JP4519324B2 - 共有結合で架橋されたインスリンダイマー - Google Patents
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Description
【０００１】
【技術分野】
本発明は、新規なインスリン類縁体、このようなインスリン類縁体からなる医薬、糖尿病の治療のための医薬を製造する方法およびインスリン類縁体の製造方法に関する。
【０００２】
【背景技術】
プロテオホルモンであるインスリンは、ランゲルハンスス島のβ細胞で産生される。その最も重要な生理学的作用には血糖レベルの低下が包含される。インスリンの不足は、グルコース代謝の逸脱によって特徴づけられる糖尿病（Ｉ型）の複雑な病的状態を招来する。
【０００３】
糖尿病は医薬製剤中のインスリンおよびインスリン類縁体の使用によって治療される。最も広く用いられている治療形態の置換療法では、インスリンは皮下投与される。この最も一般的な副作用は低血糖（低い血中グルコースレベル）である。糖尿病の治療のためのインスリンの医薬製剤は絶えず開発されているにもかかわらず、それらの効力と副作用の低下の組み合わせに関して有望な新規インスリン類縁体の研究が続けられている。すなわち、たとえば速効性の「インスリンリリスプロ」は、アミノ酸プロリンB28およびリジンB29を置換することにより開発された（EP 0 383 472 B1）。同様にリジンB29のε−アミノ基の脂肪酸アシル化による長時間作用型のインスリン誘導体も開発されている（J. Markussen, S. Havelund, P. Kurtzhals, A.A. Andersen, J. Halstrφm, E.Hasselager, U.D. Larsen, U. Ribel, L. Schaeffer, K. Vad, I. Jonassan, Diabetologia 1996, 39: 281−288）。ヒトインスリンのネイティブな構造のこのような修飾は、インスリン作用の時間経過に影響を与えることが可能ではあるが、治療に使用することができて、一部の組織特異性のみ特に肝臓選択性によって、生理学的状態に適したさらに標的化された治療を可能にするインスリン類縁体はまだなく、かなりの問題が未解決のままである。また大きな効力の結果として、ネイティブな構造をもつヒトインスリンまたは動物インスリンよりも少量で使用できる類縁体は開示されていない。
【０００４】
糖尿病の治療に使用されるインスリンはすべて、常に分子量約６,０００のモノマーのインスリン分子である。すべてのモノマーインスリンの類縁体および誘導体は部分的または完全なインスリンアゴニストであることが証明され（S. Gammeltott, Physiol. Rev. 1984, 64: 1321）、受容体結合と生物学的シグナルの誘発の間には緊密な相関が示されている。ただ２、３の例で、たとえば共有結合で架橋されたインスリンダイマーは受容体結合と生物活性の間に不一致のあることが観察されている（A. Schuettler, D. Brandenburg, Hoppe Seyler's Z. Physiol. Chem. 1982, 363: 317-330; M. Weiland, C. Brandenburg, D. Brandenburg, H.G. Joost, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990, 87: 1154-1158）。さらに、インスリンダイマーは、様々な組織におけるインスリン受容体の鑑別に有用なことが証明されている（M. Breiner, M. Weiland, W. Becker, D. Mueller-Wieland, R. Streicher, M. Fabry,H.G. Joost, Molecular Pharmacology 1993, 44: 271-276）。したがって、それらは病的な場合における診断に基本的に重要である。
【０００５】
今日までに報告されているダイマーはすべて、それらのネイティブな長さでの２つのインスリンの共有結合による架橋が関与している。インスリンダイマーは動物実験において比較的に肝臓選択性を示すことから、原理的に特に興味がもたれ（ネイティブなインスリン構造をもつＢ1,Ｂ1′−スベロイル−インスリンダイマーについて証明された。F. Shojaee-Moradie, N.C. Jackson, M. Boroujerdi, D. Brandenburg, P.H. Soenksen, R.H. Jones, Diabetologia 1995, 38: 1007-1013）、したがって現在糖尿病の治療に用いられているすべてのインスリンよりも血中のグルコースレベルの生理学的低下をもたらすことが可能になる。そこに用いられているＢ1,Ｂ1′−スベロイル−インスリンダイマーは、しかしながら、受容体への結合よりもインビトロでの生物活性はかなり低い（157〜199％と比較して28.8％。M.A. Tatnell, R.H. Jones, K.P. Willey, A. Schuettler, D. Brandenburg, Biochem. J. 1983, 216: 687-694）。したがって、受容体結合に対する生物活性の比はきわめて低く０.１５〜０.１８である。本発明者らの知る限りこれらの所見を糖尿病の治療に向けて適用またはさらに発展させたという事実はない。
【０００６】
【発明の開示】
本発明者らは今回、それらの性質により上述の問題の解決および糖尿病治療の改良に有望な、以下インスリン類縁体とも呼ぶ新規なインスリンダイマーを設計し合成した。この関連で、インスリンモノマーによる今日までの治療に比較して本発明者らのアプローチのユニークな特徴は、２つの同種または異種インスリンモノマーが架橋を介して互いに共有結合によって連結してなるインスリン類縁体およびそれらの生理学的に許容される塩が使用されることであり、この場合、インスリンモノマーはヒトインスリンおよび動物インスリンならびに上述のインスリン誘導体からなる群より選択され、インスリン類縁体の２つのインスリンモノマーの少なくとも１つは誘導体である点である。特にＢ鎖のＣ末端がＢ26位置で切断されたかまたは修飾されたインスリン類縁体が使用される。インスリンのモノマーはタンパク質を連結させるために適当な物質によって架橋することができる。タンパク質を連結するための物質および方法は、古くから知られている。特に、新規なインスリン類縁体は、好ましくは２つのインスリンモノマーのＢ鎖Ｎ−末端アミノ基の間に位置する架橋を有し、この場合、架橋は式 (ＣＲＲ′)n(ＣＯ−)2（式中、ｎ、Ｒ、Ｒ′は式Ｉについて以下に定義し記載する）の直鎖状または分岐鎖状の二官能性カルボン酸残基から形成させることが特に好ましい。動物インスリンの例はブタ、サル、ウシおよびニワトリインスリンである。インスリン誘導体は天然に存在するアミノ酸残基の少なくとも１個の置換および／または欠失および／または少なくとも１個のアミノ酸残基および／または有機残基の付加によって他の点では相当する天然に存在するインスリンと同一なインスリンと異なるインスリンである。インスリン誘導体モノマーの一例には、Ｇly(Ａ21)、Ａrg(Ｂ31)、Ａrg(Ｂ32）ヒトインスリンがあり、本発明のインスリンダイマー類縁体の一例にはＢ1,Ｂ1′−Ｓub−[Ｄ−ＡlaB26]−des−[Ｂ27−Ｂ30]−インスリン−Ｂ26−アミドインスリンダイマーがある。インスリン類縁体は特に一般式Ｉ：
【０００７】
【化２】
［式中、
Ｘは、互いに独立して、分岐状または分岐のないＣ1〜Ｃ10−アルキル基、モノまたはポリ置換されたアリール基、Ｃ1〜Ｃ10−アルキル基、モノもしくはポリ置換または非置換Ｏ−アリール基、アミノ酸またはそれらの誘導体、または式ＮＲＲ′（式中、Ｒ、Ｒ′はＨ、ＮＨ2、分岐状または分岐のないＣ1〜Ｃ10−アルキル基、またはモノもしくはポリ置換または非置換アリール基である)であり、
ｎは０、１、２....１６である］
によって表すことができる。
【０００８】
本発明はさらに、Ｘはカルボン酸基がアミド化されているアミノ酸誘導体である上記式Ｉのインスリン類縁体に関する。
【０００９】
本発明はさらに、Ｘはカルボン酸基がアミド化されているアミノ酸サルコシンである上記式Ｉのインスリン類縁体に関する。
【００１０】
本発明はさらに、２つのＢ鎖中のＸ残基は互いに異種である上記式Ｉのインスリン類縁体に関する。
【００１１】
本発明はさらにＸはアミノ基である上記式Ｉのインスリン類縁体に関する。
本発明はさらに、このようなインスリン類縁体からなる医薬、糖尿病を治療するための医薬の製造方法、およびインスリン類縁体の調製方法に関する。
【００１２】
インスリン類縁体は２つの任意に部分的に保護されたモノマー分子を予め活性化されたジカルボン酸により架橋することによって既知の方法で製造される（A. Schuettler, D. Brandenburg, Hoppe Seyler's Z. Physiol. Chem. 1982, 363: 317-330）。モノマー類縁体は酵素触媒半合成または遺伝子操作方法によって得ることができる（本発明の実施例参照）。
【００１３】
したがって、本発明はさらに上に記載したようなインスリン類縁体を製造するにあたり、
(ａ) モノマーインスリン類縁体を酵素触媒半合成または遺伝子操作法によって得、
(ｂ) 工程(ａ)からのモノマーインスリン類縁体を場合によって保護基によって部分的に保護し、
(ｃ) 工程(ｂ)からの保護されたモノマーインスリン類縁体および／または工程（ａ）からのモノマーインスリン類縁体を予め活性化したジカルボン酸と反応させ、ついで
(ｄ) 工程(ｃ)で得られたインスリン類縁体を反応混合物から単離する
方法に関する。
【００１４】
ヒトインスリンおよびモノマーインスリン類縁体に比べて、本発明のダイマーはとくインビトロにおけるにインスリン受容体との高い親和性および著しい効力によって傑出していて、後者はインスリンの作用の２０倍にまで達する。
【００１５】
以前に開示された共有結合したインスリンダイマーに反して、新規なダイマーはきわめて高い生物活性を示す。受容体結合に対する生物活性の比は少なくとも２であり、場合により４または５さえ示す。したがって、それらは生物学的に、かなり有効であると考えられる。これらの比をＢ1,Ｂ1′−スベロイルダイマーについて文献に記載された値と比較すると、少なくとも１１（０.１８：２）および最大２８のファクターが明らかである。
【００１６】
本発明のインスリンダイマーによって達成される利点は特に、
１．現在治療的に使用されているインスリンおよびすべての類縁体に比較して比較的に肝臓選択性であり、したがって、より生理学的な作用様式が期待される（作用の一次部位は肝臓であり、末梢ではない）。
２．以前に初めて開示されたインスリンダイマーに比較して、かなり改良された生物学的効果がある。
３．インスリンおよびモノマー類縁体に比較してかなり増大した生物学的活性は、同等な効果が著しく少量の活性物質で達成されるので使用時にきわめて有利である。
【００１７】
【実施例】
略号：
ＡＡ アミノ酸
Ａc 酢酸基（ＣＨ3ＣＯＯ-）
Ａlox アルミニウムオキシド（Ａl2Ｏ3）
ＣＺＥ 毛細管ゾーンクロマトグラフィー
ＤＩＰＥＡ Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ ジメチルスルホキシド
ＤＯＩ デスオクタペプチドインスリン
Ｅq 当量
Ｆmoc ９−フルオレニルメトキシカルボニル
ＨＯＢt １−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＨＰＣＬ 高速液体クロマトグラフィー
ＭＡＬＤＩ マトリックス−補助レーザー脱着／イオン化
ＭＰＬＣ 中圧液体クロマトグラフィー
Ｍsc メチルスルホニルエトキシカルボニル
ＭＷ 分子量
ＮaＯＨ 水酸化ナトリウム
ＮＭＭ Ｎ−メチルモルホリン
ＲＰ 逆相
ＯＮＳu Ｎ−オキシスクシンイミドエステル
Ｓar サルコシン
Ｓub スベロイル
ＴＢＴＵ 2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチル ウロニウムテトラフルオロボレート
ＴＥＡ トリエチルアミン
ＴＦＡ トリフルオロ酢酸
ＴＯＦ フライト時間
ＴＰＣＫ トシル−Ｌ−フェニルアラニルクロロメチルケトン
Ｔris トリス−(ヒドロキシメチル)アミノメタン
【００１８】
実施例１
Ｂ1,Ｂ1′−Ｓub−[ＳarB26]−des−(Ｂ27−Ｂ30)−インスリン−Ｂ26−アミドインスリンダイマーの合成
Ｇ ly −Ｐ he −Ｐ he −Ｓ ar −ＮＨ 2 の合成
ペプチドは４−(２′,４′−ジメトキシフェニル−Ｆmoc−アミノメトキシ)フェノキシ樹脂上、Ｆmoc 保護基法を用いて合成した。カップリングに使用したＦmoc−アミノ酸エステルはＴＢＴＵ／ＨＯＢｔ法によって形成させ、樹脂の名目上の負荷に基づいて３モル過剰に使用した。ペプチドは以下の合成プロトコールに従って合成した。
【００１９】
【表１】
【００２０】
陽イオンのトラップとして９５％ＴＦＡ、４％Ｈ2Ｏおよび１％トリエチルアミンからなる除去溶液１０mlの添加による酸分解によって樹脂からペプチドを切断した。室温で２時間撹拌したのち、樹脂をろ過し、ジクロロメタンで完全に洗浄した。ペプチドをさらに精製するためには、ＲＰ−ＭＰＬＣカラムクロマトグラフィーを行い、直線２−プロパノール勾配（０.０７％ＴＦＡ開始緩衝液および供給緩衝液それぞれの４００ml中０〜４０％ ２−プロパノール）で溶出した。Nucleosil 20−Ｃ18を静止相として使用した。流速は１８０〜２００ml／時間とした（収率８２.６％）。
【００２１】
[ Ｓ ar B26 ] − des − ( Ｂ 27 −Ｂ 30) −インスリン−Ｂ 26 −アミドの合成
Ｂ鎖の頭部切断Ｃ末端（truncated C terminus）を有するインスリンはＮα A1−Ｍsc−des−(Ｂ23−Ｂ30)−インスリンにテトラペプチドを酵素的にカップリングさせて合成した。この目的には、ネイティブなインスリンを酵素的にまずＤＯＩに分解し、ついでこれに部分的に保護基を付すことが必要であった。
【００２２】
des − ( Ｂ 23 −Ｂ 30) −インスリンの合成
３００mg（５１.６６μmol）のインスリンを６０mlの反応緩衝液（０.０５Ｍ Ｔris、１mM ＣａＣｌ2）に取る。ｐＨを固体Ｔris によって９.５に調整し、１６mgのＴＰＣＫ処理トリプシンを添加してタンパク分解を開始する。インキュベーションは水浴中37℃で約６時間行い、反応はＲＰ−ＨＰＬＣでモニタリングする。反応を氷酢酸４mlの添加によって停止させ、反応混合物をロータリーエバポレーター中で濃縮する。最初は Sephadex G 25f ゲルろ過、ついで Sephadex G 50f ゲルろ過によって後処理を行う。生成物は凍結乾燥する（収率７３.３％）。
ＭＷ：４８６５
【００２３】
Ｎ α A1 − ( Ｍ sc) − des − ( Ｂ 23 −Ｂ 30) −インスリンの合成
３００mg（６１.６６μmol）の des−(Ｂ23−Ｂ30)−インスリンを２２５μlのＴＥＡを加えてＤＭＳＯ ２２.５ml中に溶解する。穏やかに撹拌しながらＤＭＳＯ ５ml中Ｍsc−ＯＮＳu １８mg（６７.８６μmol）溶液を加える。２０分の反応時間ののち、７５０μlの氷酢酸を加えて反応を停止させ、反応溶液を４℃で１６時間、脱イオンした水に対して透析する。透析液を凍結乾燥する。さらに精製するためには、SP−Sepharose（ｐＨ３；３５０ml開始緩衝液、３５０mlの０.０９Ｍ ＮａＣｌ供給緩衝液）上イオン交換クロマトグラフィーを行い、Sephadex G 25f 上脱塩を実施する。生成物は凍結乾燥する（収率３０.８％）。
ＭＷ：５０１５.１６
【００２４】
Ｇ ly −Ｐ he −Ｐ he −Ｓ ar −ＮＨ 2 のＮ α A1 − ( Ｍ sc) − des − ( Ｂ 23 −Ｂ 30) −インスリンへのトリプシンカップリング
１３２.７５mg（３００μmol）のＧly−Ｐhe−Ｐhe−Ｓar−ＮＨ2および１５０.４５mg（３０μmol）のＮα A1−(Ｍsc)−des−(Ｂ23−Ｂ30)−インスリンを２mlのＤＭＦ（Ａlox上で撹拌）、２mlの１,４−ブタンジオールおよび４００μｌの０.０５Ｍ Ｃａ(ＣＨ3ＣＯＯ)2溶液中に溶解または懸濁する。見かけのｐＨをＮＭＭによって６.７〜７.０に調整する。ついで０.０５Ｍ Ｃａ(ＣＨ3ＣＯＯ)2溶液１００μｌ中に溶解したＴＰＣＫ−処理トリプシン２３mgを反応混合物に加える。反応時間中に、反応の進行はＲＰ−ＨＰＬＣによって追跡し、ｐＨをチェックしてＮＭＭにより適宜再調整する。４.５時間後、ほぼ９０％の変換が達成される。３０％濃度の酢酸４.５mlにより反応を停止させる。酵素、ペプチドおよび他の低分子量物質を Sephadex G 50f ゲルクロマトグラフィーによって除去する。ついで未反応ペプチドをＲＰ−ＭＰＬＣにより回収する。インスリン誘導体の更なる精製は Nucleosil 100-10Ｃ8（２.０cm直径、２５.０cm長に５.０cmプレカラム付き）上ＲＰ−ＨＰＬＣによって行う（収率４８.６％）。
ＭＷ：５２９０.２
【００２５】
Ｂ 1, Ｂ 1 ′−Ｓ ub − [ Ｓ ar B26 ] − des − ( Ｂ 27 −Ｂ 30) −インスリン−Ｂ 26 −アミドインスリンダイマーの合成
１００mg（１８.９μmol）のＮα A1−(Ｍsc)−[ＳarB26]−des−(Ｂ27−Ｂ30)−インスリンＢ26−アミドを、５.５当量のＨＯＢｔとともに４００μｌのＤＭＳＯ、８.７μｌのＤＭＦおよび９.５μｌのＮＭＭに溶解する。３０分後、０.６当量のスベリン酸ビス−ＯＮＳｕエステルを固体の形で加え、８〜３０時間撹拌する。全反応混合物を１.５mlの１０％濃度の酢酸中に３００μｌの氷酢酸の添加とともに取り、Sephadex G 50f 上でクロマトグラフィーに付す。ダイマーの分画を凍結乾燥する。Ｍsc 基を除去するためには、Ｍsc−保護タンパク質を５mlのジオキサン／水混合物（2/1, v/v）に溶解し、０℃に冷却する。５１４μｌの２Ｎ ＮａＯＨを添加して、混合物を０℃で１２０秒間撹拌する。２.２mlの氷酢酸を加えて反応を停止させる。反応混合物をSephadex G 25f 上ゲルクロマトグラフィーに付し凍結乾燥する（収率１１.９％）。
中間体および最終生成物の特性解析は、ＲＰ−ＨＰＬＣ、酸性ＣＺＥならびにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルによって行った（表１）。
【００２６】
【表２】
【００２７】
実施例２
Ｂ1,Ｂ1′−Ｓub−[Ｄ−ＡlaB26]−des−(Ｂ27−Ｂ30)−インスリン−Ｂ26−アミドインスリンダイマーの合成
この頭部切断(truncated）インスリンダイマーの合成は、合成テトラペプチドＧly−Ｐhe−Ｐhe−Ｄ−Ａla−ＮＨ2を用いたほかは本発明の実施例１に記載した合成と同様にして行った。相当する収率、純度および分子量は表２に示す。
【００２８】
【表３】
【００２９】
実施例３
Ｂ1,Ｂ1′−Ｓub−[ＧluB26]−des−(Ｂ27−Ｂ30)−インスリン−Ｂ26−アミドインスリンダイマーの合成
この頭部切断インスリンダイマーの合成は、合成テトラペプチド Ｇly−Ｐhe−Ｐhe−Ｇlu−ＮＨ2を用いたほかは本発明の実施例１に記載した合成と同様にして行った。相当する収率、純度および分子量は表３に示す。
【００３０】
【表４】
【００３１】
実施例４
本発明の実施例１〜３についての本発明の生物学的性質
本発明の実施例１〜３に記載のＢ1,Ｂ1′−Ｓub−[Ｓar−Ｄ−ＡlaまたはＧluB26]−des−(Ｂ27−Ｂ30)−インスリン−Ｂ26−アミドインスリンダイマーの生物学的性質を、一方では受容体に基づいて、他方ではインビトロにおける生物活性に基づいて測定した。
【００３２】
受容体結合はＩＭ−９リンパ球に対する置換研究により測定した。相対的生物活性はグルコースの輸送の形態での培養３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞に対して測定した。表４には合成インスリンダイマーの結合親和性および相対的生物学的活性を示す。
【００３３】
【表５】
【００３４】
参考文献
１．J. Markussen, S. Havelund, P. Kurtzhals, A.A. Andersen, J. Halstrom, E. Hasselager, U.D. Larsen, U. Ribel, L. Schaeffer, K. Vad, I. Jonassen, Diabetologia 1996, 39, pp.281-288.
２．European patent EP 0 383 472 B1.
３．S. Gammeltoft, Physiol Rev. 1984, 64, p.1321.
４．A. Schuettler, D. Brandenburg, Hoppe Seyler's Z. Physiol, Chem. 1982, 363, pp.317-330.
５．M. Weiland, C. Brandenburg, D. Brandenburg, H.G. Joost, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990 87, pp.1154-1158.
６．M. Breiner, M. Weiland, W. Becker, D. Mueller-Wieland, R. Streicher, M. Fabry, H.G. Joost, Molecular Pharmacology 1993, 44, pp.271-276.
７．F. Shojaee-Moradie, N.C. Jackson, M. Boroujerdi, D. Brandenburg, P.H. Soenksen, R.H. Jones, Diabetologia 1995, 38, pp.1007-1013.
８．M.A. Tatnell, R.H. Jones, K.P. Willey, A. Schuettler, D. Brandenburg, Biochem. J. 1983, 216, pp.687-694.
【技術分野】
本発明は、新規なインスリン類縁体、このようなインスリン類縁体からなる医薬、糖尿病の治療のための医薬を製造する方法およびインスリン類縁体の製造方法に関する。
【０００２】
【背景技術】
プロテオホルモンであるインスリンは、ランゲルハンスス島のβ細胞で産生される。その最も重要な生理学的作用には血糖レベルの低下が包含される。インスリンの不足は、グルコース代謝の逸脱によって特徴づけられる糖尿病（Ｉ型）の複雑な病的状態を招来する。
【０００３】
糖尿病は医薬製剤中のインスリンおよびインスリン類縁体の使用によって治療される。最も広く用いられている治療形態の置換療法では、インスリンは皮下投与される。この最も一般的な副作用は低血糖（低い血中グルコースレベル）である。糖尿病の治療のためのインスリンの医薬製剤は絶えず開発されているにもかかわらず、それらの効力と副作用の低下の組み合わせに関して有望な新規インスリン類縁体の研究が続けられている。すなわち、たとえば速効性の「インスリンリリスプロ」は、アミノ酸プロリンB28およびリジンB29を置換することにより開発された（EP 0 383 472 B1）。同様にリジンB29のε−アミノ基の脂肪酸アシル化による長時間作用型のインスリン誘導体も開発されている（J. Markussen, S. Havelund, P. Kurtzhals, A.A. Andersen, J. Halstrφm, E.Hasselager, U.D. Larsen, U. Ribel, L. Schaeffer, K. Vad, I. Jonassan, Diabetologia 1996, 39: 281−288）。ヒトインスリンのネイティブな構造のこのような修飾は、インスリン作用の時間経過に影響を与えることが可能ではあるが、治療に使用することができて、一部の組織特異性のみ特に肝臓選択性によって、生理学的状態に適したさらに標的化された治療を可能にするインスリン類縁体はまだなく、かなりの問題が未解決のままである。また大きな効力の結果として、ネイティブな構造をもつヒトインスリンまたは動物インスリンよりも少量で使用できる類縁体は開示されていない。
【０００４】
糖尿病の治療に使用されるインスリンはすべて、常に分子量約６,０００のモノマーのインスリン分子である。すべてのモノマーインスリンの類縁体および誘導体は部分的または完全なインスリンアゴニストであることが証明され（S. Gammeltott, Physiol. Rev. 1984, 64: 1321）、受容体結合と生物学的シグナルの誘発の間には緊密な相関が示されている。ただ２、３の例で、たとえば共有結合で架橋されたインスリンダイマーは受容体結合と生物活性の間に不一致のあることが観察されている（A. Schuettler, D. Brandenburg, Hoppe Seyler's Z. Physiol. Chem. 1982, 363: 317-330; M. Weiland, C. Brandenburg, D. Brandenburg, H.G. Joost, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990, 87: 1154-1158）。さらに、インスリンダイマーは、様々な組織におけるインスリン受容体の鑑別に有用なことが証明されている（M. Breiner, M. Weiland, W. Becker, D. Mueller-Wieland, R. Streicher, M. Fabry,H.G. Joost, Molecular Pharmacology 1993, 44: 271-276）。したがって、それらは病的な場合における診断に基本的に重要である。
【０００５】
今日までに報告されているダイマーはすべて、それらのネイティブな長さでの２つのインスリンの共有結合による架橋が関与している。インスリンダイマーは動物実験において比較的に肝臓選択性を示すことから、原理的に特に興味がもたれ（ネイティブなインスリン構造をもつＢ1,Ｂ1′−スベロイル−インスリンダイマーについて証明された。F. Shojaee-Moradie, N.C. Jackson, M. Boroujerdi, D. Brandenburg, P.H. Soenksen, R.H. Jones, Diabetologia 1995, 38: 1007-1013）、したがって現在糖尿病の治療に用いられているすべてのインスリンよりも血中のグルコースレベルの生理学的低下をもたらすことが可能になる。そこに用いられているＢ1,Ｂ1′−スベロイル−インスリンダイマーは、しかしながら、受容体への結合よりもインビトロでの生物活性はかなり低い（157〜199％と比較して28.8％。M.A. Tatnell, R.H. Jones, K.P. Willey, A. Schuettler, D. Brandenburg, Biochem. J. 1983, 216: 687-694）。したがって、受容体結合に対する生物活性の比はきわめて低く０.１５〜０.１８である。本発明者らの知る限りこれらの所見を糖尿病の治療に向けて適用またはさらに発展させたという事実はない。
【０００６】
【発明の開示】
本発明者らは今回、それらの性質により上述の問題の解決および糖尿病治療の改良に有望な、以下インスリン類縁体とも呼ぶ新規なインスリンダイマーを設計し合成した。この関連で、インスリンモノマーによる今日までの治療に比較して本発明者らのアプローチのユニークな特徴は、２つの同種または異種インスリンモノマーが架橋を介して互いに共有結合によって連結してなるインスリン類縁体およびそれらの生理学的に許容される塩が使用されることであり、この場合、インスリンモノマーはヒトインスリンおよび動物インスリンならびに上述のインスリン誘導体からなる群より選択され、インスリン類縁体の２つのインスリンモノマーの少なくとも１つは誘導体である点である。特にＢ鎖のＣ末端がＢ26位置で切断されたかまたは修飾されたインスリン類縁体が使用される。インスリンのモノマーはタンパク質を連結させるために適当な物質によって架橋することができる。タンパク質を連結するための物質および方法は、古くから知られている。特に、新規なインスリン類縁体は、好ましくは２つのインスリンモノマーのＢ鎖Ｎ−末端アミノ基の間に位置する架橋を有し、この場合、架橋は式 (ＣＲＲ′)n(ＣＯ−)2（式中、ｎ、Ｒ、Ｒ′は式Ｉについて以下に定義し記載する）の直鎖状または分岐鎖状の二官能性カルボン酸残基から形成させることが特に好ましい。動物インスリンの例はブタ、サル、ウシおよびニワトリインスリンである。インスリン誘導体は天然に存在するアミノ酸残基の少なくとも１個の置換および／または欠失および／または少なくとも１個のアミノ酸残基および／または有機残基の付加によって他の点では相当する天然に存在するインスリンと同一なインスリンと異なるインスリンである。インスリン誘導体モノマーの一例には、Ｇly(Ａ21)、Ａrg(Ｂ31)、Ａrg(Ｂ32）ヒトインスリンがあり、本発明のインスリンダイマー類縁体の一例にはＢ1,Ｂ1′−Ｓub−[Ｄ−ＡlaB26]−des−[Ｂ27−Ｂ30]−インスリン−Ｂ26−アミドインスリンダイマーがある。インスリン類縁体は特に一般式Ｉ：
【０００７】
【化２】
Ｘは、互いに独立して、分岐状または分岐のないＣ1〜Ｃ10−アルキル基、モノまたはポリ置換されたアリール基、Ｃ1〜Ｃ10−アルキル基、モノもしくはポリ置換または非置換Ｏ−アリール基、アミノ酸またはそれらの誘導体、または式ＮＲＲ′（式中、Ｒ、Ｒ′はＨ、ＮＨ2、分岐状または分岐のないＣ1〜Ｃ10−アルキル基、またはモノもしくはポリ置換または非置換アリール基である)であり、
ｎは０、１、２....１６である］
によって表すことができる。
【０００８】
本発明はさらに、Ｘはカルボン酸基がアミド化されているアミノ酸誘導体である上記式Ｉのインスリン類縁体に関する。
【０００９】
本発明はさらに、Ｘはカルボン酸基がアミド化されているアミノ酸サルコシンである上記式Ｉのインスリン類縁体に関する。
【００１０】
本発明はさらに、２つのＢ鎖中のＸ残基は互いに異種である上記式Ｉのインスリン類縁体に関する。
【００１１】
本発明はさらにＸはアミノ基である上記式Ｉのインスリン類縁体に関する。
本発明はさらに、このようなインスリン類縁体からなる医薬、糖尿病を治療するための医薬の製造方法、およびインスリン類縁体の調製方法に関する。
【００１２】
インスリン類縁体は２つの任意に部分的に保護されたモノマー分子を予め活性化されたジカルボン酸により架橋することによって既知の方法で製造される（A. Schuettler, D. Brandenburg, Hoppe Seyler's Z. Physiol. Chem. 1982, 363: 317-330）。モノマー類縁体は酵素触媒半合成または遺伝子操作方法によって得ることができる（本発明の実施例参照）。
【００１３】
したがって、本発明はさらに上に記載したようなインスリン類縁体を製造するにあたり、
(ａ) モノマーインスリン類縁体を酵素触媒半合成または遺伝子操作法によって得、
(ｂ) 工程(ａ)からのモノマーインスリン類縁体を場合によって保護基によって部分的に保護し、
(ｃ) 工程(ｂ)からの保護されたモノマーインスリン類縁体および／または工程（ａ）からのモノマーインスリン類縁体を予め活性化したジカルボン酸と反応させ、ついで
(ｄ) 工程(ｃ)で得られたインスリン類縁体を反応混合物から単離する
方法に関する。
【００１４】
ヒトインスリンおよびモノマーインスリン類縁体に比べて、本発明のダイマーはとくインビトロにおけるにインスリン受容体との高い親和性および著しい効力によって傑出していて、後者はインスリンの作用の２０倍にまで達する。
【００１５】
以前に開示された共有結合したインスリンダイマーに反して、新規なダイマーはきわめて高い生物活性を示す。受容体結合に対する生物活性の比は少なくとも２であり、場合により４または５さえ示す。したがって、それらは生物学的に、かなり有効であると考えられる。これらの比をＢ1,Ｂ1′−スベロイルダイマーについて文献に記載された値と比較すると、少なくとも１１（０.１８：２）および最大２８のファクターが明らかである。
【００１６】
本発明のインスリンダイマーによって達成される利点は特に、
１．現在治療的に使用されているインスリンおよびすべての類縁体に比較して比較的に肝臓選択性であり、したがって、より生理学的な作用様式が期待される（作用の一次部位は肝臓であり、末梢ではない）。
２．以前に初めて開示されたインスリンダイマーに比較して、かなり改良された生物学的効果がある。
３．インスリンおよびモノマー類縁体に比較してかなり増大した生物学的活性は、同等な効果が著しく少量の活性物質で達成されるので使用時にきわめて有利である。
【００１７】
【実施例】
略号：
ＡＡ アミノ酸
Ａc 酢酸基（ＣＨ3ＣＯＯ-）
Ａlox アルミニウムオキシド（Ａl2Ｏ3）
ＣＺＥ 毛細管ゾーンクロマトグラフィー
ＤＩＰＥＡ Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ ジメチルスルホキシド
ＤＯＩ デスオクタペプチドインスリン
Ｅq 当量
Ｆmoc ９−フルオレニルメトキシカルボニル
ＨＯＢt １−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＨＰＣＬ 高速液体クロマトグラフィー
ＭＡＬＤＩ マトリックス−補助レーザー脱着／イオン化
ＭＰＬＣ 中圧液体クロマトグラフィー
Ｍsc メチルスルホニルエトキシカルボニル
ＭＷ 分子量
ＮaＯＨ 水酸化ナトリウム
ＮＭＭ Ｎ−メチルモルホリン
ＲＰ 逆相
ＯＮＳu Ｎ−オキシスクシンイミドエステル
Ｓar サルコシン
Ｓub スベロイル
ＴＢＴＵ 2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチル ウロニウムテトラフルオロボレート
ＴＥＡ トリエチルアミン
ＴＦＡ トリフルオロ酢酸
ＴＯＦ フライト時間
ＴＰＣＫ トシル−Ｌ−フェニルアラニルクロロメチルケトン
Ｔris トリス−(ヒドロキシメチル)アミノメタン
【００１８】
実施例１
Ｂ1,Ｂ1′−Ｓub−[ＳarB26]−des−(Ｂ27−Ｂ30)−インスリン−Ｂ26−アミドインスリンダイマーの合成
Ｇ ly −Ｐ he −Ｐ he −Ｓ ar −ＮＨ 2 の合成
ペプチドは４−(２′,４′−ジメトキシフェニル−Ｆmoc−アミノメトキシ)フェノキシ樹脂上、Ｆmoc 保護基法を用いて合成した。カップリングに使用したＦmoc−アミノ酸エステルはＴＢＴＵ／ＨＯＢｔ法によって形成させ、樹脂の名目上の負荷に基づいて３モル過剰に使用した。ペプチドは以下の合成プロトコールに従って合成した。
【００１９】
【表１】
陽イオンのトラップとして９５％ＴＦＡ、４％Ｈ2Ｏおよび１％トリエチルアミンからなる除去溶液１０mlの添加による酸分解によって樹脂からペプチドを切断した。室温で２時間撹拌したのち、樹脂をろ過し、ジクロロメタンで完全に洗浄した。ペプチドをさらに精製するためには、ＲＰ−ＭＰＬＣカラムクロマトグラフィーを行い、直線２−プロパノール勾配（０.０７％ＴＦＡ開始緩衝液および供給緩衝液それぞれの４００ml中０〜４０％ ２−プロパノール）で溶出した。Nucleosil 20−Ｃ18を静止相として使用した。流速は１８０〜２００ml／時間とした（収率８２.６％）。
【００２１】
[ Ｓ ar B26 ] − des − ( Ｂ 27 −Ｂ 30) −インスリン−Ｂ 26 −アミドの合成
Ｂ鎖の頭部切断Ｃ末端（truncated C terminus）を有するインスリンはＮα A1−Ｍsc−des−(Ｂ23−Ｂ30)−インスリンにテトラペプチドを酵素的にカップリングさせて合成した。この目的には、ネイティブなインスリンを酵素的にまずＤＯＩに分解し、ついでこれに部分的に保護基を付すことが必要であった。
【００２２】
des − ( Ｂ 23 −Ｂ 30) −インスリンの合成
３００mg（５１.６６μmol）のインスリンを６０mlの反応緩衝液（０.０５Ｍ Ｔris、１mM ＣａＣｌ2）に取る。ｐＨを固体Ｔris によって９.５に調整し、１６mgのＴＰＣＫ処理トリプシンを添加してタンパク分解を開始する。インキュベーションは水浴中37℃で約６時間行い、反応はＲＰ−ＨＰＬＣでモニタリングする。反応を氷酢酸４mlの添加によって停止させ、反応混合物をロータリーエバポレーター中で濃縮する。最初は Sephadex G 25f ゲルろ過、ついで Sephadex G 50f ゲルろ過によって後処理を行う。生成物は凍結乾燥する（収率７３.３％）。
ＭＷ：４８６５
【００２３】
Ｎ α A1 − ( Ｍ sc) − des − ( Ｂ 23 −Ｂ 30) −インスリンの合成
３００mg（６１.６６μmol）の des−(Ｂ23−Ｂ30)−インスリンを２２５μlのＴＥＡを加えてＤＭＳＯ ２２.５ml中に溶解する。穏やかに撹拌しながらＤＭＳＯ ５ml中Ｍsc−ＯＮＳu １８mg（６７.８６μmol）溶液を加える。２０分の反応時間ののち、７５０μlの氷酢酸を加えて反応を停止させ、反応溶液を４℃で１６時間、脱イオンした水に対して透析する。透析液を凍結乾燥する。さらに精製するためには、SP−Sepharose（ｐＨ３；３５０ml開始緩衝液、３５０mlの０.０９Ｍ ＮａＣｌ供給緩衝液）上イオン交換クロマトグラフィーを行い、Sephadex G 25f 上脱塩を実施する。生成物は凍結乾燥する（収率３０.８％）。
ＭＷ：５０１５.１６
【００２４】
Ｇ ly −Ｐ he −Ｐ he −Ｓ ar −ＮＨ 2 のＮ α A1 − ( Ｍ sc) − des − ( Ｂ 23 −Ｂ 30) −インスリンへのトリプシンカップリング
１３２.７５mg（３００μmol）のＧly−Ｐhe−Ｐhe−Ｓar−ＮＨ2および１５０.４５mg（３０μmol）のＮα A1−(Ｍsc)−des−(Ｂ23−Ｂ30)−インスリンを２mlのＤＭＦ（Ａlox上で撹拌）、２mlの１,４−ブタンジオールおよび４００μｌの０.０５Ｍ Ｃａ(ＣＨ3ＣＯＯ)2溶液中に溶解または懸濁する。見かけのｐＨをＮＭＭによって６.７〜７.０に調整する。ついで０.０５Ｍ Ｃａ(ＣＨ3ＣＯＯ)2溶液１００μｌ中に溶解したＴＰＣＫ−処理トリプシン２３mgを反応混合物に加える。反応時間中に、反応の進行はＲＰ−ＨＰＬＣによって追跡し、ｐＨをチェックしてＮＭＭにより適宜再調整する。４.５時間後、ほぼ９０％の変換が達成される。３０％濃度の酢酸４.５mlにより反応を停止させる。酵素、ペプチドおよび他の低分子量物質を Sephadex G 50f ゲルクロマトグラフィーによって除去する。ついで未反応ペプチドをＲＰ−ＭＰＬＣにより回収する。インスリン誘導体の更なる精製は Nucleosil 100-10Ｃ8（２.０cm直径、２５.０cm長に５.０cmプレカラム付き）上ＲＰ−ＨＰＬＣによって行う（収率４８.６％）。
ＭＷ：５２９０.２
【００２５】
Ｂ 1, Ｂ 1 ′−Ｓ ub − [ Ｓ ar B26 ] − des − ( Ｂ 27 −Ｂ 30) −インスリン−Ｂ 26 −アミドインスリンダイマーの合成
１００mg（１８.９μmol）のＮα A1−(Ｍsc)−[ＳarB26]−des−(Ｂ27−Ｂ30)−インスリンＢ26−アミドを、５.５当量のＨＯＢｔとともに４００μｌのＤＭＳＯ、８.７μｌのＤＭＦおよび９.５μｌのＮＭＭに溶解する。３０分後、０.６当量のスベリン酸ビス−ＯＮＳｕエステルを固体の形で加え、８〜３０時間撹拌する。全反応混合物を１.５mlの１０％濃度の酢酸中に３００μｌの氷酢酸の添加とともに取り、Sephadex G 50f 上でクロマトグラフィーに付す。ダイマーの分画を凍結乾燥する。Ｍsc 基を除去するためには、Ｍsc−保護タンパク質を５mlのジオキサン／水混合物（2/1, v/v）に溶解し、０℃に冷却する。５１４μｌの２Ｎ ＮａＯＨを添加して、混合物を０℃で１２０秒間撹拌する。２.２mlの氷酢酸を加えて反応を停止させる。反応混合物をSephadex G 25f 上ゲルクロマトグラフィーに付し凍結乾燥する（収率１１.９％）。
中間体および最終生成物の特性解析は、ＲＰ−ＨＰＬＣ、酸性ＣＺＥならびにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルによって行った（表１）。
【００２６】
【表２】
実施例２
Ｂ1,Ｂ1′−Ｓub−[Ｄ−ＡlaB26]−des−(Ｂ27−Ｂ30)−インスリン−Ｂ26−アミドインスリンダイマーの合成
この頭部切断(truncated）インスリンダイマーの合成は、合成テトラペプチドＧly−Ｐhe−Ｐhe−Ｄ−Ａla−ＮＨ2を用いたほかは本発明の実施例１に記載した合成と同様にして行った。相当する収率、純度および分子量は表２に示す。
【００２８】
【表３】
実施例３
Ｂ1,Ｂ1′−Ｓub−[ＧluB26]−des−(Ｂ27−Ｂ30)−インスリン−Ｂ26−アミドインスリンダイマーの合成
この頭部切断インスリンダイマーの合成は、合成テトラペプチド Ｇly−Ｐhe−Ｐhe−Ｇlu−ＮＨ2を用いたほかは本発明の実施例１に記載した合成と同様にして行った。相当する収率、純度および分子量は表３に示す。
【００３０】
【表４】
実施例４
本発明の実施例１〜３についての本発明の生物学的性質
本発明の実施例１〜３に記載のＢ1,Ｂ1′−Ｓub−[Ｓar−Ｄ−ＡlaまたはＧluB26]−des−(Ｂ27−Ｂ30)−インスリン−Ｂ26−アミドインスリンダイマーの生物学的性質を、一方では受容体に基づいて、他方ではインビトロにおける生物活性に基づいて測定した。
【００３２】
受容体結合はＩＭ−９リンパ球に対する置換研究により測定した。相対的生物活性はグルコースの輸送の形態での培養３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞に対して測定した。表４には合成インスリンダイマーの結合親和性および相対的生物学的活性を示す。
【００３３】
【表５】
参考文献
１．J. Markussen, S. Havelund, P. Kurtzhals, A.A. Andersen, J. Halstrom, E. Hasselager, U.D. Larsen, U. Ribel, L. Schaeffer, K. Vad, I. Jonassen, Diabetologia 1996, 39, pp.281-288.
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３．S. Gammeltoft, Physiol Rev. 1984, 64, p.1321.
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５．M. Weiland, C. Brandenburg, D. Brandenburg, H.G. Joost, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990 87, pp.1154-1158.
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７．F. Shojaee-Moradie, N.C. Jackson, M. Boroujerdi, D. Brandenburg, P.H. Soenksen, R.H. Jones, Diabetologia 1995, 38, pp.1007-1013.
８．M.A. Tatnell, R.H. Jones, K.P. Willey, A. Schuettler, D. Brandenburg, Biochem. J. 1983, 216, pp.687-694.
Claims (13)
- 式Ｉ：
Ｘは、互いに独立して、分岐状または分岐のないＣ1〜Ｃ10−アルキル基、モノまたはポリ置換されたアリール基、Ｃ1〜Ｃ10−アルキル基、モノもしくはポリ置換または非置換Ｏ−アリール基、アミノ酸またはそれらの誘導体、または式ＮＲＲ′（式中、Ｒ、Ｒ′はＨ、ＮＨ2、分岐状または分岐のないＣ1〜Ｃ10−アルキル基、またはモノもしくはポリ置換または非置換アリール基である)であり、
ｎは０、１、２....１６である］
によって表されるインスリン類縁体。 - Ｘはカルボン酸基がアミド化されているアミノ酸である請求項１記載のインスリン類縁体。
- Ｘはアミノ酸のサルコシンである請求項２記載のインスリン類縁体。
- ２つのＢ鎖中のＸ残基は互いに異種である請求項１または２に記載のインスリン類縁体。
- Ｘはアミノ基である請求項１または２に記載のインスリン類縁体。
- Ｂ1,Ｂ1′−Ｓub−[ＳarB26]−des−(Ｂ27−Ｂ30)−インスリン−Ｂ26−アミドインスリンダイマー。
- Ｂ1,Ｂ1′−Ｓub−[Ｄ−ＡlaB26]−des−(Ｂ27−Ｂ30)−インスリン−Ｂ26−アミドインスリンダイマー。
- Ｂ1,Ｂ1′−Ｓub−[ＧluB26]−des−(Ｂ27−Ｂ30)−インスリン−Ｂ26−アミドインスリンダイマー。
- 請求項１〜８のいずれかに記載のインスリン類縁体ならびに亜鉛塩、フェノール、ｍ−クレゾール、グリセロールおよび緩衝物質からなる群より選択される添加物を含む医薬製剤。
- 請求項１〜８のいずれかに記載のインスリン類縁体を含む糖尿病治療の医薬を製造する方法。
- 医薬として使用するための請求項１〜８のいずれかに記載のインスリン類縁体。
- 請求項１〜８のいずれかに記載のインスリン類縁体１種または２種以上からなる診断用キット。
- (ａ) モノマーインスリン類縁体を酵素触媒半合成または遺伝子操作法によって得、
(ｂ) 工程(ａ)からのモノマーインスリン類縁体を保護基によって場合により部分的に保護し、
(ｃ) 工程(ｂ)からの保護されたモノマーインスリン類縁体および／または工程（ａ）からのモノマーインスリン類縁体を予め活性化したジカルボン酸と反応させ、ついで
(ｄ) 工程(ｃ)で得られたインスリン類縁体を反応混合物から単離する
ことからなる、請求項１〜８のいずれかに記載のインスリン類縁体を製造する方法。
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