ES2202899T3

ES2202899T3 - Agregados de derivados de la insulina humana.

Info

Publication number: ES2202899T3
Application number: ES98949960T
Authority: ES
Inventors: Svend Havelund; Per Balschmidt; Ib Jonassen; Thomas Hoeg-Jensen
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1997-10-24
Filing date: 1998-10-23
Publication date: 2004-04-01
Anticipated expiration: 2018-10-23
Also published as: HUP0004096A2; UA69393C2; HUP0004096A3; DK1025125T3; CN1281466A; PL195845B1; WO1999021888A1; KR100539193B1; KR20010031247A; AU9622198A; AU757933B2; PT1025125E; CN1240718C; NO20002050D0; BR9813128A; ATE243711T1; DE69815877T2; RU2218349C2; CA2308705A1; EP1025125B1

Abstract

Agregado hidrosoluble de un derivado de insulina en el que los residuos B24-B30 de la cadena B B es la secuencia Phe-X-X-X-X-X-X, donde cada X independientemente representa cualquier aminoácido o una eliminación, al menos una X es un residuo de lisina Ne-sustituido con ácido litocólico 5-alfa o ácido litocólico 5-beta a través de un enlace aglutamil, y-glutamil o a- o a-aspartil, en el que a) el agregado tiene un tamaño mayor que la aldolasa, determinado en un sistema de filtración en gel, y b) el agregado comprende al menos 2 iones de zinc, preferiblemente de 2 a 5 iones de zinc, preferiblemente mejor de 2 a 3 iones de zinc, por cada 6 moléculas de derivado de insulina.

Description

Agregados de derivados de la insulina humana.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a agregados hidrosolubles de efecto prolongado de derivados de la insulina humana, a derivados de la insulina humana capaces de generar tales agregados, a composiciones farmacéuticas que los contienen, y al uso de tales agregados en el tratamiento de la diabetes.

Antecedentes de la invención

Diabetes es el término general utilizado para definir los trastornos en las personas que sufren una excesiva excreción de orina, como en la diabetes mellitus y en la diabetes insípida. La diabetes mellitus es un trastorno metabólico en el que, en mayor o menor medida, se pierde la capacidad para utilizar la glucosa. Aproximadamente un 2% de la población padece diabetes.

Desde la introducción de la insulina en los años veinte, se han hecho continuos progresos para mejorar el tratamiento de la diabetes mellitus. Con el fin de ayudar a evitar niveles de glicemia extremos, los pacientes diabéticos siguen a menudo un tratamiento con múltiples inyecciones, a través de las cuales se administra la insulina en cada comida. Muchos pacientes diabéticos son tratados con múltiples inyecciones de insulina diarias mediante un sistema que consiste en una o dos inyecciones diarias de una insulina de efecto prolongado para cubrir el requisito basal, complementado por inyecciones en bolo de una insulina de acción rápida para cubrir los requisitos relacionados con la comida.

Las composiciones de insulina de efecto prolongado se conocen bien en la técnica. Así, un importante tipo de composiciones de insulina de efecto prolongado comprende suspensiones acuosas inyectables de cristales de insulina o insulina amorfa. En estas composiciones, los compuestos de insulina utilizados normalmente son la insulina protamina, la insulina zinc o la insulina protamina zinc.

Cuando se utiliza la insulina humana o animal para crear formas asociadas más altas, p. ej. en presencia de iones de Zn^{2+}, el resultado es la precipitación en forma de cristales o en un producto amorfo (Brange, Galenics of Insulin, págs. 20-27, Springer Verlag 1987). Así, con un pH 7 y usando 6 Zn^{2+}/hexámero de insulina porcina, el resultado es una precipitación casi completa de la solución (Grant, Biochem J. 126, 433-440, 1972). El agregado soluble más alto que se ha propuesto está compuesto de 4 unidades hexaméricas, correspondientes a un peso molecular de aproximadamente 144 kDa. Blundell et al. (Diabetes 21 (Suppl. 2), 492-505, 1972) describen la unidad soluble de insulina porcina en presencia de Zn^{2+} con un pH 7 como un hexámero. Los primeros estudios de ultracentrifugación con un pH 2 mostraron que el dímero de insulina, de peso molecular (pm) 12 kDa, era la especie preponderante (Jeffrey, Nature 197, 1104-1105, 1963; Jeffrey, Biochemistry 5, 489-498, 1966; Jeffrey, Biochemistry 5, 3820-3824, 1966). Fredericq, trabajando con un pH 8 y usando un 0.4-0.8% (p/p) de Zn^{2+} en relación a la insulina, estableció un peso molecular de 72 kDa, correspondiente a una estructura dodecamérica y, usando un 1% de Zn^{2+}, pesos moleculares de aproximadamente 200-300 kDa (Arch. Biochem Biophys. 65, 218-228, 1956). Un estudio de revisión exhaustivo de los estados de asociación de la insulina animal se encuentra en Blundell et al. (Adv. Protein Chem. 26, 297-330, 1972).

Algunos inconvenientes están relacionados con el uso de suspensiones de insulina. En estos casos, con el objetivo de asegurar una dosis exacta, las partículas de insulina deben ser suspendidas de forma homogénea por agitación suave antes de que un volumen definido de la suspensión sea vertido de un frasco o expelido de un cartucho. Así mismo, para el almacenamiento de las suspensiones de insulina, la temperatura debe mantenerse dentro de unos límites más estrechos que para las soluciones de insulina, con el objetivo de evitar la formación de grumos o coagulación.

Aunque anteriormente se creía que las protaminas eran no inmunogénicas, ahora se ha visto que las protaminas pueden ser inmunogénicas en el hombre y que su uso para fines médicos puede llevar a la formación de anticuerpos (Samuel et al., Studies on the immunogenicity of protamines in humans and experimental animals by means of a micro-complement fixation test, Clin. Exp. Immunol. 33, págs. 252-260 (1978)).

También se han encontrado pruebas de que el complejo protamina - insulina es en sí mismo inmunogénico (Kurtz et al., Circulating IgG antibody to protamine in patients treated with protamine-insulins. Diabetologica 25, págs. 322-324 (1983)). En consecuencia, con algunos pacientes deberá evitarse el uso de composiciones de insulina de efecto prolongado que contengan protaminas.

Otro tipo de composiciones de insulina de efecto prolongado son las soluciones que tienen un valor de pH inferior al pH fisiológico a partir del cual se precipitará la insulina debido al aumento en el valor del pH al ser inyectada la solución. Un inconveniente es que las partículas sólidas de la insulina actúan como un irritante local provocando inflamación del tejido en el sitio de la inyección.

En el documento WO 91/12817 (Novo Nordisk NS) se exponen composiciones de insulina soluble de efecto prolongado que comprenden complejos de insulina de cobalto (III). La dilación de estos complejos es sólo intermedia y su biodisponibilidad es reducida.

Se han descrito derivados de insulina solubles que contienen sustituyentes lipofílicos ligados al grupo \varepsilon-amino de un residuo de lisina en cualquiera de las posiciones B26 a B30 p. ej. en WO 95/07931 (Novo Nordisk NS), WO 96/00107 (Novo Nordisk NS) y WO 97/31022 (Novo Nordisk NS). Tales derivados tienen una acción prolongada tras la inyección subcutánea en comparación con la insulina humana soluble, y esta acción prolongada ha sido explicada por un enlace reversible a la albúmina en el subcutis, la sangre y el tejido periférico (Markussen, Diabetologia 39, 281-288, 1996; Kurzhals, Biochem J. 312, 725-731, 1995; Kurzhals, J. Pharm Sciences 85, 304-308, 1996; y Whittingham, Biochemistry 36, 2826-2831, 1997).

No obstante, ahora hemos descubierto un nuevo mecanismo que prolonga la acción de algunos derivados de insulina solubles. El nuevo mecanismo se basa en la formación parcial o total de formas agregadas solubles de los derivados, siendo caracterizado por un tamaño más grande que la aldolasa (pm = 158 kDa) en un sistema de filtración en gel definido.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Curva de calibración de los valores K_{AV} versus peso molecular en el sistema de filtración en gel usando una columna de Sephacryl® S-300 HR en un eluyente neutro acuoso que consta de cloruro sódico 125 mM y fosfato sódico 20 mM con un pH 7.4. Se aprecia una relación casi lineal entre K_{AV} y el logaritmo del peso molecular. Los estándares se muestran en la Tabla 1.

Figura 2. Filtración en gel de insulina humana Lys^{B29}(N^{\varepsilon} \omega-carboxiheptadecanoil) des(B30) que tiene 0, 2 y 3 Zn^{2+}/hexámero, respectivamente, usando una columna de Sephacryl® S-300 HR en un eluyente neutro acuoso que consta de cloruro sódico 125 mM y fosfato sódico 20 mM con un pH 7.4, lo que demuestra la importancia del Zn^{2+} para la formación de agregados para este derivado. Se eluye una columna de 28 x 1 cm a un ritmo de 15 ml/h. Se inyectaron derivados de insulina (200\mul) en una preparación estándar que comprende 600 \muM del derivado, 0, 2 ó 3 Zn^{2+}/6 moléculas de insulina, NaCl 20 mM, fenol 16 mM, m-cresol 16 mM, fosfato sódico 7 mM con un pH 7.5.

Figura 3. Filtración en gel de insulina humana Lys^{B29}(N\varepsilon \omega-carboxiheptadecanoil) des(B30) con 3 Zn^{2+}/hexámero usando una columna de Sephacryl ® S-300 HR en un eluyente neutro acuoso que comprende un tampón de fosfato de sodio 5 mM, pH 7.5, cloruro sódico 10 mM, fenol 16 mM, m-cresol 16 mM y glicerol al 1.6% (p/v). Una comparación con la Figura 2 aclara la importancia de la concentración de cloruro sódico para la formación de agregados de este derivado.

Fig.4. Esquema de la síntesis de los ligandos conjugados.

Descripción de la invención

La expresión "derivado de insulina", tal y como se utiliza aquí, (y otras expresiones relacionadas) se refiere a la insulina humana o a un derivado análogo de la misma, en el que al menos un sustituyente orgánico está ligado a uno o a más de los aminoácidos.

Por "análogo de la insulina humana", tal y como se utiliza aquí, (y expresiones relacionadas) se entiende la insulina humana en la que uno o más aminoácidos han sido eliminados y/o sustituidos por otros aminoácidos, incluyendo aminoácidos no codificables, o bien la insulina humana que comprende aminoácidos adicionales, es decir, más de 51 aminoácidos.

La presente invención está basada en el descubrimiento de una nueva forma agregada y soluble de derivados de insulina. La nueva forma agregada y soluble de derivados de insulina se disocia lentamente tras la inyección subcutánea, haciéndolos adecuados para una preparación de insulina de larga duración, con la ventaja de que la preparación no contiene ningún precipitado.

Las ventajas de las preparaciones solubles frente a las suspensiones son una mayor precisión en la dosis, se evita la agitación del frasco o bolígrafo, permiten una aguja más fina, lo que se traduce en menos dolor durante la inyección, se rellenan más fácilmente los frascos o cartuchos y se evita la utilización de una bola en el cartucho usada para suspender el precipitado en caso de ausencia de aire.

Más específicamente, la presente invención se refiere a un agregado hidrosoluble de derivados de insulina de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por tener un tamaño más grande que la aldolasa, preferiblemente más grande que la ferritina, corno se determina por un sistema de filtración en gel según se ha especificado aquí.

El agregado según la invención tiene preferiblemente un volumen aparente correspondiente a un valor K_{AV} inferior a 0.32, preferiblemente inferior a 0.20, como se determina por la filtración en gel usando un gel Sephacryl® S-300 HR, o un valor K_{AV} inferior a 0.50, preferiblemente inferior a 0.40, como se determina por la filtración en gel usando un gel Superose® 6HR.

El agregado es soluble preferiblemente con un pH en la gama de 6.8 a 8.5.

\newpage

La nueva forma agregada se puede observar para derivados de insulina bajo condiciones en las que se sabe que la unidad hexamérica existe para la mayoría de las insulinas. Así, en una forma de realización preferida, la forma agragada está compuesta de subunidades hexaméricas, preferiblemente al menos 4, más preferiblemente de 5 a 50, e incluso más preferiblemente de 5 a 200 subunidades hexaméricas. Cualquier subunidad hexamérica de las formas agregadas de esta invención puede tener cualquiera de las estructuras conocidas R_{6}, R_{3} T_{3}, o T_{6} (Kaarsholm, Biochemistry 28, 4427-4435, 1989).

Se ha descubierto que las sustancias como el Zn^{2+} y los compuestos fenólicos conocidos por estabilizar la unidad hexamérica, también sirven para estabilizar la nueva forma agregada de algunos derivados de insulina. Las unidades estructurales que forman los agregados pueden ser las unidades hexaméricas conocidas por la estructura de la insulina determinada por cristalografía de rayos X (Blundell, Diabetes 21 (Suppl. 2), 492-505, 1972). Los iones como Zn^{2+}, conocidos por estabilizar la unidad hexamérica en forma de complejos de 2 ó 4 Zn^{2+}/hexámero (Blundell, Diabetes 21 (Suppl. 2), 492-505, 1972), son esenciales para la formación de agregados de algunos derivados, como para la insulina humana Lys^{B29}(N\varepsilon \omega -carboxiheptadecanoil) des(B30).

La Figura 2 muestra la filtración en gel de la insulina humana Lys^{B29}(N\varepsilon \omega-carboxiheptadecanoil) des(B30) en el sistema descrito aquí de preparaciones que contienen 0, 2, y 3 Zn^{2+}/hexámero, respectivamente. En ausencia de Zn^{2+} los agregados no se forman; la posición de elución indica la presencia de un monómero o un dímero. Así, el agregado según la invención preferiblemente consta de al menos 2 iones de zinc, más preferiblemente de 2 a 5 iones de zinc, e incluso más preferiblemente de 2 a 3 iones de zinc por 6 moléculas del derivado de insulina. Además, el agregado consta ventajosamente de al menos 3 moléculas de un compuesto fenólico por cada 6 moléculas de derivado de insulina. En la cavidad central de la estructura de 2 Zn^{2+}/hexámero, 6 residuos de Glu^{B13} proporcionan los sitios de enlace para hasta 3 iones de Ca^{2+} (Sudmeier et al., Science 212, 560-562, 1981). De esta manera, la adición de iones de Ca^{2+} estabiliza el hexámero y pueden ser añadidos a las formulaciones farmacéuticas, siempre que el derivado de insulina permanezca en solución.

El tiempo de eliminación de la mitad del agregado de la invención tras la inyección subcutánea en los seres humanos dura preferiblemente tanto o incluso más que la de una preparación de insulina humana NPH.

En una forma de realización particularmente preferida de la presente invención, el agregado está compuesto de derivados de insulina que tienen un enlace de albúmina inferior al de la insulina humana Lys^{B29}(N\varepsilon tetradecanoil) des(B30).

Las estructuras primarias de los derivados de insulina que se emplean en la presente invención son aquellas en las que:

- los residuos B24-B30 de la cadena B del derivado de insulina es la secuencia Phe-X-X-X-X-X-X, dónde cada X independientemente representa cualquier aminoácido codificable o una eliminación;

siempre que el derivado de insulina exhiba una potencia de al menos un 5%, p. ej. como se evalúa por el ensayo de la célula grasa libre o por afinidad con el receptor de la insulina.

El sustituyente lipofilico en el residuo de lisina del derivado de insulina del agregado según la invención es ácido litocólico 5-\alpha o ácido litocólico 5-\beta.

El sustituyente lipofílico está ventajosamente ligado a un residuo de lisina por medio de un enlace \gamma- o \alpha-glutamil, o por medio de un enlace \beta- o \alpha-aspartil.

La presente invención proporciona además nuevos derivados de insulina capaces de formar agregados. Estos derivados de insulina pueden proporcionarse en forma de agregados en preparaciones farmacéuticas o, de forma alternativa, pueden proporcionarse en formas no agregadas en preparaciones farmacéuticas, en cuyo caso los agregados se forman después de la inyección subcutánea de dichas preparaciones.

En consecuencia, la presente invención se refiere también a preparaciones farmacéuticas que comprenden un agregado de derivados de insulina o derivados de insulina no agregados, los cuales forman los agregados después de la inyección subcutánea.

Preferiblemente según la presente invención, la preparación farmacéutica comprende agregados, una fracción sustancial de los cuales (preferiblemente más del 75%) tiene un tamaño más grande que la aldolasa, como se determina por la filtración en gel usando el medio de la preparación como eluyente.

En otra forma de realización, se proporciona una preparación farmacéutica que consta de análogos de insulina tanto agregada como de acción rápida, éstos últimos siendo preferiblemente de insulina humana o uno de los análogos de la insulina, insulina humana Asp^{B28}, insulina humana Lys^{B28}Pro^{B29} o insulina humana des(B30). Dicha preparación proporcionará un inicio rápido de la acción, así como un perfil de larga duración.

En esta forma de realización, la preparación farmacéutica comprende preferiblemente insulina agregada e insulina de acción rápida en una proporción molar de 90:10 a 10:90.

La lenta disociación de las formas agregadas puede verse ralentizada adicionalmente in vivo por la adición de agentes fisiológicos aceptables que aumentan la viscosidad de la preparación farmacéutica.

De esta manera, la preparación farmacéutica según la invención puede comprender además un agente que aumenta la viscosidad, preferiblemente polietilenoglicol, polipropilenoglicol, copolimeros derivados, dextranos y/o
polilactidos.

La preparación farmacéutica comprende además, preferiblemente, una sustancia de tampón, como un tampón TRIS, fosfato, glicina o glicilglicina (u otra sustancia de ion bipolar), un agente isotonizante, como NaCl, glicerol, manitol y/o lactosa, y fenol y/o m-cresol como conservantes. Entre las sustancias auxiliares de una preparación farmacéutica, el cloruro sódico, usado como agente isotónico, y el fenol, usado para la conservación, son particularmente importantes para promover la agregación en la preparación y de ese modo prolongar efectivamente el tiempo de eliminación del lugar de la inyección. La preparación farmacéutica según la invención consta preferiblemente de iones Na^{+} en una concentración de 10 a 150 mM.

La preparación farmacéutica más preferida es una preparación que contiene 0.1-2 mM de un derivado de insulina según la presente invención, 0.3-0.9% de Zn (p/p en relación al derivado de insulina), y compuestos fenólicos como fenol o m-cresol o mezclas de los mismos en una concentración total de 5-50 mM, e iones Na^{+} en una concentración de 10 mM a 150 mM.

La presente invención se refiere además a un método de tratamiento de la diabetes mellitus que consiste en la administración, a una persona que necesite dicho tratamiento, de una cantidad eficaz de agregados hidrosolubles de derivados de la insulina según la invención, o de una cantidad eficaz de un derivado de la insulina según la invención capaz de formar agregados hidrosolubles en el momento de la inyección subcutánea.

Los derivados de insulina de la invención pueden prepararse mediante los métodos generales descritos en los documentos WO 95/07931 (Novo Nordisk A/S), WO 96/00107 (Novo Nordisk A/S), WO 97/31022 (Novo Nordisk A/S), la solicitud PCT N° DK97/00296 (Novo Nordisk A/S), la EP 511 600 (Kurakay Co. Ltd.) y la EP 712 862 (Eli Lilly). Los derivados enumerados en la Tabla 2 han sido preparados por acilación selectiva del grupo \varepsilon-amino de la insulina humana Lys^{B29} des(B30) por los ligandos activados en la forma de los respectivos ésteres de N-hidroxisuccinimida. Los ligandos conjugados pueden ser preparados usando la química convencional de los péptidos (figura 4).

Algunos de los derivados enumerados en las solicitudes de las patentes anteriormente mencionadas y que, en las publicaciones de Markussen, Diabetologia 39, 281-288, 1996; Kurzhals, Biochem J. 312, 725-731, 1995; Kurzhals, J. Pharm Sciences 85, 304-308, 1996; y Whittingham, Biochemistry 36, 2826-2831, 1997, se describen como de efecto prolongado debido a su mecanismo de enlace a la albúmina, también poseen la capacidad para formar agregados de alto peso molecular según la presente invención. La insulina humana Lis^{B29}(N\varepsilon litocolil-\gamma-Glu) des(B30) de WO 95/07931 y la insulina humana Lys^{B29}(N\varepsilon \omega-carboxiheptadecanoyl) des(B30) de WO 97/31022 son ejemplos de derivados de insulina capaces de formar agregados de alto peso molecular con un pH neutro. Hay selectividad entre los sustituyentes lipofílicos en cuanto a su capacidad para inducir la formación de agregados. Así, de los dos isómeros, la insulina humana Lys^{B29}(N\varepsilon litocolil-\gamma-Glu-) des(B30) y la insulina humana Lys^{B29}(N\varepsilon litocolil-\gamma-Glu-) des(B30), sólo el primero forma agregados en la formulación usada, ver Tabla 1.

Determinación de la formación de agregados

La forma agregada se demuestra por filtración en gel usando un gel con un limite de exclusión de 1,500 kDa para las proteínas globulares y 400 kDa para los dextranos lineales. Se usa un sistema de tampón acuoso con pH neutro para la filtración en gel y los derivados de insulina en estado agregado se aplican a la columna en la forma de una preparación farmacéutica en una concentración de 600 nmol de insulina/ml. Los estados agregados de los derivados de insulina se eluyen antes que la aldolasa, cuyo peso molecular es de 158 kDa.

El experimento de la filtración en gel, usando las condiciones establecidas en esta sección, es el método físico-químico directo para revelar la propiedad de formación potencial de un agregado de un derivado de insulina.

La eliminación tras la inyección subcutánea en cerdos refleja la combinación de las propiedades de enlace de la albúmina y de formación del polímero del derivado de insulina, además de una variedad de factores biológicos.

La formación de agregados solubles de alto peso molecular se demuestra por la filtración en gel usando una columna Sephacryl ® S-300 HR en un eluyente acuoso neutro que comprende cloruro sódico 125 mM y fosfato de sodio 20 mM con un pH 7.4. Este sistema de tampón fue elegido para imitar la resistencia iónica y el pH del tejido, con el objetivo de poder detectar derivados agregados bajo condiciones similares a las que se producen después de la inyección subcutánea. Obviamente, en otros sistemas de tampón con una concentración inferior de cloruro sódico o un valor de pH inferior o más alto, los derivados pueden no aparecer en estado agregado. No obstante, a la hora de evaluar el estado real de agregación en una preparación farmacéutica, se usa el medio de la preparación, salvo el Zn^{2+} que está ligado a la insulina, como el eluyente para la filtración en gel.

\newpage

Se eluye una columna de 28 x 1 cm a un ritmo de 15 ml/h. Los derivados de insulina fueron inyectados (200\mul) como una formulación estándar que comprendía 600 \muM de derivado, 200 o 300 \muM de Zn^{2+}, NaCl 20 mM (o variado), fenol 16 mM, m-cresol 16 mM, fosfato de sodio 7 mM, con un pH 7.5.

El limite de exclusión del Sephacryl ® S-300 HR está establecido por el fabricante, Pharmacia, como un peso molecular de 1,500 kDa para las proteínas globulares y 400 kDa para los dextranos lineales. En la práctica la elución de solutos de diferentes tamaños se caracteriza por el volumen disponible como valores K_{AV}:

K_{AV}=(V_{E}-V_{0})/(V_{T}-V_{0})

dónde V_{E} es el volumen de elución, V_{0} es el volumen vacío, p. ej. el volumen de elución del dextrano azul, V_{T} es el volumen total. Por lo tanto, el valor K_{AV} es independiente de las dimensiones de la columna. En este sistema, la aldolasa (pm = 158 kDa) se eluye hasta aproximadamente un valor K_{AV} de 0.32, la albúmina (pm = 67 kDa) hasta aproximadamente un K_{AV} de 0.38, y la forma monomérica de la insulina (pm = 6 kDa) a un valor K_{AV} de aproximadamente 0.71. La calibración de la columna usando una serie de estándares del peso molecular muestra una relación casi lineal entre K_{AV} y el logaritmo del peso molecular, ver Figura 1.

TABLA 1

Valores K_{AV}, constantes de enlace de la albúmina y tiempo de eliminación de la mitad de los derivados asociados de la insulina mayores que la aldolasa (pm 158 kDa), derivados de insulina no asociados más pequeños que la aldolasa y estándares usados como marcadores del tamaño molecular. Las constantes de enlace de albúmina y el tiempo de eliminación de los derivados en cerdos han sido normalizados usando la insulina humana Lys^{B29}(N\varepsilon tetradecanoil) des(B30) como compuesto de referencia. La eliminación T_{50%} para la insulina NPH en cerdos ha sido determinada en 10.5 h (Markussen et al. 1996).

Compuestos	K_{AV}	Enlace de la	Eliminación
		albúmina K_{ass}	T_{50%}, h
		(mol/l)^{-1}
Derivados asociados de la insulina
humana que forman agregados
mayores que la aldolasa**
Lys^{B29}(N\varepsilon litocolil-\gamma-Glu-)des(B30)	0.04*	0.3x10^{5}	22.8
Lys^{B29}(N\varepsilon \omega-carboxiheptadecanoil)	0.05	25x10^{5}	18.7
des(B30)
Lys^{B29}(N\varepsilon \omega-carboxinonadecanoil)	0.04	36x10^{5}	21.9
des(B30)
Lys^{B29}(N\varepsilon colesteriloxicarbonil)	0.00
Derivados no asociados de la insulina
humana que forman agregados más
pequeños que la aldolasa.**
Insulina humana***	0.61	0	(2)
Insulina humana (sin zinc)	0.72
Lys^{B29}(N\varepsilon litocolil) (sin zinc)	0.74
Lys^{B29} (N\varepsilon decanoil) ***	0.67	0.06x10^{5}	5.1
Lys^{B29}(N\varepsilon tetradecanoil) des(B30)	0.51	1.0x10^{5}	14.3
Lys^{B29}(N\varepsilon litocolil-\gamma-Glu-) des(B30)	0.53	0.3x10^{5}	11.8
Estándares****

TABLA 1 (continuación)

Compuestos	K_{AV}	Enlace de la	Eliminación
		albúmina K_{ass}	T_{50%}, h
		(mol/l)^{-1}
Insulina humana B9Asp, B27Glu	0.71	0	(1)
(monomérica, pm 6 kDa)
Ribonucleasa (pm 13.7 kDa)	0.63
Albúmina (pm 67 kDa)	0.38
Aldolasa (pm 158 kDa)	0.32
Catalasa (pm 232 kDa)	0.30
Ferritina (pm 440 kDa)	0.19
Tiroglobulina (pm 669 kDa)	0.08
* El 75% de los derivados se eluyeron en el valor máximo, y el 25% en la posición del
monómero o el dimero.
** Se aplicó una muestra de 200 \mul como una preparación farmacéutica que comprende 600\muM de derivado,
200 \muM de Zn^{2+}, cloruro sódico 0-20 mM, fosfato de sodio 7 mM,fenol 16 mM, m-cresol 16 mM, glicerol
al 16% y con un pH 7.5.
* Igual que pero con 300 \muM de Zn^{2+}.
**** Estándares aplicados disueltos en agua.

Los ejemplos de derivados de insulina capaces de formar agregados solubles de elevado peso molecular y que tienen una acción prolongada basada principalmente en esta propiedad son la insulina humana Lys^{B29}(N\varepsilon litocolil-\gamma-Glu-) des(B30), ver Tabla 1. Cabe destacar que la proporción entre el tiempo de eliminación de la mitad de los derivados y la constante de enlace de la albúmina es alta para esta clase de compuestos. Los ejemplos de derivados de insulina que no son capaces de formar agregados solubles de elevado peso molecular pero que tienen una acción prolongada basada en la propiedad de enlace de la albúmina son la insulina humana Lys^{B29}(N\varepsilon litocolil-\gamma-Glu-) des(B30) y la insulina humana Lys^{B29}(N\varepsilon-tetradecanoil-) des(B30), ver Tabla 1. Cabe destacar que la proporción entre el tiempo de eliminación de la mitad de los derivados y la constante de enlace de la albúmina es baja para esta clase de compuestos.

En WO 97/31022 se ha formulado una preparación farmacéutica de insulina humana Lys^{B29}(N\varepsilon-\omega-carboxiheptadecanoil) des(B30) que comprende 600 nmol/ml de derivado, tampón de fosfato sódico 5 mM, pH 7.5, cloruro sódico 10 mM, fenol 16 mM, m-cresol 16 mM, 2-3 Zn^{2+}/hexámero y glicerol al 1.6% (p/v). Con el objetivo de establecer el grado de agregación en esta formulación se realizó una filtración en gel usando la misma columna que la descrita anteriormente, pero usando el medio de la preparación como eluyente. El Zn^{2+} está en su mayor parte ligado a la insulina y en consecuencia no es considerado como un constituyente del medio. Puesto que el eluyente contiene sustancias fenólicas, la concentración del derivado en las fracciones se controló por HPLC, ver Figura 3. El valor K_{AV} de aproximadamente 0.45 indica que las unidades hexaméricas o dodecaméricas son las especies preponderantes en la preparación, es decir, que en esta formulación publicada no se presentó ningún agregado de elevado peso molecular de los derivados de insulina.

Se desarrolló un método alternativo para determinar la capacidad de los derivados de insulina para formar agregados solubles de elevado peso molecular, adecuado para el equipo de la HPLC. Las dimensiones de la columna, el volumen de inyección y la velocidad de flujo corresponden al primer método, mientras que la temperatura aumenta a 37°C y el tampón de fosfato cambia a hidrocloruro trishidroximetilaminometano y a cloruro sódico adicional. El estado agregado de la insulina es definido para eluirse antes que la aldolasa estándar en la filtración en gel, al igual que en el primer método.

Los valores K_{AV} se muestran para dos niveles de zinc en la tabla 2. Comparado con la referencia, la insulina Lys^{B29}(N\varepsilon tetradecanoil) des(B30), el largo tiempo de eliminación de un depósito subcutáneo está correlacionado con una tendencia del derivado de la insulina a formar grandes agregados.

TABLA 2 Formación de agregados de derivados de insulina medidos por el método 2 de filtración en gel.

Compuestos	K_{AV} (Superose	Enlace de la	Elimina-
	6HR)^{2)}	albúmina	ción en
			cerdos^{1)},
	2Zn^{2+}/	3Zn^{2+}/	K_{ass},(10^{5}M^{-1})	T_{50%},(h)
	6 ins	6 ins
IH Lys^{B29}(N\varepsilon -litocoloil-\gamma-Glu) des(B30)	0.00	-0.01	0.33	22.8
IH Lys^{B29}(N\varepsilon-deoxicoloil-\gamma-Glu) des(B30)	0.20	0.07	0.03	13.9
IH Lys^{B29}(N\varepsilon-litocoloil-\gamma-amido-(-Glu)	-0.02	0.00	0.23	>34
des(B30)
IH Lys^{B29}(N\varepsilon-litocoloil-\beta-Asp) des(B30)	0.18	0.11	n.d.	n.d.
IH Lys^{B29}(N\varepsilon-litocoloil-\beta-Ala) des(B30)	0.00	0.13	n.d.	n.d.
IH Lys^{B29}(N\varepsilon-litocoloil-\gamma-aminobutanoil)	0.06	0.00	n.d.	n.d.
des(B30)
IH Lys^{B29} (N\varepsilon -litocoloil) des(B30)	-0.01	0.23	0.38	>34
IH Lys^{B29} (N\varepsilon-dehidrolitocoloil) des(B30)	0.05	0.03	0.26	>34
IH Lys^{B29}(N\varepsilon-colanoil) des(B30)	0.40	0.17	0.48	20.1
IH Lys^{B29}(N\varepsilon-hexadecanoil-\alpha-amido-\gamma-Glu)	0.38	0.41	0.56	15.3
des(B30)
IH AspA21 Lys^{B29}(Ne-tetra-decanoil)	0.55	0.46	0.97	16.4
des(B30)
IH Lys^{B29}(N\varepsilon-tetradecanoil-) des(B30)	0.58	0.56	1.00	14.3
Insulina humana, (IH)	0.64	0.64	-	2
Estándares
IH Asp^{B9} Glub^{B27} (monomérica, pm 6 kDa)	0.73
Ribonucleasa (pm 13.7 kDa)	0.72
Ovalbúmina (pm 43 kDa)	0.58
Aldolasa (pm 158 kDa)	0.50
Ferritina (pm 440 kDa)	0.40
Tiroglobulina (pm 669 kDa)	0.28
1) Normalizado para la insulina humana Lys^{B29}(N(tetradecanoil) des(B30) (T_{50%} = 14.3 h)
2) Superose 6 HR 10/30 (Pharmacia Biotech) eluida a 37°C por cloruro sódico 140 mM, trishidroximetil-
aminometano 10 mM, azida de sodio 0.02%, y ácido clorhídrico añadido con un pH 7.4. Un tiempo de
duración de 90 minutos (0.25 mI/min) seguido de un período de lavado de 150 minutos(0.5 ml/min).
El volumen de inyección fue de 200 \mul.

Claims

1. Agregado hidrosoluble de un derivado de insulina en el que los residuos B24-B30 de la cadena B es la secuencia Phe-X-X-X-X-X-X, donde cada X independientemente representa cualquier aminoácido o una eliminación, al menos una X es un residuo de lisina N\varepsilon-sustituido con ácido litocólico 5-\alpha o ácido litocólico 5-\beta a través de un enlace \alpha-glutamil, \gamma-glutamil o \beta- o \alpha-aspartil, en el que a) el agregado tiene un tamaño mayor que la aldolasa, determinado en un sistema de filtración en gel, y b) el agregado comprende al menos 2 iones de zinc, preferiblemente de 2 a 5 iones de zinc, preferiblemente mejor de 2 a 3 iones de zinc, por cada 6 moléculas de derivado de insulina.

2. Agregado hidrosoluble según la reivindicación 1, donde dicho agregado tiene un tamaño más grande que la ferritina, determinado en un sistema de filtración en gel.

3. Agregado hidrosoluble según la reivindicación 1 o 2, donde dicho agregado tiene un volumen aparente correspondiente a un valor K_{AV} inferior a 0.32, determinado mediante filtración en gel usando un gel Sephacryl®
S-300 HR.

4. Agregado hidrosoluble según la reivindicación 3, donde dicho agregado tiene un volumen aparente correspondiente a un valor K_{AV} inferior a 0.20, determinado mediante filtración en gel usando un gel Sephacryl® S-300 HR.

5. Agregado hidrosoluble según la reivindicación 1 o 2, donde dicho agregado tiene un volumen aparente correspondiente a un valor K_{AV} inferior a 0.50, determinado mediante filtración en gel usando un gel Superosa® 6HR.

6. Agregado hidrosoluble según la reivindicación 5, donde dicho agregado tiene un volumen aparente correspondiente a un valor K_{AV} inferior a 0.40, determinado mediante filtración en gel usando un gel Superosa® 6HR.

7. Agregado hidrosoluble según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde dicho agregado es soluble con un pH en la gama entre 6.8 y 8.5.