JP2003535106A - グルコース検知性インスリン誘導体からの、インスリンのグルコース依存性放出 - Google Patents

グルコース検知性インスリン誘導体からの、インスリンのグルコース依存性放出

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、周囲の媒質（例えば組織）中のグルコース濃度の関数としてデポーからインスリンを放出できる、組込まれたグルコースセンサを有するインスリン誘導体に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の分野】
本発明は、周囲媒質（例えば組織）中のグルコース濃度の関数としてデポー剤
からインスリンを放出できる、組込まれたグルコースセンサを有するインスリン
誘導体に関する。
【０００２】 本発明の一態様において、組込まれたグルコースセンサを有するインスリン誘
導体は、該誘導体の遅延作用性かつ水溶性の凝集体中に取り込まれ、その中では
凝集する傾向が減少することにより、周囲の媒質（例えば組織）中のグルコース
濃度が増大するに伴ってインスリンの吸収速度が増大する。
【０００３】 本発明のもう一つの態様では、組込まれたグルコースセンサを有するインスリ
ン誘導体の結晶性組成物が提供される。周囲媒質（例えば組織）中のグルコース
濃度が増大すると、インスリン結晶の溶解速度が高くなり、従って吸収速度が増
大する。
【０００４】 本発明は、組込まれたグルコースセンサを有するインスリン誘導体に関し、グ
ルコース濃度の関数としてインスリンを放出できる斯かるインスリン誘導体を含
有する薬学的組成物に関し、また糖尿病の治療における斯かる組成物の使用に関
する。
【０００５】
【従来の技術】
糖尿病は、真性糖尿病および潜伏性糖尿病におけるような、過剰な尿排泄を有
する人間における病気についての一般的な用語である。真性糖尿病は、グルコー
スを利用する能力が部分的または完全に喪失される代謝性疾患である。
【０００６】 1920年代におけるインスリンの発見以来、真性糖尿病の治療を改善するための
継続的な研究が行われてきた。極端な血糖値レベルを回避する補助として、糖尿
病患者は屡々複数回の注射療法を実施し、それによって食事毎にインスリンが投
与される。多くの糖尿病患者は、基本的要求をカバーするために一日に１回また
は２回の遅延製インスリン組成物の注射を含み、かつ食事関連の要求を満たすた
めに迅速作用性インスリンの一時的大量注射で補うレジメに従って、一日複数回
のインスリン注射で治療される。
【０００７】 遅延した作用プロファイルを有するインスリン組成物は、当該技術において周
知である。従って、このようなインスリン組成物の一つの主要なタイプは、結晶
性インスリンまたは非晶質インスリンの注射可能な水性懸濁液を含んでなるもの
である。典型的には、これら組成物中のインスリンは、プロタミンインスリン、
亜鉛インスリン、またはプロタミン亜鉛インスリンの形態で提供される。
【０００８】 ヒトまたは動物のインスリンは、例えばZn2+イオンの存在下においてより高い
集合形態になると、結晶質または非晶質の生成物の形態で沈殿が生じる；例えば
、Jens Brange（編者）による「インスリン製剤」（Springer Verlag (1987)）
第20〜27ページを参照されたい。従って、pH7において、インスリン６量体当た
り６Zn2+イオンをブタインスリンの溶液に添加すると、インスリンの略完全な沈
殿が生じる。
【０００９】 もう一つのタイプの遅延型インスリン組成物は、生理的pHよりも低いpH値を有
する溶液からなるものであり、該溶液が注射された時にそのpH値が生理的pHに上
昇するので、該溶液が注射されるとインスリン類縁体は沈殿する。この原理は、
インスリン類縁体にグルコースセンサを組み込むことによって、本発明と組合せ
ることができる。これら類縁体はグルコースセンサに加えて、位置A21に、注射
すべき溶液に実際的に有用な程度に低いpHで安定なアミノ酸残基を有する。位置
A21の適切なアミノ酸残基の例は、グリシン、セリン、およびアラニンである。
また、このインスリンは、分子の正味の電荷を約２単位だけ増大させる変異を有
する。例えば、位置B27のThrはArgで置換することができ、また位置B30における
Thr-OHはThr-NH2で置換することができ、または塩基性残基、例えばB31〜B32のA
rg-Argを加えてもよい。
【００１０】 B26〜B30の何れかの位置にあるリジン残基のε-アミノ基に結合した親油性置
換基を有する可溶性インスリン誘導体が、前記文献に記載されている。このよう
な誘導体は、可溶性ヒトインスリンに比較して、皮下注射後の遅延作用プロファ
イルを有しており、この遅延作用は、皮下組織、血液および抹消組織でのアルビ
ミンに対する可逆的結合によって説明されている。
【００１１】 親油性置換基を特徴とする幾つかの可溶性誘導体、即ち、定義されたゲル濾過
システムで分析した時にアルドラーゼ（Mw=158kDa）よりも大きな分子量を有す
る高分子量凝集体を形成できる誘導体において、それらの遅延した作用の追加の
機構が開示されている。
【００１２】 健康人の血中グルコース濃度は約5 mMであり、食事の後には約7 mMに上昇する
。今日、血中グルコースの頻繁なモニタリングに基づいて、食事関連の注射のた
めの即効性インスリンおよび基礎インスリンのための可溶性デポー剤インスリン
を使用する最も進んだインスリン療法を適用するときでも、糖尿病は屡々制御不
能なグルコース濃度に遭遇する。投与するインスリンが多過ぎて、グルコース濃
度が約3 mM未満になると、低血糖現象が起きて意識喪失が生じる。投与するイン
スリンが少な過ぎて、グルコース濃度が約20 mMに上昇すると、血中にアセトン
が現れ、糖尿病性ケトアシドーシスを生じ、最終的には糖尿病性昏睡に至る。し
かし、ケトアシドーシスおよび最終的な糖尿病性昏睡は抑制することが望まれる
。しかし、糖尿病の後期合併症を低減するためには、糖尿病の血中グルコース濃
度をできる限り5 mMに近くなるように、より緊密に制御することが望ましい。ア
メリカ合衆国における1998年以来のDCCT（糖尿病合併症臨床試験）の研究では、
９年間に亘って、１型糖尿病における糖尿病合併症の発生が試験された（N Engl
J Med 1993, 329, 977-986）。UKPDS（英国予想糖尿病研究）では、１５年に亘
って、２型糖尿病における合併症の発生が研究された（Lancet 1998, 352, 854-
865）。これら二つの型の糖尿病間では合併症のパターンが異なるが、両研究と
も、血中グルコースの緊密な制御によって合併症の顕著な低減がもたらされると
結論した。従って、糖尿病において、5 mMの正常値に近いグルコース制御を得る
ための手段について、未だ満たされていない医学的必要性が存在している 理論的には、緊密なグルコース制御を得るための一つの方法は、患者の組織内
に位置するグルコースセンサを、インスリンポンプを制御するコンピュータに結
合することであろう。このポンプは、皮下に挿入された針に接続されたカテーテ
ルを経由している。しかし、おそらくは安定且つ信頼性のあるグルコースセンサ
が存在しないために、このようなフィードバック制御システムは未だ実現されて
いないように思える。組織内に挿入されるグルコースセンサは、フィブリンを過
剰成長させるようであり、また、例えば赤外光学系に基づく非侵襲性のセンサは
、未だ発明または開発されていない。
【００１３】 デポー剤からのグルコース依存性インスリン放出のためのシステムを開発する
試みが、以前に報告されている。中空繊維のような固相マトリックスに固定化さ
れたコンカナバリンＡのような炭水化物結合性レクチンは、マルトトリオース、
マルトースまたはデキストランのような炭水化物部分で置換されたインスリン誘
導体に結合する。このマトリックスは、溶解したグルコースおよびインスリン誘
導体の拡散を許容する。前身のグルコース濃度が上昇するに伴って、グルコース
は、マトリックスからの増大する量のインスリン誘導体を置換え、より多くのイ
ンスリンを循環系に利用可能にすることにより、それが必要とされるときにはイ
ンスリンレセプターに利用可能にする。これらレクチンに基づくシステムは、お
そらくはインスリン含有マトリックスを身体内にインプラントすることの不便さ
、および大きなインスリンデポー剤を身体内に担持させることの危険性のために
、臨床的には実施されていないようである。
【００１４】 グルコースで制御されるインスリン放出システムのもう一つの示唆される例は
、グルコースオキシダーゼ触媒によるグルコースのグルコン酸への変換に基づい
ている。グルコースオキシダーゼは、例えばエチレン／酢酸ビニル共重合体のマ
トリックスに固相化され、インスリンまたはインスリン誘導体が固体状態で該マ
トリックス中にトラップされる。従って、固体状態からの可溶性インスリンの放
出速度はグルコース濃度を反映する。同様に、これらグルコースオキシダーゼに
基づくシステムも、おそらくは同じ理由で臨床的には実施されていない。
【００１５】 更に、グルコースを検知する分子構造がマトリックス（即ち、可溶性または固
体ポリマー）の一部であるデポー剤からの、グルコースに制御されたインスリン
放出を提供する試みがなされている。
【００１６】
【発明の概要】
我々は、注射または吸入されたデポー剤からのインスリンの放出がグルコース
依存性である、新規なインスリン誘導体を発明した。このデポー剤において、グ
ルコースセンサで修飾されたインスリン誘導体は、結晶状態または高度に凝集し
た可溶性の状態である。両状態とも、注射部位からの遅延された吸収をもたらす
。この可溶性凝集体における結晶および凝集状態の可溶性は、周囲組織における
グルコース濃度によって影響される。グルコース濃度の増大は、結晶の溶解およ
び可溶性凝集体の解離を促進する。
【００１７】 皮下または筋肉内注射されたデポー剤の投与量および容積は、通常の基本イン
スリン組成物のそれと同様であり、一日に１または２回の注射による基本インス
リン供給をカバーすることを意味する。グルコースセンサを有するインスリン誘
導体の吸入されたインスリン組成物は、一日に数回、典型的には食事の前または
最終に接種すればよい。
【００１８】 アルドラーゼ（Mw=158 kDa）よりも分子量が大きい高分子量凝集体を形成でき
る親油性置換基を特徴とする可溶性インスリン誘導体が、WO 99/21888（ノボノ
ルディスク）に開示されており、その全体の内容を、本明細書の一部として本願
に援用する。このような凝集体からのインスリン誘導体の放出は、該可溶性凝集
体の拡散制御された崩壊に依存するように思える。しかし、選択されたインスリ
ン誘導体から形成された幾つかの高分子量凝集体は、凝集したインスリン誘導体
を含有する緩衝溶液の中にグルコースが導入されたときに崩壊し、より小さな凝
集体を形成する。このグルコース濃度が高いほど、この凝集した誘導体はより完
全に崩壊する。
【００１９】 凝集体の状態、および該状態を減少させるグルコースの能力は、溶出液中に種
々の濃度のグルコースを含有する緩衝液中の、凝集したインスリン誘導体のゲル
濾過によって示すことができる。
【００２０】 皮下デポー剤からのインスリン誘導体放出の増大は、同じ投与量のインスリン
誘導体を注射した後の、種々の血中グルコースレベル（例えば5 mMおよび10 mM
）にクランプされたブタ血漿中での、インスリン誘導体の異なるレベルによって
示すことができる。
【００２１】 グルコース依存性インスリン放出のこの新規な概念は、インスリン療法の従来
技術における注射レジメの便宜性に適合し、また身体内にインプラントされた大
きなデポー剤の貯蔵に付随する手術または危険を必要としない。
【００２２】
【発明の詳細な記述】
以下、添付の図面を参照して、本発明を更に詳細に説明する。
【００２３】 ここで用いる「インスリン誘導体」の用語（および関連の表現）は、ヒトイン
スリン、または少なくとも一つの有機置換基が一以上のアミノ酸に結合している
その類縁体を意味する。
【００２４】 ここで用いる「ヒトインスリンの類縁体」は、一以上のアミノ酸残基が欠失し
、および／または他のアミノ酸残基（コード可能でないアミノ酸残基を含む）で
置換されたヒトインスリン、または追加のアミノ酸残基を含む（即ち、全部で51
よりも多いアミノ酸残基を含む）ヒトインスリンを意味する。ヒトインスリンの
アミノ酸配列は、例えば、Merck & Co.によって1989年に発行されたメルクイン
デックス第11版、第4888頁に与えられている。
【００２５】 「デポー剤」とは、NPHインスリンおよびLenteインスリンのような結晶性組成
物の形態、またはインスリン類縁体もしくはインスリン誘導体のアルブミン結合
性または可溶性凝集体の溶液、または中性で沈殿する酸溶液の形態で、皮下もし
くは筋肉内に注射または吸入されたインスリン組成物の量を意味する。
【００２６】 「吸収」とは、デポー剤中のインスリンが循環系に輸送されるプロセスを意味
する。
【００２７】 「グルコースセンサ」とは、グルコースに結合でき、またはグルコースと反応
できる化学基を意味する。該グルコースセンサはインスリン分子の一部である。
可逆的結合について、該センサ／グルコース複合体の解離定数、即ちKdは、通常
は0.01μM〜100 mM、例えば1μM〜20μM、または1 mM〜20 mM、または1 mM〜100 mMの範囲である。可逆的グルコースセンサの例は、有機ボレート、例えば、イ
ンスリン誘導体への結合が炭素−炭素結合を介して行われるアリールボロネート
または他のボレートである。アルキルボロネートは酸化的に変化し易く、不安定
であることが多い（Snyder, Kuck and Johnson, J.Am.Chem. Soc 1938, 60, 105
）。生理的条件下でグルコースに結合するボロネートセンサが好ましい。フェニ
ルボロネートのような単純なアリールボロネートは、比較的高いpH>9でのみグル
コースと結合する（Shinkai and Takeuchi, Treds Anal. Chem. 1996, 15, 188
）。生理的pHでグルコースに結合する酸性ボレートが好ましい。このようなボレ
ートグルコースセンサの例は、アミノエチル-アリール-2-ボロネート類（Nielec
ki, Eggert and Norrild, J. Chem. Soc., Prkin Trans 2 1999, 449）、近傍に
アミノ基を有する他のボロネート類（Shiino et al., J. Controlled Release 1
995, 37, 269）、または電子吸引性基で置換されたアリールボロネート類（Egge
rt et al., J.Org.Chem. 1999, 64, 3846）、例えばスルホ-、カルボキシ-、ニ
トロ-、シアノ-、フルオロ-フェニルボロネート類、ピリジンボロネート類、ピ
リジニウムボロネート類、またはそれらの組合せである。例えばフルクトースに
対するよりも大きなグルコース感受性を保証するために、ジボロネート類を用い
てもよい。
【００２８】
【化２】 このような酸性ボロネートは、生理的pHの水溶液中においてテトラヘドラルな
配置をとり、それによってグルコースの結合を可能にする。可逆的グルコースセ
ンサは、任意にボロネートを含むペプチドまたは偽性ペプチドであってもよい。
不可逆的グルコースバインダの例は、グルコースと反応してオキシム類およびヒ
ドラゾン類を形成するオキシアミン類およびヒドラジン類である（Veprek and J
ezek, J. Peptide Sci. 1999, 5, 582）。有用なオキシアミン官能基の例は、ア
ミノオキシ酢酸、AOA（Vilaseca et al., Bioconjugate Cem. 1993, 4, 515）、
およびO-アミノセリン、Ams（Spetzler and Hoeg-Jensen, J. Pept. Sci. 1999,
5, 582）である。
【００２９】 一つの好ましい実施例において、本発明はインスリン誘導体の可溶性凝集形態
の発見に基づいており、その凝集状態はグルコースにより影響される。該凝集体
は、好ましくは6.8〜8.5の中性pHにおいて水に可溶性である。インスリン誘導体
の可溶性凝集形態は、皮下注射の後に徐々に解離し、長期作用性インスリン組成
物に適するようになる。その利点は、該組成物が沈殿を含まないことである。組
織中のグルコース濃度が高いほど、解離およびその後の吸収の速度が高くなる。
懸濁した組成物に対する可溶性組成物の利点は、投与量におけるより高い精度、
瓶またはペンを振盪する必要がないこと、注射の際の痛みが少ない細い針を使用
できること、瓶またはカートリッジへの充填が容易であること、および空気なし
で沈殿を懸濁させるために使用されるカートリッジ中の球を必要としないことで
ある。
【００３０】 分布係数KAVによって評価される凝集体の見掛けの溶出容積は、Bio-Gel P300
（BIO-RAD）を用いたゲル濾過により測定したときに、グルコース濃度が0 mMか
ら20 mMまたは100 mMに増大すると、高い値に変化する。この実験において、凝
集の状態に対するグルコースの最適な効果を達成するためには、略アルドラーゼ
サイズの凝集体を得るように（即ち、0.10のKAV値）、塩化ナトリウムの濃度を
低下すべきである。
【００３１】 この凝集形態は、殆どのインスリンについて６量体ユニットが存在することが
知られている条件下で、インスリン誘導体について観察することができる。従っ
て、好ましい実施例において、この凝集形態は６量体サブユニット、好ましくは
少なくとも4、より好ましくは5〜500の６量体サブユニットで構成される。本発
明の組成物の如何なる６量体サブユニット凝集形態も、既知のR6、R3、T3または
T6構造の何れかを有することができ、T6が好ましい形態である（Kaarsholm, Bio
chemistry 28, 4427-4435）。
【００３２】 ６量体ユニットを安定化することが知られているZn2+のような物質もまた、幾
つかのインスリン誘導体の凝集形態を安定化することが分かっている。該凝集体
を形成する構成ブロックは、X線結晶学的に決定されたインスリンの構造から知
られた６量体ユニットであってよい（Blundell, Diabetes 21 (Suppl. 2), 492-
505, 1972）。６量体ユニットを2または4 Zn2+／６量体の複合体として安定化す
ることが知られているZn2+のようなイオン（Blundell, Diabetes 21 (Suppl. 2)
, 492-505, 1972）は、殆どのインスリン類縁体および誘導体の凝集体形成に不
可欠である。従って、本発明によるグルコース依存性の凝集インスリン誘導体組
成物は、6分子のインスリン誘導体当たり、好ましくは少なくとも2個の亜鉛イオ
ン、より好ましくは2〜5個の亜鉛イオン、更に好ましくは2〜3個の亜鉛イオンを
含む。更に、当該組成物は、有利には、6分子のインスリン誘導体当たり少なく
とも3分子のフェノール化合物を含む。2 Zn2+／６量体構造の中央キャビティー
において、GluB13の6残基は、3以下のCa2+イオンのための結合部位を与える（Su
dmeier et al., Science 212, 560-562, 1981）。従って、Ca2+イオンは６量体
を安定化し、インスリン誘導体が溶液中に残留する条件で、薬学的組成物に添加
することができる。
【００３３】 約5 mMの正常な血中グルコース濃度を有する健康なヒト患者において、皮下注
射後の本発明の凝集体の消失半減期は、好ましくはヒトインスリンNPH組成物の
半減期以上である。
【００３４】 本発明の特に好ましい実施例において、当該凝集体は、LysB29(Nε-テトラデ
カノイル)des(B30)ヒトインスリンよりも低いアルブミン結合性を有する。
【００３５】 本発明によるインスリン凝集体のリジン残基における置換基は、好ましくは6
〜40の炭素原子を含む親油性基である。
【００３６】 適切な親油性置換基の例は、リトコール酸、コール酸、ヒオコール酸、デオキ
シコール酸、ケノデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、ヒオデオキシコ
ール酸またはコラン酸の酸残基である。
【００３７】 もう一つの好ましい実施例において、親油性置換基は、アミノ酸リンカーを使
用してリジン残基のε-アミノ基に結合される。この実施例によれば、親油性置
換基はγ-またはα-グルタミルリンカー、またはβ-またはα-アスパルチルリン
カーを介してリジン残基に結合されるのが有利である。
【００３８】 更にもう一つの好ましい実施例において、前記親油性置換基は、ボレート基、
アリールボロネート、アミノアリールボロネートまたはグルコース結合性ペプチ
ドの形態のグルコースセンサを含んでいる。
【００３９】 本発明は更に、凝集度がグルコース濃度に反比例するような凝集体を形成でき
る、新規なインスリン誘導体を提供する。これらのインスリン誘導体は、薬学的
組成物において凝集形態を与えてもよく、或いは、薬学的組成物中で非凝集形態
を与えてもよいが、この場合は前記組成物の皮下注射後に凝集する。
【００４０】 従って、本発明は更に、インスリン誘導体の凝集体、または皮下注射後に凝集
体を形成する非凝集のインスリン誘導体を含有し、その凝集の程度がグルコース
濃度に逆相関する薬学的組成物に関する。グルコース分子の作用による、可溶性
インスリンポリマーの可溶性インスリン６量体への解離は、次式によって説明さ
れる。
【００４１】
【化３】 ここで、ｎは、ポリマーインスリンのネットワークを破壊して、該ネットワーク
からインスリン６量体を放出するのに必要なグルコース分子の数である。ｎのア
ドバンテージが１よりも大きいことは図１から明らかであり、この図はｎを1か
ら6に増大させると、ポリマー（即ち、結合された６量体）に対する遊離インス
リン6量体画分の曲線の勾配が増大することを示している。従って、一つの結合
しか関与しない機構ではなく、ンスリン６量体の間の多くの相互作用によって、
高グルコース濃度でのインスリンの迅速な放出、および低グルコース濃度での緩
慢な放出が可能である。
【００４２】 好ましくは、本発明による薬学的組成物は、溶出液として前記組成の媒質を用
いたゲル濾過により測定したときに、実質的な画分がアルドラーゼよりも大きい
分子量を有する凝集体を含む。
【００４３】 もう一つの実施例において、当該薬学的組成物は、凝集性インスリン類縁体お
よび即効性インスリン類縁体の両方を含み、後者は、好ましくはヒトインスリン
、またはインスリン類縁体であるAspB28ヒトインスリン、LysB28ProB29ヒトイン
スリン、GlyA21,LysB3,IleB28ヒトインスリン、AspA21,LysB3,IleB28ヒトインス
リンもしくはdes(B30)ヒトインスリンのうちの一つである。この容易な組成物は
、迅速な作用開始および長期の作用プロファイルの両方を提供し、後者は糖尿病
患者の血中グルコース濃度によって影響されるであろう。混合形態の二つのイン
スリンの場合には、混合された６量体類の両者が血中グルコースの影響下にある
であろう。
【００４４】 この実施例において、当該薬学的組成物は、90：10〜10：90のモル比で凝集性
インスリンおよび即効性インスリンを含有する。
【００４５】 凝集形態の緩やかな解離は、当該薬学的組成物の粘度を増大させる生理学的に
許容可能な物質の添加によって、インビボでは更に遅くすることができる。従っ
て、本発明による薬学的組成物は、粘度を増大させる物質、好ましくはポリエチ
レングリコール、ポリプロピレングリコール、その共重合体、デキストランおよ
び／またはポリ乳酸を含有してもよい。
【００４６】 更にもう一つの実施例において、グルコース検知基を含むインスリン誘導体は
、結晶を形成するプロタミンを使用して結晶性NPH組成物として調製され、また
は結晶中のZn2+イオンを使用して結晶性Lente組成物として調製される。これら
の場合に、結晶の溶解速度は、グルコースとグルコース検知基との間の相互作用
によって向上する。
【００４７】 更にもう一つの実施例において、当該遅延性インスリン組成物は、溶液が注射
されたときにpH値が生理学的pHに上昇することに起因して、インスリン類縁体が
沈殿するような前記生理学的pH以下のpH値を有する溶液である。このような類縁
体は、EP 0 254 516B1（ノボノルディスク）およびEP 0 368 187B1（ヘキスト）
に記載されている。これらの類縁体は、位置A21に、注射される溶液中で実際的
に有用な低いpH値で安定なアミノ酸残基を有している。位置A21における適切な
アミノ酸残基の例は、グリシン、セリン、またはアラニンである。また、このイ
ンスリンは、分子の正味の電荷を２だけ増大させる突然変異を有しており、例え
ば、位置B27におけるThrはArgで置換することができ、また位置B30におけるThr-
OHはThr-NH2で置換することができ、または追加の塩基性残基、例えばB31-B32の
Arg-Argを有することができる。この原理を、インスリン類縁体中へのグルコー
スセンサの組込みにより本発明と組み合わせると、グルコースとグルコース検知
基との間の相互作用によって結晶の溶解度が向上し、吸収を促進させる。
【００４８】 グルコースセンサの結合を可能にする部位は、グリシンA1およびフェニルアラ
ニンB1のＮ末端アミノ基、およびリジンB29のεアミノ基である。この目的のた
めに、例えば位置B3またはB28に、一以上の追加のまたは別のリジン残基を組込
んでもよい。更に、ペプチド鎖の一部として、好ましくはB鎖のＣ末端部分にグ
ルコースセンサを組込んでもよい。
【００４９】 当該薬学的組成物は更に、リン酸塩（例えばリン酸ナトリウム）、グリシンま
たはグリシルグリシン緩衝剤のような緩衝物質、塩化ナトリウムまたはグリセロ
ールのような等張剤、並びに保存剤としてのフェノールおよび／またはm-クレゾ
ールを含有する。任意に、マンニトールまたはソルビトールを等張剤として添加
することができ、その結果として得られるグルコースセンサとの相互作用を利用
して、当該組成物の安定性および放出プロファイルを調節することができる。本
発明による薬学的組成物の補助物質のうちで、等張剤として使用される塩化ナト
リウム、６量体の形成を促進および安定化させる亜鉛および任意のカルシウムイ
オンは、それらが組成物中のインスリン誘導体の凝集を促進し、それによって注
射部位からの消失時間を効果的に延長させるので、特に重要である。本発明によ
る薬学的組成物は、好ましくは5〜150 mMの濃度の塩素イオンを含有する。
【００５０】 当該組成物において、本発明のグルコース検知性インスリンの濃度は、一般に
は0.1〜15 mM、例えば0.1〜15 mMの範囲である。この組成物中に含まれる亜鉛の
量は、インスリン誘導体に対して0.3〜0.9重量％である。フェノールもしくはm-
クレゾールまたはそれらの混合物のようなフェノール性化合物は、5〜50 mMの合
計濃度で適切に適用され、また塩素イオンの濃度は10 mM〜100 mMである。
【００５１】 本発明は更に、真性糖尿病を治療する方法であって、このような治療を必要と
する人に対して、本発明によるインスリン誘導体の水溶性凝集体の有効量、また
は皮下注射すると水溶性凝集体を形成でき且つ該凝集体のサイズがグルコース濃
度に依存する、本発明によるインスリン誘導体の有効量を投与することを含んで
なる方法を提供する。
【００５２】 如何なる患者の最適投与量レベルも、用いられる特定のヒトインスリン誘導体
の薬効、年齢、体重、身体的活動、および患者の食事を含む種々の因子に依存し
、また他の薬物との可能な組合せ、および糖尿病症例の重篤度に依存する。本発
明のヒトインスリン誘導体の一日投与量は、公知のインスリン組成物と同様に、
当業者が夫々の個々の患者について決定することが推奨される。
【００５３】 グルコース検知性インスリンの製造に使用されるグルコースセンサ構造ブロッ
クは、後述の実施例に記載したようにして製造することができる。本発明のイン
スリン誘導体は、WO 95/07931（ノボノルディスクA/S）、WO 95/00170（ノボノ
ルディスクA/S）、WO 97/31022（ノボノルディスクA/S）、WO 98/02460（ノボノ
ルディスクA/S）、EP 511 600（Kuraray Co. Ltd.）およびEP 712 862（Eli-Lil
ly）に開示された一般的方法によって調製することができる。
【００５４】 上記特許出願に列記され、またMarkussen, Diabetologia39, 281-288, 1996；
Kurzhals, Biochem J. 312, 725-731, 1995；Kurzharl, J.Pharm Sciences 85,
304-308, 1996；およびWhittngham, Biochemistry 36, 2826-2831, 1997におい
て、アルビミン結合機構により遅延されるものとして記載された幾つかの誘導体
は、高分子量凝集体を形成する能力をも有している。WO 95/07931からのLysB29(
Nε-リトコリル-γ-グルタミル)-des(B30)ヒトインスリン、およびWO 97/31022
からのLysB29(Nεω-カルボキシヘプタデカノイル)-des(B30)ヒトインスリンは
、中性pHで高分子量の可溶性凝集体を形成できるインスリン誘導体の例である。
【００５５】 ＜炭水化物結合の決定＞ グルコースおよび他の炭水化物に対するグルコース検知性インスリン誘導体の
親和性は、Biacore（登録商標）センサチップ上で行われる実験によって評価す
ることができる（例えば、www.biacore.comおよびRich RL; Myszka DG, Journal of Molecular Recognition, 13(6) 388-407 (2000)参照）。Biacore機器は表面
プラズモン共鳴（SPR）に基づいており、これはマイクロフローセル中のデキス
トラン被覆された金表面に結合した物質の質量を測定する光学技術である。この
デキストランは、小分子、ペプチドまたはタンパク質の固定化により化学的に修
飾することができる。試験すべき化合物のデキストランまたは修飾デキストラン
への結合はリアルタイムで測定され、これは速度論的測定を可能にする。
【００５６】 本発明の目的のためには、標準のアミンカップリング法により、グルカミンが
カルボキシレート表面に固定化される。このグルカミン修飾された表面は、図２
に示すように、グルコース検知性インスリン17aを結合する。種々の量のグルコ
ースを、グルカミン表面上にポンプ輸送する前の17a溶液に添加することにより
、グルコース濃度が減少したときに信号が減衰することが示される。この応答を
定量して、EC50が決定できる拮抗曲線としてプロットされる。図３参照。使用し
た条件（低結合性）の下で、EC50は解離常数Kdの値の良好な評価である。本発明
の多くのインスリン誘導体を用いて得られたデータを、表１に提示する。上記実
験で使用した実験条件は、0.1 M NaCl、0.1 Mリン酸、pH7.4、25℃である。
【００５７】
【表１】 ＜インスリン受容体結合性の決定＞ 本発明のインスリン誘導体のインスリン活性は、インスリン受容体プレパレー
ションに対するそれらの結合性によって示すことができる。シンチプレート（Wa
ilac）をヤギ抗マウスIgGでコーティングし、インスリン受容体抗体を添加し、
続いて可溶化したヒトインスリン受容体を添加した。インスリン受容体に対する
本発明のインスリンの結合性を、125I-TyrA14ヒトインスリンおよびシンチレー
ション計数を用いた拮抗により測定する。本発明によるインスリン誘導体を用い
て得られた結果を、表２に提示する。
【００５８】
【表２】 ＜凝集体形成の決定＞ 本発明のインスリンの凝集形態は、アルドラーゼ以上の排除限界をもったゲル
を使用することにより、ゲル濾過によって示される。ゲル濾過において中性pHの
緩衝水溶液システムを使用し、600 nmolインスリン/mLの濃度の薬学的組成物の
形態でインスリン誘導体をカラムに掛ける。凝集状態のインスリン誘導体は、15
8 kDaの分子量を有するアルドラーゼと共に、またはそれよりも前に溶出する。
【００５９】 ゲル濾過の溶出容積は、下記のように定義される分配計数KAVによって記述す
ることができる。
【００６０】 KAV＝（VR−VO）／（Vt−VO） ここで、VRは保持容積、VOは空隙容積、Vtはベッドの合計容積である。VOは青デ
キストランの溶出容積として得られ、またVtはカラム寸法の測定および容積の計
算によって得られる。
【００６１】 この節において規定した条件を用いたゲル濾過実験は直接的な生理化学的方法
であり、これを使用して、本発明のインスリン誘導体の凝集体形成特性を証明す
ることができる。皮下注射後にインスリン誘導体が注射部位から消失する速度は
、種々の生物学的因子の外に、ポリマー形成、グルコース濃度、およびインスリ
ン誘導体のアルブミン結合特性の組合された影響を反映する。消失速度の便利な
尺度は消失半減期、即ちT50％であり、これは例えばブタにおいて測定すること
ができる。T50％は、外部γ計数器を用いて測定したときに、A14Thr(125I)類縁
体の50％が注射部位から消失するときの時間である（Ribel, U et al., The Pig
as a Model for Subcutaneous Absorption in Man. In:M. Serrano-Rios and P
.J. Lefebre (Eds): Diabetes 1985; Proceedings of the 12th Congress of th
e International Diabetes Federation, Madrid, Spain, 1985 (Excerpta Medic
a, Amsterdam, (1986) 891-96）。
【００６２】 グルコース依存性の高分子量可溶性凝集体の形成は、20〜140 mMの塩化ナトリ
ウム、pH7.4以上で5 mMのリン酸ナトリウム、および0〜20 mM、例えば0〜100 mM
で変化するグルコース濃度を含む中性の水性溶出液中において、ポリアクリルア
ミドゲルBio-Gel P300（BIO-RAD）のカラムを用いたゲル濾過によって証明され
る。カラム容積後に部分的に溶出するインスリン誘導体については、低濃度の塩
化ナトリウムでゲル濾過を行えばよい。記載した緩衝系は、皮下注射後と同じ条
件下で凝集状態が変化する誘導体を検出できるようにするために、インビボの哺
乳類組織中での条件に似せるように選択された。アルドラーゼの分子量に近い分
子量を有する凝集体が得られるように精密に塩化ナトリウム濃度を減少し、また
はpH値を増大させる他の緩衝系においては、グルコースの影響を観察する可能性
がより良好になる。
【００６３】 凝集のためのゲル濾過試験： 10×1 cmのカラムで使用でき且つデッド容積の
小さい空のカラムHR 10/10（Amersham Pharmacia Biotech code 19-7402-01）に
、インストラクションマニュアル（BIO-RAD）に従ってBio-Gel P-300（BIO-RAD
）を充填し、37℃において4.5 cm/h（0.06 mL/min）の線形流で溶出させた。合
計のベッド容積を計算するために、約10 cmの実際のカラム長を測定した。広範
囲の分子量を分離するために使用可能な7.9 mLのゲル濾過カラムであるBio-Gel
300（BIO-RAD）を、37℃において、アジ化ナトリウム0.01％で保存し且つpH7.4
まで塩酸を添加した塩化ナトリウム 100 mM、リン酸ナトリウム 5 mMによって溶
出させた。ラン時間は240分であり、注入容積は100μLであった。カラム容積後
に部分的に溶出するインスリン誘導体については、低塩化ナトリウム濃度でゲル
濾過を繰り返した。凝集状態に対するグルコースの解離効果を、20 mL以上のグ
ルコースを含有させ、任意にpHを8.0にまで増大させることによって試験した。
本発明の多くのインスリン誘導体を用いて得られたデータを、下記の表３に示す
。
【００６４】
【表３】 凝集状態を研究するための別の方法は、光散乱、浸透圧測定および超遠心であ
る。
【００６５】
【実施例】
＜化学基および商業的に入手可能な化学薬品についての冒頭語＞ Ams O-アミノセリン AOA アミノオキシ酢酸 Boc tert-ブトキシカルボニル Bzl ベンジル Dab ジアミノ酪酸 Dap ジアミノプロピオン酸 DCC N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド DMF N,N-ジメチルホルムアミド Fmoc 9-フルオレニルメトキシカルボニル HOSu N-ヒドロキシスクシンイミド NMP N-メチル-2-ピロリドン Orn オルニチン TEA トリエタノールアミン TFA トリフルオロ酢酸 THF テトラヒドロフラン ＜略語＞ ESMS：電子スプレー質量スペクトル分析 HPLC：高性能液体クロマトグラフィー LCMS：液体クロマトグラフィー質量スペクトル分析 MALDI-MS：マトリックス援用レーザ脱離イオン化質量スペクトル分析 Mw：分子量。
【００６６】 例１ LysB29(Nε-リトコロイル)-N-フェニル-B29-ベンジルアミド-2-ボロン
酸des(B30)ヒトインスリン，１ 2,2-ジメチルプロパン-1,3-ジイル-2-(ブロモメチル)フェニルボロネート(Bie
lecki, Eggert and Norrild, J. Chem. Soc. Perkin Trans 2, 1999, 449)をア
ニリンと反応させて、N-フェニル-ベンジルアミン-2-(2,2-ジメチルプロパン-1,
3-ジイル)ボロネートを得た。このアミンを、アクロモバクターリティカス・プ
ロテアーゼ(Morihara and Ueno, Biotech. Bioeng. 1991, 37, 693)を用いてdes
(B30)ヒトインスリン中のLysB29のカルボン酸基とカップリングさせた。続いて
、LysB29のε-アミノ基を、N-ヒドロキシスクシンイミジルリトコレート(US 5,6
46,242)を選択的に用いてアシル化し、構造１を得た。
【００６７】
【化４】 上記の手順を用いて、N-ヒドロキシスクシンイミジルリトコレートを、親油性酸
残基を有する例えばヒオコール酸、ヒオデオキシコール酸、又はケノデオキシコ
ール酸のような酸における、他のN-ヒドロキシスクシンイミジルエステルと置換
することにより、関連化合物を得られる。
【００６８】 例２ LysB29(Nε-リトコロイル)-N'-メチル-N'-(ベンジル-2-ボロン酸)-2-ア
ミノ-N-フェニル-B29-エチルアミドdes(B30)ヒトインスリン，２ 2,2-ジメチルプロパン-1,3-ジイル-2-(ブロモメチル)フェニルボロネート(Bie
lecki, Eggert and Norrild, J. Chem. Soc. Perkin Trans 2, 1999, 449)をN'-
フェニル-N-メチルエチレンジアミンと反応させ、N'-フェニル-N-メチル-N-ベン
ジル-2-(2,2-ジメチルプロパン-1,3ジイル)ボロネートエチレンジアミンを得た
。このアミンを、アクロモバクターリティカス・プロテアーゼ(Morihara and Ue
no, Biotech. Bioeng. 1991, 37, 693)を用いて、des(B30)ヒトインスリン中のL
ysB29のカルボン酸基とカップリングさせた。続いてLysB29のs-アミノ基を、N-
ヒドロキシスクシンイミジルリトコレート(US 5,646,242)を選択的に用いてアシ
ル化し、構造２を得た。
【００６９】
【化５】 上記の手順を用いて、N-ヒドロキシスクシンイミジルリトコレートを、親油性酸
残基を有する例えばヒオコール酸、ヒオデオキシコール酸、又はケノデオキシコ
ール酸のような酸における、他のN-ヒドロキシスクシンイミジルエステルと置換
することにより、関連化合物を得られる。
【００７０】 例３ LysB29(Nε-リトコロイル)-N-フェニル-B30-(ベンジルアミド-2-ボロン
酸)ヒトインスリン，３ 2,2-ジメチルプロパン-1,3-ジイル-2-(ブロモメチル)フェニルボロネート(Bie
lecki, Eggert and Norrild, J. Chem. Soc. Perkin Trans 2, 1999, 449)をメ
チルアミンと反応させ、N-メチル-ベンジルアミン-2-(2,2-ジメチルプロパン-1,
3-ジイル)ボロネートを得た。このアミンを、ジシクロヘキシルカルボジイミド
および1-ヒドロキシベンゾトリアゾールを用いてtert-ブチルオキシカルボニル-
トレオニン(Boc-Thr)とカップリングさせ、Boc-基をトリフルオロ酢酸を用いて
除去した。得られたトレオニン N-メチル-ベンジルアミド-2-ボロネートを、ア
クロモバクターリティカス・プロテアーゼ(Morihara and Ueno, Biotech. Bioen
g. 1991, 37, 693)を用いて、des(B30)ヒトインスリン中のLysB29のカルボン酸
基とカップリングさせた。続いてLysB29のε-アミノ基を、N-ヒドロキシスクシ
ンイミジルリトコレート(US 5,646,242)を選択的に用いてアシル化し、構造３を
得た。
【００７１】
【化６】 上記の手順を用いて、N-ヒドロキシスクシンイミジルリトコレートを、親油性酸
残基を有する例えばヒオコール酸、ヒオデオキシコール酸、又はケノデオキシコ
ール酸のような酸における、他のN-ヒドロキシスクシンイミジルエステルと置換
することにより、関連化合物を得られる。
【００７２】 例４ LysB29(Nε-リトコロイル)-N'-メチル-N'-(ベンジル-2-ボロン酸)-2-ア
ミノ-N-メチル-B30-エチルアミド ヒトインスリン，４ 2,2-ジメチルプロパン-1,3-ジイル-2-(ブロモメチル)フェニルボロネート(Bie
lecki, Eggert and Norrild, J. Chem. Soc. Perkin Trans 2, 1999, 449)をN',
N-ジメチルエチレンジアミンと反応させて、N'-メチル-N-メチル-N-ベンジル-2-
(2,2-ジメチルプロパン-1,3-ジイル)ボロネートを得た。このアミンを、ジシク
ロヘキシルカルボジイミドおよび1-ヒドロキシベンゾトリアゾールを用いて、te
rt-ブチルオキシカルボニル-トレオニンとカップリングさせ、Boc-基をトリフル
オロ酢酸を用いて除去した。得られたトレオニン N-メチル-N'-メチル-N'-ベン
ジル-(2-(2,2-ジメチルプロパン-1,3-ジイル)ボロネート)2-アミノ-エチルアミ
ドを、アクロモバクターリティカス・プロテアーゼ(Morihara and Ueno, Biotec
h. Bioeng. 1991, 37, 693)を用いてdes(B30)ヒトインスリン中のLysB29のカル
ボン酸基とカップリングさせた。続いて、LysB29のε-アミノ基をN-ヒドロキシ
スクシンイミジルリトコレート(US 5,646,242)を選択的に用いてアシル化し、構
造４を得た。
【００７３】
【化７】 上記の手順を用いて、N-ヒドロキシスクシンイミジルリトコレートを、親油性酸
残基を有する例えばヒオコール酸、ヒオデオキシコール酸、又はケノデオキシコ
ール酸のような酸における、他のN-ヒドロキシスクシンイミジルエステルと置換
することにより、関連化合物を得られる。
【００７４】 例５ LysB29(Nε-リトコロイル)-N'-(ベンゾイル-3-ボロノ-5-ニトロ)-2-ア
ミノ-N-フェニル-B30-エチルアミドdes(B30)ヒトインスリン，５ 3-ボロノ-5-ニトロ-安息香酸(Combi-Blocks, San Diego, CA, USA)を、ジシク
ロヘキシルカルボジイミドおよび1-ヒドロキシベンゾトリアゾールを用いて、N-
フェニルエチレンジアミンにカップリングさせた。得られたN'-(3-ボロノ-5-ニ
トロ-ベンゾイル)N-フェニルエチレンジアミンを、アクロモバクターリティカス
・プロテアーゼ(Morihara and Ueno, Biotech. Bioeng. 1991, 37, 693)を用い
てdes(B30)ヒトインスリン中のLysB29のカルボン酸基とカップリングさせた。続
いて、LysB29のε-アミノ基を、N-ヒドロキシスクシンイミジルリトコレート(US
5,646,242)を選択的に用いてアシル化し、構造５を得た。
【００７５】
【化８】 上記の手順を用いて、N-ヒドロキシスクシンイミジルリトコレートを、親油性酸
残基を有する例えばヒオコール酸、ヒオデオキシコール酸、又はケノデオキシコ
ール酸のような酸における、他のN-ヒドロキシスクシンイミジルエステルと置換
することにより、関連化合物を得られる。
【００７６】 例６ LysB29(Nε-リトコロイル)-2-(ピリジニウム-3-ボロン酸)-アセチル-2-
アミノ-N-フェニル-B30-エチルアミドdes(B30)ヒトインスリン，６ 2,2-ジメチルプロパン-1,3-ジイル-3-ボロノ-ピリジン(Eggert, Frederiksen,
Morin and Norrild, J. Org. Chem. 1999, 64, 3846)をブロモ酢酸と反応させ
た。得られた2-(2,2-ジメチルプロパン-1,3-ジイル-3-ボロノピリジニウム)酢酸
を、ジシクロヘキシルカルボジイミドおよび1-ヒドロキシベンゾトリアゾールを
用いてN-フェニルエチレンジアミンとカップリングさせた。得られたアミンを、
アクロモバクターリティカス・プロテアーゼ(Morihara and Ueno, Biotech. Bio
eng. 1991, 37, 693)を用いてdes(B30)ヒトインスリン中のLysB29のカルボン酸
基とカップリングさせた。続いて、LysB29のε-アミノ基をN-ヒドロキシスクシ
ンイミジルリトコレート(US 5,646,242)を用いて選択的にアシル化し、構造６を
得た。
【００７７】
【化９】 上記の手順を用いて、N-ヒドロキシスクシンイミジルリトコレートを、親油性酸
残基を有する例えばヒオコール酸、ヒオデオキシコール酸、又はケノデオキシコ
ール酸のような酸における、他のN-ヒドロキシスクシンイミジルエステルと置換
することにより、関連化合物を得られる。
【００７８】 例７ LysB29(Nε-テトラデカノイル)-B29-アニリド-3-ボロン酸des(B30)ヒト
インスリン，７ アニリン-3-ボロン酸を、アクロモバクターリティカス・プロテアーゼ(Moriha
ra and Ueno, Biotech. Bioeng. 1991, 37, 693)を用いてdes(B30)ヒトインスリ
ン中のLysB29のカルボン酸基とカップリングさせた。続いて、N-ヒドロキシスク
シンイミジルテトラデカノイレート(US 5,646,242)を用いてLysB29のε-アミノ
基を選択的にアシル化し、構造７を得た。
【００７９】
【化１０】 上記の手順を用いて、N-ヒドロキシスクシンイミジルテトラデカノイレートを、
親油性酸残基を有する例えばリトコール酸、ヒオコール酸、ヒオデオキシコール
酸、又はケノデオキシコール酸のような酸における、他のN-ヒドロキシスクシン
イミジルエステルと置換することにより、関連化合物を得られる。
【００８０】 例８ LysB29(N'-リトコロイル)-AmsB30 ヒトインスリン，８ Ams(Boc)-OBut(Spetzler and Hoeg-Jensen、J. Pept. Sci. 1999, 5, 582)を
、アクロモバクターリティカス・プロテアーゼ(Morihara and Ueno, Biotech. B
ioeng. 1991, 37, 693)を用いて、des(B30)ヒトインスリン中のLysB29のカルボ
ン酸基とカップリングさせた。続いて、LysB29のε-アミノ基をN-ヒドロキシス
クシンイミジルリトコレート(US 5,646,242)を選択的に用いてアシル化し、イン
スリンをトリフルオロ酢酸を用いて脱保護し、構造８を得た。
【００８１】
【化１１】 上記の手順を用いて、N-ヒドロキシスクシンイミジルリトコレートを、親油性酸
残基を有する例えばヒオコール酸、ヒオデオキシコール酸、又はケノデオキシコ
ール酸のような酸における、他のN-ヒドロキシスクシンイミジルエステルと置換
することにより、関連化合物を得られる。
【００８２】 例９ PheB26(3-(N,N-ジメチル-アミノメチル)-4-ボロン酸)，LysB29(Nε-リ
トコロイル)des(B30)ヒトインスリン，９ 3-(N,N-ジメチル-アミノメチル)-4-ボロノ-フェニルアラニン(NBPhe)を4-ボロ
ノフェニルアラニン(RSP, Worchester, MA, USA)から作製し、標準的な固相ペプ
チド合成を用いて、以下のペプチド配列：ペプチド配列Gly-Phe-Phe-NBPhe-Thr-
Pro-Lys(リトコロイル)に組込んだ。このペプチドを、トリプシンを用いてdes-
オクタペプチドヒトインスリンとカップリングさせた。
【００８３】
【化１２】 上記の手順を用いて、N-ヒドロキシスクシンイミジルリトコレートを、親油性酸
残基を有する例えばヒオコール酸、ヒオデオキシコール酸、又はケノデオキシコ
ール酸のような酸における、他のN-ヒドロキシスクシンイミジルエステルと置換
することにより、関連化合物を得られる。
【００８４】 例10 LysB29(Nε-コラノイル-3-ボロン酸)des(B30)ヒトインスリン，10 3-ボロノ-コラノイルを、リトコール酸からの脱離(Templeton et al. Steroid
s 2000, 65, 219)およびハイドロボレーション(Kirk et al. J. Chem. Soc. Per
kin Trans 1 1976, 1836)により調製した。リトコレートをそのN-ヒドロキシス
クシンイミジルエステルに変換し、des(B30)ヒトインスリン中のLysB29のε-ア
ミノ基を選択的にアシル化するためにこれを用いた(US 5,646,242)。
【００８５】
【化１３】 上記の手順を用いて、コラン酸N-ヒドロキシスクシンイミジルを、親油性酸残基
を有する酸の他のN-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、例えば6,7-ジヒドロ
キシコラン酸エステル、6-ヒドロキシコラン酸エステル、又は7-ヒドロキシコラ
ン酸エステルと置換することにより、関連化合物が得られる。
【００８６】 例11 LysB29(Nε-(リトコロイル-(4-メチル-アミノメチル-3-ボロン酸-ベン
ゾイル)))des(B30)ヒトインスリン，11 4-メチル-アミノメチル-3-ボロノ-安息香酸(Combi-Blocks, San Diego, CA, U
SA)を、N-ヒドロキシスクシンイミジルリトコレートをアシル化剤として用い、N
-アシル化した。得られたリトコールイル安息香酸を、そのN-ヒドロキシスクシ
ンイミジルエステルに変換し、des(B30)ヒトインスリンのLysB29のε-アミノ基
を選択的にアシル化するために用い(US 5,646,242)、構造１１を得た。
【００８７】
【化１４】 上記の手順を用いて、N-ヒドロキシスクシンイミジルリトコレートを、親油性酸
残基を有する例えばヒオコール酸、ヒオデオキシコール酸、又はケノデオキシコ
ール酸のような酸における、他のN-ヒドロキシスクシンイミジルエステルと置換
することにより、関連化合物を得られる。
【００８８】 例12 LysB29(Nε-リトコロイル)-4-N-(ベンジル-2-ボロン酸)-4-アミン-B29-
アニリドdes(B30)ヒトインスリン，12 2,2-ジメチルプロパン-1,3-ジイル-2-(ブロモメチル)フェニルボロネート(Bie
lecki, Eggert and Norrild, J. Chem. Soc. Perkin Trans 2, 1999, 449)を1,4
-フェニレンジアミンと反応させて、1,4-フェニレンジアミン-N-ベンジルアミン
-2-(2,2-ジメチルプロパン-1,3-ジイル)ボロネートを得た。このアミンを、アク
ロモバクターリティカス・プロテアーゼ(Morihara and Ueno, Biotech. Bioeng.
1991, 37, 693)を用いてdes(B30)ヒトインスリン中のLysB29のカルボン酸基と
カップリングさせた。続いて、N-ヒドロキシスクシンイミジルリトコレート(US
5,646,242)を用いてLysB29のε-アミノ基を選択的にアシル化し、構造12を得た
。
【００８９】
【化１５】 上記の手順を用いて、N-ヒドロキシスクシンイミジルリトコレートを、親油性酸
残基を有する例えばヒオコール酸、ヒオデオキシコール酸、又はケノデオキシコ
ール酸のような酸における、他のN-ヒドロキシスクシンイミジルエステルと置換
することにより、関連化合物を得られる。
【００９０】 例13 LysB29(Nε-(-カルボキシアミドフェニル-3-ボロン酸 ノナデカノイル)
)des(B30)ヒトインスリン 13
【化１６】 α，ω-ドデカンジカルボンのモノヒドロキシスクシンイミジルエステルを、3
-ボロノ-アニリンと反応させた。得られたω-カルボキシアミドフェニル-3-ボロ
ン酸ノナデカノイルを、そのヒドロキシスクシンイミジルエステルに変換した。
このエステルを、des(B30)ヒトインスリンのε-アミノ基を選択的にアシル化す
るために用い、所望の誘導体を得た(US 5,646,242)。
【００９１】 例14 tert-ブチルオキシカルボニルアミノキシ酢酸N-スクシンイミジル，Boc
-AOA-OSuの合成 tert-ブチルオキシカルボニルアミノキシ酢酸を、氷冷した酢酸エチルまたは
アセトニトリル中に溶解させ、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド(1.0当量)
およびN-ヒドロキシスクシンイミド(1.0当量)を用いて処理した。この反応混合
物を室温で一晩撹拌した。形成されたN,N'-ジシクロヘキシル尿素を濾過により
除去し、濾液を真空下で蒸発させて乾燥させた。粗製のBoc-AOA-OSu を次なる工
程に直接用いるか、クロロホルムからの再結晶化により精製した。Kurth et al.
J. Med. Chem. 1993, 36, 1255から採用。
【００９２】 例15 LysB29(AOA)des(B30)ヒトインスリン15の合成 des(B30)ヒトインスリン(1g)を、1N NaOHを用いてpHを10.2に調整することに
より50mL 0.05M ホウ酸中に溶解させ、恒温槽内で15℃で静置した。この溶液に
、50mL アセトニトリル中に溶解した61mgのBoc-AOA-OSuを添加した。１時間後に
、pH9.0の19mL 0.2Nエタノールアミンの添加により反応を停止させた。全体量が
250mLになるまで水を、添加することにより生成物を沈澱させ、HClを用いてｐＨ
を5.5に調整し、この溶液を−20℃にまで冷却した。沈殿物を、−10℃で遠心分
離法により分離し、真空下で乾燥させた。質量分析により、親インスリン化合物
、モノアシル化されたインスリン、およびジアシル化されたインスリンが出現し
た。乾燥した生成物を、１時間、室温にて0.3mL トリイソプロピルシランを加え
た10mL トリフルオロ酢酸を用いて処理した。この反応混合物を100mLの低温のジ
エチルエーテルに滴下添加し、形成された沈殿物を分離して真空下で乾燥させた
。最後に、RP-HPLCによりpH 4.0 にて、20乃至60％のエタノールの勾配を用いて
化合物15を精製した。MALDI-MSにより見出されたMw：5778(理論値：5780)。
【００９３】
【化１７】 例16 LysB29(AOA)des(B30)ヒトインスリンの結晶質プロタミンの調製 １．LysB29(AOA)des(B30)ヒトインスリンの原液 35.0mgLysB29(AOA)des(B30)ヒトインスリンを，32μL 1N HCl，375μL m-クレ
ゾール溶液(20mg/mL)、65μL フェノール溶液(50mg/mL)、80mg グリセロール、
および32.7μL ZnCl2溶液(10mg/mL)を添加することにより水に溶解させ、最後に
体積を5mLに調整した。ｐＨは約３である。 ２．この原液2.25mLを、硫酸プロタミンの10 mg/mL水溶液の197μLと混合した
。 ３．得られた混合物に、375μL m-クレゾール溶液(20mg/mL)、65μL フェノー
ル溶液(50mg/mL)、80mg グリセロール、1.85mL 70 mM Na2PO4を含有する2.25mL
のリン酸ナトリウム緩衝液(pH 8.0)を添加し、水を用いて体積を5mLに調整した
。この第２の混合物のｐＨは約５〜６であり、LysB29(AOA)des(B30)インスリン
およびプロタミンの非晶質の沈殿物が形成された。ｐＨを、1N NaOHを用いて7.3
に調整した。室温で静置するとLysB29(AOA)des(B30)インスリン-プロタミンの結
晶が出現した。
【００９４】 例17 LysB29(Nε-(γ-グルタミル-Nα-リトコロイル)，LysB30(Nε-3-ニトロ
-5-ボロノベンゾイル)ヒトインスリン，17 3-ニトロ-5-ボロノ安息香酸(Combi Blocks, San Diego, USA)を、THFおよびMg
SO4中のピナコルと反応させた。得られた3-ニトロ-5-ピナコルボロノ安息香酸を
、THF中のN-ヒドロキシスクシンイミドおよびDCCと反応させた。スクシンイミド
エステルを、DMF中のNα-tert-ブチルオキシカルボニル-リジン(Bachem)および
トリエチルアミンと反応させた。得られたNα-tert-ブチルオキシカルボニル、Nε -3-ニトロ-5-ピナコルボロノ-リジンを10：1のメタノールおよび塩化トリメチ
ルシリルを用いて処理し、Nε-3-ニトロ-5-ピナコルボロノベンゾイルメチルリ
ジネート，塩酸塩を得た：1H-NMR(CDCl3)δ：8.84(dd，1H，ArH)，8.71(bd，3H
，NH3 +)，8.61(dd，1H，ArH)，8.54(dd，1H，ArH)，7.98(s，1H，NH)，4.17(m，
1H，αCH)，3.75(s，3H，CH3)，3.48(m，2H，CH2N)，2.09(m，2H，CH2)，1.72(m
，3H，βCH+CH2)，1.57(m，1H，βCH')，1.31(s，12H，ピナコリル)。
【００９５】
【化１８】 このアミノ酸誘導体を、NMP-水中のアクロモバクターリティカス・プロテアー
ゼ(Morihara and Ueno, Biotech. Bioeng. 1991, 37, 693)を用いて、des(B30)
ヒトインスリン中のLysB29のカルボン酸基とカップリングさせ、17aを得た(収率
：70％。ESMSにより見出されたMw：6041(理論値：6041))。続いて、LysB29のε-
アミノ基を、pH 10のアセトニトリル-水中のγ-N-ヒドロキシスクシンイミジル
α-メチルグルタミル-Nα-リトコレートを用いて選択的にアシル化し(US 5,646,
242)、メチルエステルを鹸化して構造17を得た(収率：53％。ESMSにより見出さ
れたMw：6513(理論値：6515))。
【００９６】
【化１９】
【化２０】 例18 LysB29(Nε-(γ-グルタミル-Nα-リトコロイル)，OrnB30(Nε-3-ニトロ
-5-ボロノベンゾイル)ヒトインスリン，18 17のOrnB30類縁体を、17の調製のために用いた方法に対応する方法により調製
した。
【００９７】 Nε-3-ニトロ-5-ピナコルボロノベンゾイル、メチルオルニテート，塩酸塩：1 H-NMR(CDCl3)δ：8.82(dd，1H，ArH)，8.71(bd，3H，NH3 +)，8.59(dd，1H，ArH)
，8.54(dd，1H，ArH)，8.07(s，1H，NH)，4.26(m，1H，αCH)，3.72(s，3H，CH3 )，3.51(m，2H，CH2N)，2.16(m，2H，CH2)，1.89(m，2H，CH2)，1.32(s，12H，
ピナコリル)。
【００９８】
【化２１】 18a，収率：59％。ESMSにより見出されたMw：6028(理論値：6027)。
【００９９】 18，収率：62％。ESMSにより見出されたMw：6501(理論値：6501)。
【０１００】
【化２２】 例19 LysB29(Nε-(γ-グルタミル-Nα-リトコロイル)，DapB30(Nε-3-ニトロ
-5-ボロノベンゾイル)ヒトインスリン，19 17のDapB30類縁体を、17の調製のために用いた方法に対応する方法により調製
した。
【０１０１】 Nε-3-ニトロ-5-ピナコルボロノベンゾイル、ジアミノプロピオン酸メチル，
塩酸塩：1H-NMR(CDCl3)δ：8.90(dd，1H，ArH)，8.84(bd，3H，NH3 +)，8.68(dd
，1H，ArH)，8.55(dd，1H，ArH)，6.25(s，1H，NH)，4.55(m，1H，αCH)，4.26(
m，1H，βCH)，4.07(m，1H,βCH')，1.32(s，12H，ピナコリル)。
【０１０２】
【化２３】 19a，収率：60％。ESMSにより見出されたMw：6000(理論値：5999)。
【０１０３】 19，収率：56％。ESMSにより見出されたMw：6473(理論値：6473)。
【０１０４】
【化２４】 例20 LysB29(Nε-(γ-グルタミル-Nα-リトコロイル)，LysB30(Nε-4-ボロノ
ベンゾイル)ヒトインスリン，20 4-ピナコルボロノ安息香酸(Aldrich Fine Chemicals)を、THF中のN-ヒドロキ
シスクシンイミドおよびDCCと反応させた。スクシンイミドエステルをDMF中のN
α-tert-ブチルオキシカルボニル-リジン(Bachem)およびトリエチルアミンと反
応させた。得られたNα-tert-ブチルオキシカルボニル、Nε-4-ピナコルボロノ-
リジンを、10：1のメタノールおよび塩化トリメチルシリルを用いて処理し、Nε -4-ピナコルボロノベンゾイル、メチルリジネート，塩酸塩を得た：1H-NMR(CDCl3 )δ：9.04(bs，1H，NH)，8.71(bs，3H，NH3 +)，7.90(d，2H，ArH)，7.80(d，2H
，ArH)，4.13(m，1H，αCH)，3.74(s，3H，CH3)，3.47(m，2H，CH2N)，2.69(m，
2H，CH2)，2.07(m，2H，CH2)，1.67(m，3H，βCH＋CH2)，1.54(m，1H，βCH)，1
.32(s，12H，ピナコリル)。
【０１０５】
【化２５】 このアミノ酸誘導体を、アクロモバクターリティカス・プロテアーゼ(Morihar
a and Ueno, Biotech. Bioeng. 1991, 37, 693)を用いて、des(B30)ヒトインス
リン中のLysB30のカルボン酸基にカップリングさせ、20aを得た(収率：53％。ES
MSにより見出されたMw：6000)。続いて、LysB29のε-アミノ基を、γ-N-ヒドロ
キシスクシンイミジルα-メチル グルタミル-Nα-リトコレート(US 5,646,242)
を選択的に用いてアシル化し、メチルエステル基を鹸化して構造20を得た(収率
：61％。ESMSにより見出されたMw：6470)。
【０１０６】
【化２６】
【化２７】 例21 LysB29(Nε-(γ-グルタミル-Nα-リトコロイル)，OrnB30(Nε-4-ボロノ
ベンゾイル)ヒトインスリン，21 OrnB30類縁体20を、20の調製に用いられた方法に対応する方法により調製した
。Nε-4-ピナコルボロノベンゾイル，メチルオルタテート，塩酸塩：1 H-NMR(CDCl3)δ：8.90(bs，1H，NH)，8.69(bs，3H，NH3 +)，7.88(d，2H，ArH)
，7.80(d，2H，ArH)，4.21(m，1H，αCH)，3.69(s，3H，CH3)，3.50(m，2H，CH2 N)，2.66(m，2H，CH2)，2.12(m，1H，βCH)，1.88(m，1H，βCH)，1.29(s，12H
，ピナコリル)。
【０１０７】
【化２８】 21a，収率：56％。ESMSにより見出されたMw：5983(理論値：5985)。
【０１０８】 21，収率：62％。ESMSにより見出されたMw：6456(理論値：6456)。
【０１０９】
【化２９】 LysB29(Nε-(γ-グルタミル-Nα-リトコロイル)，DabB30(Nε-4-ボロノベンゾ
イル)ヒトインスリン，22 20のDabB30類縁体を、20の調製に用いた方法に対応する方法により調製した。
【０１１０】 Nε-4-ピナコルボロノベンゾイル，ジアミノ酪酸メチル，塩酸塩：1 H-NMR(CDCl3)δ：8.96(bs，1H，NH)，8.88(bs，3H，NH3 +)，7.87(d，2H，ArH)
，7.77(d，2H，ArH)，4.29(m，1H，αCH)，3.75(m，1H，CHN)，3.64(m，1H，CH'
N)，3.56(s，3H，CH3)，2.47(m，2H，βCH)，1.31(s，12H，ピナコリル)。
【０１１１】
【化３０】 22a，収率：71％。ESMSにより見出されたMw：5969(理論値：5973)。
【０１１２】 22，収率：59％。ESMSにより見出されたMw：6442(理論値：6442)。
【０１１３】
【化３１】 例23 LysB29(Nε-(γ-グルタミル-Nα-リトコロイル)，OrnB30(Nε-4-ボロノ
ベンゼンスルホニル)ヒトインスリン，23 塩化4-ブロモベンゼンスルホニル(Aldrich Fine Chemicals)を、DMFおよびTEA
中のNα-tert-ブチルオキシカルボニルメチルオルニテートアセテート(Chemlmpe
x、Illinois, USA)と反応させた。得られた臭化物を、ジオキサン中の酢酸カリ
ウムを含んだ中のbis(ピナコル)ジボロンおよび1,1'-ビス(ジフェニルホスフィ
ノ)フェノセンジクロロパラジウム(II)(Ishiyama et al. J. Org. Chem. 1995,6
0,7508)と反応させた。得られたNα-tert-ブチルオキシカルボニル、Nε-(4-ピ
ナコルボロノ-ベンゼンスルホニル)-リジンを、10：1のメタノールおよび塩化ト
リメチルシリルを用いて処理し、Nε-(4-ピナコルボロノ-ベンゼンスルホニル)
，メチルオルニテート，塩酸塩を得た：1H-NMR(DMSO-d6)δ：8.57(bs，3H，NH3 + )，7.87(dd，4H，ArH)，6.66(t，1H，NHSO2)，4.31(m，1H，αH)，3.77(s，3H，
CH3)，2.93(m，2H，CH2N)，2.15(m，2H，CH2)，1.85(m，1H，βCH)，1.75(m，1H
，βCH')，1.34(s，12H，ピナコリル)。
【０１１４】
【化３２】 このアミノ酸誘導体を、アクロモバクターリティカス・プロテアーゼ(Morihar
a and Ueno, Biotech. Bioeng. 1991, 37, 693)を用いてdes(B30)ヒトインスリ
ン中のLysB29のカルボン酸基とカップリングさせ、メチルエステルを鹸化して23
aを得た(収率：30％。ESMSにより見出されたMw：6006(理論値：6005))。続いて
、γ-N-ヒドロキシスクシンイミジルα-メチルグルタミル-Nα-リトコレート(US
5,646,242)を用いてLysB29のε-アミノ基を選択的にアシル化し、Glu メチルエ
ステルを鹸化して構造23を得た(収率：51％。ESMSにより見出されたMw：6493(理
論値：6492))。
【０１１５】
【化３３】 例24 LysB29(Nε-(γ-グルタミル-Nα-リトコロイル)，LysB30(Nε-4-ボロノ
ベンゼンスルホニル)ヒトインスリン，24 23のLysB30類縁体を、23の調製のために用いた方法に対応する方法により調製
した。
【０１１６】 Nε-(4-ピナコルボロノ-ベンゼンスルホニル)，メチルリジネート，塩酸塩：1H-
NMR(CDCl3)δ：8.59(bs，2H，NH)，7.89(m，4H，ArH)，4.28(m，1H，αH)，3.81
(s，3H，CH3)，2.93(m，2H，CH2N)，2.09(m，2H，CH2)，1.76(m，1H，βCH)，1.
58(m，3H，CH2＋βCH')，1.34(s，12H，ピナコリル)。
【０１１７】
【化３４】 24a，収率：53％。ESMSにより見出されたMw：6022(理論値：6020)。
【０１１８】 24，収率：60％。ESMSにより見出されたMw：6507(理論値：6506)。
【０１１９】
【化３５】
【化３６】 例25 LysB29(Nε-(γ-グルタミル-Nα-リトコロイル)，LysB30(Nε-2,5-ジフ
ルオロ-4-ボロノベンゼンスルホニル)ヒトインスリン，25 23のLysB30(Nε-4-ボロノ-2,5-ジフルオロ-ベンゼンスルホニル)類縁体を、23
の調製のために用いた方法に対応する方法により調製した。
【０１２０】 Nε-(2,5-ジフルオロ-4-ピナコルボロノ-ベンゼンスルホニル)，メチルリジネー
ト，塩酸塩：1H-NMR(CDCl3)δ：8.42(m，3H，NH3 +)，7.49(m，2H，ArH)，6.40(t
，1H，NHSO2)，4.21(m，1H，αH)，3.82(s，3H，CH3)，3.05(m，2H，CH2N)，2.0
5(m，2H，CH2)，1.65(m，4H，2×CH2)，1.34(s，12H，ピナコリル)。
【０１２１】
【化３７】 25a，収率：71％。ESMSにより見出されたMw：6055(理論値：6054)。
【０１２２】 25，収率：59％。ESMSにより見出されたMw：6542(理論値：6542)。
【０１２３】
【化３８】
【化３９】 例26 LysB29(Nε-(γ-グルタミル-Nα-リトコロイル)，LysB30(N'-(3-ニトロ
-5-ボロノ-ベンゾイル)-1,4-フェニレンジアミン)ヒトインスリンアミド，26 N-(tert-ブチルオキシカルボニル)-フェニレンジアミン(Aldrich)を、THF中の
N-スクシンイミジル-3-ニトロ-5-ピナコルボロノベンゾエートと反応させた（例
16を参照のこと）。TFAを用いてBoc-基を除去し、N'-(3-ニトロ-5-ボロノ-ベン
ゾイル)-1,4-フェニレンジアミン，トリフルオロ酢酸塩を得た：1 H-NMR(DMSO-d6)δ：10.78(s，1H，NH)，8.89(s，1H，ArH)，8.63(s，1H，ArH)
，8.54(s，1H，ArH)，7.84(d，2H，ArH)，7.28(d，2H，ArH)，1.34(s，12H，ピ
ナコリル)。
【０１２４】
【化４０】 このアニリン誘導体を、アクロモバクターリティカス・プロテアーゼ(Morihar
a and Ueno, Biotech. Bioeng. 1991, 37, 693)を用いて、des(B30)ヒトインス
リン中のLysB29のカルボン酸基とカップリングさせ、26aを得た(収率：4％。ESM
Sにより見出されたMw：5990(理論値：5990))。続いて、α-メチルグルタミル-N-
リトコール酸γ-N-ヒドロキシスクシンイミジル(US 5,646,242)を用いてLysB29
のε-アミノ基を選択的にアシル化し、メチルエステル基を鹸化して構造26を得
た(収率：25％。ESMSにより見出されたMw：6478(理論値：6477))。
【０１２５】
【化４１】 例27 ProB0-(Nα-(2-ボロノ-ベンジル)ヒトインスリン，27 tert-ブチル プロリネート(Aldrich)を、エーテルおよびTEA中の2-(ピナコル
ボロノ)ベンジルブロミド(Combi Blocks, CA, USA)と反応させた。tert-ブチル
基をTFAを用いて除去し、アミノ酸を、DCCおよびTHF中のN-ヒドロキシスクシン
イミドと反応させ、N-(2-ピナコルボロノベンジル)，O-スクシンイミジル プロ
リネートを得た：1 H-NMR(CDCl3)δ：7.69(d，1H，ArH)，7.41(d，1H，ArH)，7.34(t，1H，ArH)，7
.20(t，1H，ArH)，4.07(s，2H，ArCH2)，3.77(m，1H，αCH)，3.16(m，2H，CH2N
)，2.91(m，1H，βCH)，2.77(s，4H，スクシニル)，2.70(m，1H，βCH')，2.15(
m，2H，CH2)，1.30(s，12H，ピナコリル)。
【０１２６】
【化４２】 活性エステルを、DMSO中の(GlyA1、LysB29-diBoc)ヒトインスリンとカップリ
ングさせ、TFAを用いて保護基を開裂し、27を得た(ESMSにより見出されたMw：65
27(理論値：6526))。
【０１２７】
【化４３】 例28 ProB0-(3-ニトロ-5-ボロノ-ベンゾイル)ヒトインスリン，28 ProB0-(3-ニトロ-5-ボロノ-ベンゾイル)ヒトインスリン，28を、27の調製に用
いた方法と同様の方法により調製した。
【０１２８】 O-スクシンイミジル-3-ニトロ-5-ピナコールボロノ-ベンゾエート：1H-NMR(CDCl3 )δ：9.00(dd，1H，ArH)，8.90(dd，1H，ArH)，8.83(dd，1H，ArH)，2.93(s，4
H，スクシニル)，1.37(s，12H，ピナコリル)。
【０１２９】
【化４４】 28，(収率：51％。ESMSにより見出されたMw：6488(理論値：648))。
【０１３０】
【化４５】 例29 LysB29(Nε-(γ-グルタミル-Nα-リトコロイル)，LysB30(Nε-イソプロ
ピル，Nε-(2-ボロノ)ベンジル)ヒトインスリン，29 Nα-tert-ブチルオキシカルボニル-Nε-イソプロピルリジン(Senn Chem)を、
エタノール中のトリメチルシリルジアゾメタンと反応させた。得られたメチルエ
ステルアミンをエーテルおよびTEA中の臭化2-(ピナコルボロノ)ベンジルと反応
させ、Nα-tert-ブチルオキシカルボニル、Nε-イソプロピル、Nε-(2-ピナコル
ボロノベンジル)メチルリジネートを得た：1H-NMR(CDCl3)δ：7.68(d，1H，ArH)
，7.57(d，1H，ArH)，7.34(t，1H，ArH)，7.18(t，1H，ArH)，4.94(bd，1H，NH)
，4.23(m，1H，αH)，3.78(s，2H，ArCH2)，3.70(s，3H，CH3)，2.89(hept，1H
，CHMe2)，2.39(m，2H，CH2N)，1.65(m，2H，CH2)，1.53(m，2H，CH2)，1.44(s
，9H，Boc)，1.35(s，12H，ピナコリル)。
【０１３１】 10：1のメタノールおよび塩化トリメチルシリルを用いて処理し、Nε-イソプ
ロピル、Nε-(2-ピナコルボロノベンジル)，メチルリジネート，ジヒドロクロラ
イドを得た。
【０１３２】
【化４６】 このアミノ酸誘導体を、アクロモバクターリティカス・プロテアーゼ(Morihar
a and Ueno, Biotech. Bioeng. 1991, 37, 693)を用いて、des(B30)ヒトインス
リン中のLysB29のカルボン酸基とカップリングさせ、メチルエステル基を鹸化し
て29aを得た(収率：32％。ESMSにより見出されたMw：6011(理論値：6011))。続
いて、γ-N-ヒドロキシスクシンイミジルα-メチルグルタミル-Nα-リトコレー
ト(US 5,646,242)を用いてLysB29のε-アミノ基 選択的にアシル化し、Glu メチ
ルエステル基を鹸化して構造29を得た(収率：79％。ESMSにより見出されたMw：6
498(理論値：6498))。
【０１３３】
【化４７】
【化４８】 例30 LysB29(Nε-(γ-グルタミル-Nα-リトコロイル)，LysB30(Nε-メチル，
Nε-(2-ボロノ)ベンジル)ヒトインスリン，30 Nα-tert-ブチルオキシカルボニル-リジンを、エタノール中のトリメチルシリ
ルジアゾメタンと反応させた。得られたメチルエステルアミンを、ベンズアルデ
ヒド、ホウ化水素ナトリウム、ホルムアルデヒド、および水素化ホウ素ナトリウ
ム、ならびに水素化分解(Andruszkiewicz, J. Pol. Chem. 1988. 62. 257)を介
してNε-メチル誘導体に変換し、続いて2-(ピナコルボロノ)ベンジルブロミドを
用いたN-アルキル化を行った。得られたNα-tert-ブチルオキシカルボニル、Nε
-メチル、Nε-(2-ピナコルボロノベンジル)メチルリジネートを10：1のメタノー
ルおよび塩化トリメチルシリルを用いて処理し、Nε-メチル、Nε-(2-ボロノベ
ンジル)，メチルリジネート，ジヒドロクロライドを得た：1H-NMRδ(DMSO-d6 ＋
1dr．DCl/D2O)7.77(d，1H，ArH)，7.58(d，1H，ArH)，7.47(m，2H，ArH)，4.68(
d，1H，ArCH)，4.30(d，1H，ArCH')，4.03(m，1H，αCH)，3.78(s，3H，OCH3)，
3.11(m，2H，NCH2)，2.62(s，3H，NCH3)，1.88(m，2H，CH2)，1.79(m，2H，CH2)
，1.40(m，2H，CH2)。LCMSにより見出されたMw：309.2(M＋H+)。
【０１３４】
【化４９】 このアミノ酸誘導体を、アクロモバクターリティカス・プロテアーゼ(Morihar
a and Ueno, Biotech. Bioeng. 1991, 37, 693)を用いて、des(B30)ヒトインス
リン中のLysB29のカルボン酸基とカップリングさせ、メチルエステル基を鹸化し
て30aを得た(収率：58％。ESMSにより見出されたMw：5983(理論値：5983))。続
いてLysB29のε-アミノ基を、γ-N-ヒドロキシスクシンイミジルα-メチルグル
タミル-Nα-リトコレート(US 5,646,242)を用いて選択的にアシル化し、Glu メ
チルエステル基を鹸化して構造30を得た(収率：12％。ESMSにより見出されたMw
：6470(理論値：6470))。
【０１３５】
【化５０】
【化５１】 例31 LysB29(Nε-(γ-グルタミル-Nα-リトコロイル)，DabB30(Nε-メチル，
Nε-(2-ボロノ)ベンジル)ヒトインスリン，31 30のDabB30類縁体を，30の調製に用いた方法に対応する方法により調製した。
【０１３６】 Nε-メチル，Nε-(2-ボロノベンジル)，メチルジアミノブチラート，ジヒドロク
ロライド：1H-NMR δ(DMSO-d6 ＋1dr．DCl/D2O)7.78(d，1H，ArH)，7.60(d，1H
，ArH)，7.47(m，2H，ArH)，4.69(d，1H，ArCH)，4.36(d，1H，ArCH')，4.22(m
，1H，αCH)，3.78(s，3H，OCH3)，3.36(m，2H，NCH2)，2.80(s，3H，NCH3)，2.
40(m，2H，CH2)。LCMSにより見出されたMw：281.0(M＋H+)。
【０１３７】
【化５２−１】 31a，(収率：23％。ESMSにより見出されたMw：5955(理論値：5955))。
【０１３８】 31，(収率：62％。ESMSにより見出されたMw：6442(理論値：6442))。
【０１３９】
【化５２−２】 例32 LysB29(Nε-(γ-グルタミル-Nα-リトコロイル)，AspB30(β-(N'-(2-ボ
ロノベンジル)ピペラジノ))ヒトインスリン，32 N'-tert-ブチルオキシカルボニル-ピペラジン(Aldrich)を、エーテルおよびTE
A中の臭化2-(ピナコルボロノ)ベンジルと反応させた。Boc-基を除去し、アミン
を、DMF中のカルボニルジイミダゾールを用いてNα-tert-ブチルオキシカルボニ
ルα-tert-ブチルアスパルテートとカップリングさせた。得られたアスパルテー
トを、TFA、続いて10：1のメタノールおよび塩化トリメチルシリルを用いて処理
し、β-(N'-(2-ボロノベンジル)ピペラジン))メチルアスパルテート、ジヒドロ
クロライドを得た：1H-NMR(D2O-MeOD)δ：7.77(d，1H，ArH)，7.50(m，2H，ArH)
，7.41(t，1H，ArH)，4.47(s，2H，ArCH2)，4.37(m，1H，αCH)，3.726(s，3H，
CH3)，3.13(m，2H，CH2)。
【０１４０】
【化５３】 このアミノ酸誘導体を、アクロモバクターリティカス・プロテアーゼ(Morihar
a and Ueno, Biotech. Bioeng. 1991, 37, 693)を用いてdes(B30)ヒトインスリ
ン中のLysB29のカルボン酸基とカップリングさせ、メチルエステル基を鹸化して
32aを得た(収率：47％。ESMSにより見出されたMw：6025(理論値：6024))。続い
て、LysB29のε-アミノ基を、γ-N-ヒドロキシスクシンイミジルα-メチルグル
タミル-Nα-リトコレート(US 5,646,242)およびGluを選択的に用いてアシル化し
、メチルエステル基を鹸化して構造32を得た(収率：50％。ESMSにより見出され
たMw：6510(理論値：6511))。
【０１４１】
【化５４】
【化５５】 例33 LysB29(Nε-(γ-グルタミル-Nα-リトコロイル)，GluB30(β-(N'-(2-ボ
ロノベンジル)ピペラジノ))ヒトインスリン，33 32のGluB30類縁体を、32の調製のために用いた方法に対応する方法により調製
した。
【０１４２】 γ-(N'-(2-ボロノベンジル)ピペラジン))メチルグルタメート、ジヒドロクロラ
イド：1H-NMR(D2O)δ：7.74(d，1H，ArH)，7.45(m，2H，ArH)，7.39(t，1H，ArH
)，4.44(s，2H，ArCH2)，4.07(m，1H，αCH)，3.72(s，3H，CH3)，2.54(m，2H，
CH2)，1.65(m，2H，CH2)，2.13(m，2H，CH2)。
【０１４３】
【化５６】 33a，(収率：28％。ESMSにより見出されたMw：6039(理論値：6038))。
【０１４４】
【化５７】 例34 LysB29-(Nε-(3-ニトロ-5-ボロノ-ベンゾイル)ヒトインスリン，34 O-スクシンイミジル-3-ニトロ-5-ピナコルボロノ-ベンゾエートを，3-ニトロ-
5-ピナコルボロノ安息香酸およびTHF中のHONSuおよびDCCから作製した。1H-NMR(
CDCl3)δ：9.00(dd，1H，ArH)，8.90(dd，1H，ArH)，8.83(dd，1H，ArH)，2.93(
s，4H，スクシニル))，1.37(s，12H，ピナコリル)。
【０１４５】
【化５８】 この物質を、アセトニトリル／水中のdes(B30)ヒトインスリンとカップリングさ
せ、34を得た(ESMSにより見出されたMw：6001(理論値：6001))。
【０１４６】
【化５９】 例35 LysB29-(Nε-(4-ボロノ-ベンゾイル)ヒトインスリン，35 O-スクシンイミジル-4-ピナコルボロノ-ベンゾエートを、4-ピナコルボロノ安
息香酸および、THF中のHONSuおよびDCCから作製した。
【０１４７】1 H-NMR(CDCl3)δ：7.68(d，1H，ArH)，7.57(d，1H，ArH)，7.34(t，1H，ArH)，7
.18(t，1H，ArH)，4.94(bd，1H，NH)，4.23(m，1H，αH)，3.78(s，2H，ArCH2)
，3.70(s，3H，CH3)，2.89(hept，1H，CHMe2)，2.39(m，2H，CH2N)，1.65(m，2H
，CH2)，1.53(m，2H，CH2)，1.44(s，9H，Boc)，1.35(s，12H，ピナコリル)。
【０１４８】
【化６０】 O-スクシンイミジル-4-ピナコルボロノ-ベンゾエートを用いて、des(B30)ヒト
インスリン中のLysB29のε-アミノ基の選択的アシル化により、35を得た(ESMSに
より見出されたMw：5956(理論値：5855))。
【０１４９】
【化６１】 例36 B30-Ams(Boc)-モルホリドヒトインスリン，36 Fmoc-Ams(Boc)(Speztler and Hoeg-Jensen, J. Peptide Sci, 1999, 5, 582)
を、THF中のDCCを用いてモルホリンにカップリングさせた。Fmoc-基を、THF-水
中のLiOHを用いて除去し、Ams(Boc)-モルホリドを得た。
【０１５０】1 H-NMR(CDCl3)δ：7.72(bs，2H，NH2)，3.97(m，3H)，3.77(m，1H)，3.61(m，8H
)，1.45(m，9H)。
【０１５１】
【化６２】 この物質を、アクロモバクターリティカス・プロテアーゼ(Morihara and Ueno
, Biotech. Bioeng. 1991, 37, 693)を用いてdes(B30)ヒトインスリン中のLysB2
9のカルボン酸基とカップリングさせ、36を得た(収率：65％。ESMSにより見出さ
れたMw：5980(理論値：5978))。
【０１５２】
【化６３】 例37 Nε-(2-ボロノベンジル)メチルオルニチネート，37 Nα-tert-ブチルオキシカルボニル-オルニチンをメタノール−トリエチルアミ
ン中の2-ホルミルフェニルボロン酸と反応させ、続いて、ホウ化水素ナトリウム
を用いて処理した(Wiskur et al, Org. Letters 2001, 3, 1311)。得られた二次
アミンを、10：1のメタノールおよび塩化トリメチルシリルを用いた処理により
メチルエステルに変換し、Nε-(2-ボロノベンジル)、メチルオルニチネート、二
塩酸塩を得た。
【０１５３】1 H-NMRδ(DMSO-d6)7.69(d，1H，ArH)，7.56(d，1H，ArH)，7.41(m，2H，ArH)，4
.28(d，1H，ArCH2)，4.05(m，1H，αCH)，3.76(s，3H，OCH3)，2.91(m，2H，NCH2 )，1.87(m，4H，2CH2)。LCMSにより見出されたMw：263.0(M-H2O＋H+)。
【０１５４】
【化６４】 例38 Nε-(2-ボロノベンジル)メチルリジネート，38 Nα-tert-ブチルオキシカルボニル-リジンを、メタノール-トリエチルアミン
中の2-ホルミルフェニルボロン酸と反応させ、続いて、ホウ化水素ナトリウムを
用いて処理した(Wiskur et al, Org. Letters 2001, 3, 1311)。得られた二次ア
ミンを、10：1のメタノールおよび塩化トリメチルシリルを用いた処理によりメ
チルエステルに変換させ、Nε-(2-ボロノベンジル)、メチルリジネート、ジヒド
ロクロライドを得た。
【０１５５】1 H-NMRδ(DMSO-d6)7.79(d，1H，ArH)，7.53(d，1H，ArH)，7.40(m，2H，ArH)，4
.46(d，1H，ArCH2)，3.99(m，1H，αCH)，3.74(s，3H，OCH3)，2.85(m，2H，NCH2 )，1.80(m，2H，CH2)，1.67(m，2H，CH2)，1.40(m，2H，CH2)。LCMSにより見出
されたMw：277.1(M-H2O＋H+)。
【０１５６】
【化６５】 例39 例23の記載に従って合成したLysB29(Nε-(γ-グルタミル-Nα-リトコロ
イル)，OrnB30(Nε-4-ボロノベンゼンスルホニル)ヒトインスリンの溶液600nmol
/mLを含む薬学的組成物 4.8mgのインスリン誘導体23を、400μL 水中に氷槽で懸濁し、8μL 1N 水酸化
ナトリウムを添加することにより溶解させた。さらに，36μL 0.01M 酢酸亜鉛(
インスリン当り0.5亜鉛に対応する)、300μL 水、60μL 0.32M フェノール、120
μL 0.16M m-クレゾール、84μL 0.1M リン酸ナトリウム、300μL 0.5M 塩化ナ
トリウムを添加した。次いで室温にて、7μL 0.2M 塩酸により溶液のｐＨ値を7.
6に調整した。最後に水を添加して1.2mLにし、得られた溶液を濾過により消毒し
、無菌状態でカートリッジに移した。
【０１５７】 例40 例19の記載に従って合成したLysB29(Nε-(γ-グルタミル-Nα-リトコロ
イル)，DapB30(N-3-ニトロ-5-ボロノベンゾイル)ヒトインスリンの溶液600 nmol
/mLを含む薬学的組成物 10mgのインスリン誘導体19を、600μL 水に氷槽で懸濁し、10μL 1N 水酸化ナ
トリウムを添加することにより溶解させた。さらに、75μL 0.01M 酢酸亜鉛(イ
ンスリン当り0.5亜鉛に対応する)、500μL水、125μL 0.32M フェノール、250μ
L 0.16M m-クレゾール、175μL 0.1M リン酸ナトリウム、500μL 0.5M 塩化ナト
リウムを添加した。次いで、室温にて、10μL 0.2M 塩酸によって、溶液のpH値
を、7.6に調整した。最後に水を添加して2.5mLにし、得られた溶液を濾過により
殺菌し、無菌状態でカートリッジに移した。
【０１５８】 例41 例19の記載に従って合成したLysB29(Nε-(γ-グルタミル-Nα-リトコロ
イル)，DapB30(Nε-3-ニトロ-5-ボロノベンゾイル)ヒトインスリンの、ブタにお
ける遅延性試験 例40の記載に従って処方剤を調製し、Tyr(1251)A84 トレーサーを、インスリ
ン誘導体19の溶解の直後に添加した。この処方剤100μLを5匹のブタの首の一方
の側に皮下注射すると共に、参照処方剤を5匹のブタの首の他方の側に皮下注射
し、それらデポー剤の消失を外部γ-計測器により計測した。T50% は、インスリ
ン誘導体19で13.4時間であり、参照化合物のNB29ミリストイルdes(B30)ヒトイン
スリン（Ribel, U. et al., The Pig as a Model for Subcuta-neous Absorptio
n in Man。出典：M. Serrano-RiosおよびP.J. Lefebre(Eds.)：Diabetes 1985；
国際糖尿病連盟第12回会議の議事録，マドリッド，スペイン，1985年（Exceptra
Medica, Amsterdam, (1986, 891-896)) (Havelund, S et el., Acylated INsul
in, WO 95/07931(Novo Nordisk)）では9.2時間であった。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、一つの結合だけを含む機構と比較したときに、インスリン６量体間の
複数の相互作用によって、インスリンの放出とグルコース濃度との間の急峻な相
関関係が可能であることを示している。
【図２】 図２は、Biacore（登録商標）グルカミンセンサチップ上でのグルコース結合
性インスリン誘導体17aの会合および解離を示している。RUは応答単位である。
【図３】 図３は、Biacore（登録商標）グルカミンセンサチップからの、本発明による
多くのグルコース検知性インスリン誘導体のグルコース置換曲線を示している。
【図４】 図４は、下記（ａ）〜（ｄ）により37℃で溶出された、Bio-Gel P300上でのゲ
ル濾過試験における、LysB29（Nε-(γ-グルタミル-Nα-リソコロイル)-DapB30(
Nε-3-ニトロ-5-ボロンベンゾイル)ヒトインスリン（例19の表題化合物）の凝集
試験の結果を示している。 （ａ）塩化ナトリウム100 mM、リン酸ナトリウム5 mM、ナトリウムアジド0.01
％と共に保存し、pH7.4まで塩酸を加えた（実線）、 （ｂ）塩化ナトリウム25 mM、リン酸ナトリウム5 mM、ナトリウムアジド0.01
％と共に保存し、pH8.0まで塩酸を加えた（破線）、 （ｃ）塩化ナトリウム25 mM、リン酸ナトリウム5 mM、ナトリウムアジド0.01
％と共に保存し、pH8.0まで塩酸を加え、グルコース20 mMを加えた（点線）、 （ｄ）塩化ナトリウム25 mM、リン酸ナトリウム5 mM、ナトリウムアジド0.01
％と共に保存し、pH8.0まで塩酸を加え、グルコース200 mMを加えた（点線）、 AUは吸収単位である
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１４年６月１日（２００２．６．１）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【化１】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＣ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ， ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，Ｐ Ｔ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 マルクッセン、ヤン デンマーク国、ディーケー−2730 ヘルレ ブ、キクドバッケン ７ (72)発明者 オスターガールド、ソレン デンマーク国、ディーケー−2700 ブロン スホイ、ボルレビーベイ 21 (72)発明者 リッダーベルグ、シグネ デンマーク国、ディーケー−2800 リング ビー、シー37、ニイブロベイ 304 (72)発明者 バルシュミット、ペール デンマーク国、ディーケー−3060 エスペ ルゲルデ、ティベループ・アレ 20 (72)発明者 シェーファー、ラウゲ デンマーク国、ディーケー−2100 コベン ハブン・オー、ホルネマンスガーデ 12 (72)発明者 ヨナッセン、イブ デンマーク国、ディーケー−2500 バルビ ー、キルケベンゲット ２ Ｆターム(参考） 4C076 AA16 AA94 BB11 CC30 FF31 FF70 4C084 AA02 AA07 BA01 BA08 BA19 BA20 BA23 CA59 DB34 MA17 MA21 MA66 NA12 NA20 ZC35 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 BA50 BA51 DA37 EA20 EA30 FA50

Claims (32)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 グルコース検知基を含むインスリン誘導体。
  2. 【請求項２】 天然のインスリンの誘導体である、請求項１に記載のインス
    リン誘導体。
  3. 【請求項３】 インスリン類縁体の誘導体である、請求項１に記載のインス
    リン誘導体。
  4. 【請求項４】 グルコースに対して0.01μM〜10μMの親和性を有する、請求
    項１〜３の何れか１項に記載のインスリン誘導体。
  5. 【請求項５】 前記グルコース検知基がアリールボロネート基である、請求
    項１〜４の何れか１項に記載のインスリン誘導体。
  6. 【請求項６】 前記アリールボロネート基が電子吸引性置換基を有する、請
    求項５に記載のインスリン誘導体。
  7. 【請求項７】 前記電子吸引性置換基がスルホン、カルボキシ、ニトロ、シ
    アノ、およびフルオロからなる群から選択される、請求項６に記載のインスリン
    誘導体。
  8. 【請求項８】 2-アミノメチルアリールボロネートの形態で前記ボロネート
    基に近接したアミノ基を有する、請求項６に記載のインスリン誘導体。
  9. 【請求項９】 前記ホウ素原子から2.0オングストローム以内にアミノ基を
    有する、請求項６に記載のインスリン誘導体。
  10. 【請求項１０】 請求項５に記載のインスリン誘導体であって、前記アリー
    ルボロネート基は下記の中から選択され、ここでRは親油性置換基および任意の
    リンカーを含む分子のインスリン部分を意味し、またR'は水素、メチル、エチル
    、プロピル、イソプロピルまたはベンジルを意味するインスリン誘導体： 【化１】
  11. 【請求項１１】 請求項５に記載のインスリン誘導体であって、前記アリー
    ルボロネート基は、GlyA1もしくはPheB1のα-アミノ基を介して、或いは位置B3
    、B28、B29もしくはB30におけるLys残基のε-アミノ基または位置B30におけるOr
    n残基、Dap残基、Dab残基、Asp残基もしくはGlu残基を介してインスリン部分に
    結合しているインスリン誘導体。
  12. 【請求項１２】 請求項５に記載のインスリン誘導体であって、前記アリー
    ルボロネート基は、リンカーを介してインスリン部分に結合しているインスリン
    誘導体。
  13. 【請求項１３】 請求項１２に記載のインスリン誘導体であって、前記リン
    カーはγ-グルタミル、α-グルタミル、β-アスパルチル、α-アスパルチル、β
    -アラニン、ピペラジンまたはアニリンからなる群から選択されるインスリン誘
    導体。
  14. 【請求項１４】 請求項５に記載のインスリン誘導体であって、前記グルコ
    ース検知アリールボロネートは、インスリン部分の位置B26におけるアミノ酸残
    基の一部であるインスリン誘導体。
  15. 【請求項１５】 請求項１〜４の何れか１項に記載のインスリン誘導体であ
    って、前記グルコース検知基はペプチドもしくは偽性ペプチドであり、任意にAs
    n、Trp、His、Asp、Arg、またはボロネート含有アミノ酸を配列中に含むインス
    リン誘導体。
  16. 【請求項１６】 請求項１５に記載のインスリン誘導体であって、前記グル
    コース検知ペプチドはB鎖の残基26〜30以内に含まれており、任意にB鎖C末端残
    基30を越えて伸びているインスリン誘導体。
  17. 【請求項１７】 請求項１〜１３の何れか１項に記載のインスリン誘導体で
    あって、前記グルコース検知基は、高分子量凝集体の形成を行うことができる置
    換基の中に作り込まれているインスリン誘導体。
  18. 【請求項１８】 請求項１７に記載のインスリン誘導体であって、前記グル
    コース検知基はアリールボロネートであり、前記凝集を起こさせる置換基は親油
    性基であるインスリン誘導体。
  19. 【請求項１９】 請求項１８に記載のインスリン誘導体であって、前記親油
    性基は、リトコール酸、ヒオコール酸、ヒオデオキシコール酸、およびケノデオ
    キシコール酸からなる群から選択される胆汁酸誘導体であるインスリン誘導体。
  20. 【請求項２０】 請求項１９に記載のインスリン誘導体であって、前記親油
    性基は、γ-グルタミル、α-グルタミル、β-アスパルチル、α-アスパルチルま
    たはβ-アラニンスペーサを介してインスリン部分に結合されるインスリン誘導
    体。
  21. 【請求項２１】 請求項１８に記載のインスリン誘導体であって、前記親油
    性基は、10〜30の炭素原子を有するα,ω-ジカルボン酸誘導体であるインスリン
    誘導体。
  22. 【請求項２２】 グルコース検知基を有するインスリン誘導体に結合できる
    単糖、二糖、三糖もしくはポリオール基を有するインスリン誘導体。
  23. 【請求項２３】 請求項１〜２１の何れか１項に記載のインスリン誘導体で
    あって、前記グルコース検知基に加えて、単糖、二糖、三糖もしくはポリオール
    置換基を有するインスリン誘導体
  24. 【請求項２４】 請求項１〜２３の何れか１項に記載のインスリン誘導体ま
    たは該誘導体の混合物であって、＞150 kDaの分子量を有する水溶性の高分子凝
    集体を形成できるインスリン誘導体。
  25. 【請求項２５】 水溶性で遅延性のグルコース依存性薬学的組成物であって
    、請求項１〜２１の何れか１項に記載のインスリン誘導体、または該インスリン
    誘導体と請求項２２に記載のインスリン誘導体との混合物を含有してなる薬学的
    組成物。
  26. 【請求項２６】 グルコース依存性の放出プロファイルを有する可溶性かつ
    長期作用性のインスリン製剤であって、請求項１〜２３の何れか１項に記載のイ
    ンスリン誘導体、または該インスリン誘導体の混合物を含有してなる薬学的組成
    物。
  27. 【請求項２７】 可溶性で二相作用性のインスリン製剤であって、ヒトイン
    スリン、またはdes（B30）ヒトインスリン、もしくはAspB28ヒトインスリン、も
    しくはLysB28ProB29ヒトインスリン、もしくはGlyA21,LysB3,IleB28ヒトインス
    リン、もしくはAspA21,LysB3,IleB28ヒトインスリンのような作用発現が迅速な
    インスリンと10：1〜1：10の比率で混合された、請求項１〜２４の何れか１項に
    記載のインスリン誘導体を含有してなるインスリン製剤。
  28. 【請求項２８】 組織中のグルコース濃度が増大するに伴って増大し、また
    該グルコース濃度が減少するに伴って減少する注射されたデポー剤からの吸収率
    を有することを特徴とする、可溶性インスリン製剤。
  29. 【請求項２９】 請求項１〜２３の何れか１項に記載のインスリン誘導体の
    結晶性製剤。
  30. 【請求項３０】 本発明によるインスリン誘導体の医薬としての使用。
  31. 【請求項３１】 糖尿病の治療に使用するための組成物の製造における、本
    発明によるインスリン誘導体の使用。
  32. 【請求項３２】 糖尿病の治療を必要とする患者において糖尿病を治療する
    方法であって、前記患者に対して、薬学的に許容可能なキャリアと共に、治療的
    に有効な量の本発明によるインスリン誘導体を投与することを含んでなる方法。
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