학 조성물을 제안하고;
이때 상기 당뇨병은 I형 및 II형 당뇨병을 의미한다.
본 발명의 제7 측면은, 본 발명의 측쇄 화합물, 아실화된 인슐린 유사체 및 약학 조성물의 투여 방법을 제안하고, 상기 화합물, 아실화된 인슐린 유사체 및 약학 조성물은 주 2회, 주 1회 또는 그보다 덜 빈번하게 투여된다.
본 발명의 제8 측면은, 화학식 (I)의 측쇄 화합물과 인간 인슐린 유사체를 사용하여 아실화 반응을 수행하는 단계를 포함하는, 화학식 (II)의 신규한 아실화된 인슐린 유사체를 제조하는 방법을 제안하고, 이때, 상기 인간 인슐린 유사체는 A쇄 및 B쇄를 갖고, 상기 A쇄의 아미노산 서열은 서열 번호 1에 표시된 것이고, 상기 B쇄의 아미노산 서열은 서열 번호 2 또는 서열 번호 3에 표시된 것이다.
종래 기술과 비교하여, 본 발명은 다음과 같은 유익한 효과를 갖는다:
본 발명은, 당뇨병 치료에 사용될 수 있고, 현재의 일일 제제(daily preparation)(인슐린 데글루덱)에 비해 혈당 조절 작용 시간이 더 긴 신규한 아실화 인간 인슐린 유사체를 제공한다. 이는, 주 1회 또는 그 미만의 빈도로 피하 투여할 수 있는 주간(weekly) 제제 또는 보다 지속성 인슐린 제제로 사용할 수 있으며, 기초 인슐린 요법이 필요한 당뇨병 환자에게 만족스러운 치료 효과를 제공하고 환자 순응도를 향상시킬 것이다.
본 발명을 설명하는 과정에서, 본원의 관련 용어가 설명되고 예시되는데, 이는 단지 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 보호 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 안 된다.
본원에 사용되는 "인슐린 유사체"는, 자연 발생 인슐린에 존재하는 하나 이상의 아미노산 잔기의 결실 및/또는 교환, 및/또는 자연 발생 인슐린으로부터 유도된 하나 이상의 아미노산 잔기의 첨가에 의해 수득될 수 있는 형태를 갖는 폴리펩티드, 예컨대 인간 인슐린 구조의 분자 구조체를 의미한다.
"desB30 인슐린" 및 "desB30 인간 인슐린"은 B30 아미노산 잔기가 결여된 천연 인슐린 또는 이의 유사체를 의미한다.
"당뇨병"이라는 용어에는 I형 당뇨병, II형 당뇨병, 임신성 당뇨병(임신 중) 및 고혈당증을 유발하는 기타 병태가 포함된다. 이 용어는, 췌장이 부족한 양의 인슐린을 생성하거나 신체 세포가 인슐린에 적절하게 반응하지 못해 세포가 포도당을 흡수하지 못하는 대사 장애에 사용된다. 결과적으로, 포도당이 혈액에 축적된다. 인슐린 의존성 당뇨병(insulin-dependent diabetes mellitus; IDDM) 및 청소년 발병 당뇨병으로도 알려진 I형 당뇨병은 베타 세포 파괴로 인해 발생하며, 종종 인슐린 결핍을 초래한다. 인슐린 비의존성 당뇨병(NIDDM) 및 성인 발병 당뇨병으로도 알려진 II형 당뇨병은 주요 인슐린 저항성과 연관되어 있으며, 따라서 상대적인 인슐린 결핍 및/또는 인슐린 저항성을 수반하는 주요 인슐린 분비 결함과 관련이 있다.
"A14E, B16E, B25H, B29K (N(ε)-에이코산디오일-L-Lys-숙신산-2xOEG), desB30 인간 인슐린"은, 인간 인슐린의 A14 위치에 있는 아미노산 Y가 E로 돌연변이되고, 인간 인슐린의 B16 위치에 있는 아미노산 Y가 E로 돌연변이되고, 인간 인슐린의 B25 위치에 있는 아미노산 F가 H로 돌연변이되고, 인간 인슐린의 B29 위치에 있는 아미노산 K가 B29에서의 리신 잔기의 ε 질소(Nε로 명명) 상의 잔기 에이코산디오일-L-Lys-숙신산-2xOEG을 사용한 아실화에 의해 변형되고, 인간 인슐린의 B30 위치에 있는 아미노산 T가 결실되었음을 의미한다.
"OEG"는 [2-(2-아미노에톡시)에톡시]에틸카보닐이고; 2xOEG 또는 (OEG)2는 모두 2개의 OEG를 나타낸다.
"Su"는 숙신이미딜-1-일 = 2,5-디옥소-피롤리딘-1-일이다.
"OSu"는 숙신이미딜-1-일옥시 = 2,5-디옥소-피롤리딘-1-일옥시를 의미한다.
도 1: 단일 피하 투여 후 C57 마우스의 혈당 변화;
도 2: SD 래트의 I.V.PK의 시간 및 약물 농도 데이터;
도 3: T1DM 마우스에 대한 반복 투여의 무작위 혈당 변화 곡선;
도 4: T1DM 마우스에 대한 반복 투여의 무작위 혈당 변화 곡선;
도 5: SD 래트의 S.C.PK의 시간 및 약물 농도 곡선;
도 6: C57BL6 마우스의 S.C.PK에서의 시간 및 약물 농도 곡선;
도 7: 비글의 I.V.PK의 시간 및 약물 농도 곡선.
도 2: SD 래트의 I.V.PK의 시간 및 약물 농도 데이터;
도 3: T1DM 마우스에 대한 반복 투여의 무작위 혈당 변화 곡선;
도 4: T1DM 마우스에 대한 반복 투여의 무작위 혈당 변화 곡선;
도 5: SD 래트의 S.C.PK의 시간 및 약물 농도 곡선;
도 6: C57BL6 마우스의 S.C.PK에서의 시간 및 약물 농도 곡선;
도 7: 비글의 I.V.PK의 시간 및 약물 농도 곡선.
본 발명의 솔루션은 실시예와 함께 아래에서 설명될 것이다. 이러한 실시양태의 예가 도면에 예시되어 있으며, 여기서 동일하거나 유사한 참조 번호는 동일하거나 유사한 구성 요소 또는 전체적으로 동일하거나 유사한 기능을 갖는 구성 요소를 나타낸다. 실시예에 특별한 기술이나 조건이 기재되어 있지 않은 경우에는 해당 분야의 문헌이나 제품 사양서에 기재된 기술이나 조건을 사용한다. 제조사의 표시 없이 사용되는 시약이나 기구는 시중에서 구할 수 있는 통상적 제품이다. 당업자는 하기 실시예가 단지 본 발명을 설명하기 위해 사용된 것이며, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다는 것을 이해할 것이다.
실시예 1
인슐린 돌연변이 유사체(A14E, B16E, B25H, B29K, desB30 인간 인슐린 유사체)의 제조
인슐린 유사체를 위한 벡터의 구성, 효모 발현, 처리 및 정제는 당업자가 쉽게 인식하는 표준 기술을 사용하여 수행할 수 있다. 인슐린 유사체 제조의 비제한적인 예는 이전에 기술되었다(Glendorf T,Sorensen AR,Nishimura E,Pettersson I,& Kjeldsen T:Importance of the Solvent-Exposed Residues of the Insulin B chain α-Helix for Receptor Binding: Biochemistry. 2008;47(16):4743-51). 즉, 효모 발현 시스템을 이용하여 인공적으로 설계된 C-펩티드를 통해 지속형 인슐린의 A 및 B 단일 쇄를 연결하였고, 스페이서 펩티드를 첨가하여 전구체 단백질의 안정성을 증가시켜 타겟 단백질의 발현이 증가되었다. 효소 절단 및 후속 정제를 통해 하류 정제 과정에서 스페이서 펩티드와 C 펩티드를 모두 절단하여 지속성 인슐린 유사체를 수득하였다. 이중-쇄 DesB30 유사체로의 완전한 전환은 MALDI-TOF MS에 의해 검증되었으며, 그 순도는 산성 및 중성 조건에서 RP-HPLC에 의해 테스트되었다. 유전자-형질전환된 숙주균을 스크리닝하여 수득된 조작 균주(engineered strain)는 고밀도로 발효가 가능하며, 발현 수준이 높고 발효 비용이 낮다. 설계된 유전자는 간단하고 효율적인 정제 과정의 개발을 촉진한다.
1) 재조합 발현 벡터의 제조
타겟 유전자의 전체 합성은 General Biosystems(Anhui) Co., Ltd.에 위탁하여 수행되었고, 타겟 유전자 서열과 벡터 pPIC9K를 제한 효소 BamHI 및 EcoRI(TAKARA)로 분해하고(digested), 제조업체의 지침에 따라 Gel Extraction Kit를 사용하여 분해된 생성물을 정제 및 회수했다. 제조업체의 지침에 따라 DNA Ligation Kit Ver2.1(TAKARA)을 사용하여 벡터를 연결하고(ligate) 수용성(competent) 세포 DH5a에 형질전환시켰다. 플레이트 상의 단일 콜로니를 무작위로 취하고, 타깃 유전자의 시퀀싱을 Guangzhou Aike Biotechnology Co., Ltd.에 의뢰해 정확성을 검증한 후, 오메가 플라스미드 추출 키트를 이용해 정확한 발현 벡터를 추출하고 검증했다. 제한 효소 SalI(TAKARA)로 선형화한 후, 제조사의 지침에 따라 발현 벡터를 Gel Extraction Kit로 정제 및 회수한 후, 향후 사용을 위해 -20℃에서 보관하였다.
2) 재조합 조작 균주(engineering strain)의 제조 및 단백질 발효 발현
상기 선형화된 재조합 발현 플라스미드를 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) GS115 수용 세포(Invitrogen)에 첨가하고, 전기 충격법으로 형질전환시킨 후, MicroPulser(Bio-Rad, 165-2100) 장비로 전기 충격을 실시하였다. 전기 충격 후, 예비-냉각된 1 mol/L 소르비톨 1 mL를 첨가하고, 세균 현탁액을 멸균된 원심분리관에 옮기고, 회수하고, 진탕기에서 30℃, 220 rpm으로 2시간 동안 배양한 후, MD 배지 플레이트로 코팅하고, 30℃ 인큐베이터에서 역(inverted) 배양하였다. 플레이트 상에서 성장한 형질전환체를 Geneticin G418(merck)을 사용하여 높은 카피 재조합체에 대해 스크리닝했다.
상기에서 스크리닝된 재조합체를 진탕 플라스크에서 배양 및 발효시킨 후, 단일 콜로니를 취하여 배양을 위해 YPD 배지에 접종하고, 30℃, 220 rpm의 진탕기에서 약 2일 동안 진탕시키고, 배양에 의해 수득된 시드액을 BMGY 배지(Buffered Glycerol-complex Medium)에 1:100 비율로 접종하고, 30℃, 220 rpm의 교반기에서 약 24시간 동안 진탕에 의해 배양한 후, 무수 메탄올을 발효 배지의 1 부피%로 첨가하여 단백질의 발현을 유도하고, 12시간마다 무수 메탄올을 보충한 후, 유도 120시간 후에 발효를 종료하였다. 발효액(fermentation broth)을 수집하고, 6000 rpm에서 6분간 원심분리한 후, 상청액을 수집하였다. 상청액을 양이온 크로마토그래피, 효소 분해, 중합체 크로마토그래피, 한외여과 및 동결건조로 처리하였다. 동결건조된 샘플의 순도는 HPLC로 90% 검출되었으며, 분자량은 MALDI-TOF MS로 검출되었다. A14E, B16E, B25H, Des(B30) 인간 인슐린 유사체의 분자량의 검출값은 5628.41Da이었고, 이론값은 5628.39Da이었고, 검출값은 이론값과 일치하였고, A14E, B16H, B25H, Des(B30) 인간 인슐린 유사체의 분자량 검출값은 5637.06Da이었고, 이론값은 5636.31Da이었고, 검출값은 이론값과 일치하였다.
실시예 2 지속형 인슐린의 제조
2.1 A14E, B16E, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH
2
)
18
CO-
L
-Lys-CO(CH
2
)
2
CO-(OEG)
2
), desB30 인간 인슐린 유사체의 제조
(1) COOH(CH
2
)
18
CO-
L
-Lys-CO(CH2)
2
CO-(OEG)
2
-OSu 측쇄 화합물의 제조 공정
a) 3구 둥근 바닥 플라스크에 ZCX-A00(40g, 58.39mmol), ZCX-B00(31.80g, 233.56mmol), Dowex50 WX2-100 산성 양이온 수지(60g) 및 n-옥탄 360mL를 첨가하고, 혼합물을 교반하고, 온도를 110℃로 올린 후 72시간 동안 환류를 유지하였다. 가열 전원을 끄고, 혼합물을 계속 교반하고, 실온으로 되돌렸다. 여액을 흡인 여과(suction filtration)하여 버리고 필터 잔류물을 수득한 후, 필터 잔류물에 디클로로메탄 360 mL를 첨가하고, 실온에서 2시간 동안 교반한 후, 필터 잔류물을 흡인여과하고, 수득된 여액을 진공에서 농축 건조시켜 고체 조생성물을 수득한다. 고체 조생성물에 이소프로판올 60mL를 첨가하여 재결정화하여 생성물 ZCX-01 16.19g을 수득하였다.
ESI-MS m/z: 433.33 [M+H]+로서, 이는 이론값과 일치했다.
b) 250mL 1구 플라스크에 ZCX-01(10.0g, 23.11mmol) 및 디클로로메탄 130mL를 첨가한 후, N-하이드록시숙신이미드(2.93g, 25.42mmol) 및 디사이클로헥실카보디이미드(5.72g, 27.73mmol)를 첨가하고, 혼합물을 30℃에서 24시간 동안 반응시켰다. 이어서, 혼합물을 여과하여 침전물을 제거하고, 증류하고, 농축 건조시켜 고체 조생성물을 수득하였다. 고체의 조생성물에 이소프로판올 60mL와 n-헵탄 60mL를 첨가하여 재결정하여 생성물 ZCX-02 10.15g을 수득하였다.
ESI-MS m/z: 530.32 [M+H]+로서, 이는 이론값과 일치했다.
c) 250mL 1구 둥근 바닥 플라스크에 ZCX-02(10.6g, 20mmol), ZCX-C00(라이신 유도체, 8.2g, 22mmol) 및 디클로로메탄 150mL를 첨가하고, 실온에서 교반한 후, 트리에틸아민 5.5mL를 첨가했다. 2N 염산 용액을 혼합물에 첨가하여 pH=1-2로 조정하고, 혼합물을 30분 동안 계속 교반한 다음, 분리하고, 수성상을 버리고, 유기상을 진공에서 농축 건조시키고, 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 생성물 Nα-(장쇄 지방족 이산)-L-Lys-1-벤질 에스테르-6-Boc를 수득한다.
ESI-MS m/z: 752.52 [M+H]+로서, 이는 이론값과 일치했다.
d) ZCX-03의 H NMR 데이터는 수득된 구조가 타겟 생성물 ZCX-03임을 보여주었다.
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.37 (s, 10H), 6.08 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 5.19 (dd, J = 26.8, 13.8 Hz, 4H), 4.66 (dd, J = 12.5, 7.4 Hz, 1H), 4.54 (s, 1H), 3.07 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 2.37 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.29 - 2.17 (m, 2H), 1.87 (d, J = 34.8 Hz, 1H), 1.73 (d, J = 14.2 Hz, 1H), 1.68 - 1.58 (m, 4H), 1.46 (s, 11H), 1.28 (d, J = 12.9 Hz, 30H).
1구 둥근 바닥 플라스크에 ZCX-03(11.5 g, 15 mmol), 트리플루오로아세트산 55 mL, 디클로로메탄 55 mL를 첨가하고, 0℃ 저온 탱크에 넣고, 혼합물을 교반하고, 1시간 동안 반응했다. TLC 검출에 의해 반응이 기본적으로 완료된 후, 반응 시스템을 진공에서 농축 건조시켜 점성 액체를 수득한 후, 디클로로메탄 200 mL를 첨가하여 용해시키고, 혼합물을 포화 NaHCO3 용액으로 세척한 후, 분리하하고, 유기상을 포화 염수로 2회 세척하고, 분리하고, 유기상을 진공에서 농축 건조시키고, 무수 에탄올로 재결정화하여 8.35g의 생성물 ZCX-C04를 수득하였다.
ESI-MS m/z 651.56 [M+H]+로서, 이는 이론값과 일치하였다.
e) 1구 둥근 바닥 플라스크에 ZCX-C04(8.00g, 12.31mmol), 디클로로메탄 150mL, 트리에틸아민 3mL를 첨가하고, 혼합물을 교반하여 실온에서 용해시킨 후, 숙신산 무수물(2.46g, 24.62) mmol)을 첨가했다. 첨가 후, 혼합물을 교반하고, 30℃에서 24시간 동안 반응시켰다. TLC 검출에 의해 반응이 기본적으로 완료된 후, 2N HCl 용액 10mL를 첨가하여 pH= 1-2로 조정한 다음, 혼합물을 30분 동안 교반하고, 분리하고, 수성상을 버리고, 유기상을 포화 염수로 1회 세척한 후, 분리하고, 유기상을 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 여액을 진공에서 농축 건조시켜 고체 조생성물을 수득하였다. 고체 조생성물을 무수 에탄올로 재결정하여 8.9g의 생성물 ZCX-C05를 수득하였다.
ESI-MS m/z 751.03 [M+H]+로서, 이는 이론값과 일치하였다.
ZCX-05의 H NMR 데이터는 수득된 구조가 타겟 생성물 ZCX-05임을 보여주었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.38 (d, J = 3.7 Hz, 10H), 6.39 - 6.26 (m, 2H), 5.19 (q, J = 12.2 Hz, 2H), 5.13 (s, 2H), 4.66 (td, J = 8.4, 4.6 Hz, 1H), 3.24 (d, J = 59.8 Hz, 2H), 2.74 - 2.65 (m, 2H), 2.51 (dd, J = 10.4, 5.6 Hz, 2H), 2.37 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.30 - 2.23 (m, 2H), 1.85 (d, J = 34.4 Hz, 1H), 1.65 (d, J = 24.7 Hz, 5H), 1.52 (d, J = 36.5 Hz, 2H), 1.38 - 1.22 (m, 30H).
f) 250mL 1구 플라스크에 ZCX-05(8.5g, 11.32mmol) 및 디클로로메탄 130mL를 첨가한 후, N-하이드록시숙신이미드(1.95g, 16.98mmol) 및 디사이클로헥실카보디이미드(3.50g, 16.98mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 30℃에서 24시간 동안 연속적으로 반응시킨 후, 여과하여 침전물을 제거하고, 증류하고, 농축 건조시켜 고체 조생성물 ZCX-06을 수득하였고, 이는 정제 없이 다음 단계에 직접 사용되었다.
이전 단계에서 수득된 고체 조생성물 ZCX-06에 [2-(2-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세트산(다른 명칭은 H-2xOEG-OH임)(3.73 g, 11.32 mmol) 및 디클로로메탄 130 mL를 첨가하고, 실온에서 10분간 교반한 후, 트리에틸아민 2.4 mL를 첨가하였다. 첨가 후, 혼합물을 교반하고, 30℃에서 24시간 동안 반응시켰다. TLC 검출에 의해 반응이 기본적으로 완료된 후, 혼합물에 2N HCl 용액 10mL를 첨가하고, 30분 동안 교반한 후, 분리하고, 수성상을 버리고, 유기상을 포화 염수로 2회 세척하고, 분리하고, 수성상을 버리고, 유기상을 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 여액을 진공에서 농축 건조시켜 고체 조생성물을 수득하였다. 고체 조생성물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 생성물 ZCX-07 5.50g을 수득하였다.
ESI-MS m/z 1042.59 [M+H]+로서, 이는 이론값과 일치하였다.
g) 250mL 1구 플라스크에 ZCX-07(5.00g, 4.80mmol) 및 디클로로메탄 130mL를 첨가한 후, N-하이드록시숙신이미드(0.83g, 7.2mmol) 및 디사이클로헥실카보디이미드(1.49g, 7.2mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 30℃에서 24시간 동안 연속적으로 반응시킨 후, 여과하여 침전물을 제거하고, 증류하고, 농축 건조시켜 고체 조생성물을 수득하였다. 고체의 조생성물에 이소프로판올 50mL와 n-헵탄 50mL를 첨가하여 재결정하여 생성물 ZCX-08 4.30g을 수득하였다.
ESI-MS m/z 1139.10 [M+H]+로서, 이는 이론값과 일치하였다.
ZCX-08의 H NMR 데이터는 수득된 구조가 타겟 생성물 ZCX-08임을 보여주었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.36 (s, 10H), 7.27 - 7.22 (m, 1H), 6.63 (s, 1H), 6.29 (dd, J = 11.9, 6.7 Hz, 2H), 5.18 (t, J = 9.8 Hz, 2H), 5.12 (s, 2H), 4.61 (td, J = 7.9, 5.1 Hz, 1H), 4.51 (s, 2H), 4.02 (s, 2H), 3.83 - 3.76 (m, 2H), 3.70 - 3.66 (m, 4H), 3.61 (dd, J = 8.7, 4.0 Hz, 4H), 3.56 - 3.48 (m, 4H), 3.47 - 3.40 (m, 2H), 3.23 - 3.12 (m, 2H), 2.87 (s, 4H), 2.52 (d, J = 5.2 Hz, 2H), 2.47 (d, J = 5.4 Hz, 2H), 2.36 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.23 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 1.80 (s, 1H), 1.64 (dd, J = 14.5, 7.3 Hz, 5H), 1.53 - 1.44 (m, 2H).
h) 1구 둥근 바닥 플라스크에 ZCX-08(1.40g, 1.22mmol), 10% Pd/C(0.12g), 트리플루오로아세트산 0.1mL, THF 30mL 및 메탄올 10mL를 첨가하고, 플라스크를 수소로 3회 교체하고, 수소 벌룬으로 밀봉한 후, 혼합물을 30℃에 놓고, 수소화 및 탈벤질화를 위해 6시간 동안 교반했다. TLC 검출에 의해 반응이 기본적으로 완료된 후, 혼합물을 여과하여 10% Pd/C를 제거하고, n-헵탄 120mL를 유기 여액에 적가하고, 계속 교반했다. 적가하는 동안 고체가 침전되었고, 적하가 완료된 후 혼합물을 실온에서 0.5시간 동안 교반하고, 여과하여 생성물 ZCX-09 0.83g을 수득하였고, 이는 COOH(CH2)18CO-L-Lys-CO(CH2)2CO-(OEG)2-OSu 지방족 측쇄이었다.
ESI-MS m/z 959.45 [M+H]+로서, 이는 이론값과 일치하였다.
ZCX-09의 H NMR 데이터는 수득된 구조가 타겟 생성물 ZCX-09임을 보여주었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 4.63 (d, J = 25.1 Hz, 2H), 3.88 (s, 2H), 3.28 (dd, J = 11.5, 5.7 Hz, 2H), 3.19 (dd, J = 11.3, 5.6 Hz, 2H), 2.83 (s, 3H), 2.22 - 2.14 (m, 2H), 2.10 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 1.60 - 1.42 (m, 4H), 1.26 (d, J = 24.8 Hz, 26H).
(2) A14E,B16E,B25H,B29K(N(ε)-COOH(CH
2
)
18
CO-
L
-Lys-CO(CH
2
)
2
CO-(OEG)
2
), desB30 인간 인슐린 유사체의 제조
A14E, B16E, B25H, Des(B30) 인간 인슐린(60mg, 0.01mmol)을 순수(pure water) 5mL와 DMF 2mL의 용액에 용해시킨 후, 10℃ 저온 반응조에 넣고, 트리에틸아민 100ul를 적가하여 pH를 11.50으로 조정했다. COOH(CH2)18CO-L-Lys-CO(CH2)2CO-(OEG)2-OSu 측쇄 화합물(14.37mg, 0.015mmol)을 DMF 3mL에 용해시켜 측쇄 혼합 용액을 형성한 후, 교반 하에, 상기 반응계에 측쇄 혼합 용액을 빠르게 첨가하고, 1N NaOH 용액을 사용하여 반응계의 pH를 11.00-11.50으로 일정하게 유지하였다. 첨가 후, 타이밍이 시작되었고, 1.0시간의 반응 후, 용액의 pH를 1N HCl 용액을 사용하여 7.0-7.5로 조정했다. 반응을 종료하여 반응성 단백질의 아실화의 조생성물 용액을 수득하였고, 반응 공정은 RP-HPLC로 제어되었다.
(3) A14E,B16E,B25H,B29K(N(ε)-COOH(CH
2
)
18
CO-
L
-Lys-CO(CH
2
)
2
CO-(OEG)
2
), desB30 인간 인슐린 유사체의 정제
상기 단백질 아실화 조생성물 용액을 유기상 함량이 약 15%(v:v)가 되도록 물로 희석하고, 0.45μm 필터막으로 여과한 후, RP-HPLC로 정제하여 정제액을 수득하였다.
(4) A14E,B16E,B25H,B29K(N(ε)-COOH(CH
2
)
18
CO-
L
-Lys-CO(CH
2
)
2
CO-(OEG)
2
), desB30 인간 인슐린 유사체의 한외여과 및 동결건조
상기 정제액을 한외여과막 패키지 시스템을 이용하여 주사용수로 대체한 후, 동결건조시켜 23mg의 동결건조된 생성물을 수득하고, 수득된 인간 인슐린 유사체의 분자 구조는 다음과 같았다:
(5) A14E,B16E,B25H,B29K(N(ε)-COOH(CH
2
)
18
CO-
L
-Lys-CO(CH
2
)
2
CO-(OEG)
2
), desB30 인간 인슐린 유사체의 구조 확인
A14E, B16E, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)18CO-L-Lys-CO(CH2)2CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체의 측정된 질량 스펙트럼은 6471.42Da였고, 이는 6471.64Da의 이론적 분자량과 일치한다. 이는, A14E, B16E, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)18CO-L-Lys-CO(CH2)2CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체가 성공적으로 제조되었음을 보여주었고, 이는 Insulin-a3로 약칭될 수 있다.
2.2 A14E, B16E, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH
2
)
16
CO-
L
-Lys-CO(CH
2
)
2
CO-(OEG)
2
), desB30 인간 인슐린 유사체의 제조
(1) COOH(CH
2
)
16
CO-
L
-Lys-CO(CH
2
)
2
CO-(OEG)
2
-OSu 측쇄 화합물의 제조 공정
COOH(CH2)16CO-L-Lys-CO(CH2)2CO-(OEG)2-OSu 측쇄(ZCY-09라고 함)의 제조 방법은 실시예 2.1의 COOH(CH2)18CO-L-Lys-CO(CH2)2CO-(OEG)2-OSu 측쇄 화합물의 제조 방법과 유사하고, 제조된 타겟 생성물의 구조 및 MS 테스트는 아래와 같다.
ESI-MS m/z 931.40 [M+H]+로서, 이는 이론값과 일치하였다.
ZCY-09의 H NMR 데이터는 수득된 구조가 타겟 생성물 ZCY-09임을 보여주었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 4.60 (s, 2H), 3.85 (d, J = 26.1 Hz, 2H), 2.83 (d, J = 4.1 Hz, 5H), 2.28 (p, J = 7.9 Hz, 4H), 2.18 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 2.10 (t, J = 7.3 Hz, 2H).
(2) A14E, B16E, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH
2
)
16
CO-
L
-Lys-CO(CH
2
)
2
CO-(OEG)
2
), desB30 인간 인슐린 유사체의 제조
A14E, B16E, B25H, Des(B30) 인간 인슐린(60mg, 0.01mmol)을 순수 5mL와 DMF 2mL의 용액에 용해시킨 후, 10℃ 저온 반응조에 넣고 트리에틸아민 100ul를 적가하여 pH를 11.50으로 조정했다. COOH(CH2)16CO-L-Lys-CO(CH2)2CO-(OEG)2-OSu 측쇄(13.95mg, 0.015mmol)를 DMF 3mL에 용해시켜 측쇄 혼합 용액을 형성하였다. 교반 하에, 상기 반응계에 측쇄 혼합 용액을 빠르게 첨가하였고, 1N NaOH 용액을 사용하여 반응계의 pH를 11.00-11.50으로 일정하게 유지하였다. 첨가 후, 타이밍이 시작되었고, 1.0시간의 반응 후, 용액의 pH를 1N HCl 용액을 사용하여 7.0-7.5로 조정했다. 반응을 종료하여 반응성 단백질 아실화의 조생성물 용액을 수득하였고, 반응 과정은 RP-HPLC로 조절하였다.
(3) A14E, B16E, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH
2
)
16
CO-
L
-Lys-CO(CH
2
)
2
CO-(OEG)
2
), desB30 인간 인슐린 유사체의 정제
상기 단백질 아실화 조생성물 용액을 유기상 함량이 약 15%(v:v)가 되도록 물로 희석하고, 0.45μm 필터막으로 여과한 후, RP-HPLC로 정제하여 정제액을 수득하였다.
(4) A14E, B16E, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH
2
)
16
CO-
L
-Lys-CO(CH
2
)
2
CO-(OEG)
2
), desB30 인간 인슐린 유사체의 한외여과 및 동결건조
상기 정제액을 한외여과막 패키지 시스템을 이용하여 주사용수로 대체한 후, 동결건조시켜 18mg의 동결건조된 생성물을 수득하였고, 수득된 인간 인슐린 유사체의 분자 구조는 다음과 같았다:
(5) A14E, B16E, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH
2
)
16
CO-
L
-Lys-CO(CH
2
)
2
CO-(OEG)
2
), desB30 인간 인슐린 유사체의 구조 확인
A14E, B16E, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)16CO-L-Lys-CO(CH2)2CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체의 측정된 질량 스펙트럼은 6443.40Da이었고, 이는 이론적 분자량 6443.41Da와 일치한다. A14E, B16E, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)16CO-L-Lys-CO(CH2)2CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체가 성공적으로 제조되었음을 보여주었고, 이는 Insulin-a2로 약칭될 수 있다.
2.3 A14E, B16H, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH
2
)
18
CO-L-Lys-CO(CH
2
)
2
CO-(OEG)
2
), desB30 인간 인슐린 유사체의 제조
COOH(CH2)18CO-L-Lys-CO(CH2)2CO-(OEG)2-OSu 측쇄 제조 방법은 실시예 2.1의 COOH(CH2)18CO-L-Lys-CO(CH2)2CO-(OEG)2-OSu 측쇄 화합물의 제조 방법과 동일하다.
A14E, B16H, B25H, Des(B30) 인간 인슐린(60mg, 0.01mmol)을 순수 5mL와 DMF 2mL의 용액에 용해시킨 후, 10℃ 저온 반응조에 넣고, 트리에틸아민 100μL를 적가하여 pH를 11.50으로 조정했다. Nα-(에이코산디오산)-Nε-(OCCH2CH2CO-(2xOEG-OSu)-L-Lys 측쇄(14.37mg, 0.015mmol)를 DMF 3mL에 용해시켜 측쇄 혼합 용액을 형성하였다. 상기 반응계에 교반 하에 측쇄 혼합 용액을 빠르게 첨가하고, 1N NaOH 용액을 사용하여 반응계의 pH를 11.00-11.50으로 일정하게 유지시켰다. 첨가 후, 타이밍을 시작하였다. 상기 용액의 농도를 1N HCl 용액으로 7.0-7.5로 조정하였다. 반응을 종료하여 반응성 단백질의 아실화 조생성물 용액을 수득하였고, 반응 공정은 RP-HPLC로 조절하였다.
상기 단백질 아실화 조생성물 용액을 유기상 함량이 약 15%(v:v)가 되도록 물로 희석하여 하고, 0.45μm 필터막으로 여과한 후, RP-HPLC로 정제하여 정제액을 수득하였다.
상기 정제액을 한외여과막 패키지 시스템을 이용하여 주사용수로 대체한 후, 동결건조시켜 동결건조된 생성물 16mg을 수득하였고, 수득된 인간 인슐린 유사체의 분자 구조는 다음과 같았다:
A14E, B16H, B25H, B29K(N($)-COOH(CH2)18CO-L-Lys-CO(CH2)2CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체의 측정된 질량 스펙트럼은 6480.10Da이었고, 이는 이론적 분자량 6480.10Da와 일치한다. A14E, B16H, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)18CO-L-Lys-CO(CH2)2CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체가 성공적으로 제조되었음을 보여주었고, 이는 Insulin-a10으로 약칭될 수 있다.
2.4 A14E, B16E, B25H, B29K (N
ε
-에이코산디오일-gGlu-2xOEG), DesB30 인간 인슐린 유사체의 제조
(1) 19-((S)-1-tert-부톡시카보닐-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-디옥소-피롤리딘-1-일옥시카보닐메톡시)에톡시]에틸카바모일}메톡시)에톡시]에틸카바모일}프로필카바모일)노나데칸산 tert-부틸 에스테르의 제조:
(다른 명칭은 tBu-에이코산디오일-gGlu(OtBu)-2xOEG-Osu이다)
TSTU(1.50 g) 및 DIPEA(0.91 mL)를 아세토니트릴(60ml) 중 19-((S)-1-tert-부톡시카보닐-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-디옥소-피롤리딘-1-일옥시카보닐메톡시)에톡시]에틸카바모일}메톡시)에톡시]에틸카바모일}프로필카바모일)노나데칸산 tert-부틸 에스테르(3.0g, Shanghai Topbiochem Technology Co., Ltd.에서 구입)를 함유하는 용액에 첨가하고, 혼합물을 밤새 실온에서 교반한 후, 진공에서 농축하였다. 수성 0.1 N HCl(100 mL) 및 에틸 아세테이트(200 mL)를 잔류물에 첨가한 후, 분리하고, 수성상을 에틸 아세테이트(50 mL)로 추출하고, 유기상을 합하고, 포화 염수로 1회 세척하고, 무수 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 진공에서 농축하여 유성(oily) 액체 3.21g을 수득하였다.
ESI-MS m/z 972.30 [M+H]+로서, 이는 이론값과 일치하였다.
(2) 19-((S)-1-카복시-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-디옥소-피롤리딘-1-일옥시카보닐메톡시)에톡시]에틸카바모일}메톡시)에톡시]에틸카바모일}프로필카바모일)노나데칸산:
(다른 명칭은 에이코산디오일-gGlu-2xOEG-OSu이다)
tBu-에이코산디오일-gGlu(OtBu)-2xOEG-Osu(3.0g)를 트리플루오로아세테이트(66mL)에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 45분 동안 교반하였다. TLC 검출로 반응이 완료된 후, 혼합물을 진공에서 농축하여 유성 액체를 수득한 후, 톨루엔으로 3회 농축하여 고체를 수득하였다. 이소프로필 알코올을 이용하여 재결정하고 여과하여 백색 고체 2.35g을 수득하였다.
ESI-MS m/z 860.60 [M+H]+로서, 이는 이론값과 일치하였다.
(3) (A14E, B16E, B25H, B29K (N
ε
-에이코산디오일-gGlu-2xOEG), DesB30 인간 인슐린 유사체의 제조
A14E, B16E, B25H, Des(B30) 인간 인슐린(60mg, 0.01mmol)을 순수 5ml와 DMF 2mL의 용액에 용해시킨 후, 10℃ 저온 반응조에 넣고 트리에틸아민 100ul를 적가하여 pH를 11.50으로 조정했다. 에이코산디오일-gGlu-2xOEG-OSu 지방족 측쇄(15.00mg, 0.017mmol)를 DMF 3mL에 용해시켜 측쇄 혼합 용액을 형성한 후, 교반 하에 측쇄 혼합 용액을 상기 반응계에 빠르게 첨가하고, 반응 시스템의 pH를 11.00-11.50으로 일정하게 유지하기 위해 1N NaOH 용액을 사용했다. 첨가 후, 타이밍이 시작되었고, 1.0시간의 반응 후, 용액의 pH를 1N HCl 용액을 사용하여 7.0-7.5로 조정했다. 반응을 종료하여 반응성 단백질의 아실화의 조생성물 용액을 수득하였고, 반응 과정은 RP-HPLC로 조절하였다.
(4) A14E, B16E, B25H, B29K (N
ε
-에이코산디오일-gGlu-2xOEG), DesB30 인간 인슐린 유사체의 정제
상기 단백질 아실화 조생성물 용액을 유기상 함량이 약 15%(v:v)가 되도록 물로 희석하고, 0.45μm 필터막으로 여과한 후, RP-HPLC로 정제하여 정제액을 수득하였다.
(5) A14E, B16E, B25H, B29K (N
ε
-에이코산디오일-gGlu-2xOEG), DesB30 인간 인슐린 유사체의 한외여과 및 동결건조
상기 정제액을 한외여과막 패키지 시스템을 이용하여 주사용수로 대체한 후, 동결건조시켜 9.3mg의 동결건조된 생성물을 수득하였고, 수득된 인간 인슐린 유사체의 분자 구조는 다음과 같았다.
(6) A14E, B16E, B25H, B29K(N
ε
-에이코산디오일-gGlu-2xOEG), DesB30 인간 인슐린 유사체의 구조 확인
A14E, B16E, B25H, B29K(Nε-에이코산디오일-gGlu-2xOEG), DesB30 인간 인슐린 유사체의 측정된 질량 스펙트럼은 6372.28Da였으며, 이는 이론적 분자량 6372.33Da와 일치했다. A14E, B16E, B25H, B29K(Nε-에이코산디오일-gGlu-2xOEG), DesB30 인간 인슐린 유사체의 타겟 생성물이 제조되었음을 보여주었고, 이는 Insulin-a1으로 약칭될 수 있다
2.5 A14E, B16H, B25H, B29K(Nε-에이코산디오일-gGlu-2xOEG), DesB30 인간 인슐린 유사체의 제조
(1) 19-((S)-1-tert-부톡시카보닐-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-디옥소-피롤리딘-1-일옥시카보닐메톡시)에톡시]에틸카바모일}메톡시)에톡시]에틸카바모일}프로필카바모일)노나데칸산 tert-부틸 에스테르의 제조:
(다른 명칭은 tBu-에이코산디오일-gGlu(OtBu)-2xOEG-Osu이다)
TSTU(1.50 g) 및 DIPEA(0.91 mL)를 19-((S)-1-tert-부톡시카보닐-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-디옥소-피롤리딘-1-일옥시카보닐메톡시)에톡시]에틸카바모일}메톡시)에톡시]에틸카바모일}프로필카바모일)노나데칸산 tert-부틸 에스테르(3.0g, Shanghai Topbiochem Technology Co., Ltd.에서 구입)를 아세토니트릴(60mL)에 용해시키고, 혼합물을 밤새 실온에서 교반한 후, 진공에서 농축하였다. 수성 0.1 N HCl(100 mL) 및 에틸 아세테이트(200 mL)를 잔류물에 첨가한 후, 분리하고, 수성 상을 에틸 아세테이트(50 mL)로 추출하고, 유기 상을 합하고, 포화 염수로 1회 세척하고, 무수 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 진공에서 농축하여 유성 액체 3.21g을 수득하였다.
ESI-MS m/z 972.30 [M+H]+로서, 이는 이론값과 일치하였다.
(2) 19-((S)-1-카복시-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-디옥소-피롤리딘-1-일옥시카보닐메톡시)에톡시]에틸카바모일}메톡시)에톡시]에틸카바모일}프로필카바모일)노나데칸산:
(다른 이름은 에이코산디오일-gGlu-2xOEG-OSu이다)
tBu-에이코산디오일-gGlu(OtBu)-2xOEG-Osu(3.0g)를 트리플루오로아세테이트(66mL)에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 45분 동안 교반하였다. TLC 검출로 반응이 완료된 후, 혼합물을 진공에서 농축하여 유성 액체를 수득한 후, 톨루엔으로 3회 농축하여 고체를 수득하였다. 이소프로필알코올을 이용하여 재결정하고 여과하여 백색 고체 2.35g을 수득하였다.
ESI-MS m/z 860.60 [M+H]+로서, 이는 이론값과 일치하였다.
(3) (A14E, B16H, B25H, B29K(N
ε
-에이코산디오일-gGlu-2xOEG), DesB30 인간 인슐린 유사체의 제조
A14E, B16H, B25H, Des(B30) 인간 인슐린(60mg, 0.01mmol)을 순수 5mL와 DMF 2mL의 용액에 용해시킨 후, 10℃ 저온 반응조에 넣고 트리에틸아민 100μL를 적가하여 pH를 11.50으로 조정했다. 에이코산디오일-gGlu-2xOEG-OSu 지방족 측쇄(15.00mg, 0.017mmol)를 DMF 3mL에 용해시켜 측쇄 혼합 용액을 만들고, 교반 하에 측쇄 혼합 용액을 상기 반응계에 빠르게 첨가하고, 반응 시스템의 pH를 11.00-11.50으로 일정하게 유지하기 위해 1N NaOH 용액을 사용했다. 첨가 후, 타이밍이 시작되었고, 1.0시간의 반응 후, 용액의 pH를 1N HCl 용액을 사용하여 7.0-7.5로 조정했다. 반응을 종료하여 반응성 단백질의 아실화의 조생성물 용액을 수득하였고, 반응 과정은 RP-HPLC로 조절하였다.
상기 단백질 아실화 조생성물 용액을 유기상 함량이 약 15%(v:v)가 되도록 물로 희석하고, 0.45μm 필터막으로 여과하였다.
상기 정제액을 한외여과막 패키지 시스템을 이용하여 주사용수로 대체한 후, 동결건조시켜 동결건조된 생성물 13.21mg을 수득하였고, 수득된 인간 인슐린 유사체의 분자 구조는 다음과 같았다.
A14E, B16H, B25H, B29K(Nε-에이코산디오일-gGlu-2xOEG), DesB30 인간 인슐린 유사체의 측정된 질량 스펙트럼은 6381.01Da였으며, 이는 이론적 분자량 6381.51Da와 일치했다. A14E, B16H, B25H, B29K(Nε-에이코산디오일-gGlu-2xOEG), DesB30 인간 인슐린 유사체의 타겟 생성물이 성공적으로 제조되었음을 보여주었고, 이는 Icodec로 약칭될 수 있다
실시예 3: 인슐린의 시험관 내 생물학적 활성 테스트
본 발명의 아실화된 인슐린 유사체는 인슐린 수용체 B로 형질감염된 세포를 활성화하여 인슐린 수용체 자가인산화를 생성할 수 있고, 또한 인간 혈청 알부민(HSA)에 가역적으로 결합할 수 있다. 인슐린의 생물학적 활성을 평가하기 위해 Cisbio의 Phospho-IR beta(Tyr1150/1151) 키트 방법으로 인슐린 수용체 B의 인산화 수준을 검출했다. 세포를 밤새 96-웰 플레이트에 접종하고, 배지 내 혈청을 제거한 후, 무-혈청 배지 40μl를 첨가하여 약 4시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 블랭크 용액(0.6% 카제인, 0.06mg/mL EDTA, 1xDPBS)을 사용하여 일련의 인슐린 유도체 희석액을 제조하고, CO2 인큐베이터(37℃, 5% CO2)에서 5분간 96웰 플레이트에서 세포와 함께 배양했다. 96웰 플레이트의 액체를 따라내고, 용해 완충액(2% Triton X-100, 150mM NaCl, 50mM HEPES, pH = 7) 및 억제제(키트의 차단 시약)의 혼합물 100μL를 첨가하여 세포를 용해시킨 후, 플레이트를 350rpm에서 30분 동안 진탕시켰다. 세포 용해 후 상청액에서 인슐린 수용체 인산화 수준을 측정하고 Graphpad Prism 5 소프트웨어의 비선형 회귀를 사용하여 데이터에 곡선을 피팅하여 상대 활성(%)을 평가했다. 생리학적 조건을 시뮬레이션하기 위해 블랭크 용액에 1.5% HSA가 포함된 관련 분석도 사용되었다. 본 발명의 인슐린-활성화된 인슐린 수용체의 인산화 수준의 변화는 알부민 결합 활성의 간접적인 반영으로서 검출되었다.
| 샘플 로트 번호 | 0%HSA | 1.5%HSA | |||
| EC50(nM) | 상대 HI 활성 | EC50(nM) | 상대 HI 활성 | 상대 0% HSA 활성 | |
| 인간 인슐린 (HI) | 1.232 | 1 | 2.592 | 1 | 48% |
| Degludec (DEG.) | 4.551 | 27.07% | 20.59 | 12.59% | 22.10% |
| Icodec | 77.20 | 1.60% | 1477 | 0.17% | 5.23% |
| Insulin-a1 | 230 | 0.54% | 5017 | 0.05% | 4.58% |
| insulin-a3 | 213.2 | 0.58% | 4488 | 0.06% | 5.86% |
| Insulin-a10 | 85.47 | 1.44% | 1310 | 0.20% | 6.52% |
| 주: (1) A14E, B16E, B25H, B29K(Nε-에이코산디오일-gGlu-2xOEG), DesB30 인간 인슐린 유사체, 상기 화합물은 Insulin-a1로 약칭된다. (2) A14E, B16H, B25H, B29K(Nε-에이코산디오일-gGlu-2xOEG), DesB30 인간 인슐린 유사체, 상기 화합물은 Icodec로 약칭된다. |
|||||
표 1의 데이터로부터, 새로운 인슐린 약물인 Insulin-a3 및 Insulin-a10을 제조하기 위한 새로운 지방 측쇄 아실화의 시험관 내 활성은 0% HSA 및 1.5% HAS의 조건에서 재조합 인간 인슐린 또는 인슐린 데글루덱에 비해 현저히 감소함을 알 수 있다. 주된 이유는, 측쇄와 알부민의 결합이 더 강하고, 인슐린 전구체와 수용체의 결합이 더 약하므로, 측쇄가 시험관 내 활성에 특정한 영향을 미치며 새로운 인슐린 약물과 알부민의 다른 결합 능력도 나타내기 때문이다. STZ에 의해 모델링된 C57BL6 마우스의 이러한 반복 투여 실험에서는, 대조군 Insulin-a1의 유효 혈당 조절 효과가 3일/시간(day/time) 동안 유지될 수 있고, Insulin-a3의 유효 혈당 조절 효과가 4-5일/시간 동안 유지될 수 있음을 알 수 있다. Insulin-a3는 대조군 Insulin-a1에 비해 혈당 조절 유지 시간이 길고, 효과가 더 우수함을 알 수 있다. 따라서, 인슐린 전구체가 동일할 때 새로운 인슐린 약물에서는 이러한 가역적 결합력이 더 우수하다.
실시예 4 정상 C57BL/6 마우스에 대한 테스트 약물의 혈당 강하(hypoglycemic) 효과
(1) 테스트 제품
| 명칭 | 공급처 | 물리적 상태 | 보관 조건 |
| Degludec | Dongguan HEC Biopharmaceutical R&D Co., Ltd. |
무색 액체 | 4℃ |
| Icodec | 무색 액체 | 4℃ | |
| Insulin-a1 | 무색 액체 | 4℃ | |
| Insulin-a3 | 무색 액체 | 4℃ | |
| Insulin-a4 | 무색 액체 | 4℃ | |
| Insulin-10 | 무색 액체 | 4℃ |
이들 중, Degludec은 인슐린 데글루덱(degludec)을 의미하고, Icodec은 A14E, B16H, B25H, B29K(Nε-에이코산디오일-gGlu-2xOEG), DesB30 인간 인슐린 유사체를 의미하고, Insulin-a1은 CN105636979A에 개시된 지속형 인슐린 A14E, B16E, B25H, B29K(Nε-에이코산디오일-gGlu-2xOEG), DesB30 인간 인슐린 유사체를 의미한다. Insulin-a3은 A14E, B16E, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)18CO-L-Lys-CO(CH2)2CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체를 의미한다. Insulin-a4는 A14E, B16E, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)16CO-L-Lys-CO(CH2)2CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체를 의미한다. Insulin-a10은 A14E, B16H, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)18CO-L-Lys-CO(CH2)2CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체를 의미한다.
(2) 샘플 구성
약리학적 실험에 사용된 다양한 인슐린 유사체 API는 PBS 완충액을 사용하여 원하는 농도로 제형화되었다.
(3) 실험 동물
| 종 | C57BL/6 마우스 |
| 수준 | SPF |
| 주문한 체중 범위 | 20-24g |
| 성별 | 수컷 |
| 공급처 | Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd |
| 공급처 주소 | 중국 후난 |
| 동물 식별 방법 | 마커로 꼬리에 마킹함 |
| 주문한 동물 수 | 40 |
| 이용한 동물 수 | 36 |
(4) 실험 방법
SPF 등급 C57BL/6 마우스를 사육 온도 20-26℃, 습도 40-70%, 주야간 시간 12시간/12시간의 차단 환경의 적절한 사육 상자에서 사육했고, 마우스는 표준 식품 및 오토클레이브된 살균수를 자유롭게 접근하였다. 3일간의 검역 기간과 2일간의 적응 기간을 거친 후, 무작위 혈당을 측정하고, 마우스를 칭량했다. 마우스를 무작위 혈당과 체중에 따라 6개 그룹으로 나누었다. 동물 그룹핑 및 투여는 표 4에 제시되어 있다.
| 그룹 | 유형 | 수 | 용량 (nmol/Kg) | 투여 부피 (mL/Kg) | 투여 방식 | 투여 빈도 |
| 대조군 | C57BL/6 | 6 | / | 10 | S.C. | 1회 |
| Degludec | C57 BL/6 | 6 | 200 | 10 | S.C. | 1회 |
| Icodec | C57 BL/6 | 6 | 1400 | 10 | S.C. | 1회 |
| Insulin-a1 | C57 BL/6 | 6 | 1400 | 10 | S.C. | 1회 |
| Insulin-a3 | C57 BL/6 | 6 | 1400 | 10 | S.C. | 1회 |
| Insulin-a4 | C57 BL/6 | 6 | 1400 | 10 | S.C. | 1회 |
| Insulin-a10 | C57BL/6 | 6 | 1400 | 10 | S.C. | 1회 |
단일 피하 투여(S.C.)를 사용하여 상응하는 비히클 또는 약물을 투여했다. 대조군에는 전 과정 동안 금식 없이 비히클 PBS를 투여하였으며, 동물들은 자유롭게 먹고 마시도록 하였다. C57 마우스의 무작위 혈당 값은 투여 전과 투여 후 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 24, 48, 54, 72 및 96시간에 측정되었다.
모든 원시(raw) 데이터는 Excel 파일에 입력되었으며, 평균±SEM으로 표시되었다. 데이터의 통계적 분석은 Graphpad Prism 7.0 소프트웨어, 원-웨이 또는 투-웨이 ANOVA 비교 방법을 사용하여 수행되었으며, P<0.05를 유의미한 차이에 대한 기준으로 사용했다.
(5) 결과
대조군과 비교 시에, 투여 1시간 후, 인슐린 데글루덱, Icodec, Insulin-a1, Insulin-a3, Insulin-a4 및 Insulin-a10 그룹의 혈당은 크게 감소했고; 투여 2시간 후, 인슐린 데글루덱 그룹의 마우스의 혈당은 최저 수준에 도달한 후, 서서히 증가한 반면, 다른 5개 투여 그룹의 마우스의 혈당은 계속해서 천천히 감소했고; 투여 10시간 후, 인슐린 데글루덱 그룹의 혈당은 점차 회복되었고, Insulin-a4 그룹의 혈당은 최저 수준에 도달하여 점차 회복되었으며, Icodec, Insulin-a1, Insulin-a3 및 Insulin-a10 그룹의 혈당은 여전히 느린 감소를 유지했고; 투여 24시간 후, 인슐린 데글루덱 그룹의 마우스의 혈당은 정상으로 돌아왔고, Insunlin-a4 그룹의 혈당은 점차 회복되고, Insulin-a1 및 Insulin-a3 그룹의 혈당은 최저 수준에 도달하였으며, 둘 사이에는 유의한 차이가 없었고, 추적 관찰(follow-up) 혈당이 점차 회복되는 반면, Icodec 및 Insulin-a10 그룹의 혈당은 계속해서 천천히 감소했고; 투여 48시간 후, Insulin-a1과 Insulin-a4 그룹의 혈당은 정상으로 돌아왔고, Insulin-a3 그룹의 혈당은 상승세를 보였지만 여전히 낮은 수준을 유지하고 있으며, Icodec 그룹의 혈당은 최저 수준에 도달한 후, 점차 회복되는 반면, Insulin-a10 그룹의 혈당은 계속해서 천천히 감소했고; 투여 72시간 후, Insulin-a3 그룹의 혈당은 낮게 유지되었고, Icodec 그룹의 혈당은 점차 회복되는 반면, Insulin-a10 그룹의 혈당은 최저 수준에 도달한 후, 점차 증가했고; 투여 96시간 후, Insulin-a10 그룹을 제외한 다른 그룹의 혈당은 정상 수준으로 회복되었으며, Insulin-a10 그룹의 혈당은 점차 증가하였으나, 아직 정상 수준에 도달하지 못했다. 구체적인 데이터는 표 5 및 도 1에 나와 있다.
결과에 따르면 정상 C57BL/6 마우스를 대상으로 한 이번 단일 투여 실험에서 인슐린 데글루덱의 유효 혈당 조절 시간은 24시간, Insulin-a4의 유효 혈당 조절 시간은 48시간, Insulin-a1의 유효 혈당 조절 시간은 72시간이며, Icodec과 Insulin-a3의 유효 혈당 조절 시간은 모두 96시간인 반면, Insulin-a10의 유효 혈당 조절 시간은 96시간 초과이다. Icodec과 비교하면 Insulin-a3의 혈당 조절 효과는 약간 떨어지지만, 여전히 Icodec과 동일한 유효 혈당 조절 시간을 갖고 있는 반면, Insulin-a10의 혈당 조절 효과는 Icodec의 추세와 일치하고, 더 긴 시간동안 유지될 수 있다.
실시예 5: C57BL/6 마우스의 STZ-유도 I형 당뇨병(T1DM)에 대한 테스트 약물의 혈당 강하 효과
(1) 테스트 제품
| 명칭 | 공급처 | 물리적 상태 | 보관 조건 |
| Insulin-a1 | Dongguan HEC Biopharmaceutical R&D Co., Ltd. | 무색 액체 | 4℃ |
| Insulin-a3 | 무색 액체 | 4℃ |
(2) 샘플 구성
약리학적 실험에 사용된 다양한 인슐린 유사체 API는 PBS 완충액을 사용하여 원하는 농도로 제형화되었다.
(3) 실험 동물
| 종 | C57BL/6 마우스 |
| 수준 | SPF |
| 주문한 체중 범위 | 20-24g |
| 성별 | 수컷 |
| 공급처 | Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd |
| 공급처 주소 | 중국 후난 |
| 동물 식별 방법 | 마커로 꼬리에 마킹함 |
| 주문한 동물 수 | 40 |
| 이용한 동물 수 | 40 |
(4) 실험 방법
SPF 등급 C57BL/6 마우스를 사육 온도 20-26℃, 습도 40-70%, 주야간 시간 12시간/12시간의 차단 환경의 적절한 사육 상자에서 사육했고, 마우스는 표준 식품과 오토클레이브된 살균수에 자유롭게 접근할 수 있었다. 3일간의 격리 기간과 2일간의 적응 기간을 거친 후, 마우스를 12시간 동안 금식시키고, 스트렙토조토신 용액(STZ, 13 mg/mL, 시트레이트 완충액 중) 또는 시트레이트 완충액 130mg/kg(대조군)을 복강 내 주사했다. 스트렙토조토신 투여 후 3일과 7일에 무작위 혈당과 공복 혈당이 검출되었으며, 무작위 혈당값이 25mmol/L 초과, 공복 혈당값이 11.1mmol/L 초과인 경우 추적 관찰 실험을 위한 T1DM 모델 마우스로서 선택되었다. 투여 전날, 무작위 혈당을 모니터링하고, 마우스를 칭량했다. 마우스를 무작위 혈당과 체중에 따라 4개 그룹으로 나누었다.
동물 분류 및 투여는 다음과 같다.
| 그룹 | 유형 | 수 | 용량 (nmol/Kg) | 투여 부피 (mL/Kg) | 약물 전달 방식 | 투여 빈도 |
| 대조군 | C57BL/6 | 6 | / | 10 | S.C. | 4회 |
| 모델 | C57 BL/6 | 7 | / | 10 | S.C. | 4회 |
| Insulin-a1 | C57 BL/6 | 7 | 1400 | 10 | S.C. | 4회 |
| Insulin-a3 | C57 BL/6 | 7 | 1400 | 10 | S.C. | 4회 |
피하 투여(S.C.)를 사용하여 상응하는 비히클 또는 약물을 4-5일마다 1회씩 총 4회 투여하였다. 실험 동안 동물들은 자유롭게 먹고 물을 마실 수 있었다. 1차 투여 전, 및 투여 후 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 24, 48, 72 및 96 시간의 무작위 혈당을 평가하였고, 2차, 3차 및 4차 투여 전, 및 투여 후 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48, 72, 96 및 120시간의 무작위 혈당도 평가하였다.
모든 원시 데이터는 Excel 파일에 입력되었으며, 평균±SEM으로 표시되었다. 데이터의 통계적 분석은 Graphpad Prism 7.0 소프트웨어, 원-웨이 또는 투-웨이 ANOVA 비교 방법을 사용하여 수행되었으며, P<0.05를 유의미한 차이에 대한 기준으로 사용했다.
(5) 결과
구체적인 데이터는 표 9 및 도 2에 나와 있다.
| 그룹 | 시점 (일) | |||||||
| 0 (1차) |
1 |
4 (2차) |
5 |
9 (3차) |
10 |
14 (4차) |
18 |
|
| 대조군 | 7.5±0.5 | 8.8±0.5 | 8.0±0.4 | 8.0±0.7 | 7.9±0.5 | 12.2±8.3 | 7.6±0.8 | 7.5±0.6 |
| 모델 | 31.1±3.8 | 31.7±2.0 | 31.4±3.7 | 30.7±4.5 | 28.8±6.2 | 29.0±3.5 | 30.1±5.2 | 28.9±5.6 |
| Insulin-a1 | 33.3±0.1 | 22.5±9.6* | 31.1±2.3 | 15.6±6.6 *** |
28.4±4.9 | 12.2±7.9*** | 28.4±5.9 | 26.2±5.7 |
| Insulin-a3 | 31.3±3.1 | 17.4±6.7*** | 26.9±8.0 | 7.1±3.8 *** |
26.2±7.9 | 8.6±5.7*** | 24.4±5.7 | 19.7±6.4* |
| 주: 모델 대비 *P<0.05, ***P<0.001 | ||||||||
결과는, 모델 그룹과 비교 시에, Insulin-a1의 혈당이 각 투여 24시간 후에 크게 감소하여 최저 수준에 도달한 다음 천천히 증가하여 투여 72시간 후에 정상 수준에 도달했고; 1차 및 2차 투여 후 24시간 후에, Insulin-a3의 혈당이 크게 감소하여 최저 수준에 도달한 후, 천천히 증가하여 투여 96시간 후에 정상 수준에 도달한 것으로 나타났다. 투여 횟수가 증가함에 따라 Insulin-a3의 유효 혈당 조절 시간은 3차 및 4차 투여 후 연장되어 투여 120시간 후에야 정상 수준에 도달하였고, 각 투여 후에, Insulin-a3의 혈당 강하 효과는 Insulin-a1보다 우수했다.
결론적으로, Insulin-a3의 혈당 조절 효과와 유효 혈당 조절 시간은 Insulin-a1보다 훨씬 우수하였다.
실시예 6: C57BL/6 마우스의 STZ-유도 I형 당뇨병(T1DM)에 대한 테스트 약물의 혈당 강하 효과
(1) 테스트 제품
| 명칭 | 공급처 | 물리적 상태 | 보관 조건 |
| Icodec | Dongguan HEC Biopharmaceutical R&D Co., Ltd. | 무색 액체 | 4℃ |
| Insulin-a3 | 무색 액체 | 4℃ | |
| Insulin-a10 | 무색 액체 | 4℃ |
(2) 샘플 구성
약리학적 실험에 사용된 다양한 인슐린 유사체 API는 PBS 완충액을 사용하여 원하는 농도로 제형화되었다.
(3) 실험 동물
| 종 | C57BL/6 마우스 |
| 수준 | SPF |
| 주문한 체중 범위 | 20-24g |
| 성별 | 수컷 |
| 공급처 | Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd |
| 공급처 주소 | 중국 후난 |
| 동물 식별 방법 | 마커로 꼬리에 마킹함 |
| 주문한 동물 수 | 350 |
| 이용한 동물 수 | 60 |
(4) 실험 방법
SPF 등급 C57BL/6 마우스를 사육 온도 20-26℃, 습도 40-70%, 주야간 시간 12h/12h의 장벽 환경에서 적합한 사육 상자에서 사육하였고, 마우스는 표준 식품과 오토클레이브된 멸균수에 자유롭게 접근할 수 있었다. 3일간의 격리 기간과 2일간의 적응 기간을 거친 후, 마우스를 12시간 동안 금식시키고, 스트렙토조토신 용액(STZ, 13mg/mL, 시트레이트 완충액)을 130mg/kg으로 복강 내 주사했다. 스트렙토조토신 투여 후 3일과 7일에 무작위 혈당과 공복 혈당을 검출하였고, 무작위 혈당값이 25mmol/L 초과, 공복 혈당값이 11.1mmol/L 초과인 경우 추적 관찰 실험을 위한 T1DM 모델 마우스로 선택하였다. 투여 전날, 무작위 혈당을 모니터링하고, 마우스를 칭량했다. 마우스를 무작위 혈당과 체중에 따라 6개 그룹으로 나누었다.
동물 분류 및 투여는 표 12에 제시되어 있다.
| 그룹 | 유형 | 수 | 용량 (nmol/Kg) | 투여 부피 (mL/Kg) | 약물 전달 방식 | 투여 빈도 |
| 모델 | C57 BL/6 | 7 | / | 10 | S.C. | 3회 |
| Icodec-250 | C57 BL/6 | 7 | 250 | 10 | S.C. | 3회 |
| Icodec-500 | C57 BL/6 | 7 | 500 | 10 | S.C. | 3회 |
| Icodec-1000 | C57 BL/6 | 7 | 1000 | 10 | S.C. | 3회 |
| HEC-Insulin-a3 | C57 BL/6 | 7 | 500 | 10 | S.C. | 3회 |
| HEC-Insulin-a10 | C57 BL/6 | 7 | 500 | 10 | S.C. | 3회 |
피하 투여(S.C.)를 사용하여 상응하는 비히클 또는 약물을 4-5일마다 1회씩 총 3회 투여하였다. 실험 동안 동물들은 자유롭게 먹고 물을 마실 수 있었다. 1차 투여 전, 및 투여 후 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 24, 48, 72 및 96 시간의 무작위 혈당을 평가하였고, 2차, 3차 및 4차 투여 전, 및 투여 후 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48, 72, 96 및 120시간의 무작위 혈당도 평가하였다.
모든 원시 데이터는 Excel 파일에 입력되었으며, 평균±SEM으로 표시되었다. 데이터의 통계적 분석은 Graphpad Prism 7.0 소프트웨어, 원-웨이 또는 투-웨이 ANOVA 비교 방법을 사용하여 수행되었으며, P<0.05를 유의미한 차이에 대한 기준으로 사용했다.
(5) 결과
구체적인 데이터는 표 13 및 도 3에 나와 있다.
| I형 당뇨병 마우스의 무작위 혈당에 대한 반복 투여의 효과(평균±SEM, n=7) | |||||||
| 그룹 | 시점 (일) | ||||||
| 0 (1차) |
1 |
4 (2차) |
5 |
9 (3차) |
10 |
14 |
|
| 모델 | 32.0±1.7 | 32.1±1.5 | 31.0±3.5 | 28.0±3.5 | 33.0±0.7 | 29.8±3.1 | 31.1±2.9 |
| Icodec-250 | 32.5±2.2 | 25.7±4.2 ** |
31.3±2.6 | 25.1±3.2 | 31.8±2.2 | 17.2±6.8 *** |
30.6±4.6 |
| Icodec-500 | 32.5±1.6 | 20.3±6.3*** | 30.6±2.6 | 19.5±5.8 ** |
27.0±7.1* | 15.9±6.0 *** |
33.0±0.9 |
| Icodec-1000 | 30.8±2.9 | 20.4±4.6*** | 31.6±2.1 | 12.8±5.4 *** |
29.7±3.7* | 10.1±6.4 *** |
27.7±4.6 |
| Insulin-a3 | 31.8±3.2 | 20.7±5.2*** | 29.7±3.7 | 20.1±5.4 ** |
27.7±6.2* | 16.0±9.4 ** |
27.4±6.3 |
| Insulin-a10 | 32.0±1.7 | 19.7±6.6*** | 27.6±4.4 | 15.2±8.9 ** |
26.6±5.7* | 11.7±9.4 *** |
26.1±6.2# |
| 주: 모델 대비 *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001. | |||||||
모델 그룹과 비교 시에, Icodec-250, 500, 1000 nmol/kg의 세 가지 용량의 혈당은 각 투여 24시간 후에 크게 감소하여 최저 수준에 도달한 후, 천천히 증가했다. 전체 실험 기간 동안, Icodec의 혈당 강하 효과와 유효 혈당 조절 시간은 용량-의존적 방식으로 나타났고, 즉, 용량이 높을수록 강하 효과가 강해지고, 혈당 조절 시간이 길어지는 것으로 나타났다. 1000 nmol/kg의 용량에서, 유효 혈당 조절 시간은 96시간에 도달할 수 있다.
모델군과 비교했을 때, Insulin-a3의 혈당은 각 투여 24시간 후에 크게 감소하여 최저 수준에 도달한 후, 천천히 증가하여 1차 및 2차 투여 후 96시간 후에 혈당이 정상 수준으로 돌아왔다. 투여 횟수가 증가함에 따라, Insulin-a3의 유효 혈당 조절 시간은 3차 투여 이후 연장되었으며, 투여 120시간 후에야 정상 수준에 도달했다. 동시에, Insulin-a10의 혈당은 각 투여 24시간 후에 크게 감소하여 최저 수준에 도달한 후, 서서히 증가했으며, 1차 투여 후 96시간 후에 혈당이 정상 수준으로 돌아왔고, 투여 횟수가 증가함에 따라, Insulin-a10의 유효 혈당 조절 시간은 2차 및 3차 투여 이후 연장되었으며, 투여 120시간 후에야 정상 수준에 도달했다. Icodec-1000 nmol/kg 그룹과 비교 시에, Insulin-a3의 혈당 조절 효과는 약간 떨어지나, Icodec-500 nmol/kg 그룹에 비해 우수하며, 유효 혈당 조절 시간은 96-120시간 동안 유지될 수 있었고; Insulin-a10의 혈당 조절 효과는 Icodec-1000 nmol/kg과 동일하며, 유효 혈당 조절 시간은 120시간 동안 유지된다.
결론적으로, Insulin-a3와 Insulin-a10은 Icodec의 2배 미만의 용량에서도 동일하거나 더 나은 혈당 강하 효과를 수득할 수 있다.
실시예 7: 래트의 정맥 주사에 대한 PK 테스트
(1) 테스트 제품
| 명칭 | 공급처 | 물리적 상태 | 보관 조건 |
| Insulin-a1 | Dongguan HEC Biopharmaceutical R&D Co., Ltd. | 무색 액체 | 4℃ |
| Insulin-a3 | 무색 액체 | 4℃ |
(2) 샘플 구성
약리학적 실험에 사용된 다양한 인슐린 유사체 API는 PBS 완충액을 사용하여 원하는 농도로 제형화되었다.
(3) 실험 동물
| 종 | SD 래트 |
| 수준 | SPF |
| 체중 범위 | 330-370g |
| 성별 | 수컷 |
| 공급처 | Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd |
| 공급처 주소 | 중국 후난 |
| 동물 식별 방법 | 마커로 꼬리의 베이스를 마킹함 |
| 이용한 동물 수 | 4 |
(4) 실험 방법
4마리의 수컷 SD 래트(그룹당 2마리)에게 10nmol/kg Insulin-α1 또는 Insulin-α3의 단일 정맥 내(i.v.) 용량을 투여하고, 혈액을 수집하고, 혈장을 투여 후 0.083, 0.25, 0.5, 1, 2, 5, 7, 24시간 후에서 원심분리하고, 혈장 중 Insulin-α1 또는 Insulin-α3의 농도를 LC-MS/MS 방법으로 검출하였다.
(5) 실험 결과
도 4 및 표 16의 결과는, Insulin-a1과 비교 시에 Insulin-a3의 AUClast 및 Cmax가 약간 높았음을 보여주며, 보다 높은 Cmax는, 혈장 결합이 더 높을 수 있음을 나타낸다. 또한, Insulin-a1과 Insulin-a3의 반감기는 각각 15.3±4.8시간 및 11.2±1.9시간이었다. 결론적으로, Insulin-a3 및 Insulin-a1은 래트의 PK에 대해 유사한 효과를 나타낸다.
| SD 래트의 생체내 I.V. PK 데이터 표 | ||||||
| 테스트 화합물 | Cmax(ng/mL) | AUClast(ng*h/mL) | T1/2 (h) | |||
| 평균 | SD | 평균 | SD | 평균 | SD | |
| Insulin-a1 | 1050 | 83 | 7550 | 660 | 15.3 | 4.8 |
| Insulin-a3 | 1230 | 99 | 9170 | 1100 | 11.2 | 1.9 |
실시예 8: 래트의 생체내 피하주사에 대한 PK 테스트
(1) 테스트 제품
| 명칭 | 공급처 | 물리적 상태 | 보관 조건 |
| Icodec | Dongguan HEC Biopharmaceutical R&D Co., Ltd. | 무색 액체 | 4℃ |
| Insulin-a1 | 무색 액체 | 4℃ | |
| Insulin-a10 | 무색 액체 | 4℃ |
(2) 샘플 구성
약리학적 실험에 사용된 다양한 인슐린 유사체 API는 PBS 완충액을 사용하여 원하는 농도로 제형화되었다.
(3) 실험 동물
| 종 | SD 래트 |
| 수준 | SPF |
| 체중 범위 | 220-340g |
| 성별 | 수컷 |
| 공급처 | Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd |
| 공급처 주소 | 중국 후난 |
| 동물 식별 방법 | 마커로 꼬리의 베이스를 마킹함 |
| 이용한 동물 수 | 9 |
(4) 실험 방법
9마리의 SD 래트(그룹당 3마리)에게 10 nmol/kg Insulin-α1, Insulin-α10 및 Icodec의 단일 피하(S.C.) 용량을 투여하고, 혈액을 수집하고, 혈장을 투여 후 1시간, 2시간, 5시간, 24시간, 31시간, 48시간, 72시간, 96시간 및 120시간에 원심분리하고, 혈장 중 Insulin-α1, Insulin-α3 및 Icodec의 농도를 검출했다.
(5) 실험 결과
도 5 및 표 19의 결과는, Icodec과 비교 시에 Insulin-a1과 Insulin-a10의 AUClast와 Cmax가 약간 높았음을 보여주며, 보다 높은 Cmax는, 혈장 결합이 더 높을 수 있음을 나타낸다. 또한, Insulin-a1과 Insulin-a10의 피하 반감기는 각각 21시간과 17.2시간이었다. 결론적으로, 래트에 대한 Insulin-a10의 PK 효과는 대조군 Icodec의 효과보다 우수하다.
| SD 래트의 피하 S.C. PK 데이터 표 | ||||||||
| 테스트 화합물 |
Cmax(ng/mL) | AUClast(ng*h/mL) | MRTINF_obs(h) | T1/2 (h) | ||||
| 평균 | SD | 평균 | SD | 평균 | SD | 평균 | SD | |
| Icodec | 183 | 34 | 6560 | 2500 | 30.5 | 4.4 | 16.7 | 1.3 |
| Insulin-a1 | 313 | 46 | 10300 | 1900 | 34.1 | 4.6 | 21 | 2.8 |
| Insulin-a10 | 280 | 14 | 9350 | 150 | 29.2 | 1.2 | 17.2 | 1.0 |
실시예 9: C57BL6 마우스에서의 피하 주사의 PK 테스트
(1) 테스트 제품
| 명칭 | 공급처 | 물리적 상태 | 보관 조건 |
| Insulin-a1 | Dongguan HEC Biopharmaceutical R&D Co., Ltd. | 무색 액체 | 4℃ |
| Insulin-a3 | 무색 액체 | 4℃ |
(2) 샘플 구성
약리학적 실험에 사용된 다양한 인슐린 유사체 API는 PBS 완충액을 사용하여 원하는 농도로 제형화되었다.
(3) 실험 동물
| 종 | C57BL6 마우스 |
| 수준 | SPF |
| 체중 범위 | 23-25g |
| 성별 | 수컷 |
| 공급처 | Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd |
| 공급처 주소 | 중국 후난 |
| 동물 식별 방법 | 마커로 꼬리의 베이스를 마킹함 |
| 이용한 동물 수 | 6 |
(4) 실험 방법
6마리의 C57 마우스(그룹당 3마리)에게 10nmol/kg Insulin-α1 또는 Insulin-α3의 단일 피하(S.C.) 용량을 투여하고 혈액을 수집하고 혈장을 투여 후 1시간, 2시간, 5시간, 24시간, 31시간, 55시간 및 72시간에 원심분리하고, 혈장 중 Insulin-a1 또는 Insulin-a3의 농도를 검출했다.
(5) 실험 결과
도 6 및 표 22의 결과는, Insulin-a1과 비교 시에 Insulin-a3의 AUClast 및 Cmax가 약간 더 높았으며, Cmax가 높을 수록 혈장 결합이 더 높을 수 있음을 나타내며, 인슐린 수용체 활성에 있어서 1.5% HAS를 첨가한 테스트에서는, Insulin-a3가 알부민 결합 효과가 더 우수하여 보다 긴 효능 지속 기간을 반영하는 것이 입증되었다. 또한, Insulin-a1과 Insulin-a3의 피하 반감기는 각각 14.3시간 및 18.6시간이었다. 결론적으로, 마우스에서 Insulin-α3의 PK 효과는 대조군 Insulin-α1의 효과보다 열등하지 않다.
| C57BL6 마우스의 피하 S.C. PK 데이터 표 | ||||||
| 테스트 화합물 | Cmax(ng/mL) | AUClast(ng*h/mL) | T1/2 (h) | |||
| 평균 | SD | 평균 | SD | 평균 | SD | |
| Insulin-a1 | 339 | 73 | 10000 | 1500 | 14.3 | 3.7 |
| Insulin-a3 | 385 | 39 | 12300 | 1600 | 18.6 | 3.1 |
실시예 10: 비글견의 PK 실험
(1) 테스트 제품
| 명칭 | 공급처 | 물리적 상태 | 보관 조건 |
| Icodec | Dongguan HEC Biopharmaceutical R&D Co., Ltd. | 무색 액체 | 4℃ |
| Insulin-a10 | 무색 액체 | 4℃ |
(2) 샘플 구성
약리학적 실험에 사용된 다양한 인슐린 유사체 API는 PBS 완충액을 사용하여 원하는 농도로 제형화되었다.
(3) 실험 동물
| 종 | 비글견 |
| 수준 | 일반 등급 |
| 체중 범위 | 9-11 kg |
| 성별 | 수컷 |
| 공급처 | Beijing Marshall Biotechnology Co., Ltd. |
| 공급처 주소 | 중국 베이징 |
| 동물 식별 방법 | 귀 넘버링 |
| 이용한 동물 수 | 2 |
(4) 실험 방법
비글견 2마리(각 그룹당 1마리)의 이중-사이클 교차 디자인을 사용하였고, 휴약 기간은 1주일로 하였으며, 10 nmol/kg의 단일 용량의 Icodec 또는 Insulin-a10을 각 사이클마다 뒷다리의 외측소복재정맥(lateral small saphenous vein)에 투여하고, 혈액을 수집하고, 투여 후 0.083, 0.25, 0.5, 1, 2, 6, 8, 24, 30, 48, 72 및 96시간에 혈장을 원심분리하고, 혈장 중 Icodec 또는 Insulin-a10의 농도를 검출했다.
(5) 실험 결과
| 비글견의 I.V. PK 데이터 표 | |||
| 테스트 화합물 | Cmax(ng/mL) | AUClast(ng*h/mL) | T1/2 (h) |
| Icodec | 1240±170 | 35700±120 | 35.7±6.7 |
| Insulin-a10 | 1170±14 | 28300±3500 | 46±10.8 |
표 25 및 도 7의 결과는, Icodec과 비교 시에 Insulin-a10의 Cmax가 대등하고, AUClast가 약간 더 낮았던 반면, Insulin-a10의 반감기는 46 ± 10.8시간으로, 이는 35.7 ± 6.7 시간의 Icodec보다 상당히 더 길었음을 보여주었다. 결론적으로, 비글의 Insulin-a10의 Cmax는 Icodec의 Cmax와 대등하고, 반감기는 더 길다는 것을 알 수 있다.
본 명세서 전반에 걸쳐 "실시양태", "일부 실시양태", "일 실시양태", "다른 예", "예", "특정 예" 또는 "일부 예"에 대한 언급은 실시양태 또는 예와 관련되어 기재된 특정 특징, 구조, 물질, 또는 특성은 본 발명의 적어도 하나의 실시양태 또는 예에 포함된다. 따라서, 본 명세서 전반에 걸쳐 다양한 곳에서 "일부 실시양태에서", "일 실시양태에서", "실시양태에서", "다른 예에서", "예에서", "특정 예에서" 또는 "일부 예에서"와 같은 문구의 기재는 반드시 본 발명의 동일한 실시양태 또는 예를 언급하는 것은 아니다. 또한, 특정 특징, 구조, 물질 또는 특성은 하나 이상의 실시양태 또는 예에서 임의의 적절한 방식으로 조합될 수 있다. 또한, 당업자는, 서로 상충되지 않는 한, 상이한 실시양태, 예 또는 이들의 특징을 통합 및 조합할 수 있다.
예시적인 실시양태가 언급되고 설명되었지만, 상기 실시양태가 본 발명을 한정하는 것으로 해석될 수 없으며, 본 발명의 사상, 원리 및 범위를 벗어남이 없이 변경, 대체 및 변형이 실시양태에서 이루어질 수 있음을 당업자는 이해할 것이다.
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<110> Sunshine Lake Pharma Co., Ltd.
<120> Insulin analog
<130> 2022
<140> PCT/CN2022/094392
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<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 1
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 2
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 2
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Glu
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 3
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 3
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu His
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Thr Pro Lys
20 25
Claims (18)
- 하기 화학식 (I)에 나타낸 구조를 갖는 신규한 측쇄 화합물:
W-X-Y-Z-R (I)
상기 식에서,
W는 10 내지 20개의 탄소 원자를 갖는 지방산 또는 지방 이산이고, 상기 구조는 -CO(CH2)nCOOH이고, n은 10 내지 20의 정수이고;
X는 카복실산기를 함유하는 디아미노 화합물이고, 이때 상기 카복실산기를 연결하는 탄소 원자는 키랄 탄소 또는 비키랄(achiral) 탄소일 수 있고, X는 하기 화학식 (a1), (a2) 또는 (a3)에 나타낸 구조를 갖고:
[상기 식에서, s는 2 내지 20, 바람직하게는 2 내지 10, 더 바람직하게는 2 내지 8의 정수임],
X의 아미노기 중 하나는 W의 아실기 중 하나와 연결되어 아미드 결합을 형성하고;
Y는 -A(CH2)mB-이고, 이때 m은 1 내지 10의 정수, 바람직하게는 1 내지 6의 정수이고, A 및 B는 부재하거나 -CO-이고;
Z는 -(OEG)p이고, p는 1 내지 3의 정수, 바람직하게는 2이고, 상기 OEG 구조는이고;
R은 이탈기, 바람직하게는 활성화된 에스테르기이고;
W, X, Y 및 Z 사이의 연결기는 아미드 펩티드 결합 또는 펩티드 결합이다. - 하기 화학식 (I)에 나타낸 구조를 갖는 신규한 측쇄 화합물:
W-X-Y-Z-R (I)
상기 식에서,
W는 10 내지 20개의 탄소 원자를 갖는 지방산 또는 지방 이산이고, 그 구조는 -CO(CH2)nCOOH이고, n은 10 내지 20의 정수이고;
X는 카복실산기를 함유하는 디아미노 화합물이고, 이때 상기 카복실산기를 연결하는 탄소 원자는 키랄 탄소 또는 비키랄 탄소일 수 있고, X는 하기 화학식 (a1), (a2) 또는 (a3)에 나타낸 구조를 갖고:
[상기 식에서, s는 2 내지 20, 바람직하게는 2 내지 10, 더 바람직하게는 2 내지 8의 정수임],
X의 아미노기 중 하나는 W의 아실기 중 하나와 연결되어 아미드 결합을 형성하고;
Y는 -A(CH2)mB-이고, 이때 m은 1 내지 10의 정수, 바람직하게는 1 내지 6의 정수이고, A 및 B는 부재하거나 -CO-이고;
Z는 -(OEG)p이고, p는 4 내지 30의 정수이고, 상기 OEG 구조는이고;
R은 이탈기, 바람직하게는 활성화된 에스테르기이고;
W, X, Y 및 Z 사이의 연결기는 아미드 펩티드 결합 또는 펩티드 결합이다. - 제1항에 있어서,
하기 구조식을 갖는 화합물:
상기 식에서,
n은 14 내지 20의 정수이고, s는 2 내지 4의 정수이고, m은 1 내지 4의 정수이고, p는 2이고,
R은 하기 기로부터 선택되고:
바람직하게는, n은 16 내지 18의 정수이고, s는 2 내지 4의 정수이고, m은 2이고, p는 2이고,
바람직하게는, R은이다.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
하기 화합물 중 어느 하나로부터 선택되고:
[상기 식에서, R은임],
바람직하게는, 하기 구조식 중 어느 하나를 갖고:
더욱 바람직하게는, 하기 구조식 중 어느 하나를 갖는, 화합물:
.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 측쇄 화합물과 인간 인슐린 유사체(analog) 사이의 아실화 반응에 의해 수득되며, 하기 화학식 (II)에 나타낸 구조를 갖는 신규한 아실화된 인슐린 유사체:
W-X-Y-Z-M (II)
상기 식에서,
W는 10 내지 20개의 탄소 원자를 갖는 지방산 또는 지방 이산이고, 상기 구조는 -CO(CH2)nCOOH이고, n은 10 내지 20의 정수이고;
X는 카복실산기를 함유하는 디아미노 화합물이고, 이때 상기 카복실산기를 연결하는 탄소 원자는 키랄 탄소 또는 비키랄 탄소일 수 있고, X는 하기 화학식 (a1), (a2) 또는 (a3)에 나타낸 구조를 갖고:
[상기 식에서, s는 2 내지 20, 바람직하게는 2 내지 10, 더 바람직하게는 2 내지 8의 정수임],
X의 아미노기 중 하나는 W의 아실기 중 하나와 연결되어 아미드 결합을 형성하고;
Y는 -A(CH2)mB-이고, 이때 m은 1 내지 10의 정수, 바람직하게는 1 내지 6의 정수이고, A 및 B는 부재하거나 -CO-이고;
Z는 -(OEG)p이고, p는 1 내지 3의 정수, 바람직하게는 2이고, 상기 OEG 구조는이고;
W, X, Y 및 Z 사이의 연결기는 아미드 결합 또는 펩티드 결합이고;
M은 인간 인슐린 유사체이다. - 제5항에 있어서,
상기 측쇄 화합물이 하기 구조를 갖고:
바람직하게는, 상기 측쇄 화합물이 하기 구조를 갖는, 아실화된 인슐린 유사체:
상기 식에서,
n은 14 내지 20의 정수이고, s는 2 내지 8의 정수이고, m은 1 내지 6의 정수이고, p는 1 내지 3의 정수이다. - 제5항에 있어서,
상기 인간 인슐린 유사체 M이 A쇄 및 B쇄를 갖고, 상기 A쇄의 아미노산 서열은 서열 번호 1에 표시된 것이고, 상기 B쇄의 아미노산 서열은 서열 번호 2 또는 서열 번호 3에 표시된 것이고, 상기 인간 인슐린 유사체는 B29 위치의 라이신 잔기의 ε 질소를 통해 아미드 결합으로 상기 측쇄 화합물과 연결되는, 아실화된 인슐린 유사체. - 제4항에 있어서,
하기 구조를 갖는 아실화된 인슐린 유사체:
A14E, B16E, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)nCO-NHC(COOH)(CH2)SCH2NH-CO(CH2)mCO-(OEG)p), desB30 인간 인슐린 유사체, 또는
A14E, B16H, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)nCO-NHC(COOH)(CH2)SCH2NH-CO(CH2)mCO-(OEG)p), desB30 인간 인슐린 유사체
상기 구조에서,
n은 14 내지 20의 정수이고, s는 2 내지 8의 정수이고, m은 1 내지 6의 정수이고, p는 2이다. - 제4항에 있어서,
하기 구조를 갖는 아실화된 인슐린 유사체:
A14E, B16E, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)nCO-NHC(COOH)(CH2)SCH2NH-CO(CH2)mCO-(OEG)p), desB30 인간 인슐린 유사체, 또는
A14E, B16H, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)nCO-NHC(COOH)(CH2)SCH2NH-CO(CH2)mCO-(OEG)p), desB30 인간 인슐린 유사체
상기 구조에서,
n은 14 내지 18의 정수이고, s는 3 내지 4의 정수이고, m은 2 내지 4의 정수이고, p는 2이다. - 제6항에 있어서,
하기 화합물 중 어느 하나로부터 선택되고:
A14E, B16E, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)18CO-Lys-CO(CH2)2CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체,
A14E, B16E, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)18CO-L-Lys-CO(CH2)2CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체,
A14E, B16E, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)18CO-D-Lys-CO(CH2)2CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체,
A14E, B16E, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)16CO-Lys-CO(CH2)2CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체,
A14E, B16E, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)16CO-D-Lys-CO(CH2)2CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체,
A14E, B16E, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)16CO-L-Lys-CO(CH2)2CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체,
A14E, B16E, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)14CO-Lys-CO(CH2)2CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체,
A14E, B16E, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)14CO-D-Lys-CO(CH2)2CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체,
A14E, B16E, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)14CO-L-Lys-CO(CH2)2CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체,
A14E, B16E, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)18CO-L-Dab-CO(CH2)2CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체,
A14E, B16E, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)16CO-L-Dab-CO(CH2)2CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체,
A14E, B16E, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)14CO-L-Dab-CO(CH2)2CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체,
A14E, B16E, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)18CO-L-Lys-CO(CH2)3CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체,
A14E, B16E, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)16CO-L-Lys-CO(CH2)3CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체,
A14E, B16E, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)18CO-L-Dab-CO(CH2)3CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체,
A14E, B16E, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)18CO-L-Lys-CO(CH2)4CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체,
A14E, B16E, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)18CO-L-Dab-CO(CH2)4CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체,
A14E, B16E, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)16CO-L-Dab-CO(CH2)4CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체,
A14E, B16H, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)18CO-Lys-CO(CH2)2CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체,
A14E, B16H, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)18CO-L-Lys-CO(CH2)2CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체,
A14E, B16H, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)18CO-D-Lys-CO(CH2)2CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체,
A14E, B16H, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)16CO-Lys-CO(CH2)2CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체,
A14E, B16H, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)16CO-D-Lys-CO(CH2)2CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체,
A14E, B16H, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)16CO-L-Lys-CO(CH2)2CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체,
A14E, B16H, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)14CO-Lys-CO(CH2)2CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체,
A14E, B16H, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)14CO-D-Lys-CO(CH2)2CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체,
A14E, B16H, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)14CO-L-Lys-CO(CH2)2CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체,
A14E, B16H, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)18CO-L-Dab-CO(CH2)2CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체,
A14E, B16H, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)16CO-L-Dab-CO(CH2)2CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체,
A14E, B16E, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)14CO-L-Dab-CO(CH2)2CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체,
A14E, B16H, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)18CO-L-Lys-CO(CH2)3CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체,
A14E, B16H, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)16CO-L-Lys-CO(CH2)3CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체,
A14E, B16H, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)18CO-L-Dab-CO(CH2)3CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체,
A14E, B16H, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)18CO-L-Lys-CO(CH2)4CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체,
A14E, B16H, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)18CO-L-Dab-CO(CH2)4CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체,
A14E, B16H, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)16CO-L-Dab-CO(CH2)4CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체;
바람직하게는, 하기 화합물 중 어느 하나로부터 선택되고:
A14E, B16E, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)18CO-Lys-CO(CH2)2CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체,
A14E, B16E, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)18CO-L-Lys-CO(CH2)2CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체,
A14E, B16H, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)18CO-Lys-CO(CH2)2CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체;
A14E, B16H, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)18CO-L-Lys-CO(CH2)2CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체;
보다 바람직하게는, 하기 화합물 중 어느 하나로부터 선택되는, 아실화된 인슐린 유사체:
A14E, B16E, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)18CO-L-Lys-CO(CH2)2CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체,
A14E, B16H, B25H, B29K(N(ε)-COOH(CH2)18CO-L-Lys-CO(CH2)2CO-(OEG)2), desB30 인간 인슐린 유사체. - 제1항 내지 제4항의 측쇄 화합물 및 제5항 내지 제10항의 아실화된 인슐린 유사체를 포함하는 약학 조성물.
- 대상체(subject)의 당뇨병을 치료 또는 예방하기 위한 약제의 제조에서의, 제1항 내지 제3항의 측쇄 화합물, 제10항의 아실화된 인슐린 유사체 및 제11항의 약학 조성물의 용도로서, 상기 당뇨병은 I형 및 II형 당뇨병을 의미하는, 용도.
- 제12항에 있어서,
상기 화합물, 아실화된 인슐린 유사체 및 약학 조성물이 주 2회, 주 1회 또는 그보다 덜 빈번하게 투여되는, 용도. - 치료 유효량의 제1항 내지 제4항의 측쇄 화합물, 제5항 내지 제10항의 아실화된 인슐린 유사체 및 제11항의 약학 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체의 당뇨병을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 상기 당뇨병은 I형 및 II형 당뇨병을 의미하는, 방법.
- 제14항에 있어서,
상기 화합물, 아실화된 인슐린 유사체 및 약학 조성물이 주 2회, 주 1회 또는 그보다 덜 빈번하게 투여되는, 방법. - 대상체의 당뇨병을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 제1항 내지 제4항의 측쇄 화합물, 제5항 내지 제10항의 아실화된 인슐린 유사체 및 제11항의 약학 조성물로서, 상기 당뇨병은 I형 및 II형 당뇨병을 의미하는, 측쇄 화합물, 아실화된 인슐린 유사체 및 약학 조성물.
- 제16항에 있어서,
상기 화합물, 아실화된 인슐린 유사체 및 약학 조성물이 주 2회, 주 1회 또는 그보다 덜 빈번하게 투여되는, 측쇄 화합물, 아실화된 인슐린 유사체 및 약학 조성물. - 제1항의 화학식 (I)의 측쇄 화합물과 인간 인슐린 유사체를 사용하여 아실화 반응을 수행하는 단계
를 포함하는 제5항의 화학식 (II)의 신규한 아실화된 인슐린 유사체를 제조하는 방법으로서,
이때, 상기 인간 인슐린 유사체는 A쇄 및 B쇄를 갖고, 상기 A쇄의 아미노산 서열은 서열 번호 1에 표시된 것이고, 상기 B쇄의 아미노산 서열은 서열 번호 2 또는 서열 번호 3에 표시된 것인, 방법.
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