MX2012014641A - Derivados de insulina que contienen enlaces disulfuro adicionales. - Google Patents

Abstract

La presente invención se relaciona con derivados de insulina que contienen enlaces disulfuro adicionales y métodos para su elaboración.

Description

DERIVADOS DE INSULINA QUE CONTIENEN ENLACES DISULFURO ADICIONALES CAMPO DE LA INVENCION La. presente invención se relaciona con derivados de insulina que contiene enlaces disulfuro adicionales y métodos para su elaboración.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION La diabetes mellitus es un trastorno metabólico en el cual la capacidad de utilizar glucosa se pierde parcial o completamente. En el tratamiento de diabetes mellitus se han sugerido y utilizado muchas variedades de formulaciones de insulina, tales como insulina regular, insulina isofano (denominado NPH) , suspensiones de zinc e insulina (tales como SemilenteMR, LenteMR y UltralenteMR) , e insulina de isofano bifásic .

La insulina humana consiste de dos cadenas polipeptídicas , las cadenas A y B las cuales contienen 21 y 30 residuos aminoácidos, respectivamente. Las cadenas A y B están interconectadas por dos puentes disulfuro. La insulina de la mayor parte de las otras especies es similar pero puede contener sustituciones de aminoácidos en algunas posiciones. Dentro de la última década se han desarrollado numerosos análogos de insulina humana. Se han diseñado para perfiles de acción particulares, es decir, acción rápida o acción REF.237436 prolongada. Los productos disponibles comercialmente que comprenden tales análogos de insulina incluyen LevemirMR, NovoRapidMR, HumalogMR, ApidraMR y LantusMR.

La insulina humana se degrada rápidamente en el lumen del tracto gastrointestinal por la acción de múltiples proteasas lo que limita su absorción a la circulación. Los análogos de insulina que son hidrofílicos y estabilizados contra la degradación proteolítica muestran mayor biodisponibilidad de modelos en animales cuando se comparan con la insulina nativa.

La incorporación de enlaces disulfuro en proteínas es una de las maneras naturales de mejorar la estabilidad de la proteína; se ha encontrado una correlación entre la abundancia de enlaces disulfuro y la temperatura máxima de crecimiento entre organismos termofílieos , lo que implica la importancia de enlaces disulfuro en estabilización de proteína en un ambiente de alta temperatura (Mallick P, et al, 2002, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 99, 9679-9684; Ladenstein R, et al, 2006, FEBS J., 273, 4170-4185). También existen muchos ejemplos de enlaces disulfuro que son manipulados exitosamente en proteínas con incrementos concomitantes en la estabilidad. Una de las mayores estabilizaciones se obtiene para la ribonucleasa barnasa (Clarke J. , Fersht A., 1993, Biochem., 32, 4322-4329). Esta estabilización se lleva a cabo al incrementar la energía de activación que se requiere para desplegado o al limitar las conformaciones desplegadas de la proteína y por lo tanto disminuir su entropía conformacional (Pace C.N., 1990, Trends Biol. Sci., 14-17) . No obstante, deben aprenderse muchas más necesidades en esta área de investigación que surge. Hasta ahora, no ha habido informes de enlaces disulfuro manipulados en insulina.

Aún existe la necesidad por derivados novedosos de insulina que sean estables.

SUMARIO DE LA INVENCION La presente invención se relaciona con derivados de insulina que tienen dos o más sustituciones cisteína y una cadena lateral unida a la insulina, en donde los tres enlaces disulfuro de insulina humana son retenidos y los sitios de sustituciones cisteína se seleccionan de manera que introducen residuos cisteína que son colocados en la estructura tridimensional del derivado de insulina plegado para permitir la formación de uno o más enlaces disulfuro adicionales no presentes en la insulina humana.

En un aspecto, se obtiene un derivado de insulina de la invención en donde los sitios de sustituciones de cisteína se seleccionan de manera que: (1) los residuos cisteína introducidos se colocan en la estructura tridimensional del derivado de insulina plegado para permitir la formación de uno o más enlaces disulfuro adicionales no presentes en la insulina humana, y (2) el derivado de insulina retiene las actividades biológicas deseadas asociadas con insulina humana.

En un aspecto, se obtienen un derivado de insulina de la invención en donde los sitios de sustituciones de cisteína se seleccionan de manera que: (1) los residuos cisteína introducidos se colocan en la estructura tridimensional del derivado de insulina plegado para permitir la formación de uno o más enlaces disulfuro adicionales no presentes en la insulina humana, (2) el derivado de insulina retiene las actividades biológicas deseadas asociadas con insulina humana, y (3) el derivado de insulina tiene estabilidad física aumentada en relación a la insulina humana y/o al derivado de insulina sin uno o más enlaces disulfuro adicionales.

En un aspecto se obtiene un derivado de insulina de la invención en donde los sitios de sustituciones cisteína se seleccionan de manera que: (1) los residuos cisteína introducidos se colocan en la estructura tridimensional del derivado de insulina plegado para permitir la formación de uno o más enlaces disulfuro adicionales no presentes en la insulina humana, (2) el derivado de insulina retiene las actividades biológicas deseadas asociadas con insulina humana, y (3) el derivado de insulina se estabiliza contra la degradación proteolítica .

En la presente también se describe un método para estabilizar un derivado de insulina que comprende sustituir dos o más aminoácidos de una insulina con residuos cisteína y unir una cadena lateral a la insulina, en donde a. se retienen los tres enlaces disulfuro de insulina humana, y b. los sitios de sustituciones de cisteína se seleccionan de manera tal que los residuos cisteína introducidos se colocan en la estructura tridimensional del derivado de insulina plegado para permitir la formación de uno o más enlaces disulfuro adicionales no presentes en la insulina humana, por lo que se genera un derivado de insulina que comprende uno o más enlaces disulfuro adicionales no presentes en la insulina humana.

BREVES DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Figura 1: Comparación de perfiles PK i.v. en ratas del derivado del ejemplo 1 comparado con el derivado similar sin el enlace disulfuro adicional. Una cantidad de 2 nmoles/kg de análogo de insulina dosificado intravenosamente a ratas .

Figura 2: Comparación de perfiles PK i.v. en perros del derivado del ejemplo 1 comparado con el derivado similar sin el enlace disulfuro adicional. Una cantidad de 2 nmoles/kg de análogo de insulina dosificado intravenosamente a perros .

Figura 3: Datos de calorimetría de exploración diferencial (DSC, por sus siglas en inglés) de derivados de insulina de la invención. Exploración DSC del derivado de insulina de la invención comparado con un derivado de la técnica anterior sin un enlace disulfuro adicional.

Figura 4: Datos de calorimetría de exploración diferencial (DSC, por sus siglas en inglés) de análogos de insulina originales. Exploración de DSC de análogos de insulina originales de la invención y de insulina humana (0.2 mM y libre de zinc) .

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION En la presente invención muestran derivados de insulina novedosos en donde los enlaces disulfuro se han manipulado en los derivados de insulina.

Un aspecto de un derivado de insulina de acuerdo con la invención tiene dos o más sustituciones cisteína y se retienen los tres enlaces disulfuro de la insulina humana.

En un aspecto, un derivado de insulina de la invención tiene una cadena lateral. En un aspecto la cadena lateral se une al grupo amino epsilón de un residuo lisina. En un aspecto la cadena lateral se une a un grupo amino epsilón de un residuo lisina en la cadena B.

En un aspecto, un derivado de insulina de acuerdo con la invención tiene dos o más sustituciones cisteína, los tres enlaces disulfuro de insulina humana retienen y una cadena lateral la cual se une al grupo amino epsilón de un residuo lisina tal como en la cadena B.

En un aspecto de la invención, los sitios de sustituciones de cistelna se seleccionan de manera tal que los residuos cisteína introducidos se colocan en la estructura tridimensional del derivado de insulina plegado para permitir la formación de uno o más enlaces disulfuro adicionales no presentes en la insulina humana.

Los inventores han encontrado que los derivados de insulina de acuerdo con la invención presentan estabilidad física mejorada. También se ha encontrado que la tendencia de los derivados de insulina de acuerdo con la invención a formar agregados biológicamente inactivos y/o insolubles de los análogos de insulina se reduce, por ejemplo, como resultado de exposición de los análogos a tensiones termomecánicas y/o interacción con interfases y superficies que son desestabilizantes, tales como superficies e interfases hidrofóbicas .

Los derivados de insulina humana de acuerdo con la invención se unen al receptor de insulina. Se ha encontrado sorprendentemente por los inventores que los derivados de insulina humana de acuerdo con la invención tienen tanto estabilidad física mejorada como retención de unión al receptor de insulina.

En un aspecto, los derivados de insulina de acuerdo con la invención, es decir, que contienen uno o más enlaces disulfuro adicionales están más prolongados que los derivados de insulina similares sin uno o más enlaces disulfuro adicionales. Mediante el término "más prolongado" en la presente se quiere indicar que tienen una vida media de eliminación más prolongada o, en otras palabras, un efecto de insulina por un período extendido, es decir, una duración de acción más prolongada. Se ha encontrado sorprendentemente por los inventores que los derivados de insulina que comprenden uno o más enlaces disulfuro pueden tener una vida media de eliminación prolongada o, en otras palabras, un efecto de insulina por un período extendido, o una duración de acción prolongada en comparación con derivados de insulina similares sin uno o más enlaces disulfuro adicionales.

En un aspecto, los derivados de insulina de la invención se estabilizan contra degradación proteolítica, es decir, contra degradación rápida en el tracto gastrointestinal (GI) o en otra parte en el cuerpo. En un aspecto, los derivados de insulina de la invención son estabilizados contra degradación proteolítica en relación al derivado de insulina sin uno o más enlaces disulfuro adicionales .

Un derivado de insulina el cual es estabilizado contra degradación proteolítica en la presente debe entenderse como un derivado de insulina el cual se somete a una degradación más lenta por una o más proteasas en relación a la insulina humana. En una modalidad, un derivado de insulina de acuerdo con la invención se somete a una degradación más lenta por una o más proteasas en relación a la insulina humana. En una modalidad adicional de la invención un derivado de insulina de acuerdo con la invención es estabilizado contra la degradación por una o más enzimas que se seleccionan del grupo que consiste de: pepsina (tales como, por ejemplo, las isoformas pepsina A, pepsina B, pepsina C y/o pepsina F) , quimiotripsina (tal como, por ejemplo, las isoformas quimiotripsina A, quimiotripsina B y/o quimiotripsina C) , tripsina, enzima degradante de insulina (IDE, por sus siglas en inglés) , elastasa (tales como, por ejemplo, las isoformas de elastasa o pancreática I y/o II) , carboxipeptidasa (por ejemplo, las isoformas carboxipeptidasa A, carboxipeptidasa A2 y/o carboxipeptidasa B) , aminopeptidasa, catepsina D y otras enzimas presentes en los extractos intestinales derivados de rata, cerdo o humano.

En una modalidad un derivado de insulina de acuerdo con la invención se estabiliza contra degradación por una o más enzimas que se seleccionan del grupo que consiste de: quimiotripsina, tripsina, enzima degradante de insulina (IDE, por sus siglas en inglés), elastasa, carboxipeptidasas , aminopeptidasas y catepsina D. En una modalidad adicional, un derivado de insulina de acuerdo con la invención se estabiliza contra degradación por una o más enzimas que se seleccionan del grupo que consiste de: quimiotripsina, carboxipeptidasas e IDE. En una modalidad adicional, un derivado de insulina de acuerdo con la invención se estabiliza contra la degradación por una o más enzimas que se seleccionan de: quimiotripsina e IDE. En una modalidad adicional, un derivado de insulina de acuerdo con la invención se estabiliza contra la degradación por una o más enzimas que se seleccionan de: quimiotripsina y carboxipeptidasas .

Una "proteasa" o una "enzima proteasa" es una enzima digestiva la cual degrada proteínas y péptidos y la cual se encuentra en diversos tejidos del cuerpo humano tales como, por ejemplo, el estómago (pepsina) , el lumen intestinal (quimiotripsina, tripsina, elastasa, carboxipeptidasas, etc.) o superficies de la mucosa del tracto GI (aminopeptidasas , carboxipeptidasas, enteropeptidasas , dipeptidil peptidasas, endopeptidasas , etc.), el hígado (enzima degradante de insulina, catepsina D, etc.), y en otros tejidos.

Se puede determinar T½ como se describe en el Ejemplo 102 como una medida de la estabilidad proteolítica de un derivado de insulina de acuerdo con la invención hacia enzimas proteasa tales como quimiotripsina, pepsina y carboxipeptidasa A o hacia una mezcla de enzimas tales como extractos de tejido (de hígado, riñon, duodeno, yeyuno, íleon, colon, estómago, etc.). En una modalidad de la invención se incrementa T½ en relación a la insulina humana. En una modalidad adicional T½ se incrementa en relación al derivado de insulina sin uno o más enlaces disulfuro adicionales. En una modalidad adicional T¾ se incrementa por lo menos 2 veces en relación a insulina humana. En una modalidad adicional T¾ se incrementa por lo menos dos veces en relación al derivado de insulina sin uno o más enlaces disulfuro adicionales. En una modalidad adicional, T¾ se incrementa por lo menos 3 veces en relación a insulina humana. En una modalidad adicional TM se incrementa por lo menos 3 veces en relación al derivado de insulina humana sin uno o más enlaces disulfuro adicionales. En una modalidad adicional T½ se incrementa por lo menos 4 veces en relación a la insulina humana. En una modalidad adicional T¾ se incrementa por lo menos 4 veces en relación al derivado de insulina sin uno o más enlaces disulfuro adicionales. En una modalidad adicional M se incrementa por lo menos 5 veces en relación a la insulina humana. En una modalidad adicional T½ se incrementa por lo menos 5 veces en relación al derivado de insulina humana sin uno o más enlaces disulfuro adicionales. En una modalidad adicional T½ se incrementa por lo menos 10 veces en relación a la insulina humana. En una modalidad adicional T½ se incrementa por lo menos 10 veces en relación al derivado de insulina humana sin uno o más enlaces disulfuro adicionales.

En un aspecto, un derivado de insulina de acuerdo con la invención tiene estabilidad química mejorada. En un aspecto, un derivado de insulina de acuerdo con la invención tiene estabilidad física mejorada. En un aspecto, un derivado de insulina de acuerdo con la invención tiene estabilidad química y física mejoradas.

En un aspecto, un derivado de insulina de acuerdo con la invención tiene estabilidad química y/o física mejorada en relación a la insulina humana. En un aspecto, un derivado de insulina de acuerdo con la invención tiene estabilidad química y/o física mejoradas en relación al derivado de insulina sin uno o más enlaces disulfuro adicionales.

El término "estabilidad física", como se utiliza en la presente, se refiere a la tendencia del derivado de insulina a formar agregados biológicamente inactivos y/o insolubles de la proteína como resultado de la exposición de la proteína a tensiones termomecánicas y/o interacción con interfases y superficies que son desestabilizantes, tales como superficies e interfases hidrofóbicas . La inestabilidad física por lo tanto involucra cambios conformacionales en relación a la insulina humana los cuales incluyen pérdida de estructura de orden superior, agregación, fibrilación, precipitación y/o adsorción a superficies. Los péptidos tales como insulina se sabe que son susceptibles a inestabilidad debido, por ejemplo, a fibrilación. La estabilidad física de una solución que comprende el derivado de insulina se puede evaluar por medios convencionales, por ejemplo, inspección visual, nefelometría y/o mediciones de turbidez después de exposición de la solución rellenada en recipientes adecuados (por ejemplo, cartuchos o frascos) a tensiones mecánicas/físicas (por ejemplo, agitación) a temperaturas diferentes durante diversos períodos de tiempo. La inspección visual de la solución se realiza con una luz de enfoque angosto con un fondo oscuro. La turbidez de la solución se caracteriza por una calificación visual que clasifica el grado de turbidez, por ejemplo, en una escala de 0 a 3 (una solución que no muestra turbidez corresponde a una calificación visual de 0 y una solución que muestra turbidez visual con luz diurna corresponde a una calificación visual de 3) . Una solución se clasifica como inestable físicamente con respecto a la proteína de agregación, cuando muestra una turbidez visual con luz diurna. De manera alternativa, la turbidez de la solución se puede evaluar mediante mediciones de turbidez sencillas bien conocidas por las personas expertas. La estabilidad física del derivado de insulina también se puede evaluar mediante el uso de un agente espectroscópico o sonda del estado conformacional del derivado de insulina. La sonda preferiblemente es una molécula pequeña que de modo preferencial se une a un confórmero no nativo de la proteína. Un ejemplo de una sonda espectroscópica molecular de estructura de proteína es tioflavina T La tioflavina T es un colorante fluorescente que ha sido utilizado ampliamente para la detección de fibrillas amiloides. En presencia de fibrillas y posiblemente otras configuraciones proteínicas también, la tioflavina T genera un máxima de excitación nuevo en aproximadamente 450 nm y una emisión aumentada en aproximadamente 482 nm cuando se une a una forma de proteína de fibrilla. La tioflavina T no unida es esencialmente no fluorescente a las longitudes de onda. La estabilidad física de los derivados de insulina de la invención se puede determinar, por ejemplo, como se describe en el ejemplo 109.

Otras moléculas pequeñas pueden ser utilizadas como sondas de los cambios en la estructura de proteína de los estados nativo a no nativo. Por ejemplo, las sondas de "parche hidrofóbico" que se unen preferencialmente a parches hidrofóbicos expuestos de una proteína. Los parches hidrofóbicos generalmente están enterrados dentro de la estructura terciaria de una proteína en su estado nativo pero quedan expuestos conforme la proteína comienza a desplegarse o desnaturalizarse. Los ejemplos de tales sondas espectroscópicas moleculares pequeñas, colorantes hidrofóbicos tales como antraceno, acridina, fenantrolina o similares. Otras sondas espectroscópicas son complejos de metal-aminoácido tal como complejos de cobalto metálico de aminoácidos hidrofóbicos tales como fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina y valina o similares.

El término "estabilidad química" del derivado de insulina, como se utiliza en la presente se refiere a cambios covalentes químicos en la estructura de la proteína que llevan a la formación de productos de degradación química con potencia biológica potencialmente menor y/o propiedades inmunogénicas aumentadas potencialmente en comparación con la estructura de proteína nativa e involucra evitar la degradación de enlaces covalentes, tales como hidrólisis, racemización, oxidación o reticulado. Se pueden formar diversos productos de degradación química dependiendo del tipo y naturaleza de la proteína nativa y del ambiente en el cual se expone el derivado de insulina. La eliminación de degradación química muy probablemente puede no evitarse por completo e incrementar las cantidades de productos de degradación química con frecuencia se observa durante el almacenamiento y uso de la formulación de proteína como es bien sabido por las personas expertas en el ámbito. La mayor parte de las proteínas son susceptibles a desamidación, proceso en el cual el grupo amida de cadena lateral en residuos glutamina o asparagina es hidrolizado para formar un ácido carboxílico libre. Los residuos de asparagina y ácido aspártico pueden formar adicionalmente producto de degradación isoAsp. Otras vías de degradación involucran la formación de productos de transformación de peso molecular alto en donde dos o más moléculas proteínicas se unen covalentemente entre sí mediante transamidación y/o interacciones disulfuro lo que genera la formación de productos de degradación diméricos, oligoméricos o poliméricos unidos covalentemente (Stability of Protein Pharmaceuticals, Ahern. T.J. & Manning M.C., Plenu Press, New York 1992) . La oxidación (por ejemplo, de residuos metionina) y la racemización se puede mencionar como otra variante de degradación química. La estabilidad química del derivado de insulina se puede evaluar al medir la cantidad de los productos de degradación química en diversos puntos en el tiempo después de exposición a diferentes condiciones ambientales (la formación de productos de degradación con frecuencia puede ser acelerada, por ejemplo, incrementado la temperatura) . Los productos de degradación individuales con frecuencia se determinan por separación de los productos de degradación dependiendo del tamaño y/o carga de la molécula, por ejemplo utilizando una combinación de métodos cromatográficos (por ejemplo SEC-HPLC, RP-HPLC o IE-HPLC) y espectroscópicos (diversos métodos de espectrometría de masas) algunas veces en combinación con f agmentación química/enzimática .

En una modalidad, el derivado de insulina de la invención tiene estabilidad química mejorada en relación a la del derivado de insulina sin uno o más enlaces disulfuro adicionales cuando se prueba como se describe en los ej emplos .

En una modalidad, el derivado de insulina de la invención tiene una hidrofilicidad aumentada en relación con la insulina humana y/o el derivado de insulina sin uno o más enlaces disulfuro adicionales cuando se prueban para hidrofilicidad como se conoce por las personas expertas y, por ejemplo, como se describe en el ejemplo 101.

En una modalidad, el derivado de insulina de la invención tiene poca o nula tendencia a agregarse. La tendencia de agregación preferiblemente mejora de modo significativo en relación a la tendencia de agregación de insulina humana y/o el derivado de insulina sin uno o más enlaces disulfuro adicionales cuando se prueba en un análisis de tioflavina.

En un aspecto, un derivado de insulina de acuerdo con la invención tiene estabilidad termodinámica mejorada tal como, por ejemplo, estabilidad de plegamiento, estabilidad conformacional y/o una temperatura de fusión mayor.

Cuando se utiliza en la presente, se dice que un derivado de insulina tiene "estabilidad termodinámica" mejorada si la desnaturalización del derivado requiere un nivel de tensión mayor tal como una temperatura mayor y/o una mayor concentración de agente de desnaturalización en comparación con la insulina humana o un derivado de insulina sin uno o más enlaces disulfuro adicionales.

La estabilidad conformacional se puede evaluar por dicroismo circular y RMN, tal como se describe, por ejemplo, por Hudson y Andersen, Peptide Science, vol 76 (4) , pp. 298-308 (2004) . La temperatura de fusión se entiende como la temperatura a la cual una estructura de insulina cambia reversible o irreversiblemente. Una temperatura de fusión mayor corresponde a estructuras más estables . La temperatura de fusión se puede determinar, por ejemplo, al evaluar la estabilidad conformacional por dicroismo circular y/o RMN como una función de la temperatura o por calorimetría de exploración diferencial. La estabilidad termodinámica también se puede determinar por espectroscopia CD y/o RMN en presencia de una concentración cada vez mayor de agente de desnaturalización tal como, por ejemplo, clorhidrato de guanidinio. La energía libre del desdoblado como se describe previamente (Kaarsholm, N.C., et al, 1993, Biochemistry, 32, 10773-8) se puede determinar en tales experimentos. Ante la desnaturalización de la proteina, la CD negativa en el intervalo UV lejano (240-218-nm) disminuye gradualmente, concordante con la pérdida de estructura secundaria ordenada que acompaña al desdoblado de una proteína. (Holladay et al., 1977, Biochim. Biophys. Acta, 494, 245-254; Melberg y Johnson, 1990, Biochim. Biophys. Acta, 494, 245-254) . El espectro de CD de insulina en el intervalo UV cercano (330-250-nm) refleja el ambiente del cromóforo tirosina con contribuciones a partir de los enlaces disulfuro (Morris et al., 1968, Biochim. Biophys. Acta., 160, 145-155; ood et al., 1975, Biochim. Biophys. Acta, 160, 145-155; Strickland & Mercóla, 1976, Biochemistry, 15, 3875-3884) . La energía libre del desdoblado de insulina se ha calculado previamente a partir de estudios y se ha determinado que es 4.5 kcal/mol (Kaarlsholm, N.C., et al, 1993, Biochemistry, 32, 10773-8) .

El espectro CD de insulina en el intervalo UV cercano (330-250-nm) refleja el ambiente del cromóforo de tirosina con contribuciones a partir de enlaces disulfuro. Puesto que los residuos tirosina son parte de la superficie de dímero de insulina, cambios en la elipticidad molar en esta región (especialmente a 276 nm) reflejan el estado de asociación de insulina. Otra manera de medir el estado de asociación de insulina es por aplicación de cromatografía de exclusión de tamaño bajo condiciones no disociantes, como se conoce en el ámbito y como se describe en los ejemplos.

Un derivado de insulina de acuerdo con la invención puede tener sustancialmente la misma o una potencia in vivo aumentada en relación con la insulina original. En un aspecto, un derivado de insulina de la invención tiene sustancialmente la misma potencia in vivo en relación a una insulina original. En un aspecto, un derivado de insulina de la invención tiene potencia in vivo aumentada en relación con la insulina original.

Los análisis estándar para medir potencia in vivo de insulina se conocen por la persona experta en el ámbito e incluyen análisis descritos en los ejemplos tales como: potencia de derivados de insulina de la invención en relación a la insulina humana, análisis de pinza en estado estable intravenosa tal como farmacocinética en ratas y PK en ratas posterior a inyección intraintestinal, efecto de disminución de glucosa en sangre y análisis PK en rata intravenosos.

Un derivado de insulina de acuerdo con la invención puede tener sustancialmente la misma o una potencia in vitro aumentada en relación a la insulina original. En un aspecto, un derivado de insulina de la invención tiene sustancialmente la misma potencia in vitro en relación a la insulina original. En un aspecto, un derivado de insulina de la invención tiene una potencia in vitro aumentada en relación con la insulina original .

Los análisis estándar para medir potencia in vitro de insulina se conocen por las personas expertas en el ámbito e incluyen, por ejemplo, los análisis in vitro siguientes: (1) análisis de radio-receptor de insulina en los cuales la potencia relativa de una insulina se define como la relación de insulina respecto a derivado de insulina requerido para desplazar 50% de 125I- insulina unida específicamente a receptores de insulina presentes en las membranas celulares, por ejemplo, en una fracción de membrana plasmática de hígado de rata; (2) análisis de lipogénesis, realizados, por ejemplo, con adipocitos de ratas en los cuales la potencia relativa de insulina se define como la relación de insulina respecto al derivado de insulina requerido para obtener 50% de la conversión máxima de [3-3H] glucosa en material extraíble orgánico (es decir, lípidos) ; y (3) análisis de oxidación de glucosa en células grasas aisladas en las cuales la potencia relativa del derivado de insulina se define como la relación de insulina respecto al derivado de insulina para obtener 50% de la conversión máxima de glucosa-1- [14C] en [14CC>2] .

Los enlaces disulfuro se derivan por el acoplamiento de dos grupos tiol y en la presente debe entenderse como el enlace entre dos átomos de azufre, es decir, una estructura que tiene la conectividad general R-S-S-R. Los enlaces disulfuro también se pueden denominar enlaces disulfuro de conexión, enlaces SS o puentes disulfuro. Se crea un puente disulfuro por la introducción de dos residuos aminoácidos cisteína a un péptido con oxidación subsecuente de los dos grupos tiol a un- enlace disulfuro. La oxidación se puede realizar químicamente (como se conoce por las personas expertas en el ámbito) o puede suceder durante la expresión de insulina en, por ejemplo, levadura.

Cuando se introducen residuos cisteína en el derivado de insulina sin uno o más enlaces disulfuro adicionales, los residuos cisteína se colocan en la estructura tridimensional del análogo de insulina plegado para permitir la formación de uno o más enlaces disulfuro adicionales no presentes en la insulina humana. Por ejemplo, se colocan dos residuos cisteína nuevos, la proximidad de los residuos cisteína nuevos en la estructura tridimensional es tal que el enlace disulfuro se puede formar entre dos residuos cisteína nuevos.

Se pueden determinar fácilmente varios de los enlaces disulfuro en una proteína (tal como insulina) mediante mediciones precisas de masa intacta como se describe, por ejemplo, en los Ejemplos. La conectividad de los enlaces disulfuro se puede verificar (determinar) mediante técnicas estándar conocidas en el ámbito tal como ubicación de péptidos . La estrategia general para ubicación de enlace disulfuro en un péptido de insulina incluye las siguientes etapas: 1) fragmentación de la insulina no reducida en péptidos unidos por disulfuro que contienen, si es posible, únicamente un enlace disulfuro único por péptido.

Las condiciones seleccionadas también son tales que se evita el rearreglo de enlaces disulfuro, 2) separación de los péptidos unidos disulfuro entre sí, 3) identificación de los residuos cisteína involucrados en los enlaces disulfuro individuales.

La insulina humana típicamente se digiere por Glu-C proteasa lo que proporciona el péptido I que contiene dos enlaces disulfuro (A6-A11 y A7-B7) y un péptido II que contiene un enlace disulfuro único (A20-B19) . Para asignar inequívocamente los enlaces disulfuro en el péptido I, es necesaria fragmentación adicional. Previamente se han utilizado la hidrólisis ácida (Ryle et al., 1955 Biochem J. 60, 541-56), degradación de Edman manual (Kumazaki T, Ishii, S. 1990 J. biochem (Tokio) 17, 414-9) o digestión prolongada con termolisina (Ota M, Ariyoshi, Y., 1995, Biosci. Biotech. Biochem. 59, 1956-7) para hidrolizar enlaces CysCys en proteínas. Una manera alternativa de asignar los enlaces disulfuro en el péptido I es una reducción parcial con triscarboxietilfosfina (reducción del enlace disulfuro A7-B7) , alquilación de los residuos cisteína reducidos seguido por reducción completa y alquilación de cisteína utilizando un grupo alquilo diferente (Yen, T.-Y., Yan, H. , Macher, B., 2001 J Mass Spectrom. 37, 15-30). La estrategia de la ubicación de los enlaces disulfuro de insulina que contienen enlaces disulfuro adicionales en principio es la misma que la indicada en lo anterior para insulina humana ajustada para cada análogo de manera que se adapte al enlace disulfuro nuevo. La determinación de la estructura de insulina por RMN o cristalografía de rayos X es un enfoque alternativo para verificar la conectividad del enlace disulfuro. Las condiciones para resolver las estructuras por RMN y/o rayos X de la insulina se han descrito previamente y se conocen en el ámbito.

En un aspecto de la invención se proporciona un derivado de insulina el cual tiene una cadena lateral y por lo menos dos sustituciones cisteína en donde los tres enlaces disulfuro de insulina humana se han retenido.

Con el término "sustitución de cisteína" se quiere indicar en la presente reemplazar un aminoácido el cual está presente en la insulina humana con una cisteína. Por ejemplo, la isoleucina en la posición 10 en la cadena A (IleAlO) y la glutamina en la posición 4 de la cadena B de la insulina humana (GlnB4) puede estar sustituida, cada una, por un residuo cisteína. Con el término "sustitución con otro residuo aminoácido" en la presente se quiere indicar la sustitución de un aminoácido el cual está presente en insulina humana con un aminoácido el cual no es cisteína.

El término "insulina humana", como se utiliza en la presente, significa la hormona insulina humana cuyas estructuras bidimensionales y tridimensionales así como sus propiedades son bien conocidas. La estructura tridimensional de la insulina humana se ha determinado, por ejemplo, por RMN y cristalografía de rayos X bajo muchas condiciones diferentes y muchas de estas estructuras están depositadas en el Protein data bank (http://www.rcsb.org). Los ejemplos no limitantes de estructura de insulina humana es la estructura T6 (http : //www. rcsb . org/pdb/explore . do?structureld=lMSO) y la estructura R6 (htt : www . rcsb . org/pdb/explore . do?structureld=lEV3 ) . La insulina humana tiene dos cadenas polipeptídicas , denominadas como la cadena A y la cadena B. La cadena A es un péptido de 21 aminoácidos y la cadena B es un péptido de 30 aminoácidos, las dos cadenas están conectadas por enlaces disulfuro: un primer puente entre la cisteína en la posición 7 de la cadena A y la cisteína en la posición 7 de la cadena B y un segundo puente entre la cisteína en la posición 20 de la cadena A y la cisteína en la posición 19 de la cadena B. Está presente un tercer enlace entre las cisteínas en la posición 6 y 11 de la cadena A. Así, "un derivado de insulina en donde los tres enlaces disulfuro de la insulina humana están retenidos" se entiende la presente como un derivado de insulina que comprende los tres enlaces disulfuro de la insulina humana, es decir, un enlace disulfuro entre la cisteína y la posición 7 de la cadena A y la cisteína en la posición 7 de la cadena B, un enlace disulfuro entre la cisteína en la posición 20 de la cadena A y la cisteína en la posición 19 de la cadena B y un enlace disulfuro entre las cisteínas en la posición 6 y 11 de la cadena A.

En el cuerpo humano, la hormona insulina se sintetiza como un precursor de cadena sencilla proinsulina (preproinsulina) que consiste de un prepéptido de 24 aminoácidos seguido por proinsulina que contiene 86 aminoácidos en la configuración: prepéptido-B-Arg Arg-C-Lys Arg-A, en el cual C es un péptido de conexión de 31 aminoácidos. Arg-Arg y Lys-Arg son sitios de separación para la ruptura del péptido de conexión de las cadenas A y B.

En un aspecto de la invención, se proporciona un derivado de insulina el cual tiene dos o más sustituciones cisteína, en donde los tres enlaces disulfuro de insulina humana se retienen y en donde por lo menos un residuo aminoácido en una posición que se selecciona del grupo que consiste de A9, A10 y A12 de la cadena A está sustituido con una cisteína, por lo menos un residuo aminoácido en una posición que se selecciona del grupo que consiste de Bl, B2 , B3, B4, B5 y B6 de la cadena B está sustituido con una cisteína, una cadena lateral se une al grupo amino epsilón de un residuo lisina en la cadena B y opcionalmente el aminoácido en la posición B30 está suprimido. En un aspecto de la invención, el residuo aminoácido en la posición A10 de la cadena A está sustituido con una cisteína, por lo menos un residuo aminoácido en una posición que se selecciona del grupo que consiste de Bl, B2, B3 y B4 de la cadena B está sustituido con una cisteína, una cadena lateral está unida al grupo amino epsilón de un residuo lisina en la cadena B y opcionalmente el aminoácido en la posición B30 está suprimido. En un aspecto de la invención, por lo menos ún residuo aminoácido en una posición que se selecciona del grupo que consiste de A9, A10 y A12 de la cadena A está sustituido con una cisteína, por lo menos un residuo aminoácido en una posición que se selecciona del grupo que consiste de Bl, B2, B3 , B4 , B5 y B6 de la cadena B está sustituido con una cisteína, por lo menos un residuo aminoácido en una posición que se selecciona del grupo que consiste de A14 , A21, Bl, B3, B10, B16, B22, B25, B26, B27, B28, B29, B30, B31, B32 está sustituido con un aminoácido el cual no es una cisteína, una cadena lateral está unida al grupo amino epsilón de un residuo lisina en la cadena B y opcionalmente el aminoácido en la posición B30 está suprimido. Se entiende que cuando Bl o B3 es cisteína, el mismo aminoácido no puede ser un aminoácido el cual no es cisteína mientras que si, por ejemplo, Bl es cisteína, B3 puede, de acuerdo con el aspecto de la invención, estar sustituido con un aminoácido el cual no es una cisteína, y viceversa. En un aspecto de la invención, el residuo aminoácido en la posición A10 de la cadena A está sustituido con una cisteína, por lo menos un residuo aminoácido en una posición que se selecciona del grupo que consiste de Bl, B2 , B3 y B4 de la cadena B está sustituido con una cisteína, opcionalmente por lo menos un residuo aminoácido está sustituido con un aminoácido el cual no es una cisteína, una cadena lateral se une al grupo amino epsilón de un residuo lisina en la cadena B y opcionalmente el aminoácido en la posición B30 está suprimido. En un aspecto de la invención, el residuo aminoácido en la posición AlO de la cadena A está sustituido con una cisteína, por lo menos un residuo aminoácido en una posición que se selecciona del grupo que consiste de B3 y B4 de la cadena B está sustituido con una cisteína, opcionalmente por lo menos un residuo aminoácido está sustituido con un aminoácido el cual no es una cisteína, una cadena lateral está unida al grupo amino epsilón de un residuo lisina en la cadena B y opcionalmente el aminoácido en la posición B30 está suprimido. En un aspecto de la invención, el residuo aminoácido en la posición AlO de la cadena A está sustituido con una cisteína, el residuo aminoácido en la posición B3 de la cadena B está sustituido con una cisteína, opcionalmente por lo menos un residuo aminoácido está sustituido con un aminoácido el cual no es una cisteína, una cadena lateral está unida al grupo amino epsilón de un residuo lisina en la cadena B y opcionalmente el aminoácido en la posición B30 está suprimido. En un aspecto de la invención, el residuo aminoácido en la posición A10 de la cadena A está sustituido con una cisteína, el residuo aminoácido en B4 de la cadena B está sustituido con una cisteína, opcionalmente por lo menos un residuo aminoácido está sustituido con un aminoácido el cual no es una cisteína, una cadena lateral está unida al grupo amino epsilón de un residuo lisina en la cadena B y opcionalmente el aminoácido en la posición B30 está suprimido.

En un aspecto se obtienen derivados de insulina de acuerdo con la invención en donde se suprime la posición B30.

Un enlace disulfuro adicional obtenido por la invención puede ser la conexión de dos cisteínas de la misma cadena, es decir, dos cisteínas en la cadena A o dos cisteínas en la cadena B de la insulina, o conectar una cisteína en la cadena A con una cisteína en la cadena B de la insulina. En un aspecto, se obtiene un derivado de insulina de acuerdo con la invención en donde por lo menos un enlace disulfuro adicional conecta dos cisteínas en la cadena A o conecta dos cisteínas en la cadena B. En un aspecto se obtiene un derivado de insulina de acuerdo con la invención en donde por lo menos un enlace disulfuro adicional conecta una cisteína en la cadena A con una cisteína en la cadena B.

Cuando se utiliza en la presente, el término "enlaces disulfuro adicionales" significa uno o más enlaces disulfuro los cuales no están presentes en la insulina humana .

En un aspecto de la invención las cisteínas están sustituidas en dos posiciones del derivado de insulina en donde las posiciones se seleccionan del grupo que consiste de: A10C, B1C; A10C, B2C; A10C, B3C; A10C, B4C; A10C, B5C; y B1C, B4C.

En un aspecto de la invención, las cisteínas están sustituidas en dos posiciones del análogo de insulina, en donde las posiciones se seleccionan del grupo que consiste de: A10C, B1C; A10C, B2C; A10C, B3C; A10C, B4C; y B1C, B4C.

En un aspecto de la invención, las cisteínas están sustituidas en dos posiciones del derivado de insulina en donde las posiciones se seleccionan del grupo que consiste de: A10C, B1C; AlOC, B2C; AlOC, B3C; y AlOC, B4C .

En un aspecto de la invención, las cisteínas están sustituidas en dos posiciones del análogo de insulina, en donde las posiciones se seleccionan del grupo que consiste de: AlOC, B3C; y AlOC, B4C.

En un aspecto de la invención, las cisteínas están sustituidas en dos posiciones del análogo de insulina, en donde las posiciones son AlOC y B3C.

En un aspecto de la invención, las cisteínas están sustituidas en dos posiciones del análogo de insulina, en donde las posiciones son AlOC y B4C.

En un aspecto de la invención, los derivados de insulina de la invención comprenden, además de las sustituciones de cisteína, uno o más aminoácidos que se seleccionan del grupo que consiste de: A8H, A14E, A14H, A18L, A21G, B1G, B3Q, B3E, B3T, B3V, B3K, B3L, B16H, B16E, B22E, B24G, B25A, B25H, B25N, B27E, B27D, B27P, B28D, B28E, B28K, desBl, desB24, desB25, desB27 y desB30. En un aspecto de la invención, los derivados de insulina de la invención comprenden, además de las sustituciones cisteína, uno o más aminoácidos que se seleccionan del grupo que consiste de: A8H, A14E, A21G, desBl, B1G, B3Q, B3E, B10E, B16H, B16E, B24G, B25H, B25A, B25N, B25G, desB27, B27E, B28E, B28D y desB30.

En un aspecto de la invención, los derivados de insulina de la invención comprenden, además de las sustituciones cisteína, uno o más aminoácidos que se seleccionan del grupo que consiste de: A21G, desBl, B1G, B3Q, B3S, B3T y B3E.

En un aspecto de la invención, los derivados de insulina de la invención comprenden, además de las sustituciones cisteína, uno o más aminoácidos que se seleccionan del grupo que consiste de: A8H, A14E, A14H, B16H, B10E, B16E, B5H, B25A, B25N, B27E, B27P, desB27 y B28E.

En un aspecto de la invención, los derivados de insulina de la invención comprenden, además de las sustituciones cisteína, uno o más aminoácidos que se seleccionan del grupo que consiste de: B28E, B28D, desB27 y A14E.

En un aspecto de la invención, los derivados de insulina de la invención comprenden, además de las sustituciones cisteína, uno o más aminoácidos que se seleccionan del grupo que consiste de: B3K, B29E, B27E, B27D, desB27, B28E, B28D, B28K y B29P.

En un aspecto de la invención, los derivados de insulina de la invención comprenden, además de las sustituciones cisteína, un péptido C que conecta la parte C-terminal de la cadena B con la parte N-terminal de la cadena A (para formar lo que se denomina un derivado de insulina de cadena única) . En una modalidad de la invención, la insulina original se selecciona del grupo que consiste de análogos de insulina de cadena sencilla. En una modalidad de la invención, la insulina original se selecciona del grupo que consiste de análogos de insulina de cadena sencilla enumerados en WO2007096332 , WO2005054291 o WO2008043033 , patentes las cuales se incorporan específicamente en la presente como referencia.

En un aspecto de la invención, se obtiene un derivado de insulina el cual comprende dos sustituciones cisteína que resultan en un enlace disulfuro adicional en relación a la insulina humana.

De acuerdo con la invención, "una insulina" en la presente debe entenderse como insulina humana, desB30 insulina humana o un análogo de insulina.

El término "péptido de insulina" , como se utiliza en la presente, significa un péptido que es insulina humana, desB30 insulina humana o un análogo o un derivado de la misma con actividad de insulina.

El término "análogo de insulina", como se utiliza en la presente, significa una insulina modificada en donde uno o más residuos de aminoácidos de la insulina han sido sustituidos por otros residuos aminoácidos y/o en donde uno o más residuos aminoácidos han sido suprimidos de la insulina y/o en donde uno o más residuos aminoácidos han sido agregados y/o insertados a la insulina.

En un aspecto, un derivado de insulina de acuerdo con la invención es un análogo de insulina (como se define en lo anterior) que contiene uno o más enlaces disulfuro adicionales en relación a la insulina humana y que contienen una cadena lateral unida al grupo amino epsilón de residuo lisina presente en la cadena B de la molécula.

El término "derivado de insulina" se pretende que signifique una insulina (como se define en lo anterior) que ha sido derivatizada químicamente. Esto significa que una cadena lateral (como se define en la presente) se ha acoplado a la insulina. En el sentido más amplio, la cadena lateral puede ser de cualquier clase tal como PEG, pero, de manera más preferida, la cadena lateral es la que contiene un ácido graso o una porción de diácido graso.

El término "insulina original", como se utiliza en la presente, se pretende que signifique una insulina con uno o más enlaces disulfuro adicionales, es decir, insulina humana, desB30 insulina humana o un análogo de insulina con uno o más enlaces disulfuro adicionales, antes de ser derivatizada con una cadena lateral.

El término "derivado de insulina sin uno o más enlaces disulfuro adicionales", como se utiliza en la presente, se pretende que signifique un derivado de insulina que tiene tres enlaces disulfuro presentes de manera natural en la insulina humana, es decir, un primer puente entre la cisteína en la posición 7 de la cadena A y la cisteína en la posición 7 de la cadena B, un segundo puente entre la cisteína en la posición 20 de la cadena A y la cisteína en la posición 19 de la cadena B y un tercer puente entre las cisternas en la posición 6 y 11 de la cadena A y la cadena lateral unida a la insulina pero sin enlaces/puentes disulfuro adicionales.

El término "cadena lateral" se utiliza en la presente y se pretende que signifique un ácido graso o un diácido (opcionalmente vía uno o más enlazantes) acoplado a la insulina original de la invención, tal como al grupo amino epsilón de una lisina presente en la cadena B de la insulina original. El ácido graso o la parte diácido de la cadena lateral confiere afinidad a albúmina sérica y los enlazantes actúan ya sea para modificar (por ejemplo, incrementar) la afinidad por albúmina, modificar la solubilidad del derivado de insulina y/o modular (aumentar/disminuir) la afinidad del derivado de insulina por el receptor de insulina.

En un aspecto, un derivado de insulina de acuerdo con la invención es un análogo de insulina que comprende por lo menos dos sustituciones cisteína, en donde el análogo de insulina está acilado en uno o más aminoácidos del péptido de insulina .

En la presente, el término "insulina acilada" cubre la modificación de la insulina humana o un análogo de insulina por unión de una o más porciones acilo vía un enlazante a la insulina.

Un ejemplo no limitante de derivados de insulina en la forma de análogos de insulina acilados los cuales pueden ser modificados por sustituciones cisteína de acuerdo con la invención se puede encontrar, por ejemplo, en O 2009/115469 Al.

En una modalidad, un derivado de insulina de acuerdo con la invención es una insulina modificada en donde dos residuos aminoácidos han sido sustituidos por residuos cisteína, una cadena lateral ha sido introducida y opcionalmente el aminoácido en la posición B30 ha sido suprimido en relación a la secuencia de aminoácidos de la insulina humana.

En una modalidad, un derivado de insulina de acuerdo con la invención comprende una cadena lateral y entre 2 y 9 mutaciones en relación a una insulina humana en donde por lo menos dos sustituciones son a residuos cisteína, de manera alternativa un derivado de insulina de acuerdo con la invención comprende una cadena lateral y entre 2 y 8 mutaciones en relación a una insulina humana en donde por lo menos dos mutaciones son a residuos cisteína, de manera alternativa, una cadena lateral y entre 2 y 7 mutaciones en relación a la insulina humana en donde por lo menos dos sustituciones son a residuos cisteína, de manera alternativa, una cadena lateral y entre 2 y 6 mutaciones en relación a la insulina humana en donde por lo menos dos sustituciones son a residuos cisteína, de manera alternativa, una cadena lateral y entre 2 y 5 mutaciones en relación a la insulina humana en donde por lo menos dos sustituciones son a residuos cisteína, de manera alternativa una cadena lateral y entre 2 y 4 mutaciones en relación a la insulina humana en donde por lo menos dos sustituciones son a residuos cisteína, de manera alternativa, una cadena lateral y entre 2 y 3 mutaciones en relación a la insulina humana, en donde por lo menos dos sustituciones son a residuos cisteína, o de manera alternativa, una cadena lateral y dos sustituciones cisteína en relación a la insulina humana.

Las modificaciones en la molécula de insulina se indican comenzando con la cadena (A o B) , la posición y el código de uno a 3 letras para el residuo aminoácido que sustituye al residuo aminoácido nativo.

En la presente, términos como "Al", "A2" y "A3" etc. indican el aminoácido en la posición 1, 2, 3, etc, respectivamente, en la cadena A de insulina (contando desde el extremo N-terminal) . Similarmente, términos como Bl, B2 y B3, etc. indica el aminoácido en la posición 1, 2 y 3 etc., respectivamente, en la cadena B de insulina (contada desde el extremo N-terminal) . Utilizando los códigos de una letra para los aminoácidos, un término como A10C designa que el aminoácido en la. posición A10 es cisterna. Utilizando los códigos de tres letras para aminoácidos, la expresión correspondiente es AlOCys.

Mediante los términos "desB30", "B(l-29)" o "desThrB30" se quiere indicar una cadena B de insulina natural o un análogo de la misma que carece del aminoácido B30 (treonina, Trh) y "A(l-21)" significa la cadena A de insulina natural. Así, por ejemplo, A10C, B1C, desB30 insulina humana, o de manera alternativa AlOCys, BICys, desB30 insulina humana (o de manera alternativa CysAlO, CysBl, desThrB30 insulina humana) es un análogo de insulina humana en donde el aminoácido en la posición 10 en la cadena A está sustituido con cisteína, el aminoácido en la posición 1 en la cadena B está sustituido con cisteína y el aminoácido en la posición 30 (treonina, Thr) en la cadena B está suprimido.

En la presente, la denominación de los péptidos o proteínas se realiza de acuerdo con los siguientes principios: Se proporcionan los nombres como mutaciones y modificaciones (tales como acilaciones) en relación a péptido o proteína original tal como insulina humana. Para la denominación de la porción acilo, la denominación se realiza de acuedo con la nomenclatura de IUPAC y/o en otros casos como la nomenclatura peptídica. Por ejemplo, denominando la porción acilo : Fórmula química 1 puede ser, por ejemplo, "octadecanodioil-YGlu-OEG-OEG" , "octadecanodioil-gGlu-OEG-OEG" , "octadecanodioil-gGlu-2XOEG" o "17-carboxiheptadecanoil-YGlu-OEG-OEG" , en donde OEG es la anotación breve para el residuo aminoácido ácido 8-amino-3 , 6-dioxaoctanoico, -NH (CH2) 20 (CH2) 2OCH2CO- , y yGlu (O gGlu) es la anotación breve para la porción de aminoácido gamma L-glutámico.

Por ejemplo, la insulina del ejemplo 1 (con la secuencia/estructura que se indica a continuación) se denomina "A10C, A14E, B4C, B25H, B29K (N^ctadecanodioil-gGlu-OEG-OEG) , desB30 insulina humana para indicar que el aminoácido en la posición A10, I en insulina humana ha sido mutado a C; A14 , Y en insulina humana ha sido mutado a E; el aminoácido en posición B4, Q en la insulina humana ha sido mutado a C; el aminoácido en la posición B25, F en insulina humana, ha sido mutado a H, el aminoácido en la posición B29, K como en la insulina humana, ha sido modificado por acilación del nitrógeno epsilón en el residuo lisina de B29, indicado como ?e, por el residuo octadecanodioil-YGlu-OEG-OEG, y el aminoácido en la posición B30, T en la insulina humana ha sido suprimido. Los asteriscos en la fórmula siguiente indican que el residuo en cuestión es diferente (es decir, mutado) en comparación con la insulina humana. Los enlaces disulfuro como se encuentran en la insulina se muestran con átomos de azufre y el enlace disulfuro adicional de la invención se muestra con una línea.

FORMULA QUIMICA 2, SEC ID NO : 1 Además, las insulinas de la invención también se pueden denominar de acuerdo con la nomenclatura IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) . De acuerdo con esta nomenclatura, la insulina acilada anterior con un puente disulfuro adicional se le asigna el siguiente nombre: N{Epsilón-B29} - [2- [2- [2- [ [2- [2- [2- [ [ (4S) -4 -carboxi-4 - (17-carboxiheptadecanoilamino) -butanoil] amino] etoxi] etoxi] acetil] amino] etoxi] etoxi] acetil] - [CysAlO, GluA14, CysB4 , HisB25] , des-ThrB30-insulina (humana) .

En la presente, el término "residuo aminoácido" es un aminoácido del cual un grupo hidroxilo removido de un grupo carboxi y/o partir del cual un átomo de hidrógeno ha sido removido de un grupo amino.

En un aspecto de la invención, el derivado de insulina de acuerdo con la invención comprende un grupo acilo en, por ejemplo, el grupo epsilón-amino de un residuo Lys de la secuencia de aminoácidos de insulina. En un aspecto, el derivado de insulina comprende un residuo que une albúmina, es decir, un residuo el cual, bajo condiciones in vivo, se une a albúmina cuando se une a un péptido o proteína.

En un aspecto, el residuo que une albúmina es un residuo lipofílico. En un aspecto adicional, el residuo lipofílico se une a la secuencia de aminoácidos de insulina por medio de un enlazante .

En un aspecto adicional de la invención, el residuo que une albúmina se carga negativamente a pH fisiológico. En un aspecto de la invención, el residuo que une albúmina comprende un grupo el cual puede ser cargado negativamente. Un grupo preferido el cual puede ser cargado negativamente es un grupo de ácido carboxilico.

En un aspecto, el residuo que une albúmina es un residuo diácido graso a,?.

En un aspecto adicional de la invención, el residuo diácido graso a,? del residuo lipofílico tiene de 6 a 40 átomos de carbono, de 8 a 26 átomos de carbono o de 8 a 22 átomos de carbono o de 14 a 22 átomos de carbono, o de 16 a 22 átomos de carbono, o de 6 a 20 átomos de carbono, o de 16 a 18 átomos de carbono, o de 16 átomos de carbono, o de 18 átomos de carbono, o de 20 átomos de carbono o de 22 átomos de carbono.

En otro aspecto de la invención, el residuo que une albúmina es un grupo acilo de un ácido alcano a, ?-dicarboxílico de cadena lineal o ramificada. En un aspecto adicional, el residuo que une albúmina es un grupo acilo de un ácido alcano a, ?-dicarboxílico de cadena lineal o ramificada el cual incluye una porción de aminoácido tal como, por ejemplo, la porción gamma-Glu. En otro aspecto adicional, el residuo que une albúmina es un grupo acilo o un ácido alcano a, ?-dicarboxilico de cadena lineal o ramificada y el cual incluye dos porciones de aminoácidos tales como, por ejemplo, la porción gamma-Glu y una porción de 8-amino-3 , 6-dioxaoctanoico porción (OEG) . En un aspecto adicional, el residuo que une albúmina es un grupo acilo de un ácido alcano- , ?-dicarboxílicos de cadena lineal o ramificada los cuales incluyen más porciones de aminoácidos tales como, por ejemplo, una porción gamma-Glu y porciones de ácido 8-amino-3 , 6-dioxaoctanoico (OEG) consecutivas.

En una modalidad, la porción acilo unida al análogo de insulina original tiene la siguiente fórmula general: Acy-AAln-AA2m-AA3p- Fórmula química 3 en donde n es 0 o un número entero en el intervalo de 1 a 3 ; m es 0 o un número en el intervalo de 1 a 10; p es 0 o un número entero en el intervalo de 1 a 10; Acy es un ácido graso o un diácido graso que comprende de aproximadamente 8 a 24 átomos de carbono; AA1 es un residuo aminoácido lineal o cíclico neutro; AA2 es un residuo aminoácido ácido; AA3 es un residuo aminoácido que contiene alquilenglicol neutro; el orden en el cual aparecen AAl, AA2 y AA3 en la fórmula se puede intercambiar de manera independiente; AA2 puede presentarse varias veces en la fórmula (por ejemplo, Acy-AA2-AA32-AA2-) ; AA2 puede presentarse de manera independiente (= ser diferente) varias veces en la fórmula (por ejemplo, Acy-AA2 -AA32-AA2 - ) ; las conexiones entre Acy, AAl, AA2 y/o AA3 son enlaces amida (peptídicos) los cuales, formalmente, se pueden obtener por retiro de un átomo de hidrógeno o un grupo hidroxilo (agua) de cada uno de Acy, AAl, AA2 y AA3 ; y la unión a la insulina estabilizada con proteasa puede ser desde el exremo C-terminal de un residuo AAl, AA2 o AA3 en la porción acilo de la fórmula (I) o de una o varias cadenas laterales de un residuo AA2 presente en la porción de fórmula (I) .

En otra modalidad, la porción acilo unida al análogo de insulina original tiene la fórmula Acy-AAln-AA2m-AA3P-(I), en donde AA1 se selecciona de Gly, D- o L-Ala, ácido PAla, 4-aminobutírico, ácido 5-aminovalérico, ácido 6-aminohexanoico, D- o L-Glu-a-amida, D- o L-Glu-y-amida, D-o L-Asp- -amida, D- o L-Asp-P-amida, o un grupo de uno de la fórmula : (ácido tranexámico (Trx) ) , Fórmulas químicas 4 a partir de la cual un átomo de hidrógeno y/o un grupo hidroxilo ha sido retirado y en donde q es 0, 1, 2, 3 ó 4 y, en esta modalidad, AA1 puede, de manera alternativa, ser ácido 7-aminoheptanoico u 8 -aminooctanoico .

En otra modalidad, la porción acilo unida al análogo de insulina original tiene la fórmula general Acy-AAln-AA2m-AA3p- (I) , en donde AA1 es como se define en lo anterior y AA2 se selecciona de L- o D-Glu, L- o D-Asp, L- o D-homoGlu o cualquiera de los siguientes: Fórmula química A partir de las cuales se ha retirado un átomo de hidrógeno y/o un grupo hidroxilo y en donde las flechas indican el punto de unión al grupo amino de AA1 , AA2 , AA3 o el grupo amino de la insulina estabilizada con proteasa.

En un aspecto, el residuo aminoácido cíclico neutro designado como AA1 es un aminoácido que contiene un anillo carbocíclico de 6 miembros saturado que opcionalmente contiene un heteroátomo de nitrógeno y que preferiblemente el anillo es un anillo ciclohexano o un anillo piperidiná. Preferiblemente, el peso molecular de este aminoácido cíclico neutro está en el intervalo de aproximadamente 100 a aproximadamente 200 Da.

El residuo aminoácido ácido denominado AA2 es un aminoácido con un peso molecular de aproximadamente 200 Da que comprende dos grupos de ácido carboxílico y un grupo amino primario o secundario. De manera alternativa, el residuo aminoácido ácido denominado AA2 es un aminoácido con un peso molecular de hasta aproximadamente 250 Da que comprende un grupo de ácido carboxílico y un grupo sulfonamida primario o secundario.

El residuo aminoácido que contiene alquilenglicol , neutro, denominado AA.3 es una porción alquilen-glicol , opcionalmente una porción oligo- o polialquilenglicol que contiene una funcionalidad de ácido carboxílico en un extremo y una funcionalidad de grupo amino en el otro extremo.

En la presente, el término porción alquilenglicol cubre porciones mono-alquilenglicol así como porciones oligo-alquilenglicol . Los mono- y oligo-alquilenglicoles comprenden cadenas basadas en mono- y oligo-etilenglicol , basadas en mono- y oligo-propilenglicol y oligo-propilenglicol y basadas en mono- y oligo-butilenglicol, es decir, cadenas que están basadas en la unidad repetida -CH2CH20-, -CH2CH2CH20- o -CH2CH2CH2CH20- . La porción alquilenglicol está monodispersa (con longitud/peso molecular bien definido) . Las porciones monoalquilenglicol comprenden -OCH2CH20-, -OCH2CH2CH20- o -OCH2CH2CH2CH20- que contienen grupos diferentes en cada extremo.

Como se menciona en la presente, el orden en el cual aparecen AA1, AA2 y AA3 en la porción acilo con la fórmula (I) (Acy-AAln-AA2m-AA3p- ) se pueden intercambiar independientemente. En consecuencia, la fórmula (I) Acy-AAln-AA2ra-AA3p- también abarca porciones como, por ejemplo, la fórmula Acy-AA2m-AAln-AA3p- , Acy-AA2 -AA3n-AA2 - , Acy-AA3p-AA2m-AAln- , en donde Acy, AA1, AA2 , AA3 , n, m y p son como se definen en la presente.

Como se menciona en la presente, las conexiones entre las porciones Acy, AA1, AA2 y/o AA3 se obtienen formalmente por formación de enlace amida (enlace peptídico) (-CONH-) por remoción de agua de los compuestos originales de los cuales formalmente se construyen. Esto significa que con el fin de obtener la fórmula completa para la porción acilo con la fórmula (I) (Acy-AAln-AA2m-AA3p- , en donde Acy, AA1, AA2 , AA3 , n, m y p son como se definen en la presente) , uno, formalmente, necesitar tomar los compuestos proporcionados para los términos Acy, AAl, AA2 y AA3 y remover un hidrógeno y/o hidroxilo de los mismos y, formalmente, conectar los bloques de construcción obtenidos de esta manera en los extremos libres así obtenidos .

Los ejemplos específicos, no limitantes de las porciones acilo de la fórmula Acy-AAln-AA2m-AA3p- los cuales pueden estar presentes en los análogos de insulina acilados de esta invención se enumeran en WO 2009/115469 Al, pp. 27-43.

Cualquiera de los ejemplos específicos no limitantes anteriores de las porciones acilo de la fórmula Acy-AAln-AA2m-AA3p- se pueden unir a un grupo amino epsilón de un residuo lisina presente en cualquiera de los ejemplos específicos no limitantes anteriores de los análogos de insulina originales y de esta manera se proporcionan ejemplos específicos adicionales de los análogos de insulina acilados de esta invención.

Los análogos de insulina originales se pueden convertir en las insulinas aciladas que contienen enlaces disulfuro adicionales de esta invención por introducción del grupo deseado de la fórmula Acy-AAln-AA2m-AA3p- en el residuo lisina. El grupo deseado de la fórmula Acy-AAln-AA2n-AA3p- se puede introducir por cualquier método conveniente y se describen muchos métodos en la técnica anterior para estas reacciones. Detalles adicionales aparecen de los ejemplos en este documento.

En un aspecto de la invención, los sitios de sustituciones de ciclina se seleccionan de manera tal que el derivado de insulina humana retenga las actividades biológicas deseadas asociadas con insulina humana. Las actividades biológicas deseadas se conocen por las personas expertas en el ámbito e incluyen, por ejemplo, unión a un receptor de insulina, unión al receptor IGF-1 (factor 1 de crecimiento de insulina) , potencia in vitro, potencia in vivo, como por ejemplo, la descrita en los Ejemplos 106 y 107.

En un aspecto, los derivados de insulina de acuerdo con la invención se obtienen, en donde la unión de receptor al receptor de insulina es de por lo menos 1% de la unión de receptor del derivado de insulina sin uno o más enlaces disulfuro adicionales al receptor de insulina. En un aspecto, la unión del receptor al receptor de insulina es de por lo menos 3% de la unión de receptor del derivado de insulina sin uno o más enlaces disulfuro adicionales al receptor de insulina. En un aspecto, la unión del receptor al receptor de insulina es de por lo menos 5% de la unión de receptor del derivado de insulina sin uno o más enlaces disulfuro adicionales al receptor de insulina. En un aspecto, la unión del receptor al receptor de insulina es de por lo menos 10% de la unión de receptor del derivado de insulina sin uno o más enlaces disulfuro adicionales al receptor de insulina. En un aspecto, la unión del receptor al receptor de insulina es de por lo menos 15% de la unión de receptor del derivado de insulina sin uno o más enlaces disulfuro adicionales al receptor de insulina. En un aspecto, la unión del receptor al receptor de insulina es de por lo menos 20% de la unión de receptor del derivado de insulina sin uno o más enlaces disulfuro adicionales al receptor de insulina. En un aspecto, se obtienen derivados de insulina de acuerdo con la invención en donde la unión de receptor al receptor de insulina se incrementa. En un aspecto, se obtienen derivados de insulina de acuerdo con la invención en donde la unión a receptor al receptor de insulina es de por lo menos 110% de la unión del receptor del derivado de insulina sin uno o más enlaces disulfuro adicionales al receptor de insulina.

En un aspecto, la unión del receptor al receptor de insulina es de por lo menos 120% de la unión de receptor del derivado de insulina sin uno o más enlaces disulfuro adicionales al receptor de insulina. En un aspecto, la unión del receptor al receptor de insulina es de por lo menos 130% de la unión de receptor del derivado de insulina sin uno o más enlaces disulfuro adicionales al receptor de insulina. En un aspecto, la unión del receptor al receptor de insulina es de por lo menos 140% de la unión de receptor del derivado de insulina sin uno o más enlaces disulfuro adicionales al receptor de insulina. En un aspecto, la unión del receptor al receptor de insulina es de por lo menos 150% de la unión de receptor del derivado de insulina sin uno o más enlaces disulfuro adicionales al receptor de insulina. En un aspecto, la unión del receptor al receptor de insulina es de por lo menos 160% de la unión de receptor del derivado de insulina sin uno o más enlaces disulfuro adicionales al receptor de insulina. En un aspecto, la unión del receptor al receptor de insulina está entre 110 y 200% de la unión de receptor del derivado de insulina sin uno o más enlaces disulfuro adicionales al receptor de insulina. En un aspecto, la unión del receptor al receptor de insulina está entre 120 y 180% de la unión de receptor del derivado de insulina sin uno o más enlaces disulfuro adicionales al receptor de insulina. En un aspecto, la unión del receptor al receptor de insulina está entre 140 y 180% de la unión de receptor del derivado de insulina sin uno o más enlaces disulfuro adicionales al receptor de insulina. En un aspecto, la unión del receptor al receptor de insulina está entre 150 y 170% de la unión de receptor del derivado de insulina sin uno o más enlaces disulfuro adicionales al receptor de insulina.

La producción de polipéptidos , por ejemplo insulinas, es bien conocida en el ámbito. Un análogo de insulina para ser utilizado para producir un derivado de insulina de acuerdo con la invención puede ser producido, por ejemplo, por síntesis peptídica clásica, por ejemplo síntesis peptídica en fase sólida utilizando química t-Boc o Fmoc u otras técnicas bien establecidas, véase, por ejemplo, Greene y Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley & Sons, 1999. El análogo de insulina también se puede producir por un método el cual comprenda cultivar una célula hospedadora que contenga una secuencia de ADN que codifique para el análogo y que sea capaz de expresar el análogo de insulina en un medio nutriente adecuado bajo condiciones que permitan la expresión del análogo de insulina. Se pueden utilizar varios métodos recombinantes en la producción de insulina humana y análogos de insulina humana. Tres ejemplos no limitantes de métodos los cuales pueden ser utilizados en la producción de insulina en microorganismos tales como, por ejemplo, Escherichia coli y Saccharomyces cerevisiae se describen, por ejemplo, en WO2008034881.

Típicamente, el análogo de insulina se produce al expresar una secuencia de ADN que codifica para un análogo de insulina en cuestión o un precursor del mismo en una célula hospedadora adecuada por técnicas bien conocidas como se describen, por ejemplo, en EP 1,246,845 o O2008034881, ambas las cuales se incorporan específicamente en la presente como referencia.

El análogo de insulina se puede expresar con una extensión N-terminal como se describe en EP 1,246,845.

Después de secreción al medio de cultivo y recuperación, el precursor de insulina se someterá a diversos procedimientos in vi tro para eliminar posible secuencia de extensión N-terminal y conectar el péptido para proporcionar el análogo de insulina. Los métodos incluyen conversión enzimática por medio de tripsina o una proteasa de Ac ramojbacter lyticus en presencia de éster de L-treonina seguido por conversión del éster de treonina del análogo de insulina en un análogo de insulina por hidrólisis básica o ácida como se describe en la especificación de patente de E.U.A. No. 4,343,898 ó 4, 916, 212.

Los ejemplos de extensiones N-terminal del tipo adecuado en la presente invención se describen en la patente de E.U.A. No. 5,395,922 y la patente EP No. 765,395, ambas patentes las cuales se incorporan en la presente específicamente como referencia.

Para análogo de insulina que comprenden residuos aminoácidos no nat\irales, las células recombinantes deben ser modificadas de manera que los aminoácidos no naturales se incorporen en el análogo, por ejemplo, mediante el uso de mutantes de ARNt . Por lo tanto, brevemente, los análogos de insulina de acuerdo con la invención se preparan de modo análogo a la preparación de análogos de insulina conocidos.

En una modalidad adicional, la invención se relaciona con un proceso para producir un derivado de insulina que comprende: (i) cultivar una célula hospedadora que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para un precursor de insulina; (ii) aislar el precursor de insulina del medio de cultivo; (iii) convertir el precursor de insulina en un análogo de insulina por conversión enzimática in vitro; y (iv) acilar el análogo de insulina con una cadena lateral.

En una modalidad adicional, la invención se relaciona con un proceso para producir un derivado de insulina que comprende: (i) cultivar una célula hospedadora que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para un precursor de insulina; (ii) aislar el precursor de insulina del medio de cultivo; (iii) convertir el precursor de insulina en un análogo de insulina; y (iv) acilar el análogo de insulina con una cadena lateral .

En una modalidad de la presente invención la célula hospedadora es una célula hospedadora de levadura y en una modalidad adicional la célula hospedadora de levadura se selecciona del género Saccharomyces. En una modalidad adicional, la célula hospedadora de levadura se selecciona de la especie Saccharomyces cerevisiae .

Los análogos de insulina pueden ser modificados, por ejemplo acilados, de acuerdo con los métodos conocidos por las personas expertas en el ámbito, como se describen, por ejemplo, en WO 2010/029159, WO 00/55119, WO 04/029077 y WO 2006/008238, los cuales se incorporan como referencia.

En un aspecto de la invención, se obtiene un método para estabilizar un derivado de insulina el cual comprende sustituir dos o más aminoácidos de un derivado de insulina con residuos cisteína, en donde a. se retienen tres enlaces disulfuro de insulina humana, y b. se seleccionan tres sitios de sustituciones de cisteína de manera tal que los residuos cisteína introducidos se colocan en una estructura tridimensional del análogo de insulina plegado para permitir la formación de uno o más enlaces disulfuro adicionales no presentes en la insulina humana, por lo que se genera un derivado de insulina humana que comprende uno o más enlaces disulfuro adicionales no presentes en la insulina humana.

Es evidente de la descripción como obtener un derivado de insulina de acuerdo con la invención. Las personas expertas en el ámbito de esta manera saben cuando lean la descripción, de qué manera modificar un derivado de insulina de modo tal que los residuos cisteína introducidos se colocan en la estructura tridimensional del análogo de insulina plegado para permitir la formación de uno o más enlaces disulfuro adicionales no presentes en la insulina humana además de los tres enlaces disulfuro de la insulina humana .

COMPOSICIONES FARMACEUTICAS Otro objetivo de la presente invención es proporcionar una formulación farmacéutica que comprende un derivado de insulina de acuerdo con la presente invención, el cual esté presente en una concentración de 0.1 mg/ml a 500 mg/ml y en donde la formulación tenga un pH de 2.0 a 10.0. La formulación puede comprender además uno o varios inhibidores de proteasa, un sistema amortiguador, uno o varios conservadores, uno o varios agentes de tonicidad, uno o varios agentes quelantes, estabilizantes y tensioactivos . En una modalidad de la invención, la formulación farmacéutica es una formulación acuosa, es decir, una formulación que comprende agua .

En otra modalidad, la formulación farmacéutica es una formulación seca (por ejemplo, liofilizada o secada por aspersión) lista para uso sin disolución previa alguna.

Las composiciones farmacéuticas que contienen un derivado de insulina de acuerdo con la presente invención se pueden administrar a un paciente en necesidad del tratamiento en diversos sitios, por ejemplo, en sitios tópicos, por ejemplo, piel y sitios de mucosa, en sitios en las cuales exista absorción por derivación, por ejemplo, administración en una arteria, en una vena, en el corazón y en sitios los cuales involucran absorción, por ejemplo, administración en la piel, debajo de la piel, en un músculo o en abdomen.

La administración de composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención puede ser a través de diversas vías de administración, por ejemplo lingual, sublingual, bucal, en la boca, oral, en el estomago e intestino, nasal, pulmonar, por ejemplo a través de los bronquiolos y alvéolos o una combinación de los mismos, epidérmica, dérmica, transdérmica, vaginal, rectal, ocular, por ejemplo a través de la conjuntiva, uretal y parenteral a pacientes en necesidad de este tratamiento.

Las composiciones de la presente invención se pueden administrar en varias formas de dosificación, por ejemplo, como soluciones, suspensiones, emulsiones, microemulsiones , emulsiones múltiples, espumas, pomada balsámica, pastas, emplastos, ungüentos, tabletas, tabletas recubiertas, enjuagues, cápsulas, por ejemplo, cápsulas de gelatina dura y cápsulas de gelatina suave, supositorios, cápsulas rectales, gotas, geles, aspersiones, polvo, aerosoles, inhalantes, gotas para los ojos, ungüentos oftálmicos, enjuagues oftálmicos, pesarios vaginales, anillos vaginales, ungüentos vaginales, solución para inyección, soluciones de transformación in situ, por ejemplo gelificación in situ, fraguado in situ, precipitación in situ, cristalización in situ, solución de infusión e implantes.

Para administración parenteral un derivado de insulina de esta invención se formula de modo análogo a la formación de insulinas conocidas. Además, para administración parenteralmente , un derivado de insulina de esta invención se administra de modo análogo a la administración de insulinas conocidas y los médicos están familiarizados con este procedimiento .

La administración parenteral se puede realizar por medio de una jeringa, opcionalmente una jeringa similar a pluma. De manera alternativa, la administración parenteral se puede realizar por medio de una bomba de infusión.

Las composiciones inyectables que contienen un derivado de insulina de esta invención se pueden preparar utilizando las técnicas convencionales de la industria farmacéutica las cuales involucran disolver y mezclar los ingredientes según sea apropiado para proporcionar el producto final deseado. Así, de acuerdo con un procedimiento, un derivado de insulina de esta invención se disuelve en una cantidad de agua la cual es un poco menor que el volumen final de la composición que se va a preparar. Un agente isotónico, un conservador y un amortiguador se agregan según se requiera y se ajusta el valor de pH de la solución, si es necesario, utilizando un ácido, por ejemplo, ácido clorhídrico o una base, por ejemplo, hidróxido de sodio acuoso, según se necesite. Finalmente se ajusta el volumen de la solución con agua hasta obtener la concentración deseada de los ingredientes.

De modo más preciso, una preparación de derivado de insulina de esta invención, por ejemplo una solución o suspensión se puede preparar al disolver un compuesto de esta invención en un medio acuoso en condiciones ligeramente ácidas, por ejemplo, en una concentración en el intervalo de aproximadamente 240 a aproximadamente 2400 nmoles/ml. El medio acuoso se vuelve isotónico, por ejemplo con cloruro de sodio o glicerol. Además, el medio acuoso puede contener amortiguadores tales como acetato o citrato, conservadores tales como m-cresol o fenol y iones zinc, por ejemplo, en una concentración de hasta aproximadamente 20 µg de Zn++ por unidad de actividad de insulina. El valor de pH de la solución se ajusta hacia neutralidad sin encontrarse demasiado cerca del punto isoeléctrico del compuesto de esta invención con el fin de evitar precipitación. El valor de pH de la preparación de insulina final depende del compuesto de la invención que se utilice, la concentración de iones zinc y la concentración del compuesto de esta invención. La preparación de derivado de insulina se vuelve estéril, por ejemplo, mediante filtración estéril.

Las formulaciones destinadas para uso oral se pueden preparar de acuerdo con cualquier método conocido y estas formulaciones pueden contener uno o más agentes que se seleccionen del grupo que consiste de agentes edulcorantes, agentes saborizantes , agentes colorantes y agentes conservadores con el fin de proporcionar preparaciones farmacéuticamente elegantes y agradables al paladar. Las tabletas pueden contener el ingrediente activo en una mezcla con excipientes no tóxicos farmacéuticamente aceptables los cuales son adecuados para la elaboración de tabletas . Estos excipientes pueden ser, por ejemplo, diluyentes inertes tales como manitol, maltodextrina, caolín, carbonato de calcio, carbonato de sodio, lactosa, fosfato de calcio o fosfato de sodio; agentes granulantes y desintegrantes, por ejemplo, almidón de maíz; agentes de unión, por ejemplo, almidón, gelatina, polímeros o goma acacia; y agentes lubricantes, por ejemplo, estearato de magnesio, ácido esteárico o talco. Las tabletas pueden estar sin recubrimiento o se pueden recubrir con técnicas conocidas para retrasar la desintegración o liberación del polipéptido terapéuticamente activo.

Las formulaciones administrables por vía oral de la presente invención se pueden preparar y administrar de acuerdo con métodos bien conocidos en la química farmacéutica, véase Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed. (A. Osol ed. , 1985) .

Las preparaciones de derivado de insulina de esta invención se utilizan de modo similar al uso de preparaciones de insulina conocidas.

La cantidad de un compuesto de esta invención que se va a administrar, la determinación de con que frecuencia se administra un compuesto de esta invención y la elección de cual compuesto o compuestos de esta invención se van a administrar, opcionalmente junto con otros compuestos para diabéticos se decide consultando con el médico quien está familiarizado con el tratamiento de diabetes.

En un aspecto, el derivado de insulina de acuerdo con la invención se administrar por vía oral. En un aspecto, el derivado de insulina de acuerdo con la invención se administra por vía parenteral .

En otra modalidad, la presente invención se relaciona con un derivado de insulina de acuerdo con la invención para uso como un medicamento.

En una modalidad, un derivado de insulina de acuerdo con la invención se utiliza para la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de hiperglucemia, diabetes tipo 2, tolerancia deteriorada a la glucosa y diabetes tipo 1.

En otra modalidad, un derivado de insulina de acuerdo con la invención se utiliza como un medicamento para retrasar o evitar el progreso de la enfermedad en diabetes tipo 2.

En una modalidad de la invención, el derivado de insulina de acuerdo con la invención es para uso como un medicamento para el tratamiento o prevención de hiperglucemia, diabetes tipo 2, tolerancia deteriorada a la glucosa, diabetes tipo 1 o para retrasar o evitar el progreso de enfermedad en diabetes tipo 2.

En una modalidad adicional de la invención, se proporciona un método para el tratamiento o prevención de hiperglucemia, diabetes tipo 2, tolerancia deteriorada a la glucosa, diabetes tipo 1 o para retrasar o evitar el progreso de enfermedad en diabetes tipo 2, el método comprende administrar a un paciente en necesidad del tratamiento una cantidad eficaz para el tratamiento de un derivado de insulina de acuerdo con la invención.

El término "diabetes" incluye diabetes tipo 1, diabetes tipo 2 y otros estados que provocan hiperglucemia.

El término "tratamiento" de una enfermedad incluye " el tratamiento, prevención o alivio de la enfermedad.

LA SIGUIENTE ES UNA LISTA DE ASPECTOS ADICIONALES QUE DESCRIBEN LA INVENCION: 1. Un derivado de insulina que tiene dos o más sustituciones de cisteína y una cadena lateral unida a la insulina, en donde los tres enlaces disulfuro de insulina humana son retenidos, y los sitios de sustituciones de cisteína se seleccionan de manera que en los residuos cisteína introducidos se colocan en la estructura tridimensional del derivado de insulina plegado para permitir la formación de uno o más enlaces disulfuro adicionales no presentes en la insulina humana. 2. Un derivado de insulina de acuerdo con el aspecto 1, en donde los sitios de sustituciones de cisteína se seleccionan de manera que (1) los residuos de cisteína introducidos se colocan en la estructura tridimensional del derivado de insulina plegado para permitir la formación de uno o más enlaces disulfuro adicionales no presentes en la insulina humana, y (2) el derivado de insulina humana retiene las actividades biológicas deseadas asociadas con la insulina humana . 3. Un derivado de insulina de acuerdo con el aspecto 1 ó 2, en donde los sitios de sustituciones de cisteína se seleccionan de manera que (1) los residuos de cisteína introducidos se colocan en la estructura tridimensional del derivado de insulina plegado para permitir la formación de uno o más enlaces disulfuro adicionales no presentes en la insulina humana, (2) el derivado de insulina humana retiene las actividades biológicas deseadas asociadas con la insulina humana, y (3) el derivado de insulina humana tiene estabilidad física aumentada en relación con la insulina humana y/o la insulina original . 4. Un derivado de insulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos precedentes, en donde los sitios de sustituciones de cisteína se seleccionan de manera que (1) los residuos de cisteína introducidos se colocan en la estructura tridimensional del derivado de insulina plegado para permitir la formación de uno o más enlaces disulfuro adicionales no presentes en la insulina humana, (2) el derivado de insulina humana retiene las actividades biológicas deseadas asociadas con la insulina humana, y (3) el derivado de insulina humana se estabiliza contra degradación proteolítica. 5. Un derivado de insulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos precedentes, hasta la extensión posible, en donde por lo menos un residuo aminoácido en una posición que se selecciona del grupo que consiste de A9 , AlO, All y A12 de la cadena A está sustituido con una cisteína, por lo menos un residuo aminoácido en una posición que se selecciona del grupo que consiste de Bl, B2, B3, B4, B5 y B6 de la cadena B está sustituido con una cisteína y opcionalmente el aminoácido en la posición B30 se ha suprimido . 6. Un derivado de insulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos precedentes, en la extensión posible, en donde el residuo aminoácido en la posición AlO de la cadena A está sustituido con una cisteína, el residuo aminoácido en una posición que se selecciona del grupo que consiste de Bl, B2 , B3 y B4 de la cadena B está sustituido con una cisteína, y opcionalmente el aminoácido en la posición B30 se ha suprimido. 7. Un derivado de insulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos precedentes, en la extensión posible, en donde el residuo aminoácido en la posición AlO de la cadena A está sustituido con una cisteína, el residuo aminoácido en una posición que se selecciona del grupo que consiste de B3 y B4 de la cadena B está sustituido con una cisteína, y opcionalmente el aminoácido en la posición B30 se ha suprimido. 8. Un derivado de insulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos precedentes, en la extensión posible, en donde el residuo aminoácido en la posición AlO de la cadena A está sustituido con una cisteína, y un aminoácido en la posición B3 de la cadena B está sustituido con una cisteína, y opcionalmente el aminoácido en la posición B30 se ha suprimido. 9. Un derivado de insulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos precedentes, en la extensión posible, en donde el residuo aminoácido en la posición AlO de la cadena A está sustituido con una cisteína, el aminoácido en la posición B4 de la cadena B está sustituido con una cisteína, y opcionalmente el aminoácido en la posición B30 se ha suprimido. 10. Un derivado de insulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos precedentes, en donde el residuo aminoácido en la posición A21 de la cadena A está sustituido con cisteína, el ?-esiduo aminoácido en una posición que se selecciona del grupo que consiste de B25 y B26 de la cadena B está sustituido con una cisteína y opcionalmente el aminoácido en la posición B30 está suprimido. 11. Un derivado de insulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos precedentes, en la extensión posible, en donde el residuo aminoácido en la posición AlO de la cadena A está sustituido con cisteína, el residuo aminoácido en una posición que se selecciona del grupo que consiste de Bl, B2 , B3 y B4 de la cadena B está sustituido con una cisteína y opcionalmente el aminoácido en la posición B30 está suprimido, en donde la vida media de eliminación del derivado de insulina se extiende en relación a un derivado de insulina sin uno o más enlaces disulfuro adicionales . 12. Un derivado de insulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos precedentes, en la extensión posible, en donde el residuo aminoácido en la posición AlO de la cadena A está sustituido con una cisteína, el residuo aminoácido en una posición que se selecciona del grupo que consiste de B3 y B4 de la cadena B está sustituido con una cisteína y opcionalmente el aminoácido en la posición B30 está suprimido, en donde la vida media de eliminación del derivado de insulina se extiende en relación a un derivado de insulina sin uno o más enlaces disulfuro adicionales. 13. Un derivado de insulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos precedentes, en la extensión posible, en donde el residuo aminoácido en la posición AlO de la cadena A está sustituido con una cisteína y un aminoácido en la posición B3 de la cadena B está sustituido con una cisteína, y opcionalmente el aminoácido en la posición B30 está suprimido, en donde la vida media de eliminación del derivado de insulina se extiende en relación a un derivado de insulina sin uno o más enlaces disulfuro adicionales. 14. Un derivado de insulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos precedentes, en la extensión posible, en donde el residuo aminoácido en la posición AlO de la cadena A está sustituido con una cisteína, el aminoácido en la posición B4 de la cadena B está sustituido con una cisteína, y opcionalmente el aminoácido en la posición B30 está suprimido, en donde la vida media de eliminación del derivado de insulina se extiende en relación a un derivado de insulina sin uno o más enlaces disulfuro adicionales. 15. Un derivado de insulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos precedentes, en donde el residuo aminoácido en la posición A21 de la cadena A está sustituido con una cisteína, el residuo aminoácido en una posición que se selecciona del grupo que consiste de B25 y B26 de la cadena B está sustituido con una cisteína, y opcionalmente el aminoácido en la posición B30 está suprimido, en donde la vida media de eliminación del derivado de insulina se extiende en relación a un derivado de insulina sin uno o más enlaces disulfuro adicionales. 16. Un derivado de insulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos precedentes, en la extensión posible, en donde uno o más enlaces disulfuro adicionales se obtienen entre la cadena A y la cadena B. 17. Un derivado de insulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos precedentes, en la extensión posible, en donde uno o más enlaces disulfuro adicionales se obtienen entre la cadena A y la cadena B . 18. Un derivado de insulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos precedentes, en la extensión posible, en donde por lo menos un enlace disulfuro adicional se conecta a dos cisteínas en la cadena A o se conecta a dos cisteínas en la cadena B. 19. Un derivado de insulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos precedentes, en la extensión posible, en donde la unión de receptor al receptor de insulina es por lo menos 1% de la unión de receptor de un derivado de insulina sin uno o más enlaces disulfuro adicionales . 20. Un derivado de insulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos precedentes, en la extensión posible, en donde la unión de receptor al receptor de insulina es por lo menos 25% de la unión de receptor de un derivado de insulina sin uno o más enlaces disulfuro adicionales. 21. Un derivado de insulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos precedentes, en la extensión posible, en donde la unión de receptor al receptor de insulina es por lo menos 50% de la unión de receptor de un derivado de insulina .sin uno o más enlaces disulfuro adicionales . 22. Un derivado de insulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos precedentes, en la extensión posible, en donde la unión de receptor al receptor de insulina es por lo menos 75% de la unión de receptor de un derivado de insulina sin uno o más enlaces disulfuro adicionales. 23. Un derivado de insulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos precedentes, en la extensión posible, en donde la unión de receptor al receptor de insulina es por lo menos 90% de la unión de receptor de un derivado de insulina sin uno o más enlaces disulfuro adicionales . 24. Un derivado de insulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos precedentes, en la extensión posible, el cual tiene estabilidad física mejorada en relación a la insulina original. 25. Un derivado de insulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos precedentes, en la extensión posible, el cual tiene un perfil más prolongado en comparación con el derivado de insulina sin uno o más enlaces disulfuro adicionales. 26. Un derivado de insulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos precedentes, en la extensión posible, el cual tiene una vida media de eliminación extendida en relación a un derivado de insulina sin uno o más enlaces disulfuro adicionales. 27. Un derivado de insulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos precedentes, en la extensión posible, en donde el aminoácido en la posición B30 se ha suprimido. 28. Un derivado de insulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos precedentes, en la extensión posible, en donde por lo menos un enlace disulfuro adicional se conecta a dos cisternas en la cadena A o se conecta a cisteínas en la cadena B. 29. Un derivado de insulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos precedentes, en la extensión posible, el cual tiene dos sustituciones de cisteína. 30. Un derivado de insulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos precedentes, en la extensión posible, en donde la insulina se selecciona del grupo que consiste de: A10C, A14E, B1C, B16H, B25H, desB30 insulina humana, A10C, A14E, B1C,B25H, desB30 insulina humana, A10C, A14E, B2C, B16H, B25H, desB30 insulina humana, A10C, A14E, B2C, B25A, desB30 insulina humana, A10C, A14E, B2C, B25H, desB30 insulina humana, A10C, A14E, B3C( B16H, B25H, desB30 insulina humana, A10C, A14E, B3C, ?25?, desB27, desB30 insulina humana, A10C, A14E, B3C, B25H, desB30 insulina humana, A10C, A14E, B3C, desB27, desB30 insulina humana, A10C, A14E, B4C, B16H, B25H, desB30 insul humana, A10C, A14E, B4C, B25A, desB30 insulina humana, A10C, A14E, B4C, B25H, B28E, desB30 insulina humana, A10C, A14E, B4C, B25H, desB27, desB30 insulina humana, A10C, A14E, B4C, B25H, desB30 insulina humana, A10C, A14E, B4C, B25N, B27E, desB30 insul humana, A10C, A14E, B4C, B25N, desB27, desB30 insulina humana, A10C, A14E, desBl, B4C, B25H, desB30 insulina humana, A10C, A14H, B4C, B25H, desB30 insulina humana, A10C, B3C, B25H, desB27, desB30 insulina humana, A10C, B3C, B25H, desB30 insulina humana, A10C, B4C, B25H, desB27 , desB30 insulina humana, A10C, B4C, B25H, desB30 insulina humana, A10C, A14E, B1C, B16H, B25H, desB30 insulina humana, A10C, A14E, B2C, B16H, B25H, desB30 insulina human , A10C, A14E, B3C, B16H, B25H, desB30 insulina humana, A10C, A14E, B4C, B16H, B25H, desB30 insulina humana y una cadena lateral se une a la parte N-terminal de la insulina o el grupo amino epsilon de un residuo lisina en la insulina. 31. Un derivado de insulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos precedentes, en la extensión posible, en donde la insulina se selecciona del grupo que consiste de: A10C, A14E, B1C, B16H, B25H, desB30 insulina humana, A10C, A14E, B1C, B25H, desB30 insulina humana, A10C, A14E, B2C, B16H, B25H, desB30 insulina humana, A10C, A14E, B2C, B25A, desB30 insulina humana, A10C, A14E, B2C, B25H, desB30 insulina humana, A10C, A14E, B3C, B16H, B25H, desB30 insulina humana, A10C, A14E, B3C, B25H, desB27, desB30 insulina humana, A10C, A14E, B3C, B25H, desB30 insulina humana, AIOC, A14E, B3C, desB27, desB30 insulina humana, AlOC, A14E, B4C, B16H, B25H, desB30 insulina AlOC, A14E, B4C, B25A, desB30 insulina humana, AlOC, A14E, B4C, B25H, B28E, desB30 insulina AlOC, A14E, B4C, B25H, desB27, desB30 insulina AlOC, A14E, B4C, B25H, desB30 insulina humana, AlOC, A14E, B4C, B25N, B27E, desB30 insulina AlOC, A14E, B4C, B25N, desB27, desB30 insulina AlOC, A14E, desBl, B4C, B25H, desB30 insulina AlOC, A14H, B4C, B25H, desB30 insulina humana, AlOC, B3C, B25H, desB27, desB30 insulina humana, AlOC, B3C, B25H, desB30 insulina humana, AlOC, B4C, B25H, desB27, desB30 insulina humana, AlOC, B4C, B25H, desB30 insulina humana, AlOC, A14E, B1C, B16H, B25H, desB30 insulina AlOC, A14E, B2C, B16H, B25H, desB30 insulina A10C, A.14E, B3C, B16H, B25H, desB30 insulina humana, A10C, A14E, B4C, B16H, B25H, desB30 insulina humana y LA cadena lateral se une aL grupo amino epsilon de un residuo lisina en la cadena B de la insulina. 32. Un derivado de insulina de cualquiera de los aspectos precedentes, en la extensión posible, en donde la insulina se selecciona del grupo que consiste de: A10C, A21G, B1G, B3C, B27E, desB30 insulina humana A10C, A21G, B1G, B3E , B4C, B27E, desB30 insulina humana A10C, A21G, B2C, B3E, B27E, B28K, desB29, desB30 insulina humana A10C, A21G, B2C, B3E, B28E, desB30 insulina humana A10C, A21G, B3C, B27E, B28K, desB29, desB30 insulina humana A10C, A21G, B3C, B28E, desB30 insulina humana A10C, A21G, B3E, B4C, B22E, B28E, desB30 insulina humana A10C, A21 G, B3E, B4C, B27E, B28K, desB29, desB30 insulina humana A10C, A21 G, B3E, B4C, B28E, desB30 insulina humana A10C, A21G, B3E, B4C, desB24, B28E, desB30 insulina humana A10C, A21G, B3K, B4C, B28E, desB30 insulina humana A10C, A21G, B3Q, B4C, B28D, desB30 insulina humana AlOC, A21G, B3Q, B4C, B28E, desB30 insulina humana AlOC, A21G, B4C, B28E, desB30 insulina humana AlOC, A21 G, B4C, desB30 insulina humana AlOC, A21G, desBl, B2C, B3E, B27E, B28K, desB29, desB30 insulina humana AlOC, A21G, desBl, B2C , B3E, B28E, desB30 insulina humana AlOC, A21G, desBl, B3C, B27E, B28K, desB29, desB30 insulina humana AlOC, A21G, desBl, B3C, B27E, desB30 insulina humana AlOC, A21G, desBl, B3C, B28E, desB30 insulina humana AlOC, A21G, desBl, B3E, B4C, B27E, B28K, desB29, desB30 insulina humana AlOC, A21G, desBl, B3E, B4C, B28E, desB30 insulina humana AlOC, A21G, desBl, B3Q, B4C, B28E, desB30 insulina humana AlOC, A22K, B3C, desB27, desB30 insulina humana AlOC, B1C, B28D, desB30 insulina humana AlOC, B2C, B28D, desB30 insulina humana AlOC, B2C, B3A, desB30 insulina humana AlOC, B2C, B3D, desB30 insulina humana A10C, B2C, B3E, desB30 insulina humana A10C, B2C, B3F, desB30 insulina humana A10C, B4C, B28D insulina humana A10C, B4C, B28D, desB30 insulina humana y la cadena lateral se une a la parte N- terminal de la insulina o el grupo amino epsilon de un residuo lisina en la insulina. 33. Un derivado de insulina de cualquiera de los aspectos precedentes, en la extensión posible, en donde la insulina se selecciona del grupo que consiste de: A10C, A21G, B1G, B3C, B27E, desB30 insulina humana A10C, A21G, B1G, B3E , B4C, B27E, desB30 insulina humana A10C, A21G, B2C, B3E, B27E, B28K, desB29, desB30 insulina humana A10C, A21G, B2C, B3E, B28E, desB30 insulina humana A10C, A21G, B3C, B27E, B28K, desB29, desB30 insulina humana A10C, A21G, B3C, B28E, desB30 insulina humana A10C, A21G, B3E , B4C, B22E, B28E, desB30 insulina humana A10C, A21G, B3E, B4C, B27E, B28K, desB29, desB30 insulina humana A10C, A21G, B3E, B4C, B28E, desB30 insulina humana A10C, A21G, B3E, B4C, desB24, B28E, desB30 insulina humana A10C, A21G, B3K, B4C, B28E, desB30 insulina humana A10C, A21G, B3Q, B4C, B28D, desB30 insulina humana A10C, A21G, B3Q, B4C , B28E, desB30 insulina humana A10C, A21G, B4C, B28E, desB30 insulina humana A10C, A21G, B4C, desB30 insulina humana AlOC, A21G, desBl, B2C, B3E, B27E, B28K, desB29, desB30 insulina humana A10C, A21G, desBl, B2C , B3E, B28E, desB30 insulina humana AlOC, A21G, desBl, B3C, B27E, B28K, desB29, desB30 insulina humana AlOC, A21G, desBl, B3C, B27E, desB30 insulina humana AlOC, A21G, desBl, B3C, B28E, desB30 insulina humana AlOC, A21G, desBl, B3E, B4C, B27E, B28K, desB29, desB30 insulina humana AlOC, A21G, desBl, B3E , B4C, B28E, desB30 insulina humana AlOC, A21G, desBl, B3Q, B4C, B28E, desB30 insulina humana AlOC, A22K, B3C, desB27, desB30 insulina humana AlOC, B1C, B28D, desB30 insulina humana AlOC, B2C, B28D, desB30 insulina humana A10C, B2C, B3A, desB30 insulina humana A10C, B2C, B3D, desB30 insulina humana A10C, B2C, B3E, desB30 insulina humana A10C, B2C, B3F, desB30 insulina humana A10C, B4C, B28D insulina humana A10C, B4C, B28D, desB30 insulina humana y la cadena lateral se une a un grupo amino epsilon de un residuo lisina en la cadena B de la insulina. 34. Un derivado de insulina de cualquiera de los aspectos precedentes, en la extensión posible, en donde la cadena lateral se une al N-terminal de la insulina o al grupo amino epsilon de un residuo lisina en la insulina. 35. Un derivado de insulina de cualquiera de los aspectos precedentes, en la extensión posible, en donde la cadena lateral se une al grupo amino epsilon de un residuo lisina en la cadena B de a insulina. 36. Un derivado de insulina de cualquiera de los aspectos precedentes, en la extensión posible, en donde la cadena lateral es una porción acilo de la fórmula general: Acy-AAln-AA2m-AA3p- . 37. Un derivado de insulina de cualquiera de los aspectos precedentes, ' en la extensión posible, el cual se selecciona del grupo que consiste de derivados de insulina mencionados en los ejemplos. 38. Un método para estabilizar una insulina que comprende sustituir dos o más aminoácidos de una insulina con residuos cisteína y unir una cadena lateral a la insulina, en donde a. se retienen tres enlaces disulfuro de insulina humana, y b. los sitios de sustituciones de cisteína se seleccionan de manera tal que los residuos cisteína introducidos se colocan en la estructura tridimensional del derivado de insulina plegado para permitir la formación de uno o más enlaces disulfuro adicionales no presentes en la insulina humana, por lo que se genera un derivado de insulina que comprende uno o más enlaces disulfuro adicionales no presentes en la insulina humana. 39. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad biológicamente activa del derivado de insulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos 1-37 y un portador farmacéuticamente aceptable. 40. Una composición farmacéutica de acuerdo con el aspecto 39 la cual comprende además un portador y/o excipiente farmacéuticamente aceptable y, opcionalmente, un adyuvante . 41. Un método para el tratamiento de diabetes mellitus en un sujeto, que comprende administrar a un sujeto un derivado de insulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos 1 a 37 o una composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de los aspectos 39 a 40. 42. Un método para reducir la concentración de glucosa en . sangre en mamíferos al administrar al paciente en necesidad del tratamiento una dosis terapéuticamente activa de un derivado de insulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos 1 a 37 o una composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de los aspectos 39 a 40. 43. Un derivado de insulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos 1 a 37 para uso como una sustancia farmacéutica en el tratamiento o prevención de hiperglucemia , diabetes tipo 2, tolerancia deteriorada a la glucosa y diabetes tipo 1. 44. Un derivado de insulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos 1 a 37 para uso como una sustancia farmacéutica en el retraso o prevención de progreso de enfermedad en diabetes tipo 2. 45. Un proceso para preparar una composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de los aspectos 39 a 40 que comprende mezclar un derivado de insulina de acuerdo con cualquiera de los aspectos 1 a 37 con sustancias y/o excipientes farmacéuticamente aceptables. 46. Una composición farmacéutica que se puede obtener por el proceso de acuerdo con el aspecto 45.

Todas las referencias, que incluyen publicaciones, solicitudes de patente y patentes mencionados en la presente se incorporan en este documento como referencia en su totalidad y en la misma medida como si cada referencia fuera indicada individual y específicamente para ser incorporada como referencia y en donde se establece su totalidad en la presente (en el grado máximo permitido por la ley) .

Todos los encabezados y subencabezados se utilizan en la presente por conveniencia únicamente y no deben considerarse como limitantes de la invención de modo alguno.

El uso de cualquiera y la totalidad de los ejemplos o lenguaje ejemplar (por ejemplo, "tal como") que se proporciona en la presente únicamente se pretende que aclare de mejor manera la invención y no representa una limitación respecto al alcance de la invención, a menos que se reivindique en otro sentido. En la redacción de la especificación nada debe considerarse que indique un elemento no reivindicado como esencial para la práctica de la invención .

La cita e incorporación de documentos de patente en la presente se realiza por conveniencia únicamente y no refleja punto de vista alguno respecto a la validez, patentabilidad y/o puesta en vigor de tales documentos de patente .

Esta invención incluye todas las modificaciones y equivalentes de la materia objeto reivindicada en las reivindicaciones que se anexan en la presente, como lo permite la ley aplicable.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustración y no como limitación.

Las abreviaturas utilizadas en la presente son las siguientes: pAla es beta-alanil, Aoc es ácido 8-aminooctanoico, tBu es terbutilo, DCM es diclorometano, DIC es diisopropilcarbodiimida, DIPEA = DIEA es N, N-diisopropiletilamina, DMF es N, -dimetilformamida, DMSO es sulfóxido de dimetilo, EtOAc es acetato de etilo, Fraoc es 9- fluorenilmetilcarboxicarbonilo, yGlu es gamma L-glutamilo, HC1 es ácido clorhídrico, HOBt es 1-hidroxibenzotriazol , NMP es N-metilpirrolidona, MeCN es acetonitrilo, OEG es [2- (2-aminoetoxi) etoxi] etilcarbonilo, Su es succinimidil-1-ilo = 2 , 5-dioxo-pirrolidin-l-ilo, OSu es succinimidil-l-iloxi = 2 , 5-dioxopirrolidin-l-iloxi, RPC es cromatografía en fase inversa, t.a. es temperatura ambiente, TFA es ácido trifluoroacético , THF es tetrahidrofurano, TNBS es ácido 2 , , 6-trinitrobencensulfónico, TRIS es tris (hidroximetil) -aminometano y TSTU es tetrafluoroborato de O- (N- succinimidil) -1,1,3, 3 -tetrametiluronio .

Los siguientes ejemplos y procedimientos generales hacen referencia a compuestos intermediarios y productos finales identificados en la descripción y en los esquemas de síntesis. La preparación de los compuestos de la presente invención se describe detalladamente utilizando los siguientes ejemplos, pero las reacciones químicas descritas se presentan en términos de su aplicabilidad general para la preparación de los compuestos de la invención. Ocasionalmente, la reacción puede no ser aplicable como se describe a cada compuesto incluido dentro del alcance descrito de la invención. Los compuestos para los cuales sucede esto se reconocerán fácilmente por aquellos expertos en el ámbito. En estos casos, las reacciones se pueden llevar a cabo con éxito mediante modificaciones convencionales conocidas por aquellos expertos en el ámbito, es decir, mediante protección apropiada de los grupos de interferencia o al cambiar otros reactivos convencionales o por modificación habitual de las condiciones de reacción. Alternativamente, otras reacciones descritas en la presente o convencionales en otro sentido serán aplicables para la preparación de los compuestos correspondientes de la invención. En todos los métodos de preparación, todos los materiales iniciales se conocen o se pueden preparar f cilmente a partir de materiales iniciales conocidos . Todas las temperaturas se proporcionan en peso cuando hacen referencia a los rendimientos y todas las partes son en volumen cuando hace referencia a disolventes y eluyentes.

Los compuestos de la invención se pueden purificar al utilizar uno o más de los siguientes procedimientos los cuales son típicos dentro del ámbito. Estos procedimientos se pueden modificar - si se requiere - con respecto a los gradientes, pH, sales, concentraciones, flujo, columnas, etc. Dependiendo de factores tales como el perfil de impureza, la solubilidad de las insulinas en cuestión, etc., estas modificaciones pueden ser reconocidas fácilmente y realizadas por una persona experta en el ámbito.

Después de CLAR ácida o eliminación de sal, los compuestos se aislan por liofilización de las fracciones puras .

Después de CLAR neutra o cromatografía de intercambio aniónico se elimina la sal de los compuestos, por ejemplo, mediante cromatografía de exclusión de tamaño, precipitado a pH isoeléctrico o eliminación de sal por CLAR ácida .

PROCEDIMIENTOS TIPICOS DE PURIFICACION; El sistema CLAR es un sistema Gilson que consiste de lo siguiente: manejador de líquido modelo 215, bomba modelo 322-H2 y un detector UV modelo 155. La detección habitualmente es a 210 nm y 280 nm.

El sistema Ákta Purifier FPLC (Amershan Biosciences) consiste de lo siguiente: bomba modelo P-900, detector UV modelo UV-900, detector de pH y conductividad modelo pH/C-900, recolector de fracciones modelo Frac-950. La detección UV típicamente es a 214 nm, 254 nm y 276 nm.

CLAR ACIDO Columna: Macherey-Nagel SP 250/21 Nucleusil 300-7 C4 Flujo: 8 ml/min Amortiguador A: TFA 0.1% en acetonitrilo Amortiguador B: TFA 0.1% en agua Gradiente: 0.0 - 5.0 min: 10% de A 5.00 - 30.0 min: 10% de A a 90% de A 30.0 - 35.0 min: 90% de A 35.0 - 40.0 min: 100% de A CLAR NEUTRA Columna: Phenomenex, Júpiter, CA 5 µp? 250 x 10.00 mm, 300 Á Flujo: 6 ml/min Amortiguador A: TRIS 5 mM, (NH4)2S04 7.5 mm, pH = 7.3, CH3CN 20% Amortiguador B: CH3CN 60%, agua 40% Gradiente: 0.5 min: 10% de B 5 - 35 min: 10-60 de B 35 - 39 min: 60% de B 39 - 40 min: 70% de B 40 - 43.5 min: 70% de B CROMATOGRAFIA DE INTERCCAMBIO ANIONICO Columna: RessourceQ, 1 mi Flujo: 6 ml/min Amortiguador A: NH4HC03 0.09%, NH4OAc 0.25%, etanol 42.5%, pH 8.4 Amortiguador B: NH4HC03 0.09%, NH4OAc 2.5%, etanol 42.5%, pH 8.4 Gradiente: 100% de A a 100% de B durante 30 volúmenes de columna ELIMINACION DE SAL; Columna: HiPrep 26/10 Flujo: 10 ml/min, 6 volúmenes de columna Amortiguador: NH4HC03 10 mM PROCEDIMIENTO GENERAL PARA LA SINTESIS EN FASE SOLIDA DE REACTIVOS DE ACILACION DE LA FORMULA GENERAL (II) : (II) : Acy-AAln-AA2m-AA3p-Act, en donde Acy, AA1, AA2, AA3 , n, m y p son como se define en lo anterior y Act es el grupo saliente de un éster activo tal como N-hidroxisuccinimida (OSu) o 1 -hidroxibenzotriazol , y en donde los ácidos carboxílieos dentro de las porciones Acy y AA2 de la porción acilo son protegidas como ásteres de terbutilo.

Los compuestos de la fórmula general (II) de acuerdo con la invención se pueden sintetizar sobre un soporte sólido utilizando procedimientos bien conocidos por personas expertas en el ámbito de la síntesis de péptidos en fase sólida. Este procedimiento comprende la unión de un aminoácido protegido con Fmoc a una resina de 2-clorotritilcloruro de poliestireno . La unión se puede complétar, por ejemplo, utilizando el aminoácido protegido en N libre en presencia de una amina terciaria como trietilamina o N, -diisopropiletilamina (véanse referencias más adelante) . El extremo C- erminal (el cual está unido a la resina) de este aminoácido está en el extremo de una secuencia de síntesis que se acopla a las insulinas originales de la invención. Después de la unión del aminoácido Fmoc a la resina, el grupo Fmoc se desprotege utilizando, por ejemplo, aminas secundarias, como piperidina o dietilamina seguido por acoplamiento a otro (o el mismo) aminoácido protegido con Fmoc y desprotección. La secuencia de síntesis finaliza por acoplamiento de (a,?) diácidos grasos protegidos con monoterbutilo, como esteres monoterbutílieos de los ácidos hexadecanodioico, heptadecanodioico, octadecanodioco o eicosanodioico . La separación de los compuestos de la resina se lleva a cabo utilizando ácido diluido como 0.5-5% de TFA/DCM (ácido trifluoroacético en diclorometano) , ácido acético (por ejemplo 10% en DCM o HOAc/trifluoroetanol/DCM 1:1:8) , o hexafluoroisopropanol en DCM (véase, por ejemplo, "Organic Synthesis on Solid Phase", F.Z. Dórwad, Wiley-VCH, 2000. ISBN 3-527-29950-5, "Peptides: Chemistry and Biology" , N. Sewald & H.-D. Jakubke, Wiley-VCH, 2002, ISBN 3-527-30405-3 o "The Combinational Cheemistry Catalog" 1999, Novabiochem AG, y las referencias mencionadas en esos documentos) . Esto asegura que los ásteres de terbutilo presentes en los compuestos como grupos grupos protectores de ácido carboxílico no se han desprotegidos. Finalmente, el grupo carboxi C-terminal (liberado de la resina) se activa, por ejemplo, como un éster de N-hidroxisuccinimida (OSu) y se utiliza directamente o después de purificación como reactivo de acoplamiento en unión a insulinas originales de la invención.

De manera alternativa, los reactivos de acilacióri de la fórmula general (II) anteriores se pueden preparar por solución en síntesis de fases como se describe más adelante.

Los diácidos grasos protegidos como monoterbutilo tales como ácido hexadecanodioco, heptadecanodioico , octadecanodioixo o eicosanodioico se activan, por ejemplo, como OSu-ésteres como se describe en lo siguiente o como cualquier otro éster activado conocido por aquellos expertos en el ámbito, tales como ésteres de HOBt o HOAt . Este éster activo se acopla con uno de los aminoácidos AA1, AA2 o AA3 protegido con monoterbutilo en un disolvente adecuado tal como THF, DMF, NMP (o una mezcla de disolventes) en presencia de una base adeuada tal como DIPEA o trietilamina . El intermediario se aisla, por ejemplo, por procedimientos de extracción o por procedimientos cromatográficos .

El intermediario resultante nuevamente se someta a activación (como se describe en lo anterior) y a acoplamiento con uno de los aminoácidos AA1, AA2 o AA3 protegidos con monoterbutilo como se describe en lo anterior. Este procedimiento se repite hasta que se obtiene el intermediario protegido deseado Acy-AAln-AA2mAA3p-OH . Esto a su vez se activa para proporcionar los reactivos de acilación de la fórmula general (II) Acy-AAln-AA2raAA3p-Act.

Los reactivos de acilación preparado por cualquiera de los métodos anteriores puede ser desprotegido con (terbutilo) después de la activación de esteres de OSu . Esto se puede realizar por tratamiento con TFA del reactivo de acilación protegido con terbutilo activado con OSu. Después de la acilación de cualquier insulina estabilizada con proteasa se obtiene la insulina de la invención estabilizada con proteasa acilada no protegida resultante.

Si los reactivos preparados por cualquiera de los métodos anteriores no se desprotegen (con terbutilo) después de activación como ésteres de OSu, la acilación de cualquier insulina estabilizada con proteasa proporciona la insulina de la invención estabilizada con proteasa acilada protegida con terbutilo correspondiente. Con el fin de obtener la insulina de la invención estabilizada con proteasa acilada y no protegida, la insulina protegida debe ser desprotegida. Esto se puede realizar por tratamiento con TFA para proporcionar la insulina de la invención estabilizada con proteasa acilada desprotegida .

La acilación de un residuo lisina (en la posición epsilon) de insulina humana o un análogo de insulina se realiza a pH alcalino (por ejemplo a pH 10, 10.5, 11, 11.5 ó 12) .

El procedimiento general (A) se ilustra en el primer ejemplo.

EJEMPLO 1, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) A10C, A14E, B4C, B25H, B29K (Ne-octadecanodioil-gGlu-OEG-OEG) desB30 insulina humana Nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) N{Epsilon-B29} - [2 - [2- [2 - [ [2 - [2 - [2 - [2 - [ [ (4S) -4-carboxi-4- (17 -carboxiheptadecanoilamino) butanol] amino] -etoxi] etoxi] acetil] amino] etoxi] -etoxi] acetil] - [CysAlO, GluA14 , CysB4 , HisB25] , des-Thr-B30-insulina (humana) Se disuelven 2 g de A10C, B4C, A14E, B25H,desB30 insulina humana en 50 mi de Na2C03 acuoso 100 mM, se agregan 3 mi de N P. Se ajusta el pH a 11.2 con NaOH 1 N. Se agrega de manera simultánea octadecanodioil-gGlu-OEG-OEG-OSu (0.8 g, 1.4 equivalentes) disuelto en 6 mi de NMP con NaOH 1N manteniendo el pH en aproximadamente 11. Después de 5 minútos se agregan 40 mi de agua y el pH se hace descender a 5.5 por adición de HC1 1 N. El precipitado se aisla por centrifugación. El residuo se disuelve en 30 mi de acetonitrilo y 30 mi de agua que contiene TFA 1% y se purifica por CLAR en 4 corridas: Columna: Phenomenex, Gemini, 5 µ, C18, 110 Á, 250 X 30 CM Flujo: 20 ml/min1 Eluyentes : A: TFA 0.1% en agua B: TFA 0.1% en acetonitrilo, Gradiente : 0-7.5 min: 10% de B, 7.5-87.5 min: 10% de B a 60% de B, 87.5-92.5 min: 60% de B 92.5-97.5 min: 60% de B a 100% de B 97.5-100 min: 100% de B 100-103 min: 10% de B Las fracciones puras se acumulan y liofilizan. El material seco se disuelve en 200 mi de agua y se agrega NaOH 0.1 N a pH = 8.1 y se liofiliza para proporcionar 1 g del derivado de insulina del título.

MALDI-E : m/z : 6340; calculado: 6341.

CL-EM (electroaspersión): m/z = 1586.04 (M+4) / (6340) EJEMPLO 2, PROCEDIMIENTO GENERAL (A): A10C, A14E, B3C, B25H, B29K (N (eps) octadecanodioil -gGlu) , desB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29} - [ (4S) -4 -carboxi-4 - (17-carboxiheptadecanoilamino) butanoil] [CysAlO , GluA14 , CysB3 , HisB2 5] , des -ThrB30- Insulina (humana) CLEM (electroaspersión) : m/z = 1517.0 (M+4)/4 (6064) EJEMPLO 3, PROCEDIMIENTO GENERAL (A): A10C, A14E, B3C, B25H, B29K (Ne-octadecanodioil) , desB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29} -17-carboxiheptadecanoil- [CysAlO , CysB3 , HisB25] , des-ThrB30-Insulina humana EM (electroaspersión) m/4 : m/z = 1485.0 (5935.9) . Calculada: 1484.8 EJEMPLO 4, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) : A10C, A14E, B3C, B25H, B29K (Ne-octadecanodioil-gGlu) , desB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29} - [ (4S) -4 -carboxi-4- (17-carboxiheptadecanoilamino) butanoil] [CysAlO , CysB3 , HisB25] , des-ThrB30- Insulina (humana) MS (electroaspersión) m/4: m/z = 1525.8 (6099.1) . Calculada: 1525.8 EJEMPLO 5, PROCEDIMIENTO GENERAL (A): A10C, A14E, desBl, B4C, B25H, B29K (Ne-octadecanodioil-gGlu-2xOEG) , desB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29} - [2- [2- [2 - [ [2- [2- [2 - [ [ (4S) -4-carboxi-4- ( 17 -carboxiheptadecanoilamino) butanoil] amino] -etoxi] etoxi] acetilamino] etoxi] etoxi] acetil] -[CysA10,GluA14(CysB4,HisB25] , des-PheBl, ThrB30- Insulina (humana) - (A) -péptido, (B2-B29) -péptido MS (electroaspersión) m/4 : m/z = 1549.4 (6193.6) . Calculada: 1549.3 Los siguientes derivados se prepararon de manera similar: EJEMPLO 6, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) : A10C, A14H, B4C, B25H, B29K (Ne"°ctadecanodioil -gGlu-2xOEG) , deSB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29}- [2- [2- [2- [ [2- [2- [2- [ [ (4S) -4-carboxi- 4- (17-carboxiheptadecanoil-amino) butanoil] amino] etoxi] -etoxi] acetilamino] etoxi] etoxi] acetil- [CysAlO , HisA14 , CysB4 , HisB25] , des-ThrB30 - Insulina (humana) Los siguientes análogos se preparan de manera similar: EJEMPLO 7, PROCEDIMIENTO GENERAL (A): A10C, A14E, B3C, B25H, B29K (?e -eicosanodioil-gGlu-2xOEG) , desB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29}- [2- [2- [2- [ [2- [2- [2- [ [ (4S) -4-carboxi-4- (19 -carboxinonadecanoil-araino) butanoil] amino] etoxi] -etoxi] acetil] amino] etoxi] etoxi] acetil] - [CysA10íGluA14,CysB3,HisB25] , des- hrB30-Insulina (humana) MS (electroaspersión) m/4 : m/z = 1597.6 (6386.4).

Calculada: 1597.5 EJEMPLO 8, PROCEDIMIENTO GENERAL (A): A10C, A14E, B1C, B25H, B29K (Ne-eicosanodioil-gGlu- 2xOEG) , desB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29} - [2- [2- [2- [ [2- [2- [2- [ [ (4S) -4-carboxi- 4- ( 19 -carboxinonadecanoil-amino) butanoil] amino] etoxi] etoxi] ] acetil] amino] etoxi] etoxi] -acetil] - [CysA10,GluA14,CysBl,HisB25] , des-ThrB30-Insulina (humana) MS (electroaspersión) m/4: m/z = 1588.9 (6351.6). Calculada: 1588.8 EJEMPLO 9, PROCEDIMIENTO GENERAL (A): A10C, A14E, B4C, B25H, B29K (Ne -octadecanodioil -gGlu) , desB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29}- [ (4S) -4-carboxi-4- (17-carboxiheptadecanoilamino) butanoil] [CysAlO , GluA14 , CysB4 , HisB2 5] , des -ThrB30- Insulina (humana) MS (electroaspersión) m/4: m/z = 1514.1 (6351.6). Calculada: 1513.8 EJEMPLO 10, PROCEDIMIENTO GENERAL (A): A10C, A14E, B3C, B25H, B29K (Ne"octadecanodioil -gGlu-OEG-OEG) , desB30 insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29} - [2- [2- [2- [ [2- [2- [2- [ [ (4S) -4-carboxi- 4- (17-carboxiheptadecanoil-amino) butanoil] amino] etox ] -etoxi] acetil] amino] etoxi] etoxi] acetil] - [CysA10,GluA14,CysB3,HisB25] , des -ThrB30 -Insulina (humana) MS (electroaspersión) m/4 : m/z = 1589.6 (6355.4). Calculada: 1589.9 EJEMPLO 11, PROCEDIMIENTO GENERAL (A): A10C, A14E, B3C , B25H, B29K (Ne-octadecanodioil-gGlu-gGlu) , desB30 insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29} - [ (4S) -4 -carboxi-4 - [ [ (4S) -4-carboxi- 4- (17-carboxiheptadecanoil-amino) butanoil] amino] butanoil] -[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25] , des-ThrB30-Insulina humana MS (electroaspersión) m/4: m/z = 1549.2 (6194.2). Calculada: 1549.6 EJEMPLO 12, PROCEDIMIENTO GENERAL (A): A10C, A14E, B4C, B25H, desB27 , B29K (?e-octadecanodioil-gGlu) , desB30 insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29} - [ (4S) -4-carboxi-4- (17-carboxiheptadecanoilamino) butanoil] [CysAlO, GluA14 , CysB , HisB2 5] , des-ThrB27 , ThrB3 O -Insulina (humana) MS (electroaspersión) m/4 : m/z = 1488 (5948). Calculada: 1488 EJEMPLO 13, PROCEDIMIENTO GENERAL (A): A10C, A14E, B4C , B25H, B29K (Ne-octadecanodioil) , desB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29 } -17-carboxiheptadecanoil- [CysAlO , GluA14 , CysB4 , HisB25] , desThrB30- Insulina (humana) MS (electroaspersión) m/4: m/z = 1481.9 (5921.9). Calculada: 1481.5 EJEMPLO 14, PROCEDIMIENTO GENERAL (A): A10C, A14E, B4C, B25H, B29K (Ne-octadecanodioil-gGlu-gGlu) , desB30 insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29} - [ (4S) -4-carboxi-4- [ [ (4S) -4-carboxi-4- ( 17 -carboxiheptadecanoil-amino) butanoil] amino] butanoil] -[CysAlO , GluA14 , CysB4 , HisB25] , des-ThrB30-Insulina humana MS (electroaspersión) m/4: m/z = 1546.1 (6180.2). Calculada: 1545 EJEMPLO 15, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) : A10C, A14E, B2C# B25H, B29K (NE-octadecanodioil-gGlu-OEG-OEG) , desB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29} - [2- [2- [2- [ [2- [2- [2- [ [ (4S) -4-carboxi-4- ( 17-carboxiheptadecanoil-amino) butanoil] amino] etoxi] etoxi] -acetil] amino] etoxi] etoxi] acetil] - [CysA10,GluA14,CysB2,HisB25] , des-ThrB30-Insulina (humana) MS (electroaspersión) m/4 : m/z = 1593.6 (6370.4). Calculada: 1593.6 EJEMPLO 16, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) : A10C, A14E, B1C, B25H, B29K (Ne-octadecanodioil-gGlu-OEG-OEG) , desB30 insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29} - [2- [2- [2- [ [2- [2- [2- [ [ (4S) -4-carboxi- 4 - (17-carboxiheptadecanoil-amino) butanoil] amino] etoxi] -etoxi] acetil] amino] etoxi] etoxi] acetil] - [CysA10,GluA14,CysBl,HisB25] , des -ThrB30- Insulina (humana) MS (electroaspersión) m/4: m/z = 1581.5 (6322.1). Calculada: 1581.5 EJEMPLO 17, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) : A10C, A14E, B3C, B16H, B25H, B29K (Ne-eicosanodioil-gGlu-OEG-OEG) , desB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29} - [2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S) -4-carboxi- 4 - ( 19 -carboxinonadecanoi1 -amino) butanoi1] amino] etoxi] -etoxi] acetil] amino] etoxi] etoxi] acetil] -[CysAl0,GluA14,CysB3,HisB16,HisB25] , des-ThrB30 - Insulina (humana) MS (electroaspersión) m/4: m/z = 1590.5 (6357.8).

Calculada: 1590.5 EJEMPLO 18, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) A10C, A14E, B4C, B25H, B29K (Ne-miristilo) , desB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29 } - tetradecanoil- [CysA10,GluA14,CysB4,HisB25] , des-ThrB30- Insulina humana MS (electroaspersión) m/4 : m/z = 1460.0 (5835.8) . Calculada: 1460.0 EJEMPLO 19, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) A10C, B4C, B29K (?e -miristilo) , desB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29} -tetradecanoil- [CysAlO , CysB4] , des- ThrB30- Insulina (humana) MS (electroaspersión) m/3: m/z = 1961.4 (5881.2). Calculada: 1961.4 EJEMPLO 20, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) A10C, A14E, B3C, B25H, desB27, B29K (N (eps) octadecanodioil -gGlu) , desB30 insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29} - [ (4S) -4-carboxi-4- (17-carboxiheptadecanoilamino) butanoil] - [CysAlO, GluAl4 , CysB3 , HisB25] , des-ThrB27 , ThrB30-Insulina (humana) MS (electroaspersión) m/4: m/z = 1492.2 (5964.0). Calculada: 1492.0 EJEMPLO 21, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) A10C, A14E, B3C, B25H, desB27, B29K(N(eps) octadecanodioil-gGlu-2xOEG) , deSB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29}- [2- [2- [2- [ [2- [2- [2- [ [ (4S) -4-carboxi-4- (17-carboxiheptadecanoil-amino) butanoil] amino] etoxi] etoxi] -acetil] amino] etoxi] etoxi] acetil] - [CysAlO , GluA14 , CysB3 , HisB25] , des-ThrB27 , hrB30 - Insulina (humana) MS (electroaspersión) m/4: m/z = 1564.7 (6254.3). Calculada: 1564.6 EJEMPLO 22, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) A10C, A14E, B3C, B25H, B29K (Ne-eicosanodioil-gGlu) , desB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29} - [ (4S) -4-carboxi-4- (19-carboxinonadecanoilamino) butanoil] - [CysAlO , GluA14 , CysB3 , HisB25] , des-ThrB30 - Insulina (humana) MS (electroaspersión) m/4: m/z = 1524.4 (6093.1). Calculada: 1524.3 EJEMPLO 23, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) A10C, A14E, B4C, B25H, B29K ( (eps) eicosanodioil- gGlu-2xOEG) , desB30 insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29}- [2- [2- [2- [ [2- [2- [2- [ [ (4S) -4-carboxi- 4- (19-carboxinonadecanoil-amino) butanoil] amino] etoxi] etoxi] -acetil] amino] etoxi] etoxi] acetil] - [CysA10,GluA14,CysB4,HisB25] , des-ThrB30-Insulina (humana) MS (electroaspersión) m/4 : m/z = 1593.2 (6369.4). Calculada: 1593.4 EJEMPLO 24, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) A10C, A14E, B3C, B25H, desB27, B29K (N (eps) eicosanodioil-gGlu) , desB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29} - [ (4S) -4 -carboxi-4 - (19-carboxinonadecanoilamino) butanoil] - [CysAlO , GluA14 , CysB3 , HisB25] , des-ThrB27 , ThrB30 -Insulina (humana) MS (electroaspersión) m/4: m/z = 1499.1 (5992.0). Calculada: 1499.0 EJEMPLO 25, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) A10C, A14E, B3C, B25H, desB27, B29K (N (eps) eicosanodioil -gGlu-2xOEG) , desB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29}- [2- [2- [2- [ [2- [2- [2- [ [ (4S) -4-carboxi-4 - (19-carboxinonadecanoil-amino) butanoil] amino] etoxi] etoxi] -acetil] amino] etoxi] etoxi] acetil] - [CysAlO , GluA14 , CysB3 , HisB25] , des-ThrB27 , ThrB3O - Insulina (humana) MS (electroaspersión) m/4 : m/z = 1571.8 (6282.3). Calculada: 1571.6 Similarmente, se pueden preparar los siguientes derivados de insulina: EJEMPLO 26, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) A10C, A14E, B4C, B25H, B29K (Ne-hexadecanodioil-gGlu) , desB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29}- [ (4S) -4 -carboxi -4 - (15-carboxipentadecanoilamino) butanoil] - [CysA10,GluA14,CysB4,HisB25] , des -ThrB30- Insulina (humana) EJEMPLO 27, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) A10C, A14E, B4C, B25H, B29K (Ne-hexadecanodioil-gGlu-OEG-OEG) , desB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29}- [2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S) -4-carboxi- 4- (15-carboxipentadecanoil-amino) butanoil] amino] etoxi] etoxi] -acetil] amino] etoxi] etoxi] acetil] - [CysA10,GluA14,CysB4,HisB25] , des-ThrB30- Insulina (humana) EJEMPLO 28, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) A10C, A14E, B4C, B25H, B29K (NE-hexadecanodioil) , desB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29 } -15-carboxipentadecanoil- [CysAlO , GluA14 , CysB , HÍSB25] , desThrB30 - Insulina (humana) EJEMPLO 29, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) A10C, A14E, B4C, B25H, B29 NE -hexadecanodioil -gGlu-gGlu) , desB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29} - [ (4S) -4 -carboxi- - [ [ (4S) -4-carboxi-4- (15-carboxipentadecanoilamino) butanoil] amino] butanoil] -[CysA10,GluA14, CysB4 , HisB25] , des-ThrB30- Insulina (humana) EJEMPLO 30, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) A10C, A14E, B4C , B25H, desB27, B29K (Ne-octadecanodioil-gGlu-OEG-OEG) , desB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29} - [2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S) -4-carboxi-4- (17-carboxiheptadecanoil-amino) butanoil] mino] etoxi] etoxi] acetil] amino] etoxi] etoxi] -acetil] - [CysA10,GluA14,CysB4,HisB25] , des-ThrB27, ThrB30-Insulina (humana) EJEMPLO 31, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) A10C, A14E, B4C, B25H, desB27, B29K (N-octadecanodioil-gGlu-gGlu) , desB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29 } - [ (4S) -4 -carboxi-4- [ [ (4S) -4 -carboxi-4 -(15-carboxipentadecanoil-amino) butanoil] amino] butanoil] -[CysA10,GluA14,CysB4 HisB25] , des-ThrB27 , hrB30- Insulina humana EJEMPLO 32, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) A10C, A14E, B4C, B25H, desB27, B29K (Ne-hexadecanodioil-gGlu-OEG-OEG) , desB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29} - [2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S) -4-carboxi- 4- ( 15 -carboxipentadecanoilamino) butanoil] amino] etoxi] -etoxi] acetil] amino] etoxiletoxilacetil [CysAlO , GluA14 , CysB4 , HisB25] , des-ThrB27 , ThrB30- Insulina (humana) EJEMPLO 33, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) A10C, A14E, B4C, B25H, desB27, B29K (?e-hexadecanodioil-gGlu) , desB30 insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29}- [ (4S) -4 -carboxi-4 - (15-carboxipentadecanoilamino) butanoil] [CysAlO , GluA14 , CysB4 , HisB2 5] , des-ThrB27,ThrB30-Insulina (humana) EJEMPLO 34, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) A10C, A14E, B3C, B25H, B29K (Ne-hexadecanodioil -gGlu) , desB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29}- [ (4S) - -carboxi-4- (15-carboxipentadecanoilamino) butanoil] [CysAlO, GluA14 , CysB3 , HisB25] , des-ThrB30-Insulina (humana) EJEMPLO 35, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) A10C, A14E, B3C, B25H, B29K (Ne-hexadecanodioil -gGlu-OEG-OEG) , desB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29} - [2- [2- [2- [ [2- [2- [2- [ [ (4S) -4-carboxi- 4 - ( 15 - carboxipentadecanoilamino) butanoil] amino] etoxi] etoxi] -acetil] amino] etoxi] etoxi] acetil] - [CysAlO, GluA14 , CysB3 , HisB25] , des-ThrB30 - Insulina (humana) EJEMPLO 36, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) A10C, A14E, B2C, B25H, B29K (Ne-hexadecanodioil-gGlu-OEG-OEG) , desB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29} - [2- [2- [2- [[2- [2- [2- [ [ (4S) -4-carboxi-4- ( 15 -carboxipentadecanoilamino) butanoilamino] -etoxi] etoxi] acetilamino] etoxi] etoxi] acetil] [CysAlO, GluA14 , Cys B2, HisB25] , des-ThrB30- Insulina (humana) EJEMPLO 37, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) A10C, A14E, B2C, B25H, B29K (Ne-hexadecanodioil-gGlu) , desB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29} - [ (4S) -4 -carboxi-4 - (15-carboxipentadecanoilamino) butanoil] [CysAlO , GluA14 , CysB2 , HisB2 5] , des-ThrB30- Insulina (humana) EJEMPLO 38, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) A10C, A14E, B2C, B25H, B29K (Ne-octadecanodioil-gGlu) , desB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29}- [ (4S) -4-carboxi-4- (17-carboxiheptadecanoilamino) butanoil] [CysAlO , GluA14 , CysB2 , HisB2 5] , des -ThrB30- Insulina (humana) EJEMPLO 39, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) A10C, A14E, B1C, B25H, B29K (Ne-octadecanodioil-gGlu) , desB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29}- [ (4S) -4 -carboxi-4 - (17-carboxiheptadecanoilamino) butanoil] [CysAlO , GluA14 , CysBl, HisB2 5] , des-ThrB30-Insulina (humana) EJEMPLO 40, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) A10C, A14E, B1C, B25H, B29 (Ne -hexadecanodioil -gGlu-OEG-OEG) , desB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29}- [2- [2- [2- [ [2- [2- [2- [ [ (4S) -4-carboxi- 4- (15-carboxipentadecanoil-amino) butanoil] amino] etoxi] etoxi] -acetil] amino] etoxi] etoxi] acetil] - [CysAlO, GluA14,CysBl,HisB25] , des -ThrB30 - Insulina (humana) EJEMPLO 41, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) A10C, A14E, B1C, B25H, B29K (Ne -hexadecanodioil -gGlu) , desB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29} - [ (4S) -4 -carboxi-4- ( 15 -carboxipenta-decanoilamino) butanoil] [CysAlO , GluA14 , CysBl , HisB25] , des- ThrB30- Insulina (humana) EJEMPLO 42, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) A10C, B1C, B29K (N8 -hexadecanodioil -gGlu-OEG-OEG) , desB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29} - [2- [2- [2- [ [2- [2- [2- [ [ (4S) -4-carboxi- 4- (15-carboxipentadecanoil-amino) butanoil] amino] etoxi] etoxi] -acetil] mino] etoxi] etoxi] acetil] - [CysAlO, CysBl] , des-ThrB30-Insulina (humana) EJEMPLO 43, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) A10C, B1C, B29K (Ne-hexadecanodioil -gGlu) , desB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29} - [ (4S) -4 -carboxi-4 - (15-carboxipentadecanoilamino) butanoil] [CysAlO , CysBl] ,des-ThrB30-Insulina (humana) EJEMPLO 44, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) A10C, B1C, B29K (Ne-octadecanodioil -gGlu-OEG-OEG) , desB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29}- [2- [2- [2- [ [2- [2- [2- [ [ (4S) -4-carboxi- 4- (17-carboxiheptadecanoil-amino) butanoil] amino] etoxi] etoxi] -acetil] amino] etoxi] etoxi] acetil] - [CysAlO , CysBl] ,des-ThrB30-Insulina (humana) EJEMPLO 45, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) A10C, B1C, B29K (?e -octadecanodioil -gGlu) , desB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29} - [ (4S) -4 -carboxi-4 - (17-carboxiheptadecanoilamino) butanoil] [CysAlO , CysBl] ,des-ThrB30-Insulina (humana) EJEMPLO 46, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) A10C, B2C, B29K (NE -octadecanodioil -gGlu-OEG-OEG) , desB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29}- [2- [2- [2- [ [2- [2- [2- [ [ (4S) -4-carboxi- 4 - ( 17 - carboxiheptadecanoi1 -amino) butanoil] amino] etoxi] etoxi] -acetil] amino] etoxi] etoxi] acetil- [CysAlO , CysB2] , des-ThrB30-Insulina (humana) EJEMPLO 47, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) A10C, B2C, B29K (?e -octadecanodioil -gGlu) , desB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29} - [ (4S) -4-carboxi-4- (17-carboxiheptadecanoilamino) butanoil] [CysAlO, CysB2] ,des-ThrB30-Insulina (humana) EJEMPLO 48, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) A10C, B2C / B29K (Ne-hexadecanodioil-gGlu-OEG-OEG) , desB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29}- [2- [2- [2- [ [2- [2- [2- [ [ (4S) -4-carboxi-4- (15-carboxipentadecanoil-amino) utanoil] amino] etoxi] etoxi] -acetil] amino] etoxi] etoxi] acetil] - [CysAlO , CysB2] , des-ThrB30- Insulina (humana) EJEMPLO 49, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) A10C, B2C, B29K (Ne-hexadecanodioil-gGlu) , desB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29} - [ (4S) -4-carboxi-4- (15-carboxipentadecanoilamino) butanoil] [CysAlO , CysB2] ,des-ThrB30- Insulina (humana) EJEMPLO 50, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) A10C, B3C, B29K (Ne-hexadecanodioil-gGlu) , desB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29}- [ (4S) -4-carboxi-4- (15-carboxipentadecanoilamino) butanoil] [CysAlO , CysB3] , des-ThrB30- Insulina (humana) EJEMPLO 51, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) A10C, B3C, B29K (Ne-hexadecanodioil-gGlu-OEG-OEG) , desB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29}- [2- [2- [2- [ [2- [2- [2- [ [ (4S) -4-carboxi- 4- ( 15 -carboxipentadecanoil-amino) butanoil] amino] etoxi] etoxi] -acetil] amino] etoxi] etoxi] acetil] - [CysAlO , CysB3] , des-ThrB30- Insulina (humana) EJEMPLO 52, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) A10C, B3C, B29K (NE-octadecanodioil -gGlu-OEG-OEG) , desB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29}- [2- [2- [2- [ [2- [2- [2- [ [ (4S) -4-carbOXÍ- 4- (17-carboxiheptadecanoil-amino) butanoil] amino] etoxi] etoxi] -acetil] amino] etoxi] etoxi] acetil] - [CysAlO, CysB3] , des-ThrB30-Insulina (humana) EJEMPLO 53, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) A10C, B3C, B29K (?e -octadecanodioil -gGlu) , desB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29} - [ (4S) -4 -carboxi- - (17-carboxiheptadecanoilamino) butanoil] [CysAlO , CysB3] ,des-ThrB30-Insulina (humana) EJEMPLO 54, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) A10C, B4C, B29K (Ne-octadecanodioil -gGlu) , desB30 insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29} - [ (4S) -4 -carboxi -4 - (17-carboxiheptadecanoilamino) butanoil] [CysAlO , CysB4] ,des-ThrB30-Insulina (humana) EJEMPLO 55, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) A10C, B4C, B29K (Ne-octadecanodioil -gGlu-OEG-OEG) , desB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29}- [2- [2- [2- [ [2- [2- [2- [ [ (4S) -4-carboxi-4- (17-carboxiheptadecanoil-amino)butanoil] amino] etoxi] etoxi] -acetil] amino] etoxi] etoxi] acetil] - [CysAlO, CysB4] , des-ThrB30-Insulina (humana) EJEMPLO 56, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) A10C, B4C, B29K (?e -hexadecanodioil -gGlu-OEG-OEG) , desB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29}- [2- [2- [2- [ [2- [2- [2- [ [ (4S) -4-carboxi- 4- ( 15 -carboxipentadecanoil- amino) butanoil] amino] etoxi] etoxi] -acetil] amino] etoxi] etoxi] acetil] - [CysAlO , CysB4] ,des-ThrB30-Insulina (humana) EJEMPLO 57, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) A10C, B4C, B29K (Ne-hexadecanodioil -gGlu) , desB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29}- [ (4S) -4-carboxi-4- (15-carboxipentadecanoilamino) butanoil] [CysAlO , CysB4] , des-ThrB30-Insulina (humana) EJEMPLO 58, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) A10C, A14E, B1C, B16H, B25H, B29K (Ne-eicosanodioil -gGlu-2xOEG) , desB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29}- [2- [2- [2- [ [2- [2- [2- [ [ (4S) -4-carboxi-4- (19-carboxinonadecanoil-amino) butanoil] amino] etoxi] etoxi] -acetil] amino] etoxi] etoxi] acetil- [CysAlO, GluA14 , CysBl, HisB16 , HisB25] , des -ThrB30 - Insulina (humana) EJEMPLO 59, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) A10C, A14E, B1C, B16H, B25H, B29K (?e-eicosanodioil-gGlu) , desB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29} - [ (4S) -4-carboxi-4- (19-carboxinonadecanoilamino) butanoil] [CysAlO , GluA14 , CysBl , HisB16 , HisB25] , des-ThrB30- Insulina (humana) EJEMPLO 60, PROCEDIMIENTO GENERAL (A): A10C, A14E, B1C, B16H, B25H, B29K (Ne-octadecanodioil-gGlu-OEG-OEG) , desB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29} - [2- [2 - [2 - [ [2- [2- [2- [ [ (4S) -4-carboxi-4- (17-carboxiheptadecanoil-amino) butanoil] amino] etoxi] etoxi] -acetil] amino] etoxi] etoxi] acetil] - [CysAlO, GluA14 , CysBl, HisB16 , HisB25] , des-ThrB30- Insulina (humana) EJEMPLO 61, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) A10C, A14E, B1C, B16H, B25H, B29K (Ne-octadecanodioil-gGlu) , desB30 insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29} - [ (4S) -4-carboxi-4- (17- carboxiheptadecanoilamino) butanoil] [CysAlO , GluA14 , CysBl, HisBl 6,HisB25] , des -ThrB30- Insulina (humana) EJEMPLO 62, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) A10C, A14E, B1C, B16H, B25H, B29K (?e-hexadecanodioil-gGlu) , desB30 insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29} - [ (4S) - 4 - carboxi-4 - (15-carboxipentadecanoilamino) butanoil] [CysAlO , GluA14 , CysBl, HisBl 6,HisB25] , des-ThrB30-Insulina (humana) EJEMPLO 63, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) A10C, A14E, B1C, B16H, B25H, B29K (Ne--hexadecanodioil-gGlu-OEG-OEG) , desB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29} - [2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S) -4-carboxi-4- (15-carboxipentadecanoil-amino) butanoil] amino] etoxi] etoxi] -acetilamino] etoxi] etoxi] acetil] - [CysAlO, GluA14, CysBl, HisB16, HisB25] , des-ThrB30-insulina (humana) EJEMPLO 64, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) A10C, A14E, B2C, B16H, B25H, B29K (?e-hexadecanodioil-gGlu-OEG-OEG) , desB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29}- [2- [2- [2- [ [2 - [2- [2 - [ [ (4S) -4-carboxi-4- (15-carboxipentadecanoil-amino) butanoilamino] etoxi] etoxi] -acetilamino] etoxi] etoxi] acetil] - [CysAlO , GluA14 , CysB2 , HisB16 , HisB25] , des -ThrB3 O -Insulina (humana) EJEMPLO 65, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) A10C, A14E, B2C, B16H, B25H, B29K (Ne-hexadecanodioil-gGlu) , desB30 insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29}- [ (4S) -4-carboxi-4- (15-carboxipentadecanoilamino) butanoil] [CysAlO , GluA14 , CysB2 , Hisl6 ,HisB25] , des-ThrB30-Insulina (humana) EJEMPLO 66, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) A10C, A14E, B2C, B16H, B25H, B29K (?e-octadecanodioil-gGlu) , desB30 insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29} - [ (4S) -4-carboxi-4- (17-carboxiheptadecanoilamino) butanoil] [CysAlO , GluA14 , CysB2 , Hisl6 ,HisB25] , des-ThrB30- Insulina (humana) EJEMPLO 67, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) A10C, A14E, B2C, B16H, B25H, B29K (Ne-octadecanodioil-gGlu-OEG-OEG) , desB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29}- [2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S) -4-carboxi-4- (17-carboxiheptadecanoil-amino) butanoil] amino] etoxi] etoxi] -acetilamino] etoxi] etoxi] acetil] - [CysAlO, GluA14 , CysB2 , HisB16, HisB25] , des-ThrB30-Insulina (humana) EJEMPLO 68, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) A10C, A14E, B2C, B16H, B25H, B29 (Ne-eicosanodioil-gGlu-OEG-OEG) , desB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29}- [2- [2- [2- [ [2- [2- [2- [ [ (4S) -4-carboxi- 4- (19-carboxinonadecanoil-amino) butanoil] amino] etoxi] etoxi] -acetil] amino] etoxi] etoxi] acetil] - [CysAlO, GluA14 , CysB2 , HisB16 , HisB25] , des -ThrB30- Insulina (humana) EJEMPLO 69, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) A10C, A14E, B2C, B16H, B25H, B29K (Ne-eicosanodioil-gGlu) , desB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29} - [ (4S) -4 -carboxi-4 - (19-carboxinonadecanoilamino) butanoil] [CysAlO , GluA14 , CysB2 , HisB16 ,HisB25] , des -ThrB30-Insulina (humana) EJEMPLO 70, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) A10C, A14E, B3C, B16H, B25H, B29K (Ne-eicosanodioil-gGlu) , desB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29} - [ (4S) -4 -carboxi-4 - (19-carboxinonadecanoilamino) butanoil] [CysAlO , GluA14 , CysB3 , HisB16 ', HisB25] , des-ThrB30-Insulina (humana) EJEMPLO 71, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) A10C, A14E, B3C, B16H, B25H, B29K (?e- octadecanodioil-gGlu-OEG-OEG) , deSB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29}- [2- [2- [2- [ [2- [2- [2- [ [ (4S) -4-carboxi- 4- ( 17 -carboxiheptadecanoilamino) -butanoil] amino] etoxi] etoxi] -acetil] amino] etoxi] etoxi] acetil] - [CysAlO , GluA14 , CysB3 , HisB16 , HisB25] , des-ThrB30-Insulina (humana) EJEMPLO 72, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) A10C, A14E, B3C, B16H, B25H, B29K (?e-octadecanodioil-gGlu) , desB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29} - [ (4S) -4 -carboxi-4 - (17-carboxiheptadecanoilamino) butanoil] [CysAlO , GluA14 , CysB3 , HisBl 6,HisB25] , des-ThrB30-Insulina (humana) EJEMPLO 73, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) A10C, A14E, B3C, B16H, B25H, B29K (Ne-hexadecanodioil-gGlu) , desB30 insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29} - [ (4S) -4 -carboxi-4- (15-carboxipentadecanoilamino) butanoil] [CysAlO , GluA14 , CysB3 , HisBl 6,HisB25] , des-ThrB30- Insulina (humana) EJEMPLO 74, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) : A10C, A14E, B3C, B16H, B25H, B29K (Ne-hexadecanodioil-gGlu-OEG-OEG) , deSB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29} - [2- [2- [2- [ [2- [2- [2- [ [ (4S) -4-carboxi-4- (15-carboxipentadecanoil-amino) butanoil] amino] etoxi]etoxi] -acetil] amino] etoxi] etoxi] acetil] - [CysAlO , GluA14 , CysB3 , HisB16 , HisB25] , des-ThrB30 - Insulina (humana) EJEMPLO 75, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) A10C, A14E, B4C, B16H, B25H, B29K (Ne-hexadecanodioil-gGlu-OEG-OEG) , desB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29} - [2- [2- [2- [ [2- [2- [2- [ [ (4S) -4-carboxi- 4- (15-carboxipentadecanoil-amino) butanoil] amino] etoxi] etoxi] -acetil] amino] etoxi] etoxi] acetil] - [CysAlO, GluA14( CysB4 , HisB16 , HisB25] , des -ThrB30- Insulina (humana) EJEMPLO 76, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) A10C, A14E, B4C, B16H, B25H, B29K (Ne-hexadecanodioil-gGlu) , desB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29} - [ (4S) -4-carboxi-4- (15-carboxipentadecanoilamino) butanoil] [CysAlO, GluAl4 , CysB4,HisBl 6,HisB25] , des-ThrB30- Insulina (humana) EJEMPLO 77, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) A10C, A14E, B4C, B16H, B25H, B29K (Ne-octadecanodioil-gGlu) , desB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29} - [ (4S) -4~carboxi-4- (17-carboxiheptadecanoilamino) butanoil] [CysAlO , GluA14 , CysB4 , HisBl 6,HisB25] , des-ThrB30-Insulina (humana) EJEMPLO 78, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) A10C, A14E, B4C, B16H, B25H, B29K (Ne-octadecanodioil-gGlu-OEG-OEG) , desB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29} - [2- [2- [2 - [ [2- [2- [2 - [ [ (4S) -4-carboxi-4- (17-carboxiheptadecanoil-amino) butanoilamino] etoxi] etoxi] -acetil] amino] etoxi] etoxi] acetil] - [CysAlO , GluA14 , CysB4 , HisB16 , HisB25] , des-ThrB30 - Insulina (humana) EJEMPLO 79, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) : A10C, A14E, B4C, B16H, B25H, B29K (NE-ecosanodioil-gGlu-OEG-OEG) , desB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29} - [2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S) -4-carboxi- 4- (19-carboxinonadecanoil-amino) butanoil] amino] etoxi] etoxi] -acetil] amino] etoxi] etoxi] cetil] - [CysAlO , GluA14 , CysB4 , HisB16 , HisB25] , des-ThrB30-Insulina (humana) EJEMPLO 80, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) A10C, A14E, B4C, B16H, B25H, B29K (Ne-ecosanodioil-gGlu) , desB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29}- [ (4S) -4-carboxi-4- (19-carboxinonadecanoilamino) butanoil] [CysAlO , GluA14 , CysB4 , HisB16 ,HisB25] , des-ThrB30-Insulina (humana) EJEMPLO 81, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) A10C, A14E, B1C, B25H, B29K (N (eps) eicosanodioil -gGlu) , desB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29} - [ (4S) -4 -carboxi-4 - (19-carboxinonadecanoilamino) butanoil] [CysAlO , GluA14 , CysBl , HisB25] , des-ThrB30-Insulina (humana) EJEMPLO 82, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) A10C, A14E, B2C, B25H, B29K (N (eps) eicosanodioil -gGlu) , desB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29} - [ (4S) -4 -carboxi-4- (19-carboxinonadecanoilamino) butanoil] [CysAlO , GluA14 , CysB2 , HisB25] , des-ThrB30- Insulina (humana) EJEMPLO 83, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) A10C, A14E, B2C, B25H, B29K (N (eps) eicosanodioil -gGlu-2xOEG) , desB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29} - [2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S) -4-carboxi-4- ( 19-carboxinonadecanoil-amino) butanoil] amino] etoxi] etoxi] -acetil] amino] etoxi] etoxi] acetil] - [CysAlO, GluA14 , CysB2 , HisB25] , des-ThrB30 - Insulina (humana) EJEMPLO 84, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) A10C, A14E, B4C, B25H, desB27, B29K (N(eps) eicosanodioil-gGlu) , desB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29}- [ (4S) -4 -carboxi-4 - (19-carboxinonadecanoilamino) butanoil] [CysAlO , GluA14 , CysB , HisB25] , des-ThrB27 , ThrB30- Insulina (humana) EJEMPLO 85, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) A10C, A14E, B4C, B25H, desB27, B29 ( (eps) eicosanodioil-gGlu-2xOEG) , desB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye-, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29} - [2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S) -4-carboxi-4- ( 19 -carboxinonadecanoil-amino) butanoil] amino] etoxi] etoxi] -acetil] mino] etoxi] etoxi] acetil] -[CysAlO, GluA14,CysB4,HisB25] , des-ThrB27 , ThrB30- Insulina (human ) EJEMPLO 86, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) A10C, A14E, B4C , B25H, B29K (N(eps) eicosanodioil-gGlu) , desB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29 } - [ (4S) -4 -carboxi-4 - (19-carboxinonadecanoilamino) butanoil] [CysAlO , GluA14 , CysB4 , HisB25] , des-ThrB30-Insulina (humana) EJEMPLO 87, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) A10C, A14E, B3C, B25H, desB27, B29K (N(eps) hexadecanodioil-gGlu) , desB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29}- [ (4S) - -carboxi-4 - (15-carboxipentadecanoilamino) butanoil] [CysAlO , GluA14 , CysB3 , HisB25] , des-ThrB27, ThrB30- Insulina (humana) EJEMPLO 88, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) A10C, A14E, B3C, B25H, desB27, B29K ( (eps) hexadecanodioil-gGlu-2xOEG) , desB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29 } - [2- [2- [2- [ [2- [2- [2- [ [ (4S) -4-carboxi-4- (15-carboxipentadecanoil-amino) butanoil] amino] etoxi] etoxi] -acetil] amino] etoxi] etoxi] acetil] - [CysAlO , GluA14 , CysB3 , HisB25] , des-ThrB27 , ThrB30 -Insulina (humana) EJEMPLO 89, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) A10C, A14E, B3C, desB27, B29K (N (eps) hexadecanodioil-gGlu) , desB30 insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29}- [ (4S) - 4 -carboxi -4 - (15-carboxipentadecanoilamino) butanoil] [CysAlO , GluA14 , CysB3] , des-ThrB27 , ThrB30- Insulina (humana) EJEMPLO 90, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) A10C, A14E, B3C, desB27, B29K ( (eps) hexadecanodioil -gGlu-2xOEG) , desB30 insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29} - [2- [2- [2- [ [2- [2- [2- [ [ (4S) -4 -carboxi -4- (15-carboxipentadecanoil-amino) butanoil] amino] etoxi] etoxi] -acetil] amino] etoxi] etoxi] acetil] - [CysAlO , GluA14 , CysB3] , des-ThrB27 , ThrB30- Insulina (humana) EJEMPLO 91, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) A10C, A14E, B3C, desB27, B29K ( (eps) octadecanodioil-gGlu) , desB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29} - [ (4S) -4 -carboxi- 4 - (17-carboxiheptadecanoilamino) butanoil] [CysAlO , GluA14 , CysB3] ,des-ThrB27 , ThrB30- Insulina (humana) EJEMPLO 92, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) A10C, A14E, B3C, desB27, B29K ( (eps) octadecanodioil-gGlu-2xOEG) , desB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29} - [2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S) -4 -carboxi -4- ( 17 -carboxiheptadecanoil -amino) butanoil] amino] etoxi] etoxi] -acetil] amino] etoxi] etoxi] acetil] - [CysAlO , GluA14, CysB3] , des-ThrB27 , ThrB30- Insulina (humana) EJEMPLO 93, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) A10C, A14E, B3C, desB27, B29K (N (eps) eicosanodioil-gGlu) , desB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29} - [ (4S) -4-carboxi-4- (19-carboxinonadecanoilamino) butanoil] [CysAlO , GluA14 , CysB3] , des-ThrB27,ThrB30-Insulina (humana) EJEMPLO 94, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) A10C, A14E, B3C, desB27, B29K (N(eps) eicosanodioil -gGlu-2xOEG) , desB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29}- [2- [2- [2- [ [2- [2- [2- [ [ (4S) -4-carboxi-4- (19-carboxinonadecanoil-amino) butanoil] amino] etoxi] etoxi] -acetil] amino] etoxi] etoxi] acetil] - [CysAlO , GluA14 , CysB3] , des-ThrB27 , ThrB30- Insulina (humana) EJEMPLO 95, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) A10C, A14E, B3C, B16H, B25H, B29K (N(eps) eicosanodioil-2xgGlu) , desB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29}- [ (4S) -4-carboxi-4- [ [ (4S) -4-carboxi-4- (19-carboxinonadecanoilamino) butanoil] amino] butanoil] -[CysAlO , GluA14 , CysB3 , HisB16 , HisB25] , des-ThrB30 -Insulina (humana) EJEMPLO 96, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) A10C, A14E, B3C, B16E, B25H, B29K (N (eps) eicosanodioil -gGlu-2xOEG) , desB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29} - [2- [2 - [2 - [ [2- [2 - [2 - [ [ (4S) -4-carboxi-4- (19-carboxinonadecanoilamino) utanoil] amino] etoxi] etoxi] - acetil] amino] etoxi] etoxi] -acetil] - [CysAlO, GluA14 , CysB3 , GluB16 , HisB25] , des-ThrB30 - Insulina (humana) EJEMPLO 97, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) A10C, A14E, B4C, B16E, B25H, B29K (N (eps) eicosanodioil-gGlu-2xOEG) , desB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29} - [2- [2- [2- [ [2- [2- [2- [ [ (4S) -4-carboxi- 4- (19-carboxinonadecanoilamino) butanoil] amino] etoxi] etoxi] -acetil] amino] etoxi] etoxi] acetil] - [CysAlO , GluA14 , CysB4 , GluB16 , HisB25] , des-ThrB30- Insulina humana EJEMPLO 98, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) A10C, A14E, B3C, B16H, B25H, B29K ( (eps) eicosanodioil-2xgGlu) , desB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29} - [ (4S) -4 -carboxi-4 - [ [ (4S) -4-carboxi-4-(19-carboxinonadecanoilamino) utanoil] amino] butanoil] -[CysAlO , GluA14 , CysB3 , HisB16 , HisB25] , des-ThrB30 - Insulina (humana) EJEMPLO 99, PROCEDIMIENTO GENERAL (A) A10C, A14E, B4C, B16E, B25H, B29K ( (eps) eicosanodioil-2xgGlu) , desB30 Insulina humana nombre IUPAC (OpenEye, estilo IUPAC) : N{Epsilon-B29} - [ (4S) -4-carboxi-4- [ [ (4S) -4-carboxi-4- (19-carboxinonadecanoilamino) butanoil] -amino] butanoil] - [CysAlO, GluA14 , CysB4 , GluB16 , HisB25] , des -ThrB30 - Insulina (humana) EJEMPLO 100, UNION A RECEPTOR DE INSULINA: ANALISIS DE UNION A RECEPTOR DE INSULINA (SOBRE RECEPTOR DE INSULINA SOLUBILIZADO) La afinidad del derivado de insulina de la invención por el receptor de insulina humano se determinó por el análisis de proximidad de centelleo (SPA, por sus siglas en inglés) (de acuerdo con Glendorf et al. (2008), Biochemistry, 47, 4743-4751) . Se realizaron experimentos de unión de competencia en placas de 96 pozos (poliestireno Optiplate-96, PerkinElmer) con un robot Eppendorf epMotion 5075 utilizando IR humana solubilizada (holorreceptor) semipurificada con purificación en aglutinina de germen de trigo a partir de células de riñon de hámster bebé (BHK, por sus siglas en inglés) las cuales se transfectaron de manera estable con el vector pZem que contiene el inserto humano IR-A o IR-B. Los análisis se iniciaron al realizar series de diluciones (ocho diluciones, 5 veces cada una, primera dilución, 43 veces) del sobrenadante de levadura que contiene el derivado de insulina y el estándar de insulina humana. Una mezcla de reactivo que consiste de esferas de SPA (esferas de unión de anticuerpo SPA PVT, Anti-body-Bindings Beads, Anti-Mouse Reagent Cat. No. RPNQ0017, GE Healthcare) resuspendidas en amortiguador de unión, anticuerpo anti-IR monoclonal de ratón (83-7) , IR humano solubilizado (hIR-A o hIR-B) e insulina marcada con [125I]A14Tyr se agregaron a las diluciones en serie de las muestras apropiadas. La concentración final de insulina marcada con [125I] A14Tyr fue de 7.5 pM y el amortiguador consistió de HEPES 100 mM (pH 7.8), NaCl 100 mM, MgS04 10 mM y Tween 20 0.025% (v/v) . Las placas se incubaron con agitación ligera durante 24 h a temperatura ambiente. Se centrifugaron durante 2 minutos a 2000 rpm y se contaron en un equipo TopCount NXT durante 3 min/pozo. Los datos a partir de SPA se analizaron de acuerdo con el modelo logístico de cuatro parámetros (Volund, A., (1978), Biometrics, 34, 357-365) y las afinidades del derivado de insulina se expresaron en relación a las de insulina umana.

Este análisis también se lleva a cabo con HSA 1.5% en el amortiguador de análisis con el fin de imitar condiciones fisiológicas.

Preparación de anticuerpos monoclonales mIR Se producen anticuerpos específicos (F12 u 83-7) por técnica monoclonal: inmuniza a ratones RBF al inyectar 50 µg de mIR purificado en FCA subcutáneamente seguido por dos inyecciones con 20 µg de mIR en FIA. Los ratones con una mayor respuesta se refuerzan intravenosamente con 25 µg de mIR y los bazos se cosechan después de 3 días. Las células del bazo se fusionan con la línea de células de mieloma Fox (Kóhler, G & Milstein C. (1976) , European J. Immunology, 6:511-19; Taggart RT et al (1983), Science 219: 1228-30) . Los sobrenadantes se criban para producción de anticuerpo en una prueba ELISA específica para mIR. Los pozos positivos se clonan y se prueban en transferencia Western .

ANALISIS DE UNION DE RECEPTOR DE INSULINA (SOBRE UN RECEPTOR DE INSULINA ASOCIADO A MEMBRANA) Unión de [125I] - insulina humana a la isoforma A del receptor de insulina humana (hIR-A) recombinante asociado a membrana Extracción de receptores de insulina asociados a membrana: células BHK (tk-tsl3) que expresan la isoforma A del receptor de insulina humana a partir de una fábrica celular de diez capas se cosechan y homogenizan en 25 mi de amortiguador enfriado con hielo (HEPES 25 mM, pH 7.4, CaCl2 2.5 mM, MgCl2 1 mM, 250 mg/1 de bacitracina, Pefablock 0.1 mM (Roche) ) . El homogeneizado se estratifica cuidadosamente sobre colchones de sacarosa 41%, se centrifuga en la ultracentrifuga a 95,000 x g durante 75 minutos en un rotor Beckman SW28 a 4°C. Las membranas plasmáticas se recolectan desde la parte superior del colchón de sacarosa, se diluyen 1:4 con amortiguador y se centrifugan a 40,000 x g durante 45 min en un rotor Beckman SW28. Los sedimentos se suspenden en amortiguador (HEPES 25 mM, pH 7.4, CaCl2 2.5 mM, MgCl2 1 mM, 250 mg/1 de bacitracina, Pefablock 0.1 mM) y se almacenan a -80°C.

La unión de radioligando a receptores de insulina asociados a membrana se realiza por duplicado en OptiPlates de 96 pozos (Perkin Elmer) . La proteína de membrana se incuba durante 150 minutos a 25°C con [125I-TyrA14] - insulina humana 50 pM en un volumen total de 200 mi de amortiguador de análisis (HEPES 50 mM, NaCl 150 mM, MgS04 5 mM, Tritón X-100 0.01%, HSA 0.1% (libre de ácido graso), inhibidores de proteasa libres de EDTA CompleteMR) , concentraciones cada vez mayores de insulina humana o derivado de insulina (típicamente, entre 0.01 y 300 nM) y 1 mg de microesferas de PVT recubiertas con WGA (GE Healthcare) . El análisis finaliza por centrifugación de la placa a 2000 rpm durante 2 minutos y cuantificación de la radioactividad unida mediante cuenta en un equipo Packard TopCount NXT después de un retraso de 60 minutos.

Los datos se unión se ajustan utilizando el algoritmo de regresión sigmoidea de cuatro parámetros en GraphPad Prism 5.02 (GraphPad Software, San Diego, CA) . Los resultados se proporcionan como CI50 en relación a la insulina humana, en %.

AFINIDADES DE RECEPTOR DE INSULINA: El impacto de un puente disulfuro adicional en los derivados de insulina de la invención es - sorprendentemente - solo menor. El efecto de la cadena lateral de ácido graso se vuelve el impacto más grande, segundo al impacto de mutaciones con ninguna cisteína en la insulina original. Esto se ilustra en la siguiente tabla y es un hallazgo general. La baja afinidad por receptor de insulina de las insulinas derivatizadas con ácido graso de la invención se desea con el fin de obtener perfiles in vivo prolongados y de duración prolongada EJEMPLO 101, HIDROFOBICIDAD DE LOS DERIVADOS DE INSULINA DE LA INVENCION; La hidrofobicidad de un derivado de insulina se encuentra por CLAR en fase inversa bajo condiciones isocráticas. El tiempo de elusión del derivado de insulina se compara con el de la insulina humana (en la presente, denominado HI) u otro derivado con una hidrofobicidad conocida bajo las mismas condiciones. La hidrofobicidad, k'rel, se calcula como: k'relderiv = ( (tderiv-t0) / (tref -t0) ) *k' relref . Utilizando HI como referencia: k'relref = k'relHi = 1. El tiempo vacío del sistema CLAR, t0 se determina al inyectar 5 µ? de NaN03 0.1 mM. Condiciones de corrida: Columna: Lichrosorb RP-C18, 5 µ??, 4 x 250 mm Amortiguador A: fosfato de sodio 0.1 M; pH 7.3, CH3CN 10 volumen% Amortiguador B: CH3CN 50 volumen% Volumen de inyección: 5 µ? Tiempo de corrida: máximo, 60 minutos Después de correr un gradiente inicial, el nivel isocrático para la corrida se selecciona el derivado y la referencia (por ejemplo, HI) y los tiempos de elusión del derivado y la referencia bajo condiciones isocráticas se utiliza en la ecuación anterior para calcular k'relderiV.

EJEMPLO 102, DEGRADACION DE DERIVADOS DE INSULINA UTILIZANDO ENZIMAS DE LUMEN DE DUODENO Degradación de derivados de insulina utilizando enzimas de lumen de duodeno (preparado por filtración del contenido de lumen de duodeno) de ratas SPD.

El análisis se realiza por un robot en una placa de 96 pozos (2 mi) con 16 pozos disponibles para derivados de insulina y estándares. Los derivados de insulina ~ 15 µ? se incuba con enzimas de duodeno en Hepes 100 mM, pH = 7.4 a 37°C, las muestras se toman después de 1, 15, 30, 60, 120 y 240 min y la reacción se suspende por adición de TFA. Los derivados de insulina intacta en cada punto se determinan por RP-CLAR. El tiempo medio de degradación se determina por ajuste exponencial de los datos y normalización a tiempo medio determinado por las insulinas de referencia A14E, B25H y desB30 insulina humana o insulina humana en cada análisis. La cantidad de enzimas agregadas para la degradación es tal que el tiempo medio para degradación de la insulina de referencia está entre 60 min y 180 min. El resultado se proporciona como el tiempo medio de degradación para el derivado de insulina en duodeno de rata dividido entre el tiempo medio de degradación de la insulina de referencia del mismo experimento (relación de degradación relativa) .

EJEMPLO 103. FAR ACOCINETICA EN RATA DE PK INTRAVENOSA EN RATA: A ratas anestesiadas se les dosifica intravenosamente (i.v.) con derivados de insulina a diversas dosis y las concentraciones en plasma de los compuestos usados se mide utilizando inmunoanálisis o espectrometría de masas a intervalos especificados durante 4 horas o más posteriores a la dosis. Los parámetros farmacocinéticos posteriormente se calcularon utilizando WinNonLin Professional (Pharsight Inc., Mountain View, CA, USA) .

Se utilizaron ratas istar macho sin ayuno (Taconic) con un peso aproximadamente de 200 gramos.

El peso corporal se midió y las ratas posteriormente se anestesiaron con Hypnorm/Dormicum (cada compuesto se diluye por separado 1:1 en agua estéril y después se mezcla; se prepara fresco en el día de experimento) . Se inició la anestesia por 2 ml/kg de la mezcla Hypnorm/Doricum s.c. seguido por dos dosis de mantenimiento de 1 ml/kg s.c. a intervalos de 30 min y dos dosis de mantenimiento de l ml/kg, s.c. con intervalos de 45 min. Si se requiere, con el fin de mantener a las ratas ligeramente anestesiadas durante una o varias dosis adicionales se suministra 1-2 ml/kg s.c. El pesado y la anestesia inicial se realizan en una habitación que mantiene a las ratas con el fin de evitar tensión en los animales al moverse de una habitación a otra.

Los perfiles PK se muestran en la figura 1.

EJEMPLO 104, FARMACOCINETICA EN PERROS, PK INTRAVENOSA EN PERRO ; Perros mestizos machos (aproximadamente 12 kg) reciben una dosis única intravenosamente de insulina, análogo de insulina (2 nmoles/kg) . Se extrae sangre y se recolecta plasma en los puntos de tiempo 0.17, 0, 0.083, 0.25, 0.5, 0.75, 1, 1.25, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 5, 8, 10, 12, 16, 24, 32, 48, 72, 96, 120, 144 y 168 horas después de la dosificación. Las muestras de plasma se analizan ya sea por inmunoanálisis tipo emparedado o LCMS . Los perfiles de concentración-tiempo en plasma se analizan por análisis farmacocinético sin compartimientos utilizando el programa WinNonlin Professional 5.2 (Pharsight Inc., Mountain Vie , CA, USA) .

EJEMPLO 105, FARMACOCINETICA EN RATA, PK EN RATA POSTERIOR A INYECCION INTRAINTESTINAL; A ratas anestesiadas se les dosifica intraintestinalmente (dentro del yeyuno) con derivados de insulina. Las concentraciones en plasma de los compuestos utilizados así como los cambios en la glucosa en sangre se miden a intervalos especificados durante 4 horas o mayor, posterior a la dosificación. Los parámetros farmacocinéticos subsecuentemente se calculan utilizando WinNonlin Professional (Pharsight Inc., Mountain View, CA, USA).

Ratas Sprague-Dawley macho (Taconic) , con un peso de 250-300 g, que se mantienen en ayuno durante ~ 18 h se anestesian utilizando Hypnorm-Dormícum s.c. (0.079 mg/ml de citrato de fentanilo, 2.5 mg/ml de fluanisona y 1.25 mg/ml de midazolam) , 2 ml/kg como una dosis de cebado (para un punto de tiempo -60 min antes de la dosificación de sustancia de prueba) , 1 ml/kg después de 20 min seguido por 1 ml/kg cada 40 min.

Las insulinas que van a ser probadas en el modelo de inyección intraintestinal se formulan de acuerdo con la siguiente composición (en % en peso) : 45% de propilenglicol (Merck) 33% de Capmul MCM CIO (Abitec) 11% de poloxámero 407 (BASF) 11% de polietilenglicol 3350 Ultra (Fluka) La cantidad de insulina agregada se resta igualmente de CaprauL 'MCM CIO, poloxámero 407 y PEG 3350 y no de propilenglicol con el fin de mantener la cantidad de propilenglicol independiente de la carga de medicamento constante a 45%.

La rata anestesiada se coloca en una manta homeotérmica estabilizada a 37°C. Un catéter de polietileno de 20 cm montado en una jeringa de 1 mi se rellena con formulación de insulina o vehículo. Se realiza una incisión en la línea media de 4-5 cm en la pared abdominal. El catéter se inserta ligeramente en el yeyuno medio ~ 50 cm del ciego por penetración de la pared intestinal. Si está presente contenido intestinal, se mueve el sitio de aplicación ± 10 cm. La punta del catéter se coloca aproximadamente 2 cm dentro del lumen del segmento intestinal y se fija sin el uso de ligaduras. Los intestinos se sustituyen cuidadosamente en la cavidad abdominal y la pared abdominal y la piel se cierran con autograpas en cada capa. En un tiempo 0, las ratas se dosifican vía el catéter, 0.4 ml/kg del compuesto de prueba o vehículo.

Se recolectan muestras de sangre para determinación de concentraciones de glucosa sanguínea total en tubos capilares heparinizados de 10 µ? mediante punción de los vasos capilares en la punta de la cola. Las concentraciones de glucosa en sangre se miden después de dilución en 500 µ? de amortiguador de análisis por el método de glucosa oxidasa utilizando un autoanalizador Biosen (EKF Diagnostic Gmbh. Alemania) . La media los cursos de concentración de glucosa sanguínea (media ± SEM) se realizan para cada compuesto.

Las muestras se recolectan para determinación de la concentración de insulina en plasma. Se extrae 100 µ? de muestras de sangre en tubos enfriados que contienen EDTA.

Las muestras se mantienen en hielo hasta que se centrifugan (7000 rpm, 4°C, 5 min) , el plasma es pipeteado a tubos Micronic y después se congela a 20°C hasta el análisis. Las concentraciones en plasma de los derivados de insulina se miden en un inmunoanálisis el cual se considera apropiado o validado para el derivado individual.

Se extraen muestras de sangre en t = -10 (únicamente para glucosa en sangre) , en t = -1 (justo antes de la dosificación) y a intervalos especificados durante 4 horas o más posteriores a la dosificación.

EJEMPLO 106, POTENCIA DE LOS DERIVADOS DE INSULINA ACILADOS DE ESTA INVENCION CON RELACION CON LA INSULINA HUMANA, PINZA INTRAVENOSA EN ESTADO ESTABLE Se utilizan para el experimento de la pinza ratas macho Sprague-Dawley con un peso de 238-383 g en el día del experimento. Las ratas tienen acceso libre a pienso bajo condiciones controladas ambientales y se mantienen en ayuno durante la noche (desde las 3 pm) antes del experimento de pinza .

Protocolo Experimental: Se aclimatan las ratas en las instalaciones para animales durante por lo menos 1 semana antes del procedimiento quirúrgico. Aproximadamente 1 semana antes del experimento con pinzas, se insertan catéteres Tygon bajo anestesia con halotano dentro de la vena yugular (para infusión) y la arteria carótida (para muestreo de sangre) y se exterioriza y fija en el lomo del cuello. A las ratas se les proporciona estreptocilina vet . (Boehringer Ingelheim; 0.15 ml/rata, i.m) post-quirúrgicamente y se colocan en una unidad de cuidado animal (25°C) durante el período de recuperación. Con el fin de obtener analgesia, se administra anorfina (0.06 mg/rata, s.c.) durante la anestesia y se administra Rimadyl (1.5 mg/kg, s.c.) después de recuperación completa de la anestesia (2-3 h) y nuevamente un día después, durante 2 días.

A las 7 am en el día del experimento en el que se sometieron a ayuno durante la noche (a partir de 3 pm los días previos) las ratas han sido pesadas y se han puesto en contacto con las jeringas de muestreo y un sistema de infusión (bombas básicas Harvard 22, Harvard y Perfectum Hypodermic jeringa de vidrio, Aldrich) y después se colocan en jaulas de pinza individual en donde permanecen durante aproximadamente 45 min antes de iniciar el experimento. Las ratas son capaces de moverse libremente en su corrimiento habitual durante la totalidad del experimento y tienen acceso libre a agua para beber. Después de 30 min el período basal durante el cual los niveles de glucosa en plasma se midieron a intervalos de 10 min, el derivado de insulina que se va a probar y la insulina humana (un nivel de dosis para rata n = 6-7) por nivel de dosis) se suministran como infusión (i.v.) a una tasa constante de 300 min. Opcionalmente un bolo de apresto de infusión del derivado de insulina que se va a probar se administra con el fin de alcanzar niveles inmediatos de estado estable en plasma. La dosis de la infusión en bolo de apresto se puede calcular en base en los datos de depuración obtenidos de i.v. bolos farmacocinéticos por una persona experta en el ámbito de farmacocinética . Las concentraciones de glucosa en plasma se miden a intervalos de 10 min durante la infusión de glucosa acuosa 20% y se ajusta en consecuencia con el fin de mantener la euglucemia.

Muestras de eritrocitos resuspendidos se acumulan de cada rata y se regresan en volúmenes de aproximadamente 1/2 mi vía el catéter carótido.

En cada día del experimento las muestra de las soluciones de los derivados de insulina individuales que se van a probar y la solución de insulina humana se toman antes y al final de los experimentos de pinza y las concentraciones de los péptidos se confirman por CLAR. Las concentraciones en plasma de insulina de rata y el péptido C así como del derivado de insulina que se va a probar y la insulina humana se miden en puntos de tiempo relevantes antes de y después de la finalización de los estudios. Al final del experimento se mata a las ratas utilizando una sobredosis de pentobarbital .

EJEMPLO 107, POTENCIA DE LOS DERIVADOS DE INSULINA ACILADOS DE ESTA INVENCION EN RELACION AL DERIVADO DE INSULINA CONTROL, ADMINISTRACION SUBCUTANEA A RATAS Ratas Sprague-Dawley macho (n = 6 por grupo) reciben una dosis única subcutáneamente de vehículo o insulina análogo de insulina (50 ó 200 nmoles/animal para análogos con una duración de acción media o una duración de acción prolongada, respectivamente) . La sangre (sublingual) se arrastra y el plasma se recolecta y los puntos de tiempo 0, 1, 2, 4, 8, 24 y 48 ó 0, 2, 4, 8, 24, 48, 72, 96 horas después de la dosificación, para análogos con una duración de acción media o una duración de acción prolongada, respectivamente) . El plasma se analiza para glucosa. Se calcula el efecto de disminución de glucosa como el área bajo la curva de glucosa - delta plasma como una función de tiempo y en comparación con un derivado de insulina control.

EJEMPLO 108, DETERMINACIONES DE TEMPERATURA DE FUSION Calorimetría de exploración diferencial (DSC, por sus siglas en inglés) La recolección de datos se realiza utilizando un microalimentador de exploración diferencial de VP-DSC (MicroCal, LLC, Northampton, MA) . Todas las exploraciones de proteina (derivados de insulina ~ 200 µ?) se realizan con amortiguador de fosfato 2 mM en la celda de referencia, de 15°C a 120°C a una velocidad de exploración de l°C/min y una presión en exceso de 0.21 MPa. Todas las muestras y referencias se desgasificaron inmediatamente antes de su uso. Una exploración de referencia de amortiguador-amortiguador se restó de cada exploración de muestra antes de normalización de concentración.

Los datos DSC se muestran en las figuras 3 y 4.

EJEMPLO 109, MEDICION DE LAS TENDENCIAS DE FIBRILACION PROCEDIMIENTO GENERAL PARA ANALISIS DE FIBRILACION DE TIOFLAVINA T (ThT) ; Principio La baja estabilidad física de un péptido puede llevar a formación de fibrilla amiloide, tal como se observa como estructuras macromoleculares similares a hebras bien ordenadas en la muestra que ha la postre resultan en formación de gel . Esto tradicionalmente se ha medido por inspección visual de la muestra. No obstante, la clase de mediciones es muy subjetiva y depende del observador. Por lo tanto se prefiere en gran medida la aplicación de una sonda indicadora de molécula pequeña. La tioflavina T (ThT) es esta sonda y tiene una firma de fluorescencia distintiva cuando se une a fibrillas (Naiki et al. Anal. Biochem. 177, 244-249, 1989; Le-Vine, Methods Enzymol . 309, 274-284, 1999) . El curso en el tiempo de la formación de fibrillas se puede describir por una curva sigmoidea con la siguiente expresión (Nielsen et al. Biochemistry 40, 6036-6046, 2001): Aquí, F es la fluorescencia de ThT en un tiempo t. La constante t0 es el tiempo que se necesita para llegar a 50% de fluorescencia máxima. Los dos parámetros importantes que describen la formación de fibrilla son el tiempo de retraso calculado por t0-2t y la constante de velocidad aparente kapp = 1/t.

La formación de un intermediario parcialmente plegado del péptido se sugiere como un mecanismo de inicio general para fibrilación. Algunos de estos intermediarios nuclean para formar una plantilla sobre la cual pueden ensamblarse intermediarios y a la fibrilación avanza. El tiempo de retraso corresponde al intervalo en el cual se acumula la masa crítica del núcleo y la constante de velocidad aparente es la velocidad con la cual se forma la fibrilla misma.

Separación de muestra Las muestras se preparan frescas antes de cada análisis. Cada análogo se disuelve en fosfato de sodio 7 mM, pH = 7.4. Se agrega a las muestras tioflavina T desde una solución concentrada en agua a una concentración final de 1 µ?. Se colocan alícuotas de muestra de 200 µ? en una placa de microtitulación de 96 pozos (Packard OptiplateMR-96 , poliestireno blanco) . Habitualmente se colocan en una columna de los pozos cuatro duplicados de cada muestra (que corresponden a una condición de prueba) . La placa se sella con Scotch Pad (Qiagen) .

Mediciones de incubación y fluorescencia La incubación a una temperatura dada, la agitación y las mediciones de la emisión de fluorescencia de ThT se realizan ya sea en un lector de placa de fluorescencia Fluoroskan Ascent FL o Varioskan (Thermo Labsystems) . La temperatura se ajusta a 37°C. La agitación orbital se ajusta a 960 rpm con una amplitud de 1 mm en todos los datos presentados. Las mediciones de fluorescencia se realizan utilizando una excitación a través de un filtro de 444 nm y una medición de emisión a través de un filtro de 485 nm.

Cada corrida se inicia al incubar la placa en la temperatura de análisis durante 10 min. La placa se mide cada 20 minutos durante habitualmente 45 horas. Entre cada' medición la placa se agita y se calienta como se describe en lo anterior.

Manejo de datos Los puntos de datos de medición se guardan en formato Microsoft Excel para procesamiento adicional y se realiza dibujo y ajuste de curva utilizando GraphPad Prism. La emisión de fondo de ThT en ausencia de fibrillas no se toma en consideración. Los puntos de datos típicamente son una media de cuatro muestras . Únicamente los datos obtenidos en el mismo experimento (es decir, muestras en la misma placa) se presentan en la misma gráfica asegurando medición relativa de fibrilación entre las muestras individuales de un análisis en vez de comparación entre análisis diferentes.

El conjunto de datos se puede ajustar a la Ec . (1) . No obstante, puesto que las curvas sigmoideas completas habitualmente no se obtienen durante el tiempo de medición, el grado de fibrilación se expresa como fluorescencia ThT en diversos puntos de tiempo calculada como la media de cuatro muestras y se muestra con la desviación estándar.

Es evidente que ninguna de las insulinas de acuerdo con la invención que fueron probadas hacia fibrilación en el análisis ThT mostró signo alguno de fibrilación como se observa por (ausencia de) fluorescencia aumentada como una función del tiempo. Esto es muy raro y esto vuelve evidente la utilidad de los análogos de la invención.

EJEMPLO 110, LIPOGENESIS EN ADIPOCITOS DE RATA Como una medida de la potencia in vitro de las insulinas de la invención se puede utilizar lipogénesis.

Se aislan adipocitos primarios de rata de las plantas de las patas macho epididy y se incuban en 3H-glucosa en amortiguador que contiene, por ejemplo HSA libre de grasa 1% y ya sea la forma estándar (insulina humana, HI) o la insulina de la invención. La glucosa marcada se convierte en lípidos extraíbles de una manera dependiente de la dosis, lo que resulta en curvas de dosis - respuesta completas. Los resultados se expresan como potencia relativa (%) con límites de confianza de 95% de insulina de la invención en comparación con el estándar (HI) .

Datos de lipogénesis para insulinas de la invención : Para la mayor parte de los análogos de acuerdo con la invención existe una buena concordancia entre los datos de lipogénesis que se obtienen- (en presencia de HSA 0.1%) y los datos de receptor de insulina obtenidos en presencia de HSA 1.5% y de esta manera se confirma que la unión de receptor se traduce en activación de receptor.

EJEMPLO 111, ESTABILIDAD QUIMICA DE LOS ANALOGOS DE INSULINA DE LA INVENCION La estabilidad química de un análogo de insulina se determinó después de incubar análogo de insulina en fosfato 2 mM, pH = 7.5 a 37°C hasta por 8 semanas. La formación de productos de peso molecular alto (HMWP, por sus siglas en inglés) se determinó por análisis SEC CLAR después de 0, 2, 4 y opcionalmente 8 semanas. Los resultados del método SEC se proporcionan como diferencia entre la formación de HMWP a 37°C y 5°C de inicio de muestra como un porcentaje de la absorbancia total a 215 nm. Los productos de degradación química se determinan por análisis de RP CLAR después de 0, 2, 4 y opcionalmente 8 semanas. Los resultados del método RP se proporcionan como una diferencia entre la degradación química observada a 37°C y 5°C de inicio de muestra como el porcentaje de la absorbancia total a 215 nm.

Método de SEC-CLAR: disolvente: NaCl 500 mM, NaH2P04 10 mM, H3PO4 5 mM, 2 -propanol 50% (v/v) flujo: 0.5 ml/min tiempo de corrida: 30 min detección UV: 215 nm columna: columna insulina HMWP de Waters 7.8 x 300 mm Temperatura: 50°C Método de RP-CLAR: disolvente A: amortiguador fosfato 0.09 M, pH 3.6 (fosfato ácido de diamonio), MeCN 10% (v/v) disolvente B: MeCN 80% (v/v%) flujo: 0.3 ml/min tiempo de corrida: 33 min detección UV: 215 nm columna: columna Waters Acquity BEH130 C18, 1.7 µt?, 150 >: 2.1 mm temperatura: 50°C Gradiente : Se concluye que los análogos con un disulfuro a B3 en general son más estables que los análogos con un disulfuro a B4 y los análogos con un disulfuro a B2 o Bl son menos estables .

EJEMPLO 112, DETERMINACION DE ESTRUCTURA POR RAYOS X: Un ejemplo de condiciones de cristalización se proporciona en lo siguiente, no obstante, las condiciones exactas pueden ser diferentes para diferentes análogos y las condiciones óptimas se encuentran mediante cribado de muchas condiciones diferentes. Se obtienen cristales por el método de difusión de vapor y goteo por sedimentación a partir, por ejemplo, una solución de depósito que contiene tartrato de K/Na 0.8 M, Tris 0.1 M, pH 8.5, PEG MME 5000 0.5%. Los datos se recolectan con un ánodo giratorio (Rigaku, MicroMax-007HF) equipado con un detector MarCCD y se procesan por XDS (J Appl Crystallogr 26: 795-800). La estructura se resuelve por sustitución molecular utilizando Molrep (J Appl Crystallogr 30: 1022-1025) con una estructura interna como modelo de búsqueda. El refinamiento de los datos y la construcción del modelo se realiza utilizando los programas Refmac (Acta Crystallogr D 53: 240-255) y Coot (Acta Crystallogr D 60: 2126-2132) .

EJEMPLO 113, DESNATURALIZACION DE CLORHIDRATO DE GUANIDINIO; La desnaturalización de clorhidrato de guanidinio de derivados de insulina seleccionados que contienen enlaces disulfuro adicionales puede ser seguida por espectroscopia de dicroísmo circular (CD, por sus siglas en inglés) con el fin de determinar la energía libre de desdoblado. Ante la desnaturalización de una proteína, el CD negativo en el intervalo UV lejano (240-218-nm) disminuye gradualmente, concordante con la pérdida de estructura secundaria ordenada que acompaña al desdoblado de una proteína. El espectro CD del UV lejano de la insulina humana es sensible a desdoblado tanto de proteína como autoasociación (Holladay et al., 1977 Biochim. Biophys. Acta 494, 245-254; Melberg & Johnson, 1990, Biochim. Biophys. Acta 494, 245-254). Con el fin de separar estos fenómenos a pH 8, se llevaron a cabo titulaciones con GuHCl en diferentes concentraciones de proteína, por ejemplo, 3, 37 y 250 µ? . A estas concentraciones, los análogos de insulina existen principalmente como monómeros, dímeros y una mezcla de dímeros y agregados superiores . El espectro de CD de insulina en el intervalo UV cercano (330-250-nm) refleja el ambiente del cromóforo tirosina con contribuciones a partir de los enlaces disulfuro (Morris et al., 1968, Biochim. Biophys. Acta. 160, 145-155; Wood et al., 1975, Biochim. Biophys. Acta. 160, 145-155; Strickland & Mercóla, 1976, Biochemistry 15, 3875-3884). Las gráficas de cambio en las condiciones elípticas molares tanto en las regiones UV cercana como UV lejana como una función de la concentración desnaturalizante se van a generar. La energía libre de desdoblado se calcula previamente a partir de tales curvas de desnaturalización de insulina ajustados con dos modelos de estado (Kaarsholm, N. C. et al 1993 Biochemistry, 32, 10773-8) .

Las concentraciones de proteína se determinan por absorbancia UV y/o RP-CLAR y/o SEC-CLAR. Las muestras de desnaturalización se preparan al combinar relaciones de proteína diferentes y soluciones concentradas de GuHCl con Tris 10 mM/C104 -amortiguador, pH 8.0. Las soluciones concentradas de proteína típicamente son de 1.5 mM en Tris 10 mM/C104-, pH 8.0. Las soluciones concentradas de GuHCl son de 8.25 M (determinado por refractometría) en 10 mM de Tris/C104-, pH 8.0. Todos los espectros CD se registran a 25°C. Las muestras de desnaturalización CD en UV lejano se exploran a partir de 250 a 218 nm. La longitud de trayectoria de célula típica y las concentraciones de proteína son 0.2 cm y 37 pM, respectivamente. Las muestras de desnaturalización CD del UV cercano se exploran de 330 a 250 nm utilizando una longitud de trayectoria de 1 cm y típicamente proteína 75 pM. Todos los espectros se suavizan por un algoritmo de transformada de Fourier antes de la sustracción de los blancos de disolvente apropiados. En el intervalo UV lejano, Ae se basa en la concentración molar del enlace peptídico mientras que en UV cercano, ?e se normaliza con la concentración molar del monómero de insulina.

Las curvas de desnaturalización de GuHCl se analizan suponiendo que la transición doblado/desdoblado es en dos etapas, en cuyo caso las constantes de equilibrio se pueden obtener en cada concentración desnaturalizante utilizando K = (?e?-?e) (?e - ?e?) , en donde ?e es el valor observado de CD y ?e? y ?e? representan los valores "CD para las formas nativa y desdoblada, respectivamente, a la concentración dada de GuHCl (Pace, C. N. (1975) CRC Crit.

Rev. Biochem. 3, 1-43) . Los valores para ?e? y ?e? a concentraciones de GuHCl en la región de transición se obtienen por extrapolación lineal de las líneas de base pre-y post- transición dentro de la región de transición, es decir, ?e? = ?e°? + mN [GuHCl] y ?e? = ?e°? + mu [GuHCl] , en donde ?e°? y ?e°? son las intercepciones y mN y m0 son las pendientes de las líneas de base pre- y post-transición, respectivamente. La energía libre del desdoblado a una concentración dada de desnaturalizante en la zona de transición se proporciona por AG = -RT ln K. Suponemos una dependencia lineal de AG sobre la concentración desnaturalizante: AG = AGH2o_m [GuHCl] , en donde AGH2o es el valor de AG en ausencia de desnaturalizante y m es una medida de la dependencia de AG sobre la concentración desnaturalizante. Por lo tanto, los valores AG derivados de K en la zona de transición se pueden extrapolar de regreso a desnaturalizante 0 M para proporcionar AGH20- La relación entre ?e y [GuHCl] para la curva de desdoblado completa se muestra en la ec 1 (Santoro, M. M. , & Bolen, D. . (1988) Biochemistry 27, 8063-8068) : ?e = { (?e°? + mN[GuHCl]) + (?e°? + mu[GuHCl]) exp[- (AGH20-m[GuHCl] )/RT) }/{ (I + exp [ - (AGH20-m [GuHCl] ) /RT] } Con ?e como la respuesta y [GuHCl] como la variable independiente, esta ecuación se somete a análisis de mínimos cuadrados no lineales utilizando, por ejemplo, el procedimiento NLIN de PC SAS /SAS Inc., Cary, NC) . Seis parámetros después describe la curva de desnaturalización: ?e°?, ?e°?, mN, mu, m, y AGH2O- Además, la concentración de GuHCl en el punto medio de la curva de desnaturalización, Craid está proporcionado por AGH2o/m. La diferencia en la energía libre de desdoblado entre insulinas humana y mutante se puede calcular entonces a partir de AAGH2O = AGH2O (mutante) - AGH2o (natural) .

EJEMPLO 114, DETERMINACION DE MASA INTACTA PRECISA: La instrumentación de CL-EM consiste del sistema Acquity UPLC (Waters, Milford, MA) y el espectrómetro de masas Synapt G (Waters, Milford, MA) . Los análogos de insulina se aplican a una columna de CLAR en fase inversa C18 y se analizan utilizando un gradiente lineal de acetonitrilo en ácido trifluoroacético 0.05%. El flujo a partir de CLAR se aplica directamente a la interfaz de electroaspersión del sistema Synapt G2 que opera en el modo únicamente EM positivo con un potencial de capilaridad de 2500 V, una temperatura fuente de 110°C, temperatura de desolvatacion de 250°C y un flujo de gas en cono (N2) de 50 1/h. Los espectros de EM para m/z = 100 a m/z = 3000 se adquieren dos veces por segundo. El instrumento se calibra por una mezcla estándar de Nal antes del análisis y aspersión inmovilizada de leucina encefaliña se aplica durante los análisis de CL-EM. Las masas de insulina intactas se reconstruyen por BioPharmaLynx 1.2 (Waters, Milford, MA) utilizando el algoritmo MaxEnt3. El espectrómetro de masas Orbitrap XL (Thermo Fisher) se puede utilizar en vez de Synapt G2. El instrumento Orbitrap es operado en el modo EM positivo con un voltaje fuente de 4 kv, corriente fuente de 100 µ?, flujo de gas de cubierta de 40, flujo de gas auxiliar de 10, flujo de gas de barrido de 5, voltaje capilar de 20 V. Todos los parámetros EM se ajustan durante la sintonización de los instrumentos para funcionamiento óptimo y pueden desviarse ligeramente de los indicados en lo anterior. La precisión de masas que se obtiene por este método es mejor de 10 ppm.

Columna: Acquity BEH C18 1 x 150 mm, 1.7 µp? (Waters) Flujo: 0.1 ml/min Amortiguador A: 0.02% (v/v) o 0.05% (v/v) de TFA Amortiguador B:0.02% (v/v) o 0.04% (v/v) TFA en acetonitrilo Gradiente: 5% de B durante 2 min; 5% de B a 50% de B en 12 minutos, 50% de B a 90% de B en 1 minuto Detección UV: 215 nm Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (14)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un derivado de insulina, caracterizado porque tiene dos o más sustituciones cisteína y una cadena lateral unida a la insulina, en donde los tres enlaces disulfuro de insulina humana se retienen, y los sitios de sustituciones de cisteína se seleccionan de manera tal que los residuos de cisteína introducidos se colocan en la estructura tridimensional del derivado de insulina plegado para permitir la formación de uno o más enlaces disulfuro adicionales no presentes en la insulina humana.

2. El derivado de insulina de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque los sitios de sustituciones de cisteína se seleccionan de manera que (1) los residuos de cisteína introducidos se coloquen en la estructura tridimensional del derivado de insulina plegado para permitix- la formación de uno o más enlaces disulfuro adicionales no presentes en la insulina humana, y (2) el derivado de insulina humana retiene las actividades biológicas deseadas asociadas con la insulina human .

3. El derivado de insulina de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque los sitios de sustituciones de cisteína se seleccionan de manera que (1) los residuos de cisteína introducidos se coloquen en la estructura tridimensional del derivado de insulina plegado para permitir la formación de uno o más enlaces disulfuro adicionales no presentes en la insulina humana, (2) el derivado de insulina humana retiene las actividades biológicas deseadas asociadas con la insulina humana, y (3) el derivado de insulina humana tiene estabilidad física aumentada en relación con la insulina humana y/o la insulina original.

4. El derivado de insulina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque los sitios de sustituciones de cisteína se seleccionan de manera que (1) los residuos de cisteína introducidos se colocan en la estructura tridimensional del derivado de insulina plegado para permitir la formación de uno o más enlaces disulfuro adicionales no presentes en la insulina humana, (2) el derivado de insulina humana retiene las actividades biológicas deseadas asociadas con la insulina human , y (3) el derivado de insulina humana se estabiliza contra degradación proteolítica.

5. El derivado de insulina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el residuo aminoácido en la posición AlO de la cadena A está sustituido con una cisteína, el residuo aminoácido en la posición seleccionada del grupo que consiste de Bl, B2, B3 y B4 de la cadena B está sustituido con una cisteína y opcionalmente el aminoácido en la posición B30 ha sido suprimido .

6. El derivado de insulina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque uno o más enlaces disulfuro adicionales se obtienen entre la cadena A y la cadena B.

7. El derivado de insulina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque tiene un perfil más prolongado que un derivado de insulina sin uno o más enlaces disulfuro adicionales.

8. El derivado de insulina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la insulina se selecciona del grupo que consiste de: A10C, A14E, B1C, B16H, B25H, desB30 insulina humana, A10C, A14E, B1C, B25H, desB30 insulina humana, A10C, A14E, B2C, B16H, B25H, desB30 insulina humana, A10C, A14E, B2C, B25A, desB30 insulina humana, A10C, A14E, B2C, B25H, desB30 insulina humana, A10C, A14E, B3C, B16H, B25H, desB30 insulina humana, A10C, A14E, B3C, B25H, desB27, desB30 insulina humana, A10C, A14E, B3C, B25H, desB30 insulina humana, A10C, A14E, B3C, desB27, desB30 insulina humana, A10C, A14E, B4C, B16H, B25H, desB30 insulina humana, A10C, A14E, B4C, B25A, desB30 insulina humana, A10C, A14E, B4C, B25H, B28E, desB30 ' insulina humana, A10C, A14E, B4C, B25H, desB27, desB30 insulina humana, A10C, A14E, B4C, B25H, desB30 insulina humana, A10C, A14E, B4C, B25N, B27E, desB30 insulina humana, A10C, A14E, B4C, B25N, desB27, desB30 insulina humana, A10C, A14E, desBl, B4C, B25H, desB30 insulina human , A10C, A14H, B4C, B25H, desB30 insulina humana, AIOC, B3C, B25H, desB27, desB30 insulina humana, AlOC, B3C, B25H, desB30 insulina humana, AlOC, B4C, B25H, desB27, desB30 insulina humana, AlOC, B4C, B25H, desB30 insulina humana, AlOC, A14E, B1C, B16H, B25H, desB30 insulina humana, AlOC, A14E, B2C, B16H, B25H, desB30 insulina humana, AlOC, A14E, B3C, B16H, B25H, desB30 insulina humana, AlOC, A14E, B4C, B16H, B25H, desB30 insulina humana y una cadena lateral está unida a la parte N-terminal de la insulina o al grupo amino epsilon de un residuo lisina en la insulina.

9. El derivado de insulina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la cadena lateral está unida al N-terminal de la insulina del grupo amino epsilon de un residuo lisina en la insulina.

10. Un método para estabilizar una insulina caracterizado porque comprende sustituir dos o más aminoácidos de una insulina con residuos cisteína y unir lado a lado a la insulina, en donde a. tres enlaces disulfuro de insulina humana se retienen, y b. los sitios de sustituciones de cisteina se seleccionan de manera tal que los residuos cisteina introducidos se colocan en la estructura tridimensional del derivado de insulina plegado para permitir la formación de uno o más enlaces disulfuro adicionales no presentes en la insulina humana, por lo que se genera un derivado de insulina que comprende uno o más enlaces disulfuro adicionales no presentes en la insulina humana.

11. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende una cantidad biológicamente activa del derivado de insulina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y un portador farmacéuticamente aceptable .

12. Un método para el tratamiento de diabetes mellitus en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar al sujeto un derivado de insulina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 11.

13. Un proceso para la preparación de una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque comprende mezclar un derivado de insulina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 con sustancias farmacéuticamente aceptables y/o excipientes.

14. Una composición farmacéutica, caracterizada porque se puede obtener por el proceso de conformidad con la reivindicación 13.