JP2014139215A - 制御された薬物送達のための複合体に基づくシステム - Google Patents
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Abstract
【解決手段】薬物と第一の糖を含むリガンドとを含む複合体を哺乳類に投与したとき、少なくとも1つの複合体の薬物動態または薬力学的特性が、第二の糖の血清濃度に対し感受性を示すことを特徴とする複合体。例示的な複合体および徐放性製剤が、使用及び調製方法に加えて提供される。第一の糖が、グルコースであり、第二の糖がL−フコース、N−アセチルグルコサミン又は/及びα−メチルマンノースである複合体で、薬物の無い複合体の分子量が約10,000Da未満である、複合体。
【選択図】なし
Description
本出願は、2009年1月28日出願の米国仮特許出願第61/147,878号、2009年3月12日出願の米国仮特許出願第61/159,643号、2009年3月20日出願の米国仮特許出願第61/162,107号、2009年3月25日出願の米国仮特許出願第61/163,084号、2009年6月24日出願の米国仮特許出願第61/219,897号、2009年6月24日出願の米国仮特許出願第61/219,897号、2009年7月7日出願の米国仮特許出願第61/223,572号および2009年10月19日出願の米国仮特許出願第61/252,857号の優先権を主張し、これらそれぞれの内容全体は、参照により、本明細書に組み込まれる。
以下、本明細書全体で使用される特定の官能基、化学用語および一般用語との定義を、さらに詳細に記載する。本発明の目的のため、化学元素は、元素の周期表、CASバージョン、Handbook of Chemistry and Physics,第75編、表紙裏に従って表し、特定の官能基は、一般的に、本明細書に記載するように定義する。さらに、有機化学の一般原則および特定の官能部分および反応性は、Organic Chemistry,Thomas Sorrell,University Science Books,Sausalito,1999;SmithおよびMarch March’s Advanced Organic Chemistry,第5編,John Wiley & Sons社,New York,2001;Larock,Comprehensive Organic Transformations,VCH Publishers社,New York,1989;Carruthers,Some Modern Methods of Organic Synthesis,第3編,Cambridge University Press,Cambridge,1987に記載されている。
一態様において、本開示は、薬物と第一の糖を含むリガンドとを含む結晶性複合体を提供する。リガンド(または、複合体が複数のリガンドを含む場合は、複数のリガンド)は、複合体を哺乳類に投与した場合、少なくとも1つの複合体の薬物動態または薬力学的特性が、第二の糖の血清濃度に対し感受性を示すようなものである。ある実施形態では、複合体のPKおよび/またはPD特性は、グルコースのような内在性糖の血清濃度に対して感受性を示す。ある実施形態では、複合体のPKおよび/またはPD特性は、外因性糖、たとえば、マンノース、L−フコース、N−アセチルグルコサミンおよび/またはα−メチルマンノース(これらに限定されない)の血清濃度に対して感受性を示す。
種々の実施形態で、複合体(すなわち複合体化薬物および/または化学的または酵素的分解により複合体から放出された薬物)の薬物動態および/または薬力学的挙動は、糖の血清濃度の変化によって変更されてもよい。
一般的に、複合体は、少なくとも1種のリガンドを含む。ある実施形態では、複合体は、単一のリガンドを含む。ある実施形態では、複合体は、少なくとも2個の分離リガンド、たとえば、2、3、4、5個またはそれ以上のリガンドを含む。複数のリガンドが存在する場合、該リガンドは、同じまたは異なる化学構造を有してもよい。
R1は、それぞれ独立して、水素、−ORy、−N(Ry)2、−SRy、−O−Y、−G−Zまたは−CH2RXであり;
Rxは、それぞれ独立して、水素、−ORy、−N(Ry)2、−SRyまたは−O−Yであり;
Ryは、それぞれ独立して、−R2、−SO2R2、−S(O)R2、−P(O)(OR2)2、−C(O)R2、−CO2R2または−C(O)N(R2)2であり;
Yは、それぞれ独立して、単糖、二糖、または三糖であり;
Gは、それぞれ独立して、共有結合、または場合によっては置換されたC1−9アルキレンであり、ここで、Gの1個以上のメチレン単位は、場合によっては、−O−、−S−、−N(R2)−、−C(O)−、−OC(O)−、−C(O)O−、−C(O)N(R2)−、−N(R2)C(O)−、−N(R2)C(O)N(R2)−、−SO2−、−SO2N(R2)−、−N(R2)SO2−または−N(R2)SO2N(R2)−で置き換えられ;
Zは、それぞれ独立して、ハロゲン、−N(R2)2、−OR2、−SR2、−N3、−C≡CR2、−CO2R2、−C(O)R2または−OSO2R2であり;および
R2は、それぞれ独立して、水素、または場合によっては置換された基であって、C1−6脂肪族、フェニル、窒素、酸素またはイオウから選択される1〜2個のヘテロ原子を有する4〜7員複素環、または窒素、酸素またはイオウから選択される1〜4個のヘテロ原子を有する5〜6員単環式ヘテロアリール環から選択される基である。)
ある実施形態では、式(IIIa)または(IIIb)のリガンドは、単糖である。ある実施形態では、該リガンドは二糖である。ある実施形態では、該リガンドは三糖である。ある実施形態では、該リガンドは四糖である。ある実施形態では、該リガンドは、合計4個以下の単糖部分を含む。
複合体は、いかなる薬物も含むことができることが理解される。複合体は、同じ薬物の複数のコピーを含むことができおよび/または複数の種類の薬物を含むことができる。複合体は、いかなる特定の薬物にも限定されず、および小分子薬物または生体分子薬物を含んでもよい。一般的に、使用される薬物は、治療されるべき疾患または障害に依存する。本明細書で使用される用語「薬物」は、薬物の塩の形態および塩でない形態を包含する。たとえば、用語「インスリン分子」は、インスリン分子の全ての塩の形態および塩でない形態を包含する。塩形態は、薬物により、アニオン性でもカチオン性でもよいことは理解される。
B鎖(SEQ ID NO:2):FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT
ヒトインスリンは、ウサギ、ブタ、ウシおよびヒツジのインスリンと、アミノ酸A8、A9、A10およびB30においてのみ異なる(以下の表を参照)。
種々の実施形態で、本開示の複合体は、アミノエチルグルコース(AEG)、アミノエチルマンノース(AEM)、アミノエチルビマンノース(AEBM)、アミノエチルトリマンノース(AETM)、β−アミノエチル−N−アセチルグルコサミン(AEGA)およびアミノエチルフコース(AEF)からなる群から独立して選択される1種以上のリガンドに複合体化するインスリン分子を含む。ある実施形態では、インスリン分子は、A1アミノ酸残基を介して複合体化する。ある実施形態では、インスリン分子は、B1アミノ酸残基を介して複合体化する。ある実施形態では、インスリン分子は、LysB29のε−アミノ基を介して複合体化する。ある実施形態では、インスリン分子は、LysB29のε−アミノ基を介して複合体化する。
(A−T)は、それぞれ、複合体の分岐部内のポテンシャル繰返部を示し;
−A−は、それぞれ独立して、共有結合、炭素原子、ヘテロ原子、または場合によっては置換された基であって、アシル、脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリール、ヘテロアリールおよび複素環からなる群から選択される基であり;
Tは、それぞれ独立して、共有結合、または2価の、直鎖または分岐状、飽和または不飽和の、場合によっては置換されたC1−30炭化水素鎖であり、ここで、Tの1個以上のメチレン単位は、場合によってはおよび独立して、−O−、−S−、−N(R)−、−C(O)−、−C(O)O−、−OC(O)−、−N(R)C(O)−、−C(O)N(R)−、−S(O)−、−S(O)2−、−N(R)SO2−、−SO2N(R)−、複素環基、アリール基またはヘテロアリール基で置き換えられ;
Rは、それぞれ独立して、水素、適切な保護基、またはアシル部分、アリールアルキル部分、脂肪族部分、アリール部分、ヘテロアリール部分、またはヘテロ脂肪族部分であり;
−Bは−T−LB−Xであり;
Xは、それぞれ独立して、リガンドであり;
LBは、それぞれ独立して、共有結合またはTとXとの共有結合型複合に由来する基であり;
−Dは−T−LD−Wであり;
Wは、それぞれ独立して、薬物であり;
LDは、それぞれ独立して、共有結合、またはTとWとの共有結合型複合に由来する基であり;
kは、1〜12の整数であり;
qは、1〜4の整数であり;
pは、それぞれ独立して、1〜5の整数であり;
nは、それぞれ独立して、0〜5の整数であり;
mは、それぞれ独立して、1〜5の整数であり;および
vは、それぞれ独立して、0〜5の整数であり、
ただし、各k−分岐部内で、nの少なくとも1つは≧1であり、およびvの少なくとも1つは≧1である。)
一般式(I)(および本明細書中の他の式)は、全ての水素を明記していないことは理解すべきである。たとえば、中央の−A−がC6アリール基であり、k+q<6の場合、C6アリール環上のオープンポジションには水素が含まれていることは理解されることである。
(式中、−A−、T、D、k、q、p、n、mおよびvは、それぞれ、本明細書で定義し、記載した通りであり;
−Bは−T−LRPB−Xであり;
Xは、それぞれ独立して、リガンドであり;および
LRPBは、それぞれ独立して、TとXとの間に、ヒト血清における解離定数が1pmol/L未満である非共有結合を形成するリガンド−受容体ペアである。)
のいずれかの複合体を提供する。
(式中、−A−、T、B、k、q、p、n、mおよびvは、それぞれ、本明細書で定義し、記載した通りであり;
−Dは、−T−LRPD−Wであり;
Wは、それぞれ独立して、薬物であり;および
LRPDは、それぞれ独立して、TとWとの間に、ヒト血清における解離定数が1pmol/L未満である非共有結合を形成するリガンド−受容体ペアである)
のいずれかの複合体を提供する。
−Bは、−T−LRPB−Xであり;
Xは、それぞれ独立して、リガンドであり;
LRPBは、それぞれ独立して、TとXとの間に、ヒト血清における解離定数が1pmol/L未満である非共有結合を形成するリガンド−受容体ペアであり;
−Dは、−T−LRPD−Wであり;
Wは、それぞれ独立して、薬物であり;および
LRPDは、それぞれ独立して、TとWとの間に、ヒト血清における解離定数が1pmol/L未満である非共有結合を形成するリガンド−受容体ペアである)
のいずれかの複合体を提供する。
−A−(ノード):
ある実施形態では、−A−は、それぞれ独立して、アシル、脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリール、ヘテロアリールおよび複素環からなる群から選択される、場合によっては置換された基である。実施形態では、−A−は同じである。いくつかの実施形態では、中央の−A−は、他の全ての−A−と異なる。ある実施形態では、中央の−A−を除いて−A−は全て同じである。
ある実施形態では、Tは、それぞれ独立して、2価の、直鎖または分岐状、飽和または不飽和、場合によっては置換された、C1−20炭化水素鎖であって、Tの1個以上のメチレン単位は、場合によっておよび独立して、−O−、−S−、−N(R)−、−C(O)−、−C(O)O−、−OC(O)−、−N(R)C(O)−、−C(O)N(R)−、−S(O)−、−S(O)2−、−N(R)SO2−、−SO2N(R)−、複素環基、アリール基またはヘテロアリール基で置き換えられた炭化水素鎖である。ある実施形態では、Tの1、2、3、4または5個のメチレン単位が、場合によっておよび独立して、置き換えられる。ある実施形態では、Tは、C1−10、C1−8、C1−6、C1−4、C2−12、C4−12、C6−12、C8−12またはC10−12炭化水素鎖であって、Tの1個以上のメチレン単位は、場合によっておよび独立して、−O−、−S−、−N(R)−、−C(O)−、−C(O)O−、−OC(O)−、−N(R)C(O)−、−C(O)N(R)−、−S(O)−、−S(O)2−、−N(R)SO2−、−SO2N(R)−、複素環基、アリール基またはヘテロアリール基で置き換えられた炭化水素鎖で構成される。いくつかの実施形態では、Tの1個以上のメチレン単位は、複素環基によって置き換えられる。いくつかの実施形態では、Tの1個以上のメチレン単位は、トリアゾール部分によって置き換えられる。ある実施形態では、Tの1個以上のメチレン単位は、−C(O)−によって置き換えられる。ある実施形態では、Tの1個以上のメチレン単位は、−C(O)N(R)−によって置き換えられる。ある実施形態では、Tの1個以上のメチレン単位は、−O−によって置き換えられる。
ある実施形態では、−Bは、−T−LB−X(式中、Xはリガンドであり、LBは、共有結合、またはXとTとの共有結合型複合に由来する基である)である。例示的なリガンドおよびそれらの糖成分は、先に記載した。
ある実施形態では、−Dは、−T−LD−W(式中、Wは薬物であり、LDは、共有結合、またはWとTとの共有結合型複合に由来する基である)である。例示的な薬物は、先に記載した。
当業者であれば、種々の複合化学が、XとTと、および/またはWとTと(一般的に「成分」)を共有結合で複合体化するために使用されることを理解する。そのような技術は、当分野で広く知られており、例示的な技術を以下に検討する。成分は、直接的に結合(すなわち、介在する化学基なしで)またはスペーサー(たとえば、複合体化された構成成分と複合体骨格の残部との間にある物理的な分離を提供する架橋剤または共役鎖)を介して間接的に結合し得る。成分は、アミド、アミン、エステル、エーテル、チオエーテル、イソ尿素、イミンなど(これらに限定されない)の結合を始めとする任意の数の化学結合を介して、共有結合で複合体骨格に結合してもよい。ある実施形態では、LBおよび/またはLD(この項の目的では、一般的に、「L」)は、共有結合である。いくつかの実施形態では、Lは、場合によっては置換されたTのカルボニル反応性、チオール反応性、アミン反応性またはヒドロキシル反応性部分と、XまたはWのカルボキシル、チオール、アミンまたはヒドロキシル基の複合に由来する、場合によっては置換された部分である。いくつかの実施形態では、Lは、XまたはWの場合によっては置換されたカルボキシル反応性、チオール反応性、アミン反応性またはヒドロキシル反応性部分と、Tのカルボキシル、チオール、アミンまたはヒドロキシル基の複合に由来する、場合によっては置換された部分である。いくつかの実施形態では、Lは、
当業者であれば、種々の複合化学が、XとTと、および/またはWとTと(一般的に「成分」)を共有結合で複合体化するために使用されることを理解する。そのような技術は、当分野で広く知られており、例示的な技術を以下に検討する。ある実施形態では、ヒト血清における非共有結合の解離定数(Kd)は、1pmol/L未満である。たとえば、当分野で周知のように、成分は、非共有結合性リガンド受容体ペアを介して、非共有結合で複合体骨格に結合してもよい(たとえば、ビオチン−アビジン系ペア、これに限定されない)。そのような実施形態では、リガンド受容体ペアの1つが共有結合で成分に結合し、ペアのもう一方が共有結合で複合体骨格に結合する。成分および複合体骨格を組合わせる場合、リガンドとその受容体の間の強い非共有結合性相互反応により、成分は、非共有結合で複合体骨格に結合される。例示的なリガンド/受容体ペアとして、タンパク質/コファクターおよび酵素/基質ペアが挙げられる。通常使用されるビオチン/アビジンペアの他に、ビオチン/ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン/抗ジゴキシゲニン、FK506/FK506結合タンパク質(FKBP)、ラパマイシン/FKBP、シクロフィリン/シクロスポリンおよびグルタチオン/グルタチオントランスファーゼペアが挙げられるが、これらに限定されない。他の適切なリガンド/受容体ペアは、当業者に認識され、たとえば、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)、c−myc、FLAG(登録商標)(これらに限定されない)のようなエピトープタグとペアになったモノクロナール抗体があり、さらに、Kessler「Advances in Mutagenesis」の105−152頁,Kessler編,Springer−Verlag,1990;「Affinity Chromatography:Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology)」,Pascal Baillon編,Humana Press,2000;および「Immobilized Affinity Ligand Techniques」,Hermansonら,Academic Press,1992に記載されている。
kは、1〜12の整数である。ある実施形態では、k=1〜6、たとえば、1、2または3である。qは1〜4の整数であり、中央の−A−に結合するD基の数を定義する。ある実施形態では、q=1である。いくつかの実施形態では、q=2である。ある実施形態では、k+qは、2〜6の整数である。ある実施形態では、k+q=2、3または4である。
pは、それぞれ独立して、1〜5の整数である。ある実施形態では、各pは同じである。ある実施形態では、p=1、2または3である。ある実施形態では、p=1である。
nは、それぞれ独立して、0〜5の整数であり、ただし、各k−分岐部内で、少なくとも1つのnは、≧1である。あるk−分岐部内の分岐部を、本明細書では、n−分岐部という。
式(II)のjは、1〜4の整数であり、D基への複合の数を定義する。ある実施形態では、j=1である。ある実施形態では、j=2である。いくつかの実施形態では、j=3である。他の実施形態では、j=4である。
一般的に、複合体に負荷される薬物の量は、複合体骨格の分子量および/または化学的活性化のレベル(すなわち、側鎖基が骨格に付加される場合)を調整することによって、コントロールすることができる。種々の実施形態で、薬物負荷濃度は、複合体に対し5〜99%w/wの薬物の範囲であり得る。種々の実施形態で、50〜99%の狭い範囲内の負荷濃度が使用され得、たとえば、80〜99%の範囲で使用され得る。
先の項目では、異なる見出しで複合体の成分(たとえば、リガンド、薬物、骨格)を記載したが、本開示は、開示したリガンド、薬物および骨格のいずれかおよび全てを含む複合体を包含するものであることは理解されるべきである。
一態様では、本開示は、複合体を調製するための試薬を提供する。したがって、種々の実施形態では、一般式(I)
(式中、−A−、T、D、k、q、k+q、p、n、mおよびvは、上記および本明細書に記載したように定義され;
−Bは−T−LB’であり;および
LB’は、それぞれ独立して、水素、アルキン含有部分、アジド含有部分、または場合によっては置換されている、カルボニル反応性、チオール反応性、アミン反応性またはヒドロキシル反応性部分である)の化合物が提供される。
(式中、−A−、T、B、k、q、k+q、p、n、mおよびvは、上記および本明細書に記載したように定義され;
−Dは、−T−LD’であり;および
LDは、それぞれ独立して、水素、アルキン含有部分、アジド含有部分、または場合によっては置換されている、カルボニル反応性、チオール反応性、アミン反応性またはヒドロキシル反応性部分である)の化合物が提供される。
実施例で記載するように、本発明者らは、例示的な薬物として、インスリンを、および例示的なリガンドとして、アミノエチルグルコース(AEG)、アミノエチルマンノース(AEM)、アミノエチルビマンノース(AEBM)、アミノエチルトリマンノース(AETM)、および/またはアミノエチルフコース(AEF)、β−アミノエチル−N−アセチルグルコサミン(AEGA)を使用して、先に記載した複合体を調製する方法を例示する。限定ではないが、複合体骨格として、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(トリス)、トリス−スクシンイミジルアミノトリアセテート(TSAT)、トリス−スクシンイミジル−1,3,5−ベンゼントリカルボキシレート(TSB)およびベンゼン−1,3,5−トリカルボキシ−(N−4−酪酸−NHS−エステル)アミド(TSB−C4)を使用して、複合部位1つ当たり2個のリガンドを有し、全骨格成分の間が短い複合体を調製してもよい。より広い骨格成分間空間が望ましい場合は、スクシンイミジル(6−アミノカプロイル)アミノトリアセテート(TSAT−C6)、スクシンイミジル(6−アミノ(PEO−6))アミノトリアセテート(TSAT−PEO−6)、ベンゼン−1,3,5−トリカルボキシ−(N−6−アミノカプロン酸−NHSエステル)アミド(TSB−C6)、およびベンゼン−1,3,5−トリカルボキシ−(N−10−アミノデカン酸−NHSエステル)アミド(TSB−C10)を使用してもよい。TSAT−C6スペーサー・アーム化学は、TSAT−PEO−6と比較して、複合体により疎水性特性を付与する。
さらに、所定の多原子価度をすでに含有するリガンドを、先に記載された手法に従って、再び反応させ、幾分高いオーダーのリガンド多様性を作り出してもよい。たとえば、各リガンドの2つを反応性アミンも複合体化している適切な骨格に複合体化することによって、末端反応性アミンを含有する2価のAEM−2、AEBM−2またはAETM−2分子を調製してもよい。各リガンドの3つを反応性アミンも複合体化している適切な骨格に複合体化することによって、末端反応性アミンを含有する3価のAEM−3、AEBM−3またはAETM−3分子を調製してもよい。NH2−2価の糖を先に記載した骨格と同じ骨格と反応させ、薬物分子1個当たり4個および6個のリガンドを有する薬物複合体を生成してもよい。NH2−3価の糖を先に記載した骨格と同じ骨格と反応させ、薬物分子1個当たり6個および9個のリガンドを有する薬物複合体を生成してもよい。
実施例で検討するように、ある実施形態では、持続した形式(すなわち、溶解型組換えヒトインスリンより持続する吸収プロフィールを示す形態)で複合体を投与するのが、有利であり得る。これは、典型的なグルコース変動タイムスケール(すなわち分というより時間)により近い関係のタイムスケールでのグルコースにおける変動に応答することができる複合体の持続性レベルを提供する。ある実施形態では、非高血糖条件(すなわち、絶食させた状態)で哺乳類に投与した場合、徐放性製剤は、複合体のゼロ次放出を示し得る。
別の態様では、本開示は、複合体を使用する方法を提供する。一般的に、複合体は、糖(たとえば、グルコース、または本明細書で記載した、マンノース、α−メチルマンノース、L−フコースなどのような外因性糖)に応答する生理活性薬物をコントロール可能に提供するために使用することができる。本開示は、本開示の複合体の投与による、疾患または状態を治療することを包含する。複合体は、いかなる患者(たとえば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、マウスなど)を治療するために使用することができるが、最も好ましくは、ヒトの治療に使用される。複合体は、いかなる経路によっても患者に投与することができる。投与の最も適切な経路は、治療される疾患または状態の性質、薬物の性質、患者の状態などを始めとする様々な要因に依存する。一般的に、本開示は、経口、静脈、筋肉内、動脈内、皮下、心室内、経皮、直腸、経膣、腹腔内、局所(粉末、軟膏剤または滴剤によるように)、バッカル、または経口または経鼻スプレーまたは噴霧剤としての投与を包含する。これらの異なる経路に関する医薬組成物の製剤および製造における概論は、たとえば、Remington’s Pharmaceutical Sciences,第19編,Mack Publishing社,Easton,PA,1995に見出せる。種々の実施形態で、複合は、皮下、たとえば注射により投与してもよい。複合体は、送達を容易にするために、担体に溶解することができる。たとえば、担体として、無菌水、生理食塩水または緩衝生理食塩水(これらに限定されない)を始めとする水溶液があり得る。
先に記載したように、本明細書で記載される方法、複合体および組成物は、グルコース応答性複合体に限定されない。実施例で示すように、数種の例示的なグルコース−応答性複合体は、α−メチルマンノースおよびL−フコースのような外因性糖に対しても応答性があった。従って、ある実施形態では、複合体は、α−メチルマンノースおよびL−フコースのようなグルコース以外の糖、または複合体のPKまたはPD特性を変更し得る任意の他の糖の外因性投与により、誘引され得ることは理解されることである。
最初の実施例の組は、例示的な複合体を製造する種々の方法を記載する。該実施例は、出発成分および最終生成物を精製し、アッセイするアッセイも含む。これらの方法は、本発明の範囲内に入る他の複合体を生成するために、修正することができることは、理解すべきである。
a.ブロモエチルグルコースの合成
DOWEX50W×4樹脂(Alfa Aesar(アルファー・エイサー社),Ward Hill、MA)を脱イオン水で洗浄し、色を落とした。225gのD−グルコース(1.25mol;1当量.,Alfa Aesar)および140gのDOWEX 50W×4の混合物を、2.2Lの2−ブロモエタノール(30.5mol、25当量.;124.97g/mol;1.762g/mL;BP=150C;Alfa Aesar)で処理し、混合物を攪拌しながら、80℃に4時間加熱した。反応を、TLC(20%メタノール/ジクロロメタン(DCM))によりモニターした。約4時間後反応が終了し、室温まで放冷した。溶液をろ過して樹脂を取出し、該樹脂を酢酸エチルおよびDCMで洗浄した。得られたろ液を回転蒸発器で琥珀色の油状物とした。油状物とした後の総量は、400gであった。
加熱用マントル、オーバーヘッド攪拌器および温度計を備える、5Lの丸底三ツ口フラスコに、150gのブロモエチルグルコース(525mmol)を充填した。前記油状物を、2Lの水に溶解し、68.3gのアジ化ナトリウム(1.05mol、2当量;65g/mol;Alfa−Aesar)、次いで7.9gのヨウ化ナトリウム(52.5mmol、0.08当量;149.89g/mol;Alfa−Aesar)で処理し、溶液を50℃に温め、一晩攪拌した。溶液を室温まで冷却し、ロートバップで濃縮乾燥した。固体残基を3×500mLの5:1体積のCHCl3:MeOHを用い40℃で温浸した。合わせた有機部分をろ過し、蒸発乾固し、アジドエチルグルコース(86g)をオフホワイトの固体として得た。TLC(20%MeOH/DCM;H2SO4を有するチャコール):単一スポット、出発物質から識別不能。
32gのアジドエチルグルコースを100mLの水に取った。混濁した溶液を、ガラス・マイクロファイバー・フィルター(Whatman GF/B)によってろ過した。黄金色のろ液をロトベーパーで蒸発させ、固体とした。該固体をメタノール(100mL)に採り、混濁した溶液を再び、ガラス・マイクロファイバー・フィルターでろ過した。得られた淡黄色ろ液を真空下、固体とした。
a.ブロモエチルマンノースの合成
DOWEX50W×4樹脂(Alfa Aesar,Ward Hill、MA)を脱イオン水で洗浄し、色を落とす。225gのD−マンノース(1.25mol;1当量、Alfa Aesar)と、140gのDOWEX50W×4の混合物を、2.2Lの2−ブロモエタノール(30.5mol、25当量;124.97g/mol;1.762g/mL;BP=150℃;Alfa Aesar)で処理し、該混合物を攪拌しながら、80℃で4時間加熱する。反応を、TLC(20%メタノール/ジクロロメタン(DCM))によりモニターする。約4時間後反応が終了し、次いで室温まで放冷する。溶液をろ過して樹脂を取出し、該樹脂を酢酸エチルおよびDCMで洗浄する。得られたろ液を回転蒸発器で琥珀色の油状物とする。
加熱用マントル、オーバーヘッド攪拌器および温度計を備える、5Lの丸底三ツ口フラスコに、150gのブロモエチルマンノース(525mmol)を充填する。油状物を、2Lの水に溶解し、68.3gのアジ化ナトリウム(1.05mol、2当量;65g/mol;Alfa−Aesar)、次いで7.9gのヨウ化ナトリウム(52.5mmol、0.08当量;149.89g/mol;Alfa−Aesar)で処理し、溶液を50℃に温め、一晩攪拌する。溶液を室温まで冷却し、ロートバップで濃縮乾燥する。固体残基を、3×500mLの5:1体積CHCl3:MeOHを用い40℃で温浸する。合わせた有機部分をろ過し、蒸発乾固し、アジドエチルマンノースをオフホワイトの固体として得る。
32gのアジドエチルマンノースを100mLの水に取る。混濁した溶液を、ガラス・マイクロファイバー・フィルター(Whatman GF/B)によってろ過する。ろ液をロトベーパーで蒸発させ、固体とする。該固体をメタノール(100mL)に取り、混濁した溶液を再び、ガラス・マイクロファイバー・フィルターでろ過する。得られた淡黄色ろ液を真空下、固体とする。
実施例2のAzEM化合物を、ベンゼンジメチルエーテルを使用して選択的に保護し、カラムクロマトグラフィーで精製し、続いて臭化ベンジルと反応させ、1−α−(2−アジドエチル)−4,6−ベンズアルデヒドジアセタール−3−ベンジル−マンノピラノシドを得る。続いて、生成物を、厳密に無水条件下で、銀トリフレート化学を使用して、1−α−ブロモ−2,3,4,6−テトラベンゾイルマンノピラノシドでグリコシル化し、保護されたアジドエチルマンノビオース生成物を得る。中間体生成物を脱保護し、ベンゾイル基を除去し、AzEBMを得る。
a.1−α−ブロモ−2,3,4,6−テトラベンゾイル−マンノース
攪拌棒および窒素流入口を含む500mLの三口フラスコに、40g(60.9mmole)のペンタベンゾイルマンノースおよび80mLの塩化メチレンを加えた。得られた溶液を氷浴で<5℃に冷却し、80mLの33%HBr−酢酸溶液を、添加ロートによって、反応温度を<10℃に保つような速度で加えた。添加が完了し(約30分)、氷浴を外し、攪拌を3時間続けた。
攪拌棒、窒素流入口および300mLの無水アセトニトリルを含む1.0Lの三口フラスコに、25gの1−アジドエチルマンノース(100.4mmole)および50mLのトリエチルオルソベンゾエート(220mmole、2.2当量)を加えた。得られたスラリーを室温で攪拌し、0.8mL(10mmole)のトリフルオロ酢酸(TFA)をそのまま加えた。溶液は、10分以内に透明になり、攪拌をさらに2時間続け、次いで25mLの10%TFA水溶液を加え、攪拌をさらに2時間続け、中間体をエステル異性体に加水分解した。溶剤を真空蒸発させ、粘稠な油状物とし、これを50mLのDCMで完全に粉砕し、再び蒸発させ、粘稠な油状物を得た。トルエン(70mL)を該残基に加え、粘稠な溶液に2,4−ジベンゾイルアジドエチルマンノースで種添加を行った。微細析出物が15分以内に形成し、攪拌を室温で一晩続けた。得られた重質の懸濁液を、冷凍庫に2〜4時間置き、次いでろ過し、固体を氷冷したトルエン(2×10mL)で洗浄した。固体を重さが一定になるまで風乾し、21g(TY:50%異性体純度で22.85g)の約95%異性体純度を得た。生成物を40mLのトルエンに取り、1時間攪拌し、次いで冷凍庫にさらに2時間置いた。固体をろ過し、氷冷トルエンで洗浄(2×10mL)し、重さが一定になるまで風乾し、18.5gの単一異性体生成物、2,4−ジベンゾイルアジドエチルマンノースを83%の収率で得た。母液には、望ましくない異性体および少量の目的異性体が含有されていた。反応を、TLC:SG(ヘキサン/酢酸エチル:7/3)出発物質Rf0.0、オルソエステル中間体Rf0.9(ヘキサン/酢酸エチル:8/2)SM Rf0.8、目的異性体Rf0.4、望ましくない異性体Rf0.2で、モニターした。1H NMR 300MHz(CDCl3)δ8.12(t,4H)、7.66(t,2H)、7.5(m,4H)、5.56(t,1H)、5.48(m,1H)、5.14(m,1H)、4.5(dd,1H)、4.0(m,2H)、3.8(m,3H)、3.56(m,1H)、3.44(m,1H)。
攪拌棒、窒素流入口を供える1.0Lの三口フラスコに、185mLのDCM中の41gの粗1−ブロモ−テトラベンゾイルマンノース(60.9mmole、約2.5当量)を加えた。これに、11.2gの2,4−ジベンゾイルアジドエチルマンノース(24.5mmole)、次いで11.2gの4Aシーブを加えた。スラリーを室温で10分間攪拌し、メタノール/氷浴で−15℃に冷却した。
3.0gの過酸化ベンゾイル化マン(α−1,3)−マン(α−1.6)−α−1−アジドエチルマンノピラノシド(1.86mmole)の40mLのメタノールの懸濁液を攪拌しながら、メタノール中の0.2mLの4.28Mのナトリウムメトキシドを加えた。得られた懸濁液を室温で20時間攪拌し、透明溶液を得た。反応の終了を、TLC(SG、ヘキサン/酢酸エチル:8/2 SM Rf0.4、生成物Rf0.0)でモニターした。
パラジウム/炭素触媒、少量の酢酸、および溶剤としてエタノールを使用することによって、実施例1〜4の末端アジド化合物を、室温で直ちに水素化し、対応する末端アミン化合物を得る。図10に、AEG、AEM、AEBM、AETMの化学構造式を示す。試薬、溶剤などの量を水素化すべき糖−リガンドのモル数にあわせるべきであると当業者が理解すること以外は、プロセスは、AETMに関して以下に記載するものと同じである。
(「アミノエチルトリマンノース」、AETM)
5.3g(9.25mmole)のマン(α−1,3)−マン(α−1.6)−α−1−アジドエチルマンノピラノシドの100mLの水および50mLのエタノール溶液に、0.8gの5%Pd/Cを加えた。懸濁液を激しく攪拌しながら、30〜40psiで48時間、または出発物質がTLC(SG,メタノール,SM Rf0.75,Pdt Rf0.0,PMA vis.)に現れなくなるまで水素化した。懸濁液をセライトでろ過し、これをエタノール(2×50mL)で濯ぎ、ろ液を真空で濃縮した。
a.ジエチルジプロパルギルマロネートの合成
ジエチルマロネート(122.5g、0.7648mol)を、ナトリウムエトキシド(ナトリウム金属から調製、38.5g、1.67mol)を含有する無水エタノール(800ml)に加えた。30分後、プロパルギルブロミド(200g、1.68mol)を攪拌している懸濁液にゆっくり加え、温度を60度未満に保った。混合物を一晩(15時間)還流した。析出した塩をろ過で除去し、エタノールで洗浄した。溶剤を真空除去し、残基を水で希釈し、エタノール(2×200ml)で抽出した。合わせた抽出物をMgSO4で乾燥し、ろ過し、Et2Oで洗浄し、溶剤を真空除去し、金色の油状物を得た。該油状物を高真空(40℃)に3時間置き、放置した。固体は結晶化し始め、油状固体を形成した。一晩(16時間)放置した。シクロヘキサンをフラスコに充填し、固体を崩壊し、ろ過し、シクロヘキサンで洗浄し、白色結晶性生成物(81g、44.8%収率)を得た。反応は、GCによって追跡した。
ジエチルジプロパルギルマロネート(80g、0.339mol)を、600mlの10%アルコール性水酸化カリウム中で一晩(15時間)還流した。溶剤を真空除去し、残基を3NのHClで酸性とした。残基をEt2O(2×300ml)で抽出した。合わせた抽出物をMgSO4で乾燥し、ろ過し、Et2Oで洗浄し、油状物に真空濃縮した。高真空(40℃)に2時間置き、放置し、ジプロパルギルマロン酸を油状物(46g、75.4%収率)を得た。反応は、GCで追跡した。
ジプロパルギルマロン酸(26g、0.443mol)を、CO2の発生が止まるまで、135℃でそのまま加熱した。次いで放冷し、油状物とした。該油状物を0.5psiで蒸留した。蒸留フラスコ中に残った油状物残基および固体を合わせ(15.7g、79.9%収率)、次のステップでそのまま使用した。
50mlのCH3CN中のN−boc−エチレンジアミン(18.3g、0.1143mol)を、添加ロートを使ってゆっくり、ジプロパルギル酢酸(15.56g、0.1143mol)、TBTU(36.74g、0.114mol)およびDIPEA(29.6g、0.229mol)を含有する、攪拌している300mlのCH3CN溶液に0℃で加えた。析出が起こった。氷浴を外し、生成物を周辺温度で一晩(16時間)攪拌した。ここで反応物は全体的に均質になった。溶液を真空濃縮し、残基を800mlの水で希釈した。得られた固体をろ過し、十分水洗し、真空乾燥し、14.3gの粗生成物を得た。DCMから再結晶(2×)し、ろ過し、ヘキサンで洗浄し、生成物(9.85g、31%収率、98%HPLC(214nm)による純度)を得た。
DCM(20mL)中の1,1ジプロパルギル−アセチル−(−lN,2N−BOC−1,2−ジアミノエチル)アミド(DP、418mg、1.5mmole)に、0℃で5分間にわたりTFA(4mL)を滴下した。暗転した溶液を室温で一晩攪拌した。揮発性物質を減圧蒸発させた。トルエン(20mL)を残基に加え、減圧下で2回揮発分を取り除いた。得られた暗色油状物をさらに精製することなく使用した。
a.2−(2−BOC−アミノエチル)チオアセトアミド−トリス[(プロパルギルオキシ)メチル]アミノメタン
t−ブチルN−(2−メルカプトエチル)カルバメート(Frontrun Organix,Ipswich、MA;177.26mg、1mmole)のエタノール(5mL)溶液に、NaOH(1.1mmole)を攪拌しながら室温で加えた。この溶液に、2−ブロモアセトアミド−トリス[(プロパルギルオキシ)メチル]アミノメタン(356mg、1.0mmole、J.Org.Chem.73,5602,2008参照)を加え、攪拌を20時間続けた(TLC SG 8/2ヘキサン/酢酸エチル、pdt Rf0.4)。溶剤を真空蒸発させ、残基を酢酸エチル(40mL)に取り、水(25mL)、0.5NのNaOH(25mL)およびブライン(25mL)で順番に洗浄し、Na2SO4で乾燥し、ろ過し、油状物に濃縮した(360mg、TY452.3mg)。NMR CDCl3、(ppm):7.05(s,1H,N−H);5.25((s,1H,N−H);4.85(s,6H);3.85(s,6H);3.3(m,2H);3.15(s,2H);2.7(m,2H);2.42(s,3H);1.22(s,9H)。
2−(2−BOC−アミノエチル)チオアセトアミド−トリス[(プロパルギルオキシ)メチル]アミノメタン(1g、2.21mmole)のDCM(40mL)溶液を室温で攪拌しながら、これにTFA(4mL)を滴下した。得られた溶液を一晩攪拌した。溶剤を真空除去し、残基をトルエン(15mL)に取り、蒸発乾固した。残基をTHF(40mL)、水(40mL)に取り、攪拌し溶液とした。アジドエチルマンノース(3.75当量、2.0g、8.3mmole)、次いで硫酸銅(500mg、2.0mmole)およびアスコルビン酸ナトリウム(400mg、2.0mmole)を加え、得られた混合物を55〜60℃(油浴)で6時間攪拌し、室温に冷却し、一晩攪拌した。得られた混合物を半分の体積まで真空濃縮し、マイクロガラス・フィルターでろ過した。ろ液を樹脂カラム(Dowex50w50×4−100)に負荷し、中性になるまで水(6×75mL)で溶出した。次いで、カラムを15%水酸化アンモニウム(10×75mL)で溶出し、ニンヒドリンに陽性の画分をプールし、濃縮し、ガラス状泡状物(1.29g、TY(MW1099g/mol)、2ステップで53%)とした。
典型的な合成では、4gの粉末インスリン(Sigma Aldrich、St.Louis、MO)を、室温で、100mlの無水DMSOに溶解し、次いで4mlのトリエチルアミン(TEA)を添加する。溶液を室温で30分攪拌する。次に、1.79ml(2.6当量)のジ−tert−ブチル−ジカーボネート/THF溶液(Sigma Aldrich、St.Louis、MO)をインスリン−TEA溶液にゆっくり加え、約1時間混合する。5mlのDMSO中に250ulのエタノールアミンを含有する原液4mlを加えることにより、反応をクエンチし、次いで5分間混合する。クエンチ後、全溶液を1600mlのアセトンに注ぎ入れ、スパチュラで簡単に混合する。次に、18.9%のHCl:水溶液のアリコートを8×400μlで混合物の表面に滴下し、反応インスリンを析出させる。次いで、析出した物質を遠心分離し、析出したケーキは取っておき、上澄みを第2ビーカーにデカントする。上澄み溶液に対し、別の18.9%のHCl:水溶液のアリコートを8×400μlで混合物の表面に滴下し、反応インスリンの第2の析出物を得る。この第2の析出物を遠心分離し、上澄みは廃棄する。2つの析出ステップの遠心分離した合わせたケーキを、アセトンで1回洗浄し、室温で真空乾燥し、粗粉末を得る。該粉末は、通常60%の所望のBOC2生成物と40%のBOC3物質を含有する。
1,3,5−ベンゼントリカルボニルクロリド(1g、3.8mmole)のジクロロメタン(DCM)(5mL)溶液を、氷浴中でω−アミノ酸(3.1当量)の1NのNaOH(25mL)の溶液を激しく攪拌しながらそこへ滴下する。氷浴を外し、攪拌を室温で4時間続ける。2NのHCl(約15mL)を約pH2になるまで滴下し、得られたスラリーを、さらに2時間攪拌する。析出物をろ過し、冷水(2×20mL)で洗浄し、真空下風乾し、次いで60℃のオーブンで一晩乾燥した。得られた白色固体をさらに精製することなく使用する。各ω−アミノ酸の収量(4−アミノ酪酸:収量1.6g、91%;6−アミノカプロン酸:収量1.9g、92%)。
a.ニトロ基含有アルキン末端官能化デンドロンの水素化
n=2、4または8末端アルキンおよびニトロプロピオン酸コアを含有するデンドロンを得(たとえば、Polymer Factory,Swedenから)、さらに精製することなく使用する。デンドロンをDCMおよびエタノールの50:50体積混合物、100mLに溶解し、0.8gの5%Pd/Cを加える。激しく攪拌しながら懸濁液を、30〜40psiで48時間、またはTLCで測定して出発物質が表れなくなるまで水素化する。懸濁液をセライトでろ過し、これをエタノール(2×50mL)で濯ぎ、ろ液を真空で濃縮する。
水素化後に得た、アミノコアおよび4個の末端アルキン基を含有するデンドロン生成物(8.3mmol)をTHF(40mL)および水(40mL)に入れ、攪拌して溶液とする。アジドエチルマンノース(4.75当量、2.53g、10.51mmole)、続いて硫酸銅(500mg、2.0mmole)およびアスコルビン酸ナトリウム(400mg、2.0mmole)を加え、得られた混合物を55〜60℃(油浴)で6時間攪拌し、室温に冷却し、一晩攪拌する。得られた混合物を半分の体積まで真空濃縮し、マイクロガラス・フィルターでろ過する。ろ液を樹脂カラム(Dowex50w50×4−100)に負荷し、水(6×75mL)で中性になるまで溶出する。次いで、カラムを水酸化アンモニウム(10×75mL)で溶出し、ニンヒドリンに陽性の画分をプールし、濃縮し、ガラス状泡状物とする。
N末端活性化エステルを含有する骨格を、60mMで、1.0mlの無水DMSOに溶解し、400ul(過剰)のトリエチルアミン(TEA)を添加する。溶液を室温で10分素早く攪拌する。次いでアミン含有薬物を7.9mlのDMSOに7.4mMの濃度で、別々に溶解する。溶解したら、全薬物溶液を、10分かけて骨格/DM SO/TEA溶液に滴下し、次いで室温で2時間混合する。次いで、残っている活性化エステルを以下の様式でアミン官能化リガンドと反応させる。370mMのリガンドの溶液を適切な容積の乾燥DMSO中で調製する。溶解したら、十分な量の溶液を加え、最初の活性化エステル基の数N−1の3倍の数の反応性等価物を得る。
実施例11に記載された方法および実施例8のアミン含有薬物、NH2−B1−BOC2(A1,B29)−インスリン(MW=6,008g/mol)を使用して、以下の骨格およびリガンドを持つインスリン複合体を調製した。トリス−スクシンイミジル−1,3,5−ベンゼントリカルボキシレート(TSB)、トリス−スクシンイミジルアミノトリアセテート(TSAT)、トリス−スクシンイミジル(6−アミノカプロイル)アミノトリアセテート(TSAT−C6)およびテトラキス−(N−スクシンイミジルカルボキシプロピル)ペンタエリスリトールTSPE活性化エステル骨格を、Molecular Biosciences(Boulder、CO)から購入し、さらに精製することなく使用した。TSB−C4およびTSB−C6骨格を、実施例9に従って合成した。AEM、AEBMおよびAETMリガンドを、実施例1〜5に従って合成した。適切にサイズ調整したサイズ排除溶媒は、Biogel P2(Bio−Rad Laboratories、Hercules、CA)であり、適切にサイズ調整した限外ろ過膜の分子量カットオフは、3kDであった。
実施例11で記載した方法およびアミン含有薬物、実施例8のNH2−B1−BOC2(A1,B29)−インスリン(MW=6,008g/mol)を使用して、骨格に結合する糖リガンドの混合物を持つインスリン複合体を調製した。
実施例11で記載した方法およびアミン含有薬物、実施例8のNH2−B1−BOC2(A1,B29)−インスリン(MW=6,008g/mol)を使用して、以下のインスリン複合体を、予め合成した多価アミン含有リガンドから調製する。ジスクシンイミジルスベレート(DSS)およびTSAT−C6活性化エステル骨格は、Molecular Biosciences(Boulder、CO)から購入し、さらに精製することなく使用する。末端反応性アミンを含有する二価のAEM−2、AEBM−2およびAETM−2分子は、各リガンドの2つを、これも反応性アミンを複合体化している適切な骨格に複合体化することによって調製する。各リガンドの3つを反応性アミンも複合体化している適切な骨格に複合体化することによって、末端反応性アミンを含有する3価のAEM−3、AEBM−3またはAETM−3分子を調製をする。適切なサイズのサイズ排除溶媒は、Biogel P2(Bio−Rad Laboratories、Hercules、CA)であり、適切なサイズの限外ろ過膜の分子量カットオフは、3kDである。
実施例10bで調製した1個のアミノコアおよび4個の末端アルキン基を含有するデンドロン0.1g(0.098mmol)を、100mg/mlで、無水DMSOに溶解する。ジスクシンイミジルスベレート(DSS、Molecular Biosciences、0.098mmol)およびトリエチルアミン(400uL)を含有する溶液に滴下し、室温で1時間反応させる。次いで、この混合物を、実施例8のNH2−B1−BOC2(A1,B29)−インスリン(MW=6,008g/mol)、(0.588g、0.098mmol)を含有する50mg/mlの溶液に滴下し、2時間反応させる。
a.Fmoc−1−(B29)−インスリン
典型的な合成では、4gの粉末インスリン(Sigma Aldrich、St.Louis、MO)を、室温で、100mlの無水DMSOに溶解し、次いで4mlのトリエチルアミン(TEA)を添加する。溶液を室温で30分攪拌する。次に、1.2当量の9−フルオレニルメチルN−スクシンイミジルカルボネート(Fmoc−NHS)(Sigma Aldrich、St.Louis、MO)を、Fmoc−NHSのTHF1.0M溶液としてインスリン−TEA溶液にゆっくり加える。
典型的な合成では、1gのFmoc1−(B29)−インスリンを室温で25mlの無水DMSOに溶解し、次いで1mlのトリエチルアミン(TEA)を添加する。溶液を室温で30分攪拌する。次に、0.379ml(2.2当量)のジ−tert−ブチル−ジカーボネート/THF溶液(Sigma Aldrich、St.Louis、MO)をインスリン−TEA溶液にゆっくり加え、約1時間混合する。反応を5mlのDMSO中で、250ulのエタノールアミンを含有する原液1mlを添加してクエンチし、5分間混合する。クエンチ後、全溶液を400mlのアセトンに注ぎ入れ、スパチュラで簡単に混合する。次に、18.9%のHCl:水溶液のアリコートを8×100μlで混合物の表面に滴下し、反応インスリンを析出させる。次いで、析出した物質を遠心分離し、析出したケーキは取っておき、上澄みを第2ビーカーにデカントする。上澄み溶液に対し、別の18.9%のHCl:水溶液のアリコートを8×100μlで混合物の表面に滴下し、反応インスリンの第2の析出物を得る。この第2の析出物を遠心分離し、上澄みは廃棄する。2つの析出ステップの遠心分離した合わせたケーキを、アセトンで1回洗浄し、室温で真空乾燥し、粗粉末を得る。該粉末は、90%を超える所望のBOC2−Fmoc−1生成物を含有する。
先のステップによって得られた凍結乾燥した粉末を、ジメチルホルムアミド(DMF)中の20%ピペリジンに、4℃で30分で溶解し、次いで、0.150MのNaClを含有する25mMのHEPES、pH8.2緩衝液で10倍希釈することによって、BOC2(A1,B1)−Fmoc(B29)のFmoc保護基を除去する。NaOH溶液を使用して、pHを7.0と8.0との間に調整し、その後、物質をBiogel P2カラムに通し、Fmoc、DMFおよび他の任意の混入塩を除去する。NH2−(B29)−BOC2(A1,B1)−インスリンを、必要であれば、凍結乾燥して粉末とし、または望ましい場合は、水溶液で直接使用する。
実施例16のNH2−B29−BOC2(A1,B1)−インスリンを使用する代わりに、実施例8のNH2−B1−BOC2(A1,B29)−インスリンを使用して、先の実施例に記載した全多価リガンド−薬物複合体を調製してもよい。得られた複合体は全て、同じMWおよび置換度を有するが、インスリン分子の複合部位は、N−末端Phe−B1ではなく、ε−B29アミノ基である。これは、N−末端シークエンス解析により確認することができる。
この実施例は、リガンドの前に薬物を骨格に付加する実施例11で記載した方法の代替法を記載する。この実施例では、薬物の前にリガンドを骨格に付加する。
この実施例は、保護されていないインスリンにおいて、Lys−B29ε−アミノ部分が最も活性のあるアミンであり、次いでA1、次いでB1であるという事実を利用する。従って、保護されていないインスリンを使用する場合、得られた複合体は、Lys−B29位が主に置換されているはずである。実施例18で記載した方法および組換えヒトインスリン(MW=5808Da、Sigma Aldrich、St.Louis、MO)を使用して、Molecular Biosciences(Boulder、CO)から購入したTSAT−C6活性化エステル骨格から、以下のインスリン複合体を調製した。AEMおよびAETMは、先に記載したように合成した。適切なサイズのサイズ排除溶媒は、Biogel P2(Bio−Rad Laboratories、Hercules、CA)であり、適切なサイズの限外ろ過膜の分子量カットオフは、3kDaであった。
この実施例では、実施例18で記載した方法の変法であって、反応を有機溶剤の代わりに水性溶剤中で行う方法を記載する。
この実施例は、保護されていないインスリンにおいて、Lys−B29ε−アミノ部分が最も活性のあるアミンであり、次いでA1、次いでB1であるという事実を利用する。従って、保護されていないインスリンを使用する場合、得られた複合体は、Lys−B29位が主に置換されているはずである。実施例20で記載した方法および組換えヒトインスリン(MW=5808、Sigma Aldrich、St.Louis、MO)をアミン含有薬物として使用して、AEM−2インスリン複合体を、Molecular Biosciences(Boulder、CO)から購入した、TSAT−C6活性化エステル骨格を使用して調製した。インスリン類縁体として使用されるAEMは、先に記載したように合成した。適切なサイズのサイズ排除溶媒は、Biogel P2(Bio−Rad Laboratories、Hercules、CA)であり、適切なサイズの限外ろ過膜の分子量カットオフは、3kDであった。最終生成物(HPLCによる純度95%)は、6729g/mol(LC−MS)の所望のMWを有し、1インスリン当たり計2.0個のAEM分子の複合体化が示され、Lys−B29部位で複合体化する複合体分子が85%を超える(N末端シークエンス解析)ことがわかった。
a.複数のリガンドと1個の末端アルデヒドで官能化された骨格
最初に、N末端活性化エステルを含有する骨格を、27.0mlの無水DMSOに60mMで溶解し、次いで800ul(過剰)のトリアミン(TEA)を加える。溶液を室温で10分素早く攪拌する。アミン含有ジエチルアセタールの母液を、580mMで、5mlの無水DMSO中で調製する。溶解したら、2.9mlのジエチルアセタール溶液を、骨格/DMSO/TEA溶液に5分で滴下し、次いで室温でさらに15分混合する。次いで、残っている活性化エステルをアミン官能化リガンドを以下の様式で反応させる。リガンドの370mM溶液を、適切な容量の乾燥DMSO中で調製する。溶解したら、最初の活性化エステル基、N、−1の数の1.5倍と同じ数になる反応性等価物を得るのに十分な量の溶液を加える。たとえば、1つの骨格当たりN=3の初期活性化エステル基があれば、(1.5×(3−l)×60mM×27/370mM)=1.3mlのリガンド溶液を加える。1つの骨格当たりN=4の初期活性化エステル基があれば、(1.5×(4−l)×60mM×27/370mM)=20mlのリガンド溶液を加える、など。リガンド溶液を加えた後、溶液を室温でさらに1時間45分攪拌し、反応の完了を確実にする。反応後、全溶液を、10倍のジエチルエーテルで希釈し、激しく混合し、遠心分離し、目的物質を含有する高密度の底相を上澄みから分離する。上澄みを廃棄した後、同容積のエタノールを加え、固体状の析出した塊を生成する。遠心分離し、上澄みを廃棄した後、物質をエタノールおよびエーテルで十分洗浄し、次いで真空下乾燥し、複数のリガンドと1個のジエチルアセタール基を含有する粗骨格を得る。
乾燥させたら、集めた物質を溶液のpHを1.0に調整したDI水60mlに溶解することによって、アルデヒド基をジエチルアセタールから生成する。該溶液を30分混合し、その後、1.5MのNaClを含有する200mMのHEPES pH8.2緩衝液6mlを加え、希NaOH溶液を使用して、溶液のpHを6.5に調整する。薬物を含有するアミン48mmolを溶液に加え、必要ならpHを6.5に調整する。別に、1.5gのナトリウムシアノボロハイドライド(Sigma Aldrich、St.Louis、MO)を、0.150MのNaClを含有する20mMのHEPES pH7.0緩衝液15mlに溶解し、還元剤の母液を調製し、pHを希HCl溶液で6.5に注意深く調整する。13mlのシアノボロハイドライド母液を、薬物/骨格/アルデヒド溶液に加え、室温で一晩反応させる。
a.2AEMおよび1アミノブチルアルデヒドジエチルアセタール(ABDA)で官能化されたTSAT
この物質は、多価活性化エステル骨格としてTSAT(Molecular Biosciences、Boulder、CO)を、およびアミン含有ジエチルアセタールとして4−アミノブチルアルデヒドジエチルアセタール(Sigma Aldrich、St.Louis、MO)を使用して、実施例22aに記載の方法に従って合成した。先に記載したように合成した、AEM(MW=223g/mol)を、リガンドとして使用した。
この物質は、実施例22bに記載された方法、および上記(a)で生成したTSAT−AEM−2−ABDAと、実施例8に従って合成したアミン含有薬物、NH2−B1−BOC2(A1,B29)−インスリン(MW=6,008g/mol)とを使用して合成した。適切にサイズ調整されたサイズ排除溶媒は、Biogel P2(Bio−Rad Laboratories、Hercules、CA)であり、適切にサイズ調整された限外ろ過膜分子量カットオフは3kDであった。出発物質NH2−B1−BOC2(A1,B29)−インスリン物質は、Phe−B1末端に1個の遊離アミン基しか持っていないので、Phe−B1は、骨格へのインスリン複合化の唯一の部位である。凍結乾燥した粉末を、90%TFA/10%アニソールに4℃で1時間で溶解し、次いで、0.150MのNaClを含有するHEPES、pH8.2の緩衝液で10倍希釈して、BOC保護基を除去した。NaOH溶液を使用して、pHを7.0と8.0との間に調整し、その後、物質をBiogel P2カラムに通し、アニソール、BOCおよび脱保護の他の低MW副生成物、ならびに他の混入塩を除去する。次いで、脱保護され、精製された複合体水溶液を濃縮し、Amicon 3K膜(Millipore、Billerica、MA)を使用して、目的濃度に濃縮し、必要になるまで4℃で保存した。
a.3AEMおよび1アミノブチルアルデヒドジエチルアセタール(ABDA)で官能化されたTSPE
この物質は、多価活性化エステル骨格としてTSPE(Molecular Biosciences、Boulder、CO)を、アミン含有ジエチルアセタールとして4−アミノブチルアルデヒドジエチルアセタール(Sigma Aldrich、St.Louis、MO)を使用して、実施例22aに記載された方法に従って合成した。先に記載したように合成されたAEM(MW=223g/mol)を、リガンドとして使用した。
この物質は、実施例22bに記載した方法、および上記(a)で生成したTSPE−AEM−3−ABDAと、実施例8に従って合成されたアミン含有薬物、NH2−B1−BOC2(A1,B29)−インスリン(MW=6,008g/mol)とを使用して合成した。適切にサイズ調整されたサイズ排除溶媒は、Biogel P2(Bio−Rad Laboratories、Hercules、CA)であり、適切にサイズ調整された限外ろ過膜分子量カットオフは3kDであった。出発物質NH2−B1−BOC2(A1,B29)−インスリン物質は、Phe−B1末端に1個の遊離アミン基しか持っていないので、Phe−B1は、骨格へのインスリン複合化の唯一の部位である。凍結乾燥した粉末を、90%TFA/10%アニソールに4℃で1時間で溶解し、次いで、0.150MのNaClを含有するHEPES、pH8.2の緩衝液25mMで10倍希釈して、BOC保護基を除去する、NaOH溶液を使用して、pHを7.0と8.0との間に調整し、その後、物質をBiogel P2カラムに通し、アニソール、BOCおよび脱保護の他の低MW生成物、ならびに他の混入塩を除去する。次いで、脱保護され、精製された複合体水溶液を濃縮し、Amicon 3K膜(Millipore、Billerica、MA)を使用して、目的濃度に濃縮し、必要になるまで4℃で保存した。
a.3AEMおよび1アミノブチルアルデヒドジエチルアセタール(ABDA)で官能化されたTSPE
この物質は、多価活性化エステルスカフォールドとしてTSPE(Molecular Biosciences、Boulder、CO)を、アミン含有ジエチルアセタールとして4−アミノブチルアルデヒドジエチルアセタール(Sigma Aldrich、St.Louis、MO)を使用して、実施例22aに記載された方法に従って合成した。先に記載したように合成されたAEM(MW=223g/mol)を、リガンドとして使用した。
この物質は、実施例22bに記載した方法、および上記(a)で生成したTSPE−AEM−3−ABDA、アミン含有薬物非修飾インスリン(MW=5,808g/mol、Sigma−Aldrich、St.Louis、MO)とを使用して合成した。適切なサイズのサイズ排除溶媒は、Biogel P2(Bio−Rad Laboratories、Hercules、CA)であり、適切なサイズの限外ろ過膜の分子量カットオフは、3kDであった。出発物質、非保護インスリン物質は3個の遊離アミン基を持っているが、Phe−B1(pKa約6.8)はpH6.5で最も反応性が高いアミンであるという事実から、Phe−B1が、スカフォールドへのインスリン複合体化の優勢な部位である。凍結乾燥した粉末を0.150MのNaClを含有する25mMのHEPES pH8.2緩衝液に溶解した。NaOH溶液を使用してpHを7.0と8.0との間に調整し、その後、3K膜(Millipore、Billerica、MA)を使用して物質を目的濃度まで濃縮し、必要になるまで4℃で保存した。
スクシンイミジル−3,5−ジマレイミドフェニルベンゾエート(SDMB)を、Molecular Biosciences(Boulder、CO)から購入し、以下の実施例でさらに精製することなく使用することができる。SDMBを60mMで1.0mlの無水DMSOに溶解し、次いで400ul(過剰)のトリエチルアミン(TEA)を加える。溶液を室温で10分素早く攪拌する。次いで、別に、アミン含有薬物を7.5mlの無水DMSOに8.1mMの濃度で溶解する。溶解したら、全SDMB溶液を、10分かけてDMSO−薬物溶液に滴下し、次いで室温でさらに2時間混合し、反応の完了を確実にする。
実施例26で記載された方法、および実施例8に従って合成されたアミン含有薬物、NH2−B1−BOC2(A1,B29)−インスリン(MW=6,008g/mol)を使用して、以下の特定の薬物複合体を得る。AEM(MW=223g/mol)、AEBM(MW=385g/mol)およびAETM(MW=547g/mol)は、先に記載されたように合成し、合成においてリガンドとして使用する。適切なサイズのサイズ排除溶媒は、Biogel P2(Bio−Rad Laboratories、Hercules、CA)であり、適切なサイズの限外ろ過膜の分子量カットオフは、3kDであった。
少なくとも1個のアミノ官能基と、1個以上の末端アルキン基を含有する骨格(8.3mmol)を、THF(40mL)、水(40mL)に取り、攪拌して溶液とする。アジドエチル基含有薬物(10.51mmole)、次いで硫酸銅(500mg、2.0mmole)およびアスコルビン酸ナトリウム(400mg、2.0mmole)を加える。得られた混合物を55〜60℃(油浴)で6時間攪拌し、室温に冷却し、一晩攪拌し、半分の体積まで真空濃縮し、マイクロガラス・フィルターを通してろ過する。ろ液を樹脂カラム(Dowex50w50×4−100)に負荷し、水(6×75mL)で中性になるまで溶出する。次いでカラムを15%水酸化アンモニウム(10×75mL)で溶出し、ニンヒドリンに陽性の画分をプールし、濃縮し、ガラス状泡状物とする。
他の種のインスリンであって、少なくとも1つの反応性アミン官能基を含有するインスリン(たとえば、ウシおよびブタインスリン)を、ヒトインスリンを複合体化するために使用される任意の方法を使用して結合してもよい。当業者は、ウシまたはブタインスリンから生成された複合体の分子量は、以下の表に挙げる量だけ、ヒトインスリンから生成したものとは異なることを理解する。
少なくとも1個の反応性アミン官能基を含有する公知の全てのインスリン類縁体(たとえば、リスプロ、アスパルト、グルリジン、グラルギンおよびデテミール)は、ヒトインスリンを複合体化するために使用される任意の方法を使用して結合してもよい。当業者は、インスリン類縁体から生成された複合体の分子量は、以下の表に挙げる量だけ、ヒトインスリンから生成したものとは異なることを理解する。
N−末端アミン官能基を含有するペプチド性インスリン分泌促進物質(たとえば、GLP−1またはGLP−1類縁体エクザニチドが挙げられるがこれらに限定されない)を、インスリンを複合体化するために使用した任意の方法を使用して結合してよい。
この実施例の第二組は、いくつかの例示的な複合体のインビトロ特性を調べる種々の実験を記載する。
この比較例は、米国特許出願公開公報第20070099820号に従ったインスリン−グリコーゲン複合体の合成を記載する。簡単に言えば、1gの市販の精製されていないカキグリコーゲン(II型、Sigma−Aldrich、St.Louis、MO)を、脱イオン水に、10mg/mlの濃度で溶解する。固体CNBrを、グリコーゲンに対するCNBrの質量比0.68で得られた溶液に加え、3Nの水酸化ナトリウム(NaOH)溶液を使用して、pHを10.7+/−0.2で一定に保つ。15分間攪拌した後、別の同じ質量の固体CNBr等価物を加え、45分間攪拌しながら、pHを10.7+/−0.2で一定に保つ。次いで、インスリンをグリコーゲンに対するインスリンの質量比0.60で溶液に加え、固体炭酸水素ナトリウムを使用して、pHを9.15に調整する。溶液を一晩攪拌し、50kDaのMWCOポリエステルスルホン円盤膜フィルター(Millipore、Bedford、MA)を使用して、脱イオン水に対して徹底的に限外ろ過し、凍結乾燥する。次いで、得られた粉末を、Superdex(商標)30HiLoad16/60(Amersham Biosciences、Piscataway、NJ)充填カラムで1Mの酢酸移動相を使用するゲルろ過HPLC(Waters、Milford、MA)によって、複合体化されていないインスリンから精製する。次いで、インスリングリコーゲン画分を凍結乾燥し、複合体を純粋な白色粉末として得る。アミノ酸分析(UCLA Biopolymers Laboratory、Los Angeles、CA)を使用して測定すると、得られた精製された物質は、1インスリン−グリコーゲン複合体当たり1.0wt%のインスリンを含有していた。
この実施例は、実施例32に従って合成されたインスリン−グリコーゲンと、本発明に従って合成された例示的な複合体との間のRP−HPLCプロフィールの違いを記載する。実施例32に従って合成されたインスリン−グリコーゲンの5mg/ml溶液100ulと、例示的な複合体の1mg/ml溶液100ulとを、別々に、80%水/20%アセトニトリル(CH3CN)移動相(それぞれ、0.1%TFAを含有する)を備えるWaters Symmetry C8 5umカラム(4.6mm×250mm)に注入する。この試験で使用した例示的な複合体は、TSAT−C6を骨格として、AEMをリガンドとして、NH2−B1−BOC2(A1,B29)−インスリンを薬物として使用して合成した。
この実施例は、実施例32に従って合成したインスリン−グリコーゲンと、同じ例示的な複合体との間のMWおよびMW分布における違いを記載する。インスリン−グリコーゲン複合体のMWおよびMW分布は、pH7 HEPES緩衝生理食塩水の25mg/ml溶液1mlを、HEPES緩衝生理食塩水で平衡化されたUltrahydrogelサイズ排除カラム(Waters Corporation、Millford、MA)上へ注入することによって測定した。カラムを、30分かけて1分当たり0.5mlで溶出し、次いで溶出プロフィールを280nmでの吸光度として測定した。同じプロトコルを使用する別の実験で、1000、5000、12000、25000、50000、80000、150000、270000および410000g/mol(Sigma−Aldrich、St.Louis、MO)のデキストランMW標準を注入し、MW対保持時間の検量線を作った。インスリン−グリコーゲン複合体の検量線および溶出プロフィールに基づいて、平均MWを測定し、500,000g/mol、および250,000〜1,000,000g/mol(データは図示せず)の広い範囲で溶出した67%の分布を示した。対照的に、例示的な複合体を測定すると、LC/MS(HT Laboratories、San Diego、CA)(データ図示せず)により測定したように、正確に6,730g/molの単一MWを有している。
この実施例では、37℃および150ストローク/分の機械的攪拌速度で、Hindsら(Bioconj.Chem.11:195−201,2000)に記載された方法に従う促進条件下での、例示的な複合体と、複合体化されていないインスリンとの安定性を比較する。医薬品等級組換えヒトインスリン(RHI)を、促進安定性試験に関するコントロールとして選択した。Holcombeら(Diabetes Care27:1241−1242,2004)は、非促進条件下、RHI安定性は、少なくとも30日の間室温(RT)で保持され、冷凍した場合より非常に長い。図2は、RHIおよび2つの例示的な複合体に関する、50U/mlでのpH7.4リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)中の凝集安定性アッセイの結果を示す。全ての場合、溶液に残る%は、溶液をある時点で遠心(4500×g、5分)し、A280の上澄みを測定し、A280の上澄みを最初の出発溶液の上澄みで割ることによって求めた。複合体I−1(図45参照)は、TSAT−C6を骨格として、AEMをリガンドとして、およびNH2−B1−BOC2(A1,B29)−インスリンを薬物として使用して合成した。複合体I−16(図45参照)は、TSPEを骨格として、AEMをリガンドとして、およびNH2−B1−BOC2(A1,B29)−インスリンを薬物として使用して合成した。
複合体が化学的および物理的に安定であることが実証された後、72時間AST複合体を、5U/kgでスプラーグ・ドーレイ・ラットを使用して、その皮下生物活性インビボ対新しい複合体の評価を行った(図4参照)。
この実施例の第三の組は、いくつかの例示的な複合体のインビボ特性を調べる種々の実験を記載する。
(a)インスリン−デキストラン生物活性
この比較例では、皮下投与したインスリン−デキストラン(Sigma−Aldrich、MW約70K)のインビボ薬力学的プロフィールを評価する。以下に示すように、米国特許公開公報第20040202719号に従って合成したインスリン−デキストラン複合体は、高MWの複合体ポリマーは、体循環への吸収速度を有意に妨げるので、皮下注射後、比較的ゆっくり作用する。修飾臭化シアン(CNBr)カップリング反応を使用して、インスリン−デキストランを合成した。簡単に言えば、500mgのデキストラン(MW=70K、Sigma−Aldrich)を、50mlの脱イオン水に溶解した。56mgの固体CNBrを得られた溶液に加え、5NのNaOH溶液を使用して、pHを10.7±0.2に維持した。15分間攪拌した後、さらに56mgの固体CNBrを加え、45分間攪拌しながら、pHを10.7±0.2に維持した。次いで、300mgの組換えヒトインスリン(RHI)を溶液に加え、固体炭酸水素ナトリウムを使用して、pHを9.15に調整した。溶液を一晩攪拌し、10K MWCOポリエステルスルホン円盤膜フィルター(Millipore、Bedford、MA)を使用してDI水に対して徹底的に限外ろ過し、凍結乾燥した。次いで、得られた粉末を、Superdex(商標)75充填カラム(Amersham Biosciences、Piscataway、NJ)上の1Mの酢酸移動相を使用する高速液体クロマトグラフィー(Waters、Milford、MA)によって、複合体化されたいないインスリンから精製した。次いで、インスリン−デキストラン画分を凍結乾燥し、複合体を純粋な粉末として得た。インスリン複合体化の度合いを、アミノ酸分析(UCLA Biopolymers Laboratory、Los Angeles、CA)により測定し、10%(w/w)であった。
この実施例では、皮下投与されたインスリン−グリコーゲンのインビボ薬力学的プロフィールを評価する。インスリン−グリコーゲン複合体は、実施例32に従って合成した。インスリン−グリコーゲン複合体の生物活性は、2.5当量Uのインスリン/kg用量を、絶食させた正常非糖尿病ラット(雄スプラーグ−ドーレイ、200〜250g、n=4)の首の後ろに注射することによって評価した。血液サンプルは、注射15分前、注射時0分、および注射後、15、30、45、60、90、120、180、240、300 および360分に尾静脈出血によって集めた。市販の検査片(Precision Xtra、Abbott Laboratories、Abbott Park、IL)を使用して、血糖値を測定した。上記インスリン−デキストラン複合体と比べると、高いMWインスリン−グリコーゲン複合体は、非常により速くおよびより大きくグルコース濃度を下げる(図6参照)。この素早い作用および排出プロフィールは、皮下注射後の高MWグリコーゲンポリマー鎖の素早い酵素消化による。
この実施例では、皮下投与された例示的な複合体および組換えヒトインスリン(RHI)のインビボ薬力学的プロフィールを評価および比較する。図45の例示的な複合体I−1は、TSAT−C6をスカフォールドとして、AEMを指示薬類縁体として、およびNH2−B1−BOC2(A1,B29)−インスリンを薬物として使用して合成した。この場合、3.5U/kgの複合体を、絶食させた、正常な非糖尿病ラット(雄Sprague−Dawley、400〜500g、n=6)の首の後ろに注射した。血液サンプルを、尾血管出血によって、0分、および注射から30、60、90、120、150、180、210、240および300分後に集めた。市販の検査片(Precision Xtra、Abbott Laboratories、Abbott Park、IL)を使用して、血糖値を測定した。図7に示すように、インビボで酵素的に温浸される例示的な複合体の不能性にもかかわらず、RHIおよび例示的な複合体のグルコース低下プロフィールは、ほぼ同じである。複合体の素早い作用および排出プロフィールは、おそらく、複合体は、薬力学的特性の観点からごくわずかなMWの増加の効果をもたらすRHIより、14%しか大きくないという事実によるものである。
この実施例では、皮下投与された例示的な複合体および組換えヒトインスリン(RHI)に関し得た血清インスリンプロフィールを記載し、比較する。図45の例示的な複合体、I−1は、TSAT−C6を骨格として、AEMをリガンドとして、およびNH2−B1−BOC2(A1,B29)−インスリンを薬物として合成した。この場合、3.5U/kgの複合体を、絶食させた、正常な非糖尿病ラット(雄Sprague−Dawley、400〜500g、n=6)の首の後ろに注射した。血液サンプルを、尾血管出血によって、0分、および注射から30、60、90、120、150、180、210、240および300分後に集めた。さらに、各時点の血液を4℃で遠心分離し、血清を集めた。続いて、血清インスリン濃度を、市販のELISAキット(ヒトインスリンELISA、Mercodia、Uppsala、Sweden)で測定した。図8からわかるように、複合体の薬物動態プロフィールは、RHIのプロフィールから、統計的に識別不能であり、この複合体は、皮下注射の後、血清に素早く吸収され、そこから排出されることを実証している。
この実施例では、代表的な複合体を皮下投与して得た、血清インスリンおよび血中グルコースの低下プロフィールを記載する。図45の例示的な複合体、I−7は、TSAT−C6を骨格として、AEMをリガンドとして、および組換えヒトインスリンを薬物として(実施例37および38におけるようにB1−置換複合体の代わりに、B29−置換複合体を生成するために)を使用して合成した。この場合、5U/kgの複合体を、絶食させた、正常な非糖尿病ラット(雄Sprague−Dawley、400〜500g、n=3)の首の後ろに注射した。血液サンプルを、尾血管出血によって、0分、および注射から30、60、90、120、150、180、210、240および300分後に集めた。市販の検査片(Precision Xtra、Abbott Laboratories、Abbott Park、IL)を使用して、血糖値を測定した。さらに、各時点の血液を4℃で遠心分離し、血清を集めた。続いて、血清インスリン濃度を、市販のELISAキット(ヒトインスリンELISA、Mercodia、Uppsala、Sweden)で測定した。図9からわかるように、B29−置換複合体の薬物動態プロフィールは、RHIおよび実施例38のB1−置換複合体から統計的に識別不能であり、この複合体も、皮下注射後、血清に素早く吸収され、そこから排出されることを実証している。
この実施例では、皮下投与された例示的な複合体およびインスリンリスプロで得られた血清インスリンおよび血液グルコースプロフィールを比較する。インスリンリスプロ(HUMALOG(登録商標))は、最後から2番目のリシンおよびB鎖のC末端上のプロリン残基が逆転している速効型インスリン類縁体である。この修飾により、インスリン多量体の形成がブロックされる。溶解型組換えヒトインスリン(RHI)のデータは、比較のためにも提供される(実施例38および図8参照)。
この実施例では、一連の皮下投与された例示的な複合体で得られた血液グルコースプロフィールを比較する。例示的な複合体は、TSAT−C6を骨格として、およびNH2−B1−BOC2(A1,B29)−インスリンを薬物として使用して合成した。リガンド組成は、様々な親和力をカバーする複合体AEM−2、AEBM−2、AETM−1、AEBM−1およびAETM−2(最も低い親和性から最も高い親和力)によって変化させた。インスリン複合体は、図45に、I−1、I−2、I−3およびI−4として示す。各実験で、複合体を、5U/kg(3.5U/kgのAEM−2)で、絶食させた正常非糖尿病ラット(雄スプラーグ−ドーレイ、400〜500g、n=6)の首の後ろに注射した。血液サンプルを、尾血管出血によって、0分、および注射から30、60、90、120、150、180、210、240および300分後に集めた。市販の検査片(Precision Xtra、Abbott Laboratories、Abbott Park、IL)を使用して、血糖値を測定した。さらに、各時点の血液を4℃で遠心分離し、血清を集めた。続いて、血清インスリン濃度を、市販のELISAキット(ヒトインスリンELISA、Mercodia、Uppsala、Sweden)で測定した。
実施例41に記載したデータを鑑み、本発明者らは、より高いリガンドを有する複合体で観察される減少したPKプロフィールおよび生物活性は、内因性糖結合分子により強く結合することに起因し得るという仮定した。たとえば、いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、界面活性タンパク質AおよびD、またはセレクチンファミリーのメンバーのような内因性「レクチン様」タンパク質への結合が、これらの複合体を、低い親和力のリガンドを有する複合体より素早く排除されるようにし得ると仮定した。
実施例42に記載したデータに鑑み、本発明者らは、α−メチルマンノース(a−MM)が血清複合体濃度を誘発し、生物活性は皮下注射部位からの吸収速度の増加の結果であったかどうかの測定を試みる。この実験では、高親和力TSAT−C6−AETM−2複合体I−2を使用した。先ず、緩衝生理食塩水溶液または1Mのa−MMを含有する緩衝生理食塩水溶液のどちらかを使用して、複合体を5U/ml(0.2mg/mlインスリン当量)の濃度に希釈した。各溶液を5U/kgの用量で、3匹の非糖尿病雄SDラットそれぞれの首の後ろに、0時でsub−Q注射し、注射後、0分、ならびに15、30、45、60、90、120、150、180、240および300分で尾静脈出血により血液サンプルを集めた。市販の検査片(Precision Xtra、Abbott Laboratories、Abbott Park、IL)を使用して、血糖値を測定した。さらに、各時点の血液を4℃で遠心分離し、血清を集めた。続いて、血清インスリン濃度を、市販のELISAキット(ISOインスリンELISA、Mercodia、Uppsala、Sweden)で測定した。この実験で、a−MM複合体溶液を受けたラットは、15分で、別の後ろ四半部注射部位に、緩衝生理食塩水溶液のsub−Q注射も受けた。生理食塩水複合体溶液を受けたラットは、15分で、別の後ろ四半部注射部位に、a−MM溶液のsub−Q注射も受けた。これら15分遅れた注射は、複合体溶液のその量のa−MM sub−Q注射は、図18で表されるa−MMで誘発される効果に関与するほど高くa−MMの全身濃度を上昇しないことを確かめるために使用した。
図22における結果に基づいて、a−MM増強PKおよび生物活性結果は、注射部位での吸収の増加で説明することはできず、むしろ複合体が吸収された後に起こる全身効果の結果に違いない。以下の2つの仮定は、そのような挙動を説明できる。(a)複合体は、競合糖によって干渉され得るレクチン依存性機序によって体から排出される、または(b)複合体は、体内のレクチンに結合され、競合糖の存在下にのみ循環に放出される。(b)の場合、複合体がsub−Qデポーから完全に吸収された後、a−MMを動物に導入することにより、吸収された複合体が、体内のレクチン部位から放出され、これにより、その血清濃度および生物活性を増加させることが予測される。しかし、排出機序が(a)で記載したように作用するなら、複合体は体からすでに完全に排出されているので、複合体がsub−Qデポーから十分に吸収された後のa−MMの注射は、血清濃度または生物活性の増加をもたらさない。
■
[a−MM腹腔内注射遅延時間(分)]: [サンプル時点(注射後の分)]
[15]: [15,30,45,60,90,120,150,180,240,300,360]
[60]: [15,30,45,60,75,90,120,150,180,240,300,360]
[120]: [15,30,45,60,90,120,135,150,180,240,300,360]
[240]: [15,30,45,60,120,180,240,255,270,300,360]
■
血糖値を市販の試験片(Precision Xtra、Abbott Laboratories、Abbott Park、IL)を使用して測定した。さらに、各時点の血液を4℃で遠心分離し、血清を集めた。続いて、血清インスリン濃度を、市販のELISAキット(ISOインスリンELISA、Mercodia、Uppsala、Sweden)で測定した。
実施例42に記載したデータに鑑み、本発明者らは、実施例42で使用したAETMリガンドとは異なる糖リガンドを使用して合成した複合体の薬物動態および薬力学的挙動の測定を試みる。この実施例では、TSAT−C6骨格を使用し、以下の複合体を、実施例20に記載された方法に従って合成した(注:グルコサミンHClまたはGA−HClは、Sigma−Aldrich(St.Louis、MO)から購入し、さらに精製することなく使用した)。
この実施例では、数が増えている例示的な糖リガンドが、共有結合で結合している複合体の薬物動態および薬力学的挙動の測定を試みた。全ての複合体は、実施例20に記載された方法に従って、以下に特定する骨格および糖リガンドを使用して合成した。
実施例44で得られた結果は、競合糖の存在によって干渉され得るレクチン依存性機序を介して、体から排出される例示的な複合体と一致している。この機序をより詳しく探求するために、本発明者らは、例示的な複合体に関し、以下の実験を行い、複合体化されていないインスリンに対する血清インビボから排除される速度を測定した。この試験で使用した複合体は全て、実施例20で記載した一般的な方法に従って合成した。
この実施例では、例示的な複合体の排出速度は、生理的濃度のグルコースの存在下で抑制され得るとさらに仮定した。高血糖状態下で、複合体がインビボで血清から排出される速度を測定するために、以下の実験を行った。各実験で、頸静脈にデュアルカニューレを処置された雄Sprague−Dawleyラット(Taconic、JV/JV、350〜400g、n=3)に、I−7を、0.4mgの複合体/kg体重で投薬した。
この実施例では、任意の高濃度のグルコース以外の抑制作用のある糖、たとえば、α−メチル−マンノース(a−MM)の存在により、インスリン糖複合体の排出速度が抑制され得るとさらに仮定した。a−MMの存在下、例示的な複合体がインビボで血清から排出する速度を測定するために、以下の実験を行った。各実験で、頸静脈にデュアルカニューレを処置された雄Sprague−Dawleyラット(Taconic、JV/JV、350〜400g、n=3)に、溶解性複合体を、0.4mgの複合体/kg体重で投薬した。
この実施例の第四の組は、いくつかの例示的な複合体の合成、製剤および特性を調べる種々の実験を記載する。
先の実施例のデータが糖依存性血清排出機序と一致するなら、本発明者らは、皮下注射部位からの吸収の一定の持続速度を提供する複合体の製剤を開発を試みる。一定の吸収速度で、任意の時点での血清複合体濃度は、主に、糖−依存性排出速度によって制御される。そのような方法で、本発明者らは、糖応答性PKプロフィールを発揮する持続型徐放性インスリンを製剤化することができる。
この実施例の目的は、例示的な複合体の時間動作におけるプロタミン濃度の効果およびグルコース−応答性PKプロフィールを示すことであった。この実施例では、実施例20に記載の方法に従って合成したI−6を全身性製剤および実施例50で記載したインビボプロトコルを使用して試験した。
この実施例の目的は、例示的な複合体の製剤安定性、時間動作およびグルコース−応答性PKプロフィールにおける亜鉛濃度の効果を示すことであった。この実施例では、実施例20に記載の方法に従って合成したI−6を全身性製剤および実施例50で記載したインビボプロトコルを使用して試験した。
この実施例の目的は、例示的な複合体の時間動作およびグルコース−応答性PKプロフィールにおけるm−クレゾール濃度の効果を示すことであった。この実施例では、実施例20に記載の方法に従って合成したI−6を全身性製剤および実施例50で記載したインビボプロトコルを使用して試験した。
この実施例の目的は、例示的な複合体の時間動作およびグルコース−応答性PKプロフィールにおける塩濃度および等張剤の選択を示すことであった。この実施例では、実施例20に記載の方法に従って合成したI−6を全身性製剤および実施例50で記載したインビボプロトコルを使用して試験した。
この実施例の目的は、例示的な複合体の時間作用およびグルコース応答性PKプロフィールに対する異なる濃度の無修飾インスリンの効果を実証することであった。この実施例では、実施例20に記載の方法に従って合成したI−6を全身性製剤および実施例50で記載したインビボプロトコルを使用して試験した。
この実施例で、本発明者らは、例示的な持続型複合体の特定の製剤の用量応答効果を評価した。実施例20に記載の方法に従って合成した複合体I−6を全身性製剤および実施例50で記載したインビボプロトコルを使用して試験した。
この実施例では、本発明者らは、実施例56の持続型製剤と正確に同じ製剤を2倍スケールで合成した。物質の半分を2〜8℃で、残りの半分を室温で1週間または2週間保存した。特定した保存時間後、物質を再分散し、実施例56で記載したものと同じ4時間グルコース腹腔内注射プロトコルを使用して、15U/kgの用量で(体重(単位:g)/1.87=マイクロリットル、注入量)試験した。図38〜39に示すように、この製剤は、少なくとも2週間、冷凍保存後(図38)または室温保存後(図39)であっても、類似した性能を示した。
この実施例では、本発明者らは、異なる種類および数のリガンドから作られた複合体の持続型製剤の時間動作およびグルコース−応答性PKプロフィールの測定を試みた。この実施例の全ての複合体は、以下に明記する骨格および糖リガンドを使用して実施例20に記載する方法に従って合成した。
この実施例では、本発明者らは、TSAT−C6−AETM−2(I−6)およびTSAT−C6−GA−2(I−5)複合体から造った複合体の持続型製剤のa−MM−応答性プロフィールを試験した。両複合体とも、実施例20に記載された一般的方法に従って調製した。さらに、各複合体について、以下の持続型製剤を使用した。
持続型TSAT−C6−AETM−2(I−6)製剤のインビボでの有用性を確認するために、本発明者らは、これを(5、10および20U/kg)、正常およびSTZ−誘発糖尿病ラット(雄Sprague−Dawley、400〜500g、n=6)に投与した。製剤は、以下の手法を使用して調製した。
例示的な複合体の持続型形態を作るために、プロタミン亜鉛インスリンへの代替の取組みを使用することができることは理解される。この実施例で、本発明者らは、B29−ε−アミン基を長鎖脂肪酸で共有結合により修飾することによる、B1−置換インスリン複合体の持続型製剤への変換の方法を実証する。米国特許第6,869,930号に記載されているように、C14−ミリスチン酸でのインスリンアシル化により、たとえば、平坦な、遅延性時間作用プロフィールを有する溶解性物質が得られる。B1−置換TSAT−C6−AETM−2(I−2)は、実施例12に記載された方法に従って合成する。次いで、物質を凍結乾燥し、乾燥粉末とし、以下の手順で出発物質として使用する。
複合体の持続型形態を作るために、プロタミン亜鉛インスリンへのさらに他の代替の取組みを使用することができることは理解される。この実施例では、本発明者らは複合体の調製において、たとえば、野生型ヒトインスリンの代わりに、インスリングラルギン(LANTUS(登録商標))に置換することによる、持続型複合体の合成の方法を実証する。インスリングラルギン−複合体を形成するために、先の実施例に記載されているあらゆる合成方法を使用してよい。インスリングラルギンは、Asp−A21がグリシンで置き換えられ、および2個のアルギニンがB鎖のC−末端に付加された例示的な持続型インスリン類縁体である。これらの変化の効果は、等電点をシフトさせることであり、pH4で完全に溶解する溶液を作り出すが、生理的pHでは溶解されない。合成し、精製したら、次いで、得られた複合体の遅延性および糖応答性PK/PDプロフィールを、実施例50および59に記載の4時間IPグルコースまたはa−MM条件を使用して、評価してもよい。
糖応答性複合体を持続型製剤に製剤化する代わりに、それぞれを、ポンプ送達システムを使用して、静脈、皮下、腹腔内に連続的に注入してもよい。公知の濃度(通常、25〜100U/ml)の複合体の無菌溶液を、ポンプ貯蔵部に負荷し、一定の速度で、選ばれた分画に連続的に送達される。この速度は、対象に低血糖が観測されない最大レベルに調整される。次いで実施例50および59に記載される4時間IPグルコースまたはa−MM条件を使用して、グルコース応答性PK/PDプロフィールを評価することができる。ポンプ方法は、複合体の一定の投与および吸収速度を得るのに、賦形剤を必要としない点で有利である。種々のインスリンポンプが、当分野において記載され、この目的のために使用されてもよい。たとえば、米国特許第4,435,173号、第4,498,843号、第4,923,375号、第5,062,841号、第6,650,951号、第6,744,350号、第6,852,104号、第7,377,907号および第7,515,060号、ならびに米国特許公開公報第20080172028号、第20090005726号、第20090112165号、第20090137957号、第20090177142号、第20090177154号および第20100004598号に記載のポンプのいずれか1つを参照。これらはそれぞれ、参照によって本明細書に組み込まれる。
この実施例は、実施例64の中間体Z9AからB1−複合体化インスリンを調製する方法を記載する。以下のように、化合物Z9Aをインスリンに複合体化した。実施例8に従って合成されたNH2−B1−BOC2(A1,B29)−インスリン(0.167g)を、窒素下室温で、乾燥DMSO(3mL)に溶解し、室温で0.5時間攪拌した。この溶液に、窒素下室温で、無水トリエチルアミン(0.013mL)を加えた。乾燥DMSO(1.5mL)中の化合物Z9A(0.177g)を、室温、80rpmの攪拌速度で、(4.2uL/分)の速度のシリンジポンプを介して、インスリン−トリエチルアミン混合物に加えた。反応変換を分析HPLCによってモニターした。4時間後、別の3当量のTEA(0.010mL)を反応混合物に加えた。室温で合計10.5時間後、反応を停止させ、−20℃の冷凍庫に一晩置いた。
この実施例は、実施例64の中間体Z9AからB29−複合体化インスリンを調製する方法を記載する。以下のように、化合物Z9Aをインスリンに複合体化する。実施例16(0.167g)に従って合成されたNH2−B29−BOC2(A1,B1)−インスリンを、窒素下室温で、乾燥DMSO(3mL)に溶解し、室温で0.5時間攪拌する。この溶液に、窒素下室温で、無水トリエチルアミン(0.013mL)を加える。乾燥DMSO(1.5mL)中の化合物Z9A(0.177g)を、室温、80rpmの攪拌速度で、(4.2uL/分)の速度のシリンジポンプを介して、インスリン−トリエチルアミン混合物に加える。反応変換を分析HPLCによってモニターした。4時間後、別の3当量のTEA(0.010mL)を反応混合物に加えた。室温で合計10.5時間後、反応を停止させ、−20℃の冷凍庫に一晩置く。
この実施例では、実施例64の中間体Z9AからB29−複合体化インスリンを調製する他の方法を記載する。具体的には、この代替方法は、化合物Z9Aを、B29ε−アミノ基で保護されていないインスリンに直接カップリングすることを含む。化合物Z9Aを53mMで1.0mlの無水DMSOに溶解し、次いで0.4ml(過剰)のトリエチルアミン(TEA)を添加した。溶液を室温で5分間素早く攪拌する。次いで別途、組換えヒトインスリン(RHI)粉末を、17.2mMで、0.1MのpH11炭酸ナトリウム緩衝液1mlに溶解し、続いてpHを、1.0N水酸化ナトリウムで、10.8に調整した。溶解したら、化合物Z9Aの全溶液を、10分かけてインスリン/炭酸塩緩衝溶液に滴下した。滴下添加終了後、該溶液をさらに15分攪拌し、反応の完了を確実にした。
この実施例で、本発明者らは、実施例64の化合物Z9Aから構成した複合体の持続型製剤の時間作用およびグルコース応答性PKプロフィールの測定を試みる。この実施例用の複合体は、実施例67に記載した方法に従って合成した。以下の持続型製剤を、この複合体のために使用した。
実施例42のデータは、例示的な複合体のPKプロフィールの増加に導く推定レクチン経路を抑制するL−フコースの能力を実証する。また、β−架橋N−アセチルグルコサミンも、マンノースおよびフコースが抑制剤である経路を抑制し得ることも知られている(たとえば、Haurumら、Biochem.J.293:873−878、1993)。この実施例では、先に記載したもののようなインスリン複合体を、2−アミノエチルα−L−フコピラノシドまたは2−アミノエチルN−アセチル−β−D−グルコサミンリガンドを使用して合成する方法を記載する。2−アミノエチルα−L−フコピラノシド(MW=207g/mol)は、Niら、Bioconjugate Chem.14:232−238,2003の方法に従って調製する。2−アミノエチルN−アセチル−β−D−グルコサミン(MW=264g/mol)は、Caiら、Organic Letters7:4021−4024,2005の方法に従って合成する。これらのリガンドのいずれか1つは、上記実施例11〜13、15、17〜27および29〜31の複合体合成方法のいずれかで、容易に、アミノ−官能化糖リガンドの代わりとすることができる。
ある実施形態では、インスリン分子は、ヒトインスリン、ブタインスリンおよびウシインスリンからなる群から選択される。ある実施形態では、インスリン分子は、インスリングラルギンまたはインスリンデテミルである。ある実施形態では、インスリン分子は、3個のジスルフィド架橋を含む。
ある実施形態では、インスリン分子は、ヒトインスリン、ブタインスリンおよびウシインスリンからなる群から選択される。ある実施形態では、インスリン分子は、インスリン グラルギンまたはインスリンデテミルである。ある実施形態では、インスリン分子は、3個のジスルフィド架橋を含む。
実施例74−例示的な製剤
ある実施形態で、本開示は、複合体を含む徐放性製剤であって、プロタミンおよび亜鉛を含む製剤を提供する。本開示は、本明細書で記載する複合体(たとえば、図45、49、55、60、61または62の複合体のいずれか1つが挙げられるが、これらに限定されない)のいずれか1つを有する徐放性製剤を包含することは、理解される。
約0.15〜約0.35%v/vのm−クレゾールと;
グリセロールまたは約0.1〜約0.2MのNaClとを含む。
約3.6mgのプロタミン/mg複合体と;
約0.2mgの亜鉛/mg複合体とを含む。
約3.6mgのプロタミン/mg複合体と;
約0.2mgの亜鉛/mg複合体と;
複合体化インスリン分子の複合体化されていないインスリン分子に対するモル比を約5:1で含む。
約3.6mgのプロタミン/mg複合体と;
約0.2mgの亜鉛/mg複合体と;
複合体化インスリン分子の複合体化されていないインスリン分子に対するモル比を約5:1で;および
約0.2%v/vのm−クレゾールとを含む。
約3.6mgのプロタミン/mg複合体と;
約0.2mgの亜鉛/mg複合体と;
複合体化インスリン分子の複合体化されていないインスリン分子に対するモル比を約5:1で;および
約0.2%v/vのm−クレゾールと;
グリセロールまたは約0.15MのNaClとを含む。
ステップ1
インスリンを、14.7mMの濃度で、100mM炭酸ナトリウム緩衝液(pH11)およびアセトニトリルの66:37の体積:体積混合物に溶解する。別に、単官能性保護基−活性化エステル(たとえば、BOC−NHS)を467mMで、アセトニトリルに溶解する。インスリンが溶解したら、単官能性保護基−活性化エステル(たとえば、BOC−NHS)の小量のアリコートを、インスリン溶液に加える。pHをプロセス全体にわたってモニターし、0.1Mの水酸化ナトリウムを加えることによって、10.2〜11.0の間に維持する。反応を逆相HPLCによりモニターする。HPLCクロマトグラムが、無修飾インスリンの全てが反応し、反応混合物の相当部分がB29−保護インスリンに変換されたことを示すまで、単官能性保護基−活性化エステルのアリコートを加える。通常、保護基は実際より疎水性であり、インスリンに反応すると、無修飾インスリンより長いHPLC保持時間で溶出する。
別々に、N末端活性化エステルを含有する骨格を、174mMで、1.267mlの無水DMSOに溶解し、100ul(過剰)のトリエチルアミン(TEA)を添加する。溶液を室温で10分素早く攪拌する。他のバイアルで、リガンドの370mM溶液を、適切な容量の乾燥DMSO中で調製する。溶解したら、最初の活性化エステル基の数N−1の3倍に等しい数の反応性等価物を与えるのに十分な量の溶液を加える。たとえば、1つの骨格当たりN=3の初期活性化エステル基があれば、(3×(3−l)×60mM/370mM)=0.973mlのリガンド溶液を加える。1つの骨格当たりN=4の初期活性化エステル基があれば、(3×(4−l)×60mM/370mM)=1.46mlのリガンド溶液を加える、など。リガンド溶液を加えた後、該溶液を室温で1時間攪拌し、反応の完了を確実にする。
ステップ1で記載したように、インスリンが保護基と十分反応し、およびステップ2で、骨格とリガンドとの間で十分反応が起こった後、ステップ2の骨格−リガンド溶液を、インスリン溶液に、一定量に分割して、滴下する。得られた反応物をHPLCでモニターする。アリコートをB29−保護インスリンが十分反応するまで加え、目的のB29−保護、A1−骨格/リガンド、インスリン複合体を得る。リガンド−骨格は、しばしば、インスリンより親水性なので、目的生成物の出現時間は、B29−インスリン(ステップ1から)と比べてより短いHPLC保持時間の明らかなシフトによって合図される。目的レベルの反応を達成したら、反応溶液を0.150MのNaClを含有するpH5.0HEPES緩衝生理食塩水溶液20mMで10倍まで希釈し、pHを希HClで最終pH8.0に調整する。該水溶液を、先ず、複合体化物質と複合体化されていない物質の所望の分離に適切な固相を使用する、サイズ排除によって精製する。次いでカラムボイド体積を通過した溶液を、適切なサイズの限外ろ過膜を使用して、約10mlに濃縮する。この溶液を、Waters Symmetry Prep C18、7umカラム、19×150mmの分取逆相HPLCを使用して、さらに精製し、目的生成物を得る。緩衝液Aは、0.1%TFAを含有する脱イオン水であり、緩衝液Bは、0.1%TFAを含有するアセトニトリルである。精製前に、カラムを、Waters Deltra Prep 600システムで、80%A/20%B移動相を用い15ml/分で平衡化する。約5mlの粗溶液を、2分間かけて15ml/分の流速でカラムに注入し、その後、80%A/20%Bから75%A/25%Bまでの線形勾配を次の5分間にわたって、次いで75%A/25%Bから62%A/38%Bのよりゆるやかな線形勾配を次の22分間にわたって使用する。目的ピークの保持時間は、使用されるインスリン、骨格およびリガンドによって変化する。収集した時点で、該溶液をロートバップしアセトニトリルを除去し、凍結乾燥し、純粋な単一保護インスリン複合体を得る。
次いで、全ての場合において、保護基をインスリン複合体から除去する。ステップ1でBOC保護基を使用する場合、BOC基は、ステップ3に従って得た凍結乾燥した粉末を、4℃で1時間、90%TFA/10%アニソール中に溶解して除去し、次いで0.150MのNaClを含有するHEPES pH8.2緩衝液25mMで10倍希釈する。(BOC以外の保護基がアミン含有薬物に存在する場合、適切な脱保護条件をTFA/アニソールの代わりに使用する。保護剤のリストおよび脱保護条件は、定義の項で記載したように、Protecting Groups in Organic Synthesis,T.W.GreeneおよびP.G.M.Wuts,第3編,John Wiley&Sons,1999に見出せる。)NaOH溶液を使用し、pHを7.0と8.0との間に調整し、その後、物質をBiogel P2カラムに通し、アニソール、BOCおよび脱保護の他の低MW副生成物、ならびに他の混入塩を除去する。次いで、Amicon 3K膜(Millipore、Billerica、MA)を使用して、脱保護され、精製された複合体水溶液を、約66Uのインスリン/ml(A280測定に基づく)に濃縮し、必要になるまで4℃で保存する。最終複合体の同定は、LC−MS(HT Laboratories、San Diego、CA)により検証する。複合のA1部位を、N末端シークエンス解析(Western Analytical、St.Louis、MO)によって確認し、GlyA1をリガンド含有骨格で置換したことにより、>95%のPhe−B1−鎖末端が存在し、<5%のGlyA1−鎖末端が存在することが明らかになる。
ステップ1
N末端活性化エステルを含有する骨格を、147mMで、2.5mlの無水DMSOに溶解し、1.0ml(過剰)のトリエチルアミン(TEA)を添加する。溶液を室温で10分素早く攪拌する。別のバイアルで、リガンドの272mM溶液を、適切な容積の乾燥DMSO中で調製する。溶解すれば、最初の活性化エステル基の数N−1の3倍に等しい数の反応性等価物を与えるのに十分な溶液を加える。たとえば、1つの骨格当たりN=3の初期活性化エステル基があれば、(3×(3−l)×60mM/370mM)=0.973mlのリガンド溶液を加える。1つの骨格当たりN=4の初期活性化エステル基があれば、(3×(4−l)×60mM/370mM)=1.46mlのリガンド溶液を加える、など。リガンド溶液を加えた後、該溶液を室温で1時間攪拌し、反応の完了を確実にする。
インスリンを、1.5mLの100mM炭酸ナトリウム緩衝液(pH11)に、17.2mMの濃度で溶解する。溶液のpHを、必要であれば、0.1MのNaOHを加えることによって、約11に維持する。インスリンが溶解したら、骨格−リガンド溶液の少量のアリコートをインスリン溶液に加える。pHをプロセス全体にわたってモニターし、0.1M水酸化ナトリウムを加えることによって、10.2〜11.0の間に維持する。反応を逆相HPLCでモニターする。HPLCクロマトグラムが、実質的に全ての無修飾インスリンが反応し、反応混合物の相当部分がごく一部の一反応インスリン/骨格/リガンド複合体に変換され、および大部分の生成物が二反応インスリン/骨格/リガンド複合体であることを示すまで、骨格−リガンド溶液のアリコートを加える。通常、骨格−リガンド構造は無修飾インスリンより親水性であり、一および二反応アミン含有薬物生成物は、無修飾インスリンより短いHPLC保持時間で溶出される。同様に、目的生成物、二置換インスリン複合体のHPLCピークは、一置換インスリン複合体の保持時間より短い保持時間で現れる。
ステップ2で記載するように、インスリンが十分に骨格リガンドと反応すれば、溶液を、0.150MのNaClを含有するpH5.0HEPES緩衝生理食塩水溶液20mMで10倍まで希釈し、次いで希HClで最終pH8.0に調整する。該水溶液を、先ず、複合体化物質と複合体化されていない物質の所望の分離に適切な固相を使用する、サイズ排除によって精製する。次いでカラムボイド体積を通過した溶液を、適切なサイズの限外ろ過膜を使用して、約10mlに濃縮する。この溶液を、Waters Symmetry Prep C8、7umカラム、19×150mmの分取逆相HPLCを使用して、さらに精製し、目的生成物を得る。緩衝液Aは、0.1%TFAを含有する脱イオン水であり、緩衝液Bは、0.1%TFAを含有するアセトニトリルである。精製前に、カラムを、Waters Deltra Prep 600システムで、80%A/20%B移動相を用い15ml/分で平衡化する。約5mlの粗溶液を、2分間かけて15ml/分の流速でカラムに注入し、その後、80%A/20%Bから75%A/25%Bまでの線形勾配を次の5分間にわたって、次いで75%A/25%Bから62%A/38%Bのよりゆるやかな線形勾配を次の22分間にわたって使用する。目的ピークの保持時間は、使用されるインスリン、骨格およびリガンドによって変化する。収集した時点で、該溶液をロートバップしアセトニトリルを除去し、凍結乾燥し、純粋な複合体を得る。最終複合体の同定は、LC−MS(HT Laboratories、San Diego、CA)により検証する。複合のA1,B29部位を、N末端シークエンス解析(Western Analytical、St.Louis、MO)によって確認し、GlyA1をリガンド含有骨格で置換したため、>95%のPhe−B1−鎖末端が存在し、<5%のGlyA1−鎖末端が存在することが明らかになる。
ステップ1
N末端活性化エステルを含有する骨格を、147mMで、2.5mlの無水DMSOに溶解し、1.0ml(過剰)のトリエチルアミン(TEA)を添加する。溶液を室温で10分素早く攪拌する。別のバイアルで、リガンドの272mM溶液を、適切な容積の乾燥DMSO中で調製する。溶解すれば、最初の活性化エステル基の数N−1の3倍に等しい数の反応性等価物を与えるのに十分な溶液を加える。たとえば、1つの骨格当たりN=3の初期活性化エステル基があれば、(3×(3−l)×60mM/370mM)=0.973mlのリガンド溶液を加える。1つの骨格当たりN=4の初期活性化エステル基があれば、(3×(4−l)×60mM/370mM)=1.46mlのリガンド溶液を加える、など。リガンド溶液を加えた後、該溶液を室温で1時間攪拌し、反応の完了を確実にする。
3個の反応性アミン基を含有するインスリンであって、ここで、それぞれの反応性アミン基は、識別可能なpKa(たとえば、野生型インスリンの場合、pKa GlyA1=8.0、PheB1=6.7、LysεB29=11.2;Meiら,Pharm.Res.16:1680−1686,1999参照)を有し、最も高いpKaアミン基(たとえば、LysB29)は、単官能性保護基−活性化エステル(たとえば、BOC−NHS)で先に一保護されている、3個の反応性アミン基を含有するインスリンを、17.2mMの濃度で、1.5mLのDMSOに溶解する。B29−BOC−インスリンが溶解したら、骨格−リガンド溶液の少量のアリコートを、B29−BOC−インスリン溶液に加える。反応を逆相HPLCでモニターする。HPLCクロマトグラムが、実質的に全てのB29−BOC−インスリンが反応し、反応混合物の相当部分がごく一部の一反応B29−BOC−インスリン/骨格/リガンド複合体に変換され、および大部分の生成物が二反応B29−BOC−インスリン/骨格/リガンド複合体であることを示すまで、骨格−リガンド溶液のアリコートを加える。通常、骨格−リガンド構造は、B29−BOC−インスリンより親水性であり、一複合体化および二複合体B29−BOC−インスリン複合体は、無修飾B29−BOC−インスリンより短いHPLC保持時間で溶出される。同様に、目的生成物、二置換B29−BOC−インスリン−複合体のHPLCピークは、一置換B29−BOC−インスリン−複合体の保持時間より短い保持時間で現れる。
ステップ2で、B29−BOC−インスリンがリガンド含有骨格と十分反応したら、次いで、溶液を、0.150MのNaClを含有するpH5.0 HEPES緩衝生理食塩水溶液20mMで10倍希釈し、次いでpHを希HClで最終pH8.0に調整する。該水溶液を、先ず、複合体化物質と複合体化されていない物質の所望の分離に適切な固相を使用する、サイズ排除によって精製する。次いでカラムボイド体積を通過した溶液を、適切なサイズの限外ろ過膜を使用して、約10mlに濃縮する。この溶液を、Waters Symmetry Prep C8、7umカラム、19×150mmの分取逆相HPLCを使用して、さらに精製し、目的生成物を得る。緩衝液Aは、0.1%TFAを含有する脱イオン水であり、緩衝液Bは、0.1%TFAを含有するアセトニトリルである。精製前に、カラムを、Waters Deltra Prep 600システムで、80%A/20%B移動相を用い15ml/分で平衡化する。約5mlの粗溶液を、2分間かけて15ml/分の流速でカラムに注入し、その後、80%A/20%Bから75%A/25%Bまでの線形勾配を次の5分間にわたって、次いで75%A/25%Bから62%A/38%Bのよりゆるやかな線形勾配を次の22分間にわたって使用する。目的ピークの保持時間は、使用されるインスリン、骨格およびリガンドによって変化する。収集した時点で、該溶液をロートバップしアセトニトリルを除去し、凍結乾燥し、純粋な複合体を得る。
次いで、全ての場合において、保護基を複合体から除去する。ステップ1でBOC保護基を使用する場合、BOC基は、ステップ3に従って得た凍結乾燥した粉末を、4℃で1時間、90%TFA/10%アニソール中に溶解して除去し、次いで0.150MのNaClを含有するHEPES pH8.2緩衝液25mMで10倍希釈する。(BOC以外の保護基がアミン含有薬物に存在する場合、適切な脱保護条件をTFA/アニソールの代わりに使用する。保護剤のリストおよび脱保護条件は、定義の項で記載したように、Protecting Groups in Organic Synthesis,T.W.GreeneおよびP.G.M.Wuts,第3編,John Wiley&Sons,1999に見出せる。)NaOH溶液を使用し、pHを7.0と8.0との間に調整し、その後、物質をBiogel P2カラムに通し、アニソール、BOCおよび脱保護の他の低MW生成物、ならびに任意の他の混入塩を除去する。次いで、Amicon 3K膜(Millipore、Billerica、MA)を使用して、脱保護され、精製された複合体水溶液を、約66Uのインスリン/ml(A280測定に基づく)に濃縮し、必要になるまで4℃で保存する。最終複合体の同定は、LC−MS(HT Laboratories、San Diego、CA)により検証する。複合のA1,B1部位を、N末端シークエンス解析(Western Analytical、St.Louis、MO)によって確認し、両末端ともリガンド含有骨格で置換したため、基本的に、Phe−B1−鎖末端は存在せず、GIy−A1−鎖末端も存在しないことが明らかになる。
ステップ1
N−末端活性化エステルを含有する骨格を、147mMで、2.5mlの無水DMSOに溶解する。先の実施例とは違い、塩基は加えない。溶液を室温で10分素早く攪拌する。別のバイアルで、リガンドの272mM溶液を、適切な容積の乾燥DMSO中で調製する。溶解すれば、最初の活性化エステル基の数N−1の3倍に等しい数の反応性等価物を与えるのに十分な溶液を加える。たとえば、1つの骨格当たりN=3の初期活性化エステル基があれば、(3×(3−l)×60mM/370mM)=0.973mlのリガンド溶液を加える。1つの骨格当たりN=4の初期活性化エステル基があれば、(3×(4−l)×60mM/370mM)=1.46mlのリガンド溶液を加える、など。リガンド溶液を加えた後、該溶液を室温で1時間攪拌し、反応の完了を確実にする。
3個の反応性アミン基を含有するインスリンであって、ここで、それぞれの反応性アミン基は、識別可能なpKa(たとえば、野生型インスリンの場合、pKa GlyA1=8.0、PheB1=6.7、LysεB29=11.2;Meiら,Pharm.Res.16:1680−1686,1999参照)を有し、中間のpKaを持つアミノ基(たとえば、野生型インスリンについてはGlyA1)は、単官能性保護基−活性化エステル(たとえば、BOC−NHS)で先に一保護されている、3個の反応性アミン基を含有するインスリンを、17.2mMの濃度で、1.5mLのDMSOに溶解する。(A1−BOC−インスリンは、A1,B29−ジBOC−インスリン、A1−BOC−インスリンおよびB29−BOC−インスリン生成物の分布を得るために、数当量のBOC試薬と反応させる以外、実施例8の手順を使用して調製することができる。A1−BOC−インスリンは、RP−HPLCで単離することができ、N末端シークエンス解析で確認することができる)A1−BOC−インスリンが溶解したら、骨格−リガンド溶液の少量のアリコートを、A1−BOC−インスリン溶液に加える。反応を逆相HPLCでモニターする。HPLCクロマトグラムが、実質的に全ての無修飾A1−BOC−インスリンが反応し、反応混合物の相当部分がごく一部の一複合体化A1−BOC−インスリン/骨格/リガンド複合体に変換され、大部分の生成物が二複合体化A1−BOC−インスリン/骨格/リガンド複合体であることを示すまで、骨格−リガンド溶液のアリコートを加える。通常、骨格−リガンド構造は、A1−BOC−インスリンよりより親水性であり、一および二置換A1−BOC−インスリン複合体は、無修飾A1−BOC−インスリンより短いHPLC保持時間で溶出される。同様に、目的生成物、二置換A1−BOC−インスリン−複合体のHPLCピークは、一置換A1−BOC−インスリン−複合体の保持時間より短い保持時間で現れる。
ステップ2で、A1−BOC−インスリンが骨格リガンドと十分反応したら、次いで、溶液を、0.150MのNaClを含有するpH5.0HEPES緩衝生理食塩水溶液20mMで10倍希釈し、次いでpHを希HClで最終pH8.0に調整する。該水溶液を、先ず、複合体化物質と複合体化されていない物質の所望の分離に適切な固相を使用する、サイズ排除によって精製する。次いでカラムボイド体積を通過した溶液を、適切なサイズの限外ろ過膜を使用して、約10mlに濃縮する。この溶液を、Waters Symmetry Prep C8、7umカラム、19×150mmの分取逆相HPLCを使用して、さらに精製し、目的生成物を得る。緩衝液Aは、0.1%TFAを含有する脱イオン水であり、緩衝液Bは、0.1%TFAを含有するアセトニトリルである。精製前に、カラムを、Waters Deltra Prep 600システムで、80%A/20%B移動相を用い15ml/分で平衡化する。約5mlの粗溶液を、2分間かけて15ml/分の流速でカラムに注入し、その後、80%A/20%Bから75%A/25%Bまでの線形勾配を次の5分間にわたって、次いで75%A/25%Bから62%A/38%Bのよりゆるやかな線形勾配を次の22分間にわたって使用する。目的ピークの保持時間は、使用される薬物、骨格およびリガンドによって変化する。収集した時点で、該溶液をロートバップしアセトニトリルを除去し、凍結乾燥し、純粋な複合体を得る。
次いで、全ての場合において、保護基を複合体から除去する。ステップ1でBOC保護基を使用する場合、BOC基は、ステップ3に従って得た凍結乾燥した粉末を、4℃で1時間、90%TFA/10%アニソール中に溶解して除去する。BOC以外の保護基がアミン含有薬物に存在する場合、適切な脱保護条件をTFA/アニソールの代わりに使用する。保護剤のリストおよび脱保護条件は、定義の項で記載したように、Protecting Groups in Organic Synthesis,T.W.GreeneおよびP.G.M.Wuts,第3編,John Wiley&Sons,1999に見出せる。脱保護ステップ後、0.150MのNaClを含有するHEPES pH8.2緩衝液25mMで10倍希釈する。NaOH溶液を使用し、pHを7.0と8.0との間に調整し、その後、物質をBiogel P2カラムに通し、アニソール、BOCおよび脱保護の他の低MW生成物、ならびに他の混入塩を除去する。次いで、Amicon 3K膜(Millipore、Billerica、MA)を使用して、脱保護され、精製された複合体水溶液を、約66Uのインスリン/ml(A280測定に基づく)に濃縮し、必要になるまで4℃で保存する。最終複合体の同定は、LC−MS(HT Laboratories、San Diego、CA)により検証する。複合のB1部位を、N末端シークエンス解析(Western Analytical、St.Louis、MO)によって確認し、Phe−B1をリガンド含有骨格で置換したため、>95%のGIy−A1−鎖末端が存在し、<5%のPhe−B1−鎖末端が存在することが明らかになる。
I−6複合体がグルコースまたはa−MMのような抑制糖質の存在化または不存在下で、血清からインビボで排出される速度を測定するために、以下の実験を行った。各実験で、頸静脈にデュアルカニューレを処置された雄Sprague−Dawleyラット(Taconic、JV/JV、350〜400g、n=3)に、溶解性複合体(またはコントロールとしてRHI)を、0.4mg複合体/kg体重で投薬した。
実施例79に記載した静注排出速度実験を、0.4mg複合体/kg体重の単一静注ボーラスから連続静脈内注入に変えた。該実験の目的は、4時間目にグルコース腹腔内注射を投与し、複合体(またはコントロールとしてRHI)の投与量速度を6時間一定に保ち、血清複合体(またはRHI)濃度において得られた効果を測定することであった。各実験で、1つの頸動脈ラインを複合体またはRHIの注入のために、もう1つは血液収集のために用いるように、頸静脈にデュアルカニューレを処置された雄Sprague−Dawleyラット(Taconic、JV/JV、350〜400g、n=3)を使用した。
I−9複合体がグルコースまたはa−MMのような抑制糖質の存在下または不存在下で、血清からインビボで排出する速度を測定するため、以下の実験を行った。各実験で、頸静脈にデュアルカニューレを処置された雄Sprague−Dawleyラット(Taconic、JV/JV、350〜400g、n=3)に、溶解性複合体(またはコントロールとしてRHI)を、0.4mg複合体/kg体重で投薬した。
先に記載したグルコース応答性インスリン複合体結果が、ラットを超えて他の種に及ぶことができるかを判断するため、本発明者らは、ヒトの代わりになる、本明細書では「小型ブタ」とも言う非糖尿病雄ミニブタ(Yucatan strain)における糖依存性インビボ排出速度を探ることに目を向けた。図49にまとめられたインスリン複合体のサブセットに関し、糖依存性排出速度における糖親和力および多価の状態の効果を最初に測定する試験を行った。複合体は、図45でI−7、I−6、I−11およびII−2として示す。この試験で使用した全ての複合体は、実施例20で記載した一般的方法に従って合成した。A1,B29−二置換AETM−2インスリン−複合体II−2を製造するため、B29−一置換AETM−2インスリン−複合体(I−6)合成と比べて、1インスリン分子当たり多価活性エステル骨格およびAETMリガンドの約10倍量を使用した。
図49におけるII−2対他の複合体の性能における明白な違いに基づいて、糖親和力および多価であることの効果から、インスリン複合部位(A1対B29)の効果を切り離し、定量するのが望ましい。したがって、図49でのインスリン複合体の製造で使用した方法に類似する複合方法を使用して、図55に列挙したインスリン複合体(図45にI−12、I−13、I−14、I−15、II−1、II−3およびII−4として示す)、ならびに図60に示すコントロール化合物を合成した。この試験で使用した二置換複合体は全て、実施例20で記載した一般的方法に従って合成した。A1,B29−二置換インスリン複合体を製造するために、B29一置換インスリン−複合体合成と比べて、1インスリン分子当たり、10倍量の多価活性エステル骨格および糖親和力リガンドを使用した。A1だけが置換された物質も、実施例20に記載された一般的方法に従って調製した。しかし、この場合、ジ−tert−ブチルジカルボネートの半分の当量を使用して、実施例8に記載のBOC保護合成から単離した、B29一BOC保護インスリンを使用した。精製したら、実施例12に記載のTFA/アニソール方法を使用して、BOC基を複合体から除去した。
本発明の他の実施形態も、本発明の考察および本明細書に記載された本発明の実施から、当業者には明らかになる。本明細書および実施例は例示としてのみ考えられるもので、本発明の真の範囲および精神は、以下に続く特許請求の範囲によって示されているものである。
Claims (429)
- 薬物と、第一の糖を含むリガンドとを含む複合体であって、該複合体を哺乳類に投与したとき、少なくとも1つの複合体の薬物動態または薬力学的特性が、第二の糖の血清濃度に対し感受性を示すことを特徴とする、複合体。
- 第二の糖がグルコースである、請求項1に記載の複合体。
- 第二の糖が、マンノースである、請求項1に記載の複合体。
- 第二の糖が、L−フコースである、請求項1に記載の複合体。
- 第二の糖がN−アセチルグルコサミンである、請求項1に記載の複合体。
- 第二の糖が、α−メチルマンノースである、請求項1に記載の複合体。
- 薬物のない複合体の分子量が、約10,000Da未満である、請求項1に記載の複合体。
- 薬物のない複合体の分子量が、約250〜約5,000Daの範囲内である、請求項1に記載の複合体。
- 薬物のない複合体の分子量が、約900〜約2,000Daの範囲内である、請求項1に記載の複合体。
- 薬物を含む複合体の分子量が、約20,000Da未満である、請求項1に記載の複合体。
- 薬物を含む複合体の分子量が、約2,000〜約18,000Daの範囲内である、請求項1に記載の複合体。
- 薬物を含む複合体の分子量が、約6,500〜約8,000Daの範囲内である、請求項1に記載の複合体。
- 複合体が、固有の分子量を有する、請求項1に記載の複合体。
- 複合体が、絶食させかつ高血糖状態下で、実質的に異なる血清濃度曲線を有する、請求項1に記載の複合体。
- 高血糖状態が、哺乳類への複合体およびグルコースの同時投与によって誘発される、請求項14に記載の複合体。
- 複合体が、絶食させた状態と比較して、高血糖状態下のほうが高い血清Cmaxを有する、請求項14に記載の複合体。
- 複合体が、絶食させた状態と比較して、高血糖状態下のほうがより高い血清AUCを有する、請求項14に記載の複合体。
- 複合体が、絶食させた状態と比較して、高血糖状態下のほうがより遅い血清排出速度を有する、請求項14に記載の複合体。
- 複合体が、2分画2項分布モデルを使用して、1つは短半減期とおよび1つは長半減期と適合することができる血清濃度曲線を有し、ここで、前記長半減期は、絶食させた状態と比較して、高血糖状態下のほうがより長い、請求項14に記載の複合体。
- 絶食させた状態が、100mg/dL未満の血清グルコースCmaxを含む、請求項14〜19のいずれか一項に記載の複合体。
- 高血糖状態が、200mg/dLを超える血清グルコースCmaxを含む、請求項14〜19のいずれか一項に記載の複合体。
- 複合体が、100および300mg/dLグルコースで実質的に異なる血清濃度曲線を有する、請求項1に記載の複合体。
- 複合体が、300mg/dLグルコースでのほうが、100mg/dLグルコースにおけるより高いCmaxを有する、請求項22に記載の複合体。
- 複合体のCmaxが、300mg/dLグルコースにおいて、少なくとも50%高い、請求項23に記載の複合体。
- 複合体が、300mg/dLグルコースでのほうが、100mg/dLグルコースにおけるより高いAUCを有する、請求項22に記載の複合体。
- 複合体のAUCが、300mg/dLグルコースにおいて少なくとも50%高い、請求項25に記載の複合体。
- 複合体が、100mg/dLグルコースでのほうが、300mg/dLグルコースにおけるより速い血清排出速度を有する、請求項22に記載の複合体。
- 複合体の血清排出速度が、100mg/dLグルコースにおいて、少なくとも25%速い、請求項27に記載の複合体。
- 複合体の血清濃度曲線を、2分画2項分布モデルを使用して、1つは短半減期および1つは長半減期に適合させることができ、および前記長半減期は、300mg/dLにおいてより長い、請求項22に記載の複合体。
- 長半減期が、300mg/dLグルコースにおいて少なくとも50%長い、請求項29に記載の複合体。
- 複合体および複合体化されていない薬物が、高血糖状態下で、実質的に同じ血清濃度曲線を有する、請求項1に記載の複合体。
- 複合体および複合体化されていない薬物が、絶食させた状態下で実質的に異なる血清濃度曲線を有する、請求項1に記載の複合体。
- 複合体および複合体化されていない薬物が、高血糖状態下で実質的に同じであり、絶食させた状態下で実質的に異なる血清濃度曲線を有する、請求項1に記載の複合体。
- 絶食させた状態が、100mg/dL未満の血清グルコースCmaxを含む、請求項31〜33のいずれか一項に記載の複合体。
- 高血糖状態が、200mg/dLを超える血清グルコースCmaxを含む、請求項31〜33のいずれか一項に記載の複合体。
- 複合体が、高血糖状態と比較して、絶食させた状態下で、より低い生物活性を有する、請求項1に記載の複合体。
- 絶食させた状態が、100mg/dL未満の血清グルコースCmaxを含む、請求項36に記載の複合体。
- 高血糖状態が、200mg/dLを超える血清グルコースCmaxを含む、請求項36に記載の複合体。
- 複合体が、100mg/dLグルコースでのほうが、300mg/dLグルコースにおけるより低い生物活性を有する、請求項1に記載の複合体。
- 複合体の生物活性が、300mg/dLグルコースにおいて少なくとも25%高い、請求項39に記載の複合体。
- 哺乳類が、ヒト、イヌ、ネコ、ラットまたは小型ブタである、請求項1〜40のいずれか一項に記載の複合体。
- 哺乳類がヒトである、請求項1〜40のいずれか一項に記載の複合体。
- 薬物が、抗糖尿病薬物である、請求項1に記載の複合体。
- 薬物が、インスリン感受性改善薬である、請求項1に記載の複合体。
- 薬物が、インスリン分泌促進薬である、請求項1に記載の複合体。
- 薬物が、インスリン様成長因子1(IGF−1)である、請求項1に記載の複合体。
- 薬物が、インスリン分子である、請求項1に記載の複合体。
- インスリン分子が、ヒトインスリン、ブタインスリンおよびウシインスリンからなる群から選択される、請求項47に記載の複合体。
- インスリン分子が、インスリンリスプロ、インスリンアスパルトおよびインスリングルリジンからなる群から選択される、請求項47に記載の複合体。
- インスリン分子が、インスリングラルギンまたはインスリンデテミルである、請求項47に記載の複合体。
- インスリン分子が、3個のジスルフィド架橋を含む、請求項47に記載の複合体。
- インスリン分子が、A1アミノ酸残基を介して複合体化している、請求項47に記載の複合体。
- インスリン分子が、B1アミノ酸残基を介して複合体化している、請求項47に記載の複合体。
- インスリン分子が、LysB29のε−アミノ基を介して複合体化している、請求項47に記載の複合体。
- インスリン分子が、LysB3のε−アミノ基を介して複合体化している、請求項47に記載の複合体。
- インスリン分子がトランケートされている、請求項47に記載の複合体。
- インスリン分子が、des(B30)−インスリン、des(B28−B30)−インスリン、des(B27)−インスリン、des(B1)−インスリンまたはdes(B1−B3)−インスリンである、請求項56に記載の複合体。
- 複合体化によって、野生型ヒトインスリンと比較して、インビトロにおけるインスリン受容体親和力の減少がもたらされる、請求項47に記載の複合体。
- インスリン分子が、A3、A4、A5、A8、A9またはB30アミノ酸残基を介して複合体化している、請求項47に記載の複合体。
- インスリン分子が、A1アミノ酸残基およびLysB29のε−アミノ基を介して複合体化している、請求項47に記載の複合体。
- 複合体が、単一のリガンドを含む、請求項1に記載の複合体。
- 複合体が、少なくとも2個の別のリガンドを含み、該リガンドはそれぞれ、糖を含む、請求項1に記載の複合体。
- 複合体が、2個の別のリガンドを含み、該リガンドはそれぞれ、糖を含む、請求項1に記載の複合体。
- 複合体が、3個の別のリガンドを含み、該リガンドはそれぞれ、糖を含む、請求項1に記載の複合体。
- 複合体が、4個の別のリガンドを含み、該リガンドはそれぞれ、糖を含む、請求項1に記載の複合体。
- 複合体が、5個の別のリガンドを含み、該リガンドはそれぞれ、糖を含む、請求項1に記載の複合体。
- 別のリガンドが同じである、請求項62〜66のいずれか一項に記載の複合体。
- 少なくとも2個の別のリガンドが、異なる複合点を介して薬物に複合体化している、請求項62に記載の複合体。
- 少なくとも2個の別のリガンドが、これも薬物に複合体化している単一の複合体骨格に複合体化している、請求項62に記載の複合体。
- 少なくとも2個の別のリガンドおよび薬物が、それぞれ、分岐複合体骨格の別の分岐部に位置する、請求項62に記載の複合体。
- 少なくとも2個の別のリガンドおよび薬物が、それぞれ、分岐複合体骨格の別の分岐部の末端に位置する、請求項70に記載の複合体。
- 複合体骨格が、多分岐状である、請求項70に記載の複合体。
- 複合体骨格が、非ポリマーである、請求項62に記載の複合体。
- リガンドが、グルコース、マンノースおよびL−フコースからなる群から選択される第一の糖を含む、請求項1に記載の複合体。
- リガンドが、マンノサミンおよびβ架橋N−アセチルマンノサミンからなる群から選択される第一の糖を含む、請求項1に記載の複合体。
- リガンドが、メチルグルコース、メチルマンノース、エチルグルコース、エチルマンノース、プロピルグルコースおよびプロピルマンノースからなる群から選択される第一の糖を含む、請求項1に記載の複合体。
- リガンドが、α−L−フコピラノシドを含む、請求項1に記載の複合体。
- リガンドが、ビマンノースを含む、請求項1に記載の複合体。
- リガンドが、トリマンノースを含む、請求項1に記載の複合体。
- リガンドが、直鎖トリマンノースを含む、請求項1に記載の複合体。
- リガンドが、分岐状トリマンノースを含む、請求項1に記載の複合体。
- リガンドが、第一の糖およびアミン基を含む、請求項1に記載の複合体。
- 第一の糖およびアミン基が、C1−C6アルキル基によって分離されている、請求項82に記載の複合体。
- リガンドが、式(IIIa)または(IIIb):
(式中、
各R1は、独立して、水素、−ORy、−N(Ry)2、−SRy、−O−Y、−G−Zまたは−CH2Rxであり;
各Rxは、独立して、水素、−ORy、−N(Ry)2、−SRyまたは−O−Yであり;
各Ryは、独立して、−R2、−SO2R2、−S(O)R2、−P(O)(OR2)2、−C(O)R2、−CO2R2または−C(O)N(R2)2であり;
各Yは、独立して、単糖、二糖または三糖であり;
各Gは、独立して、共有結合または場合によっては置換されたC1−9アルキレンであり、ここで、Gの1個以上のメチレン単位は、場合によっては、−O−、−S−、−N(R2)−、−C(O)−、−OC(O)−、−C(O)O−、−C(O)N(R2)−、−N(R2)C(O)−、−N(R2)C(O)N(R2)−、−SO2−、−SO2N(R2)−、−N(R2)SO2−または−N(R2)SO2N(R2)−で置き換えられ;
各Zは、独立して、ハロゲン、−N(R2)2、−OR2、−SR2、−N3、−C≡CR2、−CO2R2、−C(O)R2または−OSO2R2であり;および
各R2は、独立して、水素または場合によっては置換された、C1−6脂肪族、フェニル、窒素、酸素またはイオウから選択される1〜2個のヘテロ原子を有する4〜7員複素環、または窒素、酸素またはイオウから選択される1〜4個のヘテロ原子を有する5〜6員単環式ヘテロアリール環から選択される基であり;
ただし、リガンドは、合計で、4個以下の単糖部分を含む。) - R1が、水素、−OH、−NHC(O)CH3、−O−Y、−G−Z、−CH2OH、−CH2−O−Yまたは−NH2である、請求項84に記載の複合体。
- Rxが、水素、−OHまたは−O−Yである、請求項84に記載の複合体。
- Ryが、水素、−R2、−C(O)R2またはアセチルである、請求項84に記載の複合体。
- Yが、単糖である、請求項84に記載の複合体。
- Yが、マンノース、グルコース、フルクトース、ガラクトース、ラムノースまたはキシロピラノースである、請求項88に記載の複合体。
- Yがマンノースである、請求項88に記載の複合体。
- Yが、D−マンノースである、請求項88に記載の複合体。
- Yが二糖である、請求項84に記載の複合体。
- Yが、スクロース、マルトース、ツラノース、トレハロース、セロビオースまたはラクトースである、請求項92に記載の複合体。
- Gが、共有結合である、請求項84に記載の複合体。
- Gが、−O−C1−8アルキレンである、請求項84に記載の複合体。
- Gが、−OCH2CH2−である、請求項95に記載の複合体。
- Zが、−N(R2)2、−OR2または−SR2である、請求項84に記載の複合体。
- Zが−SHである、請求項97に記載の複合体。
- Zが、−NH2である、請求項97に記載の複合体。
- −G−Zが、−OCH2CH2NH2である、請求項84に記載の複合体。
- リガンドが、アミノエチルグルコース(AEG)、アミノエチルマンノース(AEM)、アミノエチルビマンノース(AEBM)またはアミノエチルトリマンノース(AETM)を含む、請求項1に記載の複合体。
- リガンドが、アミノエチルトリマンノース(AETM)を含む、請求項1に記載の複合体。
- 複合体が、2個または3個の別のリガンドを含み、それぞれのリガンドが、アミノエチルトリマンノース(AETM)を含む、請求項1に記載の複合体。
- リガンドが、アノマー炭素を介して複合体化している第一の糖を含む、請求項1〜105のいずれか一項に記載の複合体。
- アノマー炭素が、αアノマーである、請求項106に記載の複合体。
- 糖が、複合体骨格を介して薬物に間接的に複合体化している、請求項106に記載の複合体。
- 複合体が、一般式(II):
(式中、
[(A−T)]は、それぞれ、複合体内のポテンシャル分岐部を示し;
(A−T)は、それぞれ、複合体の分岐部内のポテンシャル繰返部を示し;
−A−は、それぞれ独立して、共有結合、炭素原子、ヘテロ原子、または場合によっては置換されたアシル、脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリール、ヘテロアリールおよびヘテロ環からなる群から選択される基であり;
Tは、それぞれ独立して、共有結合、または2価の、直鎖または分岐状、飽和または不飽和の、場合によっては置換されたC1−30炭化水素鎖であって、ここで、Tの1個以上のメチレン単位は、場合によっては、および独立して、−O−、−S−、−N(R)−、−C(O)−、−C(O)O−、−OC(O)−、−N(R)C(O)−、−C(O)N(R)−、−S(O)−、−S(O)2−、−N(R)SO2−、−SO2N(R)−、複素環基、アリール基またはヘテロアリール基で置き換えられ;
Rは、それぞれ独立して、水素、適切な保護基、またはアシル部分、アリールアルキル部分、脂肪族部分、アリール部分、ヘテロアリール部分、またはヘテロ脂肪族部分であり;
−Bは、−T−LB−Xであり;
Xは、それぞれ独立して、リガンドであり;
LBは、それぞれ独立して、共有結合、またはTのXとの共有複合から誘導される基であり;
−Dは−T−LD−Wであり;
Wは、それぞれ独立して、薬物であり;
LDは、それぞれ独立して、共有結合、またはTのWとの共有複合から誘導される基であり;
kは、1〜12の整数であり;
jは、1〜4の整数であり;
pは、それぞれ独立して、1〜5の整数であり;
nは、それぞれ独立して、0〜5の整数であり;
mは、それぞれ独立して、1〜5の整数であり;および
vは、それぞれ独立して、0〜5の整数であり、ただし、
各k−分岐部内で、nの少なくとも1つが≧1であり、およびvの少なくとも1つが≧1である。) - k=1およびj=2である、請求項109に記載の複合体。
- k=2およびj=2である、請求項109に記載の複合体。
- k=3およびj=2である、請求項109に記載の複合体。
- 複合体が一般式(I):
(式中、
[(A−T)]は、それぞれ、複合体内のポテンシャル分岐部を示し;
(A−T)は、それぞれ、複合体の分岐部内のポテンシャル繰返部を示し;
−A−は、それぞれ独立して、共有結合、炭素原子、ヘテロ原子、または場合によっては置換された、アシル、脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリール、ヘテロアリールおよび複素環からなる群から選択される基であり;
Tは、それぞれ独立して、共有結合、または2価の、直鎖または分岐状、飽和または不飽和の、場合によっては置換された、C1−30炭化水素鎖であり、ここで、Tの1個以上のメチレン単位は、場合によっては、および独立して、−O−、−S−、−N(R)−、−C(O)−、−C(O)O−、−OC(O)−、−N(R)C(O)−、−C(O)N(R)−、−S(O)−、−S(O)2−、−N(R)SO2−、−SO2N(R)−、複素環基、アリール基、またはヘテロアリール基で置き換えられ;
Rは、それぞれ独立して、水素、適切な保護基、またはアシル部分、アリールアルキル部分、脂肪族部分、アリール部分、ヘテロアリール部分またはヘテロ脂肪族部分であり;
−Bは、−T−LB−Xであり;
Xは、それぞれ独立して、リガンドであり;
LBは、それぞれ独立して、共有結合、またはTのXとの共有複合から誘導される基であり;
−Dは、−T−LD−Wであり;
Wは、それぞれ独立して、薬物であり;
LDは、それぞれ独立して、共有結合、またはTのWとの共有複合から誘導される基であり;
kは、1〜12の整数であり;
qは、1〜4の整数であり;
pは、それぞれ独立して、1〜5の整数であり;
nは、それぞれ独立して、0〜5の整数であり;
mは、それぞれ独立して、1〜5の整数であり;
vは、それぞれ独立して、0〜5の整数であり、ただし
各k−分岐部内で、nの少なくとも1つが≧1であり、およびvの少なくとも1つが≧1である。) - pの括弧でくくられた部分の−A−は、それぞれ、n≧1の数に対応する数のnの括弧でくくられた部分によって置換されている、請求項115に記載の複合体。
- pの括弧でくくられた部分内の末端の−A−のみが、n≧1の数に対応する数のnの括弧でくくられた部分によって置換されている、請求項115に記載の複合体。
- mの括弧でくくられた部分における−A−は、それぞれ、v≧1の数に対応する数のB部分によって置換されている、請求項115に記載の複合体。
- mの括弧でくくられた部分における末端の−A−のみが、v≧1の数に対応する数のB部分によって置換されている、請求項115に記載の複合体。
- −A−は、それぞれ、アシル、脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリール、ヘテロアリールおよび複素環からなる群から選択される、場合によっては置換された基である、請求項115に記載の複合体。
- −A−が、それぞれ、同じである、請求項115に記載の複合体。
- 中央の−A−が、他の全ての−A−と異なる、請求項115に記載の複合体。
- −A−が、中央の−A−を除いて、全て同じである、請求項128に記載の複合体。
- −A−が、場合によっては置換されたアリールまたはヘテロアリール基である、請求項115に記載の複合体。
- −A−が、6員アリールである、請求項130に記載の複合体。
- −A−が、フェニルである、請求項131に記載の複合体。
- −A−が、N、OまたはSから選択されるヘテロ原子である、請求項115に記載の複合体。
- −A−が、窒素原子である、請求項115に記載の複合体。
- −A−が、炭素原子である、請求項115に記載の複合体。
- Tは、それぞれ独立して、2価の、直鎖または分岐状、飽和または不飽和、場合によっては置換された、C1−20炭化水素鎖であって、Tの1個以上のメチレン単位は、場合によっておよび独立して、−O−、−S−、−N(R)−、−C(O)−、−C(O)O−、−OC(O)−、−N(R)C(O)−、−C(O)N(R)−、−S(O)−、−S(O)2−、−N(R)SO2−、−SO2N(R)−、複素環基、アリール基またはヘテロアリール基で置き換えられた炭化水素鎖である、請求項115に記載の複合体。
- Tの1、2、3、4または5個のメチレン単位が、場合によってはおよび独立して、置き換えられた、請求項136に記載の複合体。
- Tは、C1−10炭化水素鎖から構築され、ここで、Tの1個以上のメチレン単位は、場合によってはおよび独立して、−O−、−S−、−N(R)−、−C(O)−、−C(O)O−、−OC(O)−、−N(R)C(O)−、−C(O)N(R)−、−S(O)−、−S(O)2−、−N(R)SO2−、−SO2N(R)−、複素環基、アリール基、またはヘテロアリール基で置き換えられている、請求項136に記載の複合体。
- Tの1個以上のメチレン単位が、複素環基で置き換えられている、請求項136に記載の複合体。
- Tの1個以上のメチレン単位が、トリアゾール部分で置き換えられている、請求項136に記載の複合体。
- Tの1個以上のメチレン単位が、−C(O)−で置き換えられている、請求項136に記載の複合体。
- Tの1個以上のメチレン単位が、−C(O)N(R)−で置き換えられている、請求項136に記載の複合体。
- Tの1個以上のメチレン単位が、−O−で置き換えられている、請求項136に記載の複合体。
- Tは、それぞれ、同じである、請求項136に記載の複合体。
- k=1であり、q=1である、請求項152に記載の複合体。
- k=2であり、q=1である、請求項152に記載の複合体。
- k=3であり、q=1である、請求項152に記載の複合体。
- LBおよびLDの少なくとも1つが共有結合である、請求項115に記載の複合体。
- 少なくとも1つのLBおよび/またはLDが、Tの場合によっては置換されたカルボニル反応性、チオール反応性、アミン反応性、またはヒドロキシル反応性部分と、XまたはWIのカルボキシル、チオール、アミン、またはヒドロキシル基との複合に由来する、場合によっては置換された部分である、請求項115に記載の複合体。
- 少なくとも1つのLBおよび/またはLDが、XまたはWの場合によっては置換されたカルボキシル反応性、チオール反応性、アミン反応性、またはヒドロキシル反応性部分と、Tのカルボキシル、チオール、アミン、またはヒドロキシル基との複合に由来する、場合によっては置換された部分である、請求項115に記載の複合体。
- LBおよびLDの少なくとも1つが、スクシンイミド部分である、請求項172に記載の複合体。
- k+qが、2〜6の整数である、請求項115に記載の複合体。
- k+qが2、3または4である、請求項176に記載の複合体。
- pが、それぞれ、1、2または3である、請求項115に記載の複合体。
- pが、それぞれ1である、請求項115に記載の複合体。
- それぞれのpが同じである、請求項115に記載の複合体。
- mが、それぞれ、1、2または3である、請求項115に記載の複合体。
- mが、それぞれ、1である、請求項115に記載の複合体。
- それぞれのmが同じである、請求項115に記載の複合体。
- Xが、それぞれ、アミノエチルグルコース(AEG)、アミノエチルマンノース(AEM)、アミノエチルビマンノース(AEBM)またはアミノエチルトリマンノース(AETM)を含むリガンドである、請求項109〜183のいずれか一項に記載の複合体。
- Xは、それぞれ、アミノエチルトリマンノース(AETM)を含むリガンドである、請求項109〜183のいずれか一項に記載の複合体。
- Wが、インスリン分子である、請求項185に記載の複合体。
- インスリン分子が、A1アミノ酸残基を介して複合体化している、請求項186に記載の複合体。
- インスリン分子が、B1アミノ酸残基を介して複合体化している、請求項186に記載の複合体。
- インスリン分子が、LysB29のε−アミノ基を介して複合体化している、請求項186に記載の複合体。
- インスリン分子が、LysB3のε−アミノ基を介して複合体化している、請求項186に記載の複合体。
- Xが、それぞれ、αアノマー炭素を介して、複合体骨格に複合体化したアミノエチルトリマンノース(AETM)であり;およびWが、LysB29のεアミノ基を介して、複合体骨格に複合体化したインスリン分子である、請求項115に記載の複合体。
- 式(VIa):
(式中、
−Bは、−T−LB−Xであり;
Xは、それぞれ独立して、糖を含有するリガンドであり;
LBは、それぞれ独立して、共有結合、またはTのXとの共有複合から誘導される基であり;
−Dは、−T−LD−Wであり;
Wは薬物であり;
LDは、それぞれ独立して、共有結合、またはTのWとの共有複合から誘導される基であり;
Tは、それぞれ独立して、共有結合、または2価の、直鎖または分岐状、飽和または不飽和の、場合によっては置換されたC1−30炭化水素鎖であって、ここで、Tの1個以上のメチレン単位は、場合によってはおよび独立して、−O−、−S−、−N(R)−、−C(O)−、−C(O)O−、−OC(O)−、−N(R)C(O)−、−C(O)N(R)−、−S(O)−、−S(O)2−、−N(R)SO2−、−SO2N(R)−、複素環基、アリール基またはヘテロアリール基によって置き換えられ;および
Rは、それぞれ独立して、水素、適切な保護基、またはアシル部分、アリールアルキル部分、脂肪族部分、アリール部分、ヘテロアリール部分またはヘテロ脂肪族部分である。) - 式(VIb):
(式中、
−Bは、−T−LB−Xであり;
Xは、それぞれ独立して、糖を含むリガンドであり;
LBは、それぞれ独立して、共有結合、またはTのXとの共有複合から誘導される基であり;
−Dは、−T−LD−Wであり;
Wは、薬物であり;
LDは、それぞれ独立して、共有結合、またはTのWとの共有複合から誘導される基であり;
Tは、それぞれ独立して、共有結合、または2価の、直鎖または分岐状、飽和または不飽和、場合によっては置換されたC1−30炭化水素鎖であって、Tの1個以上のメチレン単位は、場合によってはおよび独立して、−O−、−S−、−N(R)−、−C(O)−、−C(O)O−、−OC(O)−、−N(R)C(O)−、−C(O)N(R)−、−S(O)−、−S(O)2−、−N(R)SO2−、−SO2N(R)−、複素環基、アリール基またはヘテロアリール基によって置き換えられ;および
Rは、それぞれ独立して、水素、適切な保護基、またはアシル部分、アリールアルキル部分、脂肪族部分、アリール部分、ヘテロアリール部分またはヘテロ脂肪族部分である。) - 式(VIc):
−Bは、−T−LB−Xであり;
Xは、それぞれ独立して、糖を含むリガンドであり;
LBは、それぞれ独立して、共有結合、またはTのXとの共有複合から誘導される基であり;
−Dは、−T−LD−Wであり;
Wは、薬物であり;
LDは、それぞれ独立して、共有結合、またはTのWとの共有複合から誘導される基であり;
Tは、それぞれ独立して、共有結合、または2価の、直鎖または分岐状、飽和または不飽和、場合によっては置換されたC1−30炭化水素鎖であって、ここで、Tの1個以上のメチレン単位は、場合によってはおよび独立して、−O−、−S−、−N(R)−、−C(O)−、−C(O)O−、−OC(O)−、−N(R)C(O)−、−C(O)N(R)−、−S(O)−、−S(O)2−、−N(R)SO2−、−SO2N(R)−、複素環基、アリール基またはヘテロアリール基で置き換えられ;および
Rは、それぞれ独立して、水素、適切な保護基、またはアシル部分、アリールアルキル部分、脂肪族部分、アリール部分、ヘテロアリール部分またはヘテロ脂肪族部分である。) - Tは、それぞれ独立して、2価の、直鎖または分岐状、飽和または不飽和の、場合によっては置換されたC1−20炭化水素鎖であり、ここで、Tの1個以上のメチレン単位は、場合によってはおよび独立して、−O−、−S−、−N(R)−、−C(O)−、−C(O)O−、−OC(O)−、−N(R)C(O)−、−C(O)N(R)−、−S(O)−、−S(O)2−、−N(R)SO2−、−SO2N(R)−、複素環基、アリール基、またはヘテロアリール基で置き換えられている、請求項192、196または204に記載の複合体。
- Tの1、2、3、4または5個のメチレン単位が、場合によってはおよび独立して、置き換えられている、請求項207に記載の複合体。
- Tは、C1−10炭化水素鎖から構築され、ここで、Tの1個以上のメチレン単位は、場合によってはおよび独立して、−O−、−S−、−N(R)−、−C(O)−、−C(O)O−、−OC(O)−、−N(R)C(O)−、−C(O)N(R)−、−S(O)−、−S(O)2−、−N(R)SO2−、−SO2N(R)−、複素環基、アリール基、またはヘテロアリール基で置き換えられている、請求項207に記載の複合体。
- Tの1個以上のメチレン単位が、複素環基で置き換えられている、請求項207に記載の複合体。
- Tの1個以上のメチレン単位が、トリアゾール部分で置き換えられている、請求項207に記載の複合体。
- Tの1個以上のメチレン単位が、−C(O)−で置き換えられている、請求項207に記載の複合体。
- Tの1個以上のメチレン単位が、−C(O)N(R)−で置き換えられている、請求項207に記載の複合体。
- Tの1個以上のメチレン単位が、−O−で置き換えられている、請求項207に記載の複合体。
- それぞれのTが同じである、請求項207に記載の複合体。
- LBおよびLDの少なくとも1つが、共有結合である、請求項192、196または204に記載の複合体。
- 少なくとも1つのLBおよび/またはLDが、Tの場合によっては置換されたカルボニル反応性、チオール反応性、アミン反応性、またはヒドロキシル反応性部分と、XまたはWのカルボキシル、チオール、アミン、またはヒドロキシル基との複合に由来する、場合によっては置換された部分である、請求項192、196または204に記載の複合体。
- 少なくとも1つのLBおよび/またはLDが、XまたはWの場合によっては置換されたカルボキシル反応性、チオール反応性、アミン反応性、またはヒドロキシル反応性部分と、Tのカルボキシル、チオール、アミン、またはヒドロキシル基との複合に由来する、場合によっては置換された部分である、請求項192、196または204に記載の複合体。
- LBおよびLDの少なくとも1つが、スクシンイミド部分である、請求項192、196または204に記載の複合体。
- 薬物が、抗糖尿病薬物である、請求項192〜226のいずれか一項に記載の複合体。
- 薬物が、インスリン感受性改善薬である、請求項192〜226のいずれか一項に記載の複合体。
- 薬物が、インスリン分泌促進薬である、請求項192〜226のいずれか一項に記載の複合体。
- 薬物が、インスリン分子である、請求項192〜226のいずれか一項に記載の複合体。
- インスリン分子が、ヒトインスリン、ブタインスリンおよびウシインスリンからなる群から選択される、請求項230に記載の複合体。
- インスリン分子が、インスリンリスプロ、インスリンアスパルトおよびインスリングルリジンからなる群から選択される、請求項230に記載の複合体。
- インスリン分子が、インスリングラルギンまたはインスリンデテミルである、請求項230に記載の複合体。
- インスリン分子が、3個のジスルフィド架橋を含む、請求項230に記載の複合体。
- インスリン分子が、A1アミノ酸残基を介して複合体化している、請求項230に記載の複合体。
- インスリン分子が、B1アミノ酸残基を介して複合体化している、請求項230に記載の複合体。
- インスリン分子が、LysB29のε−アミノ基を介して複合体化している、請求項230に記載の複合体。
- インスリン分子が、LysB3のε−アミノ基を介して複合体化している、請求項230に記載の複合体。
- Xは、それぞれ独立して、グルコース、マンノースおよびL−フコースからなる群から選択される糖を含むリガンドである、請求項192〜226のいずれか一項に記載の複合体。
- Xが、それぞれ独立してマンノサミンおよびβ架橋N−アセチルマンノサミンからなる群から選択される糖を含むリガンドである、請求項239に記載の複合体。
- Xが、それぞれ独立して、メチルグルコース、メチルマンノース、エチルグルコース、エチルマンノース、プロピルグルコースおよびプロピルマンノースからなる群から選択される糖を含むリガンドである、請求項239に記載の複合体。
- Xが、それぞれ、α−L−フコピラノシドを含むリガンドである、請求項239に記載の複合体。
- Xが、それぞれ、ビマンノースを含むリガンドである、請求項239に記載の複合体。
- Xが、それぞれ、トリマンノースを含むリガンドである、請求項239に記載の複合体。
- Xが、それぞれ、直鎖トリマンノースを含むリガンドである、請求項239に記載の複合体。
- Xが、それぞれ、分岐状トリマンノースを含むリガンドである、請求項239に記載の複合体。
- Xが、それぞれ、糖およびアミン基を含むリガンドである、請求項239に記載の複合体。
- 糖およびアミン基が、C1−C6アルキル基で分離されている、請求項247に記載の複合体。
- Xが、それぞれ独立して、アミノエチルグルコース(AEG)、アミノエチルマンノース(AEM)、アミノエチルビマンノース(AEBM)またはアミノエチルトリマンノース(AETM)を含むリガンドである、請求項248に記載の複合体。
- Xは、それぞれ、アミノエチルトリマンノース(AETM)を含むリガンドである、請求項249に記載の複合体。
- 複合体が、Xがアミノエチルトリマンノース(AETM)を含むリガンドである箇所を2個または3個含む、請求項250に記載の複合体。
- Xが、それぞれ、アノマー炭素を介して複合体化された糖を含むリガンドである、請求項192〜226のいずれか一項に記載の複合体。
- アノマー炭素が、αアノマーである、請求項252に記載の複合体。
- Xが、それぞれ、αアノマー炭素を介して、複合体骨格に複合体化したアミノエチルトリマンノース(AETM)であり;およびWが、LysB29のεアミノ基を介して、複合体骨格に複合体化したインスリン分子である、請求項192〜226のいずれか一項に記載の複合体。
- 請求項1〜254のいずれか一項に記載の複合体を含む徐放性製剤。
- 絶食状態で哺乳類に投与した場合、製剤は、複合体のゼロ次放出を示す、請求項255に記載の製剤。
- 絶食状態で哺乳類に皮下投与した場合、製剤は、複合体のゼロ次放出を示す、請求項255に記載の製剤。
- 薬物がインスリン分子であり、製剤がプロタミンおよび亜鉛を含む、請求項255に記載の製剤。
- インスリン分子が、ヒトインスリン、ブタインスリンおよびウシインスリンからなる群から選択される、請求項258に記載の製剤。
- インスリン分子が、インスリングラルギンまたはインスリンデテミルである、請求項258に記載の製剤。
- インスリン分子が、3個のジスルフィド架橋を含む、請求項258に記載の製剤。
- 製剤が、約0.05〜約10mgのプロタミン/mg複合体を含む、請求項258に記載の製剤。
- 製剤が、複合体1mg当たり約1〜約5mgのプロタミンを含む、請求項258に記載の製剤。
- 製剤が、約0.006〜約0.5mgの亜鉛/mg複合体を含む、請求項258に記載の製剤。
- 製剤が、約0.1〜約0.25mgの亜鉛/mg複合体を含む、請求項258に記載の製剤。
- 製剤が、プロタミンおよび亜鉛を、約100:1〜約5:1の範囲の比(w/w)で含む、請求項258に記載の製剤。
- 製剤が、プロタミンおよび亜鉛を、約40:1〜約10:1の範囲の比(w/w)で含む、請求項258に記載の製剤。
- 製剤が、さらに、抗菌性防腐剤を含む、請求項258〜267のいずれか一項に記載の製剤。
- 抗菌性防腐剤が、m−クレゾール、フェノール、メチルパラベン、およびプロピルパラベンからなる群から選択される、請求項268に記載の製剤。
- 抗菌性防腐剤が、m−クレゾールである、請求項268に記載の製剤。
- 製剤が、約0.1〜約1.0%v/vのm−クレゾールを含む、請求項270に記載の製剤。
- 製剤が、約0.15〜約0.35%v/vのm−クレゾールを含む、請求項270に記載の製剤。
- 製剤が、さらに、等張剤を含む、請求項258〜267のいずれか一項に記載の製剤。
- 等張剤が、ポリオールである、請求項273に記載の製剤。
- 等張剤が、マンニトール、プロピレングリコールおよびグリセロールからなる群から選択される、請求項274に記載の製剤。
- 等張剤がグリセロールである、請求項275に記載の製剤。
- 等張剤が塩である、請求項273に記載の製剤。
- 塩がNaClである、請求項277に記載の製剤。
- 製剤が、約0.05〜約0.5MのNaClを含む、請求項278に記載の製剤。
- 製剤が、約0.1〜約0.2MのNaClを含む、請求項278に記載の製剤。
- 製剤が、さらに、ある量の複合体化されていないインスリン分子を含む、請求項258〜267のいずれか一項に記載の製剤。
- 製剤が、複合体化されているインスリン分子の複合体化されていないインスリン分子に対するモル比を約100:1〜約1:1の範囲で含む、請求項281に記載の製剤。
- 製剤が、複合体化されているインスリン分子の複合体化されていないインスリン分子に対するモル比を約25:1〜約2:1の範囲で含む、請求項281に記載の製剤。
- 複合体が、請求項327〜350のいずれか一項に定義されている、請求項255〜283のいずれか一項に記載の製剤。
- 請求項1〜254のいずれか一項の複合体を含むポンプ・デリバリー・システムであって、該ポンプ・デリバリー・システムは、前記複合体を哺乳類に注入することにより動くポンプ・デリバリー・システム。
- ポンプが、複合体を、静脈内に、皮下にまたは腹腔内に注入することにより動く、請求項285に記載のポンプ。
- 複合体が、請求項327〜350のいずれか一項に定義されている、請求項285に記載のポンプ。
- 請求項255〜284のいずれか一項の製剤を、その投与を必要とする哺乳類患者に投与することを含む、高血糖症を治療する方法。
- 患者が糖尿病である、請求項288に記載の方法。
- 患者が、血糖管理不良に関連する感染症を患う、請求項288の方法。
- 製剤が、レクチンを含まない、請求項288に記載の方法。
- 製剤が、皮下注射によって投与される、請求項288に記載の方法。
- 患者がヒトである、請求項288に記載の方法。
- 薬物が抗糖尿病薬物である、請求項288に記載の方法。
- 薬物が、インスリン感受性改善薬である、請求項288に記載の方法。
- 薬物が、インスリン分泌促進薬である、請求項288に記載の方法。
- 薬物が、インスリン分子である、請求項288に記載の方法。
- 複合体を、インスリン分子の平均一日量が、10〜200Uの範囲になるように投与する、請求項297に記載の方法。
- 複合体を毎日投与する、請求項298に記載の方法。
- 複合体を毎週投与する、請求項298に記載の方法。
- 複合体を毎月投与する、請求項298に記載の方法。
- 患者が、インスリン感受性改善薬も投与されている、請求項298に記載の方法。
- 患者が、インスリン分泌促進薬も投与されている、請求項298に記載の方法。
- 製剤が、レクチンを含まない、請求項288〜303のいずれか一項に記載の方法。
- 複合体が、請求項327〜350のいずれか一項に定義されている、請求項288〜304のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜254のいずれか一項の複合体を、その投与を必要とする哺乳類患者に投与することを含む方法。
- 薬物がインスリン分子である、請求項306に記載の方法。
- 複合体が、インスリン分子の複合体化されていないものより、血糖降下の誘発が少ない、請求項307に記載の方法。
- 複合体が、請求項327〜350のいずれか一項に定義されている、請求項307または308に記載の方法。
- 請求項255〜283のいずれか一項の製剤を、その投与を必要とする哺乳類患者に投与することを含む方法。
- 薬物がインスリン分子である、請求項310に記載の方法。
- 製剤が、インスリン分子の複合体化されていないものを含む製剤より、血糖降下の誘発が少ない、請求項311に記載の方法。
- 製剤が、インスリン分子の複合体化されていないものを含む製剤より低いHbA1cを含む、請求項311に記載の方法。
- 複合体が、請求項327〜350のいずれか一項で定義されている、請求項311〜313のいずれか一項に記載の方法。
- さらに、トリガー量の外因性糖を、患者に投与することを含む、請求項306〜314のいずれか一項に記載の方法。
- 外因性糖が、マンノースである、請求項315に記載の方法。
- 外因性糖が、L−フコースである、請求項315に記載の方法。
- 外因性糖がN−アセチルグルコサミンである、請求項315の方法。
- 外因性糖が、α−メチルマンノースである、請求項315に記載の方法。
- 複合体または製剤と、外因性糖とを、異なる経路で哺乳類に投与する、請求項315に記載の方法。
- 複合体または製剤を皮下投与し、および外因性糖を経口投与する、請求項320に記載の方法。
- 複合体または製剤を皮下投与し、および外因性糖を静脈内投与する、請求項320に記載の方法。
- インスリン分子が、ヒトインスリン、ブタインスリンおよびウシインスリンからなる群から選択される、請求項323に記載の複合体。
- インスリン分子が、インスリングラルギンまたはインスリンデテミルである、請求項323に記載の複合体。
- インスリン分子が、3個のジスルフィド架橋を含む、請求項323に記載の複合体。
- インスリン分子が、ヒトインスリン、ブタインスリンおよびウシインスリンからなる群から選択される、請求項351に記載の複合体。
- インスリン分子が、インスリングラルギンまたはインスリンデテミルである、請求項351に記載の複合体。
- インスリン分子が、3個のジスルフィド架橋を含む、請求項351に記載の複合体。
- インスリン分子が、ヒトインスリン、ブタインスリンおよびウシインスリンからなる群から選択される、請求項355に記載の複合体。
- インスリン分子が、インスリングラルギンまたはインスリンデテミルである、請求項355に記載の複合体。
- インスリン分子が、3個のジスルフィド架橋を含む、請求項355に記載の複合体。
- 請求項327〜350のいずれか一項の複合体を含む徐放性製剤であって、プロタミンおよび亜鉛を含む徐放性製剤。
- 製剤が、約1〜約5mgのプロタミン/mg複合体と、
約0.1〜約0.25mgの亜鉛/mg複合体と
を含む、請求項359に記載の製剤。 - 製剤が、プロタミンおよび亜鉛を、約40:1〜約10:1の範囲の比(w/w)で含む、請求項359に記載の製剤。
- 製剤が、さらに、ある量の複合体化されていないインスリン分子を含む、請求項359〜361のいずれか一項に記載の製剤。
- 製剤が、複合体化されているインスリン分子の複合体化されていないインスリン分子に対するモル比を約25:1〜約2:1の範囲で含む、請求項362に記載の製剤。
- 製剤が、さらに、抗菌性防腐剤を含む、請求項359〜363のいずれか一項に記載の製剤。
- 抗菌性防腐剤が、m−クレゾールである、請求項364に記載の製剤。
- 製剤が、約0.15〜約0.35%v/vのm−クレゾールを含む、請求項365に記載の製剤。
- 製剤が、さらに、等張剤を含む、請求項359〜366のいずれか一項に記載の製剤。
- 等張剤がグリセロールである、請求項367に記載の製剤。
- 等張剤がNaClである、請求項367に記載の製剤。
- 製剤が、約0.1〜約0.2MのNaClを含む、請求項369に記載の製剤。
- 製剤が、さらに、ある量の複合体化されていないインスリン分子を含む、請求項359に記載の製剤。
- 製剤が、複合体化されているインスリン分子の複合体化されていないインスリン分子に対するモル比を約25:1〜約2:1の範囲で含む、請求項371に記載の製剤。
- 製剤が、さらに、抗菌性防腐剤を含む、請求項372に記載の製剤。
- 抗菌性防腐剤が、m−クレゾールである、請求項373に記載の製剤。
- 製剤が、約0.15〜約0.35%v/vのm−クレゾールを含む、請求項374に記載の製剤。
- 製剤がさらに等張剤を含む、請求項375に記載の製剤。
- 等張剤がグリセロールである、請求項376に記載の製剤。
- 等張剤がNaClである、請求項376に記載の製剤。
- 製剤が、約0.1〜約0.2MのNaClを含む、請求項378に記載の製剤。
- 請求項327〜350のいずれか一項の複合体を含む徐放性製剤であって、
約3.6mgのプロタミン/mg複合体と、
約0.2mgの亜鉛/mg複合体と
を含む製剤。 - 製剤が、さらに、ある量の複合体化されていないインスリン分子を含み、複合体化インスリン分子の複合体化されていないインスリン分子に対するモル比が約5:1である、請求項380に記載の製剤。
- 製剤が、さらに、約0.2%v/vのm−クレゾールを含む、請求項381に記載の製剤。
- 製剤が、グリセロールを含む、請求項382に記載の製剤。
- 製剤が、さらに、約0.15MのNaClを含む、請求項382に記載の製剤。
- 式(VIII):
(式中、
[(A−T)]は、それぞれ、複合体内のポテンシャル分岐部を示し;
(A−T)は、それぞれ、複合体の分岐部内のポテンシャル繰返部を示し;
−A−は、それぞれ独立して、共有結合、炭素原子、ヘテロ原子、またはアシル、脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリール、ヘテロアリールおよび複素環からなる群から選択される、場合によっては置換された基であり;
Tは、それぞれ独立して、共有結合、または2価の、直鎖または分岐状、飽和または不飽和、場合によっては置換されたC1−30炭化水素鎖であって、ここで、Tの1個以上のメチレン単位は、場合によってはおよび独立して、−O−、−S−、−N(R)−、−C(O)−、−C(O)O−、−OC(O)−、−N(R)C(O)−、−C(O)N(R)−、−S(O)−、−S(O)2−、−N(R)SO2−、−SO2N(R)−、複素環基、アリール基またはヘテロアリール基で置き換えられ;
Rは、それぞれ独立して、水素、適切な保護基、アシル部分、アリールアルキル部分、脂肪族部分、アリール部分、ヘテロアリール部分またはヘテロ脂肪族部分であり;
−Bは、−T−LB−Xであり;
Xは、それぞれ独立して、糖を含むリガンドであり;
LBは、それぞれ独立して、共有結合、またはTのXとの共有複合から誘導される基であり;
−Dは、−T−LD−Wであり;
Wは、それぞれ独立して、薬物であり;
LDは、それぞれ独立して、共有結合、またはTのWとの共有複合から誘導される基であり;
nは、それぞれ独立して、0〜5の整数であり;
mは、それぞれ独立して、1〜5の整数であり;および
vは、それぞれ独立して、0〜5の整数であり、ただし
nの少なくとも1つは≧1であり、vの少なくとも1つは≧1である。) - 式(IX):
(式中、
−Bは、−T−LB−Xであり;
Tは、それぞれ独立して、共有結合、または2価の、直鎖または分岐状、飽和または不飽和の、場合によっては置換されたC1−30炭化水素鎖であって、ここで、Tの1個以上のメチレン単位は、場合によってはおよび独立して、−O−、−S−、−N(R)−、−C(O)−、−C(O)O−、−OC(O)−、−N(R)C(O)−、−C(O)N(R)−、−S(O)−、−S(O)2−、−N(R)SO2−、−SO2N(R)−、複素環基、アリール基またはヘテロアリール基で置き換えられ;
Rは、それぞれ独立して、水素、適切な保護基、またはアシル部分、アリールアルキル部分、脂肪族部分、アリール部分、ヘテロアリール部分、またはヘテロ脂肪族部分であり;
Xは、それぞれ独立して、糖を含むリガンドであり;
LBは、それぞれ独立して、共有結合、またはTのXとの共有複合から誘導される基であり;
−Dは−T−LD−Wであり;
Wは、それぞれ独立して、薬物であり;および
LDは、それぞれ独立して、共有結合、またはTのWとの共有複合から誘導される基である。) - アミノエチルグルコース(AEG)、アミノエチルマンノース(AEM)、アミノエチルビマンノース(AEBM)、アミノエチルトリマンノース(AETM)、β−アミノエチル−N−アセチルグルコサミン(AEGA)、およびアミノエチルフコース(AEF)からなる群から独立して選択される1個以上のリガンドに複合体化したインスリン分子を含む複合体。
- インスリン分子が、A1アミノ酸残基を介して複合体化している、請求項388に記載の複合体。
- インスリン分子が、B1アミノ酸残基を介して複合体化している、請求項388に記載の複合体。
- インスリン分子が、LysB29のε−アミノ基を介して複合体化している、請求項388に記載の複合体。
- インスリン分子が、LysB3のε−アミノ基を介して複合体化している、請求項388に記載の複合体。
- 1個以上のリガンドが、アミノエチルグルコース(AEG)である、請求項389〜392のいずれか一項に記載の複合体。
- 1個以上のリガンドが、アミノエチルマンノース(AEM)である、請求項389〜392のいずれか一項に記載の複合体。
- 1個以上のリガンドが、アミノエチルビマンノース(AEBM)である、請求項389〜392のいずれか一項に記載の複合体。
- 1個以上のリガンドが、アミノエチルトリマンノース(AETM)である、請求項389〜392のいずれか一項に記載の複合体。
- 1個以上のリガンドが、β−アミノエチル−N−アセチルグルコサミン(AEGA)である、請求項389〜392のいずれか一項に記載の複合体。
- 1個以上のリガンドが、アミノエチルフコース(AEF)である、請求項389〜392のいずれか一項に記載の複合体。
- インスリン分子が、2個以上の異なるリガンドに複合体化している、請求項388に記載の複合体。
- インスリン分子が、2個の異なるリガンドに複合体化している、請求項399に記載の複合体。
- インスリン分子が、3個の別のリガンドに複合体化している、請求項399に記載の複合体。
- インスリン分子が、4個の別のリガンドに複合体化している、請求項399に記載の複合体。
- 2個以上の別のリガンドが、インスリン分子に複合体化している単一複合体骨格に複合体化している、請求項399に記載の複合体。
- 2個以上の別のリガンドおよびインスリン分子が、それぞれ、単一分岐複合体骨格の異なる分岐部に位置する、請求項399に記載の複合体。
- 2個以上の別のリガンドおよびインスリン分子が、それぞれ、単一分岐複合体骨格の別の分岐部の末端に位置する、請求項404に記載の複合体。
- 2個以上の別のリガンドおよび複合体が、2個以上の異なる複合点を介してインスリン分子に複合体化する、請求項399に記載の複合体。
- インスリン分子が、A1アミノ酸残基およびLysB29のε−アミノ基を介して複合体化する、請求項406に記載の複合体。
- インスリン分子が、それぞれが1個以上の別のリガンドに複合体化している2個の別の複合体骨格に複合体化している、請求項407に記載の複合体。
- インスリン分子が、それぞれが1個のリガンドに複合体化している2個の別の複合体骨格に複合体化している、請求項407に記載の複合体。
- インスリン分子が、それぞれが2個のリガンドに複合体化している2個の別の分岐複合体骨格に複合体化している、請求項407に記載の複合体。
- リガンドが、分岐複合体骨格の別の分岐部に位置する、請求項410に記載の複合体。
- リガンドが、分岐複合体骨格の別の分岐部の末端に位置する、請求項411に記載の複合体。
- 2個以上の別のリガンドが、アミノエチルグルコース(AEG)である、請求項399〜412のいずれか一項に記載の複合体。
- 2個以上の別のリガンドが、アミノエチルマンノース(AEM)である、請求項399〜412のいずれか一項に記載の複合体。
- 2個以上の別のリガンドが、アミノエチルビマンノース(AEBM)である、請求項399〜412のいずれか一項に記載の複合体。
- 2個以上の別のリガンドが、アミノエチルトリマンノース(AETM)である、請求項399〜412のいずれか一項に記載の複合体。
- 2個以上の別のリガンドが、β−アミノエチル−N−アセチルグルコサミン(AEGA)である、請求項399〜412のいずれか一項に記載の複合体。
- 2個以上の別のリガンドが、アミノエチルフコース(AEF)である、請求項399〜412のいずれか一項に記載の複合体。
- アミノエチルグルコース(AEG)に複合体化したインスリン分子を含む複合体。
- アミノエチルマンノース(AEM)に複合体化したインスリン分子を含む複合体。
- アミノエチルビマンノース(AEBM)に複合体化したインスリン分子を含む複合体。
- アミノエチルトリマンノース(AETM)に複合体化したインスリン分子を含む複合体。
- β−アミノエチル−N−アセチルグルコサミン(AEGA)に複合体化したインスリン分子を含む複合体。
- アミノエチルフコース(AEF)に複合体化したインスリン分子を含む複合体。
- インスリン分子が、A1アミノ酸残基を介して複合体化している、請求項419〜424のいずれか一項に記載の複合体。
- インスリン分子が、B1アミノ酸残基を介して複合体化している、請求項419〜424のいずれか一項に記載の複合体。
- インスリン分子が、LysB29のε−アミノ基を介して複合体化している、請求項419〜424のいずれか一項に記載の複合体。
- インスリン分子が、LysB3のε−アミノ基を介して複合体化しているインスリングルリシンである、請求項419〜424のいずれか一項に記載の複合体。
- インスリン分子が、Alアミノ酸残基およびLysB29のε−アミノ基を介して複合体化している、請求項419〜424のいずれか一項に記載の複合体。
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